DE69914942T2

DE69914942T2 - Kennzeichnung einer substanz mittels eines reportergens und sequenzen, die für die in vitro expression des reportergens notwendig sind

Info

Publication number: DE69914942T2
Application number: DE69914942T
Authority: DE
Inventors: Sandrine Dautel; Cecile Persillon; Daniel Dupret; Jean-Michel Masson; Fabrice Lefevre
Original assignee: Proteus SA
Current assignee: Proteus SA
Priority date: 1998-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: JP2002531143A; EP1137804B1; AU1567900A; IL143637A0; DE69914942D1; FR2786789A1; AT259884T; EP1137804B9; ES2216598T3; CA2354986A1; FR2786789B1; WO2000034513A1; EP1137804A1; JP4580104B2; IL143637A; AU772357B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum In vitro-Nachweis einer Zielsubstanz, besonders einer Nukleinsäuresequenz jedoch allgemeiner jeder Art von Substanz in einer Probe. Die Untersuchung von Zielsubstanzen, besonders Nukleinsäuresequenzen bildet einen Hauptgegenstand in zahlreichen Forschungslaboratorien, deren Aktivität sich auf zahlreiche Gebiete erstreckt, und besonders auf das Gebiet der Medizin oder Nahrungsmittelerzeugung.
In diesen Gebieten hat die Erforschung von Sequenzen beispielsweise zum Ziel:

– die Diagnose von Viren, die Krankheiten erzeugen, wie AIDS (HIV) oder Hepatitis B (HBV),
– die spezifische Diagnose von Krankheiten bakteriellen Ursprungs, wie Tuberkulose oder Lepra,
– die Diagnose von Mutationen am Ursprung von genetischen Krankheiten oder zellularen Krebserkrankungen,
– die Diagnose einer bakteriellen Verunreinigung in einer Nahrungsmittelkette,
– die Untersuchung von Mikroorganismen, die in der biologischen Korrosion von Leitungen oder Behältern eine Rolle spielen, die in industriellen Verfahren verwendet werden.

Die Hauptschwierigkeit der diagnostischen Verfahren, die im Stand der Technik verwendet werden, liegt in der Spezifizität, der Empfindlichkeit, der Geschwindigkeit und der Reproduzierbarkeit des verwendeten Nachweistest. Diese Schwierigkeiten rühren im allgemeinen von der Art der verwendeten Markierung her. Die Art der Markierung einer Substanz ist nämlich der entscheidende Punkt jedes späteren Nachweises, der eine Verfolgung oder Quantifizierung der Substanz ermöglicht. Ob es sich um ein humanes, tierisches oder pflanzliches Diagnostikum in der Landwirtschaft oder Nahrungsmittelindustrie, in der Therapie, in der Pharmakologie, in der Forschung, in verschiedenen industriellen Verfahren usw. handelt, stets muß man spezifisch eine oder mehrere Zielsubstanzen nachweisen, verfolgen und quantifizieren. Damit dieser Nachweis optimal ist, muß man über leistungsfähige und empfindliche Markierungsmethoden verfügen.
Eine der für Nukleinsäuren spezifischen Markierungsmethoden verwendet die Amplifizierung durch PCR. Die Markierung von bei PCR verwendbaren Primern kann auf zwei Weisen erfolgen, entweder durch Markierung der Primer und vorzugsweise an ihrem 5'-Ende oder durch innere Markierung des amplifizierten Fragments.
Der erste Typ von Markierung hat den Nachteil, daß er zu einer geringen spezifischen Aktivität führt und infolgedessen die Empfindlichkeit des späteren Nachweises begrenzt. Es ist möglich, ein radioaktives Phosphat (³²P) bei 5' der Primer zu fixieren. Man hat dann ein (³²P) pro Primer. Wenn man ein Biotin oder ein Fluorochrom fixiert, kann man mehr als 3 bis 4 Indikatoren pro Primermolekül haben.
Wenn radioaktive Nukleotide in das Amplikon eingebaut werden, ist zwar die spezifische Aktivität größer, jedoch muß man in nachteiliger Weise Radioaktivität handhaben. Die aktuelle Tendenz ist, Methoden der Isotopenmarkierung durch kalte Markierungen (Fluorophor, Digoxigenin, Biotin) zu ersetzen.
Die Fluorophore sind empfindlich gegenüber Veränderungen der Umgebung:
Veränderungen in den Versuchsbedingungen (pH, Gegenwart von oxidierenden Elementen usw.) können die Länge der Emissionswelle verschieben. Außerdem wurden in erheblichem Ausmaß Phänomene der Fluoreszenzlöschung (oder Quenching) beschrieben. Der Einbau von Nukleotiden, die durch ein Fluorophor oder Digoxigenin oder Biotin markiert sind, durch Polymerasen ist wenig wirksam, da diese Nukleotide eine starke sterische Sperrigkeit zeigen, welche die Polymerisationsreaktion durch PCR behindert.
Die Patentanmeldung PCT WO 98 11249 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von mutierten Proteinen, das darin besteht, daß an das N-terminale Ende von synthetisierten Proteinen in vitro eine Peptidsequenz oder ein Reporterprotein angelagert wird mit dem nachzuweisenden Protein fusioniert wird, die von einem Liganden erkannt werden kann um die genannten Proteine im Hinblick auf ihre Analyse zu reinigen.
Die radioaktive Markierung von Proteinen kann vorgenommen werden, indem man Aminosäuren verwendet, die mit einem Isotop markiert sind, wobei das die Handhabung von Radioaktivität erfordert. Die Markierung von Proteinen durch eine Antigen/Antikörperreaktion ist ihrerseits möglicherweise nicht empfindlich genug.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Zielsubstanzen zu schaffen, das empfindlich ist und die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist.
Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) die spezifische Markierung der besagten Substanz durch ein Reportergen und durch die zur in vitro-Expression des Reportergens notwendigen Sequenzen,
b) die in vitro-Transkription und -Translation des Reportergens in ein azelluläres System wobei davon ausgegangen wird, daß, wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurezielsequenz ist, die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reportergen führen, das mit einem durch die Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert hat,
c) den in vitro-Nachweis des durch das Reportergen kodierten Reporterproteins.

Das Expose der verschiedenen hiernach beschriebenen Formen der Durchführung der Erfindung entspricht den in den Ansprüchen definierten Verfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht also auf einer Markierung, die darin besteht, an die Zielsubstanz ein DNA-Molekül anzulagern, das ein Reportergen bildet, das in vitro exprimiert werden kann. Die Markierung besteht also darin, an die Zielsubstanz ein Reportergen anzulagern, das unter die Kontrolle der für seine Expression notwendigen Sequenzen gestellt ist.
Die im Rahmen der Erfindung verwendbaren in vitro-Transkriptionspromotoren entsprechen besonders den Promotoren der Phagen T7, SP6, Qβ oder λ.
Im Schritt (b) erhält man das durch das Reportergen kodierte Protein, um spezifisch die Zielsubstanz aufzuzeigen. Der Nachweis der Markierung, welcher Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, ist empfindlich, da er Stufen der Amplifizierung bei den Stufen der Transkription (Stufe b), der Translation (Stufe b) und des Nachweises (Stufe c) einsetzt. Diese Amplifizierung kann beispielsweise einem Faktor 500 für die Transkription entsprechen (Pokrovkaya und Gurevich, Analytical Biochemistry 220, 420–423 (1994)).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch spezifisch durch den Nachweistest des Proteins im Schritt (c).
Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren nach dem Schritt der Transkription mit einem Schritt der Amplifizierung der Transkripte durch jede dem Fachmann bekannte Methode laufen, wie 3SR, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification = nukleinsäuresequenz-basierte Amplifizierung), TMA (Transcription Mediated Amplification = durch Transkription vermittelte Amplifizierung).
Im Fall, wo die Zielsubstanz einem Nukleinsäuremolekül entspricht, kann die Amplifizierung des Erkennungssignals im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnen. Ein Satz von Primern oder besonderen Sonden wird verwendet, um spezifisch eine Sequenz zu amplifizieren und an das Vorliegen einer spezifischen Oligonukleotidsequenz ein Reportergen zu assoziieren, das in-vitro exprimiert werden kann. Das Reportergen wird nur exprimiert, wenn das Zielgen vorhanden und amplifiziert ist. Wie oben angegeben versteht man unter Amplifizierung des Reportergens oder des Zielgens Reaktionen vom Typ PCR (Polymerase Chain Reaktion = Polymerasekettenreaktion), NASBA (nucleic acid sequence based amplification), SDA (strand displacement amplification = Strangverschiebungsamplifizierung), bDNA (branched DNA signal amplification = Signalamplifizierung verzweigter DNA), durch Rolling Circle, durch abgeleitete PCR-Methoden (nested PCR, multiplex PCR).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem schnell und reproduzierbar, da alle Reaktionen in vitro ausgeführt werden, was die Standardisierung des Nachweises ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, qualitative und quantitative Nachweise zu realisieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bemerkenswert, indem es für jede Art von Substanzen anwendbar ist. Jedoch wird die Erfindung besonders angewandt auf chemische und biologische Substanzen, wie Antikörper, Antikörperfragmente, Nukleotidfragmente, Gene, zelluläre Rezeptoren, Peptide, Proteine, Aminosäuren, Glykopeptide, Lipide, Glykolipide, Zucker, Polysaccharide usw. In einer besonderen Anwendung kann die Zielsubstanz das Reportergen selbst sein.
Unter Zielsubstanz versteht man jede Substanz, die direkt oder indirekt mit einem Reportergen assoziiert ist, das in vitro exprimiert werden kann.
Das Reportergen ist ein Gen, das in vitro transkribiert und translatiert werden kann in Gegenwart von Sequenzen der Regulierung seiner Expression. Das Protein, für welches das Reportergen kodiert, kann im Schritt (c) durch jede dem Fachmann bekannte Methode nachgewiesen werden. Beispielsweise kann das Reportergen das Gen des Proteins GFP (Green Fluorescent Protein) oder das der Beta-Lactamase (TEM-1) sein. Im Fall des GFP wird die Fluoreszenz-Emission gemessen. Im Fall der Beta-Lactamase wird die Aktivität dieses Enzyms gemessen, indem man eine Fraktion der Translationsreaktion in einem Puffer inkubiert, der Nitrocephin enthält. Das Nitrocephin ist ein chromogenes Beta-Lactamin, das die Eigenschaft hat, sich von Gelb nach Rot zu verändern, wenn es durch eine Beta-Laktamase hydrolysiert wird. Jedes andere Reportergen kann im erfindungsgemäßen Verfahren in Betracht gezogen werden, wie diejenigen der Beta-Lactosidase, der Beta-Glukuronidase, der Luciferase, der Peroxidase oder einer Mikroperoxidase usw.
Das Reportergen kodiert vorteilhafterweise für ein Enzym. Die Spezifizität der Markierung der Zielsubstanz des Schritts (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch jede dem Fachmann bekannte direkte oder indirekte Methode realisiert werden.
Unter direkter Methode versteht man, daß die Zielsubstanz direkt mit dem Gen und den zur Expression des Reportergens in vitro erforderlichen Elementen assoziiert wird. Es handelt sich beispielsweise um den hiernach beschriebenen Fall eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wo die Zielsubstanz eine Nukleinsequenz ist, die in diesem rekombinanten Nukleinsäuremolekül enthalten ist und gleichzeitig das Reportergen und die zu dessen Expression in vitro erforderlichen Sequenzen aufweist.
Unter indirekter Methode versteht man, daß die Zielsubstanz mit einem Reportergen und den zu dessen Expression in vitro erforderlichen Sequenzen assoziiert ist mittels eines spezifischen Liganden der Zielsubstanz. Dieser Ligand ist mit dem Reportergen und den zu dessen Expression in vitro erforderlichen Elemente assoziiert. Dadurch, daß dieser Ligand mit der Zielsubstanz in Berührung gebracht wird, wird die spezifische Markierung der Zielsubstanz ermöglicht. Es handelt sich beispielsweise um einen Antikörper, der durch das Reportergen und die zu dessen Expression in vitro erforderlichen Sequenzen markiert ist, der spezifisch eine Zielsubstanz erkennen kann, die aus einem Antigen besteht. Unter dem Paar Zielsubstanz/Ligand wird beispielsweise verstanden: ein Antigen/ein Antikörper, eine Nukleinsequenz/eine Nukleinsequenz, eine Sonde, ein Rezeptor/ein Ligand des Rezeptors, usw.
In der indirekten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Verfahren im Schritt (a) darin, die Probe, welche die Zielsubstanz enthalten kann, mit einem spezifischen Liganden dieser Zielsubstanz in Kontakt zu bringen, wobei dieser Ligand markiert ist durch ein Reportergen und die zur Expression des Reportergens in vitro erforderlichen Sequenzen. Die Fortsetzung des Verfahrens umfaßt wie oben die Schritte (b) und (c).
Die Markierung des spezifischen Liganden der Zielsubstanz kann wie oben eine direkte oder indirekte Markierung sein.
Bei der indirekten erfindungsgemäßen Methode läßt die Assoziation des Reportergens an eine Zielsubstanz, die einem Protein entspricht, mehrere Ausführungsarten zu. Die Fixierung eines Nukleinsäuremoleküls, das aus einem Reportergen und den zu seiner in vitro-Expression notwendigen Sequenzen besteht, an einem Protein kann nämlich nach dem Fachmann bekannten Methoden realisiert werden, welche Verbindungskomponenten benutzen, wie:

– Streptavidin/Biotin (Kipriyanov et al., (1995), Hum. Antibodies Hybridomas 6 (3), 93–101),
– ein Peptid, das Polylysin entspricht (Avrameas et al., (1998), PNAS 95 (10), 5601–6; Curiel et al., (1992), Hum. Gene Ther. 3 (2), 147–54; Wu et al., (1991), J. Biol. Chem. 266 (22), 14338–42; Kwoh et al., (1999), Biochim. Biophys. Acta 1444 (2), 171–90; Wu et al., (1994), J. Biol. Chem. 269 (15), 11542–6),
– p-Azido-tetrafluorbenzyl (Ciolina et al., (1999), Bioconjug. Chem. 10 (1), 49–55);
– die Triplehelices von DNA (Neves et al., (1999), FEBS Lett. 453 (1–2), 41–5).

Das erfindungsgemäße Verfahren durch direkte Markierung wird in mehreren Formen durchgeführt, die hiernach dargestellt sind.
Die Probe, an der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, kann jede humane, tierische, pflanzliche oder Umgebungsprobenahme oder jeder Stoff sein, der markiert werden kann durch ein Reportergen, das jede für seine in vitro-Expression notwendige Information besitzt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft den Nachweis einer Nukleinsäurezielsequenz, vorteilhafterweise nach der direkten Methode.
Die folgende Beschreibung betrifft daher eine in vitro-Nachweismethode einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe. Diese Methode weist die folgenden Schritte auf:

a) es wird ausgehend von der Probe ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gewonnen, das in der Richtung 5' zu 3' einen RNA-Polymerase-Promotor, ein Reportergen, das die zu seiner Expression erforderlichen Sequenzen aufweist, und gegebenenfalls einen RNA-Polymerase-Terminator aufweist, wobei die Nukleinsäurezielsequenz zwischen zwei beliebigen dieser Elemente lokalisiert ist,
b) Transkription und Translation der im Schritt (a) erhaltenen Amplifizierungsprodukte,
c) Aktivierung des durch das Reportergen kodierten, als Reportermolekül bezeichneten Proteins, das im Schritt (b) durch jedes geeignete Mittel erzeugt wurde.

Bestimmte verschiedene Formen der Durchführung des spezifischen Nachweises einer Zielsubstanz, die einer Nukleinsäuresequenz entspricht, durch direkte Markierung sind im folgenden angegeben.
Die erfindungsgemäße Methode ist geeignet zum Nachweis von Zielsequenzen, die einem Gen, einer Genfraktion oder jedem anderen Nukleinsäurefragment entsprechen können.
Die erfindungsgemäße Methode bietet den Vorteil, daß man eine Zielsequenz spezifisch in einer zu analysierenden Probe nachweisen und anschließend direkt an dieser Zielsequenz arbeiten kann.
Die erfindungsgemäße Methode ist auch insofern bemerkenswert, als sie besonders geeignet ist zum Nachweis von Nukleinsäurenzielsequenzen, die für ein Peptid oder ein Protein kodieren, das keine in vitro-identifizierbare Aktivität hat.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode wird die Präparierung des Nukleinsäuremoleküls des Schritts (a) durch in vitro-Amplifizierung der Nukleinsäurezielsequenz realisiert.
Es kann sich um eine Amplifikation durch PCR oder durch von PCR abgeleiteten Methoden vom Typ RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR oder anderen Methoden der PCR: NASBA oder Rolling Circle oder andere handeln.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode, die hiernach als Universalmethode bezeichnet wird, beruht der erste Schritt (a) der Methode auf der Durchführung einer Amplifikationsreaktion der Zielsequenz, wenn diese in der analysierten Probe vorhanden ist, mit Hilfe von zwei als Sense und Antisense bezeichneten Primern, die im folgenden definiert sind:

– ein Sense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der dem Abschnitt 5' der Zielsequenz entspricht,
– ein Antisense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der dem Abschnitt 3' der Zielsequenz entspricht, wobei die Primer nach der Amplifikation der Nukleinsäurezielsequenz und nach dem Schritt (b) die Expression des Reportergens ermöglichen.

Die Erfindung betrifft also auch einen Satz von Primern, der erfindungsgemäß im Schritt (a) einer erfindungsgemäßen Methode verwendet werden kann und dadurch gekennzeichnet ist, daß er umfaßt:

– einen Sense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der dem Abschnitt 5' der Zielsequenz entspricht,
– einen Antisense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der dem Abschnitt 3' der Zielsequenz entspricht,

In einer ersten besonderen Ausführungsweise der Universalmethode der Erfindung umfaßt der Schritt (a) die folgenden drei Reaktionen (1a):

a') die Amplifikation der Zielsequenz mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens entspricht, und
a'') die Inkontaktsetzung der Amplifikationsprodukte der vorhergehenden Reaktion mit dem Reportergen, das gegebenenfalls einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt, so daß diese Amplifikationsprodukte mit dem Reportergen hybridisieren, und schließlich
a''') die Amplifikation der Produkte von Schritt (a'') mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer dem von Schritt (a') ähnlich ist und der Antisense-Primer einen Teil umfaßt, der einem dem Reportergen nachgelagerten Abschnitt entspricht.

In dieser Ausführungsweise enthält das PCR-Reaktionsgemisch die DNA-Probe, zwei Primer, Sense und Antisense, die Reportersequenz und einen dritten Primer, der einem dem Reportergen nachgelagerten Abschnitt entspricht. Die erste Amplifikation des Schritts (a') und die zweite Amplifikation des Schritts (a''') können gleichzeitig oder ungleichzeitig realisiert werden. Wie die beigefügte 1a zeigt, ermöglichen die erste Zyklen der PCR1-Reaktion die Amplifikation der Zielsequenz. Nachdem dann diese Sequenz in genügender Menge im Reaktionsmilieu vorhanden ist, dient sie als Mega-Primer und hybridisiert sich an der Reportersequenz, die dann dank dem dritten Primer amplifiziert wird.
In einer zweiten Ausführungsform der Universalmethode der Erfindung weist der Schritt (a) die zwei folgenden Reaktionen auf (1b):

a') Amplifikation der Zielsequenz mit einem Primerpaar, dessen Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens entspricht, und
a'') Amplifikation der Produkte von Schritt (a') mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer dem vom Schritt (a') gleich ist und der Antisense-Primer ein Megaprimer ist, der aus dem Reportergen besteht, das gegebenenfalls einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt.

In dieser Ausführungsart besitzt der Antisense-Primer einen Abschnitt 5', der dem Anfang der Sequenz des Reportergens entspricht, die wie oben alle Informationen für ihre eigene Translation besitzt. Wie in der beigefügten 1b gezeigt, enthält die PCR-Reaktionsmischung die DNA-Probe, zwei Primer Sense und Antisense, und einen Megaprimer, der der Reportersequenz entspricht. Der Antisense-Primer ist in geringerer Menge als der Sense-Primer vorhanden. Die ersten Zyklen der PCR1-Reaktion ermöglichen die Amplifikation der Zielsequenz. Nachdem diese Sequenz dann im Reaktionsmilieu in genügender Menge vorhanden ist, wird sie mit Hilfe des Sense-Primers der PCR1 und des Megaprimers amplifiziert (PCR2).
In einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Universalmethode (1 c) umfaßt der Schritt (a) die Amplifikationsreaktion der Zielsequenz mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der eine kodierende Sequenz für eine ribosomale Bindungsstelle, ein Reportergen und gegebenenfalls einen Transkriptionsterminator umfaßt.
In dieser in der beigefügten 1c dargestellten Ausführungsform weist der Antisense-Primer einen für die Zielsequenz spezifischen Abschnitt 3' und einen Abschnitt 5', der einer für eine ribosomale Bindungsstelle kodierenden Sequenz entspricht, ein Reportergen und gegebenenfalls einen Transkriptionsterminator auf. Das PCR-Reaktionsgemisch enthält die DNA-Probe, zwei Primer Sense und Antisense.
Die Erfindung betrifft auch eine Mischung zur Markierung durch Amplifikation zur Realisierung der oben beschriebenen Ausführungsform. Ein solches Gemisch weist die zur Realisierung der Amplifikationszyklen notwendigen Reagenzien auf und daher besonders die vier Desoxynukleotid-Triphosphate, die Salze und Reagenzien, welche für die optimale Aktivität der DNA-Polymerase sorgen, sowie die verschiedenen oben beschriebenen Arten von Primern.
Ein Gemisch zur Markierung durch Amplifikation, das besonders geeignet ist zur Realisierung des Schritts (a) der ersten Ausführungsart der erfindungsgemäßen Universalmethode, umfaßt:

– ein Paar von Primern, dessen Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor aufweist und dessen Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens homolog ist,
– das Reportergen, das gegebenenfalls einen RNA-Polymerase-Terminator für seinen Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt, und
– einen dritten Primer, der einem der Reportergen nachgelagerten Abschnitt homolog ist.

Ein Gemisch zur Markierung durch Amplifikation, das besonders zur Realisierung des Schritts (a) der zweiten Ausführungsart der erfindungsgemäßen Universalmethode geeignet ist, umfaßt:

– ein Primerpaar, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens homolog ist, und
– einen Megaprimer, der aus dem Reportergen besteht, das gegebenenfalls einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt.

Ein Gemisch zur Markierung durch Amplifikation, das besonders geeignet ist zur Realisierung des Schritts (a) der dritten Ausführungsform der Universalmethode der Erfindung, weist ein Primerpaar, dessen Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promotor und dessen Antisense-Primer einen 5'-Abschnitt mit einer für eine ribosomale Bindungsstelle kodierenden Sequenz aufweist, ein Reportergen und gegebenenfalls einen Transkriptionsterminator auf.
Die Erfindung hat somit auch zum Gegenstand einen Kit zum Nachweis einer Nukleinsäurezielsequenz in einer Probe nach der oben beschriebenen Universalmethode.
Ein Kit zum Nachweis einer Nukleinsäurezielsequenz in einer Probe gemäß der Erfindung enthält einen oben definierten Satz von Primern, eine zur Amplifikation erforderliche Mischung, die Nukleotidtriphosphate, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, einen zellulären Translationsextrakt, die zur Transkription, zur Translation und gegebenenfalls zur Offenbarung des Reportermoleküls erforderlichen Gemische und gegebenenfalls eine oder mehrere Substanzen, welche die Aktivierung des Reportermoleküls ermöglichen, wobei die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem von der Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert ist.
Ein besonderes Beispiel eines erfindungsgemäßen Kits umfaßt außer einem der obigen Gemische zur Amplifikation eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, die Nukleotidtriphosphate und die Desoxynukleotidtriphosphate, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, einen zellulären Translationsextrakt, die zur Amplifikation, zur Transkription, zur Translation und gegebenenfalls zum Offenbaren des Reporterproteins erforderlichen Gemische und gegebenenfalls eine oder mehrere Substanzen, welche das Reportermolekül aktivieren.
Die erfindungsgemäße Methode auf dem Niveau des Schritts (a) kann auch auf der Basis der Eigenschaften von sogenannten „Padlock"-Sonden (1, 2, 3, 4, WO 97/19193) durchgeführt werden. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet zum Nachweis von Zielsequenzen, die eine punktuelle Mutation aufweisen.
Der Nachweis von Zielsequenzen unter Verwendung von „Padlock"-Sonden bildet daher eine Alternative zu den oben beschriebenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Universalmethode.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zum in vitro-Nachweis einer Nukleinsäurezielsequenz in einer Probe, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Präparation des Nukleinsäuremoleküls des Schritts (a) durch Hybridisierung und Ligation einer Sonde vom Typ Padlock mit der Nukleinsäurezielsequenz erfolgt, wenn diese in der Probe vorhanden ist.
Diese Sonde ist bei 3' und 5' aus Segmenten zusammengesetzt, die durch die Komplementärsequenz eines Reportergens getrennt sind, das die Komplementärsequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors und gegebenenfalls eines RNA-Polymerase-Terminators für seine in vitro-Transkription und die Komplementärsequenz einer ribosomalen Bindungsstelle für seine in vitro-Translation trägt, wobei die genannten Sequenzen der Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde Komplementäre der gesuchten Zielsequenz sind, so daß sie mit dieser ein Verbindungshybrid bilden, und das 5'-Ende der Sonde eine Phosphatgruppe aufweist, um die Zirkularisierung der Sonde unter der Wirkung einer Ligase zu ermöglichen. Man verwendet vorzugsweise eine Nick-Sealing-Ligase. So kann die Sonde bei Abwesenheit der Zielsequenz nicht zirkularisiert werden.
Diese Sonde kann auch an 5' und 3' aus Segmenten zusammengesetzt sein, die von 5' zu 3' durch die Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, einer ribosomalen Bindungsstelle und der Sequenz eines Reportergens mit gegebenenfalls einem RNA-Polymerase-Terminator getrennt sind.
Die 3'- und 5'-Segmente der Padlock-Sonde sind also so definiert, daß sie sich in komplementärer und an die gesuchte Zielsequenz bindender Weise hybridisieren, wie in der beigefügten 2a gezeigt.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Padlock-Sonde, die in einer obigen Methode verwendet werden kann, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde so definiert sind, daß sie sich in komplementärer und verbindender Weise mit einer Nukleinsäurezielsequenz hybridisieren, und wo die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Wie oben angegeben kann die auf der Verwendung einer Padlock-Sonde beruhende erfindungsgemäße Methode mit Vorteil verwendet werden zum in vitro-Nachweis einer Nukleinsäurezielsequenz, die eine Mutation trägt. In diesem Fall erfolgt die Präparierung des Nukleinsäuremoleküls des Schritts (a) durch Hybridisierung einer Sonde vom Typ Padlock mit der Zielsequenz, wenn diese vorhanden ist, wobei diese Sonde einer der zwei zuvor beschriebenen Sonden entspricht mit der folgenden Besonderheit: die Sequenzen der Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde sind Komplementärsequenzen der gesuchten Zielsequenz, so daß sie mit dieser ein Hybrid bilden, wo das kritische Nukleotid, das gegebenenfalls mutiert ist, sich an ihrem Verbindungspunkt befindet, wenn sie an der Zielsequenz hybridisiert sind.
Wenn also die erfindungsgemäße Methode angewandt wird, um das Vorhandensein einer Mutation auf dem Niveau einer Zielsequenz aufzuzeigen, wie in 2b gezeigt, sind die Abschnitte 3' und 5' der „Padlock"-Sonde so definiert, daß das kritische Nukleotid, das mutiert sein kann, sich an ihrem Verbindungspunkt befindet, wenn sie an der Zielsequenz hybridisiert sind. Im Fall von Fehlpaarung kann die Ligase die zwei Enden nicht verbinden und die Zirkularisierung der Sonde kann nicht stattfinden.
Die Erfindung betrifft also auch eine Padlock-Sonde, die in der obigen Methode verwendet werden kann und dadurch gekennzeichnet ist, daß die Sequenzen der genannten Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde komplementär zu einer Zielsequenz sind, die ein möglicherweise mutiertes Nukleotid trägt, so daß sie mit dieser ein Hybrid bilden, wo das genannte Nukleotid sich an ihrem Verbindungspunkt befindet, wenn sie an der Zielsequenz hybridisiert sind.
Vorteilhafterweise wird in der erfindungsgemäßen Methode, die auf der Verwendung einer Padlock-Sonde beruht, die Sonde nach der Zirkularisierung als Matrize für ihre Rolling-Circle-Replikation eingesetzt. Die Rolling-Circle-Replikation wird mit Hilfe eines zur Padlock-Sonde komplementären Primers realisiert, um die Replikation durch eine DNA-Polymerase zu initiieren, so daß eine DNA-Matrize hergestellt wird, die eine Verkettung von Reportergenen mit allen notwendigen Signalen für ihre in vitro-Expression aufweist, d. h. von 5' zu 3' eine Wiederholung des folgenden Elements (RNA-Polymerase-Promotor, der Bindungsstelle der Ribosomen, des Reportergens und gegebenenfalls des RNA-Polymerase-Terminators) oder je nach der gewählten Sonde das Komplement dieser Sequenz, worauf der komplementäre Strang dieser DNA-Matrize ausgehend von einem Oligonukleotid-Primer synthetisiert wird, um diese Matrize doppelsträngig zu machen.
Dieser Schritt der Präparation erhöht die Empfindlichkeit des Nachweises wegen der zahlreichen Kopien des Reportergens, die ausgehend von einem einzigen Zielmolekül produziert werden.
Eine ganz besondere Form der Ausführung der erfindungsgemäßen Methode, die auf den Padlock-Sonden beruht, besteht darin, im Schritt (b) direkt die Transkription des Reportergens auf die Padlock-Sonde nach deren Zirkularisierung zu bewirken und die Synthese des komplementären Stranges mit Hilfe eines Primers vorzunehmen, der komplementär zu der zum Ziel komplementären Padlock-Sonde ist.
Diese Ausführungsform umfaßt im Schritt (a) die Präparation einer den zuvor beschriebenen entsprechenden Padlock-Sonde, was entweder den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz oder den Nachweis einer Mutation an einer Nukleinsäuresequenz ermöglicht. Diese Padlock-Sonde wird so erzeugt, daß die direkte Transkription des Reportergens durch die RNA-Polymerase nur stattfinden kann, wenn die Padlock-Sonde zuvor nach ihrer Hybridisierung an der Nukleinsäurezielsequenz zirkularisiert wurde. In diesem Fall tritt keine Amplifizierung durch Rolling-Circle-Replikation ein, sondern nur die Synthese des komplementären Strangs der Padlock-Sonde mit Hilfe eines zu der zum Ziel komplementären Padlock-Sonde komplementären Primers und gegebenenfalls Ligation und dann direkte Transkription des Reportergens der Padlock-Sonde durch die RNA-Polymerase.
Die Erfindung betrifft auch Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methode, welche eine Padlock-Sonde verwenden.
Ein solcher Kit ist dadurch gekennzeichnet, daß er eine Sonde wie oben beschrieben, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine Nick-Sealing-Ligase, die Nukleotidtriphosphate und die Desoxynukleotidtriphosphate, einen Primer, um die Replikation zu initiieren, einen Primer, der die Synthese des zweiten DNA-Stranges ermöglicht, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die Mischungen, die zur Ligation, Replikation, Transkription, Translation und Offenbarung des Reportermoleküls notwendigen Mischungen, wo die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem Protein fusioniert ist, das durch die Nukleinsäurezielsequenz kodiert ist.
Ein erstes Beispiel des erfindungsgemäßen Kits umfaßt besonders:

– eine der zwei oben beschriebenen Padlock-Sonden. Die Sequenzen der Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde sind komplementär zur gesuchten Zielsequenz, so daß sie mit dieser eine Hybridverbindung bilden, und das Ende 5' der Sonde weist eine Phosphatgruppe auf, so daß die Zirkularisierung der Sonde unter der Wirkung einer Ligase ermöglicht wird.
– eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine Nick-Sealing-Ligase, die Nukleotidtriphosphate und Desoxynukleotidtriphosphate, einen Primer zum Anstoß der Rolling-Circle-Replikation, einen Primer, der die Synthese des zweiten Stranges der DNA-Matrize ermöglicht, die durch Rolling Circle erzeugt wurde, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die Mischungen, die zur Ligation, Markierung, Replikation, Transkription, Translation und Offenbarung des Reportermoleküls erforderlich sind.

Ein zweites Beispiel des erfindungsgemäßen Kits umfaßt besonders:

– eine der zwei oben beschriebenen Padlock-Sonden. Die Sequenzen der Abschnitte 3' und 5' der Padlock-Sonde sind komplementär zur gesuchten Zielsequenz, so daß sie mit dieser ein Hybrid bilden, wo das mutationsempfindliche kritische Nukleotid sich an ihrer Bindungsstelle befindet, wenn sie an der Zielsequenz hybridisiert sind, und das Ende 5' der Sonde eine Phosphatgruppe trägt, um die Zirkularisierung der Sonde unter der Wirkung einer Ligase zu ermöglichen.
– eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine Nick-Sealing-Ligase, die Desoxynukleotid-Triphosphate, die Nukleotidtriphosphate, einen Primer zum Initiieren der Rolling-Circle-Replikation, einen Primer, der die Synthese des zweiten Stranges der durch den Rolling Circle erzeugten DNA-Matrize ermöglicht, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die Mischungen, die zur Ligation, Markierung, Replikation, Transkription, Translation und zur Offenbarung des Reportermoleküls erforderlich sind.

Ein dritter Typ des zur Durchführung der obigen ganz besonderen Methode der Erfindung benutzt eine Padlock-Sonde, die umfaßt:

– eine der oben beschriebenen Padlock-Sonden, die entweder den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz oder den Nachweis einer Mutation an einer Nukleinsäuresequenz ermöglicht.
– eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine Ligase, die Desoxynukleotid-Triphosphate, die Nukleotidtriphosphate, einen Primer, um den komplementären Strang der zirkularisierten Padlock-Sonde zu synthetisieren, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die Mischungen, die erforderlich sind zur Ligation, Markierung, Replikation der DNA, Transkription und Translation und gegebenenfalls zur Offenbarung des Reportermoleküls und gegebenenfalls eine oder mehrere Substanzen, welche die Aktivierung des Reportermoleküls ermöglichen.

Die erfindungsgemäße Methode kann auch durchgeführt werden im Rahmen einer isothermischen Amplifikation, die auch als CIA („Continuous Isothermic Amplification") bezeichnet wird, von dem in der internationalen Patentanmeldung PCT Nr. WO96/01327 beschriebenen Typ.
Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode wird die gesuchte Nukleinsäurezielsequenz aus einer Probe der Nukleinsäure im Schritt (a) durch spezifische isothermische Amplifikation mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase und zwei für die Zielsequenz spezifischen Primern isoliert, von denen mindestens der eine aus einem Abschnitt 3' besteht, der sich spezifisch mit der Zielsequenz hybridisieren kann, und einem Abschnitt 5', der mindestens eine umgekehrt wiederholte Sequenz aufweist, um bei einer geeigneten Temperatur eine sogenannte Haarnadelstruktur auszubilden. Die Fusionstemperatur der doppelsträngigen Haarnadelstruktur ist vorzugsweise geringer oder gleich der Fusionstemperatur des sich spezifisch mit der Zielsequenz hybridisierenden Primerteils. Der Unterschied zwischen den zwei Fusionstemperaturen beträgt beispielsweise 10°C. Außerdem trägt einer der Primer die Transkription-Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, wie des Promotors der RNA-Polymerase des Phagen T7 und der andere Primer trägt ein Reportergen, das bei 5' eine ribosomale Bindungsstelle, aufweist.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung sei als Reportergen besonders genannt ein für eine Mikroperoxidase kodierendes Gen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weisen die zwei Primer eine umgekehrt wiederholte Sequenz auf, um bei einer adäquaten Temperatur eine Haarnadelstruktur auszubilden. Die umgekehrt wiederholten Sequenzen der zwei Primer können identisch oder verschieden sein. Es wird bevorzugt, daß sie verschieden sind, um eine Hybridisierung zwischen ihnen zu vermeiden.
Eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Methode, die auf einer isothermischen Amplifikation beruht, ist in der beigefügten 3 gezeigt. Unter den verschiedenen Primerpaaren, die in dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode verwendet werden können, sei besonders genannt das folgende, mit A bezeichnete Primerpaar:

– ein Sense-Primer, der von 5' nach 3' die umgekehrte komplementäre Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, die sogenannte RNA-Promotorsequenz und eine spezifische Sequenz aufweist, die sich der Zielsequenz vorgelagert hybridisieren kann,
– ein Antisense-Primer bestehend aus von 5' zu 3' einer ribosomalen Bindungsstelle, einem Reportergen, der umgekehrten komplementären Sequenz des Reportergens und der ribosomalen Bindungsstelle und einer spezifischen Sequenz, die sich der Zielsequenz nachgelagert hybridisieren kann, wobei mindestens einer der genannten Primer gegebenenfalls eine Restriktionsstelle aufweist.

Die Erfindung betrifft auch einen Satz von Primern, der in der obigen Methode verwendet werden kann und dadurch gekennzeichnet, daß er aufweist:

– einen Sense-Primer umfassend mindestens einen Teil, der dem Abschnitt 5' der Zielsequenz homolog ist,
– einen Antisense-Primer, umfassend mindestens einen Teil der dem Abschnitt 3' der Zielsequenz homolog ist,

wobei diese Primer nach der Amplifikation der Nukleinsäurezielsequenz und nach dem Schritt (b) die Expression eines Reportergens ermöglichen und mindestens einer der genannten Primer eine bei 5' umgekehrte wiederholte Sequenz aufweist.
Die isothermische Amplifikation wird mit dem folgenden Reaktionsmilieu durchgeführt:

– das Matrizen-Nukleinsäuremolekül, das die Zielsequenz aufweist,
– die vier Desoxynukleotid-Triphosphate,
– Salze und Reagenzien, die eine optimale Aktivität der DNA-Polymerase gewährleisten,
– eine DNA-abhängige DNA-Polymerase,
– ein Paar von Primern, die für die zu amplifizierende Zielsequenz spezifisch sind und die oben definierten umgekehrt wiederholten Sequenzen aufweisen.

Die DNA-abhängige DNA-Polymerase kann thermostabil oder mesophil sein. Vorteilhafterweise verwendet man eine mesophile DNA-Polymerase, die mit einer Strangverschiebungsaktivität ausgestattet ist, wie beispielsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. Coli. Die Zugabe dieser DNA-abhängigen DNA-Polymerase erfolgt zu Beginn der Reaktion und nach den zwei ersten Erwärmungsschritten, die zur Denaturierung der DNA erforderlich sind, bevor die isothermische Amplifikation durchgeführt wird.
Der Schritt (a) der erfindungsgemäße Methode besteht in folgendem: man erhitzt das obige Reaktionsgemisch, um die DNA-Stränge zu trennen, kühlt dann, um die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen und sie auf die adäquate Temperatur zu bringen, um die Verlängerung (Elongation) durch die DNA-Polymerase zu ermöglichen. Diese Schritte der Erwärmung, Hybridisierung und Verlängerung werden ein zweites Mal wiederholt, bevor man eine einsträngige Zielsequenz erhält, deren Enden aus umgekehrt wiederholten Sequenzen bestehen. Dieses rekombinante Nukleinsäuremolekül spielt gleichzeitig eine Rolle als Matrize und als Primer wegen seiner Haarnadelstruktur an jedem seiner Enden. Im Gegensatz zu dem, was man von PCR weiß, verläuft die Amplifikation hier spontan und bei konstanter Temperatur. Die Temperatur wird so gewählt, daß gewährleistet ist:

– das Gleichgewicht der umgekehrt wiederholten Sequenzen zwischen der Linear- und Haarnadelform,
– die Verlängerung der Primer durch die DNA-Polymerase.

Wie die beigefügte 3 zeigt, erreichen die Amplifizierungsprodukte rasch eine erhebliche Größe, was die Verlängerung begrenzen kann. Die Primer, welche die Größe des amplifizierten Fragments definieren, sind so gewählt, daß die Amplifikation der mit einem Reportergen verbundenen Zielsequenz optimiert wird.
Ein bevorzugter Ablauf des Schritts (a) der erfindungsgemäßen isothermischen Amplifikation ist wie folgt:

i) man erhitzt ein Reaktionsgemisch, das die Nukleinsäureprobe, in der die Zielsequenz eventuell vorhanden ist, die vier Desoxynukleotid-Triphosphate, Salze und Reagenzien, die eine optimale Aktivität der DNA-Polymerase gewährleisten, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, wenn diese thermophil ist (ansonsten iii), ein spezielles Primerpaar für die zu amplifizierende Zielsequenz mit den umgekehrt wiederholten Sequenzen zur Separierung der DNA-Stränge enthält, danach
ii) kühlt man ab, um die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen, und
iii) man fügt DNA-Polymerase hinzu, falls diese mesophil ist,
iv) man bringt das Reaktionsgemisch auf die für die Verlängerung durch die DNA-Polymerase adäquate Temperatur,
v) man wiederholt ein zweites Mal die Schritte Erwärmen (i), Hybridisierung (ii), Hinzufügung der DNA-Polymerase, wenn diese mesophil ist (iii) und Verlängerung
(iv), um eine Zielsequenz zu erhalten, deren Enden aus umgekehrt wiederholten Sequenzen bestehen,
vi) man läßt die Amplifikationsreaktion, bei der die Produkte der vorangehenden Schritte Matrize und Primer sind, bei konstanter Temperatur ablaufen, die so gewählt ist, daß gewährleistet ist:
– das Gleichgewicht der umgekehrt wiederholten Sequenzen zwischen der Linear- und Haarnadelform,
– die Verlängerung (Elongation) der Primer durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase.

Außerdem können die Amplifikationsprodukte durch ein Restriktionsenzym spezifisch geschnitten werden während oder nach der Amplifikationsreaktion der mit dem Reportergen des Schritts (a) verbundenen Zielsequenz. Die Restriktionsstelle liegt vorzugsweise auf der Höhe eines der Primer und vor allem vorzugsweise in einer Schleife einer Haarnadel, genauer in zwei umgekehrt wiederholten Sequenzen eines der Primer.
Die Wahl der Primer und der Schnittstelle des Enzyms wird definiert durch eine wirksame Transkription des Reportergens, so daß dieser Schnitt die spätere Transkription des Reportergens nicht verändert, wo die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen das mit einem durch die Nukleinsäurezielseguenz kodierten Protein fusioniert hat.
Im Fall des oben beschriebenen bevorzugten Primerpaars A kann die Schnittstelle an den zwei Primern liegen und dann an jedem dieser Primer identisch oder verschieden sein.
Die Erfindung hat daher auch zum Gegenstand einen Primersatz wie oben definiert, der in der vorangehenden Methode verwendet werden kann und dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens einer der zwei Primer eine Restriktionsstelle aufweist. Wenn die beiden eine Restriktionsstelle aufweisen, können diese identisch oder unterschiedlich sein.
Vorzugsweise liegt die auf mindestens einem Primer vorhandene Restriktionsstelle in einer Schleife einer Haarnadel, genauer zwischen zwei umgekehrt wiederholten Sequenzen eines der Primer.
Die Erfindung betrifft auch das Reaktionsgemisch zur Realisierung der obigen isothermischen Amplifikationsmethode mit den vier Desoxynukleotid-Triphosphaten, den Salzen und Reagenzien, welche eine optimale Aktivität der DNA-Polymerase gewährleisten, einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, einem spezifischen Primerpaar der zu amplifizierenden Zielsequenz mit bei 5' den umgekehrten wiederholten Sequenzen, welche die Reportersequenzen enthalten.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung der Methode des Nachweises einer Zielsequenz in einer DNA-Probe, wobei der Kit einen Primersatz wie oben definiert, ein Reaktionsgemisch für die Amplifikation, gegebenenfalls ein oder mehrere Restriktionsenzyme, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, und die für die Transkription, die Translation und die Offenbarung des Reportermoleküls erforderlichen Gemische enthält, wo die Transkription und die Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Außerhalb der oben beschriebenen spezifischen Beispiele für einen Kit, wo die Zielsubstanz eine Nukleinsäurezielsequenz ist, betrifft die Erfindung die Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methode unabhängig von der Zielsubstanz, wobei ein solcher Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens ein Reportergen, und die zur Transkription, Translation und Offenbarung des vom Reportergen kodierten Proteins notwendigen Gemische enthält. Es ist auch möglich, in einem einzigen Reagenzglas mehrere Nachweise nach der erfindungsgemäßen Methode zu kombinieren. In diesem Fall werden verschiedene Reporter verwendet, um jede der Zielsubstanzen nachzuweisen.
Es ist auch möglich, den gleichen Reporter für mehrere Zielsubstanzen zu verwenden. Ein positives Resultat zeigt dann nur die Gegenwart der einen oder anderen der Zielsubstanzen an.
Die Reaktion der Transkription und Translation (Schritt b) kann in zwei unterschiedene oder gleichzeitige Schritte zerlegt werden. Im letzteren Fall werden die Reaktionen der Transkription und Translation gleichzeitig realisiert. Dagegen ermöglicht die Trennung der Schritte eine leichtere Optimierung der Ausbeuten jedes Schritts und so die Gewinnung größerer Mengen des Reporterproteins, was vor allem nützlich ist im Fall von Enzymen mit geringer spezifischer Aktivität.
Die Entkoppelung zwischen der Transkription und Translation ermöglicht auch die Vermeidung von Problemen des Abbaus der DNA-Matrize durch die Nukleasen, wenn diese durch PCR gewonnen wurde. Die Komponenten der Transkriptionsreaktion sind wenig durch Nukleasen kontaminiert, im Gegensatz zu den Extrakten der Translation.
Im übrigen ermöglicht die Verwendung von je nach dem Ursprung des Reportergens verschiedenen zellulären Translationsextrakten die Optimierung der Translation. Die Translationsphase des Transkripts des Schritts (b) wird nämlich vorteilhafterweise mit einem zellulären Extrakt von gleichem Ursprung oder einem Ursprung nahe bei dem des Reportergens realisiert. Als Beispiel sei genannt die Verwendung eines Translationsextrakts, der ausgehend von Eukaryotenzellen gewonnen wurde, zur Translation eines eukaryotischen Reportergens. In einem anderen Fall der Figur wird der Translationsextrakt gewonnen aus extremophilen Organismen zur Translation eines Reportergens eines gleichen Organismus oder eines anderen extremophilen Organismus vom gleichen Typ (Thermophile, Halophile, Acidophile, usw.).
Diese spezifischen Extrakte ermöglichen die Verbesserung der Wirksamkeit der Translation. Diese kann jedoch auch mit einem Standardextrakt realisiert werden, wie beispielsweise ein Extrakt von E. coli.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist also insofern bemerkenswert, als es eine Annäherung zwischen der Punktuierung der Expression der verwendeten Transkripte und Translationsextrakte benutzt. Diese Extrakte sind auch dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder die gesuchte Eigenschaft nicht enthalten oder sie diese enthalten, die Eigenschaft jedoch unter den zum Nachweis der gesuchten Funktion realisierten Testbedingungen nicht nachweisbar ist. Es handelt sich beispielsweise um die Verwendung eines Translationsextraktes, der eine mesophile Beta-Galactosidase-Aktivität enthält, welche es ermöglicht, ein RNAm einer thermophilen Beta-Galactosidase zu translatieren und die Aktivität letzterer bei hoher Temperatur nachzuweisen, was die mesophile Beta-Galactosidase-Aktivität beseitigt.
Eine besondere Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, im Schritt (b) einen Translationsextrakt zu verwenden, der tatsächlich ein Gemisch mehrerer Translationsextrakte ist. Es handelt sich beispielsweise um den Translationsextrakt von E. coli, der ein Chaperonprotein A überexprimiert, im Gemisch mit einem Translationsextrakt von E. coli, der ein Chaperon B-Protein überexprimiert. Jede Art von Gemisch kann in Betracht gezogen werden, falls sie den oben beschriebenen Merkmalen entspricht. In gleicher Weise ist es möglich, einen Translationsextrakt zu verwenden, dem eine oder mehrere spezifische tRNAs eines oder mehrerer Kodone zugesetzt sind. Die so erhaltenen Translationsextrakte ermöglichen dann die Translation von mRNA mit spezifischen Kodonen, wie beispielsweise die Translation einer mRNA, die ein Amberkodon enthält, indem in den Translationsextrak ein tRNA-Suppressor zugefügt wird.
Die Behandlung des Schritts (b) mit einem Translationsextrakt kann auch mit einem Standardtranslationsextrakt realisiert werden, unabhängig vom Ursprung der Probe, wie beispielsweise ein Extrakt von E. coli und/oder jeder (alle) andere(n) zelluläre Extrakte) gegebenenfalls supplementiert durch interessante Moleküle, wie beispielsweise die oben angegebenen (tRNA, Chaperon).
Es ist auch möglich, dem Translationsextrakt des Schritts (b) eine oder mehrere Substanzen beizufügen, die eine wirksamere Faltung oder Reifung der exprimierten Proteine begünstigen, wie beispielsweise Chaperons, Detergenzien, Sulfobetaine, Membranextrakte usw.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Schritts (c) wird die Offenbarung der Aktivität des vom Reportergen kodierten Proteins, auch als „Reportermolekül" bezeichnet, dadurch realisiert, daß das Reportermolekül mit einem oder mehreren Substraten in Kontakt gebracht wird, welche seine Aktivität offenbaren können.
Der Fachmann kann jede Art von spezifischem Substrat in Betracht ziehen, um das Vorhandensein der Aktivität des vom Reportergen kodierten Proteins aufzuzeigen. Der Fachmann kann beispielsweise Werke wie Methods in Enzymology oder Annual Review Of Biochemistry heranziehen, worin eine große Zahl von Methoden der quantitativen Bestimmung von Enzymen und der Präparation von Substraten beschrieben sind.
Die Messung der Aktivität des Proteins des Schritts (c) kann durch direkte Ablesung in einem Fluorimeter erfolgen, wenn der Reporter beispielsweise das GFP ist, oder durch Kolorimetrie, wenn der Reporter beispielsweise die Beta-Lactamase ist. Die Ablesungen sind geeignet zur Offenbarung des Reporters. Man kann auch Messungen durch Absorption, Viskosität, Massenspektrometrie usw. vorsehen. Es ist auch vorstellbar, eine kontinuierliche Verfolgung der Aktivität des Reporters durch Ablesung zu realisieren, wenn letzterer sich dafür eignet.
Eine besondere Anwendungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die durch das Reportergen und die zu seiner Expression erforderlichen Sequenzen markierte Zielsubstanz beispielsweise einem Organismus oder in einem Verfahren zu verabreichen und dann durch Verfolgung der Schritte der Erfindung bis zum Schritt (c) der erfindungsgemäßen Methode in einer von dem Organismus oder in dem Verfahren abgenommenen Probe das vom Reportergen kodierte Protein zu suchen.
Die erfindungsgemäße Methode kann vorteilhafterweise automatisiert werden, besonders wenn es sich um eine hohe Anzahl von zu analysierenden Proben handelt. Die die Zielsubstanzen enthaltenden Proben werden dann auf einen Träger gebracht, der Biochips oder Mikrotitrationsplatten entsprechen kann, welche mehrere Dutzend bis mehrere tausend Plätze aufweisen. Diese Träger werden in einen Automaten gebracht für:

– die Präparation der Zielsubstanzen (Schritt a),
– die Zugabe von Transkriptions- und Translationsreagenzien (Schritt b),
– die Offenbarung des Reportermoleküls (Schritt c).

Infolgedessen betrifft die Erfindung eine Vorrichtung mit einer Ausbildung von einem oder mehreren Trägern, Robotern und einer Lesevorrichtung der Träger zur Realisierung der Schritte der oben beschriebenen Methode.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Markierung einer Substanz entsprechend dem Schritt (a) der oben beschriebenen Methode. Die Erfindung betrifft also auch eine durch ein Reportergen markierte Substanz und die zur in vitro-Expression des Reportergens erforderlichen Elemente, das durch dieses Markierungsverfahren erhalten werden kann, wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurezielsequenz ist, die Transkription und Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem von der Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung eines Reportergens und der zur in vitro-Expression dieses Reportergens notwendigen Elemente als Indikator einer Zielsubstanz, wo, wenn die Zielsubtanz eine Nukleinsäurezielsequenz ist, die Transkription und Translation des Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die Nukleinsäurezielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Die Erfindung wird mit weiteren Einzelheiten und Vorteilen erläutert durch die folgende Beschreibung von Ausführungsbeispielen.
Beispiel I: Markierung durch PCR und Nachweis

1) Das für die Mikroperoxidase 8 (MP8) kodierende Gen wurde im Expressionvektor pET26b+ kloniert. Dazu wurden zwei teilweise komplementäre Oligonukleotide MICRO1 und MICRO2 hybridisiert, die so ein doppelstrangiges DNA-Fragment mit vorstehenden Enden lieferten, die jeweils mit einer Nde1-Restriktionsstelle auf der Seite des ATG des Gens und mit einer XhoI-Stelle am anderen Ende kompatibel sind. Dieses DNA-Fragment wurde in den mit NdeI und XhoI digerierten Vektor pET26b+ inseriert. So enthält das erhaltene Plasmid das für die MP8 kodierende Gen unter Steuerung des Promotors der T7-RNA-Polymerase und seines Terminators, die auf der einen und anderen Seite liegen.
– Sequenz MICRO1
– Sequenz MICRO2
– doppelstrangiges DNA-Fragment
2) Dieses Plasmid diente anschließend als Matrize bei der folgenden PCR:

Plasmid: etwa 100 ng

Primer pET5': 10 pmol

Primer pET3': 10 pmol

Tagpol(Appligen): 2 U

DNTP: 200 μm jeder

Mix Tagpol Appligen: 1x

Die folgenden Amplifizierungszyklen wurden realisiert: 3 Minuten bei 94°, (30 Sekunden bei 94°, 30 Sekunden bei 60°, 1 Minute bei 72°) 30 Mal, 3 Minuten bei 72°.
Diese PCR ermöglicht die Amplifizierung eines Fragments, das von 5' zu 3' den Promotor der T7-RNA-Polymerase, die ribosomale Bindungsstelle, das MP8-Gen und den Terminator der Transkription der T7-RNA-Polymerase enthält. Das PCR-Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol gefällt.

3) Das Produkt der PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen transkribiert:

PCR-Produkt: 100 μg

T7-RNA-Polymerase (NEB): 300 U

Mix T7-RNA-Polymerase (NEB): 1x

MgCl₂: 20 mM

DTT : 20 mM

NTP : 2 mM je

3 Stunden bei 37°
4) Translationen wurden ausgehend von 0, 2,75 und 11 μg RNA unter den folgenden Bedingungen realisiert: 43,8 μl Translationsextrakt 0, 2,75 und 11 μg RNA (0, 2,75, 11 μg RNA) Wasser qsp 60 μl 3 Stunden bei 37°
5) Die Messung der Aktivität des Mikroenzyms wurde nach dem von Hirayama et al. beschriebenen Protokoll realisiert. Es wurden zwei Eichbereiche realisiert: einer in Gegenwart von 10 μl der Kontrolltranslation (ohne RNA) für die Punkte, wo man 10 μl Translation mißt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt, ausgedrückt in Einheiten Lumineszenz.

Tabelle 1
Der erhaltene Eichbereich ermöglicht die Abschätzung der bei 0,14 ng produzierten Menge MP8 mit einer Translation von 2,75 μg, was zeigt, daß dieses PCR-Produkt nach der erfindungsgemäßen Methode nachgewiesen werden kann.
Beispiel II: Nachweis einer Ziel-DNA durch Padlock und Rollin Circle

1) Es wurde das folgende Oligonukleotid präpariert:
2) Das als Ziel verwendete Plasmid enthält die folgende Sequenz:
Diese Sequenz wird durch die folgende Padlock-Sonde erkannt.
3) Die Ligationsreaktion wurde wie folgt realisiert:
Anschließend wurden die folgenden Temperaturzyklen realisiert: 3 Minuten bei 94°, (10 Sekunden bei 94°, 10 Sekunden bei 55°, 1 Minute 30 Sekunden bei 65°) 30 Mal.
4) Die Rolling-Circle-Amplifizierung wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt:
Das Oligonukleotid PADRCMP8 hat die folgende Sequenz: TTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC. Es ist komplementär zu einem Teil der Padlock-Sonde und dient daher als Primer für den Rolling Circle.
5) Synthese des komplementären Stranges. 50 pmol des Oligonukleotids PADPCRS' wurden zugesetzt sowie 5 mmol von dNTP. Dieses Oligonukleotid ist komplementär zum durch Rolling-Circle-amplifizierten Strang. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten auf 100°C erwärmt, dann abkühlen gelassen, um die Hybridisierung des Oligonukleotids im Rolling Circle zu ermöglichen. 5 U von Klenow-DNA-Polymerase und 5 U Restriktionsenzym Asel wurden anschließend zugesetzt. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C erhält man Doppelstrang-DNA-Moleküle. Eine Asel-Stelle war unmittelbar vorangehend der Promotorsequenz vorhanden, das Schneiden durch Asel ermöglicht die Multimeren zu verkürzen und begünstigt so die Transkription. Das Oligonukleotid PADPCRS' hat die folgende Sequenz: 5'TTCAGCAGGATTCCCCACAG.
6) Transkription Die Transkription des Produkts der Amplifizierung wurde unter den folgenden Bedingungen realisiert:

Produkt der obigen Reaktion: 10 μl

T7-RNA-Polymerase (NEB): 150 U

Mix T7-RNA-Polymerase (NEB): 1x

MgCl₂: 20 mM

DTT: 20 mM

NTP: 2 mM jeweils

12 Stunden bei 37°
7) Translation: Die Translation wurde wie im vorangehenden Beispiel realisiert.
8) Messung: Die Aktivitätsmessung des Mikroenzyms wurde an 10 μl der Translation nach dem von Hirayama et al. beschriebenen Protokoll vorgenommen (Hirayama O. et al., 1997, Analytical Biochem., 247, Seiten 237–241): die Negativkontrolle ist ein vollständiger Versuch, wo das Zielplasmid im Schritt 3 durch Wasser ersetzt war. Die Translation und die Messung wurden zweimal mit verschiedenen Reaktionsgemischen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben, ausgedrückt in Lumineszenz-Einheiten. Tabelle 2

BIBLIOGRAPHISCHEN REFERENZEN

1) Landegren, U., Samiotaki, M., Nilsson, M., Malmgren, H. and Kwiatkowski, M. (1996), Detecting genes with ligases. METHODS: A Compagnion to Methods in Enzymology 9, 84–90.
2) Landegren, U. and Nilsson M. (1997), Locked on target: strategies for future gene diagnostics. Ann. Med. 29, 585–590.
3) Nilsson, M., Malmgren, H., Samiotaki, Kwiatkowski, M., Chowdhary, B. P. and Landegren, U. (1994), Padlock Probes: Circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science 265, 2085–2088.
4) Nilsson, M., Krejc, K., Koch, J., Kwiatkowski, M., Gustavsson, P. and Landegren, U. (1997), Padlock probes reveal single-nucleotide differences, parent of origin and in situ distribution of centromeric sequences in human chromosomes 13 and 21. Nature Genetics 16, 252–255.

Claims

Methode zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß diese die folgenden Schritte umfaßt: a) die spezifische Markierung der besagten Substanz durch ein Reportergen und durch die zur In-vitro-Expression des besagten Reportergens notwendigen Sequenzen, b) die In-vitro-Transkription und -Translation des besagten Reportergens in ein azelluläres System, wobei davon ausgegangen wird, daß, wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurenzielsequenz ist, die Transkription und die Translation des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat, c) den In-vitro-Nachweis des durch das besagte Reportergen kodierten Reporterproteins.
Methode zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung von Schritt (a) darin besteht, die besagte markierte Substanz durch ein Reportergen zu erhalten, das mit einem RNA-Polymerase-Promoter und eventuell einem RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und einer ribosomalen Bindungsstelle für seine Translation versehen ist, so daß in Schritt (b), wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurenzielsequenz ist, die In-vitro-Transkription und – Translation des besagten Reportergens in ein azelluläres System nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Methode zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Transkripte vor der Translation amplifiziert werden.
Methode zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) die Zielsubstanz mit dem Reportergen und den zur In-vitro-Expression des besagten Reportergens notwendigen Elementen direkt verbunden wird.
Methode zum Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) die Zielsubstanz mit dem Reportergen und den zur In-vitro-Expression des besagten Reportergens notwendigen Elementen mittels eines spezifischen Liganden der Zielsubstanz verbunden wird, wobei der besagte Ligand durch ein Reportergen und die zur In-vitro-Expression des besagten Reportergens notwendigen Sequenzen markiert wird.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese die folgenden Schritte umfaßt: a) die Präparierung, ausgehend von der Probe, eines rekombinanten Nukleinsäurenmoleküls, das von 5' nach 3' einen RNA-Polymerase-Promoter, ein Reportergen mit den zu seiner Expression notwendigen Sequenzen und eventuell einen RNA-Polymerase-Terminator umfaßt, wobei die Nukleinsäurenzielsequenz zwischen zwei beliebigen dieser Elemente lokalisiert ist, b) die Transkription und die Translation des in Schritt (a) erzeugten rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei die In-vitro-Transkription und -Translation des besagten rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat, c) die Aktivierung des durch das Reportergen kodierten, als Reportermolekül bezeichneten Proteins, das in Schritt (b) durch jedwedes geeignete Mittel erzeugt wurde.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül von Schritt (a) durch In-vitro-Amplifikation der Nukleinsäurenzielsequenz präpariert wird.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül von Schritt (a) durch Amplifikation mit Hilfe von zwei Primern präpariert wird: – einem Sense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der Abschnitt 5' der Zielsequenz entspricht, – einem Antisense-Primer, der mindestens einen Teil enthält, der Abschnitt 3' der Zielsequenz entspricht, wobei die besagten Primer nach Amplifikation der Nukleinsäurenzielsequenz und nach Schritt (b) die Expression des Reportergens ermöglichen, um ein Reporterprotein zu erzeugen, das nicht mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) die drei folgenden Reaktionen umfaßt: a') die Amplifikation der Zielsequenz mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promoter und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens entspricht, und a'') die Inkontaktsetzung der Amplifikationsprodukte der vorhergehenden Reaktion mit dem Reportergen, das eventuell einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt, so daß die besagten Amplifikationsprodukte mit dem besagten Reportergen hybridisieren, und schließlich a''') die Amplifikation der Produkte von Schritt (a'') mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer dem von Schritt (a') ähnlich ist und der Antisense-Primer einen Teil umfaßt, der einem dem Reportergen nachgelagerten Abschnitt entspricht.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) die zwei folgenden Reaktionen umfaßt: a') die Amplifikation der Zielsequenz mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promoter und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der dem Anfang der Sequenz des Reportergens entspricht, und a'') die Amplifikation der Produkte von Schritt (a') mit einem Primerpaar, wobei der Sense-Primer dem von Schritt (a') gleich ist und der Antisense-Primer ein Mega-Primer ist, der aus dem Reportergen besteht, das eventuell einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt.
Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) die Amplifikationsreaktion der Zielsequenz mit einem Primerpaar umfaßt, wobei der Sense-Primer einen RNA-Polymerase-Promoter und der Antisense-Primer einen Abschnitt 5' trägt, der eine kodierende Sequenz für eine ribosomale Bindungsstelle, ein Reportergen und eventuell einen Transkriptionsterminator umfaßt.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparierung des Nukleinsäuremoleküls von Schritt (a) durch Hybridisierung und Ligation einer Sonde vom Typ Padlock mit der Nukleinsäurenzielsequenz erfolgt.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Padlock-Sonde bei 3' und 5' aus Segmenten zusammengesetzt ist, die durch die Komplementärsequenz eines Reportergens getrennt sind, das die Komplementärsequenzen eines RNA-Polymerase-Promoters und eventuell eines -Terminators für seine In-vitro-Transkription und die Komplementärsequenz einer ribosomalen Bindungsstelle für seine In-vitro-Translation trägt.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Padlock-Sonde bei 5' und 3' aus Segmenten, die von 5' nach 3' durch die Sequenz eines RNA-Polymerase-Promoters getrennt sind, einer ribosomalen Bindungsstelle und der Sequenz eines Reportergens mit eventuell einem RNA-Polymerase-Terminator zusammengesetzt ist.
Eine Padlock-Sonde, die bei einer Methode nach einem der Ansprüche 12 bis 14 eingesetzt werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Sonde bei 5' und 3' aus Komplementärsequenzen der Nukleinsäurenzielsequenz zusammengesetzt ist, um mit dieser ein Verbindungshybrid auszubilden, wobei die besagten Segmente durch die Komplementärsequenz eines Reportergens getrennt sind, das die Komplementärsequenzen eines RNA-Polymerase-Promoters und eventuell eines – Terminators für seine In-vitro-Transkription und die Komplementärsequenz einer ribosomalen Bindungsstelle für seine In-vitro-Translation trägt, damit die In-vitro-Trans kription und -Translation in ein azelluläres System des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Eine Padlock-Sonde, die bei einer Methode nach einem der Ansprüche 12 bis 14 eingesetzt werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Sonde bei 5' und 3' aus Komplementärsequenzen der Nukleinsäurenzielsequenz zusammengesetzt ist, um mit dieser ein Verbindungshybrid auszubilden, wobei die besagten Segmente durch die Sequenz eines RNA-Polymerase-Promoters, einer ribosomalen Bindungsstelle und der Sequenz eines Reportergens mit eventuell einem RNA-Polymerase-Terminator für seine In-vitro-Translation getrennt sind, damit die In-vitro-Transkription und -Translation in ein azelluläres System des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Eine Padlock-Sonde nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Segmente eine ein mutiertes Nukleotid tragende Nukleinsäurenzielsequenz ergänzen, um ein Hybrid auszubilden, bei dem sich der besagte mutierte Nukleotid am Verbindungspunkt der besagten hybridisierten Segmente auf der Nukleinsäurenzielsequenz befindet.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nach Zirkularisierung als Matrize für ihre Rolling-circle-Replikation eingesetzt wird.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Rolling-Circle-Replikation mit Hilfe eines die Padlock-Sonde ergänzenden Primers, die zielkomplementär sind, durchgeführt wird, um die Replikation durch eine DNA-Polymerase zwecks Herstellung einer DNA-Matrize anzustoßen, die verknüpfte Reportergene mit allen notwendigen Signalen für ihre In-vitro-Expression trägt, und dadurch, daß der Komplementärstrang dieser DNA-Matrize ausgehend von einem zweiten Oligonukleotid-Primer synthetisiert wird, so daß diese Matrize doppelstrangig wird.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkription des Reportergens auf die Padlock-Sonde nach ihrer Zirkularisierung und der Synthese des Komplementärstrangs mit Hilfe eines die Padlock-Sonde ergänzenden Primers, die zielkomplementär sind, direkt in Schritt (b) durchgeführt wird.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäurenzielsequenz von einer Nukleinsäurenprobe in Schritt (a) durch spezifische isothermische Amplifikation mit Hilfe einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase und zweier spezifischer Primern der Zielsequenz isoliert wird, von denen mindestens einer von einem Teil 3' gebildet wird, der spezifisch mit der Zielsequenz hybridisieren kann, und einem Teil 5', der mindestens eine umgekehrt wiederholte Sequenz umfaßt, um bei einer adäquaten Temperatur eine so genannte "Haarnadel"-Struktur auszubilden.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Primer eine umgekehrt wiederholte Sequenz tragen, um bei einer adäquaten Temperatur eine Haarnadel-Struktur auszubilden, wobei die beiden umgekehrt wiederholten Sequenzen identisch oder unterschiedlich sein können.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) der isothermischen Amplifikation die folgenden Schritte umfaßt: i.) man erhitzt ein Reaktionsgemisch, die Nukleinsäurenprobe umfassend, in der die Zielsequenz eventuell vorhanden ist, wobei die vier Deoxynukleotid-Triphosphate, Salze und Reagenzien eine optimale Aktivität der DNA-Polymerase gewährleisten, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, wenn diese thermophil ist (ansonsten iii), ein spezielles Primerpaar für die zu amplifizierende Zielsequenz mit den umgekehrt wiederholten Sequenzen zur Separierung der DNA-Stränge, danach ii.) führt man eine Abkühlung herbei, um die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen, und iii.) man fügt DNA-Polymerase hinzu, falls diese mesophil ist, danach iv.) setzt man das Reaktionsgemisch der der Elongation durch die DNA-Polymerase adäquaten Temperatur aus, v.) man wiederholt ein zweites Mal die Schritte Erhitzung (i), Hybridisierung (ii), Hinzufügung der DNA-Polymerase, sofern diese mesophil ist (iii), und Elongation (iv), um eine Zielsequenz zu erhalten, deren Enden aus umgekehrt wiederholten Sequenzen bestehen, vi.) man läßt die Amplifikationsreaktion ablaufen, bei der die Produkte des vorhergehenden Schritts Matrize und Primer sind, bei konstanter Temperatur, die so gewählt ist, daß gewährleistet ist: – das Gleichgewicht der umgekehrt wiederholten Sequenzen zwischen der Linear- und Haarnadelform, – die Elongation der Primer durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase.
Ein Primersatz zur Amplifikation einer Nukleinsäurenzielsequenz, der nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 21 bis 23 der Methode gemäß eingesetzt werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß dieser umfaßt: – einen Sense-Primer, umfassend mindestens einen Teil, der Abschnitt 5' der Zielsequenz entspricht, – einen Antisense-Primer, umfassend mindestens einen Teil, der Abschnitt 3' der Zielsequenz entspricht, wobei die besagten Primer so beschaffen sind, daß: – man nach Amplifikation der Nukleinsäurenzielsequenz ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül erhält, umfassend in Richtung 5' nach 3' einen RNA-Polymerase-Promoter, ein Reportergen mit den zu seiner In-vitro-Expression notwendigen Sequenzen und eventuell einen RNA-Polymerase-Terminator, und – die In-vitro-Transkription und -Translation des besagten Reportergens in ein azelluläres System nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Ein Primersatz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der besagten Primer eine bei 5' umgekehrt wiederholte Sequenz umfaßt.
Methode zum In-vitro-Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationsprodukte getrennt werden können, speziell durch ein Restriktionsenzym, während oder nach der Reaktion zur Amplifikation der Zielsequenz.
Ein Primersatz nach Anspruch 25, der nach Anspruch 26 der Methode gemäß eingesetzt werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der beiden Primer eine Restriktionsstelle umfaßt, und wenn beide eine Restriktionsstelle tragen, können diese identisch oder unterschiedlich sein.
Ein Primersatz nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sich die auf mindestens einem der Primer vorhandene Restriktionsstelle in einem Ring einer Haarnadel befindet, genauer zwischen zwei umgekehrt wiederholten Sequenzen einer der Primer.
Einsatz eines Reportergens und der zu seiner In-vitro-Expression in einem azellulären System notwendigen Elemente zur spezifischen Markierung einer in einer Probe enthaltenen Zielsubstanz, wobei die besagte Markierung so vonstatten geht, daß, wenn die Zielsequenz eine Nukleinsäurenzielsequenz ist, die Transkription und die Translation des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.
Ein Kit zur Durchführung der Methode zum Nachweis einer Zielsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses mindestens ein Reportergen umfaßt, die Mittel zur Verbindung des besagten Reportergens mit einer Zielsubstanz, wobei die besagten Mittel dergestalt sind, daß, wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurenzielsequenz ist, die Transkription und die Translation des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat, und die zur Transkription, Translation und Offenbarung des durch das Reportergen kodierten Reporterproteins notwendigen Mischungen.
Ein Kit nach Anspruch 30 zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß dieses einen Primersatz nach Anspruch 24 umfaßt, eine für die Amplifikation notwendige Mischung, die Nukleotid-Triphosphate, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase.
Ein Kit nach Anspruch 30 zur Durchführung einer Methode nach den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß dieses eine Sonde nach einem der Ansprüche 15 bis 17 umfaßt, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine Nick-sealing-Ligase, die Nukleotid-Triphosphate und die Deoxynukleotid-Triphosphate, einen Primer zum Anstoß der Replikation, einen Primer für die Synthese des zweiten DNA-Strangs, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die zur Ligation und zur Replikation notwendigen Mischungen.
Ein Kit nach Anspruch 30 zur Durchführung der Methode zum Nachweis einer Nukleinsäurenzielsequenz in einer Probe nach einem der Ansprüche 21 bis 23 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß dieses einen Primersatz nach einem der Ansprüche 25 oder 27 bis 28 umfaßt, ein Reaktionsgemisch zur Amplifikation, eventuell ein oder mehrere Restriktionsenzyme, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase.
Eine von einem Reportergen markierte Substanz und die zur In-vitro-Expression des besagten Reportergens notwendigen Elemente, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Gen einen RNA-Polymerase-Promoter und eventuell einen RNA-Polymerase-Terminator für seine Transkription und eine ribosomale Bindungsstelle für seine Translation trägt, so daß, wenn die Zielsubstanz eine Nukleinsäurenzielsequenz ist, die Transkription und die Translation des besagten Reportergens nicht zu einem Reporterprotein führen, das mit einem durch die besagte Nukleinsäurenzielsequenz kodierten Protein fusioniert hat.