DE60032760T2

DE60032760T2 - Methode zur markierung von materialien

Info

Publication number: DE60032760T2
Application number: DE60032760T
Authority: DE
Inventors: John Edward Lisvane MINTON; Robert Rhiwbina SLEAT
Original assignee: Trace Tag International Ltd
Current assignee: Trace Tag International Ltd
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: EP1171633A2; NO20014907L; ATE350487T1; HK1045175A1; ES2280205T5; US20150299694A1; US20120322669A1; NZ514679A; PT1171633E; EP1171633B2; WO2000061799A2; GB9908437D0; DK1171633T3; DE60032760T3; CA2368986C; ES2280205T3; NO20014907D0; WO2000061799A3; AU3830400A; EP1171633B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Markieren von Materialien und die Detektion einer solchen Markierung.
Es gibt ein weit verbreitetes Bedürfnis, in der Lage zu sein, den von einem gegebenen Material genommen Weg zu verfolgen, wenn sich dieses von einer Stelle zu einer anderen bewegt. Die Bewegung kann die von natürlichen Materialien sein (zum Beispiel, der Strömung von Wasser in Grundwasserspeichern) oder von Materialien, welche von Menschen bearbeitet oder hergestellt wurden (zum Beispiel, irgendein Artikel, der von einem Arbeiter in einem Herstellungsprozess konstruiert wurde oder natürliche Ressourcen, wie Getreide und Mineralien). In diesen Situationen kann es Gründe geben, warum es notwendig ist, spezifische Prozeduren zu entwickeln, um diese Bewegungen zu verfolgen. Es kann sein, dass eine direkte Beobachtung nicht möglich ist, wie beim Verfolgen des Weges eines unterirdischen Stromes. Es kann sein, dass es notwendig ist, die Bewegung von Waren zu überwachen, ohne die direkte Kenntnis der Transportierer oder, aus gesetzlichen Gründen, nachzuweisen, dass das Auftreten eines Materials an einer speziellen Stelle in der Biosphäre aufgrund des gleichen Ursprungsmaterials von einem bekannten Ausgangspunkt erfolgt.
Zum Beispiel können Herstellungsartikel durch einen skrupellosen Distributor beim Transit gestohlen oder zu einem viel geringeren Preis, als dieser vom Lieferanten festgesetzt wurde, wieder verkauft werden, zum Beispiel bei Kofferraumverkäufen. Ein Kernproblem zur Herbeiführung einer Verurteilung ist die Identifikation der speziell verkauften Artikel, um zu beweisen, dass die Waren von einem speziellen Distributor gestohlen und wiederverkauft wurden. Es treten auch Probleme mit Flüssigkeiten, wie Mineralöl, auf, welche routinemäßig von Frachtern ins Meer ausgewaschen werden. Es ist fast unmöglich, zu identifizieren, welcher Frachter das Öl entleert hat, und so sind Verfolgungen und Verurteilungen für die Verschmutzung der Meere kaum erfolgreich. Weitere Probleme sind verbunden mit der Bewegung natürlicher Materialien, zum Beispiel der Bewegung von Getreide. Es ist besonders schwierig, eine Charge solcher natürlichen Materialien von einer anderen zu unterscheiden. Im Falle von Getreide treten Probleme in der Europäischen Gemeinschaft dahingehend auf, wenn Getreide über mehrere unterschiedliche Grenzen bewegt wird, um eine Anzahl von EU-Subventionen für die gleiche Charge Getreide einzusammeln. Ein Verfahren zur Markierung des Getreides, welche ohne Weiteres detektiert werden kann, ist notwendig, um einen solchen Betrug zu verhindern.
Verschiedene Verfahren sind im Stand der Technik zum Markieren und Detektieren von Materialien bekannt, von denen viele Microtrace-Nukleinsäurekennungen, insbesondere Kennungen aus DNS nutzen. Nukleinsäuren können aufgrund der variablen Sequenz der Basen (Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin [Uracil im Falle von RNS, welches Thymin ersetzt]), die in dem Molekül enthalten sind, liefern. Wahrscheinlichkeitswerte können für die Häufigkeit einer gegebenen Sequenz von Basen berechnet werden, und, solange ausreichend Basen verwendet werden, das heißt, ein ausreichend großes DNS-Molekül als Markierung verwendet wird, kann dann für alle praktischen Zwecke eine einheitliche Mikrospur definiert werden. Durch Verwenden von Kombinationen universeller Sequenzen (akzeptiert als Industriestandards) und durch ein Variieren der Level spezifischer Sequenzen ist es möglich, den Typ eines gattungsmäßigen Produkts, die Herkunft des Produkts (firmenspezifische Sequenzen), die Partie oder Charge zu identifizieren und sogar ein Identifikationsmittel für eine Wirtschaftseinheit bereitzustellen.
Die frühere internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB91/00719 (veröffentlicht als WO91/17265) offenbarte ein Verfahren zum Überwachen der Bewegung eines Kohlenwasserstoffs durch die Hinzugabe einer mit Kohlenwasserstoff kompatiblen DNS als Mikrospur-Additiv. Die internationale Anmeldung Nr. PCT/GB93/01822 (Veröffentlicht als WO94/04918) offenbart ein Verfahren zum Markieren einer Flüssigkeit und nachfolgenden Detektieren, dass die Flüssigkeit markiert wurde, welches die Hinzugabe eines Additivs zu der Flüssigkeit umfasst. Das Additiv umfasst zwei oder mehr Typen von Teilchen, die für das bloße Auge nicht sichtbar sind, wobei jedes unterschiedliche Signalmittel hat oder Teile zwei oder mehr unterschiedliche Signalmittel haben. Die Signalmittel helfen bei der Detektion der Mikrotröpfchen. Eines der Signalmittel umfasst eine Nukleinsäure, während das andere Signal keine Nukleinsäuremarkierung ist. In jedem der obigen Verfahren wird dem Material die DNS Moleküle umfassende einheitliche Mikrospur hinzugegeben, wird das resultierende Material nach dessen Bewegung beprobt und wird das Vorhandensein des Mikrospuradditivs in der Probe detektiert, analysiert und dekodiert.
Die internationale Anmeldung Nr. PCT/GB94/01506 (veröffentlicht als WO95/02702) beschreibt ein Verfahren zum Markieren eines Feststoffartikels oder Gegenstands durch Hinzugabe eines Additivs mit für das bloße Auge nicht sichtbaren Mikrotröpfchen, die zwei oder mehr Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen und Kodierungsmittel, um die Identifikation zu unterstützen, einer Flüssigkeit hinzugegeben wird. Das Additiv kann entwe der zwei oder mehr Mikrotröpfchen umfassen, jeweils mit unterschiedlichen Signalmitteln, wobei wenigstens ein Mikrotröpfchen ein Kodiermittel aufweist, oder es kann ein Mikrotröpfchen mit zwei oder mehr unterschiedlichen Signalmitteln und wenigstens einem Kodiermittel umfassen. Die Kodiermittel und eines der Signalmittel umfassen eine Nukleinsäure und ein anderes der Signalmittel umfasst ein Nicht-Nukleinsäure-Signalmittel. Die das Additiv enthaltende Flüssigkeit wird dem Feststoff hinzugegeben und trocknen gelassen, um den Feststoff zu markieren. Nachfolgend werden Mikrotröpfchen mit Signalmitteln auf dem Feststoff detektiert, der Feststoff wird beprobt und die Kodiermittel dekodiert. Das Verfahren kann für die Verwendung beim Überwachen einer Interaktion zwischen irgendeinem Material, Artikel oder Gegenstand und einer Person oder Tier angepasst werden, indem eine Vorrichtung Verwendung findet, die so ausgelegt ist, dass sie ein Aerosol erzeugt, dass eine Flüssigkeit mit einem eine Mehrzahl von Mikrotröpfchen enthaltenen Additiv enthält.
Die internationale Anmeldung Nr. PCT/GB93/01822 (veröffentlicht als WO94/04918) offenbart ein Verfahren zum Markieren einer Flüssigkeit und nachfolgenden Erfassen, dass die Flüssigkeit markiert wurde. Das Verfahren umfasst: Hinzugeben zur Flüssigkeit eines Additivs mit einer Mehrzahl von Teilchen in einer Menge von nicht größer als 1 Gewichtsteil Teilchen pro 106 Gewichtsteile Flüssigkeit, wobei die Teilchen Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen, die in der Flüssigkeit für das bloße Auge nicht sichtbar sind; Beproben einer Position der das Additiv enthaltene Flüssigkeit und Detektieren des Vorhandenseins von Teilchen in der Flüssigkeit, mit der Vorsehung, dass das Signalmittel nicht nur aus einer Nukleinsäuremarkierung besteht.
In jedem der obigen Verfahren des Standes der Technik ist die offenbarte Mikrospur-Nukleinsäure oder DNS eine synthetische Nukleinsäure oder DNS mit einer variablen Region, die durch Regionen mit vorbestimmten Sequenzen flankiert ist. Die Sequenz der variablen Region verleiht jedem Mikrospur-Nukleinsäure- oder DNS-Molekül eine einzigartige, charakteristische Identität, wohingegen die vorbestimmten Sequenzen für alle Markierungen gemeinsam vorliegen. Die vorbestimmten Sequenzen werden durch Primer für die Verstärkung durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erkannt und werden für die nachfolgende Sequenzbildung verwendet. Auf diese Weise wird, um die Identität der variablen Region in der Mikrospur-Nukleinsäure oder DNS zu bestimmen, die variable Region unter Verwendung von Primern verstärkt, die komplementär zu den Flankenregionen mit vorbestimmten Sequenzen sind. Die variable Region wird dann unter Verwendung der gleichen Primer sequenziert, um die Sequenz der variablen Region und somit die Identität der Markierung zu bestimmen. Alternativ kann die Sequenzbildung von einer Sequenzier-Primerregion initiiert werden, die in der Markierung zwischen einer Flankenregion und der variablen Region eingebaut ist. Da jede Sequenzier-Primerregion eine für eine spezielle Markierung einzigartige Sequenz haben kann, erlaubt dies die Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Säure- oder DNS-Markierungen, um das Material zu markieren.
Obwohl die oben beschriebenen Prozeduren wirksam sind, liefern die Verfahren des Standes der Technik im Wesentlichen nur eine „JA/NEIN" Antwort. Mit anderen Worten, sie sind in der Lage, zu bestimmen, ob eine spezielle Probe eine Nukleinsäuremarkierung enthält und was die Identität der Markierung ist. Soweit uns bekannt ist, hat jedoch niemand bisher daran gedacht, dass es wünschenswert sein kann, die Menge einer in einem markierten Material vorhandenen Markierung zu bestimmen. Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren betrafen nur die Markierung, Detektion und Identifikation von Markierungen, ohne eine Angabe zu liefern, wie viel von einer Nukleinsäuremarkierung in der Probe vorhanden ist.
Wir haben nun herausgefunden, dass es sehr vorteilhaft sein kann, zu bestimmen, wie viel eines Markers oder einer Markierung in einem markierten Material vorhanden ist. Wir haben erkannt, dass die Menge einer Markierung in einem Material verwertbare Rückschlüsse zu der Historie und zu Bewegungen des Materials geben kann.
Zum Beispiel durch Messen der tatsächlichen Menge einer Markierung in einem Material und durch Vergleichen derselben mit der anfänglich für die Markierung des Materials verwendeten Menge ist es möglich, eine Aussage zu treffen, ob ein Verbraucher (ob nun absichtlich oder unabsichtlich) das Material verdünnt hat. Die Menge einer Markierung in dem Material kann auch anzeigen, ob eine Verunreinigung stattgefunden hat, und es kann dann die geeignete Aktion durchgeführt werden. Ein Bestimmen der Menge eines speziellen Markers ist also nützlich, wenn es mehrere Quellen einer Umweltverschmutzung gibt. In diesem Fall können verschiedene verdächtige Quellen für eine Verunreinigung, zum Beispiel Material an verschiedenen Fabriken oder Anlagen, mit verschiedenen Markierungen markiert werden. Eine Probe wird von dem verunreinigten Abwasserstrom genommen, und das Vorhandensein jedes der verschiedenen Markierungen kann detektiert werden, um festzustellen, ob die Verunreinigung durch eine spezielle Firma verursacht wurde. Wichtig ist, dass durch Messen der relativen Konzentrationen jeder Markierung in dem Abwasserstrom eine Information über den relativen Beitrag jeder Quelle zu der Umweltverschmutzung geliefert wird. Geeignete Strafen können dann durch die Autoritäten gegenüber dem verschmutzenden Fabriken oder Anlagen in Kenntnis des Anteils jedes Unternehmens oder jeder Anlage an der Verschmutzung verhängt werden.
Ein Verfahren zum Markieren eines Materials und die nachfolgende Detektion, die eine Angabe der Menge des in dem Material vorhanden Markers liefert, ist daher von Wert, und dies wurde auf dem Gebiet bisher nicht bedacht.
Es wird auch deutlich sein, dass mit den Techniken des Standes der Technik einhergehende Probleme vorliegen. Insbesondere sind für die Detektion des Markers in der Probe mehrere Schritte nötig. Ganz zuerst müssen PCR-Reaktionen durchgeführt werden, um die Mikrospur-DNS-Markierung zu verstärken. Um zu bestimmen, ob die Reaktionen erfolgreich sind, und um die Reaktionsprodukte von den Primer-Dimers, nicht eingebauten Primers und Nukleotiden zu lösen, können dann die Reaktionsprodukte zum Beispiel einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ausgesetzt werden. Die Reaktionsprodukte werden dann von dem Gel entfernt und die verstärkte DNS von den Gelfragmenten gereinigt. Die gereinigte DNS wird dann einem Sequenzierungszyklus ausgesetzt, um die Sequenz der variablen Regionen zu bestimmen. Schließlich muss die Sequenz interpretiert werden und mit einer bekannten Datenbank verglichen werden, um die Identität der verwendeten Markierung zu bestimmen. Die vielen Schritte, die in der Detektionsphase der Verfahren des Standes der Technik enthalten sind, machen die Prozedur langatmig, zeitraubend und arbeitsintensiv und daher teuer durchzuführen.
Darüber hinaus sollte für eine adäquate Separierung der PCR-Reaktionsprodukte von Primer-Dimers, nicht eingebauten Primers und Deoxynukleotiden die Länge der verstärkten DNS relativ lang sein. Im Allgemeinen zeigt die Erfahrung, dass die verstärkte DNS größer als 200 Basenpaare lang sein sollte, um unter Verwendung eines normalen Trennungsgels eine gute Separierung zu erhalten. Die Notwenigkeit eines relativ langen Verstärkungsprodukts für eine gute Separierung muss im Ausgleich stehen zu den Kosten und der mit dem Bezeichnen und Synthetisieren langer (> 100 Nukleotide lang) Oligonukleotide für die Verwendung als Markierung innewohnenden Schwierigkeit. Deshalb ist es, obwohl es effizienter und weniger teuer ist, kleinere Markierungen zu Synthetisieren, entsprechend schwieriger, diese kleinen Markierungen von Verstärkungsartefakten, die der PCR folgen, zu unterscheiden.
Deshalb gibt es auch ein unerfülltes Bedürfnis nach einem Verfahren zum Markieren eines Materials und der nachfolgenden Detektion, welches weniger Schritte umfasst und welches relativ kurze Oligonukleotide als Markierungen nutzt.
Wir liefem in Übereinstimmung mit einem ersten Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Detektieren, ob eines aus einer Mehrzahl von Materialien durch einen Marker mit einer Nukleinsäuremarkierung markiert wurde, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Beproben eines Teils des Materials; und (b) Detektieren des Vorhandenseins der Nukleinsäuremarkierung in der Probe, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Menge der in dem Material vorhandenen Nukleinsäuremarkierung bestimmt wird, um einen Hinweis auf die Menge des in dem Material vorhandenen Markers zu liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren auch den früheren Schritt umfassen: Hinzufügen oder Aufbringen eines Markers mit einer Nukleinsäuremarkierung auf dem Material.
Die Nukleinsäuremarkierung wird vorzugsweise verstärkt mithilfe einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion. Die Menge einer in einer Probe vorhanden Nukleinsäuremarkierung wird vorzugsweise bestimmt durch Messen des Verstärkungsbetrages, der möglich wird, damit die Menge der verstärkten Nukleinsäure ein vorbestimmtes Niveau erreicht. Die Menge der verstärkten Nukleinsäure in einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion kann auf einer Anzahl von Wegen bestimmt werden. Das tatsächliche Mittel, mit welchem die Menge der verstärkten Nukleinsäure bestimmt wird, ist nicht wichtig, obwohl wir hier eine Anzahl von bevorzugten Wegen beschreiben werden, durch welche die Menge gemessen werden kann. Es ist klar, dass je mehr Nukleinsäuremarkierung anfänglich in einer Probe vorhanden ist, desto weniger Verstärkung benötigt wird, um ein spezielles vorbestimmtes Niveau der verstärkten Nukleinsäure zu erreichen. Es ist deshalb möglich, das Detektionssystem unter Verwendung bekannter anfänglicher Mengen von Nukleinsäuremarkierungen in einer Reihe von Testreaktionen zu kalibrieren. Die Kinetik der Ansammlung verstärkter Nukleinsäure in einer Reaktion kann dann gemessen werden und mit der der Testreaktionen verglichen werden. Dies ermöglicht einem, zu bestimmen, wie viel Nukleinsäuremarkierung in einer Testprobe vorhanden ist, und somit, wie viel Nukleinsäure in dem markierten Material vorhanden ist. Verschiedene Verfahren zur Nukleinsäureverstärkung sind bekannt, zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion, TMA und NASBA, etc, und diese Verfahren können für die Verstärkung von Nukleinsäuremarkierungen in den Verfahren gemäß den verschiedenen Aspekten der Erfindung verwendet werden. Die Nukleinsäureverstärkungsreaktion, die bevorzugt verwendet wird, ist jedoch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Wie beabsichtigen, dass die hier beschriebenen Verfahren in geeigneter Weise mit verschie denen Ausführungsformen einer Nukleinsäuremarkierung verwendet werden, von denen jede wenigstens eine identifizierende Sequenz für die Markierung enthält. Wenn wir in dieser Anmeldung auf eine „Identifizierungsequenz" Bezug nehmen, meinen wir eine Anordnung von Nukleotiden mit einer speziellen Sequenz, wobei die Sequenz ermöglicht, dass die Identität der Nukleinsäuremarkierung, in welcher sie vorhanden ist, bestimmt werden kann. Ein Pool von Nukleinsäuremarkierungen kann somit erzeugt werden, von denen jede ein oder mehrere unterschiedliche Identifizierungssequenzen hat. Der Rest jeder Markierung in dem Pool (mit anderen Worten, Regionen, die die Identifizierungs-Sequenz oder- Sequenzen nicht enthalten) können Sequenzen haben, die allen Nukleinsäuremarkierungen in dem Pool gemein sind. Nachdem ein Material durch eine Markierung aus dem Pool markiert worden ist, kann eine Probe des Materials genommen werden. Das Detektieren des Vorhandenseins einer speziellen Identifizierungsregion in der Probe liefert deshalb einen direkten Hinweis auf die Identität der Nukleinsäuremarkierung, die zum Markieren des Materials verwendet wird.
In den Detektionsverfahren wird die Nukleinsäuremarkierung mit zwei Oligonukleotid-Primern in einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion in Kontakt gebracht. Eine erste Ausführungsform der Nukleinsäuremarkierung (hier als eine Typ I Markierung bezeichnet) enthält nur eine Identifizierungssequenz und nur einer der Oligonukleotid-Primer hat eine Sequenz, welche dieser Identifizierungssequenz entspricht. In einer weiteren Ausführungsform der Nukleinsäuremarkierung (als Typ II Markierung bezeichnet) sind zwei Identifizierungssequenzen vorhanden und beide Oligonukleotid-Primer haben Sequenzen, die den jeweiligen Identifizierungssequenzen entsprechen. Mit anderen Worten, es kann gesagt werden, dass eine Typ II Markierung unter Verwendung von Primern auf ihre Identifzierungssequenzen verstärkt wird. In einer anderen alternativen Ausführungsform der Markierung, welche wir als Typ III Markierung bezeichnen, ist nur eine Identifizierungssequenz vorhanden, welche durch Primerregionen flankiert ist, und keiner der Oligonukleotid-Primer hat eine Sequenz, die der Identifizierungssequenz entspricht.
Die Nukleinsäuremarkierung kann deshalb als mit dem ersten Oligonukleotid-Primer in Kontakt gebracht angesehen werden, der in der Lage ist, eine Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung auszulösen und eine Sequenz hat, die einer ersten Sequenz entspricht, die in der Nukleinsäuremarkierung enthalten ist. In einer ersten Ausführungsform einer Nukleinsäuremarkierung (Typ I) ist die erste Sequenz die gleiche Sequenz wie die Identifizierungssequenz, und der erste Oligonukleotid-Primer hat deshalb eine Sequenz, die der Identifizierungssequenz entspricht. Der andere Oligonukleotid-Primer in der Verstärkungsreaktion kann einer anderen Sequenz in der Nukleinsäuremarkierung entsprechen. Es ist nur notwen dig, dass einer der Oligonukleotid-Primer in der Lage ist, von der Identifizierungssequenz zu starten, so dass das Vorhandensein der Nukleinsäureverstärkung anzeigt, dass die Identifizierungssequenz vorhanden ist und somit ein Hinweis auf die Identität der Nukleinsäuremarkierung liefert.
In einer Typ II Markierung umfasst die Nukleinsäuremarkierung auch eine zweite Identifizierungssequenz, wobei in diesem Fall die Nukleinsäuremarkierung in der Verstärkungsreaktion weiter mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer mit einer Sequenz entsprechend der zweiten Identifizierungssequenz in Kontakt gebracht wird. Das erste Oligonukleotid kann eine Sequenz haben, die aus der ersten Identifizierungssequenz besteht, und das zweite Oligonukleotid kann eine Sequenz haben, die der zweiten Identifizierungssequenz komplementär ist. Alternativ hat das erste Oligonukleotid eine Sequenz komplementär zur ersten Identifizierungssequenz und hat das zweite Oligonukleotid eine Sequenz bestehend aus der zweiten Identifizierungssequenz. Die zwei Identifizierungssequenzen können aneinander angrenzen oder ihre eingreifenden Sequenzen flankieren. In dieser Ausführungsform findet die Verstärkung bei Vorhandensein von zwei Oligonukleotid-Primern statt, und beide Primer müssen in der Lage sein, sich während der Verstärkungsreaktion zu verbinden, damit eine erfolgreiche Verstärkung stattfindet. Die zwei Identifizierungssequenzen in einer Typ II Markierung kann identische Sequenzen haben oder sie können verschiedene Sequenzen haben. Die letztere Anordnung erlaubt, dass eine größere Anzahl von Permutationen einzelnergetrennter Nukleinsäuremarkierungen erzeugt wird.
Es wird klar, dass dort, wo eine Verstärkungsreaktion mit wenigstens einem Oligonukleotid-Primer entsprechend einer Identifizierungssequenz oder Sequenzen einer Typ I oder Typ II Nukleinsäuremarkierung durchgeführt wird, die Spezifizität der Verstärkungsreaktion im Wesentlichen auf dem verwendeten speziellen Oligonukleotid-Primer oder solchen Primern beruht. Falls eine Verstärkung stattfindet, bedeutet dies, dass der oder die Oligonukleotid-Primer eine komplementäre Identifizierungssequenz in der Nukleinsäuremarkierung erkannt hat/haben. Dagegen zeigt das Nichtvorhanden einer Verstärkung an, dass die spezielle Identifizierungssequenz in der in der Probe vorhandenen Markierung nicht vorhanden ist. Dies ermöglicht, dass die Identität einer unbekannten Nukleinsäuremarkierung leicht bestimmt werden kann, indem eine Reihe von Nukleinsäure-Verstärkungsmedien mit verschiedenen Primern vorbereitet werden und erfasst wird, welches der Verstärkungsmedien zu einer erfolgreichen Verstärkung führt. Es wird klar, dass die Verfahren unter Verwendung der obigen Ausführungsformen von Nukleinsäuremarkierungen erlauben, dass eine „einstufige" Prozedur durchgeführt werden kann, in welcher die Detektion, Identifikation und Quantifi zierung der Nukleinsäuremarkierung in einer Reaktion stattfindet. Das Vorhandensein einer Verstärkung zeigt an, dass eine Nukleinsäuremarkierung in der Probe vorhanden ist und gibt einen Hinweis auf die Identität der Nukleinsäuremarkierung, die zur Markierung des Materials verwendet wurde. Gleichzeitig kann die Menge einer verstärkten Nukleinsäure gemessen werden, um einen Hinweis auf die Menge der in der Probe vorhanden Nukleinsäuremarkierung und somit des Materials zu geben. Es gibt deshalb kein Erfordernis einer weiteren Reinigung einer verstärkten Markierung und einer nachfolgenden Sequenzierung, um die Identität zu bestimmen. Die in der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremarkierungen können somit viel kürzer sein als solche, die vorher verwendet wurden.
Es ist hier auch ein Verfahren zum Markieren eines Materials und zum nachfolgenden Detektieren, dass dieses markiert worden ist, offenbart, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Hinzufügen oder Aufbringen eines Markers mit einer Nukleinsäuremarkierung auf das Material, wobei die Nukleinsäuremarkierung wenigstens eine Identifizierungssequenz für die Markierung umfasst; (b) Beproben eines Teils des Materials mit einem solchen Marker und optional Trennen der Nukleinsäuremarkierung von der Probe; (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mittels einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche das In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz der Nukleinsäuremarkierung umfasst; und (d) Detektieren einer Verstärkung der Nukleinsäure als einen Hinweis auf das Vorhandensein eines Markers in der Probe und somit, dass das Material markiert worden ist.
Es ist hier auch offenbart ein Verfahren zum Detektieren, ob ein Material durch einen Marker mit einer speziellen Nukleinsäuremarkierung markiert worden ist, wobei die Nukleinsäuremarkierung wenigstens eine Identifizierungssequenz für die Markierung aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Beproben eines Teils des Materials und optional Trennen einer vorhanden Nukleinsäuremarkierung von der Probe; (b) Verstärken einer in der Probe vorhandenen Nukleinsäuremarkierung mittels einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche das In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz der Nukleinsäuremarkierung umfasst; (c) Detektieren einer Verstärkung der Nukleinsäure als einen Hinweise des Vorhandenseins der speziellen Nukleinsäuremarkierung in der Probe und somit, dass das Material durch einen Marker mit der Markierung markiert worden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäuremarkierung wenigstens eine Identifizierungssequenz für die Markierung, und das Verfahren umfasst zudem die Schritte (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mittels einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche das In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit dem ersten Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz der Nukleinsäuremarkierung umfasst; und (d) Bestimmen des Verstärkungsgrades, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäure das vorbestimmte Niveau als Hinweis auf eine in der Probe vorhandene Menge des Markers erreicht.
In günstiger Weise umfasst das Verfahren zudem die Schritte: (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mittels einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche das In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz der Nukleinsäuremarkierung umfasst; und (d) Bestimmen des Verstärkungsgrades, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäure ein vorbestimmtes Niveau als einen Hinweis auf die in der Probe vorhandene Menge eines Markers und somit der Menge eines Markers in dem Material erreicht.
Eine dritte Ausführungsform der Nukleinsäuremarkierung (Typ III) hat eine Identifizierungssequenz, welche durch eine erste und zweite Region der Nukleinsäuremarkierung mit den Primerstellen für die Nukleinsäureverstärkung flankiert ist. Die Markierung des Typs III wird deshalb in einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion verstärkt, indem diese in Kontakt mit einem ersten Oligonukleotid-Primer mit einer Sequenz gebracht wird, welche nicht der Identifizierungssequenz der Markierung entspricht. Der andere Oligonukleotid-Primer in der Verstärkungsreaktion hat eine Sequenz, welche nicht der Identifizierungssequenz entspricht. Auf diese Weise hat das erste Oligonukleotid eine Sequenz, welche einer in entweder der ersten oder zweiten Region enthaltenen Sequenz entspricht, und enthält das zweite Oligonukleotid eine Sequenz, die einer Sequenz in jeweils der anderen der ersten und zweiten Region der Markierung entspricht.
In dieser Ausführungsform kann ein Pool von Nukleinsäuren mit einer ersten und zweiten Region erzeugt werden, die in allen Markierungen im Pool vorhanden sind, aber mit einer Identifizierungssequenz, die sich von jedem Mitglied des Pools unterscheidet. Die Nukleinsäureverstärkung kann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern mit „generischen" Sequenzen durchgeführt werden, welche sich zu Sequenzen in der ersten und zweiten Region der Markierung verbinden. Die Detektion der Identifizierungssequenz und die Quantifizierung der verstärkten Nukleinsäure kann modernerweise mit der Verstärkung oder anschließend stattfinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Markieren eines Materials und das nachfolgende Detektieren, dass dieses markiert wurde, bereitgestellt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses einen Hinweis auf die Menge eines in dem Material vorhandenen Markers liefert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Hinzugeben oder Auftragen eines Markers mit einer Nukleinsäuremarkierung auf das Material, wobei die Nukleinsäuremarkierung eine erste und eine zweite Region umfasst, die eine Identifizierungssequenz für die Markierung flankieren; (b) Beproben eines Teils des Materials mit einem solchen Marker und optionales Trennen der Nukleinsäuremarkierung von der Probe; (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mittels einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche das In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der ersten Region der Nukleinsäuremarkierung umfasst; und (d) Bestimmen des Verstärkungsgrades, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäure ein vorbestimmtes Niveau als einen Hinweis auf die Menge eines in der Probe vorhandenen Markers erreicht. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Markieren eines Materials und das nachfolgende Detektieren, dass dieses markiert worden ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Hinzufügen oder Auftragen eines Markers mit einer Nukleinsäuremarkierung auf das Material, wobei die Nukleinsäuremarkierung eine erste und eine zweite Region umfasst, die eine Identifizierungssequenz für die Markierung flankieren; (b) Beproben eines Teils des Materials mit einem solchen Marker und optionales Trennen der Nukleinsäuremarkierung von der Probe; (c) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer mit einer Sequenz entsprechend einer Sequenz, die in der ersten Region der Nukleinsäuremarkierung enthalten ist, und mit einem Oligonukleotid-Fühler, der ein Signalmittel trägt und eine Sequenz entsprechend einer identifizierungssequenz aufweist; (d) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, welche eine Nukleinsäure-Polymerase mit 5' bis 3' Exonuklease-Aktivität enthält, in welcher Fragmente, die Signalmittel tragen, von dem Oligonukleotid-Fühler während der Nukleinsäureverstärkung freigesetzt werden; und (e) Detektieren freigesetzter Fragmente als einen Hinweis, dass eine Verstärkung stattgefunden hat und somit, dass das Material markiert wurde, wobei die Menge der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuremarkierung bestimmt wird, um einen Hinweis auf die Menge des in der Probe vorhandenen Markers zu liefern. Vorzugsweise wird die Nukleinsäuremarkierung mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer in Kontakt gebracht, der in der Lage ist, die Verstärkung der Markierung zu starten, und eine Sequenz hat, die einer Sequenz entspricht, die in der zweiten Region enthalten ist. Zusätzlich zum Aufweisen von Signalmitteln, welches vorugsweise ein fluoreszierendes Label ist, trägt der Oligonukleotid-Fühler vorzugsweise auch ein Löschmittel, um ein Signal von den Signalmitteln zu dämpfen. Eine solche Dämpfung ist vorzugsweise ein Ergebnis einer Förster-Resonanzenergieübertragung durch den Raum. Ein detektierbares Signal von einem freigesetzten Fragment befindet sich vorzugsweise auf einem wesentlich höheren Niveau als ein von dem Oligonukleotid-Fühler detektierbares Signal.
In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Markieren eines Materials mit einer Nukleinsäuremarkierung bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuremarkierungen, wobei jede Nukleinsäuremarkierung eine generische Region mit einer Sequenz umfasst, die in allen Nukleinsäuremarkierungen in dem Pool vorhanden ist, wobei die generische Region durch Coderegionen mit Identifizierungssequenzen für die Markierung flankiert ist; (b) Auswählen einer speziellen Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool; und (c) Hinzugeben oder Auftragen eines Markers mit der ausgewählten Nukleinsäuremarkierung auf das Material.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Bestimmen bereitgestellt, welche spezielle Nukleinsäuremarkierung aus einem bekannten Pool unterschiedlicher Nukleinsäuremarkierungen zum Markieren eines Materials verwendet wurde, wobei jede Nukleinsäuremarkierung in dem Pool wenigstens eine Identifizierungssequenz für die Markierung umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Beproben eines Teil des markierten Materials und optionales Separieren der Nukleinsäuremarkierung von der Probe; (b) Einrichten einer Mehrzahl von Nukleinsäure-Verstärkungsreaktionsmedien, wobei jedes Medium ein Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz einer anderen bekannten Nukleinsäuremarkierung in dem Pool enthält und in der Lage ist, eine andere Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool zu verstärken; (c) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäuremarkierung der Probe mit jedem der Reaktionsmedien; und (d) Detektieren, welches der Reaktionsmedien zu der Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung als Hinweise auf die Identität der für die Markierung des Materials verwendeten speziellen Nukleinsäuremarkierung führt, wobei die Menge der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuremarkierung bestimmt wird, um einen Hinweis auf die Menge des in der Probe vorhandenen Markers zu liefern.
Es wird hier auch ein Kit beschrieben, um zu bestimmen, welche spezielle Nukleinsäuremarkierung aus einem bekannten Pool unterschiedlicher Nukleinsäuremarkierungen zum Markieren eines Materials verwendet wurde, wobei jede Nukleinsäuremarkierung in dem Pool wenigstens eine Identifizierungssequenz für die Markierung umfasst, wobei das Kit Mittel zum Einrichten einer Mehrzahl von Nukleinsäure-Verstärkungsreaktionsmedien umfasst, wobei jedes Medium ein Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend der Identifizierungssequenz einer anderen bekannten Nukleinsäuremarkierung in dem Pool enthält und in der Lage ist, eine andere Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool zu verstärken. Die Nukleinsäuremarkierung umfasst vorzugsweise eine generische Region mit einer Sequenz, die in allen Nukleinsäuremarkierungen in dem Pool vorhanden ist, und jedes Nukleinsäure-Verstärkungsmedium umfasst vorzugsweise auch ein Oligonukleotid mit einer Sequenz entsprechend einer in der generischen Region enthaltenen Sequenz.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Marker ferner ein Indikatormittel zusätzlich zu der Nukleinsäuremarkierung, wobei dessen Vorhandensein ohne Weiteres in jedem beprobten Teil des Materials detektierbar ist. Das Vorhandensein des Indikatormittels in einer Probe gibt einen Hinweis darauf, dass eine Nukleinsäuremarkierung auch in der Probe vorhanden ist. So kann ein einfacher Test für das Vorhandensein eines Indikatormittels und somit einer Nukleinsäure in einer Probe durchgeführt werden, bevor eine detaillierte Analyse der Identität oder Quantität der Markierung unternommen wird. Das Indikatormittel kann eine Mehrzahl von Teilchen umfassen. Die Teilchen können aus irgendeinem geeigneten nicht lebenden oder nicht lebensfähigen vorher aber lebenden Substanzmaterial gebildet sein, und die Teilchen können eine Größe oder Form haben, die für die vorgesehenen Zwecke geeignet sind. Im Allgemeinen sind Teilchen mit einer mittleren Größe von nicht mehr als etwa 5 Mikrometer für die meisten Zwecke geeignet. Die Teilchen haben vorzugsweise eine mittlere Größe von 0,01 bis 5 Mikrometer, ganz bevorzugt 0,05 bis 1 Mikrometer, mit einer typischen Größe von etwa 0,25 oder 0,5 Mikrometer. Was wichtig ist, ist, dass sie nicht für das bloße Auge sichtbar sind, aber leicht detektiert werden können. Zu diesem Zweck können die Teilchen kenntlich gemacht werden, zum Beispiel durch fluoreszierende Farbe.
Vorzugsweise umfassen die Indikatormittel Mikrotröpfchen oder Mikrokügelchen, optional mit einer ohne Weiteres detektierbaren Kennung. Beispielhafte Mikrotröpfchen/-Kügelchen sind im Handel erhältlich von Dynal (U.K.) aus Wirral, Merseyside, UK, unter den generischen Markennamen DYNABEADS und DYNASHPERES. Die Präparierung dieser Kügelchen ist zum Beispiel offenbart in den europäischen Patentveröffentlichungen Nummern. 91953, 10986 und 106873 und in den US Patenten Nummern. 4186120, 4563510 und 4654267.
Die Verfahren gemäß der Erfindung in ihren verschiedenen Aspekten, wie hier beschrieben, liefert eine quantitative Bestimmung der Menge eines Nukleinsäuremarkers in einem markierten Material. Wir beschreiben drei bevorzugte Verfahren zum Quantifizieren der Menge einer verstärkten Nukleinsäure in einer Reaktion. Wie vorher erwähnt, ist das tatsächliche Detektionsverfahren nicht relevant, obwohl es Vorteile bei der Verwendung der hier beschriebenen Verfahren gibt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung nutzt eine 5'Nukleaseprobe zur Detektion und Quantifizierung, welche eine Modifikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist. Die 5'Nukleaseprobe wurde anfänglich beschrieben in Holland et al., 1991 (Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R. und Gelfand, D. H, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280) und Holland et al., 1992 (Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Will, S., Saiki, R. K. und Gelfand, D. H, Clinical Chemistry, 38, 462-463). Diese Probe ist auch Gegenstand der US Patente Nummern 5,210,015 und 5,487,972 und nachfolgender Modifikationen. Ein im Handel erhältliches Kit zum Durchführen der 5'Nuclease-Prüfung, bekannt als TAQ-MAN, ist von PE Biosystems erhältlich.
In einer 5'Nukiease-Prüfung, wie hier angewendet, wird die Nukleinsäuremarkierung mit einer gekennzeichneten Oligonukleotid-Sonde in Berührung gebracht, zusätzlich zu einem ersten Oligonukleotid-Primer mit einer Sequenz entsprechend einer ersten Sequenz in der Markierung, bei Vorhandensein einer DNS-Polymerase mit einer 5' bis 3'Exonuklease-Aktivität. Die gekennzeichnete Oligonukleotid-Sonde ist in der Lage, eine Sequenz in der Nukleinsäuremarkierung während der Verstärkung zu binden. In der ersten Ausführungsform der Nukleinsäuremarkierung mit einer Identifizierungssequenz (Typ I Markierung) bindet die gekennzeichnete Sonde eine Sequenz 5' bis 3' stromabwärts des ersten Oligonukleotid-Primers. In der zweiten Ausführungsform der Nukleinsäuremarkierung (Typ II Markierung), das heißt, dort, wo die Nukleinsäuremarkierung zwei Identifizierungssequenzen hat und weiter mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer entsprechend der zweiten Identifizierungsregion in Kontakt gebracht wird, wird die Sequenz, welche durch die Sonde gebunden ist, durch die erste und die zweite Identifizierungssequenz flankiert. Auf diese Weise liegt die gekennzeichnete Sonde, wenn sie während der Verstärkung an die Nukleinsäuremarkierung gebunden ist, 5' bis 3' stromabwärts eines der Oligonukleotid-Primer.
In der dritten Ausführungsform der Markierung (Typ III Markierung) besteht die durch die Sonde gebundene Sequenz aus der Identifizierungssequenz für die Nukleinsäuremarkierung. So sind in dieser Ausführungsform die Stellen der ersten und zweiten Region (die Startstellen enthaltend) derart, dass der erste Oligonukleotid-Primer, der an die Nukleinsäu remarkierung gebunden ist, 5' bis 3' stromaufwärts der gekennzeichneten Sonde liegt, die an ihre korrespondierende Identifizierungssequenz gebunden ist. In all den Ausführungsformen können der erste Oligonukleotid-Primer und die Sonde aneinander angrenzend liegen.
Alternativ können sie durch das Vorhandensein einer eingreifenden Sequenz in der Nukleinsäuremarkierung voneinander getrennt sein. Die Sonde ist gekennzeichnet mit einem Signalmittel, vorzugsweise einer fluoreszierenden Markierung.
Während der Synthesephase der PCR wird der erste Oligonukleotid-Primer durch Polymeraseaktivität der DNS-Polymerase ausgeweitet. Die gekennzeichnete Oligonukleotid-Sonde, die stromabwärts liegt, wird jedoch durch die 5' bis 3'Exonukleaseaktivität der Polymerase abgebaut und Fragmente, die das Signalmittel tragen, werden freigesetzt. Das Signalmittel auf den freigesetzten Fragmenten kann deshalb als ein Hinweis auf den Fortschritt der Verstärkungsreaktion detektiert werden. Insbesondere das Vorhandensein eines solchen Signals gibt einen Hinweis darauf, dass verstärkte Nukleinsäure vorhanden ist. Falls ein Signal detektiert wird, gibt dies somit einen Hinweis darauf, dass die Nukleinsäure in der Probe vorhanden ist und dass das Material somit markiert wurde. Ferner wird der Signalbetrag proportional zu der Menge der während des Verlaufs der Reaktion erzeugten verstärkten Nukleinsäure sein, so dass ein Messen des Signalpegels ein Hinweis auf die Menge der verstärkten Nukleinsäure geben wird.
Jede Polymerase mit einer 5' bis 3'Nukleaseaktivität kann in der 5'Nuklease-Prüfung verwendet werden. DNS-Polymerasen von Säugetieren oder Bakterien, zum Beispiel die DNS-Polymerase I von E. coli, sind deshalb für die Verwendung in dem Verfahren geeignet. Für eine Polymerase-Kettenreaktion sollte die Polymerase wärmestabil sein. Wärmestabile Polymerasen sind im Stand der Technik allgemein bekannt, zum Beispiel die DNS-Polymerasen von Thermus aquaticus, Pyrococcus fuirosis, Thermococcus litoralis, Thermus flavus, Thermus thermophilus, etc.
Zusätzlich zur Kennzeichnung durch ein Signalmittel kann die Oligonukleotid-Sonde optional auch mit Dämpfungsmittel gekennzeichnet sein, welches ein von der fluoreszierenden Markierung in einer intakten Sonde detektierbares Signal dämpft. Es hat sich herausgestellt, dass eine adäquate Dämpfung auftritt, wenn das Signalmittel an dem 5'Ende des Oligonukleotids liegt und das Dämpfungsmittel an dem 3'Ende liegt. Es wird angenommen, dass die Dämpfung mittels einer Förster-Resonanzenergieübertragung durch den Raum auftritt (FRET, beschreiben durch Förster, V. Th., (1948), Annals Physics (Leipzig), 255-75). So verursacht die Nähe des Dämpfungsmittels zu dem Signalmittel auf der Oligonukleotid-Sonde ein Signal, das von dem zu dämpfenden Signalmittel detektierbar ist, wenn das zweite Oligonukleotid intakt ist. Eine solche Dämpfung tritt nicht auf, wenn die gekennzeichneten Fragmente durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase freigesetzt sind, wenn das Dämpfungsmittel von dem Signalmittel getrennt liegt. In diesem Fall ist das detektierbare Signal von der intakten Oligonukleotid-Sonde wesentlich niedriger als das detektierbare Signal von der den freigesetzten Fragmenten, und das Signal von den freigesetzten Fragmenten kann leichter detektiert werden.
Ein alternatives Verfahren zum Messen des Vorhandenseins oder der Menge einer Nukleinsäure erfolgt durch Messen des Einbaues von Oligonukleotid-Primern in Amplicone. Für diesen Zweck wird der erste Oligonukleotid-Primer und/oder der zweite Oligonukleotid-Primer (falls vorhanden) in herkömmlicher Weise durch ein Signalmittel gekennzeichnet. Mit fortschreitender Verstärkung werden die oder der Primer in verstärkte Nukieinsäureamplicone eingebaut. Ein Signal von einem Primer, der so eingebaut worden ist, wird als ein Maß des Vorhandenseins einer verstärkten Nukleinsäure in der Reaktion detektiert. Ferner kann ein solches Signal gemessen werden, um einen Hinweis auf die Menge der verstärkten Nukleinsäure in der Reaktion zu liefern. Der/die Primer können optional auch mit einem Dämpfungsmittel gekennzeichnet werden, welches, falls es vorhanden ist, ein detektierbares Signal gegenüber den Signalmitteln in einem freien Oligonukleotid-Primer dämpft. Wenn das Oligonukleotid in ein Amplicon eingebaut ist, ist das Dämpfungsmittel jedoch nicht in der Lage, das Signal gegenüber dem Signalmittel zu dämpfen. Auf diese Weise ist das von einem freien Oligonukleotid (in Lösung) detektierbare Signal auf einem im Wesentlichen niedrigeren Pegel als das von einem eingebauten Primer detektierbare Signal. Vorzugsweise ist das Signalmittel eine fluoreszierende Kennung und findet die Dämpfung mithilfe einer Förster-Resonanzenergieübertragung durch den Raum statt.
Andere Wege zum Detektieren und Bestimmen der Menge einer verstärkten Nukleinsäure sind auch möglich. So kann zum Beispiel die Menge einer verstärkten Nukleinsäure während einer PCR-Reaktion durch ein periodisches Beproben der Reaktion quantifiziert werden. Die Menge des Nukleinsäurematerials in den Proben, das hybridisierbar zu einer Nukleinsäure-Sonde ist, wird dann gemessen. Die Sonde ist ein Oligonukleotid mit einer Sequenz komplementär zu einer Sequenz, die in der Nukleinsäuremarkierung enthalten ist, wobei diese Sequenz durch Sequenzen flankiert wird, die durch die in der Verstärkung verwendeten Primer gebunden sind. Es wird deutlich, dass dieses Verfahren funktioniert, weil nur verstärkte Nukleinsäure zum Hybridisieren an einer solchen Sonde geeignet ist. Die Sonde ist vorzugsweise gekennzeichnet, um so zu ermöglichen, dass diese leichter detektiert werden kann.
Ein solches Detektionsprinzip wird verwendet in dem PCR-LIGHT Quantitative PCR-System, hergestellt durch Tropix/PE Applied Biosystems. In diesem System wird ein Oligonukleotid-Primer mit Biotin gekennzeichnet, und die PCR-Reaktion wird während der exponentiellen Phase der Verstärkung unterbrochen. Eine Probe wird aus dem Reaktionsrohr genommen und wird an eine mit Streptavidin beschichtete Oberfläche gebunden. Das gebundene Produkt wird dann denaturiert und der ungebundene Strang entfernt. Eine „interne" Sonde, die mit Fluorescein markiert ist, wird dann mit dem denaturierten PCR-Produkt in Kontakt gebracht und ein Anti-Fluorescein-Antikörper, der mit Alkalin-Phosphatase konjugiert ist, wird zusammen mit einem chemilumineszenten Substrat hinzugegeben. Die in einem Luminometer gemessene Lichtemission weist auf das Vorhandensein und die Menge des Verstärkungsprodukts hin.
Die die Markierung bildende Nukleinsäure kann eine Deoxyribonukleinsäure (DNS) oder eine Ribonukleinsäure (RNS) sein. Die Markierung kann aus einem Protein hergestellt sein, das an die Nukleinsäure (Protein-Nukleinsäure, PNS) angehängt sein. Eine DNS wird wegen ihrer größeren Stabilität und Widerstandsfähigkeit gegenüber Nukleasen vorgezogen. Obwohl die Nukleinsäuremarkierung einen Doppelstrang haben kann, besteht sie vorzugsweise aus einem einstrangigen DNS-Molekül, ganz bevorzugt einem Oligonukleotid. Sowohl natürlich auftretende als auch synthetische Nukleinsäuren sind für die Verwendung als Markierung geeignet. Der Ausdruck „natürlich auftretend" bezieht sich auf DNS- oder RNS-Moleküle, die in der Natur auftreten. Der Ausdruck „synthetisch" wird auf eine DNS oder RNS angewendet, die im Labor unter Verwendung von Routine-Syntheseprozeduren synthetisch erzeugt werden und im relevanten Stand der Technik allgemein bekannt sind.
Vorzugsweise kann die Markierung ein synthetisches DNS-Oligonukleotid sein. Eine synthetische DNS kann aus den fünf natürlich auf tretenden Basen gebildet werden; Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, und nicht natürlich auftretende Basen, zum Beispiel, Inosinbasen und abgeleitete Nukleotide, wie 7-deazo-2'deoxyguanosin, Alkylphosphonat-Oligodeoxynukleotide, Phosphorothioat-Oligodeoxynukleotide und α-anomerische Oligodeoxynukleotide. Unter bestimmten Umständen können Markierungen, die nicht natürlich auftretende Basen beinhalten, Vorteile gegenüber solchen mit nur natürlich auftretenden Basen haben, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität, weil sie durch eine Nukleaseaktivität oder durch chemisch aktive Substanzen oder durch Umgebungseinflüsse, wie Wärme oder ultraviolette Strahlung weniger wahrscheinlich zersetzt werden. Die Verwendung von Markierungen, die nicht natürlich auftretende Basen beinhalten, ist nur beschränkt durch ihre Fähigkeit, durch die Detektionseinrichtung wirksam detektiert werden zu können. Für Markierungsverfahren unter Verwendung der bevorzugten PCR-Technologie muss die Markierung in der Lage sein, Duplexe mit PCR-Primern zu bilden und als ein Template für die in der PCR-Prozedur verwendeten Polymerasen zu fungieren.
Vorzugsweise wird die Nukleinsäure zur gleichen Zeit detektiert und quantifiziert, wie sie verstärkt wird. Verschiedene Nukleinsäure-Verstärkungstechnologien können in dem hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, zum Beispiel die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), NASBA und TMA. In einer bevorzugten Ausführungsform nutzt das Verfahren PCR, offenbart in US Patent Nrn. 4,683,202 und 4,683,195 und in den europäischen Patentveröffentlichungen Nrn. 258017 und 237362.
Typischerweise umfasst die Identifizierungssequenz wenigstens zwei Nukleotidbasen, um eine adäquate Spezifizität für jede Markierung sicherzustellen, so dass eine zufällige Verunreinigung nicht zu falschen Ergebnissen führen wird. Je länger die Sequenz ist, desto höher ist der potentielle Informationsgehalt der Markierung, aber umso wahrscheinlicher ist, dass eine Zersetzung zu einem Problem wird. Ferner ist eine Synthese von längeren Markierungen teurer und weniger effizient, wie dies oben beschrieben wurde. Vorzugsweise hat die Nukleinsäuremarkierung zwischen 60 bis 125 Basenpaare oder Nukleotide in ihrer Länge. Ganz bevorzugt hat die Nukleinsäuremarkierung weniger als 90 Nukleotide oder Basenpaare in ihrer Länge und äußerst bevorzugt hat die Nukleinsäuremarkierung etwa 63 Nukleotide oder Basenpaare in ihrer Länge. Dies ermöglicht die Hybridisierung von zwei Primern, welche typischerweise jeweils etwa 20 Basen oder Nukleotide in ihrer Länge haben und welche, wenn sie an die Markierung hybridisiert wind, durch eine Region in der Markierung von zwischen 20 bis etwa 85 Basen/Nukleotiden in ihrer Länge separiert sind. Diese Region kann eine Bindungsregion für eine 5'Nuklease-Sonde enthalten, wie dies in weiterem Detail unten beschrieben wird. Die tatsächliche Größe der Markierung ist nicht wichtig, solange die Markierung eine adäquate Größe für Primer mit einer geeigneten Größe hat, um entsprechende Sequenzen in der Markierung zu detektieren. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit können die Markierungen so kurz wie möglich gewählt werden.
Die Kennung oder Signalmittel können eine fluoreszierende Substanz sein, insbesondere eine fluoreszierende Farbe. Geeignete fluoreszierende Farbstoffe umfassen (sind aber nicht beschränkt darauf): Allophycocyanin, Phycocyanin, Phycoerythrin, Rhodamin, Oxazin, Kumarin, Fluoroscein-Derivate, zum Beispiel, Fluoresceinisothiocyanat und Carboxyfluoresceindiacetat sowie Texas-Rot, Acridin-Gelb/Orange, Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Bis-Benzamid (im Handel erhältlich von Hoechst unter dem Handelsnamen H33258) etc. Vorzugsweise ist die fluoreszierende Kennung FAM (6-carboxy-fluorescein) oder TET (6-carboxy-4,7,2'T-tetrachloro-fluorescein).
Eine aus dem Pool von Markierungen gewählte Nukleinsäuremarkierung wird verwendet, um ein Material zu markieren, indem ein Marker mit der gewählten Markierung auf das Material aufgebracht wird. Falls das zu markierende Material eine Flüssigkeit ist, dann ist es nur notwendig, die Oligonukleotidmarkierung direkt zu der Flüssigkeit hinzuzugeben. Falls das zu markierende Material eine Flüssigkeit auf Wasserbasis ist, dann kann die Markierung direkt zur Flüssigkeit hinzu gegeben werden. Falls das Material auf der Basis eines Kohlenwasserstoffs oder Öls beruht, kann die Markierung in geeigneter Weise modifiziert werden (zum Beispiel durch Methylation), bevor es dem Material hinzugegeben wird. Im Falle eines zu markierenden Feststoffmaterials kann die Oligonukleotidmarkierung zuerst in einer geeigneten Flüssigkeit gelöst werden, die dann auf den Feststoff aufgebracht wird und dort trocknen darf. Die Oligonukleotidmarkierung kann auch in Form eines Aerosols aufgebracht werden, welche auf den Feststoff gesprüht wird. Zusätzlich zu der Oligonukleotidmarkierung kann der Marker auch zudem einen Binder oder ein Detektionsmittel umfassen, wie dies vorher beschrieben wurde.
Nachfolgend kann eine Probe von dem markierten Material genommen und direkt einer Analyse unterzogen werden, und zwar mit einer optionalen Vorbearbeitung, falls notwendig. Zum Beispiel kann, wenn das Material eine Flüssigkeit ist, ein kleines Volumen der Flüssigkeit entnommen und direkt den Verstärkungsreaktionen zugegeben werden. Ebenso können kleine Feststoffteilchen (zum Beispiel Scapings) direkt den Verstärkungsreaktionen hinzugegeben werden. Es wird jedoch üblicherweise im Falle von Feststoffmaterial vorgezogen, dass die Nukleinsäuremarkierung von dem Feststoff vorher extrahiert wurde. Dies kann in herkömmlicher Weise durch Waschen des Feststoffmaterials, auf welchem der Marker aufgebracht worden ist, mit einem geeigneten Puffer auf Wasserbasis erfolgen.
Ausführungsformen der Erfindung werden nun nur beispielhaft und mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in welchen:
1 ein Plot eines detektierten Fluoreszenzsignals über einem Hintergrund an jedem PCR-Zyklus für eine Reihe von Startkonzentrationen (pro ml) einer Nukleinsäuremarkierung ist; und 2 ein aus den Daten in 1 abgeleiteter logarithmischer Plot ist, welcher den Ansprechzyklus (das heißt, den Zyklus, bei welchem das detektierte Signal über dem Hintergrundpegel liegt) für eine Reihe von Startkonzentrationen der Nukleinsäuremarkierung zeigt.
Beispiel I: Typ I Struktur detektiert und quantifiziert mit 5'Nuklease-Prüfung
Eine Typ I Markierung kann verwendet werden, um ein Material zu markieren und kann identifiziert und quantifiziert werden mittels der 5'Nuklease-Prüfung.
Ein Pool von einstrangigen DNS-Oligonukleotidmarkierungen wird gemäß herkömmlicher Oligonukleotid-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, synthetisch hergestellt. Die Markierungen haben vorzugsweise eine Länge von etwa 70 Nukleotiden (nt) und enthalten nur eine Identifizierungssequenz in jeder Markierung. Zum Beispiel kann der Pool die folgenden Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 1
SEQ: NO 2
Wie aus dem Obigen zu erkennen ist, ist die Identifizierungssequenz (Region C) eine variable Region mit einer speziellen Sequenz, welche sich von Markierung zu Markierung unterscheidet. Diese Sequenz dieser Region wird deshalb einzigartig sein für eine spezielle Markierung, auf welcher die spezielle Sequenz angeordnet ist. Die Regionen A und B haben andererseits die gleichen Frequenzen für alle Markierungen in dem Pool und können bezeichnet werden als „generische" Sequenzen. In diesem Fall können dann, falls die Identifizierungssequenz in einer Markierung 20 Nukleotide lang ist, dann mit vier verfügbaren Basen, etwa 1,1 × 10¹² einzigartige Markierungen synthetisiert werden.
Eine einzelne Oligonukleotidmarkierung wird dann aus dem Pool gewählt und dazu verwendet, ein Material durch Aufbringen eines Markers mit der gewählten Markierung zu markieren, wie dies oben beschrieben wurde. Nachfolgend wird ein Teil des markierten Materials beprobt und wird die Probe einer Analyse unterzogen, um die Identität und/oder die Menge der Markierung in der Probe zu bestimmen. Falls notwendig, kann die Oligonukleotidmarkierung optional aus der Probe extrahiert und einer Analyse unterzogen werden.
Für die Zwecke der Detektion und Quantifizierung wird ein Satz korrespondierender Oligonukleotid-Primerpaare für die Verwendung in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung herkömmlicher DNS-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik allgemein bekannt sind, synthetisch hergestellt. Ein Oligonukleotid-Primer in jedem Paar des Satzes hat eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in Region A des Pools von Markierungen. Der andere Oligonukleotid-Primer in dem Paar hat eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in der variablen Identifizierungsregion (Region C) einer anderen Oligonukleotidmarkierung in dem Pool. Auf diese Weise entspricht die Anzahl von Primer-Paaren der Anzahl von Oligonukleotid-Markierungen in dem Pool, und jedes Primer-Paar in dem Satz ist in der Lage, eine (und nur eine) der Oligonukleotid-Markierungen im Pool zu verstärken. Es wird deutlich, dass das Design der Primer-Paare und der Oligonukleotid-Sonde variiert werden kann. So kann ein Oligonukleotid-Primer in einem Paar eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in der Region A haben, wobei dann der andere Primer eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in der Region C haben wird.
Zusätzlich zu den Primer-Paaren wird ein drittes Oligonukleotid für die Verwendung als eine Sonde in der 5'Nuklease-Prüfung konstruiert, wieder unter Verwendung herkömmlicher DNS-Syntheseverfahren. Die Oligonukleotid-Sonde hat eine Sequenz bestehend aus einer komplementären Sequenz zur Sequenz in Region B der Markierungen in dem Pool. Mit der Wahl der PCR-Primer muss eine gebührende Beachtung hinsichtlich der Sequenz der gekennzeichneten Sonde erfolgen. Im Speziellen wird die Sondensequenz so gewählt, dass ihr Schmelzpunkt vorzugsweise über demjenigen der beiden PCR-Primer liegt, so dass während der Verstärkungsreaktion die Probe an ihr Zielgebiet gebunden wird, bevor eine signifikante Primer-Erweiterung stattfindet.
Die Oligonukleotid-Sonde wird mit einer fluoreszierenden Kennung gekennzeichnet, wie FAM (6-carboxy-fluorescein) oder TET (6-carboxy-4,7,2'7'-tetrachloro-fluorescein). Die fluoreszierende Kennung wird an die Sonde durch herkömmliche Mittel angebracht, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Zudem ist es heute möglich, von Wirtschaftsquellen kundengerechte Sonden mit darauf angebrachten fluoreszierenden oder anderen Kennungen zu bestellen. Ebenso wie die fluoreszierende Kennung wird ein Dämpfungsmittel an der Sonde angebracht, zum Beispiel mithilfe eines herkömmlichen Kopplungsprozesses, wie dieser im Stand der Technik bekannt ist. Das Dämpfungsmittel ist vorzugsweise eine Dämpfungsfarbe, welche, wenn sie auf der gleichen Oligonukleotid-Sonde vorhanden ist wie die fluoreszierende Kennung, das von der fluoreszierenden Kennung beobachtete Fluoreszenzsignal dämpft oder reduziert, vorzugsweise durch eine Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET). So wird in einer intakten Oligonukleotid-Sonde das Signal von der fluoreszierenden Kennung verringert.
Die Reihen von 5'Nuklease-Prüfungsreaktionen wird dann eingerichtet. Jede Reaktionsröhre enthält einen Aliquotanteil der die unbekannte Oligonukleotidmarkierung enthaltenen Probe, Taq DNS Polymerase, dNTPs, Magnesiumchlorid und einen Puffer. Zudem enthält jede Reaktionsröhre, als PCR-Primer, ein anderes Primer-Paar, gewählt aus dem Satz der oben beschriebenen Oligonukleotid-Primer sowie eine Menge der gekennzeichneten Oligonukleotid-Sonde. Die Anzahl von Reaktionsröhren entspricht der Anzahl unterschiedlicher Oligonukleotid-Markierungen im Pool. Da jedes Primer-Paar des Satzes nur in der Lage ist, eine und nur eine der Oligonukleotid-Markierungen in dem Pool der Markierungen zu verstärken, zeigt die Tatsache, dass eine erfolgreiche PCR-Reaktion in einer speziellen Reaktionsröhre aufgetreten ist, an, dass das Primer-Paar in dieser Röhre die korrespondierenden Sequenzen in der Oligonukleotid-Markierung erkannt hat und in der Lage war, diese Markierung zu verstärken. Die Identität der Oligonukleotid-Markierung, die verwendet wurde, um das Material zu markieren, kann deshalb leicht bestimmt werden, indem die PCR-Reaktionen durchgeführt werden und bestimmt wird, welche der Reaktionen erfolgreich ist. Falls natürlich vermutet wird, dass eine Probe eine spezielle Markierung enthält, dann ist es nur notwendig, eine PCR-Reaktion mit dem geeigneten Primer-Paar durchzuführen, um zu sehen, ob die Verstärkung stattfindet. Ebenso kann, falls von der Markierung angenommen wird, dass sie zu einer kleinen Anzahl von Kandidaten-Markierungen gehört, eine verringerte Anzahl von Reaktionen mit den geeigneten Primer-Paaren durchgeführt werden.
Der Vorteil der 5'Nuklease-Prüfung besteht darin, dass eine Quantifizierung der Markierung zur gleichen Zeit wie die Detektion der Verstärkung stattfinden kann. Ein einzelnes Fluoreszenzsignal wird erzeugt, dessen Vorhandensein anzeigt, dass eine Verstärkung stattgefunden hat (und somit die Identität der Markierung liefert), während die Stärke des Signals bestimmt wird, um einen Hinweis auf die Menge der Markierung in der Probe zu liefern (wie dies unten in größerem Detail beschrieben wird).
Wenn die gekennzeichnete Sonde und die Primer an ihre jeweiligen komplementären Sequenzen hybridisiert sind, ist die Struktur der Markierung derart, dass die gekennzeichnete Sonde 5' bis 3' stromabwärts eines der Primer liegt. Da die DNS-Polymerase den an die Markierung gebundenen Primer erweitert, steht dies der an die Markierung gebundenen gekennzeichneten Sonde entgegen. Die 5' bis 3'Nukleaseaktivität der Polymerase zersetzt die gekennzeichnete Sonde und setzt gekennzeichnete Fragmente in dem Reaktionsmedium frei. In Abhängigkeit von der Struktur der Markierung können jedoch die Primer und Sonde, die gekennzeichnete Probe, wenn sie an die Markierung hybridisiert ist, sogar unmittelbar stromabwärts (das heißt, angrenzend) an den Primer liegen. In diesem Falle schreitet die Exonukleaseaktivität dahingehend fort, die gekennzeichnete Sonde zu zersetzen, ohne dass eine Primer-Erweiterung stattfindet. Wie oben erwähnt, wird in einer intakten Oligonukleotid-Sonde das Signal gegenüber der fluoreszierenden Kennung reduziert, wenn aber gekennzeichnete Fragmente freigesetzt werden, wird das Signal nicht länger gedämpft und kann durch geeignete Mittel, zum Beispiel einen Fluoreszenzdetektor, detektiert werden. Ein mit fortschreitender Verstärkung sollte die Stärke des Signals exponentiell zunehmen, da eine zunehmende Anzahl von gekennzeichnete Fragmente in das Medium freigesetzt werden. Die Stärke des Signals kann bestimmt werden und dazu benutzt werden, die anfängliche Konzentration der Markierung in der Probe, wie oben beschrieben, zu bestimmen. Die bei der Prüfung verwendeten Reaktionsgefäße haben Wände, welche für das fluoreszierende Signal transparent sind, und das Signal kann deshalb während des Verlaufs der PCR-Reaktion detektiert werden, ohne dass die Reaktion unterbrochen werden muss.
Bevor die Verstärkungsreaktionen ablaufen, wird das Detektionssystem unter Verwendung bekannter Anfangsmengen von Oligonukleotid-Markierungen in einer Reihe von Testreaktionen kalibriert. 1 ist eine grafische Darstellung, welche den Pegel eines über dem Hintergrundpegel (Y-Achse) detektierten Fluoreszenz-Signals an jedem Zyklus der PCR-Reaktion (X-Achse) für eine Reihe von Ausgangskonzentrationen (10⁴, 10⁸, 10⁸, 10¹⁰ pro ml) der Nukleinsäuremarkierung darstellt. Die Oligonukleotide A2, B2 und C2 haben Konzentrationen von 10⁴/ml, A3, B3 und C3 haben Konzentrationen von 10⁸/ml, A4, B4 und C4 haben Konzentrationen von 10⁸/ml, während A5, B5 und C5 Konzentrationen von 10¹⁰/ml haben. Die horizontale Achse zeigt den Hintergrundpegel eines Fluoreszenzsignals, welcher gleich Null gesetzt ist. Wie zu sehen ist, der Ansprechzyklus, mit anderen Worten der Zyklus, bei welchem das Signal gegenüber dem Hintergrundpegel detektierbar wird (das heißt, der Punkt, an welchem die Kurve zu steigen beginnt), unterschiedlich für verschiedene Ausgangskonzentrationen der Markierung. Je mehr Markierung anfänglich in der Probe vorhanden war, desto früher in der Reaktion wird das Signal signifikant. Die für die 1 verwendeten Daten sind unten in Tabelle 1 aufgelistet.
Ausgangskonzentration 10⁴/ml
Ausgangskonzentration 10⁸/ml
Ausgangskonzentration 10⁸/ml
Ausgangskonzentration 10¹⁰/ml
Tabelle 1: Ansprechzyklen für verschiedene Ausgangskonzentrationen von Oligonukleotid. Drei Oligonukleotide wurden für jede Konzentration verwendet und sind zum Beispiel als A2, B2 und C2 dargestellt.
Die während der Kalibrierung gesammelten Daten können geplottet werden, um eine Standardkurve zu erzeugen. 2 ist eine grafische Darstellung, welche den Anspruchzyklus (mit anderen Worten, den Zyklus, bei welchem das Signal gegenüber dem Hintergrund detektierbar wird) als Y-Achse zeigt, geplottet gegen den Logarithmus der anfänglichen Startkonzentration. Es ist zu sehen, dass der Ansprechzyklus direkt proportional zu dem Block der anfänglichen Startkonzentration ist. In einem idealen Fall sollte die Steigung der Linie -3,3 sein.
Um die Ausgangskonzentration der Markierung in der Testreaktion zu bestimmen, wird der Pegel, an welchem das Signal gegenüber dem Hintergrund detektierbar wird, bestimmt. Der Ansprechzyklus wird dann mit der Standardkurve verglichen, um die Anfangskonzentration der Markierung in der Probe zu liefern. Die Konzentration der Markierung in der Probe kann natürlich dazu verwendet werden, die Konzentration der Markierung in dem markierten Material zu bestimmen.
Beispiel II: Typ II Struktur detektiert und quantifiziert mit 5'Nulease-Prüfung
Eine Typ II Markierung kann verwendet werden, um ein Material zu markieren, und kann identifiziert und quantifiziert werden, mittels der 5'Nuklease-Prüfung.
Ein Pool von einstrangigen DNS-Oligonukleotidmarkierungen wird entsprechend herkömmlicher Oligonukleotid-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, synthetisch hergestellt. Die Markierungen haben vorzugsweise eine Länge von etwa 70 Nukleotiden (nt) und enthalten zwei Identifizierungssequenzen innerhalb jeder Markierung. Zum Beispiel kann der Pool die folgenden Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 3
SEQ ID: NO 4
Wie oben gezeigt, sind einer Typ II Markierung die Region A und C variable Regionen mit Identifizierungssequenzen, welche von Markierung zu Markierung unterschiedlich sind. Die Region B ist andererseits eine „generische" Sequenz mit der gleichen Sequenz für alle Markierungen in dem Pool. In dem obigen Pool sind, da die Identifizierungssequenzen nun 40 (2 × 20) Nukleotide lang sind, etwa 2,2 × 10¹² unterschiedliche Markierungen erhältlich. So erhöht die Verwendung einer Typ II Markierung anstelle einer Typ I Markierung die Anzahl von verfügbaren Markierungen zum Markieren.
Das Material wird in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, markiert und beprobt. Die nachfolgende Identifizierung und Quantifizierung der Markierung ist ebenso wie sie in Beispiel 1 oben beschrieben wurde, mit Ausnahme dessen, dass, da es nun zwei Identifizierungsregionen gibt, beide jedes Paares von Primern in dem Primersatz so designed sind, dass sie eine Verstärkung einer einzelnen Markierung in dem Pool auslösen. Mit anderen Worten, hat ein Oligonukleotid-Primer in einem Paar des Satzes eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in Region A einer Oligonukleotid-Markierung des Pools, während der andere Primer in dem Paar eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in der Region C der gleichen Oligonukleotid-Markierung hat. Alternativ hat ein Primer eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in Region A und der andere eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in der Region C. Auf diese Weise ist jedes Paar Primer in der Lage, eine und nur eine der Markierungen in dem Pool zu verstärken. Zusätzlich zu den Primerpaaren wird eine dritte gekennzeichnete Oligonukleotid-Sonde synthetisch hergestellt, wie dies oben in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die 5'Nuklease-Prüfung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Wie mit einer Typ 1 Markierung, liefert das Vorhandensein einer erfolgreichen Verstärkung die Identität der Markierung, und der Pegel, bei welchem das Signal gegenüber dem Hintergrund detektierbar ist, wird bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen, um die Anfangskonzentration der Markierung in der Probe zu liefern. Selbstverständlich kann die Konzentration der Markierung in dem markierten Material leicht aus der Konzentration der Markierung in der Probe berechnet werden.
Beispiel III: Typ I oder Typ II Markierung detektiert und quantifiziert durch Messen des Einbaus gekennzeichneter Primer in Amplicons
Eine Typ I Markierung oder eine Typ II Markierung kann verwendet werden, um ein Material zu markieren, und kann identifiziert und quantifiziert werden, indem die Menge des Einbaus des gekennzeichneten Oligonukleotid-Primers in Amplicone (Verstärkungsprodukte) detektiert und bestimmt wird.
Ein Pool aus einstrangigen DNS-Oligonukleotid-Markierungen wird entsprechend den herkömmlichen Oligonukleotid-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, synthetisch hergestellt. Die Markierungen haben vorzugsweise etwa eine Menge von etwa 70 Nukleotiden (nt) und enthalten eine (Typ I) oder zweit (Typ II) Identifizierungssequenzen in jeder Markierung. Zum Beispiel kann der Pool die folgenden Typ I Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 5
SEQ OD: NO 6
Alternativ kann der Pool den folgenden Typ II Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 7
SEQ ID: NO 8
Das Design und die Synthese der Markierungen und das Markieren und Beproben des Materials ist so wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist. In einer Typ I Markierung (SEQ IDs 6 und 6), ist Region A gleich für alle Markierungen im Pool, während Region B die Identifizierungssequenz ist, welche sich in jeder Markierung in dem Pool unterscheidet. In der Typ II Markierung sind beide Regionen A und B (SEQ IDs 7 und 8) Identifzierungssequenzen. Ein Satz von Primer-Paaren wird synthetisch hergestellt, wie dies oben im Beispiel 1 (im Fall von der Typ I Markierung) und im Beispiel II (im Fall einer Typ II Markierung) beschrieben ist. Wie vorher ist jedes Paar Primer in der Lage eine und nur eine Markierung in dem Pool zu verstärken. Wenigstens eine der Primer in jedem Paar sollte mit einer einem Signalmittel (zum Beispiel einer fluoreszierenden Markierung) und einem Dämpfungsmittel gekennzeichnet sein, wie dies oben in Bezug auf die gekennzeichnete Oligonukleotid-Sonde im Beispiel 1 beschrieben ist.
Eine Reihe von PCR-Verstärkungsreaktionen wird eingerichtet, wie dies oben im Beispiel 1 beschrieben ist, mit Ausnahme dessen, dass die gekennzeichnete Oligonukieotid-Sonde für die 5'Nuklease-Prüfung in dem Reaktionsgemisch nicht vorhanden ist.
Eine Fluoreszenzmarkierung und ein Dämpfungsmittel werden derart gewählt, dass in einem freien Primer in der Lösung das Dämpfungsmittel das Signal von der fluoreszierenden Markierung dämpft. Diese Dämpfung erfolgt mithilfe einer Förster-Resonanzenergie-Übertragung durch den Raum. Wenn der gekennzeichnete Oligonukleotid-Primer durch die DNS-Polymerase erweitert wird und in einem Verstärkungsprodukt (Amplicon) eingebaut wird, dämpft jedoch das Dämpfungsmittel nicht das Signal von der Fluoreszenzmarkierung, und es kann ein Signal von der Fluoreszenzmarkierung detektiert werden. Mit fortschreitender Verstärkung sollte der Pegel des detektierbaren Signals exponentiell ansteigen. Je höher die Konzentration der anfänglich in der Probe vorhandenen Markierung ist, desto geringer ist die Zugriffszahl, an welcher das Signal gegenüber dem Hintergrund detektierbar ist. Durch Kalibrieren der Detektionsvorrichtung in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, kann eine Standardkurve erzeugt werden, welche die Bestimmung der Menge der Markierung ermöglichen wird. Wiederum kann das Vorhandensein des Signals gleichzeitig mit dem Pegel des Signals bestimmt werden, um die Identität der Markierung sowie deren Menge in der Probe zu liefern.
Beispiel IV: Typ I oder Typ II Markierung detektiert und quantifiziert durch direktes Messen des Verstärkungsprodukts.
Eine Typ I Markierung oder Typ II Markierung kann verwendet werden, um ein Material zu markieren und durch ein direktes Detektieren und Bestimmen der Menge von Verstärkungsprodukten identifizieren und quantifizieren, die während der PCR-Reaktion produziert wurden. Die Verstärkungsprodukte werden unter Verwendung des PCR-LIGHT Quantitative PCR-Systems, hergestellt durch Tropix/PE Applied Biosystems, detektiert und quantifiziert.
Ein Pool aus einstrangigen DNS-Oligonukleotid-Markierungen wird entsprechend herkömmli cher Oligonukleotid-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, synthetisch hergestellt. Die Markierungen haben vorzugsweise eine Länge von etwa 70 Nukleotiden (nt) und enthalten eine (Typ I) oder zwei (Typ II) Identifizierungssequenzen innerhalb jeder Markierung. Zum Beispiel kann der Pool die folgenden Typ I Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 9
SEQ ID: NO 10
Alternative kann der Pool die folgenden Typ II Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 11
SEQ ID: NO 12
Das Design und die Synthese der Markierungen sind so wie oben im Beispiel 1 beschreiben. In einer Typ I Markierung (SEQ IDs 9 und 10) sind die „generischen" Regionen A und B für alle Markierungen im Pool gleich, während die Region C die Identifizierungssequenz ist, welche sich in jeder Markierung in dem Pool unterscheidet. In der Typ II Markierung sind beide Regionen A und C (SEQ IDs 7 und 8) Identifizierungssequenzen, während die Region B in all den Markierungen im Pool gleich ist. Für die PCR-Verstärkung wird ein Satz von Primer-Paaren synthetisch hergestellt, wie dies oben im Beispiel 1 (im Falle einer Typ I Markierung) und Beispiel II (Im Falle einer Typ II Markierung) beschrieben ist. Wie vorher ist jedes Paar in der Lage, eine und nur eine Markierung in dem Pool zu verstärken.
Um die Verstärkungsprodukte zu erfassen, ist einer der Primer jedes Paares mit Biotin gekennzeichnet.
Die Markierung und Beprobung des Materials ist so, wie dies oben im Beispiel 1 beschrieben ist. Eine Reihe von PCR-Reaktionen wird eingerichtet, wobei jede Reaktionsröhre ein unterschiedliches Primer-Paar, gewählt aus dem Satz der Oligonukleotid-Primer enthält, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Die Detektion und Quantifizierung des Verstärkungsprodukts wird durch eine periodische Probennahme aus jeder Reaktionsröhre während der exponentiellen Phase der Verstärkung bewirkt. Die Probe wird auf eine Mikroplatte aufgebracht, deren Vertiefungen mit Streptavidin beschichtet sind. Ein mit nicht eingebautem Biotin gekennzeichneter Primer sowie alle Verstärkungsprodukte werden in der Vertiefung gefangen. Die Vertiefungen werden dann mehrfach mit einem Puffer ausgewaschen. Die Verstärkungsprodukte werden dann denaturiert, um eine einstrangige DNS, die an die Mikroplatte gebunden ist, freizulegen, und die komplementären Stränge werden weggespült. Eine mit Fluorescein gekennzeichnete Sonde mit einer Sequenz komplementär zu der generischen Sequenz der Region B wird der Mikroplatte hinzugegeben und darf an die gebundene einstrangige DNS hybridisieren. Der Anti-Fluorescein-Antikörper, der an die Alkalin-Phosphatase angehängt ist, wird dann zusammen mit einem chemilumeneszenten Substrat hinzugegeben und die Lichtemission in einem Luminometer detektiert und gemessen. Das Vorhandensein einer Lichtemission gibt einen Hinweis auf eine erfolgreiche Verstärkung und somit die Identität der Nukleinsäuremarkierung, während die Menge des emittierten Lichts einen Hinweis auf die Menge des Verstärkungsprodukts gibt. Wie oben mit Bezug auf Beispiel 1 beschrieben, kann dies gegenüber einer Standardkurve verglichen werden, um die Anfangskonzentration der Markierung in der Probe und somit in dem markierten Material zu geben.
Beispiel V: Typ III Markierung detektiert und quantifiziert durch 5'Nuklease-Prüfung
Ein Typ III kann verwendet werden, um ein Material zu markieren und kann mittels der 5'Nuklease-Prüfung identifiziert und quantifiziert werden.
Ein Pool von einstrangigen DNS-Oligonukleotid-Markierungen wird entsprechend herkömmli chen Oligonukleotid-Syntheseverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, synthetisch hergestellt. Die Markierungen haben vorzugsweise eine Länge von etwa 70 Nukleotiden (nt) und enthalten eine Identifizierungssequenz. Zum Beispiel kann der Pool die folgenden Markierungen enthalten: SEQ ID: NO 13
SEQ ID: NO 14
In einer Typ III Markierung ist nur eine Identifizierungssequenz, welche sich von Markierung zu Markierung unterscheidet, vorhanden (Region B). Die Regionen A und C haben Sequenzen, welche in allen Markierungen im Pool gleich sind. Eine einzelne Oligonukleotid-Markierung wird aus dem Pool gewählt und dazu verwendet, ein Material zu markieren, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Danach wird ein Teil des markierten Materials beprobt und einer Analyse unterzogen, um seine Identität und/oder die Quantität der Markierung in der Probe zu bestimmen. Dafür wird ein Paar Oligonukleotid-Primer synthetisch hergestellt, von denen einer eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in Region A und der andere eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in Region C hat. Alternativ kann ein Primer eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz in Region A und der andere eine Sequenz bestehend aus einer Sequenz in Region C haben. Zudem wird auch ein Satz gekennzeichneter Oligonukleotid-Sonden synthetisch hergestellt, wobei jede Sonde in dem Satz eine Sequenz komplementär oder korrespondierend zu einer Sequenz in Region B einer einzigen Markierung in dem Pool hat. Die Sonden werden gekennzeichnet durch Verwenden von fluoreszierenden Markierungen mit unterschiedlichen Emissionsmaxima. So kann zum Beispiel eine Sonde in dem Satz mit Rhodamin gekennzeichnet sein und die andere mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Jede Sonde ist auch an ein Dämpfungsmittel gebunden, welches das Signal von dem fluoreszierenden Signal in einer intakten Oligonukleotid-Sonde dämpft.
Um die Markierung zu identifizieren und zu quantifizieren, die verwendet wird, um das Mate rial zu markieren, wird eine 5'Nukleasereaktion eingerichtet, die ein Paar Oligonukleotid-Primer zusätzlich zu einer Anzahl von unterschiedlich gekennzeichneten Sonden des Satzes enthält. Da das Primer-Paar komplementär zu den Sequenzen in den „generischen" Regionen des Pools ist, wird jede in der Probe vorhandene Markierung verstärkt, welche Intensität sie auch immer hat. Jedoch nur eine der gekennzeichneten Sonden wird sich während der Reaktion an die Oligonukleotid-Markierung binden. Wie in Beispiel 1 oben beschrieben ist, wird eine gekennzeichnete Sonde, die an ihre komplementäre Sequenz in der Markierung hybridisiert ist, 5' bis 3' stromabwärts eines Verstärkungsprimers liegen, der an die Markierung hybridisiert ist, und 5' bis 3'Exonuklease-Aktivität der Taq DNS-Polymerase wird die gekennzeichnete Sonde während der DNS-Synthese zersetzen, um gekennzeichnete Fragmente freizusetzen. Wie oben, ist das Dämpfungsmittel nicht in der Lage, das Signal von einer fluoreszierenden Markierung in einem freigesetzten Fragment zu dämpfen. Da verschiedene Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden, um die verschiedenen Sonden zu kennzeichnen, die in der 5'Nuklease-Reaktion vorhanden sind, wird das von der 5'Nuklease-Reaktion emittierte Fluoreszenzsignal eine von mehreren Wellenlängen haben, innerhalb welcher davon, welche spezielle Sonde zersetzt wird. Um das emittierte Signal zu detektieren, wird deshalb ein Mehrkanal-Detektor verwendet, der in der Lage ist, eine emittierte Strahlung in einer Anzahl unterschiedlicher Wellenlängen zu detektieren. Da bekannt ist, welches Fluorophor verwendet wurde, um die Sonde zu kennzeichnen, wird die Detektion der Wellenlänge (oder Farbe) des emittierten Lichts ein Hinweis darauf sein, welche gekennzeichnete Sonde an die Markierung gebunden war und während der Reaktion zersetzt wurde, und somit die Identität der Oligonukleotid-Markierung in dem Pool liefern, die verwendet wurde, um das Material zu markieren. Die Stärke des Signals steigt während einer erfolgreichen Reaktion exponentiell und eine geeignete Kalibrierung des Detektionssystems wird ermöglichen, die Anfangskonzentration der Oligonukleotid-Markierung zu bestimmen, wie dies oben im Beispiel 1 erläutert ist.
Es wird klar, dass der Vorteil der Verwendung einer 5'Nuklease-Prüfung mit Typ III Markierungen darin besteht, dass es theoretisch möglich ist, die Markierung zu identifizieren und zu quantifizieren, indem eine einzige Verstärkungsreaktion verwendet wird. Diese Technik ist nur durch die Anzahl getrennter Fluoreszenz-Markierungen beschränkt, die verfügbar sind, um die verschiedenen Oligonukleotid-Sonden zu kennzeichnen, und durch die Fähigkeit der Mehrkanal-Detektoren, zwischen den Wellenlängen des emittierten Signals zu unterscheiden. Gegenwärtige Mehrkanal-Detektoren sind in der Lage, bis zu acht unterschiedliche Wellenlängen zu detektieren, was bedeutet, dass es gegenwärtig möglich ist, acht unterschiedlich gekennzeichnete Oligonukleotid-Sonden in der 5'Nuklease-Reaktion zu haben.
Mehrere solcher Reaktionen müssen daher in Abhängigkeit von der Größe des Pools von Markierungen ausgeführt werden. Jedoch mit fortschreitender Technologie erwarten wird, dass es in Zukunft möglich sein wird, einen „Ein-Rohr"-Erfassungs- und Quantifizierungsprozess zu haben.
Beispiel VI: Detailliertes Beispiel zur Darstellung einer Typ II Markierung in 5'Nuklease-Prüfung
Zwei Stufen sind das Design von Oligonukleotid-Markierungen einbezogen, die Zufallssequenz-Erzeugung und das Primer/Sonde-Design. In der ersten Stufe wird eine große Anzahl von wahlfreien DNS-Sequenzen von 100 Basen Länge unter Verwendung einer PC/Gen-Software erzeugt, die vertrieben wird von Oxford Molecular Limited, Vereintes Königreich. Jede Software, die in der Lage ist, wahlfreie DNS-Sequenzen zu erzeugen, kann verwendet werden. Die Sequenzen werden so gewählt, dass sie eine nominale gleiche Zusammensetzung für alle vier Basen haben und die erzeugten Sequenzen werden in geeignete Primer/Sonde-Designsoftware für die zweite Stufe des Primer/Sonde-Desgin exportiert.
Die Software, die verwendet wird, um die Primer und die Sonde zu gestalten, ist „Primer Express" von PE Applied Biosystems. „Primer Express" ist erhältlich als Teil der Software zum Betrieb der PE-ABI 7700 Analysehardware, die verwendet wird um 5'Nuklease-Prüfungen durchzuführen, wobei diese Hardware auch von PE Applied Biosystems hergestellt und vertrieben wird. Der detaillierte Betrieb der Software ist in dem gebundenen Handbuch beschrieben, das der Software beigefügt ist. Die „Primer-Express" Software wendet die normalen Regeln für das PCR-Primerdesign (zum Beispiel die Notwendigkeit, Haarnadeln zu vermeiden, das Erfordernis, dass die Primer eine passende T_m haben, etc), auf das Design der Primer an. Zudem vermeidet die Software eine signifikante Komplementärbildung zwischen der Sonde und den beiden PCR-Primern und stellt sicher, dass die Sonde komplementär zu der Sequenz von Interesse ist und an einer Region zwischen den zwei Primern bindet. Die Software stellt auch sicher, dass die Sonde eine T_m von wenigstens 10 Grad Celsius höher als die beiden Verstärkungsprimer hat und an dem 5'Ende der Sonde kein G hat.
Sobald eine wahlfreie Oligonukleotidsequenz in die „Primer Express" Software importiert worden ist, wird die Software angewiesen, ein neues Sonden- und Primerdesign zu erzeugen. Die Software wird dann angewiesen, und zwar unter Verwendung der „Find Primers/Probe Now" Funktion, die ersten 200 Primer- und Sondenkombinationen zu bestimmen, die mit dem Standardsatz an Parametern übereinstimmt, welche mit der Software geliefert werden. Die Standardeinstellungen sind wie folgt: Minimum T_m für beide Primer wird eingestellt auf 50 Grad C, Maximum T_m wird eingestellt auf 60 Grad C und die optimale T_m wird eingestellt auf 58 Grad C. Die maximale T_m Differenz zwischen den Primern beträgt 2 Grad. Der GC-Gehalt der Primer wird eingestellt auf ein Minimum von 20%, ein Maximum von 80%, ohne eine 3'GC-Klammer für jeden Primer. Die minimale Länge des Primers wird auf 9 eingestellt, auf das Maximum 40, und die optimale Länge ist 20. Die minimale T_m des Amplicon wird eingestellt auf 0 Grad, die maximale T_m beträgt 85 Grad, während die minimale und die maximale Länge des Amplicon 50 bzw. 150 beträgt. Die Sonde T_m wird eingestellt auf wenigstens 10 Grad höher als die T_m der Primer und die Folge der Sonde wird so engestellt, dass diese nicht mit einem G beginnt. Die maximale Basenwiederholung der Primer wird eingestellt auf 3 Residuen, während die sekundären Strukturanforderungen an den Primer wie folgt eingestellt werden: maximales Folgebasispaar 3, maximal gesamtes Basispaar 8. Die Primer- und Sodenkombination mit der geringsten Strafwertung in Bezug auf das Oligonukleotid werden dann identifiziert und die Sondenfolge wird dann als Basis zum Gestalten der Primer für die weiteren wahlfreien Oligonukleotid-Sequenzen verwendet, wie dies unten beschrieben wird.
Die oben identifizierte „gemeinsame Sondensequenz" wird in das nächste wahlfreie Oligonukleotid eingesetzt, das in die „Primer Express" Software importiert wird. Zu diesem Zweck werden die Edit-Funktionen der „Primer Express" Software verwendet, wie dies in größerem Detail in dem Betriebshandbuch für die Software beschrieben ist. Die Erfahrung hat gezeigt, dass der beste Platz zum Einfügen der Sondensequenz um die Basenposition 35 herum ist. Die eingesetzte Sondensequenz kann dann unter Verwendung der Software fixiert werden und die „Find Primers/Probe Now" Routine wieder durchgeführt werden, um die optimalen Primer-Paare auf der resultierenden Sequenz zu lokalisieren (das heißt, die wahlfreie Sequenz mit der eingesetzten Sonde). Es wird deutlich, dass, da die Software angewiesen wird, die Sondensequenz zu fixieren, diese Sequenz in allen Fällen die gleiche sein wird. Die Primer-Paare, die für die verschiedenen wahlfreien Oligonukleotide bestimmt werden, werden jedoch variieren, weil die Regionen, welche die gemeinsame Sondenregion flankieren, unterschiedlich sind, da sie wahlfrei erzeugt werden. Das beste optimale Primer-Paar wird für die Verwendung gewählt, selbst dann, wenn dieses Paar eine höhere Strafwertung hat als das beste nicht optimale Paar.
Es wird deutlich, dass die Einfügung der Sondensequenz in ein wahlfreies Oligonukleotid eine Sequenz von mehr als 100 Basen erzeugt. Dies kann auch zwei Wegen vermieden werden. Zuerst können die wahlfreien Oligonukleotide, die in der ersten Stufe erzeugt werden, so gewählt werden, dass sie in etwa 70 Basen lang sind, anstelle von 100 Basen. Auf diese Weise wird die Einfügung der Sondensequenz ermöglichen, dass die gesamte Länge der Sequenz weniger als etwa 100 Basen beträgt, und die „Find Primers/Probe Now" Routine kann auf die Sequenz angewendet werden. Dies führt jedoch nicht immer zu zufriedenstellenden Ergebnissen, da die Position, an welcher die Sonde eingesetzt wird, das Ergebnis der Primer-Suchroutine beeinflussen wird. In einigen Fällen können keine zufriedenstellenden Primer-Paare erzeugt werden, und das spezielle wahlfreie Oligonukleotid wird entsorgt werden müssen und die obige Prozedur an dem nächsten wahlfreien Oligonukleotid versucht werden.
Alternativ können die wahlfreien Oligonukleotide, die in der ersten Stufe erzeugt werden, auf einer Länge von 100 Basen beibehalten werden. Die Sondenfolge wird die wahlfreien Oligonukleotid-Sequenzen eingesetzt, und sobald zufriedenstellende Primer-Paare geschaffen worden sind, kann das resultierende Oligonukleotid in der „Primer Express" Software so editiert werden, dass alle redundanten Sequenzen entfernt werden. Zum Beispiel kann festgestellt werden, dass Fremdsequenzen in dem Oligonukleotid vorhanden sind, die außerhalb der Primer-Sequenzen liegen. Mit anderen Worten, können die Primer-Sequenzen nicht an den äußersten Enden der Oligonukleotid-Sequenz liegen. In diesem Falle kann das Oligonukleotid so editiert werden, dass diese Sequenzen entfernt werden, um die Länge des Oligonukleotids zu verringern, und die „Find Primers/Probe Now" Routine kann wieder für die editierte Sequenz durchgeführt werden.
Es sei angemerkt, dass die Verwendung der „Primer Express" Software beim Gestalten von Oligonukleotid-Primern und -Sonden nur als eine Hilfe angesehen werden sollte, um die Chancen zu maximieren, dass die 5'Nuklease-Prüfung gut arbeitet. Das einzige absolute Kriterium, dass angewendet werden muss, ist, ob die Prüfung tatsächlich in Wirklichkeit läuft. So sollte nur eine Sondensequenz, die in einer Prüfung gut gearbeitet hat, als die gemeinsame Sondensequenz ausgewählt werden, und eine ungeprüfte Sondensequenz sollte niemals als Basis für das Markierungsdesign verwendet werden. Selbst dann, wenn die Sonde mit einem speziellen Satz an Primern an einem spezifischen Zielobjekt gut arbeitet, muss sie nicht immer gut arbeiten. Alle DNS-Designs sollten ausprobiert werden, bevor die Markierung für wirtschaftliche Zwecke freigegeben wird.
Die Oligonukleotid-Markierungen, -Primer und -Sondensequenzen werden dann wirtschaftlich von gewöhnlichen Syntheseunternehmen bestellt. Um die Gefahr einer Verunreinigung zu minimieren, sollten verschiedene Synthesehäuser für die Synthese der Oligonukleotid- Markierungen und -Primer genutzt werden. Andernfalls können Primer mit verschiedenen Markierungen verunreinigt sein, was zu „negativen" Kontrollen führt, die ein positives Signal liefern und folglich die Empfindlichkeit der Detektion vermindern. Idealerweise sollte ein drittes Synthesehaus für die Produktion der Sonde genutzt werden. Die gekennzeichneten Sonden sollten in einem Puffer geliefert werden und sollten vor Licht geschützt sein.
Die Prüfungsbedingungen sollten standardisiert sein, indem ein einzelnes Puffer-Gemisch verwendet wird, wobei die einzigen Varianten die verwendeten Primer und die zu analysierende Probe des Materials ist. Da die 5'Nuklease-Prüfung auf einer Polymerase-Kettenreaktion basiert, sollte sich an die Anforderungen zum Durchführen erfolgreicher PCR-Prüfungen gehalten werden. Die Anforderungen wurden in verschiedenen Publikationen im Detail ausgeführt und es wird davon ausgegangen, dass der Fachmann diese Anforderungen kennt.
Die 5'Nukleaseprüfung wird unter Verwendung der gleichen Komponenten wie bei einer normalen PCR durchgeführt, mit Ausnahme hinsichtlich der Hinzugabe der gekennzeichneten Sonde. Die PCR-Komponenten werden vertrieben von PE-Applied Biosystems als das „Taqman PCR Cor Reagent Kit", welches die Teile-Nummer N8080288 hat. Die Komponenten des Kits sind wie folgt: Puffer A bei 10X Materialkonzentration zum Puffern des pH-Wertes und zum Bereitstellen einer fluoreszierenden Bezugsfarbe, Magnesiumchlorid bei 25 mM Materialkonzentration zum Bereitstellen von Mg²⁺ Ionen, die für die Aktivität der DNS-Polymerase benötigt werden, dATP bei 10 mM Materialkonzentration (Adeninnukleotid, benötigt für DNS-Extension), dUTP bei 10 mM Materialkonzentration (Uracilnukleotid, benötigt für DNS-Extension), dGTP bei 10 mM Materialkonzentration (Guaninnukleotid, benötigt für DNS-Extension), dCTP bei 10 mM Materialkonzentration (Cytosinnukleotid, benötigt für DNS-Extension) und Uracil N Glycosidase (UNG) bei 1 Einheit/Mikroliter, um einen DNS-Übergang von einer Prüfung zur nächsten zu verhindern. Das UNG-Enzym wird während der PCR-Reaktion inaktiviert, wird aber jede DNS, die zum Beginn des PCR-Prozesses Uracil enthält, hydrolysieren. Auf diese Weise verhindert das Enzym jede DNS daran, von einer PCR-Reaktion zur nächsten übertragen zu werden. Die PCR-Fläschchen sollten nicht geöffnet werden eine DNS-Übertragung zu verhindern.
Die Oligonukleotid-Primer und die gekennzeichneten Sonden sollten als 5 mikromolare Materiallösungen in einem geeigneten Puffer formuliert sein, welche die folgende Zusammensetzung hat: 1 mH Tris-HCl bei pH 8,3, 5 mM KCl und 0,2 mM Magnesiumchlorid. Die Primer- und Sondenlösungen werden restlos in eine Anzahl von Fläschchen aufgeteilt und tief gefroren gelagert, bis sie benötigt werden. Kein Fläschchen sollte mehr als 5 Gefrier/Tau-Zyklen durchlaufen.
Das „Tagman PCR Core Reagent Kit" und die 5 mikromolaren Sonden-Materiallösungen werden dann wie folgt zusammengemischt: 100 Mikroliter Puffer A, 220 Mikroliter Magnesiumchlorid, 20 Mikroliter dATP, 20 Mikroliter dUTP, 20 Mikroliter dGTP, 20 Mikroliter dCTP, 5 Mikroliter von AmpliTaq Gold (Taq DNS-Polymerase), 10 Mikroliter UNG, 25 Mikroliter gekennzeichnete Sonde und 120 Mikroliter Wasser. Die resultierenden 65 Mikroliter reichen aus für 40 Prüfungen, falls 14 Mikroliter pro Prifungsfläschchen verwendet wird. Zu jedem der Prüfungsfläschchen werden dann 4,5 Mikroliterjeweils des Vorwärts- und Rückwärts-Primers, 5 Mikroliter der oben beschriebenen 5 mikromolaren Materiallösungen und 2 Mikroliter der Probe mit der zu analysierenden Markierung hinzugegeben. Die resultierende Lösung hat die folgenden Endkonzentrationen jeder Komponente: 1X Puffer A, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 0,025 Einheiten/Mikroliter AmpliTaq Gold, 0,05 Einheiten/Mikroliter UNG, 0,125 Mikromol gekennzeichnete Sonde, 0,9 Mikromol Vorwärts-Primer und 0,9 Mikromol Rückwärts-Primer. Die Endkonzentration der Zielmarkierung ist unbekannt.
Entweder optische 96-Lochplatten oder optische Röhren können als Reaktionsbehälter verwendet werden. Die erstgenannten haben die Katalognummer N8010560 und letztgenannten die Katalognummer N8010933, erhältlich von PE-Applied Biosystems. Beide von diesen benötigen optische Kappen (Katalognummer N8010935 von PE-Applied Biosystems). Der ABI Prism 7700 Sequenzdetektor, hergestellt durch PE-Applied Biosystems, wird zum Durchführen der PCR und zum Detektieren des Fluoreszenzsignals verwendet und sollte in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers betrieben werden.
Figurenbeschreibung
1

2

Standard Curve: Standardkurve
Seed tags + Genos ink: Samenmarkierungen und Genosfarbe
Unknowns: Unbekannte
Standards: Standards
Slope: Steigung
Y-Intercept: Y-Erfassung
Correlation Coeff: Korrelationskoeffizient
Threshold Cycle (Ct): Ansprechzyklus (Ct)
Starting Quantity: Ausgangsmenge

Claims

Verfahren zum Detektieren, ob eines aus einer Mehrzahl von Materialien durch einen Marker mit einer Nukleinsäuremarkierung markiert wurde, bei welchem die Sequenz der Nukleinsäuremarkierung spezifisch für das Material ist, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Beproben eines Teils des Materials; und (b) Detektieren des Vorhandenseins der Nukleinsäuremarkierung in der Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuremarkierung bestimmt wird, um einen Hinweis auf die Menge des in dem Material vorhandenen Markers zu liefern.
Verfahren nach Anspruch 1, vor dem Schritt (a) zusätzlich mit dem Schritt: (i) Hinzufügen oder Aufbringen eines Markers mit einer Nukleinsäuremarkierung auf dem Material.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches ferner umfasst den Schritt einer Verstärkung wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, wobei der Verstärkungsbetrag der benötigt wird, dass der Betrag der verstärkten Nukleinsäuremarkierung ein vorbestimmtes Niveau erreicht, als ein Hinweis für die Menge der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuremarkierung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Nukleinsäuremarkierung wenigstens eine die Markierung identifizierende Sequenz aufweist, wobei das Verfahren zudem die Schritte umfasst: (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche ein Berühren der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer beinhaltet, der eine Sequenz ent sprechend der die Nukleinsäuremarkierung identifizierenden Sequenz aufweist; und (d) Bestimmen des Verstärkungsbetrages, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäuremarkierung ein vorbestimmtes Niveau als Hinweis für eine in der Probe vorhandene Menge des Markers erreichen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Nukleinsäuremarkierung eine erste und zweite Region umfasst, welche eine die Markierung identifizierende Sequenz flankieren; wobei Schritt (b) zusätzlich ein Trennen der Nukleinsäuremarkierung von der Probe umfasst; wobei das Verfahren zudem die Schritte umfasst: (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, welche ein Berühren der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer beinhaltet, der eine Sequenz entsprechend der ersten Region der Nukleinsäuremarkierung aufweist, und (d) Bestimmen des Verstärkungsbetrages, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäuremarkierung ein vorbestimmtes Niveau als Hinweis auf eine Menge eines in der Probe vorhandenen Markers erreichen kann.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Nukleinsäuremarkierung eine erste und eine zweite Region umfasst, welche eine die Markierung identifizierende Sequenz flankieren, und wobei der Schritt (b) zusätzlich den Schritt umfasst: (c) Berühren der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer, der aufweist eine Sequenz entsprechend einer in der ersten Region der Nukleinsäuremarkierung enthaltenden Sequenz und einen Oligonukleotid-Fühler, der eine Signaleinrichtung trägt und eine Sequenz entsprechend der identifizierenden Sequenz aufweist; (d) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion, welche eine Nukleinsäure-Polymerase mit einer 5' bis 3' Exonuklease-Aktivität beinhaltet, in welcher Fragmente, die Signaleinrichtungen tragen, von dem Oligonukleotid-Fühler während der Nukleinsäureverstärkung freigegeben werden; und (e) Detektieren freigegebener Fragmente als einen Hinweis, dass eine Verstärkung stattgefunden hat, und somit, dass das Material markiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Nukleinsäuremarkierung wenigstens eine die Markierung identifizierende Sequenz umfasst, wobei das Verfahren zudem die Schritte umfasst: (e) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion, weiche ein Berühren der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid beinhaltet, das eine Sequenz entsprechend der die Nukleinsäuremarkierung identifizierenden Sequenz aufweist; und (d) Bestimmen des Verstärkungsbetrages, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäuremarkierung ein vorbestimmtes Niveau als Hinweis auf eine Menge des in der Probe vorhandenen Markers und somit der Menge des Markers im Material erreichen kann.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem der Schritt (i) die Schritte umfasst: (ii) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuremarkierungen, wobei jede Nukleinsäuremarkierung eine generische Region mit einer Sequenz aufweist, die in allen Nukleinsäuremarkierungen in dem Pool vorhanden ist, wobei die generische Region durch Code-Regionen mit die Markierung identifizierenden Sequenzen flankiert ist; (ii) Auswählen einer speziellen Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool; und (iv) Hinzufügen oder Aufbringen eines Markers mit der ausgewählten Nukleinsäuremarkierung auf das Material.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Nukleinsäuremarkierung aus einem bekannten Pool unterschiedlicher Nukleinsäuremarkierungen stammt, wobei jede Nukleinsäuremarkierung im Pool wenigstens eine die Markierung identifizierende Sequenz umfasst, wobei Schritt (b) die Schritte umfasst: (c) Einrichten einer Mehrzahl von Nukleinsäuren-Verstärkungsreaktionsmedien, wobei jedes Medium ein Oligonukleotid enthält, das eine Sequenz aufweist, welches der eine andere bekannte Nukleinsäuremarkierung in dem Pool identifizierenden Sequenz entspricht und eine andere Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool verstärken kann; (d) Berühren der Nukleinsäuremarkierung der Probe mit jedem der Reaktionsmedien; und (e) Detektieren, welches der Reaktionsmedien zu der Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung als Hinweis auf die Identität der speziellen Nukleinsäuremarkierung führt, welche zum Markieren des Materials verwendet wurde.
Verfahren nach einem der Anspruche 3, 4 oder 7, in welchem die Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
Verfahren nach Anspruch 10, soweit abhängig von Anspruch 3, in welchem die Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer in Berührung gebracht wird, der eine Sequenz aufweist, die einer in der Nukleinsäuremarkierung enthaltenden ersten Sequenz entspricht und die Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung initiieren kann.
Verfahren nach Anspruch 11, in welchem die erste Sequenz eine die Nukleinsäuremarkierung identifizierende Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 10, soweit abhängig von den Ansprüchen 4 oder 7, oder nach Anspruch 11 oder 12, in welchem die Nukleinsäuremarkierung mit einem Oligonukleotid-Fühler berührt wird, der eine Signaleinrichtung trägt und eine Sequenz aufweist, die einer in der Nukleinsäuremarkierung enthaltenen zweiten Sequenz entspricht, wobei die PCT-Reaktion eine Nukleinsäure-Polymerase mit einer 5' bis 3' Exonuklease-Aktivität beinhaltet, um die Freigabe von die Signaleinrichtung tragenden Fragmenten von dem Oligonukleotid-Fühler während der Nukleinsäureverstärkung zu veranlassen.
Verfahren nach Anspruch 12, in welchem die Nukleinsäuremarkierung ferner eine zweite identifizierende Sequenz umfasst, wobei die Nukleinsäuremarkierung mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer in Berührung gebracht wird, der eine Verstärkung der Markierung initiieren kann und eine Sequenz aufweist, die der zweiten identifizierenden Sequenz entspricht.
Verfahren nach Anspruch 13, soweit abhängig von Anspruch 11, in welchem die zweite Sequenz eine die Nukleinsäuremarkierung identifizierende Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die Nukleinsäuremarkierung ferner eine zweite identifizierende Sequenz für die Nukleinsäuremarkierung umfasst, wobei die erste und die zweite identifizierende Sequenz die zweite Sequenz flankieren.
Verfahren nach Anspruch 16, in welchem die Nukleinsäuremarkierung mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer in Kontakt gebracht wird, der eine Verstärkung der Markierung initiieren kann und eine Sequenz aufweist, die der zweiten identifizierenden Sequenz entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 7 oder 10 bis 15, in welchem die Menge der verstärkten Nukleinsäure in der Verstärkungsreaktion durch Messen des an einen Nukleinsäurefühler hybridisierbaren Nukleinsäurematerials bestimmt wird, wobei der Nukleinsäurefühler eine Sequenz hat, die einer Sequenz entspricht, die in der Nukleinsäuremarkierung enthalten ist, wobei die Sequenz keine Sequenz ist, die zum Initiieren der Nukleinsäureverstärkung verwendet wird und diese nicht überlagert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, 7, 13, 16 oder 17, in welchem die Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei das erste Oligonukleotid ein Primer ist, der die Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung initiieren kann.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Nukleinsäuremarkierung eine erste und eine zweite Region aufweist, welche eine identifizierende Sequenz für die Markierung flankiert; wobei der Schritt (b) zudem ein Trennen der Nukleinsäuremarkierung von der Probe umfasst; wobei das Verfahren zudem die Schritte umfasst: (c) Verstärken wenigstens eines Teils der Nukleinsäuremarkierung mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion, welche ein Berühren der Nukleinsäuremarkierung mit einem ersten Oligonukleotid-Primer beinhaltet, der eine Sequenz entsprechend der ersten Region der Nukleinsäuremarkierung aufweist, wobei der erste Oligonukleotid-Primer eine Verstärkung der Nukleinsäuremarkierung initiieren kann, und (e) Bestimmen des Verstärkungsbetrages, der erforderlich ist, damit die verstärkte Nukleinsäuremarkierung ein vorbestimmtes Niveau als Hinweis auf eine Menge eines in der Probe vorhandenen Markers erreichen kann, und in welcher die Nukleinsäuremarkierung mit einem Nukleotid-Fühler in Kontakt gebracht wird, der eine Signaleinrichtung trägt und eine Sequenz aufweist, die der identifizierenden Sequenz entspricht, wobei die PCR-Reaktion eine Nukleinsäure-Polymerase mit 5' bis 3' Exonuklease-Aktivität beinhaltet, um die Freigabe von Fragmenten, welche die Signaleinrichtung tragen, von dem Oligonukleotid-Fühler während der Nukleinsäureverstärkung zu veranlassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 11, 12, 14 oder 19, in welchem der erste Oligonukleotid-Primer eine Signaleinrichtung trägt, wobei ein Signal von einem ersten Oligonukleotid-Primer, der in einer verstärkten Nukleinsäure eingebaut ist, gemessen wird, um einen Hinweis auf die Menge der verstärkten Nukleinsäure in der Reaktion zu liefern.
Verfahren nach Anspruch 19, soweit abhängig von Anspruch 4, in welchem der erste Oligonukleotid-Primer eine Signaleinrichtung trägt, wobei ein Signal von einem ersten Oligonukleotid-Primer, der in eine verstärkte Nukleinsäure eingebaut ist, detektiert wird, um einen Hinweis zu liefern, dass eine Verstärkung stattgefunden hat.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, in welchem ein von einem ersten Oligonukleotid-Primer, der in eine verstärkte Nukleinsäure eingebaut ist, erfasstes Signal auf einem höheren Niveau liegt als ein Signal, das von dem ersten Oligonukleotid-Primer erfasste, wenn dieser nicht eingebaut ist.
Verfahren nach Anspruch 23, in welchem der erste Oligonukleotid-Primer eine Vergütungseinrichtung trägt, um ein Signal von der Signaleinrichtung zu verstärken, wenn der erste Oligonukleotid-Primer nicht eingebaut ist.
Verfahren nach Anspruch 23, in welchem der erste Oligonukleotid-Primer eine Vergütungseinrichtung trägt, um ein Signal von der Signaleinrichtung, die auf dem ersten Oligonukleotid-Primer liegt, zu verstärken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 19 oder 20, in welchem die Nukleinsäuremarkierung mit einem zweiten Oligonukleotid-Primer in Kontakt gebracht wird, der eine Verstärkung der Markierung initiieren kann und eine Sequenz aufweist, die einer in der zweiten Region enthaltenen Sequenz entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 15 bis 17 oder 20 oder Anspruch 26, soweit abhängig von Anspruch 20, in welchem ein Signal von der auf den frei gegebenen Frag menten getragenen Signaleinrichtung gemessen wird, um einen Hinweis der Menge der verstärkten Nukleinsäure in der Reaktion zu liefern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 15 bis 17, 26 oder 27, in welchem ein von einem frei gegebenen Fragment detektierbares Signal auf einem höheren Niveau liegt als ein von einem Oligonukleotid-Fühler detektierbares Signal.
Verfahren nach Anspruch 28, in welchem der Oligonukleotid-Fühler eine Vergütungseinrichtung trägt, um ein Signal von der auf dem Oligonukleotid-Fühler liegenden Signaleinrichtung zu verstärken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 13, 15 bis 17, 20 bis 25 oder 26 bis 29, in welchem die Signaleinrichtung ein fluoreszierendes Etikett ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24, 25, 28 oder Anspruch 30, soweit abhängig von Anspruch 29, in welchem die Vergütungseinrichtung das Signal von der Signaleinrichtung durch eine Förster-Resonanzenergieübertragung durch den Raum verstärkt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem der Marker ferner ein Indikatormittel umfasst, wobei das Vorhandensein des Indikatormittels in einem beprobten Teil des Materials als Hinweis detektierbar ist, dass eine Nukleinsäuremarkierung in dem beprobten Teil vorhanden ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem der Schritt des Beprobens eines Teils des markierten Materials ferner den Schritt eines Trennens der Nukleinsäuremarkierung von der Probe umfasst.
Verfahren zum Markieren eines Materials mit einer Nukleinsäuremarkierung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Pools von Nukleinsäuremarkierungen, wobei jede Nukleinsäuremarkierung eine generische Region mit einer Sequenz aufweist, die in alle Nukleinsäuremarkierungen im Pool vorhanden ist, wobei die generische Region durch Code-Regionen mit die Markierung identifizierenden Sequenzen flankiert ist; (b) Auswählen einer speziellen Nukleinsäuremarkierung aus dem Pool; und (c) Hinzufügen oder Aufbringen eines Markers mit der ausgewählten Nukleinsäuremarkierung auf das Material.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die Nukleinsäuremarkierung aus DNA besteht.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die Nukleinsäuremarkierung ein einzelsträngiges DNA-Oligonukleotid ist.