DE60014762T2

DE60014762T2 - Methode zum Nachweis von Ribonukleinsäuren

Info

Publication number: DE60014762T2
Application number: DE60014762T
Authority: DE
Inventors: Akihiro Sagamihara-shi Yokoyama; Takahiko Yokohama-shi Ishiguro; Juichi Yamato-shi Saitoh
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-05-24
Also published as: EP1055734B1; EP1055734A2; US6541205B1; DE60014762D1; EP1055734A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die qualitative und quantitative Analyse einer Ziel-RNA mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, von der angenommen wird, dass sie in einer Genmischung aus DNA, RNA oder Ähnlichem enthalten ist, und das Verfahren ist nützlich auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik, wie etwa Gendiagnostik und Ähnlichem. Ebenfalls bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren für die qualitative oder quantitative Analyse von Mikroorganismen in einer Umwelt, wie etwa Lebensmitteln, Innenräumen, Böden, Flüssen, dem Meer und Ähnlichem.
2. Diskussion des Hintergrunds
Im Allgemeinen ist eine hohe Spezifität und eine hohe Sensitivität für eine Untersuchung von biologischen Bestandteilen erforderlich. Eine Untersuchung einer Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz (Zielnukleinsäure), kann die Eigenschaft nutzen, dass die Nukleinsäuresequenz spezifisch einen Komplex mit einer anderen Nukleinsäure mit einer Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz bildet (Nukleinsäuresonde).
Wenn eine Zielnukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz untersucht wird, ist eine Einrichtung für den Erhalt eines messbaren Signals verbunden mit der Menge des gebildeten Komplexes wichtig. Ferner kann die Menge der Zielnukleinsäure, welche in einer Probe vorhanden sein kann, extrem klein für den Zweck der klinischen Diagnostik usw. sein, so dass ein derartiges Mittel einen Schritt für die Amplifikation der extrem geringen Menge der Nukleinsäure erfordert.
Bei der Diagnostik viraler Infektionen ist, da die Menge der Zielnukleinsäure (virale Nukleinsäure) in einer klinischen Probe oftmals extrem gering ist, eine Polymeraseketteneaktion (PCR), insbesondere einer kompetitive PCR, als ein Mittel für dem Erhalt einer hohen Sensitivität bei Verbesserung der Signalstärke bekannt, um die Messung mit hoher Sensitivität und guter Reproduzierbarkeit zu verwirklichen. In diesem Verfahren wird die PCR durch Zugabe eines Kompetitors (eine andere Nukleinsäuresequenz mit einer mit der Zielnukleinsäure gemeinsamen Erkennungsbereich) zu einer Probe in einer bekannten Konzentration durchgeführt, und die Konzentration der Zielnukleinsäure in der Probe wird durch den Vergleich der Amplifikationsgrade zwischen dem Kompetitor und der Zielnukleinsäure abgeschätzt. Spezifischer wird eine Nukleinsäure mit einer Sequenz komplementär zu einem Primer an ihren Terminus und die von dem amplifizierten Produkt der Zielnukleinsäure durch eine Trenneinrichtung, wie etwa Elektrophorese oder Ähnliche (zum Beispiel basierend auf einer unterschiedlichen Kettenlänge) hergestellt, diese Nukleinsäure wird zu einer Probe gegeben, um entsprechende Konzentrationen zu ergeben, und gleichzeitig wird eine PCR dieser Mischungen durchgeführt.
Zusätzlich wurde ein Untersuchungsverfahren in einem homogenen System vorgeschlagen, als ein Verfahren für die Untersuchung einer Zielnukleinsäure unter Verwendung von PCR. Zum Beispiel wurde ein Untersuchungsverfahren vorgeschlagen, in welchem PCR in der Anwesenheit eines interkalierenden Fluorochroms durchgeführt wird, wobei die Fluoreszenz der Reaktionslösung in jedem PCR-Zyklus gemessen wird, und die anfängliche Menge der Zielnukleinsäure auf der Grundlage ihrer Änderungen bestimmt wird (JP-A-5-237000 (der Begriff „JP-A" wie hierin verwendet, bedeutet eine „nicht geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung"); Igaku-no Ayumi, 173(12): 959-963 (1995); Analytical Biochemestry, 29: 207–213 (1995)). In diesem Untersuchungsverfahren ist das durch PCR amplifizierte Produkt eine doppelsträngige DNA, so dass ein interkalierendes Fluorochrom mit einer Eigenschaft der Änderung seiner Fluoreszenzkennzeichen, wie etwa einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität durch Interkalierung in die doppelsträngige Nukleinsäure verwendet wird, wobei das Fluorochrom zu der Reaktionslösung vor dem Amplifikationsvorgang durch PCR gegeben wird, die Fluoreszenzintensität in der Reaktionslösung wird über die Zeit gemessen und die anfängliche Menge der Zielnukleinsäure wird zum Beispiel aufgrund seines Aufbauzyklus' usw. bestimmt.
Auf der anderen Seite sind das NSABA-Verfahren und das 3SR-Verfahren ebenfalls als RNA-Amplifikationsverfahren bekannt. In diesen Verfahren wird ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit einer Promotersequenz für eine Ziel-RNA unter Verwendung eines Primers mit der Promotersequenz synthetisiert, einer reversen Transkriptase und einer Ribonuklease H, wird eine RNA mit einer spezifischen Nukleotidsequenz der Ziel-RNA in der Anwesenheit einer RNA-Polymerase synthetisiert, und dann wird eine Kettenreaktion durchgeführt, in welcher die RNA nachfolgend als die Matrize für die Synthese der doppelsträngigen DNA mit der Promotersequenz verwendet wird. Danach, wenn die RNA amplifiziert ist, wird die Reaktion beendet und die amplifizierte RNA wird durch ein elektrophoretisches Verfahren oder ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde nachgewiesen.
In dem Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde, bildet eine Nukleinsäuresonde, die auf eine derartige Art und Weise markiert ist, dass sie ein messbares Signal ergibt, wie etwa sichtbares Licht, Fluoreszenz, Emission oder Ähnliche, einen Komplex mit einer Zielnukleinsäure, und die nicht reagierte Nukleinsäuresonde wird weggewaschen oder abgebaut, und die Markierung wird gemessen, um die Zielnukleinsäure zu untersuchen. Ein Sandwich-Assay genanntes Verfahren ist allgemein bekannt, welches zwei Sonden jeweils mit einer Sequenz verwendet, die eine komplementäre Bindung mit einer spezifischen Sequenz an verschiedenen Bereichen in einer spezifizierten Nukleinsäure ausbilden kann. In diesem Verfahren wird eine erste Sonde auf einem unlöslichen Träger immobilisiert, und ein Teil einer zweiten Sonde wird mit einem Farbstoff mit einer Farbe in sichtbarem Bereich, einem fluoreszierenden Material oder einem Enzym markiert, das diese bilden kann. Dann werden diese Sonden zu einer Probe gegeben, eine spezifische Nukleinsäure in der Probe wird komplementär zu der ersten und zweiten Sonde gebunden und ein Komplex bestehend aus diesen drei Materialien wird auf dem unlöslichen Träger gebildet. Nachfolgend wird der resultierende Überstand in der Probenreaktionslösung von dem unlöslichen Träger getrennt, um die freie zweite Sonde (B/F-Trennungsschritt) abzutrennen. Danach wird das Vorhandensein oder die Abwesenheit und die Menge der spezifizierten Nukleinsäure in der Probe durch Messung der Markierung in dem Komplex auf dem unlöslichen Träger bestimmt. Ebenfalls wird, wenn ein Enzym, welches einen Farbstoff mit einer Farbe im sichtbaren Bereich bilden kann, oder wenn ein Fluoreszenzmaterial als die zweite Sonde verwendet wird, die freie zweite Sonde nach dem Komplexbildungsschritt entfernt, und ein Enzymsubstrat wird als der Vorläufer zu der Probenreaktionslösung gegeben, und dann wird die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Menge der Zielnukleinsäure in der Probe durch die Messung des Farbstoffs oder des fluoreszierenden Materials bestimmt, welches das Reaktionsprodukt ist.
Da der Sandwich-Assay einen unlöslichen Träger in der Reaktionslösung verwendet, wird die zweite Sonde nicht spezifisch auf dem unlöslichen Träger adsorbiert. Demgemäß wird die Markierung in dem Komplex auf dem unlöslichen Träger gemessen und Fehler treten in den gemessenen Ergebnissen aufgrund der Anwesenheit der Markierung der nicht spezifisch an den unlöslichen Träger adsorbierten zweiten Sonde auf. Folglich tritt ein Problem auf, wenn die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Menge der spezifizierten Nukleinsäure in der Probe bestimmt werden. Da insbesondere die Diagnostik von viralen Infektionen den Nachweis einer extrem kleinen Menge einer viralen Nukleinsäure in einer klinischen Probe mit einer guten Reproduzierbarkeit und einer hohen Sensitivität erfordert, ist das durch die unspezifische Adsorption verursachte Problem, ein wichtiges zu lösendes Problem.
Um dieses Problem zu vermeiden, wurden verschiedene Versuche gemacht, wie etwa eine hydrophile Behandlung der Oberfläche des unlöslichen Trägers, die Blockierung von Adsorptionspunkten auf der Trägeroberfläche mit einem Protein usw., ausreichendes Waschen des unlöslichen Trägers nach dem B/F-Abtrennungsschritt und Ähnliches.
Jedoch hängt bei der chemischen hydrophilen Behandlung der Trägeroberfläche das Ergebnis von dem Material des Trägers ab, und ist nicht immer technisch einfach. Ebenfalls gibt es bei dem Verfahren, in welchem die Trägeroberfläche mit einem Protein beschichtet wird, um die Adsorptionspunkte auf der Trägeroberfläche im vornherein zu blockieren, die Möglichkeit, dass das Protein mit dem Nukleinsäurerest oder der Markierung der zweiten Sonde interagiert, um eine zusätzliche, nicht spezifische Adsorption auf dem Träger zu verursachen. Zusätzlich gibt es bei dem B/F-Abtrennungsschritt eine arbeitsbedingte Begrenzung in der Steigerung der Anzahl der Waschungen. Folglich kann, z.B. wenn ein oberflächenwirksames Mittel zu der Waschlösung gegeben wird, der Abbau des auf dem Träger gebildeten Komplexes beschleunigt werden.
In dem kompetitiven PCR-Verfahren, ist es notwendig, um eine Testprobe zu untersuchen, einen Kompetitor mit verschiedenen Konzentrationen einschließlich einer angenommenen Nukleinsäurekonzentration herzustellen, und die PCR einer Probe durchzuführen, zu welcher der Kompetitor hinzugegeben wurde. Zusätzlich muss ein Abtrennungsvorgang, wie etwa Elektrophorese oder Ähnliches, durch Herausnahme der Probe aus dem Reaktionsbehälter nach Beendigung der PCR durchgeführt werden. Demgemäß ist es zu aufwendig, sie in klinischen Untersuchungen einzusetzen, in welcher eine große Anzahl von Proben schnell und bequem behandelt werden muss. Da ebenfalls die Probe aus der Reaktionslösung genommen werden muss, kann ein Problem der Verursachung einer falschpositiven Reaktion aufgrund der Verschleppung des amplifizierten Produkts nicht gelöst werden. Zusätzlich, wenn das Ziel RNA ist, muss eine sogenannte RT-PCR durchgeführt werden, in welcher PCR durchgeführt wird nachdem einmal eine cDNA unter Verwendung der RNA als die Matrize in der Anwesenheit einer reversen Transkriptase durchgeführt werden, so dass es im Wesentlichen notwendig ist, zwei Stadien von Schritten durchzuführen.
In dem Verfahren, in welchem PCR in der Anwesenheit eines interkalierenden Fluorochroms durchgeführt wird, ist seine Grundlage die Interkalation in eine doppelsträngige Nukleinsäure. Demgemäß, wenn andere doppelsträngige DNA, die die spezifizierte Nukleinsäure verunreinigen, wie etwa eine große Menge genomischer DNA oder Ähnliche, in der Testprobe vorhanden sind, wird das interkalierende Fluorochrom ebenfalls in ihnen interkalieren, und ein Problem der Erzeugung eines starken Hintergrunds zu verursachen. Ebenfalls wird in dem PCR-Verfahren ein Paar komplementärer Oligonukleotide der spezifizierten Nukleinsäure als Verlängerungsreaktionsprimer verwendet, aber sie bilden wechselseitig eine komplementäre Bindung in Abhängigkeit von den Primersequenzen und erzeugen manchmal als ein Ergebnis ein Primerdimer, das wechselseitig den anderen Primer als die Matrize verwendet. Da das interkalierende Fluorochrom nicht spezifisch in Doppelstränge interkaliert, verursacht es ebenfalls ein Problem, dass der Hintergrund aufgrund der Erzeugung eines derartigen Dimers ansteigt.
Wenn das NASBA-Verfahren oder das 3SR-Verfahren verwendet wird, ist es möglich, die amplifizierte Nukleinsäure durch ein Elektrophoreseverfahren oder ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde nach der Reaktion nach Amplifikation der RNA in einer ausreichend nachweisbaren Menge zu bestimmen. Jedoch ist es unmöglich, die ursprünglich in der Probe vor der Amplifizierung vorhandene Ziel-RNA zu bestimmen. Ebenso, wenn das Elektrophoreseverfahren oder das Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde durchgeführt wird, gibt es ein Problem, dass eine falschpositive Reaktion aufgrund der Verschleppung des Amplifizierungsprodukts auftritt.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 855 447 ist auf ein Verfahren für die Untersuchung von Nukleinsäuresequenzen gerichtet, wobei eine spezifische Nukleinsäure (RNA) in DNA durch das Enzym reverse Transkriptase umgeschrieben wird. Aus der resultierenden einzelsträngigen (ss)DNA wird eine doppelsträngige (ds)DNA mit einem Promoter für eine RNA-Polymerase erzeugt. Nachfolgend wird diese dsDNA unter Verwendung der PCR-Technik amplifiziert und von diesen Kopien der dsDNA wird eine Anzahl von ssRNA-Molekülen unter Verwendung einer RNA-Polymerase umgeschrieben. Schließlich werden diese ssRNA-Kopien durch eine DNA-Sonde mit einem interkalierenden Fluorochrom nachgewiesen. Auf der Grundlage der emittierten Fluoreszenz durch den interkalierenden Farbstoff ist es möglich, die anfängliche RNA-Kopienanzahl in der Probe abzuschätzen.
Saitho J. and Ishiguro T., Nucleic Acids Symposium Series No. 37, p. 113–114, (1997), ist auf den Nachweis einer spezifischen RNA durch Fluoreszenzüberwachung von in vitro- Transkripten (RNA) eines RT-PCR-Produkts gerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäss ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein schnelles, bequemes und sehr fehlerfreies Verfahren für die Untersuchung einer Ziel-RNA (einzelsträngige RNA) mit einer spezifizierten Nukleinsäuresequenz, die ursprünglich in der Probe vorhanden ist, zur Verfügung zu stellen, und insbesondere ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch welches der gesamte Vorgang in einem geschlossenen Behälter abgeschlossen werden kann.
Spezifisch bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Folgenden (1) bis (7).

(1) Ein Verfahren für die Untersuchung einer Zielnukleinsäure gemäß Anspruch 1.
(2) Das Verfahren nach dem Vorherigen (1), wobei die Zeit, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, die Zeit ist, um eine definierte Fluoreszenzintensität zu erreichen.
(3) Das Verfahren nach dem Vorherigen (1), wobei die Zeit, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, die Zeit ist, wenn die Anstiegsrate der Fluoreszenzintensität pro Zeiteinheit maximal wird.
(4) Das Verfahren nach einem der Vorherigen (1) bis (3), wobei die Konzentration der Zielnukleinsäure durch Vergleichen der Zeit bestimmt wird, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, mit den Zeiten von wenigstens zwei RNA-Proben, die die spezifische Nukleotidsequenz in verschiedenen Konzentration enthalten.
(5) Das Verfahren nach den Vorherigen (1), wobei in dem RNA-Amplifikationssystem, eine einzelsträngige DNA in der Anwesenheit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung eines Primers mit einer Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz und eines Primers mit einer zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz homologen Sequenz hergestellt wird, wobei einer der Primer ein Promoter-Primer ist, der eine Promotersequenz der RNA-Polymerase an der 5'-Seite hat und unter Verwendung der Ziel-RNA als eine Matrize; die doppelsträngige DNA in der Anwesenheit der DNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als eine Matrize hergestellt wird; das RNA-Transkriptionsprodukt aus der doppelsträngigen DNA in der Anwesenheit einer RNA-Polymerase hergestellt wird; und das RNA-Transkriptionsprodukt nachfolgend als die Matrize für die Herstellung der einzelsträngigen DNA in der Anwesenheit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet wird.
(6) Das Verfahren nach dem Vorherigen (1), wobei ein durch eine komplementäre Bindung zwischen der mit einem interkalierenden Fluorochrom markierten Sonde und dem RNA-Transkriptionsprodukt gebildeter Komplex unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften zu der mit einem interkalierenden Fluorochrom markierten Sonde hat, welche keinen Komplex mit dem RNA-Transkriptionsprodukt bildet.
(7) Das Verfahren nach den Vorherigen (1) oder (6), wobei die mit einem interkalierenden Fluorochrom markierten Sonde komplementär an das RNA-Transkriptionsprodukt bindet, so dass das interkalierende Fluorochrom zwischen einer hergestellten RNA und der Sonde interkaliert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁹ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 2 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁸ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 3 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁷ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 4 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁶ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 5 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁵ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 6 ist eine grafische Darstellung, die eine Reaktionszeit und eine Fluoreszenzanstiegsrate bei einer Konzentration von 10⁴ Kopien/Röhrchen (anfängliche RNA-Menge), durchgeführt im Beispiel 1, zeigt.
Die 7 ist eine Eichkurve, hergestellt aus der Durchschnittszeit, wenn die Fluoreszenzanstiegsrate 1,2 in einem Verhältnis zwischen der Reaktionszeit und der Fluoreszenzanstiegsrate in jeder im Beispiel 1 durchgeführten Probenkonzentration erreichte, wobei der Fehler bei die ±-Standardabweichung anzeigt.
Die 8 ist eine Eichkurve hergestellt aus der Durchschnittszeit, wenn die Fluoreszenzanstiegsrate in einem Verhältnis zwischen der Reaktionszeit und der Fluoreszenzanstiegsrate in jeder im Beispiel 1 durchgeführten Probenkonzentration maximal wurde, wobei der Fehlerbalken die ±-Standardabweichung anzeigt.
Die 9 ist eine Eichkurve hergestellt aus der Durchschnittszeit, wenn die Fluoreszenzanstiegsrate 1,2 in einer Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Fluoreszenzanstiegsrate in jeder der in Beispiel 2 durchgeführten Probenkonzentration erreichte.
Die 10 ist eine Eichkurve hergestellt aus der Durchschnittszeit, wenn die Fluoreszenzanstiegsrate in einer Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Fluoreszenzanstiegsrate in jeder der in Beispiel 2 durchgeführten Probenkonzentrationen ein Maximum erreichte.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Einige der Erfinder haben eine Nukleinsäuresonde entwickelt, welche eine Nukleinsäuresequenz komplementär zu einer spezifischen Nukleinsäuresequenz einer Zielnukleinsäure hat und mit einem interkalierenden Fluorochrom in einer derartigen Art und Weise markiert ist, dass ein messbares Fluoreszenzsignal erzeugt wird, wenn sie an die Zielnukleinsäure gebunden wird (JP-A-8-211 050; EP 714986 ; Nucleic Acids Research, 24(24): 4992–4997 (1996)).
Da diese Nukleinsäuresonde ein messbares Fluoreszenzsignal durch Bilden einer komplementären Bindung mit einer Zielnukleinsäure erzeugt, kann die Anwesenheit oder Abwesenheit der Bildung einer Komplementärbindung nachgewiesen werden, und der folglich gebildete komplementär gebundene Komplex kann ohne Trennung eines Abschnitts der Sonde aus dem Reaktionssystem untersucht werden, welcher nicht die komplementäre Bindung bildet. Danach haben die Erfinder gefunden, dass die Untersuchung einer ursprünglich in einer Probe vorhandenen Ziel-RNA bevorzugt in einem geschlossenen System durchgeführt werden kann, durch Amplifizierung der RNA durch die Wirkung von Nukleinsäureprimern und einer Nukleinsäurepolymerase in der Anwesenheit dieser Nukleinsäuresonde und Analyse einer Beziehung zwischen einer Fluoreszenzintensität und einer Zeit erhalten durch Messung der Fluoreszenzintensität über die Zeit. Folglich wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Untersuchung einer einzelsträngigen RNA (Ziel-RNA) mit einer spezifische Nukleotidsequenz in einer Probe zur Verfügung. Der Begriff „Untersuchung", wie hierin verwendet, bedeutet sowohl nachzuweisen ob die RNA in einer Probe vorhanden ist, oder nicht, und die Menge der ursprünglich in der Probe vorhandenen RNA zu analysieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst einen Vorgang, in welchem wenigstens die folgenden Reagenzien (A) bis (I) hergestellt werden, und sie werden zu einer vermutlich eine Ziel-RNA enthaltende Probe nacheinander gegeben, wobei wenigstens zwei davon gleichzeitig zugegeben werden, oder alle davon werden zu einem Zeitpunkt zugegeben (es ist nicht notwendig (A) bis (I) in dieser Reihenfolge zuzugeben), und ein weiterer Vorgang, in welchem ein Fluoreszenzsignal über die Zeit gemessen wird:

(A) ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz komplementär zu der Sequenz des 3'-Endes einer spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA;
(B) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase;
(C) Desoxyribonukleosidtriphosphat;
(D) Ribonuklease H oder ein Enzym mit einer äquivalenten RNA-hydrolisierenden Aktivität;
(E) ein zweites einzelsträngiges Oligonukleotid mit (1) einer Promotersequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, (2) einer Verstärkersequenz des Promoters, und (3) einer Nukleotidsequenz identisch zu der Sequenz des 5'-Endes der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA in dieser Reihenfolge von der 5'-Endseite;
(F) eine DNA-gerichtete DNA-Polymerase;
(G) eine DNA-abhängige RNA-Polymerase;
(H) Ribonukleosidtriphosphat; und
(I) ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid, welches eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz hat und in einer derartigen Art und Weise markiert ist, dass ein messbares Fluoreszenzsignal erzeugt wird, wenn sie zu einer Nukleinsäure mit der gleichen Sequenz gebunden wird. Zusätzlich zu der Kombination der ersten, zweiten und dritten einzelsträngigen Oligonukleotide des Reagenz (A), des Reagenz (E) und des Reagenz (I) kann ebenfalls eine andere Kombination von ersten bis dritten einzelsträngigen Oligonukleotiden der folgenden Reagenzien (J) bis (L) ebenfalls verwendet werden:
(J) ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid mit (1) einer Promotersequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, (2) einer Verstärkersequenz des Promoters, und (3) einer Sequenz komplementär zu einer Sequenz des 3'-Endes der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA, in dieser Reihenfolge von der 5'-Endseite;
(K) ein zweites einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz identisch zu der Sequenz des 5'-Endes der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA; und
(L) ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz homolog (identisch) zu der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA und in einer derartigen Art und Weise markiert ist, dass ein messbares Fluoreszenzsignal erzeugt wird, wenn es an eine Nukleinsäure mit der gleichen Sequenz gebunden wird.

Bei dem Vorhergehenden, wenn die ersten und zweiten einzelsträngigen Oligonukleotide von (A) und (E) verwendet werden, ist die spezifische Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenzgruppe, die in der Ziel-RNA existiert, deren 5'-Ende mit der Sequenz von (3) in dem zweiten Einzelstrangoligonukleotid von (E) beginnt, und das 3'-Ende endet mit einer Sequenz komplementär zu dem ersten einzelsträngigen Oligonukleotid von (A). Ebenso, wenn die ersten und zweiten einzelsträngigen Oligonukleotide von (J) und (K) verwendet werden, ist es eine Nukleotidsequenzgruppe, die in der Ziel-RNA existiert, in welcher ihr 5'-Ende mit einer Sequenz identisch zu dem zweiten einzelsträngigen Oligonukleotid von (A) beginnt, und das 3'-Ende endet mit einer Sequenz komplementär zu der Sequenz von (3) in dem ersten einzelsträngigen Oligonukleotid von (J). Obwohl die spezifische Nukleotidsequenz wahlweise betsimmt werden kann, ist es wichtig, dass sie eine Sequenzgruppe mit einem derartigen Grad an Spezifität enthält, dass die Ziel-RNA von anderer Nukleinsäure unterschieden werden kann.
Das Reagenz (A) ist ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer komplementären Sequenz, das sequenzspezifisch an eine spezifische Nukleotidsequenz bindet. Dieses Reagenz bindet komplementär zu einer Ziel-RNA und wird für die Positionierung einer Sequenz komplementär zu dem 3'-Ende der spezifischen Nukleotidsequenz an dem 5'-Ende einer cDNA verwendet, wenn die cDNA durch die RNA-abhängige DNA-Polymerase unter Verwendung der Ziel-RNA als eine Matrize in der Anwesenheit der folgenden Reagenzien (B) und (C) synthetisiert wird.
Das Reagenz (B) ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und das Reagenz (C) ist Desoxyribonukleosidtriphospat, welches hier Substrat ist. Eine cDNA, die an ihrem 5'-Ende eine Sequenz komplementär zu dem 3'-Ende der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA hat wird in der Anwesenheit der Reagenzien (A) bis (C) synthetisiert. Diese cDNA bildet einen DNA-RNA-Doppelstrang mit der als eine Matrize verwendeten Ziel-RNA.
Das Reagenz (D) ist Ribonuklease H mit einer Aktivität für den Verdau der RNA in der DNA-RNA doppelsträngigen Form, aber ein Enzym mit einer äquivalenten RNA-hydrolisierenden Aktivität kann ebenfalls verwendet werden.
Die reverse Transkriptase, repräsentiert durch eine aviäre Myoblastomvirus reverse Transkriptase (hiernach auch als „AMV reverse Transkriptase" bezeichnet) hat eine Aktivität der Spaltung der RNA in der DNA-RNA-doppelsträngigen Form, wobei derartige Enzyme beispielhaft genannt werden können.
Das Reagenz (E) ist ein zweites einzelsträngiges Oligonukleotid mit (1) einer Promotersequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, (2) einer Verstärkersequenz des Promoters und (3) einer Nukleotidsequenz identisch zu der 5'-Endsequenz der spezifischen Nukleotidsequenz, in dieser Reihenfolge von der 5'-Endseite. In dem zweiten Oligonukleotid bindet der Rest (3) an das 3'-Ende der in der Anwesenheit der Reagenzien (A) bis (D) synthetisierten cDNA. Konsequenterweise werden in der Anwesenheit der Reagenzien (C) und (F) entsprechende komplementäre Ketten durch die DNA-gerichtete DNA-Polymerase von dem 3'-Ende des zweiten Oligonukleotids unter Verwendung der cDNA als eine Matrize und gleichzeitig vom 3'-Ende cDNA unter Verwendung des zweiten Oligonukleotids synthetisiert, und folglich wird eine komplette doppelsträngige DNA synthetisiert, die eine transkribierbare Promotersequenz hat.
Das Reagenz (F) ist eine DNA-gerichtete DNA-Polymerase. Da eine reverse Transkriptase, typisiert durch die AMV reverse Transkriptase, die DNA-gerichtete DNA-Polymerase Aktivität hat, kann ein derartiger Enzymtyp verwendet werden.
Das Reagenz (G) ist eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und das Reagenz (H) ist Ribonukleosidtriphospat, welches als ihr Substrat verwendet wird. Die in der Anwesenheit der Reagenzien (C), (E) und (F) synthetisierte doppelsträngige DNA hat eine Promoterregion der DNA-abhängigen RNA-Polymerase an ihrem Ende. Demgemäß beginnt die Synthese einer einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleotidsequenz in der Anwesenheit der Reagenzien (G) und (H) unmittelbar nach der DNA-Synthese. Beispiele der DNA-abhängigen RNA-Polymerase des Reagenz (G) enthalten T7-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase, SP6-RNA-Polymerase und Ähnliche.
Die in der Anwesenheit der Reagenzien (G) und (H) synthetisierte einzelsträngige RNA ist eine RNA mit der spezifischen Nukleotidsequenz. Demgemäß, als ein Ergebnis, dass sie synthetisiert werden und die Reagenzien (A) bis (F) vorhanden sind, wird eine Reihe der Vorherigen Reaktionen wiederholt erzeugt. Folglich wird in der vorliegenden Erfindung eine doppelsträngige DNA mit einer Promoterregion an ihrem Ende auf der Grundlage einer in einer Probe vorhandenen extrem kleinen Menge einer Ziel-RNA synthetisiert und wird die Quelle für die Synthese einer einzelsträngigen RNA mit einer spezifischen Nukleotidsequenz. Die derartige synthetisierte einzelsträngige RNA trägt zu der Synthese einer neuen doppelsträngigen DNA bei, und als ein Ergebnis, steigt die Menge der einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleotidsequenz deutlich über die Zeit an.
Das Reagenz (I) ist ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid, welches eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz hat und in einer derartigen Art und Weise markiert ist, dass ein messbares Fluoreszenzsignal erzeugt wird, wenn sie zu einer Nukleinsäure mit der gleichen Sequenz gebunden wird. Das dritte einzelsträngige Oligonukleotid kann zum Beispiel ein DNA-Fragment sein, an welches ein interkalierendes Fluorochrom gebunden ist. Für die spezifische Untersuchung der spezifischen Nukleotidsequenz hat die DNA-Gruppe bevorzugt 6 bis 100 Nukleotide, bevorzugter 10 bis 30 Nukleotide. Natürlich ist es wichtig, dass die DNA-Gruppe eine Sequenz ist, welche in der spezifischen Nukleotidsequenz vorhanden ist und komplementär zu einer Sequenzgruppe, die ausreichend von Nukleinsäuren unterschieden werden kann, die sich von der Zielnukleinsäure unterscheiden.
Um die Verlängerung der DNA-Gruppe vom 3'-Ende durch die Wirkung der RNA-abhängigen DNR-Polymerase des Reagenz (C), welches schon zugegeben wurde, zu vermeiden, wenn es eine komplementär Bindung mit der synthetisierten einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleotidsequenz bildet, ist es bevorzugt, dass eine Sequenz, die nicht komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz ist, zu dem 3'-Ende zugefügt ist, oder dass das 3'-Ende chemisch modifiziert ist.
Wenn die DNA-Gruppe eine komplementäre Bindung mit anderen Nukleinsäuren bildet, interkaliert das interkalierende Fluorochrom in die doppelsträngige Gruppe, und ändert seine Fluoreszenzeigenschaften. Ein für diesen Zweck wirkungsvolles Beispiel ist, das interkalierende Fluorochrom mit der DNA über einen Verknüpfer zu verbinden, der eine derartig geeignete Moleküllänge hat, dass er nicht seine Interkalation in die doppelsträngige Gruppe hemmt. Ein derartiger Verknüpfer ist nicht besonders beschränkt, solange es ein Molekül ist, welches nicht die Interkalation des interkalierenden Fluorochroms in die doppelsträngige Gruppe hemmt. Ein Verknüpfermolekül ausgewählt aus bifunktionalen Kohlenwasserstoffen mit funktionellen Gruppen an beiden Enden ist aufgrund der Einfachheit bei der Durchführung der Modifikation des Oligonukleotids besonders bevorzugt. Zusätzlich kann ein kommerziell erhältlicher Reagenziensatz (C6-Thiolmodifier, Markenname, hergestellt durch Clontech) oder Ähnliche ebenfalls verwendet werden.
Das interkalierende Fluorochrom ist nicht besonders beschränkt, solange seine Fluoreszenzeigenschaften durch seine Interkalation in die doppelsträngige Gruppe geändert wird, wie etwa die Fluktuation der erzeugten Fluoreszenzwellenlänge, aber diejenigen mit einer Eigenschaft des Anstiegs der Fluoreszenzintensität durch Interkalation sind insbesondere bevorzugt, zum Beispiel vom Gesichtspunkt der einfachen Messung usw. Spezifischer enthalten spezifische Beispiel Thiazolorange, Oxazolgelb und Derivate davon, welche insbesondere signifikante Änderungen in der Fluoreszenzintensität zeigen.
Die Position der DNA, an welche das interkalierende Fluorochrom über einen Verknüpfer gebunden wird, wie etwa das 5'-Ende, das 3'-Ende oder ein zentraler Teil, ist nicht besonders beschränkt, solange die Interkalation des interkalierenden Fluorochroms in die doppelsträngige Gruppe nicht gehemmt und eine komplementäre Bindung der DNA-Gruppe mit der RNA nicht gehemmt wird.
Die Menge der einzelsträngigen RNA synthetisiert durch die Reagenzien (G) und (H) unter Verwendung der doppelsträngigen DNA mit einer Promotersequenz als eine Matrize, steigt über die Zeit an. Es wurde sichergestellt, dass in diesem Reaktionssystem die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit zu der Menge der synthetisierten RNA in der Anwesenheit des Reagenz (I) mit der vorher beschriebenen Eigenschaft von einer Sequenz komplementär zu einer bestimmten Sequenz der einzelsträngigen RNA steigt( Igakuno Ayumi, 184(3): 239–244 (1998), Nucleic Acid Research, 24(24): 4992–4997 (1996)).
Das Reagenz (I) koexistiert mit wenigstens den Reagenzien (A) bis (H) in einer Probe, von der erwartet wird, dass sie die Ziel-RNA, und die angestiegene einzelsträngige RNA mit der spezifischen Nukleotidsequenz enthält, wird als ein Fluoreszenzsignal gemessen. Ebenfalls wurde herausgefunden, dass selbst wenn die amplifizierte einzelsträngige RNA eine komplementäre Bindung mit dem dritten Oligonukleotid des Reagenz (I) bildet, um ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen, fungiert diese RNA als die Matrize für die Synthese der DNA in der Anwesenheit der Reagenzien (A) bis (C). Folglich wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Anzahl von Phänomenen erzeugt, nämlich die Synthese von cDNA, die Synthese von doppelsträngiger DNA und die Synthese von RNA von der doppelsträngigen DNA bei Koexistenz entsprechender Reagenzien, in der Anwesenheit des dritten Oligonukleotids, und die Fluoreszenzintensität steigt in Abhängigkeit der ansteigenden RNA an.
Eine Ausführungsform, in welcher die Kombination der ersten, zweiten und dritten einzelsträngigen Oligonukleotid der Reagenzien (J) bis (L) anstelle der Kombination des ersten bis dritten einzelsträngigen Oligonukleotids der Reagenzien (A), (E) und (I) verwendet wird, wird im Folgenden beschrieben.
Das Reagenz (J) ist ein erstes, einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer (1) Promotersequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, (2) einer Verstärkersequenz des Promoters und (3) einer Sequenz, komplementär zu einer Sequenz des 3'-Endes der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA, in dieser Reihenfolge von der 5'-Endseite. Die Gruppe (3) dieses Reagenz bindet komplementär zu dem 3'-Ende der spezifischen Nukleotidsequenz und die cDNA komplementär zu der Ziel-RNA wird in der Anwesenheit der Reagenzien (B), (C), und (D) ähnlich zu der Ausführungsform unter Verwendung des Reagenz (A) synthetisiert.
Das Reagenz (K) ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz homolog zu dem 5'-Ende der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA. Das Reagenz (K) bindet komplementär zu dem 3'-Ende der spezifischen Nukleotidsequenz der cDNA und dann wird eine doppelsträngige DNA mit der Promotersequenz der RNA-Polymerase in der Anwesenheit der Reagenzien (C) und (F) synthetisiert. Nachfolgend wird eine zweite einzelsträngige RNA komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz von der doppelsträngigen DNA in der Anwesenheit der Reagenzien (G) und (H) synthetisiert.
Danach bindet das 3'-Ende der zweiten RNA komplementär zu dem Reagenz (K) und eine zweite cDNA entsprechend zu der zweiten RNA wird in der Anwesenheit der Reagenzien (B) bis (D) synthetisiert. Das 3'-Ende der zweiten cDNA bindet komplementär zu der Gruppe (3) des Reagenz (J), eine doppelsträngige DNA mit einer Promotersequenz wird durch die Reagenzien (C) und (F) synthetisiert, und die zweite RNA wird durch die Reagenzien (G) und (H) synthetisiert. Die derartige synthetisierte zweite RNA, komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz, wird die Quelle für die Synthese einer neuen doppelsträngigen DNA, um eine Reihe von Reaktionen wiederholt zu erzeugen, und, als ein Ergebnis, steigt die Menge der zweiten RNA stark an.
Die derartig erhaltene zweite RNA hat eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz in der Ziel-RNA. Wenn das Reagenz (L) als ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid, welches eine Sequenz identisch zu der spezifischen Nukleotidsequenz hat, und mit einem interkalierenden Fluorochrom markiert ist, koexistiert, steigt die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit zu der Menge der derartig synthetisierten zweiten RNA an.
Zusätzlich ist es erfindungsgemäß möglich, eine DNA zu untersuchen, die eine spezifische Nukleotidsequenz enthält, und ursprünglich in der Probe vorhanden ist. Der Grund dafür ist, dass, wenn eine doppelsträngige DNA mit einer transkribierbaren Promotersequenz durch ein bekanntes Verfahren erzeugt und als eine Zielnukleinsäure verwendet wird, die doppelsträngige DNA als eine Matrize für die Amplifizierungsreaktion verwendet werden kann, so dass das RNA-Transkriptionsprodukt in der Anwesenheit einer RNA-Polymerase gebildet werden kann. Beispiele für das Verfahren zur Herstellung der doppelsträngigen DNA mit einer transkribierbaren Promotersequenz enthalten ein Verfahren, in welchem eine Promotersequenz an eine Ziel-DNA unter Verwendung eines Promoterprimers zugefügt wird, und eine DNA-Polymerase und eine Verfahren, in welchem eine DNA-Kette mit einer Promotersequenz an eine Ziel-DNA unter Verwendung einer DNA-Ligase gebunden wird.
Bevorzugt wird die Messung des erfindungsgemäßen Fluoreszenzsignals über die Zeit unmittelbar nach der Zugabe der Reagenzien (A) bis (I) oder nach verstreichen einer vorbestimmten Zeit nach der Zugabe durchgeführt. Die dritte DNA des Reagenz (I) wiederholt Bindung und Dissoziation der synthetisierten RNA. Jedoch, da das zum Zeitpunkt der Bindung gemessene Fluoreszenzsignal die vorhandene Menge der RNA zum Zeitpunkt jeder Messung wiederspiegelt, ist es möglich, die ansteigenden Bedingungen der einzelsträngigen RNA über die Zeit zu verfolgen. Ebenfalls kann die Messung per se entweder kontinuierlich oder absatzweise in vorbestimmten Intervallen sein. Ferner bildet die Vorrichtung für die Messung des Fluoreszenzsignals kein Teil der vorliegenden Erfindung, und jede Vorrichtung, welche das Fluoreszenzsignal in wenigstes einem Reaktionsröhrchen kontinuierlich oder absatzweise in bestimmten Intervallen messen kann, kann verwendet werden.
Der Messabschnitt des Fluoreszenzsignals enthält einen Abschnitt, in welchen ein signifikanter Unterschied zwischen dem Anstiegsabschnitt der Fluoreszenzintensität eines Untersuchungsansatzes mit einer bestimmten Menge der Ziel-RNA, und dem eines Untersuchungsansatzes, welcher frei von der Ziel-RNA ist, gefunden wird, nämlich ein Abschnitt in dem die Fluoreszenzintensität des Untersuchungsansatzes, der eine bestimme Menge der Ziel-RNA enthält, nahezu konstant wird, welcher im Allgemeinen 4 Stunden, bevorzugt 1 Stunde ist.
Aus einer Beziehung zwischen einer verstrichenen Zeit der Amplifizierungsreaktion und einem Anstieg in der Fluoreszenzintensität in der Amplifikation und periodischen Fluoreszenzintensitätsmessschritten, wird eine Zeit, welche ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt berechnet, und die anfängliche RNA-Menge wird aus der derartig berechneten Zeit bestimmt, auf der Grundlage des Phänomens, dass der Fluoreszenzintensitätsanstieg sich in einer bestimmten Rate mit der Zeit verzögert, wie die ursprünglich in der Probe vorhandene Ziel-RNA (anfängliche RNA-Menge) abnimmt.
Ein Beispiel für die Zeit, welche ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt und hierin verwendet wird, ist eine Zeit, welche eine bestimmte Fluoreszenzanstiegsrate (Fluoreszenzintensitätswert an einer vorgeschriebenen Zeit Fluoreszenzintensitätswert des Hintergrunds), verglichen mit dem Kontrollansatz, welcher frei von der Ziel-RNA ist oder einer Zeit an welcher ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität nicht beobachtet wird in einem anfänglichen Stadium des RNA-Amplifikationsschrittes. Spezifischer kann eine Zeit verwendet werden, welche die dreifache Standardabweichung einer Fluoreszenzanstiegsrate einer Mehrzahl von Kontrollansätzen, welche frei von der Ziel-RNA sind, an einer vorgeschriebenen Zeit übersteigt.
Ebenfalls ist die Zeit verwendbar, wenn in Abhängigkeit zwischen dem allgemeinen Logarithmus der Fluoreszenzintensitätsrate und der Zeit, der allgemeine Logarithmuswert der Fluoreszenzintensitätsrate signifikant im Vergleich mit dem Kontrollansatz ansteigt.
Zusätzlich kann eine durch ein bestimmtes Kriterium berechnete Zeit ebenfalls unter Verwendung einer Zeit bestimmt werden, wenn eine Fluoreszenzintensitätsrate pro Zeiteinheit in der Fluoreszenzintensitätsrate maximal wird. Ebenfalls ist es als ein einfach vorstellbares Anwendungsbeispiel dieses Untersuchungsverfahrens möglich, die Fluoreszenzintensitätsrate zu der Zeit durch Durchführung mathematischer Ansätze zu analysieren, wie etwa Differenzialrechnung, logarithmische Ausdrücke, Annäherungskurven, und Ähnliche. Zusätzlich kann die anfängliche RNA-Menge durch Vergleich der berechneten Zeit mit dem Fall von wenigstens zwei Proben mit einer unterschiedlichen bekannten Konzentration bestimmt werden.
Wie aus der gesamten Beschreibung ersichtlich, kann erfindungsgemäß die Menge der Ziel-RNA (einzelsträngige RNA) mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, enthalten in der Probe und ursprünglich vorhanden in einer Probe, bei nahezu gleichmäßiger Temperatur in nur einem Schritt eines manuellen Vorgangs, durchgeführt zu dem Zeitpunkt des Beginnens der Reaktion, und schnell untersucht werden.
In der vorliegenden Erfindung wird eine doppelsträngige DNA mit einem DNA-abhängigen RNA-Polymerasepromoterbereich an ihrem Ende auf der Grundlage einer Ziel-RNA in einer Probe synthetisiert und wird die Quelle für die Synthese einer großen Menge einer einzelsträngigen RNA, und die Menge der synthetisierten einzelsträngigen RNA steigt stark an, so dass die anfängliche RNA-Menge bequem und rasch durch Analyse des Anstiegsvorgangs der Fluoreszenzintensität in einem Schritt bestimmt wird, in welchem der Anstieg in der Fluoreszenz aufgrund einer komplementären Bindung einer Sonde markiert mit einem interkalierenden Fluorochrom zu der gebildeten einzelsträngigen RNA gemessen wird.
Zusätzlich kann nicht nur virale RNA in dem Gebiet der klinischen Diagnostik, sondern ebenfalls Mikroorganismen in Lebensmitteln und im Boden einschließlich zum Beispiel pathogene Bakterien und antibiotikaresistente Bakterien durch einfache Änderung der Sequenzen des ersten bis dritten Oligonukleotids untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich auf der Grundlage der folgenden Beispiele beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Bezüglich der humanen Hepatitis C-Virus RNA wurde eine Eichkurve zur Bestimmung der ursprünglich in Proben vorhandenen RNA hergestellt.

(1) Ein Abschnitt der Nukleotidnummern 113 bis 267 der humanen Hepatitis C-Virus RNA (Kato et al., Proc. Atl. Sci., USA, 87: 9524–9528, (1990)) wurde als eine Standard-RNA-Probe verwendet, bestimmt durch ultraviolette Bereichsextinktion bei 260 nm, und dann mit dem folgenden RNA-Verdünnungsmittel verdünnt, um Konzentrationen von 10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵ oder 10⁴ Kopien/4μl zu ergeben. Das Verdünnungsmittel allein wird als ein Kontrolltestansatz verwendet. Zusammensetzung des RNA-Verdünnungsmittel: 10mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 mM EDTA
(2) 21,2 μl einer Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde in Röhrchen mit 0,5 ml Kapazität für die PCR (Gene Amp Thin-Walles Reaction Tubes, hergestellt durch Perkin-Elmer) gegeben, 4 μl der RNR-Probe wurde dazugegeben und dann wurden 50μl Mineralöl überschichtet. Zusammensetzung der Reaktionslösung (jede Konzentration in 30 μl des finalen Reaktionslösungsvolumens): 60 mM Tris-Acetat Puffer (pH 8,1); 13,5 mM Magnesiumacetat; 120 mM Kaluimacetat; 16 % Sorbitol; 10 mM DDT; 0,5 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP; 1 mM jeweils von ATP, CTP, GTP und UTP; 1,25 mμ ITP; 0,2 μM des ersten Oligonukleotids (Sequenz (SEQ ID NO:1))
0,2 μM des zweiten Oligonukleotids mit einer SP6 Promotersequenz (Sequenz (SEQ ID NO:2))
(In dieser Sequenz ist die „ATTTAGGTGACACTATA"-Gruppe eine SP6-Promotersequenz und „GAATACAA"-Gruppe ist ein Verstärkersequenz); 0,025 μM des dritten Oligonukleotids markiert mit einem interkalierenden Fluorochrom (Sequenz (SEQ ID NO: 3))
(Das Symbol * bezeichnet eine markierte Position mit dem interkalierenden Fluorochrom.), wobei eine chemische Struktur der interkalierenden Fluorochromgruppe des dritten Oligonukleotids markiert mit einem interkalierenden Fluorochrom und in dem Beispiel 1 verwendet im Folgenden gezeigt wird, und wobei B₁ bis B₃ Nukleinsäurebasen angeben;
30 Einheiten einer Ribonukleasehemmstoffs; 2 % DMSO; und destilliertes Wasser für die Volumeneinstellung
(3) Nach Inkubation dieser Reaktionslösung bei 50°C für 5 Minuten wurden 9,8 μl einer Enzymlösung mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben. Zusammensetzung der Enzymlösung: 42 Einheiten der AMV reversen Transkriptase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.); 171 Einheiten SP6-RNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.); 3 μg bovines Serumalbumin; und destilliertes Wasser für die Volumeneinstellung.

Nachfolgend werden unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrophotometers, welches mit einer Temperatursteuerungseinrichtung ausgestattet ist und die PCR-Röhrchen direkt messen kann, die PCR-Röhrchen bei 50°C inkubiert und die Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung in jedem Röhrchen wurde Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 510 nm in abständen von 5 Minuten gemessen. Die Fluoreszenzanstiegsrate (Fluoreszenzintensitätswert an einem vorbestimmten Wert Fluoreszenzintensitätswert des Hintergrunds) bei den verschiedenen Probenkonzentrationen sind in der 1 bis 6 gezeigt, wobei die Zeit wenn die Enzymlösung zugegeben wird 0 Minuten ist. Weiterhin wurden die Experimente bei entsprechenden Probenkonzentrationen fünf Mal durchgeführt und die Ergebnisse werden durch verschiedene Symbole (zum Beispiel •, ×, usw.) in 1 bis 6 gezeigt.
Unter Verwendung der Nullkopienprobe allein bestehend aus dem Verdünnungsmittel als der Kontrollansatz, einem Wert erhalten durch Zugabe des dreifachen der Standardabweichung zu dem durchschnittlichen Fluoreszenzanstiegsrate nach 60 Minuten, nämlich dem Durchschnitt der Zeiten, wenn die Fluoreszenzanstiegsrate einen Wert von 1,2 erreichte, und eine Regressionslinie bei schlechter Ausgleichung sind in der 7 gezeigt. Eine Gerade mit guter Korrelation wurde mit einem Korrelationskoeffizienten von –0,990 (y= –2,09 x + 35,56 (x: Abszisse, y: Ordinate)) erhalten. Der Variationskoeffizient bei jeder Konzentration war 4,4 % bei 10⁴ Kopien, 2,1 % bei 10⁵ Kopien, 3,1 % bei 10⁶ Kopien, 7,4 bei 10⁷ Kopien, 9,1 % bei 10⁸ Kopien und 4,2 % bei 10⁹ Kopien, was folglich eine gute Reproduzierbarkeit zeigt.
Bei diesen Fluoreszenzanstiegsraten, zeigt die durchschnittliche Fluoreszenzanstiegsrate pro Zeiteinheit nämlich eine Zeit wenn ein Wert ((Fluoreszenzanstiegsrate – Fluoreszenzanstiegsrate in der vorhergehenden Messung) – (Messintervall (5 Minuten)) ein Maximum und die Regressionslinie bei wenigsten Ausgleich wird in der 8 gezeigt. Der Korrelationskoeffizient was –0,955 (y= –2,2x + 43,133 (x: Abszisse, y: Ordinate)) und der Koeffizient der Variation in jeder Konzentration war 7,8 % bei 10⁴ Kopien, 0 % bei 10⁵ Kopien, 7,2 % bei 10⁶ Kopien, 0 % bei 10⁷ Kopien, 0 % bei 10⁸ Kopien, und 11,9 % bei 10⁹ Kopien. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass eine Eichkurve mit guter Reproduzierbarkeit durch dieses Verfahren erhalten werden kann.
Beispiel 2
Unter Verwendung einer Probe A und einer Probe B mit einer Standard-RNA wurden Reproduzierbarkeit und Spezifität untersucht.

(1) In Übereinstimmung mit dem Verfahren des Beispiel 1, werden Eichkurven unter Verwendung einer Standard-RNA mit 10⁴ Kopien bis 10⁹ Kopien hergestellt. Eine Eichkurve, wenn die Zeit in der eine Fluoreszenzanstiegsrate von 1,2 erreicht als ein Kriterium verwendet wird, wird in der 9 gezeigt (Korrelationskoeffizient –0,987 (y= –2,0571x + 35,371 (x: Abszisse, y: Ordinate)) und eine Eichkurve, wenn die Zeit der maximalen Fluoreszenzanstiegsrate pro Zeiteinheit als ein Kriterium verwendet wird, ist in der 10 gezeigt (Korrelationskoeffizient: –0,944 (y= –2,8x + 47,2 (x: Abszisse, y: Ordinate)).
(2) Unter Verwendung von 4 μl jeder der Proben A und B, die die Standard-RNA enthalten, wurde die Reaktionslösung und die Enzymlösung auf der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 zugegeben, jeweils in vier Zyklen, und dann bei 50°C inkubiert, um eine Fluoreszenzmessung in Abständen von 5 Minuten durchzuführen. In diesem Fall enthielten die hierin vorgestellten Proben A und B 10⁵ Kopien/ 4 μl beziehungsweise 10⁸ Kopien/4 μl.
(3) Die Bestimmungsergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt (allgemeiner Logarithmuswert der anfänglichen RNA-Menge wird als ein Indexwert ausgedrückt). In den Proben A und B werden Bestimmungswerte erhalten, welche nahezu mit dem theoretischen Werten übereinstimmen. Es war möglich die Bestimmung in einem Fehlerbereich von einer einzigen Ziffer, oder weniger, in allen Testansätzen durchzuführen, und die Reproduzierbarkeit war ebenfalls mit einem Variationskoeffizienten der von 5 %, oder weniger, hervorragend. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass die Konzentration einer spezifizierten RNA, die ursprünglich in einer Probe vorhanden ist, durch dieses Verfahren bequem und schnell mit einer guten Reproduzierbarkeit bestimmt werden kann.

Diese Anmeldung basiert auf der japanischen Patentanmeldung Nr. 11-143854, eingereicht am 24. Mai 1999.
Ein Verfahren zu Herstellung einer Zielnukleinsäure nach Anspruch 1.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren für die Untersuchung einer Zielnukleinsäure, mit. Vorsehen eines RNA-Amplifikationssystems mit: Herstellen einer doppelsträngigen DNA unter Verwendung einer Ziel-RNA, die eine spezifische Nukleotidsequenz enthält, in einer Probe als eine Matrize, wobei die doppelsträngige DNA eine Promotersequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase hat und in eine RNA transkribierbar ist, die die spezifische Nukleotidsequenz oder eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz umfasst; Herstellen eines RNA-Transkriptionsprodukts mit der spezifischen Nukleotidsequenz oder einer Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz in der Anwesenheit einer RNA-Polymerase; und Herstellen der doppelsträngigen DNA unter Verwendung des RNA-Transkriptionsprodukts als eine Matrize, in der Anwesenheit einer Sonde markiert mit einem interkalierenden Fluorochrom, die eine Sequenz komplementär zu dem RNA-Transkritptionsprodukt hat, wobei die Fluorochromeigenschaft durch Interkalation geändert wird, Messen der Fluoreszenzintensität in dem RNA-Amplifikationssystem über die Zeit; Berechnen der Zeit, wann die Fluoreszenzintensität ein vorgeschriebenes Kriterium auf der Grundlage der gemessenen Änderung in der Fluoreszenzintensität über die Zeit erfüllt hat; und Bestimmen der Konzentration der Zielnukleinsäure in der Probe auf der Grundlage der berechneten Zeit.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zeit, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, die Zeit ist, um eine definierte Fluoreszenzintensität zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zeit, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, die Zeit ist, wenn die Anstiegsrate der Fluoreszenzintensität pro Zeiteinheit maximal wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Konzentration der Zielnukleinsäure durch Vergleich der Zeit bestimmt wird, in welcher ein vorgeschriebenes Kriterium erfüllt wird, mit den Zeiten von wenigstens zwei RNA-Proben, die die spezifische Nukleotidsequenz in verschiedenen Konzentrationen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem RNA-Amplifikationssystem, eine einzelsträngige DNA in der Anwesenheit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung eines Primers mit einer Sequenz komplementär zu der spezifischen Nukleotidsequenz und eines Primers mit einer zu der spezifischen Nukleotidsequenz homologen Sequenz hergestellt wird, wobei einer der Primer ein Promoter-Primer ist, der eine Promotersequenz der RNA-Polymerase an der 5'-Seite hat und unter Verwendung der Ziel-RNA als eine Matrize; die doppelsträngige DNA in der Anwesenheit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als eine Matrize hergestellt wird; das RNA-Transkriptionsprodukt aus der doppelsträngigen DNA in der Anwesenheit einer RNA-Polymerase hergestellt wird; und das RNA-Transkriptionsprodukt nachfolgend als die Matrize für die Herstellung der einzelsträngigen DNA in der Anwesenheit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein durch eine komplementäre Bindung zwischen der mit einem interkalierenden Fluorochrom markierten Sonde und dem RNA-Transkriptionsprodukt gebildeter Komplex unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften zu der mit einem interkalierenden Fluorochrom markierten Sonde hat, welche keinen Komplex mit dem RNA-Transkriptionsprodukt bildet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, wobei die mit einem interkalierenden Fluorochrom markierte Sonde komplementär an das RNA-Transkriptionsprodukt bindet, so dass das interkalierende Fluorochrom zwischen der hergestellten RNA und der Sonde interkaliert.