DE202021004362U1 - Kontrollen für Proximity-Detection-Assays - Google Patents

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Abstract

Produkt, das aufweist:(i) eine Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist:(a) eine Proteinbindungsdomäne, die für ein Protein spezifisch ist, und(b) eine Nukleinsäuredomäne,wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Proteinbindungsdomänen aufweisen, die für dasselbe Protein spezifisch sind und gleichzeitig an das Protein binden können; und jedes Paar von Sonden für ein anderes Protein spezifisch ist;wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenzen jedes Paares von Proximity-Sonden Barcode-Sequenzen sind, die einem bestimmten Analyten entsprechen; und wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen; und(ii) eine Anzahl von Splint-Oligonukleotiden, wobei jedes Splint-Oligonukleotid Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen eines Paars von Proximity-Sonden komplementär sind;wobei die Hybridisierungssequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass nach Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihr Protein die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren;und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird.

Description

  • Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis einer Anzahl von Analyten in einer Probe unter Verwendung eines Multiplex-Nachweisassays auf Proximity-Basis. Der Assay verwendet Paare von Proximity-Sonden mit gemeinsamen Hybridisierungsstellen (d.h. Hybridisierungsstellen, die von verschiedenen Paaren von Proximity-Sonden geteilt werden). Das erfindungsgemäß bereitgestellte Produktweist eine Anzahl von Paar von Proximity-Sonden mit gemeinsamen Hybridisierungsstellen auf.
  • Hintergrund
  • Moderne Verfahren der Proteomik erfordern die Fähigkeit, eine große Anzahl verschiedener Proteine (oder Proteinkomplexe) in einem kleinen Probenvolumen nachzuweisen. Um dies zu erreichen, muss eine Multiplex-Analyse durchgeführt werden. Zu den gängigen Verfahren für den Multiplex-Nachweis von Proteinen in einer Probe gehören Proximity-Extension-Assays (PEA) und Proximity-Ligation-Assays (PLA). PEA und PLA sind in der WO 01/61037 beschrieben; PEA ist ferner in der WO 03/044231 , WO 2004/094456 , WO 2005/123963 , WO 2006/137932 und WO 2013/113699 beschrieben.
  • PEA und PLA sind Proximity-Assays, die auf dem Prinzip des „Proximity Probing“ beruhen. Bei diesen Verfahren wird ein Analyt durch die Bindung mehrerer (d.h. zwei oder mehr, im Allgemeinen zwei oder drei) Sonden nachgewiesen, die, wenn sie durch Bindung an den Analyten in die Nähe zueinander gebracht werden (daher „Proximity-Sonden“), die Erzeugung eines Signals ermöglichen. Typischerweise weist mindestens eine der Proximity-Sonden eine Nukleinsäuredomäne (oder -komponente) auf, die mit der Analyt-Bindungsdomäne (oder -komponente) der Sonde verbunden ist, und die Erzeugung des Signals beinhaltet eine Wechselwirkung zwischen den Nukleinsäurekomponenten und/oder einer weiteren funktionellen Komponente, die von der oder den anderen Sonden getragen wird. Die Signalerzeugung hängt also von einer Wechselwirkung zwischen den Sonden ab (insbesondere zwischen den Nukleinsäure- oder anderen funktionellen Anteilen/Domänen, die von ihnen getragen werden) und tritt daher nur auf, wenn die erforderlichen Sonden an den Analyten gebunden haben, wodurch dem Nachweissystem eine verbesserte Spezifität verliehen wird.
  • Bei der PEA hybridisieren Nukleinsäureeinheiten, die an die Analyt-bindenden Domänen eines Paars von Sonden gebunden sind, miteinander, wenn sich die Sonden in unmittelbarer Nähe befinden (d.h. wenn sie an ein Ziel gebunden sind), und werden dann mithilfe einer Nukleinsäurepolymerase verlängert. Die Nukleinsäureteile der Sonden innerhalb eines Paars von Sonden weisen komplementäre „Hybridisierungsstellen“ auf, die miteinander hybridisieren. Das Verlängerungsprodukt bildet eine Reporternukleinsäure, deren Nachweis das Vorhandensein eines bestimmten Analyten (des durch das betreffende Paar von Sonden gebundenen Analyten) in einer Probe von Interesse zeigt.
  • Bei PLA kommen Nukleinsäureeinheiten, die an die Analyt-bindenden Domänen eines Paars von Sonden gebunden sind, in die Nähe, wenn die Sonden des Paars von Sonden ihr Ziel binden, und können zusammen ligiert werden, oder sie können zusammen die Ligation von separat hinzugefügten Oligonukleotiden schablonieren, die mit den Nukleinsäuredomänen hybridisieren können, wenn sie in der Nähe sind. Bei PLA-Verfahren wird mindestens ein „Splint“-Oligonukleotid bereitgestellt, das die Nukleinsäureeinheiten der Proximity-Sonden überbrückt. Das Splint-Oligonukleotid weist Sequenzen auf, die komplementär zu „Hybridisierungsstellen“ auf den Sonden-Nukleinsäuredomänen sind. Die Bindung der Sondennukleinsäureanteile an das Splint-Oligonukleotid ermöglicht die gemeinsame Ligation der beiden Sondennukleinsäureanteile. Alternativ kann, wie oben erwähnt, ein zweites Splintmolekül hinzugefügt und an den ersten Splint ligiert werden. Das Ligationsprodukt wird dann amplifiziert und dient als Reporternukleinsäure.
  • Der Multiplex-Nachweis von Analyten unter Verwendung von PEA oder PLA kann durch die Aufnahme einer eindeutigen Identifizierungssequenz (ID), z.B. einer Barcode-Sequenz oder einer Primer- oder Sondenbindungsstelle, in den Nukleinsäureanteil jeder Sonde erreicht werden. Ein Reporter-Nukleinsäuremolekül, das einem bestimmten Analyten entspricht, kann anhand der enthaltenen ID-Sequenzen identifiziert werden.
  • Ein gewisses „Hintergrundsignal“ (d.h. ein falsch positives Signal) ist bei Proximity-Assays unvermeidlich. Das Hintergrundsignal kann durch zufällige Wechselwirkungen mit oder zwischen ungebundenen Proximity-Sonden in der Reaktionslösung entstehen. Derzeit wird die Höhe des Hintergrundsignals in einer Proximity-Reaktion durch die Verwendung einer separaten Negativkontrolle bestimmt. Für die Negativkontrolle wird ein Proximity-Assay nur mit Puffer (d.h. ohne Probe) durchgeführt, so dass das gesamte Signal im Hintergrund liegt. Durch den Vergleich der experimentellen Assays mit der Negativkontrolle kann das tatsächliche positive Signal bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Produkte zur Durchführung von Multiplex-Proximity-Assays mit einer verbesserten Hintergrundkontrolle bereit. Bei diesen teilen sich verschiedene Paar von Proximity-Sonden Hybridisierungsstellen. Dies begünstigt die Bildung eines „Hintergrundsignals“ zwischen allen ungebundenen Sonden, die sich dieselben Hybridisierungsstellen teilen. Alle Signale der erzeugten Reporternukleinsäuren werden zusammen gelesen (sowohl echt als auch falsch positiv). Ein echtes positives Signal kann von einem falsch positiven Signal unterschieden werden, je nachdem, ob die resultierende Reporternukleinsäure gepaarte Barcodesequenzen (d.h. Barcodesequenzen, die jeweils demselben Analyten entsprechen, was ein echtes positives Signal anzeigt) oder ungepaarte Barcodesequenzen (d.h. Barcodesequenzen, die verschiedenen Analyten entsprechen, was ein falsch positives Signal anzeigt) aufweist. Das Ausmaß des in der Reaktion erzeugten falsch-positiven Signals zeigt das Ausmaß des Hintergrunds an, was bedeutet, dass eine separate Negativkontrollreaktion zur Bestimmung des Hintergrunds nicht mehr durchgeführt werden muss, was den gesamten Assay vereinfacht.
  • Die Verwendung gemeinsamer Hybridisierungsstellen zur Bestimmung des Hintergrunds mildert auch die Leistungsunterschiede zwischen verschiedenen Hybridisierungsstellen. Verschiedene Paare von Hybridisierungsstellen können mehr oder weniger stark miteinander interagieren als andere, was dazu führt, dass von jedem Paar von Hybridisierungsstellen ein unterschiedlich starker Hintergrund erzeugt wird. Die gemeinsamen Hybridisierungsstellen ermöglichen es, den von jedem Hybridisierungsstellenpaar erzeugten Hintergrund individuell zu bestimmen, was zu einer genaueren Bestimmung des zu berechnenden Hintergrunds führt. Die vorliegende Erfindung bietet somit ein einfacheres und genaueres Mittel zur Kontrolle von falsch-positiven Ergebnissen bei Proximity-Assays.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung ein Produkt gemäß dem ersten Schutzanspruch bereit. Die abhängigen Schutzansprüche betreffen jeweils Ausgestaltungen hiervon.
  • Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Produkt bereit, das Folgendes aufweist:
    • (i) eine Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist:
      1. (a) eine Proteinbindungsdomäne, die für ein Protein spezifisch ist, und
      2. (b) eine Nukleinsäuredomäne,
      wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Proteinbindungsdomänen aufweisen, die für dasselbe Protein spezifisch sind und gleichzeitig an das Protein binden können; und jedes Paar von Sonden für ein anderes Protein spezifisch ist; wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden Barcodesequenzen sind, die einem bestimmten Analyten entsprechen; und wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen; und
    • (ii) eine Anzahl von Splint-Oligonukleotiden, wobei jedes Splint-Oligonukleotid Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen eines Paars von Proximity-Sonden komplementär sind;

    wobei die Hybridisierungssequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass nach Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihr Protein die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden mit einem Splint-Oligonukleotid hybridisieren;
    und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Wie oben beschrieben, betrifft die Erfindung den Nachweis einer Anzahl von Analyten in einer Probe. Der Begriff „Analyt“, wie er hier verwendet wird, bedeutet jede Substanz (z.B. Molekül) oder Einheit, die nachgewiesen werden soll. Der Analyt ist somit das „Ziel“ des erfindungsgemäßen Produkts, d.h. die Substanz, die nachgewiesen oder überprüft wird.
  • Der Analyt kann demnach jedes Biomolekül oder jede chemische Verbindung sein, die nachgewiesen werden soll, z.B. ein Peptid oder Protein, ein Nukleinsäuremolekül oder ein kleines Molekül, einschließlich organischer und anorganischer Moleküle. Der Analyt kann eine Zelle oder ein Mikroorganismus, einschließlich eines Virus, oder ein Fragment oder Produkt davon sein. Der Analyt kann also jede Substanz oder Einheit sein, für die ein spezifischer Bindungspartner (z.B. ein Affinitätsbindungspartner) entwickelt werden kann. Erforderlich ist lediglich, dass der Analyt in der Lage ist, mindestens zwei Bindungspartner (insbesondere die Analyt-bindenden Domänen von mindestens zwei Proximity-Sonden) gleichzeitig zu binden.
  • Assays auf der Grundlage von Proximity-Sonden haben sich als besonders nützlich für den Nachweis von Proteinen oder Polypeptiden erwiesen. Zu den Analyten von besonderem Interesse gehören daher proteinhaltige Moleküle wie Peptide, Polypeptide, Proteine oder Prionen oder jedes Molekül, das eine Protein- oder Polypeptidkomponente usw. oder Fragmente davon enthält. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Analyt ein ganz oder teilweise proteinartiges Molekül, insbesondere ein Protein. Das heißt, es ist bevorzugt, dass der Analyte ein Protein ist oder aufweist.
  • Bei dem Analyten kann es sich um ein einzelnes Molekül oder um einen Komplex handeln, der zwei oder mehr molekulare Untereinheiten enthält, die kovalent aneinander gebunden sein können oder auch nicht, und die gleich oder unterschiedlich sein können. So kann ein solcher komplexer Analyt neben Zellen oder Mikroorganismen auch ein Proteinkomplex oder ein biomolekularer Komplex sein, der ein Protein und eine oder mehrere andere Arten von Biomolekülen aufweist. Ein solcher Komplex kann also ein Homo- oder Hetero-Multimer sein. Aggregate von Molekülen, z.B. von Proteinen, können ebenfalls Zielanalyten sein, z.B. Aggregate desselben Proteins oder verschiedener Proteine. Bei dem Analyten kann es sich auch um einen Komplex zwischen Proteinen oder Peptiden und Nukleinsäuremolekülen wie DNA oder RNA handeln. Von besonderem Interesse können die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren sein, z.B. zwischen regulatorischen Faktoren, wie Transkriptionsfaktoren, und DNA oder RNA. In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten also um einen Protein-Nukleinsäure-Komplex (z.B. einen Protein-DNA-Komplex oder einen Protein-RNA-Komplex). In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um einen Nicht-Nukleinsäure-Analyten, d.h. einen Analyten, der kein Nukleinsäuremolekül enthält. Zu den Nicht-Nukleinsäure-Analyten gehören Proteine und Proteinkomplexe, wie oben erwähnt, kleine Moleküle und Lipide.
  • Die Erfindung ist auf den Nachweis einer Anzahl von Analyten in einer Probe gerichtet. Die Anzahl der Analyten kann vom gleichen Typ sein (z.B. können alle Analyten Proteine oder Proteinkomplexe sein) oder von verschiedenen Typen (z.B. können einige Analyten Proteine, andere Proteinkomplexe, andere Lipide, andere Protein-DNA- oder Protein-RNA-Komplexe usw. oder eine beliebige Kombination solcher Typen von Analyten sein).
  • Der Begriff „mehrere“, wie er in der vorliegenden Offenlegung verwendet wird, bedeutet gemäß seiner Standarddefinition mehr als eines (d.h. zwei oder mehr). Die Begriffe „eine Anzahl von“ und „mehrere“ sind austauschbar. So wird die Erfindung zum Nachweis von mindestens zwei Analyten in einer Probe eingesetzt. Es ist jedoch bevorzugt, dass deutlich mehr Analyten als zwei nachgewiesen werden. Vorzugsweise werden mindestens 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 oder 1500 oder mehr Analyten nachgewiesen.
  • Der Begriff „Nachweis“ oder „detektiert“ wird hier im weiteren Sinne verwendet und umfasst alle Mittel zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Analyten (d.h. zur Bestimmung, ob ein Zielanalyt in einer Probe von Interesse vorhanden ist oder nicht). Wenn also mit der Erfindung versucht wird, einen bestimmten interessierenden Analyten in einer Probe nachzuweisen, der Analyt aber nicht nachgewiesen wird, weil er in der Probe nicht vorhanden ist, wurde der Schritt des „Nachweises des Analyten“ dennoch durchgeführt, weil sein Vorhandensein oder Nichtvorhandensein in der Probe beurteilt wurde. Der Schritt des „Nachweises“ eines Analyten ist nicht davon abhängig, dass dieser Nachweis erfolgreich ist, d.h. dass der Analyt tatsächlich nachgewiesen wird.
  • Der Nachweis eines Analyten kann ferner jede Form der Messung der Konzentration oder der Häufigkeit des Analyten in der Probe umfassen. Es kann entweder die absolute Konzentration eines Zielanalyten oder eine relative Konzentration des Analyten bestimmt werden, wozu die Konzentration des Zielanalyten mit der Konzentration eines anderen Zielanalyten (oder anderer Zielanalyten) in der Probe oder in anderen Proben verglichen werden kann.
  • Der Begriff „Nachweis“ kann somit die Bestimmung, Messung, Beurteilung oder Bewertung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins oder der Menge eines Analyten auf jede Art und Weise umfassen. Quantitative und qualitative Bestimmungen, Messungen oder Bewertungen sind eingeschlossen, einschließlich halbquantitativer Bestimmungen. Solche Bestimmungen, Messungen oder Beurteilungen können relativ sein, z.B. wenn zwei oder mehr verschiedene Analyten in einer Probe nachgewiesen werden, oder absolut. Daher kann sich der Begriff „Quantifizierung“, wenn er im Zusammenhang mit der Quantifizierung eines Zielanalyten in einer Probe verwendet wird, auf die absolute oder relative Quantifizierung beziehen. Eine absolute Quantifizierung kann durch Einbeziehung bekannter Konzentrationen eines oder mehrerer Kontrollanalyten und/oder durch Vergleich des nachgewiesenen Gehalts des Zielanalyten mit bekannten Kontrollanalyten (z.B. durch Erstellung einer Standardkurve) erreicht werden. Alternativ kann die relative Quantifizierung durch den Vergleich der nachgewiesenen Gehalte oder Mengen zwischen zwei oder mehr verschiedenen Zielanalyten erfolgen, um eine relative Quantifizierung jedes der zwei oder mehr verschiedenen Analyten, d.h. relativ zueinander, zu erhalten. In ähnlicher Weise können auch die relativen Gehalte eines bestimmten Analyten in zwei verschiedenen Proben quantifiziert werden. Die Quantifizierung wird weiter unten erörtert.
  • Die Erfindung betrifft den Nachweis mehrerer Analyten in einer Probe. Jede Probe von Interesse kann gemäß der Erfindung untersucht werden. Das heißt, jede Probe, die Analyten von Interesse enthält oder enthalten kann und die man analysieren möchte, um festzustellen, ob sie Analyten von Interesse enthält oder nicht, und/oder um die Konzentrationen der Analyten von Interesse darin zu bestimmen.
  • Jede biologische oder klinische Probe kann daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung analysiert werden, z.B. jede Zell- oder Gewebeprobe eines Organismus, jede Körperflüssigkeit oder eine daraus gewonnene Zubereitung sowie Proben wie Zellkulturen, Zellpräparate, Zelllysate usw. Auch Umweltproben, z.B. Boden- und Wasserproben, oder Lebensmittelproben können erfindungsgemäß analysiert werden. Die Proben können frisch hergestellt oder auf jede geeignete Weise, z.B. für die Lagerung, vorbehandelt werden.
  • Zu den repräsentativen Proben gehört daher jedes Material, das ein Biomolekül oder einen anderen gewünschten oder Zielanalyten enthalten kann, z.B. Lebensmittel und verwandte Produkte, klinische und Umweltproben. Bei der Probe kann es sich um eine biologische Probe handeln, die jegliches virale oder zelluläre Material enthalten kann, einschließlich prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen, Viren, Bakteriophagen, Mykoplasmen, Protoplasten und Organellen. Ein solches biologisches Material kann somit jede Art von Säugetier- und/oder Nicht-Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Algen einschließlich Blaualgen, Pilze, Bakterien, Protozoen usw. aufweisen.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um eine klinische Probe, z.B. Vollblut und aus Blut gewonnene Produkte wie Plasma, Serum, Buffycoat und Blutzellen, Urin, Fäkalien, Zerebrospinalflüssigkeit oder eine andere Körperflüssigkeit (z.B. Atemwegssekrete, Speichel, Milch usw.), Gewebe und Biopsien. Besonders bevorzugt ist die Probe eine Plasma- oder Serumprobe. So kann die Erfindung z.B. zum Nachweis von Biomarkern oder zur Untersuchung einer Probe auf von Krankheitserregern stammende Analyten verwendet werden. Die Probe kann insbesondere von einem Menschen stammen, obwohl die Erfindung auch auf Proben von nicht-menschlichen Tieren (d.h. Veterinärproben) angewendet werden kann. Die Probe kann auf jede geeignete oder gewünschte Weise vorbehandelt werden, um sie für die Verwendung vorzubereiten, z.B. durch Zelllyse oder Entfernung usw.
  • Die Erfindung betrifft auf Proximity-Detektion basierende Multiplex-Assays. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Multiplex“ auf einen Assay, bei dem mehrere (d.h. mindestens zwei) verschiedene Analyten gleichzeitig in derselben Reaktionsmischung getestet werden. Vorzugsweise werden jedoch wesentlich mehr als zwei Analyten in einer erfindungsgemäßen Multiplex-Reaktion untersucht. In einer Multiplex-Reaktion können beispielsweise mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 Analyten oder mehr untersucht werden. Bestimmte Multiplex-Reaktionen können mehr als diese Anzahl von Analyten untersuchen, z.B. mindestens 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 Analyten oder mehr.
  • Ein „Nachweisassay auf Proximity-Basis“ ist ein Assay, der Proximity-Sonden zum Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet. Im Allgemeinen ist eine Proximity-Sonde eine Sonde, die mit mindestens einer anderen, verwandten Proximity-Sonde in Wechselwirkung tritt, um ein Signal zu erzeugen, das zum Nachweis eines Analyten nachgewiesen werden kann. Proximity-Sonden sind in der Technik wohlbekannt. Eine Proximity-Sonde, wie sie in der vorliegenden Offenbarung und Erfindung verwendet wird und wie sie in den Ansprüchen hierin definiert ist, ist eine Einheit, die eine für einen Analyten spezifische Analyt-Bindungsdomäne und eine Nukleinsäuredomäne aufweist. Mit „spezifisch für einen Analyten“ ist gemeint, dass die Analyt-bindende Domäne einen bestimmten Zielanalyten spezifisch erkennt und bindet, d.h. sie bindet ihren Zielanalyten mit höherer Affinität als sie andere Analyten oder Einheiten bindet. Die Analyt-Bindungsdomäne ist vorzugsweise ein Antikörper, insbesondere ein monoklonaler Antikörper. Antikörperfragmente oder Derivate von Antikörpern, die die Antigen-bindende Domäne aufweisen, eignen sich ebenfalls zur Verwendung als Analyt-bindende Domäne. Beispiele für solche Antikörperfragmente oder -derivate sind Fab-, Fab'-, F(ab')2 - und scFv-Moleküle.
  • Ein Fab-Fragment besteht aus der Antigen-bindenden Domäne eines Antikörpers. Ein einzelner Antikörper kann zwei Fab-Fragmente enthalten, die jeweils aus einer leichten Kette und dem daran anschließenden N-terminalen Abschnitt der schweren Kette bestehen. Ein Fab-Fragment enthält also eine ganze leichte Kette und die Domänen VH und CH1 der schweren Kette, an die es gebunden ist. Fab-Fragmente können durch Verdau eines Antikörpers mit Papain gewonnen werden.
  • F(ab')2 Fragmente bestehen aus den beiden Fab-Fragmenten eines Antikörpers sowie den Scharnierbereichen der schweren Domänen, einschließlich der Disulfidbrücken, die die beiden schweren Ketten miteinander verbinden. Mit anderen Worten: Ein F(ab')2-Fragment kann als zwei kovalent verbundene Fab-Fragmente betrachtet werden. F(ab')2-Fragmente können durch Verdau eines Antikörpers mit Pepsin erhalten werden. Die Reduktion der F(ab')2-Fragmente ergibt zwei Fab'-Fragmente, die als Fab-Fragmente mit einer zusätzlichen Sulfhydrylgruppe betrachtet werden können, die für die Konjugation des Fragments mit anderen Molekülen nützlich sein kann. ScFv-Moleküle sind synthetische Konstrukte, die durch Verschmelzung der variablen Domänen der leichten und schweren Ketten eines Antikörpers hergestellt werden. In der Regel wird diese Fusion rekombinant erreicht, indem das Antikörpergen so verändert wird, dass ein Fusionsprotein entsteht, das sowohl die variable Domäne der schweren als auch der leichten Kette enthält.
  • Die Nukleinsäuredomäne einer Proximity-Sonde kann eine DNA-Domäne oder eine RNA-Domäne sein. Vorzugsweise ist es eine DNA-Domäne. Die Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden in jedem Paar sind in der Regel so konzipiert, dass sie aneinander oder an ein oder mehrere gemeinsame Oligonukleotidmoleküle hybridisieren (an die die Nukleinsäuredomänen beider Proximity-Sonden eines Paares hybridisieren können). Dementsprechend müssen die Nukleinsäuredomänen zumindest teilweise einzelsträngig sein. In bestimmten Ausführungsformen sind die Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden vollständig einzelsträngig. In anderen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden teilweise einzelsträngig und weisen sowohl einen einzelsträngigen Teil als auch einen doppelsträngigen Teil auf.
  • Proximity-Sonden werden in der Regel paarweise bereitgestellt, wobei jedes Paar für einen Zielanalyten spezifisch ist. Wie bereits erwähnt, kann ein Zielanalyt eine einzelne Einheit sein, insbesondere ein einzelnes Protein. In dieser Ausführungsform binden beide Sonden im Proximity-Paar den Zielanalyten (z.B. ein Protein), jedoch an unterschiedlichen Epitopen. Die Epitope überschneiden sich nicht, so dass die Bindung einer Sonde des Paares an ihr Epitop die Bindung der anderen Sonde des Paares an ihr Epitop nicht beeinträchtigt oder blockiert. In diesem Fall bindet eine Sonde des Paares an ein Mitglied des Komplexes und die andere Sonde des Paares an das andere Mitglied des Komplexes. Die Sonden binden die Proteine innerhalb des Komplexes an Stellen, die sich von den Interaktionsstellen der Proteine unterscheiden (d.h. den Stellen in den Proteinen, über die sie miteinander wechselwirken).
  • Wie bereits erwähnt, werden Proximity-Sonden in Paaren bereitgestellt, die jeweils für einen Zielanalyten spezifisch sind. Damit ist gemeint, dass in jedem Paar von Proximity-Sonden beide Sonden Analyt-Bindungsdomänen aufweisen, die für denselben Analyten spezifisch sind. Da es sich bei dem verwendeten Nachweisverfahren um ein Multiplex-Verfahren handelt, werden in jedem Nachweisverfahren mehrere verschiedene Paare von Sonden verwendet, wobei jedes Paar von Sonden für einen anderen Analyten spezifisch ist. Das heißt, dass die Analyt-bindenden Domänen jedes verschiedenen Paars von Sonden für einen anderen Zielanalyten spezifisch sind. Jedes Nachweisverfahren, das Proximity-Sonden verwendet, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Wie oben beschrieben, sind besonders geeignete Proximity-basierte Detektionsassays Proximity-Extension-Assays (PEA) und Proximity-Ligation-Assays (PLA).
  • In einem ersten Schritt wird dabei die Probe mit einer Anzahl von (d.h. mehreren) Paaren von Proximity-Sonden in Kontakt gebracht wird. Jedes Paar von Proximity-Sonden weist eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde auf, und jede Proximity-Sonde weist auf: (a) eine Analyt-Bindungsdomäne, die für einen Analyten spezifisch ist; und (b) eine Nukleinsäuredomäne. In jedem Paar von Proximity-Sonden weisen beide Sonden Analyt-Bindungsdomänen auf, die für denselben Analyten spezifisch sind, und jedes Paar von Sonden ist für einen anderen Analyten spezifisch (d.h. jedes Paar von Sonden weist Analyt-Bindungsdomänen auf, die für einen anderen Analyten spezifisch sind).
  • Die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde weist eine Identifikationssequenz (ID) auf. Jede Proximity-Sonde weiset eine eindeutige ID-Sequenz auf (d.h. jede Proximity-Sonde enthält eine andere ID-Sequenz). Dies bedeutet jedoch nicht, dass jedes einzelne Sondenmolekül eine eindeutige ID-Sequenz enthält. Vielmehr weist jede Sondenart eine eindeutige ID-Sequenz auf. Mit „Sondenart“ ist eine Sonde gemeint, die eine bestimmte Analyt-Bindungsdomäne aufweist, d.h., alle Sondenmoleküle, die dieselbe Analyt-Bindungsdomäne aufweisen, enthalten dieselbe eindeutige ID-Sequenz. Jede andere Sondenart weist eine andere ID-Sequenz auf. Wie weiter unten erläutert, ermöglichen die ID-Sequenzen die Identifizierung von Reporternukleinsäuren, die im Rahmen der Erfindung erzeugt wurden.
  • Die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde weist auch mindestens eine (oder mindestens eine erste) Hybridisierungssequenz auf. Die ersten Hybridisierungssequenzen (die je nach den Strukturen der verwendeten Sonden die einzigen Hybridisierungssequenzen in den Proximity-Sonden sein können) sind in jedem Paar von Proximity-Sonden gepaart. Mit „gepaarten Hybridisierungssequenzen“ ist gemeint, dass die beiden Hybridisierungssequenzen innerhalb des Paares in der Lage sind, direkt oder indirekt miteinander zu interagieren, so dass, wenn ein Paar Proximity-Sonden an ihren Zielanalyten bindet, die Nukleinsäurebereiche der beiden Sonden direkt oder indirekt miteinander verbunden werden.
  • In einer besonderen und bevorzugten Ausführungsform sind die gepaarten Hybridisierungssequenzen komplementär zueinander, so dass sie miteinander hybridisieren. In dieser Ausführungsform ist die Hybridisierungssequenz der ersten Proximity-Sonde in einem Paar das umgekehrte Komplement der Hybridisierungssequenz der zweiten Proximity-Sonde in dem Paar.
  • In einer alternativen Ausführungsform hybridisieren die gepaarten Hybridisierungssequenzen nicht direkt aneinander, sondern beide hybridisieren an ein separates, überbrückendes Oligonukleotid, das hier als Splint-Oligonukleotid bezeichnet wird. Das separate Oligonukleotid kann als drittes Oligonukleotid in dem Assay betrachtet werden. Es können jedoch ein oder mehrere Splint-Oligonukleotide verwendet werden, so dass es dritte oder weitere Oligonukleotide geben kann, an die die gepaarten Hybridisierungssequenzen hybridisieren können. Mit anderen Worten: Die gepaarten Hybridisierungssequenzen können an ein gemeinsames Oligonukleotid hybridisieren. Dabei kann es sich um ein Template-Oligonukleotid handeln, das in der Lage ist, die Ligation und/oder Extension der Nukleinsäuredomänen zu templieren, oder es kann sein, dass die Extension und/oder Ligation des dritten und gegebenenfalls weiterer Oligonukleotide durch die Nukleinsäuredomänen templiert wird.
  • In einer solchen Ausführungsform kann das Splint-Oligonukleotid zusammen mit dem Paar von Proximity-Sonden ein drittes Mitglied jedes Proximity-Assay-Sets bilden. Das Splint-Oligonukleotid weist zwei Hybridisierungssequenzen auf: eine komplementär zur Hybridisierungssequenz der ersten Sonde im Paar von Sonden und die andere komplementär zur Hybridisierungssequenz der zweiten Sonde im Paar von Sonden. Das Splint-Oligonukleotid ist somit in der Lage, mit beiden gepaarten Hybridisierungssequenzen der Proximity-Sonden in seinem Proximity-Assay-Set zu hybridisieren. Insbesondere ist das Splint-Oligonukleotid in der Lage, mit beiden gepaarten Hybridisierungssequenzen der Proximity-Sonden in seinem Proximity-Assay-Set gleichzeitig zu hybridisieren. Wenn also ein Paar Proximity-Sonden ihren Analyten bindet und in die Nähe kommt, hybridisieren die Nukleinsäuredomänen der Sonden beide an das Splint-Oligonukleotid und bilden so einen Komplex aus den beiden Sonden-Nukleinsäuredomänen und dem Splint-Oligonukleotid.
  • Bei dem vorliegenden Verfahren wird mindestens ein Paar Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt. Mit anderen Worten, mindestens zwei Paare von Proximity-Sonden (die an verschiedene Analyten binden) haben die gleichen Hybridisierungssequenzen. Sonden aus Paaren, die ein Paar Hybridisierungssequenzen gemeinsam haben, sind in der Lage, miteinander zu hybridisieren oder gemeinsam einen Komplex zu bilden. Am wahrscheinlichsten ist eine Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuredomänen eines Paares von Proximity-Sonden, wenn beide an ihren jeweiligen Analyten gebunden sind, da die Bindung der Sonden an den Analyten die Nukleinsäuredomänen in unmittelbare Nähe bringt. Es werden sich jedoch zwangsläufig einige Wechselwirkungen zwischen gepaarten Hybridisierungssequenzen der Nukleinsäuredomänen von ungebundenen Proximity-Sonden in Lösung bilden (d.h. den Nukleinsäuredomänen von Proximity-Sonden, die nicht an ihren Analyten gebunden sind), oder wenn nur eine Proximity-Sonde an ihren Zielanalyten gebunden ist, kann sie mit einer anderen Sonde in Lösung wechselwirken. Insbesondere ist die Nukleinsäuredomäne einer ungebundenen Proximity-Sonde in Lösung ebenso wahrscheinlich mit der Nukleinsäuredomäne einer beliebigen Proximity-Sonde, die eine gepaarte Hybridisierungssequenz aufweist, zu hybridisieren (oder einen Komplex mit ihr zu bilden), unabhängig davon, ob die Proximity-Sonde an denselben Analyten oder einen anderen Analyten bindet. Reporternukleinsäuren, die als Ergebnis einer solchen unspezifischen Hybridisierung (d.h. als Ergebnis der Hybridisierung zwischen ungebundenen Proximity-Sonden in Lösung) entstehen, bilden den Hintergrund, wie weiter unten beschrieben.
  • Es ist vorzuziehen, dass ein erheblicher Anteil der Paare von Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilt. In besonderen Ausführungsformen teilen sich mindestens 25 %, 50 % oder 75 % der Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden (d.h. mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden). In einer besonderen Ausführungsform teilen sich alle Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden. Wie jedoch aus den obigen Ausführungen ersichtlich ist, ist in einer anderen Ausführungsform mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen für ein einzelnes Paar von Proximity-Sonden einzigartig. Das heißt, dass mindestens ein Paar von Proximity-Sonden seine Hybridisierungssequenzen mit keinem anderen Paar von Proximity-Sonden teilt. In bestimmten Ausführungsformen teilen sich bis zu 75 %, 50 % oder 25 % der Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit keinem anderen Paar von Proximity-Sonden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein einziges Paar von Hybridisierungssequenzen von allen Paaren von Sonden gemeinsam genutzt, die gemeinsame Hybridisierungssequenzen haben. Das heißt, alle Paare von Sonden, die ihre Hybridisierungssequenzen mit einem anderen Paar von Sonden teilen, haben das gleiche Paar von Hybridisierungssequenzen. In dieser Ausführungsform können potenziell alle im Multiplex-Assay verwendeten Paare von Sonden das gleiche Paar Hybridisierungssequenzen aufweisen.
  • Wenn sich jedoch zu viele Paare von Sonden dasselbe Paar von Hybridisierungssequenzen teilen, kann dies dazu führen, dass eine zu große Anzahl von Hintergrundinteraktionen stattfindet und die echten positiven Signale verdeckt werden. Dementsprechend kann es wünschenswert sein, dass jedes Paar von Hybridisierungssequenzen von einer begrenzten Anzahl von Paaren von Sonden gemeinsam genutzt wird. In bestimmten Ausführungsformen teilen sich nicht mehr als 20, 15, 10 oder 5 Paare von Proximity-Sonden dasselbe Paar von Hybridisierungssequenzen. Daher ist es bevorzugt, dass der erfindungsgemäße Multiplex-Assay mehrere Sätze von Paaren von Proximity-Sonden verwendet, von denen sich jedes ein bestimmtes Paar von Hybridisierungssequenzen teilt. Somit teilen sich alle Paare von Proximity-Sonden in einem bestimmten Satz von Paaren von Proximity-Sonden dasselbe Paar von Hybridisierungssequenzen, aber jedes andere Paar von Paaren von Proximity-Sonden verwendet ein anderes Paar von Hybridisierungssequenzen. Dies ermöglicht eine unspezifische Hybridisierung zwischen allen Paaren von Sonden innerhalb eines Satzes von Sondenpaaren, verhindert aber eine unspezifische Hybridisierung zwischen Paaren von Sonden in verschiedenen Sätzen von Sondenpaaren. Im Allgemeinen besteht jeder Satz von Sondenpaaren aus 2 bis 5 Paaren von Sonden, es können jedoch auch größere Sätze verwendet werden, wenn dies gewünscht wird.
  • Die Anzahl der Sätze von Sonsenpaaren, die in einem bestimmten Multiplex-Assay verwendet werden, hängt von der Gesamtzahl der im Assay verwendeten Paare von Sonden ab, d.h. von der Anzahl der verschiedenen im Assay nachgewiesenen Analyten. Je größer die Zahl der im Assay verwendeten Paare von Sonden ist, desto größer ist zwangsläufig auch die Zahl der Sätze von Sondenpaaren.
  • Der erste Schritt umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit der oben beschriebenen Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden. Die Proximity-Sonden eines Paares können der Probe vorgemischt als Paare oder als einzelne Proximity-Sonden zugesetzt werden. Das heißt, die Probe kann mit den Proximity-Sonden eines Paares getrennt oder gemeinsam zur gleichen Zeit in Kontakt gebracht werden, entweder durch gleichzeitigen Kontakt der Sonden oder in derselben Reaktionsmischung. Wenn die Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass beide Sonden eines Paars von Sonden an ein gemeinsames Splint-Oligonukleotid (und nicht aneinander) hybridisieren, können die verschiedenen Splint-Oligonukleotide mit den Paaren von Proximity-Sonden oder mit einer der Proximity-Sonden eines Paars enthalten sein oder separat zur gleichen Zeit oder nach den Proximity-Sonden hinzugefügt werden. „Kontakt mit der Probe“ bedeutet, dass die Probe und die Paare von Proximity-Sonden gemischt werden. Die Paare von Proximity-Sonden können der Probe zugesetzt werden, oder umgekehrt kann die Probe den Paaren von Proximity-Sonden zugesetzt werden. Die Probe kann verdünnt werden, bevor sie mit den Paaren von Proximity-Sonden in Kontakt gebracht wird. Ist eine Verdünnung der Probe erforderlich, so kann dies mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, z.B. einem Puffer, erfolgen. Geeignete Puffer zur Verwendung als Verdünnungsmittel sind PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung), HBS (HEPESgepufferte Kochsalzlösung) usw. Der verwendete Puffer (oder ein anderes Verdünnungsmittel) muss in einem gereinigten Lösungsmittel (z.B. Wasser) hergestellt werden, damit er keine kontaminierenden Analyten enthält. Das Verdünnungsmittel sollte daher steril sein, und wenn Wasser als Verdünnungsmittel oder als Basis des Verdünnungsmittels verwendet wird, ist das verwendete Wasser vorzugsweise ultrarein (z.B. Milli-Q-Wasser).
  • Nachdem die Probe mit den Paaren von Proximity-Sonden in Kontakt gebracht wurde, können die Nukleinsäurebereiche der Proximity-Sonden miteinander oder mit dem Splint-Oligonukleotid hybridisieren. Die Hybridisierung der Nukleinsäuredomänen untereinander oder mit dem Splint-Oligonukleotid führt zur Bildung eines kontinuierlichen oder nicht kontinuierlichen Duplexes. Ein „Duplex“, wie er hier beschrieben wird, ist ein Abschnitt doppelsträngiger Nukleinsäure. Der Duplex weist die Hybridisierungssequenz einer ersten Proximity-Sonde und die Hybridisierungssequenz einer zweiten Proximity-Sonde auf. Wenn die Hybridisierungssequenzen an ein gemeinsames Splint-Oligonukleotid und nicht aneinander hybridisieren, weist der Duplex auch das gemeinsame Splint-Oligonukleotid auf.
  • In diesem Schritt führt die Hybridisierung der Nukleinsäuredomänen aneinander zur Bildung eines kontinuierlichen Duplex, d.h. eines einzigen Duplex, der die Gesamtheit der Hybridisierungssequenzen der beiden Nukleinsäuredomänen aufweist. Die Hybridisierung der Nukleinsäuredomänen der Sonden an ein gemeinsames Splint-Oligonukleotid führt zur Bildung eines diskontinuierlichen Duplex, der einen ersten Teil, der zwischen dem Splint-Oligonukleotid und der Hybridisierungssequenz der ersten Sonde gebildet wird, einen zweiten Teil, der zwischen dem Splint-Oligonukleotid und der Hybridisierungssequenz der zweiten Sonde gebildet wird, und eine Lücke zwischen dem ersten und dem zweiten Teil des Duplex (d.h. zwischen den Hybridisierungssequenzen der beiden Sonden) aufweist. Der diskontinuierliche Duplex kann alternativ als zwei getrennte Duplexe betrachtet werden (d.h. der erste und der zweite Teil des diskontinuierlichen Duplexes können alternativ als getrennte erste und zweite Duplexe betrachtet werden). So gesehen führt die Hybridisierung der Sonden-Nukleinsäuredomänen an ein gemeinsames Splint-Oligonukleotid zur Bildung von zwei verbundenen Duplexen. Die Duplexe sind insofern verbunden, als sie durch das gemeinsame Splint-Oligonukleotid verbunden sind.
  • Der durch Hybridisierung der Nukleinsäuredomänen aneinander oder an das gemeinsame Splint-Oligonukleotid erzeugte Duplex weist ein freies 3'-Ende auf (oder mindestens ein freies 3'-Ende - der Duplex kann mehrere freie 3'-Enden enthalten. In bestimmten Ausführungsformen weist der Duplex zwei freie 3'-Enden auf). Ein freies 3'-Ende ist ein 3'-Ende eines Nukleinsäurestrangs in einem Duplex, das durch eine Polymerase verlängert werden kann.
  • In diesem Schritt erfolgt die Hybridisierung in der Regel und am häufigsten zwischen den Nukleinsäurebereichen von Proximity-Sonden in einem Paar von Proximity-Sonden, die an einen Zielanalyten gebunden sind. Wie oben beschrieben, findet jedoch auch eine Hintergrundhybridisierung mit oder zwischen den Nukleinsäuredomänen von ungebundenen, ungepaarten Sonden in Lösung statt. Eine solche Hintergrundhybridisierung findet zwischen den Nukleinsäuredomänen von Sonden aus Paaren von Sonden statt, die gemeinsame Hybridisierungssequenzen aufweisen.
  • Nach der Hybridisierung der Nukleinsäurebereiche zur Bildung des Duplex wird der Duplex einer Verlängerungs- und/oder Ligationsreaktion unterzogen, um ein Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist. Die Art der durchgeführten Reaktionen hängt davon ab, ob es sich bei dem durchgeführten Proximity-Assay um eine PLA oder PEA handelt. Bei einer PEA wird nur eine Verlängerungsreaktion durchgeführt, wodurch ein Verlängerungsprodukt entsteht. Im Folgenden wird eine Reihe von PEA-Varianten erörtert. Bei einer PLA wird eine Ligationsreaktion durchgeführt, es kann aber auch eine Verlängerungsreaktion erfolgen. Varianten von PLA werden ebenfalls weiter unten besprochen. Vorzugsweise ist das Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt ein lineares Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt (d.h. es ist kein zirkuläres Produkt).
  • Sobald das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt entstanden ist, wird es amplifiziert. Die Amplifikation kann mit jeder bekannten Nukleinsäure-Amplifikationstechnik durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Amplifikation durch PCR durchgeführt, es kann aber auch jedes andere Verfahren der Nukleinsäureamplifikation verwendet werden, z.B. die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weisen alle im Multiplex-Assay erzeugten Reporternukleinsäuren (d.h. Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte) gemeinsame Primerbindungsstellen auf. Das heißt, dass alle erzeugten Reporternukleinsäuren das gleiche Paar von Primerbindungsstellen aufweisen. Dies ist vorteilhaft, da so alle erzeugten Reporternukleinsäuren in einer einzigen Amplifikationsreaktion (z.B. PCR) mit einem einzigen Primerpaar amplifiziert werden können.
  • Nach der Amplifikation wird die Reporternukleinsäure nachgewiesen. Der Nachweis der Reporternukleinsäure erfolgt durch den Nachweis der darin enthaltenen ID-Sequenzen.
  • Durch den Nachweis der ID-Sequenzen innerhalb des Verlängerungs- oder Ligationsprodukts lässt sich feststellen, welche Sonden miteinander hybridisiert haben, um das Produkt zu erzeugen. In diesem Schritt werden auch die relativen Mengen der einzelnen Verlängerungs- oder Ligationsprodukte bestimmt. Es kann jedes geeignete Nachweisverfahren verwendet werden, die auf dem Gebiet der Technik bekannt ist.
  • Die ID-Sequenz kann eine beliebige Sequenz sein, durch die eine Proximity-Sonde unterschieden oder identifiziert werden kann. Es handelt sich also um eine Markierungssequenz, mit der eine bestimmte Proximity-Sonde nachgewiesen werden kann. Die ID-Sequenz kann direkt gerichtet sein, oder sie kann eine Bindungsstelle für eine weitere Einheit bieten, durch die sie nachgewiesen werden kann, z.B. für einen spezifischen Primer oder eine Nachweissonde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die ID-Sequenzen Barcode-Sequenzen. Eine Barcode-Sequenz ist eine bestimmte Nukleotidsequenz, die so definiert ist, dass sie einem bestimmten Analyten entspricht. Wenn jede Sonde eine Barcodesequenz trägt, enthält jede Reporternukleinsäure zwei Barcodesequenzen: eine von jeder der beiden Sonden, die zusammen das Produkt ergeben. Wenn die beiden Barcode-Sequenzen nachgewiesen werden, können die beiden Sonden, die zusammen die Reporternukleinsäure ergeben haben, identifiziert werden. Wenn die beiden Barcode-Sequenzen von einem Paar von Proximity-Sonden stammen (d.h. von einem Paar von Sonden, die denselben Zielanalyten binden), kann die Reporternukleinsäure das Vorhandensein des Zielanalyten in der Probe anzeigen oder im Hintergrund sein. Wenn die beiden Barcode-Sequenzen von ungepaarten Proximity-Sonden stammen (d.h. die beiden Barcode-Sequenzen weisen auf unterschiedliche Analyten hin), gilt die Reporternukleinsäure als Hintergrund.
  • Die Barcode-Sequenzen befinden sich innerhalb der Nukleinsäurebereiche der Sonden. Die Barcode-Sequenz befindet sich nicht innerhalb der ersten Hybridisierungssequenz: Wie oben ausgeführt, weist jede Proximity-Sonde eine andere Barcode-Sequenz auf, während die Hybridisierungssequenzen von mehreren verschiedenen Sonden gemeinsam genutzt werden. Die Barcode-Sequenzen befinden sich auch nicht in den gemeinsamen Primer-Bindungsstellen - wie oben erwähnt, weist jede Sonde eine einzigartige Barcode-Sequenz auf, während es bevorzugt ist, dass alle Sonden gemeinsame Primer-Bindungsstellen aufweisen.
  • Barcode-Sequenzen können auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Erstens können spezifische Barcode-Sequenzen durch Sequenzierung aller Reporternukleinsäuremoleküle, die während des Multiplex-Nachweisverfahrens erzeugt werden, nachgewiesen werden. Durch die Sequenzierung aller erzeugten Reporternukleinsäuremoleküle können alle verschiedenen erzeugten Reporternukleinsäuremoleküle anhand ihrer Barcodesequenzen identifiziert werden. Die Sequenzierung von Nukleinsäuren ist das bevorzugte Verfahren für den Nachweis/die Analyse von Reporternukleinsäuren.
  • Andere geeignete Verfahren zum Nachweis von Barcodes in den Reporternukleinsäuremolekülen umfassen PCR-basierte Verfahren. Beispielsweise kann eine quantitative PCR unter Verwendung von „TaqMan“-Sonden durchgeführt werden. In diesem Fall werden die Reporternukleinsäuremoleküle (oder zumindest ein Abschnitt jedes Reporternukleinsäuremoleküls, der die Barcodesequenzen enthält) amplifiziert, und es wird eine zu jeder Barcodesequenz komplementäre Sonde bereitgestellt, wobei jede unterschiedliche Sonde mit einem anderen, unterscheidbaren Fluorophor konjugiert ist. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines jeden Barcodes kann dann auf der Grundlage der Amplifikation des jeweiligen Barcodes bestimmt werden. Es ist jedoch offensichtlich, dass PCR-basierte Verfahren wie die oben beschriebenen nur für die gleichzeitige Analyse einer relativ kleinen Anzahl verschiedener Sequenzen geeignet sind, obwohl kombinatorische Verfahren mit Sonden zur Dekodierung von Barcode-Sequenzen bekannt sind und verwendet werden können, um die Multiplexing-Kapazität bis zu einem gewissen Grad zu erweitern. Bei der Nukleinsäuresequenzierung gibt es keine wirkliche Begrenzung für die Anzahl der Sequenzen, die in einem Durchgang identifiziert werden können, so dass ein höheres Maß an Multiplexreaktion möglich ist als beim Nachweis mittels PCR, weshalb die Sequenzierung das bevorzugte Verfahren für den Nachweis von Reporternukleinsäuremolekülen ist.
  • Vorzugsweise wird eine Form der DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz zum Nachweis von Barcodes in den Reporternukleinsäuremolekülen verwendet. Die Sequenzierung durch Synthese ist das bevorzugte DNA-Sequenzierungsverfahren. Beispiele für die Sequenzierung durch Synthese sind die Pyrosequenzierung, die Sequenzierung mit reversiblem Farbstoff-Terminator und die lonen-Torrent-Sequenzierung, von denen jede in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden kann. Vorzugsweise werden die Reporternukleinsäuren durch massiv parallele DNA-Sequenzierung sequenziert. Die massiv-parallele DNA-Sequenzierung kann insbesondere bei der Sequenzierung durch Synthese (z.B. reversible Farbstoff-Terminator-Sequenzierung, Pyrosequenzierung oder lonen-Torrent-Sequenzierung, wie oben erwähnt) angewendet werden. Die massiv-parallele DNA-Sequenzierung unter Verwendung der reversiblen Farbstoffterminator-Verfahren ist ein bevorzugtes Sequenzierungsverfahren. Die massiv-parallele DNA-Sequenzierung mit dem reversiblen Farbstoffterminator-Verfahren kann z.B. mit einem Illumina® NovaSeq™-System durchgeführt werden.
  • Wie in der Fachwelt bekannt, ist die massiv-parallele DNA-Sequenzierung eine Technik, bei der mehrere (z.B. Tausende oder Millionen oder mehr) DNA-Stränge parallel, d.h. gleichzeitig, sequenziert werden. Für die massiv-parallele DNA-Sequenzierung müssen die Ziel-DNA-Moleküle an einer festen Oberfläche immobilisiert werden, z.B. an der Oberfläche einer Fließzelle oder an einem Bead. Jedes immobilisierte DNA-Molekül wird dann einzeln sequenziert. Im Allgemeinen wird bei der massiv parallelen DNA-Sequenzierung mit reversibler Farbstoffterminatorsequenzierung eine Fließzelle als Immobilisierungsoberfläche verwendet, und bei der massiv parallelen DNA-Sequenzierung mit Pyrosequenzierung oder lonenstromsequenzierung wird ein Bead als Immobilisierungsoberfläche verwendet.
  • Wie dem Fachmann bekannt ist, wird die Immobilisierung von DNA-Molekülen an einer Oberfläche im Zusammenhang mit der massiven parallelen Sequenzierung im Allgemeinen durch die Anbringung eines oder mehrerer Sequenzierungsadapter an den Enden der Moleküle erreicht, die in der Lage sind, die DNA-Moleküle an eine Zieloberfläche zu binden. Das Verfahren kann daher die Anbringung eines oder mehrerer Sequenzierungsadapter an die Reporter-Nukleinsäuremoleküle umfassen, wie im Folgenden näher beschrieben.
  • In einer alternativen Ausführungsform sind die ID-Sequenzen keine Barcode-Sequenzen. Vielmehr können die ID-Sequenzen die Identifizierung der Sonden durch andere Mittel ermöglichen. Je nach Art der ID-Sequenz kann jedes geeignete Verfahren zur Identifizierung der ID-Sequenz verwendet werden. So kann es sich bei den ID-Sequenzen beispielsweise um Restriktionsstellen handeln (d.h. um eine Nukleotidsequenz, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird). In dieser Ausführungsform weist die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine andere Restriktionsstelle auf (so dass sie von einem anderen Restriktionsenzym erkannt und gespalten wird). So können verschiedene Kombinationen von Restriktionsenzymen auf die aus dem Multiplex-Test stammenden Reporternukleinsäuren angewendet werden, um festzustellen, welche Kombinationen von Sonden interagiert haben. Wird eine Reporternukleinsäure von beiden Restriktionsenzymen eines Paares gespalten, so zeigt dies, dass die beiden Sonden, die die jeweiligen Restriktionsstellen für die Enzyme aufweisen, interagiert haben, um eine Reporternukleinsäure zu erhalten.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die ID-Sequenzen Primer-Bindungsstellen. In dieser Ausführungsform weist die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine einzigartige Primer-Bindungsstelle auf. Die Amplifikation der Reporternukleinsäuremoleküle mit verschiedenen Primer-Kombinationen wird dann durchgeführt, um festzustellen, welche Kombinationen von Sonden interagiert haben. Ergibt eine Amplifikationsreaktion mit einem bestimmten Primerpaar ein Amplifikationsprodukt, so beweist dies, dass die beiden Sonden, die die jeweiligen Primerbindungsstellen aufweisen, zur Erzeugung einer Reporternukleinsäure interagiert haben. Jede andere Sequenz, die in irgendeiner Weise zur Identifizierung einer bestimmten Sonde dient, kann alternativ als ID-Sequenz verwendet werden.
  • Die Verwendung von Barcode-Sequenzen als ID-Sequenzen ist besonders bevorzugt, da so alle Reporter-Nukleinsäuremoleküle in einer einzigen Sequenzierungsreaktion nachgewiesen werden können. Die Verwendung alternativer Formen von ID-Sequenzen, wie z.B. eindeutige Restriktions- oder Primer-Bindungsstellen, sind weniger effizient, da sie erfordern, dass jede Kombination von Restriktionsenzymen oder Primern in einer separaten Reaktion getestet wird, um festzustellen, welche Sonden zur Erzeugung von Reporternukleinsäuren interagiert haben. Dennoch kann es Gelegenheiten geben, bei denen eine solche alternative Art von ID-Sequenz bevorzugt wird.
  • So werden die Reporternukleinsäuremoleküle (d.h. die Verlängerungs- oder Ligationsprodukte) nachgewiesen, und dieser Nachweis weist die Identifizierung der ID-Sequenzen (vorzugsweise Barcode-Sequenzen) in jeder Reporternukleinsäure auf, wie oben beschrieben. Der Nachweis umfasst nicht nur den Nachweis der verschiedenen erzeugten Reporternukleinsäuremoleküle, sondern auch die Bestimmung der relativen Mengen der einzelnen Reporternukleinsäuremoleküle. Dies kann mit jedem geeigneten Mittel erfolgen. Die DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz, die, wie oben beschrieben, ein bevorzugtes Mittel zum Nachweis von Reporternukleinsäuren ist, eignet sich für die relative Quantifizierung von Reporternukleinsäuremolekülen, da die Anzahl jeder einzelnen Reporternukleinsäure durch die Sequenzierungsreaktion quantifiziert wird. Wie bereits erwähnt, ist die quantitative PCR ein weiteres geeignetes Mittel zum Nachweis von Reporternukleinsäuren. Der Nachweis von Reporternukleinsäuremolekülen durch quantitative PCR ermöglicht die Quantifizierung der relativen Mengen jeder Reporternukleinsäure. Jedes andere geeignete Verfahren zur Quantifizierung der relativen Mengen der einzelnen Reporternukleinsäuren kann verwendet werden.
  • Sobald die Reporternukleinsäuren nachgewiesen wurden, wird ein Bestimmungsschritt durchgeführt, um festzustellen, welche Analyten in der Probe vorhanden sind. In diesem Schritt wird zunächst das Ausmaß des Hintergrunds bestimmt. Alle Reporternukleinsäuren, die als Ergebnis unspezifischer Sondenwechselwirkungen entstehen, können als Hintergrundinteraktionen betrachtet werden. Die relative Menge jeder dieser Hintergrundwechselwirkungen wird bestimmt, so dass das Ausmaß der Hintergrundwechselwirkung ermittelt wird. Mit „unspezifischen Sondenwechselwirkungen“ sind Wechselwirkungen zwischen Sonden gemeint, die nicht gepaart sind, d.h. Wechselwirkungen zwischen Sonden, die unterschiedliche Analyten binden. Bei solchen Reporternukleinsäuren handelt es sich um Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte, die eine erste ID-Sequenz (z.B. Barcode-Sequenz) von einer ersten Proximity-Sonde, die zu einem ersten Paar von Proximity-Sonden gehört, und eine zweite ID-Sequenz (z.B. Barcode-Sequenz) von einer zweiten Proximity-Sonde, die zu einem zweiten Paar von Proximity-Sonden gehört, aufweisen. Solche Reporternukleinsäuren können alternativ auch als Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte beschrieben werden, die eine erste ID-Sequenz (z.B. Barcode-Sequenz) von einer Proximity-Sonde, die für einen ersten Analyten spezifisch ist, und eine zweite ID-Sequenz (z.B. Barcode-Sequenz) von einer Proximity-Sonde, die für einen zweiten (oder anderen) Analyten spezifisch ist, aufweisen. Wie oben beschrieben, können unspezifische Wechselwirkungen zwischen ungepaarten Proximity-Sonden zwischen Sonden auftreten, die sich frei in Lösung befinden, oder wenn nur eine Sonde an ihren Analyten gebunden hat, was auf ihre gemeinsamen Hybridisierungsstellen zurückzuführen ist.
  • Anschließend werden die durch spezifische Sondenwechselwirkungen erzeugten Reporternukleinsäuren analysiert. Unter „spezifischen Sondenwechselwirkungen“ versteht man Interaktionen zwischen Sonden innerhalb eines Paares von Sonden, d.h. zwischen zwei Sonden, die an denselben Analyten binden. Bei solchen Reporternukleinsäuren handelt es sich um Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte, die eine erste ID-Sequenz und eine zweite ID-Sequenz (z.B. eine erste und eine zweite Barcodesequenz) aus einem Paar von Proximity-Sonden enthalten. Solche Reporternukleinsäuren können alternativ auch als Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte beschrieben werden, die eine erste ID-Sequenz und eine zweite ID-Sequenz (z.B. eine erste und zweite Barcode-Sequenz) von Proximity-Sonden aufweisen, die für denselben Analyten spezifisch sind.
  • Sonden innerhalb eines Paars von Sonden können auch in Lösung interagieren, so dass Reporternukleinsäuren, die durch spezifische Sondenwechselwirkungen erzeugt werden, auch den Hintergrund darstellen können (d.h. als Ergebnis von Hintergrundinteraktionen erzeugt werden). Daher wird die Menge jeder Reporternukleinsäure, die durch spezifische Sondenwechselwirkungen erzeugt wird, mit dem Grad der Hintergrundwechselwirkung verglichen, der durch die Menge der Reporternukleinsäuren bestimmt wird, die als Ergebnis unspezifischer Sondenwechselwirkungen erzeugt werden. Wenn eine Reporternukleinsäure, die durch eine spezifische Sondenwechselwirkung erzeugt wird, in einer höheren Konzentration vorhanden ist als die Hintergrundinteraktion (d.h. die Menge der unspezifischen Hintergrundreporternukleinsäuren), deutet dies darauf hin, dass der durch das betreffende Paar von Sonden gebundene Analyt in der Probe vorhanden ist. Wenn andererseits eine durch eine spezifische Sondenwechselwirkung erzeugte Reporternukleinsäure in einer Konzentration vorhanden ist, die nicht höher ist als die der unspezifischen Hintergrund-Reporternukleinsäuren (z.B. wenn die durch eine spezifische Sondenwechselwirkung erzeugte Reporternukleinsäure in einer Konzentration vorhanden ist, die gleich oder niedriger ist als die der unspezifischen Hintergrund-Reporternukleinsäuren), dann wird die Interaktion zwischen dem betreffenden Paar von Sonden lediglich als Hintergrund angesehen. In diesem Fall bedeutet die Tatsache, dass die Wechselwirkung zwischen den Sonden des Paars von Sonden lediglich Hintergrund ist, dass der durch das Paar von Sonden gebundene Analyt nicht in der Probe vorhanden ist.
  • Alternativ dazu können für jedes einzelne Zielmolekül Hintergrundwechselwirkungen nur als unspezifische Wechselwirkungen definiert werden, die eine Sonde einschließen, die dieses Zielmolekül bindet. Das heißt, für jedes Zielmolekül können Hintergrundwechselwirkungen als unspezifische Wechselwirkungen zwischen einer Sonde, die das Zielmolekül erkennt, und einer ungepaarten Sonde (d.h. einer Sonde, die das Zielmolekül nicht erkennt), die ihre Hybridisierungsstelle mit dem Paar von Sonden, das das Zielmolekül erkennt, teilt, definiert werden. In diesem Fall werden also unspezifische Wechselwirkungen zwischen Sonden, die beide das Zielmolekül nicht erkennen, nicht als Hintergrundwechselwirkungen für dieses bestimmte Zielmolekül betrachtet.
  • In einer besonderen Ausführungsform ist das Hintergrundniveau, mit dem das Niveau einer bestimmten Sondenwechselwirkung verglichen wird, das durchschnittliche Niveau der betrachteten Hintergrundinteraktionen, insbesondere das mittlere Niveau der betrachteten Hintergrundinteraktionen.
  • In einer besonderen Ausführungsform umfasst der erste Schritt des Verfahrens (d.h. der Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einer Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden) ferner das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer oder mehreren Hintergrundsonden, die keinen Analyten binden, wobei die Hintergrundsonden eine Nukleinsäuredomäne aufweisen, die eine ID-Sequenz und eine Hybridisierungssequenz aufweist, die sie mit mindestens einer Proximity-Sonde teilen. Die „Hintergrundsonden“ können hier auch als „inerte Sonden“ bezeichnet werden. Wie bereits erwähnt, binden die inerten Sonden keinen Analyten. Inerte Sonden können jedoch eine analytenbindende Domäne enthalten, wenn sie für einen Analyten spezifisch ist, von dem bekannt ist, dass er in der Probe nicht vorhanden ist, insbesondere für einen Antikörper. Die inerte Sonde kann in der Tat eine „Bindungsdomäne“ aufweisen, die der analytenbindenden Domäne einer funktionellen Proximity-Sonde entspricht, aber keine analytenbindende Funktion ausübt, d.h. das Äquivalent der Bindungsdomäne ist inert. In einer Ausführungsform kann die inerte Domäne durch Massen-IgG bereitgestellt werden. Alternativ können inerte Sonden eine inaktive Analyt-Bindungsdomäne, d.h. eine nicht-funktionale Analyt-Bindungsdomäne, aufweisen. Inerte Sonden können beispielsweise eine Schein-Analyt-Bindungsdomäne, wie die konstante Region eines Antikörpers, oder eine Kette eines Antikörpers (nur eine schwere Kette oder eine leichte Kette) aufweisen. Alternativ können inerte Sonden eine inerte Domäne aufweisen, an die die Nukleinsäuredomäne gebunden ist, die aber keine Funktion hat und nicht mit den Analyt-bindenden Domänen der aktiven Sonden verbunden ist. Eine inerte Domäne kann z.B. ein Protein sein, das dem Assay zugesetzt werden kann, ohne die Assay-Reaktionen zu beeinträchtigen, wie z.B. Serumalbumin (z.B. humanes Serumalbumin oder bovines Serumalbumin). In einer anderen Variante sind die inerten Sonden einfach Nukleinsäuremoleküle und enthalten keine Nicht-Nukleinsäuredomäne.
  • Jede inerte Sonde enthält eine ID-Sequenz innerhalb ihrer Nukleinsäuredomäne. In den inerten Sonden wird derselbe Typ von ID-Sequenz verwendet wie in den aktiven (d.h. nahe gelegenen) Sonden. Wenn z.B. die aktiven Sonden Barcode-Sequenzen als ID-Sequenzen verwenden, verwenden die inerten Sonden ebenfalls Barcode-Sequenzen als ID-Sequenzen. Die inerten Sonden weisen jeweils eine Hybridisierungssequenz auf, die sie mit mindestens einer Proximity-Sonde teilen. Vorzugsweise weisen die inerten Sonden jeweils eine Hybridisierungssequenz auf, die mit mehreren Proximity-Sonden geteilt wird. Wenn inerte Sonden verwendet werden, kann es sein, dass nur eine einzige Art von inerter Sonde verwendet wird, d.h. alle inerten Sonden haben die gleiche Hybridisierungssequenz. Vorzugsweise werden jedoch mehrere Arten von inerten Sonden verwendet, wobei jede inerte Sondenart eine andere Hybridisierungssequenz aufweist (gemeinsam mit einer anderen Proximity-Sonde oder einer anderen Gruppe von Proximity-Sonden). Es kann sein, dass jede verschiedene Art von Inert-Sonde eine andere, eindeutige ID-Sequenz hat. Alternativ kann auch eine gemeinsame ID-Sequenz für alle inerten Sonden aller Arten verwendet werden. In jedem Fall sind die in den inerten Sonden verwendete(n) ID-Sequenz(en) nicht mit einer Proximity-Sonde gemeinsam.
  • Aufgrund der gemeinsamen Hybridisierungsstellen zwischen den inerten Sonden und bestimmten Proximity-Sonden ist eine Hintergrundwechselwirkung in Lösung zwischen inerten Sonden und Proximity-Sonden möglich. Wenn eine inerte Sonde mit einer Proximity-Sonde wechselwirkt, führt dies zur Bildung eines Duplex zwischen den Nukleinsäurebereichen der beiden Sonden. Die Durchführung der Verlängerungs- und/oder Ligationsreaktion führt zur Bildung eines Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukts aus dem von den beiden Sonden gebildeten Duplex. Dieses Verlängerungs-/Ligationsprodukt wird zusammen mit allen anderen Produkten des Assays amplifiziert, verarbeitet und nachgewiesen. Verlängerungs-/Ligationsprodukte (d.h. Reporternukleinsäuren), die aus der Wechselwirkung zwischen einer inerten Sonde und einer Proximity-Sonde entstehen, werden im Bestimmungsschritt als Hintergrund betrachtet.
  • Der zum Nachweis der Analyten in der Probe verwendete Multiplex-Assay ist vorzugsweise ein PEA. In dieser Ausführungsform weisen die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden, wie oben erwähnt, komplementäre Hybridisierungssequenzen auf, die miteinander hybridisieren, um den Duplex zu bilden. Der gebildete Duplex wird einer Verlängerungsreaktion unterzogen, um ein Verlängerungsprodukt zu erhalten. Insbesondere ist das Verlängerungsprodukt einer PEA ein lineares Verlängerungsprodukt.
  • Es gibt mehrere verschiedene PEA-Varianten, bei denen jeweils Proximity-Sonden mit leicht unterschiedlichem Design verwendet werden. Die Nukleinsäuredomänen jeder Proximity-Sonde werden in Abhängigkeit von dem Verfahren entworfen, in der die Sonden verwendet werden sollen. Ein repräsentatives Beispiel für Proximity-Extension-Assay-Formate ist in 1 schematisch dargestellt, und diese Ausführungsformen werden im Folgenden ausführlich beschrieben. Im Allgemeinen kommen bei einem Proximity-Extension-Assay nach der Bindung eines Paares von Proximity-Sonden an ihren Zielanalyten die Nukleinsäuredomänen der beiden Sonden in räumliche Nähe zueinander und treten in Wechselwirkung (d.h. sie hybridisieren direkt oder indirekt aneinander). Die Wechselwirkung zwischen den beiden Nukleinsäuredomänen führt zu einem Nukleinsäure-Duplex, der mindestens ein freies 3'-Ende aufweist (d.h. mindestens eine der Nukleinsäuredomänen innerhalb des Duplex hat ein 3'-Ende, das verlängert werden kann). Die Zugabe oder Aktivierung eines Nukleinsäurepolymerase-Enzyms in der Testmischung führt zur Verlängerung des mindestens einen freien 3'-Endes. Auf diese Weise wird mindestens eine der Nukleinsäuredomänen innerhalb des Duplexes verlängert, wobei ihre gepaarte Nukleinsäuredomäne als Vorlage dient. Das erhaltene Verlängerungsprodukt enthält ID-Sequenzen, die angeben, aus welchen beiden Sonden das Verlängerungsprodukt erzeugt wurde.
  • Die Nukleinsäuredomänen von Proximity-Sonden können einzel- oder teilweise doppelsträngig sein. Die Nukleinsäuredomänen können miteinander hybridisieren, und eine Domäne kann die Verlängerung der anderen Domäne vorgeben. Eine oder beide Domänen können verlängert sein. Wenn eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig ist, können einzelsträngige Abschnitte der Domänen miteinander hybridisieren. Die einzelsträngigen Abschnitte können sich also am 3'-Ende des Strangs befinden. Ist eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig, kann ein Strang an die Analytbindungsdomäne konjugiert werden, und der andere Strang kann an den konjugierten Strang hybridisiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann der einzelsträngige Teil einer teilweise doppelsträngigen Domäne Teil des Strangs sein, der mit dem konjugierten Strang hybridisiert ist. Wie weiter unten näher beschrieben wird, kann der hybridisierte Strang (im Gegensatz zum konjugierten Strang) einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne als „Splint-Strang“ oder Splint-Oligonukleotid betrachtet werden.
  • Version 1 von 1 zeigt einen „konventionellen“ Proximity-Extension-Assay, bei dem die Nukleinsäuredomäne (dargestellt als Pfeil) jeder Proximity-Sonde mit ihrem 5'-Ende an die Analyt-Bindungsdomäne (dargestellt als umgekehrtes „Y“) gebunden ist, wodurch zwei freie 3'-Enden verbleiben. Wenn die Proximity-Sonden an ihren jeweiligen Analyten binden (der Analyt ist in der Figur nicht dargestellt), können die Nukleinsäurebereiche der Sonden, die an ihren 3'-Enden komplementär sind, durch Hybridisierung interagieren, d.h. einen Duplex bilden. Durch Zugabe oder Aktivierung eines Nukleinsäurepolymerase-Enzyms in der Testmischung kann jede Nukleinsäuredomäne verlängert werden, wobei die Nukleinsäuredomäne der anderen Proximity-Sonde als Matrize verwendet wird, wodurch ein Verlängerungsprodukt entsteht.
  • Version 2 von 1 zeigt einen alternativen Proximity-Extension-Assay, bei dem die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde mit ihrem 5'-Ende an die Analyt-Bindungsdomäne gebunden ist und die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde mit ihrem 3'-Ende an die Analyt-Bindungsdomäne gebunden ist. Die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde hat daher ein freies 5'-Ende (dargestellt als stumpfer Pfeil), das mit einem typischen Nukleinsäurepolymerase-Enzym (das nur 3'-Enden verlängert) nicht verlängert werden kann. Das 3'-Ende der zweiten Proximity-Sonde ist effektiv „blockiert“, d.h. es ist nicht „frei“ und kann nicht verlängert werden, da es an die Analyt-Bindungsdomäne konjugiert und somit durch diese blockiert ist. Wenn die Proximity-Sonden an ihre jeweiligen analytenbindenden Ziele auf dem Analyten binden, können die Nukleinsäuredomänen der Sonden, die an ihren 3'-Enden eine Region der Komplementarität aufweisen, durch Hybridisierung interagieren, d.h. einen Duplex bilden. Im Gegensatz zu Version 1 kann jedoch nur die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde (die ein freies 3'-Ende hat) unter Verwendung der Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde als Matrize verlängert werden, wodurch ein Verlängerungsprodukt entsteht.
  • In Version 3 von 1 ist die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde wie in Version 2 mit ihrem 5'-Ende an die Analyt-Bindungsdomäne gebunden und die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde ist mit ihrem 3'-Ende an die Analyt-Bindungsdomäne gebunden. Die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde hat daher ein freies 5'-Ende (dargestellt als stumpfer Pfeil), das nicht verlängert werden kann. In dieser Ausführungsform haben die Nukleinsäuredomänen, die an die Analytbindungsdomänen der jeweiligen Proximity-Sonden gebunden sind, jedoch keine komplementären Bereiche und können daher nicht direkt einen Duplex bilden. Stattdessen wird ein drittes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine homologe Region mit der Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde aufweist. Dieses dritte Nukleinsäuremolekül fungiert als „molekulare Brücke“ oder „Splint“ zwischen den Nukleinsäuredomänen. Das Splint-Oligonukleotid überbrückt die Lücke zwischen den Nukleinsäuredomänen und ermöglicht es ihnen, indirekt miteinander zu interagieren, d.h. jede Nukleinsäuredomäne bildet einen Duplex mit dem Splint-Oligonukleotid.
  • Wenn also die Proximity-Sonden an ihre jeweiligen Analyt-Bindungsziele auf dem Analyt binden, interagieren die Nukleinsäurebereiche der Sonden jeweils durch Hybridisierung, d.h. sie bilden einen Duplex mit dem Splint-Oligonukleotid. Das dritte Nukleinsäuremolekül oder der Splint kann daher als der zweite Strang einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne angesehen werden, die auf einer der Proximity-Sonden vorgesehen ist. Beispielsweise kann eine der Proximity-Sonden mit einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne versehen sein, die über das 3'-Ende eines Strangs an die Analytbindungsdomäne gebunden ist und bei der der andere (nicht gebundene) Strang ein freies 3'-Ende aufweist. Eine solche Nukleinsäuredomäne hat also einen terminalen einzelsträngigen Bereich mit einem freien 3'-Ende. In dieser Ausführungsform kann die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde (die ein freies 3'-Ende hat) unter Verwendung des „Splint-Oligonukleotids“ (oder der einzelsträngigen 3'-terminalen Region der anderen Nukleinsäuredomäne) als Vorlage verlängert werden. Alternativ oder zusätzlich kann das freie 3'-Ende des Splint-Oligonukleotids (d.h. der ungebundene Strang oder die einzelsträngige 3'-Region) unter Verwendung der Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde als Matrize verlängert werden.
  • Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich ist, kann das Splint-Oligonukleotid in einer Ausführungsform als separater Bestandteil des Assays bereitgestellt werden. Mit anderen Worten, es kann dem Reaktionsgemisch getrennt zugesetzt werden (d.h. es kann der Probe, die die Analyten enthält, getrennt von den Proxysonden zugesetzt werden). Da er jedoch an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das Teil einer Proximity-Sonde ist, und dies bei Kontakt mit einem solchen Nukleinsäuremolekül tut, kann er dennoch als Strang einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne betrachtet werden, auch wenn er separat zugegeben wird. Alternativ kann der Splint auch an eine der Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden vorhybridisiert werden, d.h. vor dem Kontakt der Proximity-Sonde mit der Probe hybridisiert werden. In dieser Ausführungsform kann das Splint-Oligonukleotid direkt als Teil der Nukleinsäuredomäne der Proximity-Sonde gesehen werden, d.h. die Nukleinsäuredomäne ist ein teilweise doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, z.B. die Proximity-Sonde kann durch Binden eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls an eine Analyt-bindende Domäne (vorzugsweise ist die Nukleinsäuredomäne durch einen Einzelstrang an die Analyt-bindende Domäne konjugiert) und Modifizieren des Nukleinsäuremoleküls hergestellt werden, um eine teilweise doppelsträngige Nukleinsäuredomäne (mit einem einzelsträngigen Überhang, der mit der Nukleinsäuredomäne der anderen Proximity-Sonde hybridisieren kann) zu erzeugen.
  • Daher umfasst die Verlängerung der Nukleinsäuredomäne der hier definierten Proximity-Sonden auch die Verlängerung des „Splint“-Oligonukleotids. Wenn das Verlängerungsprodukt aus der Verlängerung des Splint-Oligonukleotids entsteht, ist der resultierende verlängerte Nukleinsäurestrang vorteilhafterweise nur durch die Wechselwirkung zwischen den beiden Strängen des Nukleinsäuremoleküls (durch Hybridisierung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen) an das Paar von Proximity-Sonden gekoppelt. Daher kann in diesen Ausführungsformen das Verlängerungsprodukt unter denaturierenden Bedingungen, z.B. durch Erhöhung der Temperatur, Verringerung der Salzkonzentration usw., von dem Paar von Proximity-Sonden getrennt werden.
  • Während das in Version 3 von 1 dargestellte Splint-Oligonukleotid als komplementär zur vollen Länge der Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde gezeigt wird, ist dies lediglich ein Beispiel, und es reicht aus, wenn der Splint in der Lage ist, einen Duplex mit den Enden (oder nahe den Enden) der Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden zu bilden, d.h. eine Brücke zwischen den Nukleinsäuredomänen der beiden Sonden zu bilden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Splint-Oligonukleotid als Nukleinsäuredomäne einer dritten Proximity-Sonde bereitgestellt werden, wie in der WO 2007/107743 beschrieben, die hier durch Verweis einbezogen ist und die zeigt, dass dies die Empfindlichkeit und Spezifität von Proximity-Sonden-Assays weiter verbessern kann.
  • Version 4 von 1 ist eine Modifikation von Version 1, bei der die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde an ihrem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die nicht vollständig komplementär zur Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde ist. Wenn die Proximity-Sonden an ihren jeweiligen Analyten binden, können die Nukleinsäuredomänen der Sonden durch Hybridisierung interagieren, d.h. einen Duplex bilden, aber das äußerste 3'-Ende der Nukleinsäuredomäne (der Teil des Nukleinsäuremoleküls, der die freie 3'-Hydroxylgruppe aufweist) der ersten Proximity-Sonde kann nicht mit der Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde hybridisieren und liegt daher als einzelsträngige, nicht hybridisierte „Klappe“ vor. Bei Zugabe oder Aktivierung eines Nukleinsäurepolymerase-Enzyms kann nur die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde unter Verwendung der Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde als Matrize verlängert werden. In dieser Ausführungsform ist also nur das 3'-Ende der Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde „frei“ - das 3'-Ende der Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde ist nicht „frei“, weil es nicht komplementär zur Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde ist und daher nicht mit ihr hybridisiert und nicht verlängert werden kann.
  • Die in 1 dargestellte Version 5 könnte als Abwandlung der Version 3 betrachtet werden. Im Gegensatz zu Version 3 sind jedoch die Nukleinsäuredomänen der beiden Proximity-Sonden mit ihren 5'-Enden an ihre jeweiligen Analyt-Bindungsdomänen gebunden. In dieser Ausführungsform sind die 3'-Enden der Nukleinsäuredomänen nicht komplementär, so dass die Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden nicht direkt interagieren oder einen Duplex bilden können. Stattdessen wird ein drittes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine homologe Region mit der Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde aufweist. Dieses dritte Nukleinsäuremolekül wirkt als „molekulare Brücke“ oder „Splint“ zwischen den Nukleinsäuredomänen. Dieses „Splint“-Oligonukleotid überbrückt die Lücke zwischen den Nukleinsäuredomänen und ermöglicht es ihnen, indirekt miteinander zu interagieren, d.h. jede Nukleinsäuredomäne bildet einen Duplex mit dem Splint-Oligonukleotid. Wenn also die Proximity-Sonden an ihren jeweiligen Analyten binden, interagieren die Nukleinsäuredomänen der Sonden jeweils durch Hybridisierung, d.h. sie bilden einen Duplex mit dem Splint-Oligonukleotid.
  • Gemäß Version 3 kann also das dritte Nukleinsäuremolekül oder die dritte Schiene als der zweite Strang einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne angesehen werden, die auf einer der Proximity-Sonden vorgesehen ist. In einem bevorzugten Beispiel kann eine der Proximity-Sonden mit einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne versehen sein, die über das 5'-Ende eines Strangs an die Analytbindungsdomäne gebunden ist und bei der der andere (nicht gebundene) Strang ein freies 3'-Ende aufweist. Somit hat eine solche Nukleinsäuredomäne einen terminalen einzelsträngigen Bereich mit mindestens einem freien 3'-Ende. In dieser Ausführungsform kann die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde (die ein freies 3'-Ende hat) unter Verwendung des „Splint-Oligonukleotids“ als Vorlage verlängert werden. Alternativ oder zusätzlich kann das freie 3'-Ende des Splint-Oligonukleotids (d.h. der ungebundene Strang oder der 3'-einsträngige Bereich der ersten Proximity-Sonde) unter Verwendung der Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde als Matrize verlängert werden.
  • Wie oben im Zusammenhang mit Version 3 erläutert, kann das Splint-Oligonukleotid als separater Bestandteil des Assays bereitgestellt werden. Da es jedoch an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das Teil einer Proximity-Sonde ist, und dies bei Kontakt mit einem solchen Nukleinsäuremolekül tut, kann es als ein Strang einer teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne angesehen werden, auch wenn es separat hinzugefügt wird. Alternativ kann der Splint auch an eine der Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden vorhybridisiert werden, d.h. vor dem Kontakt der Proximity-Sonde mit der Probe hybridisiert werden. In dieser Ausführungsform kann das Splint-Oligonukleotid direkt als Teil der Nukleinsäuredomäne der Proximity-Sonde gesehen werden, d.h. die Nukleinsäuredomäne ist ein teilweise doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, z.B. die Proximity-Sonde kann durch Binden eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls an eine Analyt-bindende Domäne (vorzugsweise ist die Nukleinsäuredomäne durch einen Einzelstrang an die Analyt-bindende Domäne konjugiert) und Modifizieren des Nukleinsäuremoleküls hergestellt werden, um eine teilweise doppelsträngige Nukleinsäuredomäne (mit einem einzelsträngigen Überhang, der mit der Nukleinsäuredomäne der anderen Proximity-Sonde hybridisieren kann) zu erzeugen.
  • Daher umfasst die Verlängerung der Nukleinsäuredomäne der hier definierten Proximity-Sonden auch die Verlängerung des „Splint“-Oligonukleotids. Wenn das Verlängerungsprodukt aus der Verlängerung des Splint-Oligonukleotids entsteht, ist der resultierende verlängerte Nukleinsäurestrang vorteilhafterweise nur durch die Wechselwirkung zwischen den beiden Strängen des Nukleinsäuremoleküls (durch Hybridisierung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen) an das Paar von Proximity-Sonden gekoppelt. Daher kann in diesen Ausführungsformen das Verlängerungsprodukt unter denaturierenden Bedingungen, z.B. durch Erhöhung der Temperatur, Verringerung der Salzkonzentration usw., von dem Paar von Proximity-Sonden getrennt werden.
  • Während das in Version 5 von 1 dargestellte Splint-Oligonukleotid als komplementär zur vollen Länge der Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde dargestellt ist, handelt es sich hierbei lediglich um ein Beispiel, und es reicht aus, wenn der Splint in der Lage ist, einen Duplex mit den Enden (oder nahe den Enden) der Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden zu bilden, d.h. eine Brücke zwischen den Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden zu bilden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Splint-Oligonukleotid als Nukleinsäuredomäne einer dritten Proximity-Sonde bereitgestellt werden, wie in der WO 2007/107743 beschrieben, die hier durch Verweis einbezogen ist und die zeigt, dass dies die Empfindlichkeit und Spezifität von Proximity-Sonden-Assays weiter verbessern kann.
  • Die in 1 dargestellte Version 6 ist die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie dargestellt, sind beide Sonden eines Paares an teilweise einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle konjugiert. Bei jeder Sonde ist ein kurzer Nukleinsäurestrang über sein 5'-Ende mit der Analyt-Bindungsdomäne konjugiert. Die kurzen Nukleinsäurestränge, die mit den Analyt-Bindungsdomänen konjugiert sind, hybridisieren nicht miteinander. Vielmehr hybridisiert jeder kurze Nukleinsäurestrang mit einem längeren Nukleinsäurestrang, der an seinem 3'-Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist (d.h. das 3'-Ende des längeren Nukleinsäurestrangs ragt über das 5'-Ende des mit der Analyt-Bindungsdomäne konjugierten kürzeren Strangs hinaus). Die Überhänge der beiden längeren Nukleinsäurestränge hybridisieren aneinander und bilden einen Duplex. Die längeren Nukleinsäurestränge, die aneinander hybridisieren, werden hier als „Hybridisierungsoligonukleotide“ bezeichnet. Hybridisieren die 3'-Enden der beiden längeren Nukleinsäuremoleküle, wie dargestellt, vollständig miteinander, so weist der Duplex zwei freie 3'-Enden auf, wobei die 3'-Enden der längeren Nukleinsäuremoleküle wie in Variante 4 so gestaltet sein können, dass das äußerste 3'-Ende eines der längeren Nukleinsäuremoleküle nicht komplementär zum anderen ist und einen Flap bildet, so dass der Duplex nur ein freies 3'-Ende enthält.
  • Wenn das Verfahren unter Verwendung eins PEA durchgeführt wird, ist also in einigen Ausführungsformen in jedem Paar von Proximity-Sonden mindestens eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig. Es kann sein, dass in jedem Paar von Proximity-Sonden eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig ist (wie in den Versionen 3 und 5). Vorzugsweise sind in jedem Paar von Proximity-Sonden beide Nukleinsäuredomänen teilweise doppelsträngig, wie in Version 6.
  • Wie in Bezug auf Version 6 beschrieben, ist es bevorzugt, dass die teilweise doppelsträngige Nukleinsäuredomäne aufweist:
    • (i) ein erstes Oligonukleotid, das mit der Analyt-Bindungsdomäne konjugiert ist; und
    • (ii) ein Hybridisierungsoligonukleotid, aufweisend die erste Hybridisierungssequenz, die ID-Sequenz und eine zweite Hybridisierungssequenz, wobei sich die erste Hybridisierungssequenz am 3'-Ende des Hybridisierungsoligonukleotids befindet;
    wobei der doppelsträngige Teil der Nukleinsäuredomäne einen Duplex zwischen der zweiten Hybridisierungssequenz des Hybridisierungsoligonukleotids und dem ersten Oligonukleotid aufweist, und der einzelsträngige Teil der Nukleinsäuredomäne die erste Hybridisierungssequenz des Hybridisierungsoligonukleotids aufweist.
  • In einer besonderen Ausführungsform weist das Hybridisierungsoligonukleotid von 5' nach 3' die zweite Hybridisierungssequenz, die ID-Sequenz (vorzugsweise die Barcode-Sequenz) und die erste Hybridisierungssequenz auf, und die ID-Sequenz (vorzugsweise die Barcode-Sequenz) befindet sich im einzelsträngigen Teil der Nukleinsäuredomäne.
  • Es kann sein, dass alle Proximity-Sonden das gleiche erste Oligonukleotid und die gleiche zweite Hybridisierungssequenz (innerhalb des Hybridisierungsoligonukleotids) enthalten. Mit anderen Worten, alle Proximity-Sonden können ein einheitliches erstes Oligonukleotid und eine einheitliche zweite Hybridisierungssequenz aufweisen. Dies kann zu einem einfacheren Herstellungsverfahren für die Sonden führen.
  • Wie oben beschrieben, sind das erste Oligonukleotid und die zweite Hybridisierungssequenz komplementär zueinander, so dass die beiden Sequenzen aneinander hybridisieren können. In einer besonderen Ausführungsform ist die zweite Hybridisierungsstelle komplementär zur Gesamtheit des ersten Oligonukleotids, so dass der zwischen ihnen gebildete Duplex das gesamte erste Oligonukleotid aufweist. Dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, und es kann sein, dass die zweite Hybridisierungsstelle nur zu einem Teil des ersten Oligonukleotids komplementär ist, so dass der zwischen ihnen gebildete Duplex nur einen Teil des ersten Oligonukleotids aufweist. Wie bereits erwähnt, befindet sich die erste Hybridisierungssequenz am 3'-Ende des Hybridisierungsoligonukleotids, so dass, wenn zwei Sonden mit komplementären ersten Hybridisierungssequenzen in die Nähe kommen, die 3'-Enden ihrer Hybridisierungsoligonukleotide aneinander hybridisieren. Mit „am 3'-Ende gelegen“ kann gemeint sein, dass sich die erste Hybridisierungssequenz bis zum 3'-Terminus jedes Hybridisierungsoligonukleotids erstreckt, d.h. die ersten Hybridisierungssequenzen können das 3'-Nukleotid jedes Hybridisierungsoligonukleotids aufweisen. Dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, und die erste Hybridisierungssequenz kann sich alternativ auch nur bis zum 3'-Terminus eines Hybridisierungsoligonukleotids in jedem Paar von Sonden erstrecken. Die in der obigen PEA-Version 6 verwendeten Nukleinsäuredomänen können daher in der gleichen Weise wie die der Version 4 entworfen werden, so dass eines der Hybridisierungsoligonukleotide in jedem Paar von Sonden an seinem 3'-Ende eine Sequenz enthält, die nicht vollständig komplementär zum Hybridisierungsoligonukleotid der anderen Proximity-Sonde ist und somit einen einzelsträngigen, nicht hybridisierten „Flap“ bildet.
  • So wird nach der Hybridisierung zweier Nukleinsäuredomänen aneinander mindestens ein Hybridisierungsoligonukleotid verlängert, um das Verlängerungsprodukt zu erzeugen (mit anderen Worten, ein oder beide Hybridisierungsoligonukleotide werden verlängert, um das Verlängerungsprodukt zu erzeugen). Wenn sich die ersten Hybridisierungssequenzen bis zu den 3'-Termini beider Hybridisierungsoligonukleotide in jedem Paar von Sonden erstrecken, kann es sein, dass beide Hybridisierungsoligonukleotide zur Erzeugung des Verlängerungsprodukts verlängert werden. Enthält dagegen eines der Hybridisierungsoligonukleotide einen nicht hybridisierten Flap an seinem 3'-Ende (wie oben beschrieben), wird nur eines der Hybridisierungsoligonukleotide verlängert, um das Verlängerungsprodukt zu erzeugen (d.h. das Hybridisierungsoligonukleotid ohne den Flap).
  • Wenn es sich bei dem durchgeführten Multiplex-Assay um einen PEA handelt, wird die Verlängerungsreaktion vorzugsweise im Zusammenhang mit einer PCR-Amplifikation durchgeführt, d.h. es wird eine einzige Reaktion einschließlich einer PCR-Amplifikation durchgeführt, um sowohl die Verlängerung der Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonde und damit die Erzeugung des Reporternukleinsäuremoleküls als auch die Amplifikation des erzeugten Reporternukleinsäuremoleküls zu erreichen. In dieser Ausführungsform beginnt die Reaktion nicht mit einem Denaturierungsschritt (wie dies normalerweise bei der PCR der Fall ist), sondern mit einem Verlängerungsschritt, in dem das Reporternukleinsäuremolekül erzeugt wird. Danach wird eine Standard-PCR durchgeführt, um das Reporternukleinsäuremolekül zu amplifizieren, wobei mit der Denaturierung des Reportermoleküls begonnen wird. Wie oben beschrieben, wird die PCR vorzugsweise mit gemeinsamen Primern durchgeführt, die an gemeinsame Sequenzen an den Enden des Reporternukleinsäuremoleküls binden. Wie weiter unten beschrieben, kann einer der Primer oder beide Primer auch einen Sequenzierungsadapter enthalten. Mit anderen Worten, die Verlängerungs- und Amplifikationsschritte des Verfahrens können in einer einzigen Reaktion durchgeführt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der zum Nachweis der Analyten in der Probe verwendete Multiplex-Assay ein PLA. Der verwendete PLA kann ein „Standard“-PLA sein. Damit ist ein PLA gemeint, bei dem ein einzelnes Splint-Oligonukleotid verwendet wird, um die Nukleinsäurebereiche von zwei Proximity-Sonden zu verbinden. Bei einem Standard-PLA weisen die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden gepaarte Hybridisierungssequenzen auf, die an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, um den Duplex zu bilden. Die Nukleinsäuredomänen des Paars von Proximity-Sonden sind mit ihren jeweiligen Sonden konjugiert, so dass in jedem Paar eine Proximity-Sonde eine Nukleinsäuredomäne mit einem freien 3'-Ende und die andere eine Nukleinsäuredomäne mit einem freien 5'-Ende hat, so dass die freien Enden der Nukleinsäuredomänen der beiden Sonden miteinander ligiert werden können. Das Splint-Oligonukleotid kann an seinem 3'-Ende einen Verlängerungsblocker enthalten, so dass es nicht verlängert werden kann. Nach der Duplexbildung werden die Nukleinsäuredomänen der beiden Proximity-Sonden direkt oder indirekt aneinander ligiert, um ein Ligationsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist.
  • Wenn es sich bei dem Multiplex-Assay um einen PLA handelt, ist es vorzuziehen, dass die Nukleinsäuredomänen des Paars von Proximity-Sonden so an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, dass eine Unterbrechung im Duplex zwischen den beiden Nukleinsäuredomänen, aber keine Lücke vorhanden ist. Mit anderen Worten: Der 3'-Terminus der einen Nukleinsäuredomäne kann an das Nukleotid des Splints hybridisieren, das direkt an das Nukleotid des Splints angrenzt, an das der 5'-Terminus der anderen Nukleinsäuredomäne hybridisiert. Dies ermöglicht eine direkte Ligation der beiden Nukleinsäuredomänen aneinander.
  • Alternativ können die Nukleinsäuredomänen des Paars von Proximity-Sonden so an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, dass eine Lücke zwischen dem 3'-Terminus der einen Nukleinsäuredomäne und dem 5'-Terminus der anderen Nukleinsäuredomäne entsteht. In dieser Ausführungsform umfasst der zwischen dem Splint-Oligonukleotid und den beiden Sonden-Nukleinsäuredomänen gebildete Duplex eine Länge der einzelsträngigen Nukleinsäure des Splint-Oligonukleotids, die die beiden Teile des Duplex trennt. Die einzelsträngige Lücke kann eine beliebige Anzahl von Nukleotiden lang sein. In dieser Ausführungsform wird eine Verlängerungsreaktion zum Füllen der Lücke zwischen den Enden der beiden Sonden-Nukleinsäuredomänen durchgeführt (d.h. die Sonden-Nukleinsäuredomäne mit dem freien 3'-Ende wird verlängert, um die Lücke zu füllen). Nach dem Auffüllen der Lücke werden die Nukleinsäuredomänen der beiden Splint-Oligonukleotide mit Hilfe eines Ligaseenzyms miteinander ligiert. Die Ligation der Nukleinsäuredomänen aneinander nach dem Lückenfüllen wird hier als „indirekte Ligation“ der Nukleinsäuredomänen aneinander bezeichnet.
  • Die lückenfüllende Verlängerungsreaktion wird mit einem Polymeraseenzym durchgeführt, dem die Strangverdrängungsaktivität fehlt, so dass die Verlängerung endet, wenn die Lücke gefüllt ist, anstatt die hybridisierte Nukleinsäuredomäne stromabwärts vom freien 3'-Ende zu verdrängen. Zu den nicht-verdrängenden Polymerasen gehört die T4-DNA-Polymerase. Andere derartige Polymerasen sind auf dem Gebiet der Technik bekannt.
  • Nach der Ligation wird das Ligationsprodukt wie oben beschrieben amplifiziert (z.B. durch PCR) und nachgewiesen. Diese PLA-Varianten ergeben ein lineares Ligationsprodukt (oder Verlängerungs- und Ligationsprodukt). Es ist bevorzugt, dass ein Ligationsprodukt oder ein Verlängerungs- und Ligationsprodukt, das nach dem Verfahren erzeugt wird, linear ist.
  • Alternativ kann die PLA auch als Rolling Circle Amplification PLA (PLA-RCA) verwendet werden. Bei diesem PLA-Format werden zwei Splint-Oligonukleotide verwendet, die aneinander ligiert werden, um ein Ligationsprodukt zu erzeugen. PLA-RCA wird z.B. in Söderberg et al. beschrieben, Nature Methods 3(12): 995-1000 (2006). In dieser Ausführungsform weisen die Proximity-Sonden Nukleinsäuredomänen mit jeweils zwei Hybridisierungssequenzen auf. Die erste Hybridisierungssequenz ist komplementär zu einer Hybridisierungssequenz auf einem ersten Splint-Oligonukleotid, und die zweite Hybridisierungssequenz ist komplementär zu einer Hybridisierungssequenz auf einem zweiten Splint-Oligonukleotid. Die ersten Hybridisierungssequenzen sind, wie oben beschrieben, gepaart, so dass eine Reihe von Paaren von Proximity-Sonden dasselbe Paar erster Hybridisierungssequenzen verwenden. Diese hybridisieren mit einem bestimmten ersten Splint-Oligonukleotid, wie oben beschrieben. Die zweiten Hybridisierungssequenzen können ebenfalls gepaart sein, vorzugsweise handelt es sich jedoch um universelle Stellen, die von allen Proximity-Sonden-Nukleinsäuredomänen im Multiplex-Assay gemeinsam genutzt werden, so dass nur ein einziges zweites Splint-Oligonukleotid für alle Paare von Proximity-Sonden erforderlich ist.
  • Bei PLA-RCA befinden sich die ID-Sequenzen (vorzugsweise Barcode-Sequenzen) der Sonden-Nukleinsäuredomänen zwischen der ersten und zweiten Hybridisierungsstelle. Nach der Bindung der beiden Splint-Oligonukleotide an die Sonden-Nukleinsäuredomänen wird, wie oben beschrieben, eine lückenfüllende Verlängerungsreaktion durchgeführt. Die beiden Splint-Oligonukleotide werden dann aneinander ligiert, um ein zirkuläres Molekül zu bilden, das durch Rolling-Circle-Amplifikation amplifiziert und nachgewiesen wird.
  • Wie bereits erwähnt, wird die Reporternukleinsäure vorzugsweise durch massiv-parallele DNA-Sequenzierung nachgewiesen, was im Allgemeinen den Zusatz von Sequenzierungsadaptern zu dem zu sequenzierenden DNA-Molekül erfordert. Wie oben beschrieben, dienen Sequenzierungsadapter dazu, das DNA-Molekül auf einer Oberfläche zu immobilisieren.
  • Das Verfahren kann daher die Hinzufügung eines oder mehrerer Adapter für die Sequenzierung (Sequenzierungsadapter) zu den Reporternukleinsäuren aufweisen.
  • Bei den Sequenzierungsadaptern handelt es sich in der Regel um Nukleinsäuremoleküle (insbesondere DNA-Moleküle). In diesem Fall werden kurze Oligonukleotide, die zu den Adaptersequenzen komplementär sind, an die Immobilisierungsoberfläche (z.B. die Oberfläche eines Beads oder einer Fließzelle) konjugiert, um die Anlagerung der Ziel-DNA-Moleküle an die Oberfläche über die Adaptersequenzen zu ermöglichen. Alternativ kann auch jedes andere Paar von Bindungspartnern verwendet werden, um das Ziel-DNA-Molekül an die Immobilisierungsoberfläche zu konjugieren, z.B. Biotin und Avidin/Streptavidin. In diesem Fall kann Biotin als Sequenzierungsadapter verwendet werden, und Avidin oder Streptavidin werden an die Immobilisierungsoberfläche konjugiert, um den Biotin-Sequenzierungsadapter zu binden, oder umgekehrt.
  • Bei Sequenzierungsadaptern kann es sich also um kurze Oligonukleotide (vorzugsweise DNA) handeln, die im Allgemeinen 10-30 Nukleotide lang sind (z.B. 15-25 oder 20-25 Nukleotide). Wie oben ausgeführt, besteht der Zweck eines Sequenzierungsadapters darin, die Anlagerung der Ziel-DNA-Moleküle an eine Immobilisierungsoberfläche zu ermöglichen, und dementsprechend wird die Nukleotidsequenz eines Nukleinsäureadapters durch die Sequenz seines an die Immobilisierungsoberfläche konjugierten Bindungspartners bestimmt. Abgesehen davon ist die Nukleotidsequenz eines Nukleinsäure-Sequenzierungsadapters nicht besonders festgelegt.
  • Ein Sequenzierungsadapter kann während der PCR-Amplifikation zu einer Reporternukleinsäure hinzugefügt werden. Im Falle eines Nukleinsäure-Sequenzierungsadapters kann dies durch die Aufnahme eines Sequenzierungsadapter-Nukleotids in einen oder beide Primer erreicht werden. Handelt es sich bei dem Sequenzierungsadapter um einen Nicht-Nukleinsäure-Sequenzierungsadapter (z.B. ein Protein/Peptid oder ein kleines Molekül), kann ein Adapter auch mit einem oder beiden PCR-Primern konjugiert werden. Alternativ kann ein Sequenzierungsadapter an ein Reporternukleinsäuremolekül gebunden werden, indem der Sequenzierungsadapter direkt an das Reporternukleinsäuremolekül ligiert oder konjugiert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem einen oder den mehreren Sequenzierungsadaptern, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäure-Sequenzierungsadapter.
  • Ein oder mehrere Nukleinsäure-Sequenzierungsadapter können daher in einem oder mehreren Ligations- und/oder Amplifikationsschritten an die Reporternukleinsäure angefügt werden. Wenn also beispielsweise zwei Sequenzierungsadapter an das Reporternukleinsäuremolekül angefügt werden (einer an jedem Ende), können diese in einem einzigen Schritt (z.B. durch PCR-Amplifikation mit einem Primerpaar, das beide einen Sequenzierungsadapter enthält) oder in zwei Schritten hinzugefügt werden. Die beiden Schritte können mit denselben oder unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden, z.B. kann ein erster Sequenzierungsadapter durch Ligation und der zweite durch PCR-Amplifikation an das Reporternukleinsäuremolekül angefügt werden, oder umgekehrt; oder es kann eine erste Amplifikationsreaktion durchgeführt werden, um einen ersten Sequenzierungsadapter an das Reporternukleinsäuremolekül anzuhängen, gefolgt von einer zweiten Amplifikationsreaktion, um einen zweiten Sequenzierungsadapter an das Reporternukleinsäuremolekül anzuhängen.
  • Wie bereits erwähnt, können ein oder mehrere Sequenzierungsadapter an das Reporternukleinsäuremolekül angefügt werden. Damit sind ein oder zwei Sequenzierungsadapter gemeint - da Sequenzierungsadapter an die Enden eines DNA-Moleküls angefügt werden, können maximal zwei Sequenzierungsadapter an ein einzelnes DNA-Molekül (z.B. Reporternukleinsäure) angefügt werden. So kann ein einzelner Sequenzierungsadapter an ein Ende eines Reporternukleinsäuremoleküls angefügt werden, oder es können zwei Sequenzierungsadapter an ein Reporternukleinsäuremolekül angefügt werden, einer an jedes Ende. In einer besonderen Ausführungsform werden die Illumina-Adapter P5 und P7 verwendet, d.h. der P5-Adapter wird an ein Ende des Reporternukleinsäuremoleküls und der P7-Adapter an das andere Ende angefügt. Die Sequenz des P5-Adapters ist in SEQ ID NO: 1 (AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA) und die Sequenz des P7-Adapters ist in SEQ ID NO: 2 (CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT) angegeben.
  • Die PCR-Amplifikation kann daher mit dem Zusatz eines oder mehrerer Sequenzierungsadapter zum Reporternukleinsäuremolekül kombiniert werden. Dies kann durch Amplifikation des Reporternukleinsäuremoleküls unter Verwendung eines Primerpaars, das mindestens einen Sequenzierungsadapter aufweist, erreicht werden. In diesem Fall weist mindestens ein Primer in dem Primerpaar einen Sequenzierungsadapter stromaufwärts der Sequenz auf, die das Reporternukleinsäuremolekül bindet. Der Sequenzierungsadapter befindet sich also im Allgemeinen am 5'-Ende jedes Primers, in dem er enthalten ist.
  • In einer bestimmten Ausführungsform wird ein Amplifikationsschritt unter Verwendung eines Primerpaars durchgeführt, das einen Primer aufweist, der einen Sequenzierungsadapter enthält, so dass ein einzelner Sequenzierungsadapter an ein Ende des Reporternukleinsäuremoleküls angefügt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Amplifikationsschritt unter Verwendung eines Primerpaars durchgeführt, bei dem beide Primer einen Sequenzierungsadapter aufweisen, so dass in einem einzigen Amplifikationsschritt ein Sequenzierungsadapter an jedes Ende des Reporternukleinsäuremoleküls angefügt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform werden zwei getrennte Amplifikationsreaktionen durchgeführt, um einen Sequenzierungsadapter an jedes Ende des Reporternukleinsäuremoleküls anzuhängen, wobei jeder Amplifikationsschritt einen anderen Sequenzierungsadapter an ein anderes Ende des Moleküls anhängt.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein erster Amplifikationsschritt mit Primern durchgeführt, die keine Sequenzierungsadapter enthalten. Die amplifizierten Reporternukleinsäuremoleküle werden dann einer oder mehreren weiteren Amplifikationsreaktionen unterzogen, um Sequenzierungsadapter an jedes Ende des Moleküls anzuhängen, wie oben beschrieben.
  • Vorzugsweise wird die Reporternukleinsäure (d.h. das Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt) in zwei PCR-Schritten amplifiziert. In der ersten PCR-Reaktion wird ein erster Sequenzierungsadapter an ein Ende des Verlängerungs- oder Ligationsprodukts angefügt. Das Produkt der ersten PCR-Reaktion wird dann in einer zweiten PCR-Reaktion amplifiziert, in der ein zweiter Sequenzierungsadapter an das andere Ende der Reporternukleinsäure angefügt wird. In einer besonderen Ausführungsform wird die erste PCR-Reaktion mit einer Nukleinsäurepolymerase durchgeführt, die auch 3'-5'-Exonukleaseaktivität besitzt, und die zweite PCR-Reaktion wird mit einer Nukleinsäurepolymerase durchgeführt, der die 3'-5'-Exonukleaseaktivität fehlt, wie in WO 2012/104261 beschrieben. Geeignete Nukleinsäurepolymerasen mit 3'-5'-Exonukleaseaktivität sind die T4-DNA-Polymerase, die T7-DNA-Polymerase, die Phi29 (Φ29)-DNA-Polymerase, die DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die Pyrococcus furiosus (Pfu)-DNA-Polymerase und die Pyrococcus woesei (Pwo)-DNA-Polymerase. Geeignete Nukleinsäurepolymerasen, denen die 3'-5'-Exonukleaseaktivität fehlt, sind die α-Untereinheit der DNA-Polymerase III, das Klenow-Exo(-)-Fragment der DNA-Polymerase I, die Taq-Polymerase, die DNA-Polymerase von Pfu (exo-) und die DNA-Polymerase von Pwo (exo-).
  • In einer anderen Ausführungsform kann für beide PCR-Schritte dieselbe Polymerase verwendet werden, z.B. die Pwo- oder Pfu-Polymerase.
  • Das Verfahren kann zur gleichzeitigen Untersuchung mehrerer Proben verwendet werden. In diesem Fall werden für jede Probe separate Multiplex-Assays wie oben beschrieben durchgeführt. Sobald das Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt erzeugt wurde, wird eine Probenindexsequenz hinzugefügt. Ein Probenindex ist eine Nukleotidsequenz, die die Ausgangsprobe identifiziert, von der ein Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt abgeleitet ist. Daher wird für Verlängerungs-/Ligationsprodukte, die von jeder verschiedenen Probe stammen, eine andere Nukleotidsequenz als Probenindexsequenz verwendet. Umgekehrt werden alle Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukte aus einer bestimmten Probe mit der gleichen Probenindexsequenz gekennzeichnet.
  • Sobald alle Produkte mit einem Probenindex gekennzeichnet sind, können die Produkte mehrerer Proben gepoolt und gemeinsam analysiert werden. Bei der Sequenzierung der Reporternukleinsäuren gibt der Probenindex an, aus welcher Probe jedes einzelne Reporternukleinsäuremolekül stammt. Als Probenindex kann eine beliebige Nukleotidsequenz verwendet werden. Die Probenindexsequenzen können eine beliebige Länge haben, sind aber vorzugsweise relativ kurz, z.B. 3-12, 4-10 oder 4-8 Nukleotide.
  • Die Probenindexsequenz kann den Verlängerungs-/Ligationsprodukten durch jedes geeignete Verfahren hinzugefügt werden, z.B. kann der Probenindex in einer Amplifikationsreaktion (z.B. durch PCR) oder in einer Ligationsreaktion hinzugefügt werden. Insbesondere wenn die Reporternukleinsäuremoleküle durch massiv-parallele DNA-Sequenzierung analysiert werden sollen und Sequenzierungsadapter an beiden Enden erforderlich sind, kann die Probenindexsequenz nicht so hinzugefügt werden, dass sie sich letztlich an einem Ende der Reporternukleinsäuremoleküle befindet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Probenindexsequenzen während der PCR-Amplifikation zu den Verlängerungs-/Ligationsprodukten hinzugefügt. Wie oben erwähnt, können Sequenzierungsadapter auch während der PCR-Amplifikation zu den Verlängerungs-/Ligationsprodukten hinzugefügt werden. In einer besonderen Ausführungsform kann ein spezieller Amplifikationsschritt ausschließlich dazu dienen, den Probenindex an das Reporternukleinsäuremolekül anzuhängen. In einer anderen Ausführungsform kann der Probenindex während der PCR-Amplifikation gleichzeitig mit einem oder mehreren Sequenzierungsadaptern hinzugefügt werden. Wenn beispielsweise eine einzige PCR-Amplifikation durchgeführt wird, um Sequenzierungsadapter an beide Enden der Reporternukleinsäuremoleküle anzuhängen, kann gleichzeitig ein Probenindex hinzugefügt werden. Werden Sequenzierungsadapter in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationen an jedes Ende des Reporternukleinsäuremoleküls angefügt, kann ein Probenindex während einer der beiden PCR-Amplifikationen hinzugefügt werden. Der Probenindex kann während der ersten PCR-Amplifikation hinzugefügt werden. In diesem Fall kann er der Reporternukleinsäure am gleichen Ende hinzugefügt werden, an dem der Sequenzierungsadapter hinzugefügt wird (intern zum Sequenzierungsadapter) oder am entgegengesetzten Ende. Alternativ kann der Probenindex während der zweiten PCR-Amplifikation hinzugefügt werden; in diesem Fall muss er der Reporternukleinsäure am selben Ende hinzugefügt werden, an dem der Sequenzierungsadapter hinzugefügt wird (intern zum Sequenzierungsadapter). Alternativ kann auch ein Ligationsschritt durchgeführt werden, um den Probenindex vor der Amplifikation an das Ende jedes Reporternukleinsäuremoleküls zu hängen.
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Produkt, das verwendet werden kann, um das oben erläuterte Verfahren durchzuführen. Insbesondere, wie oben dargelegt, weist das Produkt auf:
    • (i) eine Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist:
      1. (a) eine Proteinbindungsdomäne, die für ein Protein spezifisch ist, und
      2. (b) eine Nukleinsäuredomäne,
      wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Proteinbindungsdomänen aufweisen, die für dasselbe Protein spezifisch sind und gleichzeitig an das Protein binden können; und jedes Paar von Sonden für ein anderes Protein spezifisch ist; wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenz jeder Proximity-Sonde unterschiedlich ist; und wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen; und, optional
    • (ii) eine Anzahl von Splint-Oligonukleotiden, wobei jedes Splint-Oligonukleotid Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen eines Paars von Proximity-Sonden komplementär sind; wobei die Hybridisierungssequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass nach Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihr Protein die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden miteinander oder mit einem Splint-Oligonukleotid hybridisieren; und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird.
  • Die verschiedenen Merkmale dieses Produkts sind die gleichen wie die entsprechenden Merkmale des Verfahrens (z.B. die Proximity-Sonden, ID-Sequenzen, Splint-Oligonukleotide, Hybridisierungssequenzen usw.). Insbesondere weisen in diesem Produkt beide Sonden in jedem Paar von Sonden Proteinbindungsdomänen auf, die für dasselbe Protein spezifisch sind. Mit anderen Worten: In jedem Paar von Sonden des Produkts binden beide Sonden das gleiche Protein. Wie oben beschrieben, binden die beiden Sonden in jedem Paar von Sonden ihr Zielprotein an unterschiedlichen Epitopen, so dass sie die Bindung des jeweils anderen an das Zielprotein nicht beeinträchtigen. Die erfindungsgemäßen Sonden können für die Verwendung in jeder Art oder Variante von PEA oder PLA, wie oben beschrieben, konzipiert werden.
  • In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Produkt außerdem eine oder mehrere Hintergrundsonden (oder inerte Sonden) auf, die keinen Analyten binden, wie oben beschrieben.
  • Wie bei dem Verfahren ist es bevorzugt, dass ein erheblicher Anteil der Paare von Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilt. In besonderen Ausführungsformen teilen sich mindestens 25 %, 50 % oder 75 % der Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden (d.h. mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden), wie in dem Verfahren. In einer besonderen Ausführungsform teilen sich alle Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen mit mindestens einem anderen Paar von Proximity-Sonden. Wie jedoch aus den obigen Ausführungen ersichtlich ist, ist in einer anderen Ausführungsform mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen für ein einzelnes Paar von Proximity-Sonden einzigartig. Das heißt, dass mindestens ein Paar von Proximity-Sonden seine Hybridisierungssequenzen mit keinem anderen Paar von Proximity-Sonden teilt. In bestimmten Ausführungsformen teilen bis zu 75 %, 50 % oder 25 % der Paare von Proximity-Sonden ihre Hybridisierungssequenzen nicht mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden. Wie bei dem Verfahren teilen sich in bestimmten Ausführungsformen nicht mehr als 20, 15, 10 oder 5 Paare von Proximity-Sonden im Produkt das gleiche Paar von Hybridisierungssequenzen.
  • Das erfindungsgemäße Produkt kann als eine einzige Zusammensetzung bereitgestellt werden, die alle Proximity-Sonden (und, falls vorhanden, Splint-Oligonukleotide und/oder inerte Sonden) enthält. Alternativ können alle Bestandteile des Produkts in separaten Behältern bereitgestellt werden. So können beispielsweise die Paare von Proximity-Sonden, die Splint-Oligonukleotide und die inerten Sonden alle in separaten Behältern bereitgestellt werden. Falls gewünscht, kann jedes Paar von Sonden oder sogar jede einzelne Proximity-Sonde in einem separaten Behälter bereitgestellt werden, ebenso wie jedes unterschiedliche Splint-Oligonukleotid und jede unterschiedliche inerte Sonde.
  • Das Produkt kann darüber hinaus zusätzliche Komponenten enthalten. So kann das Produkt beispielsweise ein oder mehrere Nukleinsäurepolymeraseenzyme zur Verwendung in den Verlängerungs- und/oder Amplifikationsschritten und/oder ein Ligaseenzym enthalten, wenn ein Ligationsschritt erforderlich ist. Das Produkt kann Primer zur Verwendung bei der Amplifikation enthalten. Wie oben ausgeführt, können die in den Amplifikationsschritten verwendeten Primer Sequenzadapter für die Nukleinsäuresequenzierung und/oder Probenindexsequenzen aufweisen. Das Produkt kann auch Nukleotide (z.B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) für die Verwendung in den Verlängerungs-/Amplifikationsreaktionen enthalten. Das Produkt kann eine feste Basis aufweisen, an der die Reporternukleinsäuren für die Sequenzierung immobilisiert werden können, z.B. eine Fließzelle oder ein Bead.
  • Die Erfindung und ein nicht erfindungsgemäßes Verfahren werden weiter beschrieben, und entsprechende Klauseln sind nachfolgend aufgeführt:
    1. 1. Verfahren zum Nachweis einer Anzahl von Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren die Durchführung eines Multiplex-Nachweisassays auf Proximity-Basis aufweist, wobei der Assay Folgendes aufweist:
      • (i) Inkontaktbringen der Probe mit einer Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist:
        1. (a) eine für einen Analyten spezifische Analyt-Bindungsdomäne; und
        2. (b) eine Nukleinsäuredomäne,
        wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Analyt-bindende Domänen aufweisen, die für denselben Analyten spezifisch sind und gleichzeitig an den Analyten binden können; und jedes Paar von Sonden für einen anderen Analyten spezifisch ist; wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenz jeder Proximity-Sonde unterschiedlich ist; und wobei: in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen, so dass bei Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihren Analyten die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden miteinander oder mit einem gemeinsamen Splint-Oligonukleotid hybridisieren, das Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden komplementär sind; und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird;
      • (ii) Ermöglichen, dass die Nukleinsäuredomänen der Proximity-Sonden aneinander oder an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, um einen kontinuierlichen oder nichtkontinuierlichen Duplex zu bilden, der die Hybridisierungssequenz einer ersten Proximity-Sonde und eine Hybridisierungssequenz einer zweiten Proximity-Sonde aufweist, wobei der Duplex mindestens ein freies 3'-Ende aufweist;
      • (iii) Unterziehen des Duplex einer Verlängerungs- und/oder Ligationsreaktion, um ein Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist;
      • (iv) Amplifikation des Verlängerungs- oder Ligationsprodukts;
      • (v) Nachweisen des Verlängerungsprodukts oder des Ligationsprodukts, wobei der Nachweis des Verlängerungsprodukts oder des Ligationsprodukts die Identifizierung der darin enthaltenen ID-Sequenzen und die Bestimmung der relativen Mengen jedes Verlängerungsprodukts oder Ligationsprodukts umfasst; und
      • (vi) Bestimmen, welche Analyten in der Probe vorhanden sind, wobei:
        1. (a) Verlängerungsprodukte und/oder Ligationsprodukte, die eine erste ID-Sequenz von einer ersten Proximity-Sonde, die zu einem ersten Paar von Proximity-Sonden gehört, und eine zweite ID-Sequenz von einer zweiten Proximity-Sonde, die zu einem zweiten Paar von Proximity-Sonden gehört, aufweisen, als Hintergrund angesehen werden; und
        2. (b) ein Verlängerungs- oder Ligationsprodukt, das eine erste ID-Sequenz und eine zweite ID-Sequenz von einem Paar von Proximity-Sonden aufweist und das in einer Menge vorhanden ist, die höher ist als der Hintergrund, anzeigt, dass der Analyt, der spezifisch von dem Paar von Proximity-Sonden gebunden wird, in der Probe vorhanden ist.
    2. 2. Verfahren nach Klausel 1, wobei der Analyt ein Protein ist oder aufweist.
    3. 3. Verfahren nach Klausel 1 oder 2, wobei die Analyt-bindende Domäne ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
    4. 4. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 3, wobei Schritt (i) ferner das Inkontaktbringen der Probe mit einer oder mehreren Hintergrundsonden aufweist, die keinen Analyten binden, wobei die Hintergrundsonden eine Nukleinsäuredomäne aufweisen, die eine ID-Sequenz und eine Hybridisierungssequenz aufweist, die sie mit mindestens einer Proximity-Sonde teilen; wobei ein Verlängerungs- und/oder Ligationsprodukt, das als Ergebnis einer Wechselwirkung zwischen einer Hintergrundsonde und einer Proximity-Sonde erzeugt wird, in Schritt (v) nachgewiesen und in Schritt (vi) als Hintergrund betrachtet wird.
    5. 5. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 4, wobei die ID-Sequenzen Barcode-Sequenzen sind.
    6. 6. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 5, wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen für ein einzelnes Paar von Proximity-Sonden einzigartig ist.
    7. 7. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 6, bei dem nicht mehr als 10 Paare von Proximity-Sonden das gleiche Paar von Hybridisierungssequenzen aufweisen.
    8. 8. Verfahren nach Klausel 7, wobei nicht mehr als 5 Paare von Proximity-Sonden das gleiche Paar von Hybridisierungssequenzen aufweisen.
    9. 9. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 8, wobei mindestens 25 % der Paare von Proximity-Sonden ihr Hybridisierungssequenzpaar mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilen.
    10. 10. Verfahren nach Klausel 9, wobei mindestens 50 % der Paare von Proximity-Sonden ihr Hybridisierungssequenzpaar mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilen.
    11. 11. Verfahren nach Klausel 10, wobei mindestens 75 % der Paare von Proximity-Sonden ihr Hybridisierungssequenzpaar mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilen.
    12. 12. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 11, wobei der Nachweisassay auf Proximity-Basis ein Proximity-Extension-Assay ist, bei dem die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden komplementäre Hybridisierungssequenzen aufweisen, die unter Bildung des Duplex miteinander hybridisieren; und wobei der Duplex einer Verlängerungsreaktion unterzogen wird, wobei die Verlängerungsreaktion die Verlängerung des mindestens einen freien 3'-Endes aufweist, um ein Verlängerungsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist.
    13. 13. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 11, wobei der Nachweisassay auf Proximity-Basis ein Proximity-Ligationsassay ist, wobei die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen, die an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, um den Duplex zu bilden, und wobei Schritt (iii) das direkte oder indirekte Ligieren der Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde an die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde umfasst, um ein Ligationsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist.
    14. 14. Verfahren nach Klausel 12, wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden mindestens eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig ist.
    15. 15. Verfahren nach Klausel 14, wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden beide Nukleinsäuredomänen teilweise doppelsträngig sind.
    16. 16. Verfahren nach Klausel 14 oder 15, wobei die teilweise doppelsträngige Nukleinsäuredomäne aufweist:
      • (i) ein erstes Oligonukleotid, das mit der Analyt-Bindungsdomäne konjugiert ist; und
      • (ii) ein Hybridisierungsoligonukleotid, aufweisend die erste Hybridisierungssequenz, die ID-Sequenz und eine zweite Hybridisierungssequenz, wobei sich die erste Hybridisierungssequenz am 3'-Ende des Hybridisierungsoligonukleotids befindet;
      wobei der doppelsträngige Teil der Nukleinsäuredomäne einen Duplex zwischen der zweiten Hybridisierungssequenz des Hybridisierungsoligonukleotids und dem ersten Oligonukleotid aufweist, und der einzelsträngige Teil der Nukleinsäuredomäne die erste Hybridisierungssequenz des Hybridisierungsoligonukleotids aufweist.
    17. 17. Verfahren nach Klausel 16, wobei das Hybridisierungsoligonukleotid von 5' bis 3' die zweite Hybridisierungssequenz, die ID-Sequenz und die erste Hybridisierungssequenz aufweist und die ID-Sequenz in dem einzelsträngigen Teil der Nukleinsäuredomäne lokalisiert ist.
    18. 18. Verfahren nach Klausel 16 oder 17, wobei mindestens ein Hybridisierungsoligonukleotid in Schritt (iii) verlängert wird, um das Verlängerungsprodukt zu erzeugen.
    19. 19. Verfahren nach einer der Klauseln 16 bis 18, wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden beide Nukleinsäuredomänen teilweise doppelsträngig sind und eines oder beide Hybridisierungsoligonukleotide in Schritt (iii) verlängert werden, um das Verlängerungsprodukt zu erzeugen.
    20. 20. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 19, wobei die Nukleinsäuredomäne eine DNA-Domäne ist.
    21. 21. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 20, wobei in Schritt (iv) das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt durch PCR amplifiziert wird.
    22. 22. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 21, wobei das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt durch Nukleinsäuresequenzierung nachgewiesen wird.
    23. 23. Verfahren nach Klausel 22, wobei vor der Sequenzierung ein oder mehrere Sequenzierungsadapter in einem oder mehreren Amplifikations- und/oder Ligationsschritten an das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt angehängt werden.
    24. 24. Verfahren nach Klausel 23, wobei in Schritt (iv) das Verlängerungsprodukt oder Ligationsprodukt in einer ersten PCR-Reaktion amplifiziert wird, in der ein erster Sequenzierungsadapter an ein Ende des Verlängerungsprodukts oder Ligationsprodukts hinzugefügt wird; und das Produkt der ersten PCR-Reaktion in einer zweiten PCR-Reaktion amplifiziert wird, wobei ein zweiter Sequenzierungsadapter an das andere Ende des Verlängerungsprodukts oder des Ligationsprodukts hinzugefügt wird.
    25. 25. Verfahren nach Klausel 24, wobei die erste PCR-Reaktion mit einer Nukleinsäurepolymerase durchgeführt wird, die auch 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist, und die zweite PCR-Reaktion mit einer Nukleinsäurepolymerase durchgeführt wird, der die 3'-5'-Exonukleaseaktivität fehlt.
    26. 26. Verfahren nach einer der Klauseln 24 bis 27, wobei vor der Sequenzierung eine Probenindexsequenz in einem Amplifikations- oder Ligationsschritt an das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt angehängt wird, vorzugsweise wobei die Probenindexsequenz während der PCR-Amplifikation in Schritt (iv) an das Verlängerungs- oder Ligationsprodukt angehängt wird.
    27. 27. Verfahren nach einer der Klauseln 22 bis 26, wobei die Nukleinsäuresequenzierung eine massiv-parallele DNA-Sequenzierung ist.
    28. 28. Verfahren nach einer der Klauseln 1 bis 27, wobei die Probe eine Plasma- oder Serumprobe ist.
    29. 29. Produkt, das aufweist:
      • (i) eine Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist:
        1. (a) eine Proteinbindungsdomäne, die für ein Protein spezifisch ist, und
        2. (b) eine Nukleinsäuredomäne,
        wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Proteinbindungsdomänen aufweisen, die für dasselbe Protein spezifisch sind und gleichzeitig an das Protein binden können; und jedes Paar von Sonden für ein anderes Protein spezifisch ist; wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenz jeder Proximity-Sonde unterschiedlich ist; und wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen; und, optional
      • (ii) eine Anzahl von Splint-Oligonukleotiden, wobei jedes Splint-Oligonukleotid Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen eines Paars von Proximity-Sonden komplementär sind; wobei die Hybridisierungssequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass nach Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihr Protein die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden miteinander oder mit einem Splint-Oligonukleotid hybridisieren; und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird.
    30. 30. Produkt nach Klausel 29, wobei die Proteinbindungsdomäne ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
    31. 31. Produkt nach Klausel 29 oder 30, das ferner eine oder mehrere Hintergrundsonden aufweist, die keinen Analyten binden, wobei die Hintergrundsonden eine Nukleinsäuredomäne aufweisen, die eine ID-Sequenz und eine Hybridisierungssequenz aufweist, die sie mit mindestens einer Proximity-Sonde teilen.
    32. 32. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 31, wobei die ID-Sequenzen Barcode-Sequenzen sind.
    33. 33. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 32, wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen für ein einzelnes Paar von Proximity-Sonden einzigartig ist.
    34. 34. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 33, wobei nicht mehr als 10 Paare von Proximity-Sonden dasselbe Paar von Hybridisierungssequenzen aufweisen.
    35. 35. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 34, wobei mindestens 75 % der Paare von Proximity-Sonden ihr Hybridisierungssequenzpaar mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilen.
    36. 36. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 35, wobei die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden komplementäre Hybridisierungssequenzen aufweisen, die in der Lage sind, unter Bildung eines Duplex miteinander zu hybridisieren.
    37. 37. Produkt nach einer der Klauseln 29 bis 36, wobei die Paare von Proximity-Sonden wie in einem der Punkte 14 bis 17 oder 20 definiert sind.
  • Zum weiteren Verständnis der Erfindung wird auf die nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele und die Figuren verwiesen.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
    • 1 zeigt eine schematische Darstellung von sechs verschiedenen Versionen von Proximity-Extension-Assays, die oben ausführlich beschrieben wurden. Die umgekehrten ‚Y‘-Formen stellen Antikörper als beispielhafte Analyt-Bindungsdomäne für Proximity-Sonden dar.
    • 2 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse für das Expressionsniveau von vier Analyten in sechs verschiedenen Proben, die mittels Multiplex-PEA bestimmt wurden, wobei entweder eine herkömmliche Negativkontrolle oder eine Negativkontrolle mit gemeinsamer Hybridisierungsstelle verwendet wurde.
    • 3 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse für das Expressionsniveau von fünf Analyten in sechs verschiedenen Proben (dieselben Proben wie in 2), die mittels Multiplex-PEA bestimmt wurden, wobei entweder eine traditionelle Negativkontrolle oder eine Negativkontrolle mit gemeinsamer Hybridisierungsstelle verwendet wurde.
  • Beispiele
  • Die Plasmaproben wurden von 6 Spendern gewonnen: 3 gesunde Individuen, ein Individuum mit der Diagnose Brustkrebs, ein Individuum mit der Diagnose rheumatoide Arthritis (RA) und ein Individuum mit der Diagnose entzündliche Darmerkrankung (IBD).
  • Es wurde eine Multiplex-PEA durchgeführt (unter Verwendung von Sonden, die aus Antikörpern bestehen, die mit Nukleinsäuredomänen konjugiert sind, die die in Version 6 oben beschriebene Struktur aufweisen), um 9 Proteine in den Proben nachzuweisen: NPDC1 (UniProt Q9NQX5); AHCY (UniProt P23526); TM (UniProt P07204); ANGPTL1 (UniProt 095841); LOX-1 (UniProt P78380); SEMA3F (UniProt Q13275); CDH2 (UniProt P19022); CANT1 (UniProt Q8WVQ1); und CA13 (UniProt Q8N1Q1). Die gegen NPDC1, AHCY, TM und ANGPTL1 gerichteten Sonden teilten sich ein Paar von Hybridisierungsstellen; die gegen LOX-1, SEMA3F, CDH2, CANT1 und CA13 gerichteten Sonden teilten sich ein anderes Paar von Hybridisierungsstellen. Jede Sonde enthielt eine eindeutige Barcode-Sequenz. Es wurde auch eine Negativkontrolle verwendet, die aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 % Rinderserumalbumin ohne Probe bestand.
  • Die PEA wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Während der Amplifikation der Verlängerungsprodukte wurden P5- und P7-Sequenzierungsadapter an jedes Ende der Produkte angehängt, zusammen mit einem eindeutigen Probenindex für Reporternukleinsäuren aus jeder unterschiedlichen Probe, und alle Verlängerungsprodukte wurden durch massiv-parallele DNA-Sequenzierung sequenziert, wobei eine reversible Farbstoffterminator-Sequenzierungstechnik mit einer Illumina NovaSeq-Plattform verwendet wurde.
  • Der Hintergrund der negativen Standardkontrolle für ein Ziel wurde anhand der gepaarten Barcode-Interaktion der Sonden für das Ziel bestimmt. Der Hintergrund durch gemeinsam genutzte Hybridisierungsstellen für ein Ziel wurde für jede Probe aus dem Mittelwert der nicht übereinstimmenden Wechselwirkungen (wie durch nicht übereinstimmende Barcodes bestimmt) zwischen jeder einzelnen Sonde des Paars von Sonden für das Ziel und anderen Sonden innerhalb der Gruppe (d.h. Sonden, die Hybridisierungsstellen mit den Sonden für das Ziel gemeinsam nutzen) ermittelt. Mit anderen Worten: Für jedes Ziel wurde der Hintergrund aus gemeinsamen Hybridisierungsstellen als unspezifische Wechselwirkungen zwischen jeder Sonde für das Target und anderen Sonden mit gemeinsamen Hybridisierungsstellen definiert. Unspezifische Wechselwirkungen zwischen Sonden, die beide nicht an das Ziel binden, wurden bei der Berechnung des Hintergrunds nicht berücksichtigt.
  • Die folgenden Ergebnisse wurden für die beiden Gruppen von Zielanalyten erzielt:
  • Gruppe 1 - Lineare Analyse
  • Signal oberhalb des Hintergrunds der Negativkontrolle:
    NPDC1 AHCY TM ANGPTL1
    IBD-Individuum 4.744595 18.77055 24.26055 5.650493
    RA-Individuum 24.15997 23.02676 31.97209 16.44529
    Brustkrebs-Individuum 15.63025 5.763718 21.46488 16.13142
    Gesunde Kontrolle 1 10.11761 9.273049 18.64168 24.23299
    Gesunde Kontrolle 2 14.58207 2.398616 26.94637 17.11784
    Gesunde Kontrolle 3 26.35638 6.522163 38.96036 24.39238
    Signal oberhalb des Hintergrunds aus gemeinsamen Hybridisierungsstellen:
    NPDC1 AHCY TM ANGPTL1
    IBD-Individuum 6.587558 24.20433 33.56129 6.621035
    RA-Individuum 30.17537 30.42173 36.67241 14.92188
    Brustkrebs-Individuum 18.81776 6.457732 29.32031 14.772
    Gesunde Kontrolle 1 12.29969 10.44351 21.19694 21.6378
    Gesunde Kontrolle 2 14.15044 2.597143 28.14347 13.73367
    Gesunde Kontrolle 3 31.26646 7.661677 46.84286 21.24901
  • Gruppe 1 - Logarithmische Analyse (Basis 2)
  • Signal oberhalb des Hintergrunds der Negativkontrolle:
    NPDC1 AHCY TM ANGPTL1
    IBD-Individuum 2.246285 4.230399 4.60054 2.498377
    RA-Individuum 4.594547 4.52524 4.998741 4.039603
    Brustkrebs-Individuum 3.966269 2.527 4.423906 4.011802
    Gesunde Kontrolle 1 3.338797 3.213044 4.22046 4.598901
    Gesunde Kontrolle 2 3.866123 1.262202 4.752019 4.097428
    Gesunde Kontrolle 3 4.72008 2.70535 5.283935 4.608359
    Signal oberhalb des Hintergrunds aus gemeinsamen Hybridisierungsstellen:
    NPDC1 AHCY TM ANGPTL1
    IBD-Individuum 2.719744 4.597194 5.068726 2.727057
    RA-Individuum 4.915299 4.92703 5.196623 3.899357
    Brustkrebs-Individuum 4.234023 2.691028 4.873829 3.884793
    Gesunde Kontrolle 1 3.62055 3.384535 4.405784 4.435482
    Gesunde Kontrolle 2 3.822775 1.376925 4.814728 3.779645
    Gesunde Kontrolle 3 4.966544 2.93766 5.549757 4.409324
  • Die logarithmischen Ergebnisse sind in der Grafik in 2 dargestellt.
  • Gruppe 2 - Lineare Analyse
  • Signal oberhalb des Hintergrunds der Negativkontrolle:
    LOX-1 SEMA3F CDH2 CANT1 CA13
    IBD-Individuum 93.75019 7.710203 11.65482 30.88921 22.95267
    RA-Individuum 51.94867 15.51322 13.56623 46.84155 304.8523
    Brustkrebs-Individuum 12.1141 15.45434 16.45051 36.89154 104.631
    Gesunde Kontrolle 1 23.56257 8.300925 8.070123 29.4027 4.299637
    Gesunde Kontrolle 2 18.14679 6.530255 17.95702 36.27412 14.72176
    Gesunde Kontrolle 3 25.83432 13.76144 13.69109 34.4381 5.858678
    Signal oberhalb des Hintergrunds aus gemeinsamen Hybridisierungsstellen:
    LOX-1 SEMA3F CDH2 CANT1 CA13
    IBD-Individuum 141.2799 18.21138 16.84211 31.75165 31.70223
    RA-Individuum 65.79012 31.66038 15.88331 39.08923 338.9779
    Brustkrebs-Individuum 14.1692 29.58474 20.04621 31.2304 117.9876
    Gesunde Kontrolle 1 33.38638 17.40281 10.59963 26.28186 5.242938
    Gesunde Kontrolle 2 23.59205 11.80547 21.32377 31.38729 17.40023
    Gesunde Kontrolle 3 32.05737 26.6478 16.27754 27.05954 6.934537
  • Gruppe 2 - Logarithmische Analyse (Basis 2)
  • Signal oberhalb des Hintergrunds der Negativkontrolle:
    LOX-1 SEMA3F CDH2 CANT1 CA13
    IBD-Individuum 6.55075 2.946769 3.542855 4.949031 4.52059
    RA-Individuum 5.699015 3.955426 3.761948 5.549717 8.251967
    Brustkrebs-Individuum 3.598615 3.94994 4.04006 5.205218 6.709166
    Gesunde Kontrolle 1 4.558425 3.053272 3.012591 4.877877 2.104215
    Gesunde Kontrolle 2 4.181643 2.707139 4.166476 5.180869 3.879879
    Gesunde Kontrolle 3 4.691217 3.782559 3.775165 5.105934 2.550575
    Signal oberhalb des Hintergrunds aus gemeinsamen Hybridisierungsstellen:
    LOX-1 SEMA3F CDH2 CANT1 CA13
    IBD-Individuum 7.142412 4.186769 4.074001 4.988759 4.986513
    RA-Individuum 6.039799 4.984607 3.989439 5.288699 8.405047
    Brustkrebs- Individuum 3.824686 4.886781 4.325258 4.964879 6.882491
    Gesunde Kontrolle 1 5.061188 4.121249 3.405942 4.715995 2.390375
    Gesunde Kontrolle 2 4.560229 3.561384 4.41439 4.972109 4.121035
    Gesunde Kontrolle 3 5.002584 4.735944 4.024811 4.758066 2.7938
  • Die logarithmischen Ergebnisse sind in der Grafik in 3 dargestellt.
  • Während sich für beide Gruppen von Analyten die tatsächlichen Werte der Signale oberhalb des Hintergrunds zwischen den beiden Kontrolltypen (Negativkontrolle und Kontrolle mit gemeinsamen Hybridisierungsstellen) unterscheiden können, verschieben sich die Werte für jeden Analyten für jede Probe ungefähr gleich (d.h. es gibt eine Parallelverschiebung). Dies wird durch die hohen R2-Werte für die mit jedem Analyten erzielten Ergebnisse belegt, die auf eine sehr hohe Korrelation zwischen dem Grad des Signals oberhalb des Hintergrund hinweisen, der mit jedem der beiden Verfahren bestimmt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung gemeinsamer Hybridisierungsstellen eine gute Alternative zu einer Standard-Negativkontrolle ist, da die relativen Signalstärken eines Analyten zwischen den Proben erhalten bleiben. Die Ergebnisse der Hintergrundbestimmung mit gemeinsamen Hybridisierungsstellen zeigen eine ähnliche Unterscheidung zwischen den Proben wie bei der Verwendung einer negativen Standardkontrolle.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Söderberg et al. beschrieben, Nature Methods 3(12): 995-1000 [0104]

Claims (14)

  1. Produkt, das aufweist: (i) eine Anzahl von Paaren von Proximity-Sonden, wobei jedes Paar von Proximity-Sonden eine erste Proximity-Sonde und eine zweite Proximity-Sonde aufweist und jede Proximity-Sonde aufweist: (a) eine Proteinbindungsdomäne, die für ein Protein spezifisch ist, und (b) eine Nukleinsäuredomäne, wobei beide Sonden innerhalb jedes Paares Proteinbindungsdomänen aufweisen, die für dasselbe Protein spezifisch sind und gleichzeitig an das Protein binden können; und jedes Paar von Sonden für ein anderes Protein spezifisch ist; wobei die Nukleinsäuredomäne jeder Proximity-Sonde eine ID-Sequenz und mindestens eine erste Hybridisierungssequenz aufweist, wobei die ID-Sequenzen jedes Paares von Proximity-Sonden Barcode-Sequenzen sind, die einem bestimmten Analyten entsprechen; und wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden die erste Proximity-Sonde und die zweite Proximity-Sonde gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen; und (ii) eine Anzahl von Splint-Oligonukleotiden, wobei jedes Splint-Oligonukleotid Hybridisierungssequenzen aufweist, die zu jeder der gepaarten Hybridisierungssequenzen eines Paars von Proximity-Sonden komplementär sind; wobei die Hybridisierungssequenzen jedes Paars von Proximity-Sonden so konfiguriert sind, dass nach Bindung der ersten und zweiten Proximity-Sonde an ihr Protein die jeweiligen gepaarten Hybridisierungssequenzen der ersten und zweiten Proximity-Sonden an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren; und wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen von mindestens zwei Paaren von Proximity-Sonden gemeinsam genutzt wird.
  2. Produkt nach Anspruch 1, wobei die Proteinbindungsdomäne ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
  3. Produkt nach Anspruch 1 oder 2, das ferner eine oder mehrere Hintergrundsonden aufweist, die keinen Analyten binden, wobei die Hintergrundsonden eine Nukleinsäuredomäne aufweisen, die eine ID-Sequenz und eine Hybridisierungssequenz aufweist, die sie mit mindestens einer Proximity-Sonde teilen.
  4. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein Paar von Hybridisierungssequenzen für ein einzelnes Paar von Proximity-Sonden einzigartig ist.
  5. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei nicht mehr als 10 Paare von Proximity-Sonden dasselbe Paar von Hybridisierungssequenzen aufweisen.
  6. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens 75 % der Paare von Proximity-Sonden ihr Paar von Hybridisierungssequenzen mit einem anderen Paar von Proximity-Sonden teilen.
  7. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäuredomänen jedes Paars von Proximity-Sonden gepaarte Hybridisierungssequenzen aufweisen, die in der Lage sind, mit dem Splint-Oligonukleotid zu hybridisieren, um den Duplex zu bilden, so dass die Nukleinsäuredomäne der ersten Proximity-Sonde direkt oder indirekt an die Nukleinsäuredomäne der zweiten Proximity-Sonde ligierbar ist, um ein Ligationsprodukt zu erzeugen, das die ID-Sequenz der ersten Proximity-Sonde und die ID-Sequenz der zweiten Proximity-Sonde aufweist, wenn der Duplex einer Ligationsreaktion unterzogen wird.
  8. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden mindestens eine Nukleinsäuredomäne teilweise doppelsträngig ist.
  9. Produkt nach Anspruch 7, wobei in jedem Paar von Proximity-Sonden beide Nukleinsäuredomänen teilweise doppelsträngig sind.
  10. Produkt nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Nukleinsäuredomänen beider Proximity-Sonden eines Paares mit ihren 5'-Enden an die Proteinbindungsdomäne konjugiert sind.
  11. Produkt nach Anspruch 10, wobei ein Strang der teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuredomäne ein freies 3'-Ende aufweist.
  12. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Nukleinsäuredomänen des Paars von Proximity-Sonden so an das Splint-Oligonukleotid hybridisieren, dass eine Lücke zwischen dem 3'-Terminus der einen Nukleinsäuredomäne und dem 5'-Terminus der anderen Nukleinsäuredomäne besteht.
  13. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das ferner eine Anzahl von Probenindex-Oligonukleotiden mit Nukleotidsequenzen aufweist, die eine Ausgangsprobe identifizieren.
  14. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Nukleinsäuredomäne eine DNA-Domäne ist.
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