DE68926302T2

DE68926302T2 - Nucleinsäuresonden, welche verbesserte molekularschalter enthalten, und analysemethoden und kits, bei welchen die sonden verwendet werden

Info

Publication number: DE68926302T2
Application number: DE68926302T
Authority: DE
Inventors: Hilda M. Lomeli Playa Ola Verde 260 Mexico D.F. Buyoli; Barbara C. Del Mar Ca 92014 Chu; Cesar Eduardo New York Ny 11201 Guerra; Gerald F. Encinitas Ca 92024 Joyce; Fred Russell New York Ny 10463 Kramer; Paul M. Privada Cerrito 99 Cuernavaca Mexico Lizardi; Leslie E. La Jolla Ca 92037 Orgel; Sanjay New York Ny 10463 Tyagi
Original assignee: NEW YORK HEALTH RES INST; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Medicine And Dentistry Of Ne Us, University of; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2009-09-30
Also published as: US5118801A; EP0436644B1; WO1990003446A1; ATE136941T1; DE68926302D1; JPH07508398A; EP0436644A1; DK56091A; FI911536A0; AU647376B2; US5312728A; AU4346689A; DK56091D0; ES2023290A6; JP2806455B2

Description

Nucleinsäuresonden, welche verbesserte Molekularumschaltungen enthalten, und Analysemethoden und Kits, bei welchen die Sonden gebraucht werden

Die vorliegende Erfindung betrifft biologische Testsysteme; die Nucleinsäure-Hybridisierungssonden umfassen. Diese biologischen Testsysteme lassen sich zum Nachweis von spezifischen Genen, Genabschnitten oder RNA- Molekulen verwenden. Die Testsysteme lassen sich sowohl in der klinischen Medizin beispielsweise für Gewebs-, Blut- und Urinproben als auch in der Nahrungsmitteltechnologie, Landwirtschaft und biologischen Forschung verwenden.

Technischer Hintergrund

Die Verwendung von Nucleinsäure-Hybildisierungssonden für biologische Tests ist wohlbekannt. Eine der ersten Veröffentlichungen auf dem Gebiet der DNA-Tests stammt von Gillespie, D. und Spiegelman, S., A Quantitative Assay for DNA-RNA Hybrids with DNA Immobilized on a Membrane, J. Mol. Biol. 12 (1965), 829-842. Im allgemeinen umfaßt ein solcher Test die Trennung der Nucleinsäurepolymer-Ketten in einer Probe, z.B. durch Aufschmelzen, Fixieren der getrennten DNA-Stränge an einer Nitrocellulose-Membran und danach die Einführung einer Sondensequenz, die komplementär ist zu einer nur einmal vorkommenden Sequenz des gesuchten Materials, des "Ziel"-Materials, und die Inkubation zur Hybridisierung von Sondenbereichen mit komplementären Zielbereichen, falls Zielmoleküle vorhanden sind. Nichthybridisierte Sonden werden mit Hilfe bekannter Waschverfahren entfernt und danach wird die verbliebene Sondenmenge mittels eines der verschiedenen, nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmt, das eine Messung der Menge der Zielmoleküle in der Probe ermöglicht.
Eine in jüngster Zeit entwickelte Form biologischer Tests, bei denen Nucleinsäure-Hybridisierungssonden verwendet werden, umfaßt eine zweite Sonde, die oft als "Einfang-Sonde" bezeichnet wird (Ranki, M., Palva, A., Virtanen, M., Laaksonen, M. und Soderlund, H., Sandwich Hybridization as a Convenient Method for the Detection of Nucleic Acids in Crude Samples, Gene 21 (1983), 77-85; Syvanen, A.-C., Laaksonen, M. und Soderlund, H., Fast Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affinity-based Hybrid Collection, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 5037-5048). Eine Einfangsonde enthält eine Nucleinsäuresequenz, die zum Zielmolekül komplementär ist, vorzugsweise in einem Bereich in der Nähe der Sequenz, zu der die radioaktiv markierte Sonde komplementär ist. Die Einfangsonde wfrd mit einem Mittel zu ihrer Bindung an eine feste Oberfläche versehen. Die Hybridisierung kann daher in Lösung durchgeführt werden, in der sie schnell erfolgt. Die Hybride können dann an eine feste Oberfläche gebunden werden. Ein Beispiel für ein solches Mittel ist Biotin (Langer, P.R., Waldrop, A.A. und Ward, D.C., Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 6633-6637). Die Einfangsonde kann über Biotin an Streptavidin gebunden werden, das mit festen Gelperlen kovalent verknüpft ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel einschließlich der die erforderlichen Reagenzien und Mittel enthaltenden Tests und pharmazeutischen Kits zum Nachweis, daß in einem in vitro - oder ex vitro- System Nucleinsäure-Arten vorhanden sind.
Ein Ziel auf dem Fachgebiet besteht im Nachweis verschiedener Nucleinsäuresequenzen in einer biologischen Probe, in der diese sogenannten Zielsequenzen in Mengen vorliegen, die verglichen zu ihrem Vorkommen bei vielen anderen Nucleinsäurearten einschließlich RNA und/oder DNA klein sind. Daher ist der Nachweis von Nucleinsäuren wünschenswert, die mit Krankheiten oder pathologischen Zuständen im Zusammenhang stehende Polypeptide codieren, wie beispielsweise RNA des menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV). Neben dem Nachweis von Nucleinsäuren, die die Proteine solcher Viruspartikel codieren, ist es wünschenswert, andere für Krankheiten oder pathologische Zustände charakteristische Nucleinsäuren nachzuweisen, wie z.B. im Fall von Hämophihe ein defektes Gen. Wünschenswert ist auch der Nachweis anderer Nucleinsäuren, deren Gegenwart in der Probe zeigt, daß der Organismus der Wirkung eines Medikaments, z.B. eines Antibiotikums, widerstehen kann.
Zum Nachweis einer Sonde sind verschiedene Verfahrensweisen verwendet worden. Eine Verfahrensweise besteht in der Bindung einer leicht nachweisbaren Reporter-Gruppe an die Sonde. Beispiele für solche Reporter- Gruppen sind fluoreszierende organische Moleküle und ³²P-markierte Phosphatreste. In der Praxis liegt die Empfindlichkeitsgrenze dieser Nachweisverfahren bei etwa einer Million Zielmoleküle pro Probe.
Eine zweite Verfahrensweise besteht in der Bindung eines signalerzeugenden Systems an die Sonde. Beispiele sind Enzyme, wie z.B. Peroxidase. Die Sonden werden dann mit einem farbstoffbildenden Substrat inkubiert (Leary, J.J., Brigati, D.J. und Ward, D.C., Rapid and Sensitive Colorimetric Method for Visualizing Biotin-Labeled DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Immobilized on Nitrocellulose: Bio-Blots, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4045-4049). Eine solche Verstärkung senkt die Anzahl der nachweisbaren Zielmoleküle, die mindestens vorhanden sein müssen. Durch die unspezifische Bindung von Sonden ist jedoch die Verbesserung der Empfindlichkeit im Vergleich zur radioaktiven Markierung auf etwa eine Größenordnung beschränkt, d.h. auf eine Mindestanzahl von etwa 100 000 Zielmolekülen.
Eine weitere Verfahrensweise besteht in der Herstellung vieler Kopien des Zielmoleküls mittels in vivo-Verfahren (Hartley, J.L., Berninger, M., Jessee, J.A., Bloom, F.R. und Temple, G.S., Bioassay for Specific DNA Sequences Using a Non-Radioactive Probe, Gene 49 (1986), 295-302). Das kann auch in vitro unter Verwendung eines "Polymerasekettenreaktion" (PCR) genannten Verfahrens geschehen. Dieses Verfahren wurde von Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. und Amheim, N. in "Enzymatic Amplification of Beta-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Gell Anemia", Science 230 (1985), 1350-1354, Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. und Erlich, H.A. in "Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA With a Thermostable DNA Polymerase", Science 239 (1988), 487-491, Erlich, H.A., Gelfand, D.H. und Saiki, R.K. in "Specific DNA Amplification", Nature 331(1988), 461-462, sowie Mullis et al. in den EP-A-Veröffentlichungen 200362 und 201184 (vgl. auch US-Patente 4,683,195 und 4,683,202) beschrieben. Bei der PCR ist die Sonde nur zum vorderen Ende einer Zielsequenz komplemetär, dient jedoch aufgrund eines enzymatischen Verfahrens als Primer zur Replikation der gesamten Zielsequenz. Jede Wiederholung des Verfahrens führt zu einer weiteren Verdopplung der Anzahl der Zielsequenzen, bis eine große Anzahl der Zielsequenzen, beispielsweise eine Million Kopien, erzeugt ist. Hier können nachweisbare Sonden, z.B. radioaktiv markierte Sonden, zum Nachweis der Anzahl amplifizierter Zielmoleküle verwendet werden. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens zur Amplifikation von Zielmolekülen ist im allgemeinen durch die Anzahl der erzeugten "falsch positiven Signale" beschränkt, d.h. erzeugte Abschnitte, die keine genauen Kopien des Zielmoleküls darstellen. Trotzdem ist dieses Verfahren sehr empfindlich. Das Verfahren erfordert mindestens zwei Nucleinsäuresonden und weist für einen einzigen Zyklus drei Schritte auf. Das Verfahren ist jedoch mühselig und nicht immer zuverlässig.
Ein weiteres Verfahren zur Amplifikation besteht in der Bindung der Sonde an RNA, von der bekannt ist, daß sie durch eine RNA-gesteuerte RNA- Polymerase exponentiell kopiert wird. Ein Beispiel für eine solche Polymerase ist die Replicase des Bakteriophagen Qbeta (Haruna, I. und Spiegelman, S., Autocatalytic Synthesis of a Viral RNA In Vitro, Science 150 (1965), 884-886). Ein anderes Beispiel ist die Replicase des Trespenmosaik-Virus (brome mosaic virus) (March et al., POSITIVE STRAND RNA VIRUSES (1987), Man R. Liss, New York). Bei diesem Verfahren dient die RNA als Matrize zur exponentiellen Synthese von RNA-Kopien durch eine homologe RNA-gesteuerte RNA- Polymerase. Die synthetisierte RNA-Menge ist viel größer als die anfangs vorhandene Menge. Dieses Amplifikationsverfahren ist in Chu, B.C.F., Kramer, F.R. und Orgel, L.E., Synthesis of an Amplifiable Reporter RNA for Bioassays, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 5591-5603, Lizardi, P.M., Guerra, C.E., Lomeli, H., Tussie-Luna, I. und Kramer, F.R., Exponential Amplification of Recombinant- RNA Hybridization Probes, Bio/Technology 6 (Oktober 1988), 1197-1203 [nachstehend als "Lizardi et al." bezeichnet) und der veröffentlichten EP-A 266,399 (EP-A 87903131.8) offenbart. Nach Entfernung nichthybridisierter Sonden durch Waschen wird die RNA-Polymerase zur Herstellung von Kopien der replizierbaren RNA verwendet. Gemäß der Offenbarung der veröffentlichten EP-A 266,399 kann die RNA-Replikation erfolgen, während die RNA an die Sonde gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann die replizierbare RNA vor Replikation von der restlichen Sonde abgetrennt werden. Die Patentanmeldung offenbart auch verschiedene chemische Bindungen, über die eine Sondensequenz an eine replizierbare RNA gebunden werden kann. Außerdem offenbart die Patentanmeldung, daß die Sondensequenz Teil einer replizierbaren RNA sein kann, wie in Miele, E.A., Mills, D.R. und Kramer, F.R., Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA, J. Mol. Biol. 171(1983), 281-295, beschrieben. Diese Europäische Patentanmeldung offenbart auch, daß solche rekombinanten RNAs fähig sein müssen, sowohl mit der Zielsequenz spezifisch zu hybridisieren als auch ihre Fähigkeit beizubehalten, als Matrize zur exponentiellen Replikation durch eine geeignete RNA-gesteuerte RNA-Polymerase zu dienen, wie in den von Lizardi et al., vorstehend, erhaltenen Ergebnissen gezeigt.
Im Gegensatz zur Amplifikation von Zielmolekülen unter PCR-Verwendung kann die RNA-Replikation in einem einzigen Schritt durchgeführt werden. In diesem Schritt kann man eine ganze Billion Kopien der replizierbaren RNA herstellen, wobei diese in nur zwanzig Minuten an die Sonde gebunden worden war, was theoretisch zum Nachweis eines einzigen Zielmoleküls führen kann. In der Praxis ist die Empfindlichkeit dieses Typs der Sondenreplikation jedoch durch die ständige Anwesenheit unspezifisch gebundener Sonden beschränkt. Unspezifisch gebundene Sonden führen ebenso zur Replikation wie mit Zielsequenzen hybridisierte Sonden.
Ein großes Problem bei der Durchführung von biologischen Tests, bei denen an Signal-Verstärkungssysteme gekoppelte Hybridisierungstechniken eingesetzt werden, stellen Hintergrundsignale dar, die durch unspezifisch gebundene Sondenmoleküle erzeugt werden. Diese Hintergrundsignale führen zu einer künstlichen Beschränkung der Empfindlichkeit biologischer Tests. Bei herkömmlichen biologischen Tests wird dieses Problem manchmal durch die Anwendung spezieller Waschverfahren verringert, die auf die Entfernung unspezifisch gebundenener Sonden abzielen. Diese Waschverfahren machen den Test jedoch zwangsläufig komplizierter und erhöhen seine Kosten.
Der Verminderung des Geräuschpegels von Hintergrundsignalen bei Tests, bei denen über kovalent gebundene Verknüpfungseinheiten mit replizierbarer RNA verknüpfte Sonden eingesetzt werden, dienen die in der EP- A 266,399 offenbarten Mittel, die in der Patentanmeldung als "intelligente Sonden" bezeichnet werden, wobei es sich um Sonden handelt, bei denen die daran gebundene RNA erst dann als Matrize zur Replikation dienen soll, wenn die Sonde mit einer Zielsequenz hybridisiert. In dieser Patentanmeldung werden zwei Ausführungsformen intelligenter Sonden offenbart.
In der ersten Ausführungsform dieser Patentanmeldung umfaßt die intelligente Sonde einen Sondenteil, der aus etwa 75 - 150 Desoxynucleotiden besteht und mit Hilfe von in vitro- oder in vivo-Verfahren hergestellt worden ist, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die intelligente Sonde umfaßt auch eine rekombinante replizierbare RNA, die eine inserierte heterologe Sequenz von etwa 10 - 30 Nucleotiden enthält, die beispielsweise mit Hilfe des Verfahrens von Miele, E.A., Mills, D.R. und Kramer, F.R., Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA, J. Mol. Biol. 171(1983), 281-295, hergestellt worden ist. Die Verbindung der beiden Teile an deren 5'-Enden erfolgt über eine Verknüpfungseinheit der Formel -O(PO&sub2;)NH(CH&sub2;)aSS(CH&sub2;)bNH(PO&sub2;)O-, wobei a und b jeweils eine Zahl von 2 bis 20 ist. Außerdem kann die Sequenz am 3'-Ende des DNA-Teils der intelligenten Sonde (mit großer Wahrscheinlichkeit) mit der heterologen Sequenz des RNA-Teils der intelligenten Sonde hybridisieren. Das Enzym Ribonuclease H soll den RNA-Teil der nicht mit Zielsequenzen hybridisierten intelligenten Sonden abspalten können, jedoch nicht den RNA-Teil der mit Zielsequenzen hybridisierten intelligenten Sonden, da bei Bindung der Sondensequenz des DNA-Teils einer intelligenten Sonde an ihre Zielsequenz die Sondensequenz unfähig ist, auch mit der heterologen Sequenz im RNA-Teil der intelligenten Sonde zu hybridisieren, wodurch sich eine Möglichkeit zur Beseitigung unspezifisch gebundener Sonden vor der Amplifikation bietet. Die Amplifikation über RNA-Replikation kann auch die vorherige Spaltung der Disulfidbindung in der Verknüpfungseinheit umfassen.
In dieser Ausführungsform sollte die Ribonuclease H in der Lage sein, die nicht mit Zielsequenzen hybridisierten Sonden zu spalten, da das 3'-Ende des DNA-Teils der intelligenten Sonde (der die Sondensequenz enthält) mit dem rekombinanten replizierbaren RNA-Teil hybridisiert, wobei vermutlich eine Stelle bereitgestellt wird, an der Ribonuclease H die RNA spalten und damit deren Funktionsfähigkeit als Matrize zur Amplifikation durch RNA- gesteuerte RNA-Polymerase beseitigen kann.
Die andere in der veröffentlichten EP-A 266,399 offenbarte Ausführungsform einer intelligenten Sonde enthält einen Sondenteil, eine Verknüpfungseinheit und einen replizierbaren RNA-Teil, die wie vorstehend beschrieben verknüpft sind. Bei dieser Ausführungsform umfaßt der Sondenteil jedoch nicht nur einen Sondenbereich von 50-150 Nucleotiden, sondern auf jeder Seite davon auch zusätzliche, als "Klammer"-Bereiche bezeichnete Bereiche, d.h. einen 5'-Klammer-Bereich und einen 3'-Klammer- Bereich, wobei jeder aus etwa 30-60 Nucleotiden besteht. Jeder Klammer- Bereich soll mit einem Bereich des replizierbaren RNA-Teils hybridisieren, wodurch die Funktionsfähigkeit der RNA als Matrize zur Replikation beseitigt wird, sofern die Sonde nicht mit einer Zielsequenz hybridisiert. Diese Hybridisierung bewirkt die Öffnung der Klammer-Bereiche, wodurch die RNA entweder direkt oder gegebenenfalls nach Spaltung der Disulfidbindung repliziert werden kann.
Die in der veröffentlichten EP-A 266,399 offenbarten intelligenten Sonden umfassen eine etwas komplizierte Verknüpfungsseinheit, die eine schwach kovalente und ziemlich leicht spaltbare Disulfidbindung enthält. Disulfidbindungen spalten sich unter reduzierenden Bedingungen leicht auf. Die in der Patentanmeldung offenbarten zwei Versionen intelligenter Sonden basieren auf voneinander entfernten intramolekularen Wechselwirkungen, die diese Intelligenz bewirken. Das ist ein Nachteil, der den Entwurf solcher Sonden erschwert, insbesondere weil voneinander entfernte Wechselwirkungen noch weitgehend ungeklärt sind. Die vorstehend beschriebene zweite Sondenversion weist eine weitere Schwierigkeit auf, da sie zwei voneinander entfernte Klammer-Bereiche verwendet, die einen Satz benachbarter, relativ hoch komplementärer Sequenzen verdrängen müssen. Außerdem hängt der Entwurf von den beiden entfernten, hybridisierenden Klammer-Bereichen oder keinem der beiden ab, wodurch der Entwurf sehr erschwert wird.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein einfacher allosterischer Molekularschalter, der eine Nucleinsäure-Hybridisierungssonde intelligent macht, d.h. befähigt, in einem geeigneten Test nur im Falle einer Hybridisierung der Sonde mit einer Zielsequenz ein Signal zu erzeugen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Aktivität eines signalerzeugenden Systems an den jeweiligen Zustand eines solchen Schalters zu koppeln.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von Sonden, die einen solchen allosterischen Schalter enthalten und mit einem der zahlreichen verschiedenen signalerzeugenden Systeme verknüpft sind, wobei deren Aktivität vom Zustand des Schalters abhängt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von Testsystemen mit verbesserter Empfindlichkeit, die sowohl die vorstehend beschriebenen Konstrukte als auch Kits zur Durchführung derartiger Tests nutzen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf einem einfachen allosterischen Molekularschalter, dessen Funktion auf dem Prinzip beruht, daß im Falle der Bildung einer Nucleinsäure-Doppelhelix aus einer relativ kurzen Sondensequenz und einer Zielsequenz sich die Enden der Doppelhelix aufgrund der Starrheit der Doppelhelix notwendigerweise im Abstand zueinander befinden. Die Starrheit der Doppelhelix wird von Shore, D., Langowski, J. und Baldwin, R.L in "DNA Flexibility Studied by Covalent Glosure of Short Fragments into Circles", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4833-4837, sowie Ulanovsky, L, Bodner, M., Trifonov, E.N. und Choder, M. in "Curved DNA: Design, Synthesis, and Circularization", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 862-866, im einzelnen diskutiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung einer Nucleinsäure- Hybridisierungssonde, die mindestens die folgenden notwendigen Bestandteile umfaßt: eine Sondensequenz mit einer Länge von etwa 15-115 Nucleotiden, die auf beiden Seiten von komplementären Nucleinsäuresequenzen umgeben ist, welche erheblich kürzer als die Sondensequenz sind, wobei ihre Länge vorzugsweise die Hälfte der Länge der Sondensequenz nicht wesentlich überschreitet. Diese Kombination der drei Sequenzen bildet einen einfachen allosterischen Molekularschalter. Im Falle einer Nicht-Hybridisierung mit einer Zielsequenz hybridisieren die Umschaltsequenzen miteinander, was von den Erfindern der vorliegenden Erfindung als geschlossener Schalter bezeichnet wird. Im Falle der Hybridisierung der Sondensequenz mit einer vorher bestimmten komplementären Zielsequenz, für die die Sonde entworfen worden ist, führt die starke Wechselwirkung zwischen der Sonde und den Zielsequenzen zur Bildung einer starren Doppelhelix und notwendigerweise zur Trennung der Umschaltsequenzen, was von den Erfindern der vorliegenden Erfindung als geöffneter Schalter bezeichnet wird. Bei der geöffneten Konfiguration können die Umschaltsequenzen nicht miteinander in Wechselwirkung treten.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Sondenmoleküle, die den vorstehend beschriebenen Schalter enthalten, wobei eine der Umschaltsequenzen oder beide Umschaltsequenzen in Kombination eine biologisch funktionsfähige Nucleinsäure-Einheit umfassen, die sich zur selektiven Erzeugung eines nachweisbaren Signals verwenden läßt, das auf die Hybridisierung der Sonde mit ihrer vorher bestimmten Zielsequenz hinweist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Verfahren für biologische Testssysteme, die die allosterische Veränderung in den Umschaltsequenzen in den vorstehend beschriebenen Sondenmolekülen zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals nutzen, das auf die Hybridisierung der Sonde mit ihrer vorher bestimmten Zielsequenz hinweist. Der Test kann qualitativ (ein qualitativer Nachweis) oder quantitativ (ein quantitativer Nachweis) sein. Er kann eine lineare oder exponentielle Amplifikation umfassen.
Die vorliegende Erfindung kann auch Kits von Reagenzien und Makromolekülen zur Durchführung der vorstehend beschriebenen biologischen Tests umfassen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 ist eine schematische Darstellung eines geschlossenen erfindungsgemäßen Schalters.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung des Schalters von Figur 1, der sich jedoch im geöffneten Zustand befindet.
Figur 3 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel I, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält.
Figur 4 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel II, die einen Schalter im geschlossenen Zustand enthält.
Figur 5 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel II, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält.
Figur 6 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel III, die einen Schalter im geschlossenen Zustand enthält.
Figur 7 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel III, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält.
Figur 8 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel IV, die einen Schalter im geschlossenen Zustand enthält.
Figur 9 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel IV, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält, wobei außerdem ein Ribozym gezeigt ist.
Figur 10 ist ein genaueres Schema, das die Nucleotidsequenz des in Figur 9 dargestellten Ribozyms zeigt.
Figur 11 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel IV, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält, wobei außerdem ein zusätzlicher Strang gezeigt ist.
Figur 12 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel V, die einen Schalter im geschlossenen Zustand enthält.
Figur 13 ist eine schematische Darstellung der Sonde von Beispiel V, die einen Schalter im geöffneten Zustand enthält.

Genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung

In Figur list eine Sonde oder ein Sondenteil gezeigt, die/der die drei notwendigen Bestandteile einer erfindungsgemäßen Sonde umfaßt, nämlich eine Sondensequenz und komplementäre Umschaltsequenzen an beiden Seiten der Sonde. Wie in Figur 1 dargestellt, ist der Schalter geschlossen. In Figur 2 ist die gleiche Sonde oder der gleiche Sondenteil im geöffneten Zustand gezeigt.
In Figur 1 ist die Sondensequenz 1 eine Nucleinsäure-Sondensequenz, die von ihrer 5'-Seite 2 bis zu ihrer 3'-Seite 3 reicht. Direkt neben der 5'-Seite der Sondensequenz liegt die erste Nucleinsäure-Umschaltsequenz 4. Direkt neben der 3'-Seite der Sondensequenz liegt die zweite Nucleinsäure-Umschaltsequenz 5. Die Umschaltsequenzen 4 und 5 sind komplementär und hybridisieren über die Wasserstoffbindungen 7 miteinander, wobei die Stämmchenform 6 einer "Haarnadel"-Sekundärstruktur gebildet wird. In Figur 2 hybridisiert die Sondensequenz 1 über die Wasserstoffbindungen 9 mit ihrer vorher bestimmten Zielsequenz 8. Die Umschaltsequenzen 4 und 5 sind auseinander gespreizt und treten nicht miteinander in Wechselwirkung.
Die Sonde kann RNA oder DNA sein. Zur Sicherstellung einer sehr spezifischen Wechselwirkung mit ihrer vorher bestimmten Zielsequenz 8 muß die Sondensequenz 1 eine ausreichende Länge haben. Sie sollte eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden aufweisen, obwohl die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Sondensequenz mit einer Länge von mindestens ungefähr 20 Nucleotiden bevorzugen.
Die Sondensequenz 1 sollte kurz genug sein, um sicherzustellen, daß im Falle einer Hybridisierung mit der Zielsequenz 8 (Figur 2) die Seiten 2 und 3 der Sondensequenz 1 durch die Starrheit des hybridisierten Bereichs zwischen diesen Seiten physisch daran gehindert werden, sich innerhalb einer bestimmten Distanz zu nähern, die den Umschaltsequenzen 4 und 5 eine Wechselwirkung miteinander erlauben würde. Mit anderen Worten, im Falle einer Hybridisierung der Sondensequenz sind die Umschaltsequenzen notwendigerweise nicht miteinander hybridisiert. Eine zusätzliche Kraft unterstützt den Übergang in den geöffneten Zustand. Dabei handelt es sich um Torsionskräfte, die dazu neigen, im Falle der Bildung einer Doppelhelix durch den in Figur 2 gezeigten hybridisierten Bereich die Stämmchenstruktur 6 aufzulösen. In der Praxis ist die Sondensequenz nicht länger als etwa 100 Nucleotide. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bevorzugen eine Sondensequenzlänge von 20-60 Nucleotiden, wobei eine Länge von etwa 30 Nucleotiden am meisten bevorzugt ist.
Die Umschaltsequenzen stehen zur Länge der Sondensequenz in Beziehung. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bevorzugen am meisten Umschaltsequenzen, deren Länge die Hälfte der Länge der Sondensequenz nicht übersteigt. Die Umschaltsequenzen sollten eine Länge von mindestens etwa 10 Nucleotiden aufweisen, damit die Bildung der stabilen Stämmchenstruktur 6 möglich ist (Turner, D.H., Sugimoto, N., Jaeger, J.A., Longfellow, C.E., Freier, S.M. und Kierzek, R., Improved Parameters for Prediction of RNA Structure, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52 (1987), 123 - 133). Bei bestimmten nachstehend beschriebenen Ausführungsformen müssen die Umschaltsequenzen ausreichend lang sein, damit sie die erforderlichen funktionellen Sequenzen enthalten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bevorzugen Umschaltsequenzen von etwa 10-30 Nucleotiden.
Beim Entwurf einer erfindungsgemäßen Sonde sollte man die relative Stabilität des im geöffneten Schalterzustand befindlichen Hybridmoleküls (Figur 2) im Vergleich zur Stabilität des im geschlossenen Schalterzustand befindlichen Hybridmoleküls (Figur 1) unter den verwendeten Testbedingungen beachten: erstere sollte größer sein. Es gibt jedoch Testbedingungen, unter denen die Stabilität der Hybridmoleküle nur von der Länge abhängig ist (Wood, W.I., Gitschier, J., Lasky, L.A. und Lawn, R.M., Base Gomposition-independent Hybridization in Tetramethylammonium Chloride: A Method for Oligonucleotide Screening of Highly Complex Gene Libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1585-1588).
Der Schalterentwurf kann leicht getestet werden, indem Sonden oder Sondenteile (Figuren 1 und 2) vor und nach Hybridisierung mit Zielsequenzen enthaltenden Nucleinsäure-Modellsystemen mit geeigneten Nudeasen gespalten und anschließend die Spaltprodukte mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese getestet werden. Da dies dem Fachmann klar ist, erfolgt keine weitere Beschreibung.
Zur Unterstützung des Übergangs vom geschlossenen in den geöffneten Schalterzustand kann das Prinzip des Strangaustausches zur Bereitstellung einer zusätzlichen Kraft genutzt werden (Green, C. und Tibbetts, C., Reassociation Rate Umited Displacement of DNA Strands by Branch Migration, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 1905-1918). Das kann durch Überlappung einer Umschaltsequenz mit einer Sondensequenz erreicht werden, was bedeutet, daß mindestens ein Nucleotid der Umschaltsequenz gleichzeitig auch ein Nucleotid der Sondensequenz ist.
Obwohl die Umschaltsequenzen neben der Sondensequenz liegen müssen, müssen sie nicht direkt benachbart sein. Einige Nucleotide können die Umschaltsequenzen von der Sondensequenz trennen. Wie dem Fachmann bekannt ist, dürfen es jedoch nicht zu viele sein, damit die Funktion des Schalters nicht grundlegend beeinträchtigt wird.
Erfindungsgemäße Sondenmoleküle, die den vorstehend beschriebenen Schalter enthalten, können eine unterschiedliche Konstruktion aufweisen und dennoch die allosterische Veränderung, die mit der Hybridisierung der Sondensequenz (Fig. 2) einhergeht, zur Signalerzeugung nutzen.
Aufgrund ihrer Konformation im geöffneten Zustand kann eine Umschaltsequenz beispielsweise die Wechselwirkung mit einem anderen Makromolekül oder selbst mit einem unterschiedlichen Teil des gleichen, zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals erforderlichen Moleküls ermöglichen. Im nachstehenden Beispiel I kann die zweite Umschaltsequenz im geöffneten Zustand mit einem komplementären Nucleinsäurestrang hybridisieren. In Beispiel III bildet die erste Umschaltsequenz im geöffneten Zustand eine Haarnadel-Struktur, die eine spezifische Bindung an ein virales Protein ermöglicht. In Beispiel IV kann die zweite Umschaltsequenz im geöffneten Zustand mit einem Oligoribonucleotid oder einem Oligodesoxyribonucleotid in Wechselwirkung treten. In Beispiel V nimmt die erste Umschaltsequenz im geöffneten Zustand eine Konformationsstruktur an, die eine Wechselwirkung mit einem relativ weit entfernten Bereich des gleichen Sondenmoleküls ermöglicht.
Es ist auch möglich, umgekehrt vorzugehen. In Beispiel II können die Umschaltsequenzen nur dann an ein spezifisches Enzym binden, wenn sie sich im geschlossenen Zustand befinden.
Eine Signalerzeugung unter Verwendung von erfindungsgemäßen Sondenmolekülen und Verfahren kann sehr unterschiedlich sein. Der Zustand des einfachen allosterischen Schalters steuert die Signalerzeugung, was bedeutet, daß kein Signal erzeugt wird, wenn die Sondensequenz nicht mit ihrer Zielsequenz hybridisiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bevorzugen signalerzeugende Systeme, die zur Erhöhung der Empfindlichkeit eine Amplifikation, insbesondere eine exponentielle Amplifikation umfassen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige der unzähligen Variationen, die eine Amplifikation umfassen. Zur Erzeugung eines leicht nachweisbaren Signals nutzen sie allesamt die exponentielle Replikation einer replizierbaren RNA durch eine RNA-gesteuerte RNA-Polymerase. In den Beispielen wird die von Kacian, D.L, Mills, D.R., Kramer, F.R. und Spiegelman, S. in "A Replicating RNA Molecule Suitable for a Detailed Analysis of Extracellular Evolution and Replication", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 3038-3042, beschriebene MDV-1-RNA verwendet. In den Beispielen wird auch Q-beta- Replicase verwendet, die die spezifische Polymerase zur Replikation von MDV- 1-RNA ist. Q-beta-Replicase ist von Haruna, I. und Spiegelman, S. in "Specific Template Requirements of RNA Replicases", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54 (1965), 579-587, beschrieben. Natürlich kann eine beliebige replizierbare RNA und deren homologe Replicase verwendet werden. Bei anderen nützlichen signalerzeugenden Systemen können Enzyme, Enzym-Cofaktoren, Ribozyme sowie DNA- und RNA-Sequenzen eingesetzt werden, die zur biologischen Aktivität erforderlich sind (z.B. Promotoren, Primer oder Linker, die zur Ugierung von zur Transformation von Bakterien verwendeten Plasmiden erforderlich sind). Nachweisbare Signale sind unterschiedlich und umfassen beispielsweise radioaktive Strahlung, Lichtabsorption, Fluoreszenz, Massenzunahme und das Vorliegen biologisch aktiver Verbindungen.
Die zum Nachweis von hybridisierten erfindungsgemäßen Sonden verwendbaren Testverfahren sind auch unterschiedlich. In den folgenden Beispielen wird die Synthese einer replizierbaren RNA benutzt, um anzuzeigen, daß eine Hybridisierung der Sondensequenz erfolgt ist. Die in den Beispielen veranschaulichten signalerzeugenden Systeme gehören zu drei allgemeinen Klassen: in den Beispielen II und III ist der Schalter innerhalb einer replizierbaren RNA enthalten, in den Beispielen IV und V ist eine replizierbare RNA an einen Sondenteil gebunden, kann jedoch erst nach Abspaltung davon repliziert werden, was von der Gegenwart eines geöffneten Schalters abhängt, und im Beispiel I kann die Transkription einer replizierbaren RNA von einer nach Hybridisierung zugegebenen Matrize nur dann erfolgen, wenn eine im geöffneten Zustand befindliche Umschaltsequenz einen Teil eines funktionsfähigen Transkriptionspromotors bildet.
Jede der spezifischen Ausführungsformen, die in den beigefügten Beispielen dargelegt sind, erfüllt das gesetzte Ziel, nur im Falle einer Hybridisierung der Sonde mit einer Zielsequenz ein Signal zu erzeugen. Entweder hängt die biologische Aktivität der beschriebenen signalerzeugenden Systeme strikt vom Schalterzustand ab, oder der Schalterzustand stellt ein Mittel zur Verhinderung der Signalerzeugung durch unspezifisch gebundene Sonden bereit, oder der Schalterzustand stellt ein Mittel zur Trennung hybridisierter Sonden von unspezifisch gebundenen Sonden bereit. Jede der spezifischen Ausführungsformen vermindert daher merklich die durch unspezifisch gebundene Sonden verursachten Hintergrundsignale, wobei die Empfindlichkeit der Tests einschließlich der eine Amplifikation umfassenden Tests deutlich verbessert wird.

Beispiel 1

Die in diesem Beispiel verwendete Sonde ist ein einzelner DNA-Strang, der so entworfen ist, daß er drei Sequenzen enthält: eine Sondensequenz mit einer Länge von etwa 34 Nucleotiden, eine erste Umschaltsequenz von etwa 17 Nucleotiden, die der 5'-Seite der Sondensequenz direkt benachbart ist, und eine zweite Umschaltsequenz von etwa 17 Nucleotiden, die der 3'-Seite der Sondensequenz direkt benachbart ist. Die Umschaltsequenzen sind so entworfen, daß sie zueinander komplementär sind. Im Falle einer Hybridisierung miteinander umfassen die hybridiserten Umschaltsequenzen einen Promotor für eine DNA-gesteuerte RNA-Polymerase, nämlich die RNA- Polymerase des Bakteriophagen T7. In der vorliegenden Patentanmeldung wird die erste Umschaltsequenz als "Promotorsequenz" und die zweite Umschaltsequenz als "eine zu einem Promotor komplementäre" Sequenz bezeichnet. In diesem Beispiel umfassen die Umschaltsequenzen die Enden des Sondenmoleküls. Der Entwurf der Promotorsequenz und der zu einem Promotor komplementären Sequenz erfolgte nach Osterman, H.L. und Coleman, J.E., T7 Ribonucleic Acid Polymerase-Promoter Interactions, Biochemistry 20 (1981), 4885-4892. Als spezifische, zu einem Promotor komplementäre Sequenz wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung die Sequenz TAATACGACTCACTATA ausgewählt.
Das Sondenmolekül, das eine zu einer vorher bestimmten Zielsequenz komplementäre Sondensequenz umfaßt, kann mittels chemischer Oligodesoxyribonucleotid-Synthese unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden, vgl. z.B. Gait, M.J., OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984), IRL Press, Oxford, Großbritannien.
Die in diesem Beispiel beschriebene Sonde kann zum Nachweis einer zur Sondensequenz komplementären DNA- oder RNA-Zielsequenz verwendet werden. Die Zielsequenz kann in einer Probe enthalten sein, die andere, damit nicht verwandte Nucleinsäuren und andere Substanzen, beispielsweise Proteine, enthält. Die Sonde kann zum Nachweis eines Genbereichs eines infektiösen Krankheitserregers (Virus, Bakterium, Protozoon, etc.) in einer klinischen Probe, beispielsweise menschliches Blut oder Urin, verwendet werden.
Die Zielsequenz muß der Sonde zugänglich gemacht werden. Dies erfolgt mittels Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, wird die Nucleinsäure vor Zugabe der Sonde aus einer Probe isoliert.
Die Sonde und die Probe, die Nucleinsäure-Zielsequenzen enthalten kann, werden anschließend unter Bedingungen inkubiert, die Zeitdauer sowie Temperatur einschließen und zur Hybridisierung der Sondensequenzen mit Zielsequenzen geeignet sind. Geeignete Bedingungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zur quantitativen Bestimmung der Anzahl der vorhandenen Zielsequenzen sollte die Sonde in einer Menge verwendet werden, die die erwartete Höchstmenge der Zielsequenzen überschreitet, vorzugsweise erheblich überschreitet. Falls nur ein qualitativer Nachweis des Vorkommens von Zielsequenzen gewünscht ist, kann eine geringere Sondenmenge verwendet werden.
Mit Zielsequenzen hybridisierte Sonden werden von den nichtgebundenen Sonden mittels Verfahren abgetrennt, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, beispielsweise durch Verwendung von Einfang-Sonden.
Nach Trennung enthält die behandelte Probe mit Zielsequenzen hybridisierte Sonden (Figur 2) und auch unspezifisch gebundene Sonden. Diese beiden weisen jedoch nicht die gleiche Form auf. Bei den hybridisierten Sonden sind die allosterischen Schalter geöffnet, d.h. die Umschaltsequenzen haben nicht miteinander hybridisiert. Bei den unspezifisch gebundenen Sonden bleibt die Hybridisierung der Umschaltsequenzen bestehen.
Im folgenden wird der Nachweis von Sonden mit geöffneten Schaltern beschrieben. Das Beispiel umfaßt eine Amplifikation vor dem Nachweis.
In Figur 3 wird die Probe mit dem einzelsträngigen DNA-Molekül 10 inkubiert, das die Promotorsequenz 11 und die Matrizensequenz 12 zur Transkription einer replizierbaren RNA umfaßt. Unter auf dem Fachgebiet bekannten Bedingungen kann die Promotorsequenz 11 über die Wasserstoffbindungen 13 mit der zu einem Promotor komplementären zweiten Umschaltsequenz 5 von Sonden mit geöffnetem Schalter hybridisieren. Dieses DNA-Molekül besteht aus 17 Desoxyribonucleotiden der Promotorsequenz (die zu der vorstehend dargelegten, zu einem Promotor komplementären Sequenz komplemetär ist), denen sich 244 Desoxyribonucleotide anschließen, die zu der in Lizardi et al., vorstehend, beschriebenen MDV-Poly (+)-RNA komplementär sind. Mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), kann dieses DNA- Molekül durch Isolierung eines der komplementären Stränge eines geeigneten Restriktionsfragments eines Plasmids, das diese Sequenz enthält, hergestellt werden. Ein von den Erfindern der vorliegenden Erfindung konstruiertes geeignetes Plasmid enthält (1) eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle (d.h. eine Restriktionsstelle, die nirgendwo sonst im Plasmid enthalten ist) stromaufwärts vom Promotor in dessen Nähe sowie (2) eine SmaI- Restriktionsstelle an dem Ende der MDV-Poly-CDNA, die dem Promotor abgewandt ist.
Zur Synthese von etwa 50-200 oder mehr MDV-Poly-RNA-Transkripten für jeden geöffneten Schalter wurde die Probe anschließend mit einer im Handel erhältlichen donierten RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 inkubiert, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Bedingungen verwendet wurden (Milligan, J.F., Duncan, R.G., Witherell, G.W. und Uhlenbeck, O.C., Oligoribonucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase and Synthetic DNA Templates, Nucleic Acids Research 15 (1987), 8783-8798).
Danach wurde Q-beta-Replicase, eine RNA-gesteuerte RNA-Polymerase, zugegeben und mit den MDV-Poly-RNA-Transkripten, die für diese Polymerase Matrizen sind, inkubiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten Q- beta-Replicase mit Hilfe des Verfahrens von Eoyang, L. und August, J.T., Q-beta RNA polymerase from phage Q-beta-infected E.coli, in: Procedures in Nucleic Acid Research (Herausgeber Cantoni, G.L. und Davis, D.R.) Bd. 2 (1971), Seiten 829-839, Harper and Row, New York, her. Die Inkubation erfolgte unter Bedingungen, die zur exponentiellen Amplifikation der Transkripte geeignet waren (Kramer, F.R., Mills, D.R., Gole, P.E., Nishihara, T. und Spiegelman, S., Evolution in vitro: Sequence and Phenotype of a Mutant RNA Resistant to Ethidium Bromide, J. Mol. Biol. 89 (1974), 719-736).
Der Nachweis der exponentiell amplifizierten RNA kann mit Hilfe eines der verschiedenen physikalischen und chemischen Mittel erfolgen, die vorstehend in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben sind. Zur quantitativen Bestimmung ist die nach einer festgesetzten Inkubationszeit mit der RNA- gesteuerten RNA-Polymerase nachgewiesene RNA-Menge ein Maß für die Anzahl der in der Probe vorhandenen Zielsequenzen.

Beispiel II

Die in diesem Beispiel verwendete Sonde ist eine replizierbare rekombinante RNA (Miele, E.A., Mills, D.R. und Kramer, F.R., Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA, J. Mol. Biol. 171(1983), 281-295). In Figur 4 ist die Sonde mit 14 bezeichnet. Sie kann nach dem Verfahren von Lizardi et al., vorstehend, hergestellt werden. Zur Herstellung einer Sonde gemäß diesem Beispiel ist die innerhalb der replizierbaren rekombinanten RNA enthaltene heterologe Sequenz 15 so konstruiert, daß sie drei Sequenzen enthält: die Sondensequenz 16 mit einer Länge von etwa 46 Nucleotiden, die etwa 23 Nucleotide enthaltende erste Umschaltsequenz 17, die der 5'-Seite der Sondensequenz direkt benachbart ist, und die etwa 23 Nucleotide enthaltende zweite Umschaltsequenz 18, die der 3'-Seite der Sondensequenz direkt benachbart ist. Die Umschaltsequenzen sind so konstruiert, daß sie, wenn sie miteinander hybridisieren, eine doppelsträngige Erkennungsstelle für Ribonuclease III von Escherichia coli bilden. Diese Erkennungsstelle ist nicht vorhanden, wenn die Umschaltsequenzen nicht miteinander hybridisieren. Die in Figur 4 gezeigte spezifische Erkennungsstelle, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, ist von Rosenberg, M und Kramer, R.A. in "Nucleotide Sequence Surrounding a Ribonuclease III Processing Site in Bacteriophage T7 RNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 984-988, beschrieben. Sie kann durch Transkription eines rekombinanten Plasmids unter Verwendung der von Uzardi et. al., vorstehend, beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Exposition der Zielsequenz, Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz und Trennung von nichtgebundenen Sonden erfolgten wie in Beispiel I beschrieben. Wie in Figur 5 gezeigt, hybridisiert die Sondensequenz 16 einer hybridisierten Sonde 14 mit der Zielsequenz 8, wobei die Trennung der Umschaltsequenzen 17 und 18 erzwungen wird.
Zur Spaltung aller unspezifisch gebundenen Sonden (und aller verbliebenen nichtgebundenen Sonden) wurde die Probe danach mit Ribonuclease III von E.coli unter geeigneten Bedingungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, inkubiert, wodurch sie nicht mehr als Matrizen zur exponentiellen Replikation durch Q-beta-Replicase dienen konnten (Nishihara, T., Mills, D.R. und Kramer, F.R., Localization of the Q-beta Replicase Recognition Site in MDV-1 RNA, J. Biochem. 93 (1983), 669-674). Danach wurde die Ribonuclease III mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. Phenolextraktion, aus der Probe entfernt.
Durch eine kurze Erhitzung wurde die Sonde von der Zielsequenz getrennt (Lizardi et al., vorstehend), obwohl vorherige Experimente gezeigt hatten, daß dieser Schritt nicht obligatorisch ist.
Die exponentielle Replikation der Sonde durch Q-beta-Replicase und der Nachweis wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt.

Beispiel III

Die in diesem Beispiel verwendete Sonde 19 (Figur 6) ist wie in Beispiel II eine replizierbare rekombinante RNA, wobei allerdings die Sondensequenz 20 eine Länge von etwa 38 Nucleotiden aufweist und die komplementären Umschaltsequenzen 21 und 22 von jeweils etwa 19 Nucleotiden so konstruiert sind, daß sie im Falle einer Hybridisierung miteinander keine Bindungsstelle für das Hüllprotein des Bakteriophagen R17 bilden. Falls, wie in Figur 7 gezeigt, eine solche Hybridisierung jedoch nicht erfolgt, organisiert sich die erste Umschaltsequenz 21 so, daß sie eine Sekundärstruktur umfaßt, die eine starke Bindungsstelle für dieses Hüllprotein bildet (Carey,J., Cameron, V., de Haseth, P.L. und Uhlenbeck, O.C., Sequence-Specific Interaction of R17 Coat Protein With Its Ribonucleic Acid Binding Site, Biochemistry 22 (1983), 2601-2610).
Freilegung der Zielsequenz, Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz und Trennung von nichtgebundenen Sonden wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt.
Mit Hilfe von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren wurde das Hüllprotein des Bakteriophagen R17 an einen festen Träger, wie z.B. Sephadex- oder Sepharoic-Gelperlen, Magnetkörner oder Mikrotiterplatten, kovalent gebunden. Ein Beispiel für ein solches Bindungsverfahren ist von Alagon, A.J. und King, T.P. in "Activation of Polysaccharides with 2-Iminothiolane and Its Uses", Biochemistry 19 (1980), 4331-4345, beschrieben. Die gewaschene Probe, die an Zielsequenzen gebundene Sonden und unspezifisch gebundene Sonden enthielt, wurde dem insolubilisierten R17-Hüllprotein zugegeben. Unspezifisch gebundene Sonden wurden durch Waschen entfernt.
Die Sonde wurde durch kurze Erhitzung sowohl vom R17-Hüllprotein als auch von der Zielsequenz befreit und danach wurde der feste Träger entfernt.
Die exponentielle Replikation der Sonde durch Q-beta-Replicase und der Nachweis wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt.

Beispiel IV

Die in diesem Beispiel verwendete Sonde 23 (Figur 8) ist eine einzelsträngige RNA, die so entworfen wurde, daß sie vier funktionell verschiedene Sequenzen enthält: die Sondensequenz 24 mit einer Länge von etwa 34 Nucleotiden, die erste Umschaltsequenz 25 von etwa 17 Nucleotiden, die der 5'-Seite der Sondensequenz direkt benachbart ist, die zur ersten Umschaltsequenz komplementäre und gleich lange zweite Umschaltsequenz 26, die sich direkt neben der 3'-Seite der Sondensequenz befindet, und die replizierbare RNA-Sequenz 27, die sich an der 3'-Seite der zweiten Umschaltsequenz befindet, wobei mindestens fünf Nucleotide der replizierbaren RNA-Sequenz auch Nucleotide der 3'-Seite der zweiten Umschaltsequenz sind, d.h. die replizierbare RNA-Sequenz überlappt die zweite Umschaltsequenz.
Freilegung der Zielsequenz, Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz und Trennung von nichtgebundenen Sonden wurden unter auf dem Fachgebiet bekannten geeigneten Bedingungen wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt. Wie in Figur 9 gezeigt, hybridisiert die Sondensequenz 24 mit der Zielsequenz 8, wobei die Umschaltsequenzen 25 und 26 gezwungen werden, sich zu trennen, und die replizierbare RNA-Sequenz 27 freigesetzt wird. Die replizierbaren RNA-Sequenzen der gebundenen Sonden wurden an dieser Stelle keiner exponentiellen Replikation durch eine RNA-Polymerase unterworfen, selbst wenn die Schalter geöffnet waren. Damit sie einer exponentiellen Replikation unterworfen werden können, müssen die replizierbaren RNA-Sequenzen 27 an ihrer 5'-Seite gespalten werden (Nishihara, T., Mills, D.R. und Kramer, F.R., Localization of the Q-beta Replicase Recognition Site in MDV-1 RNA, J. Biochem. 93 (1983), 669-674).
Zur Spaltung der replizierbaren RNA-Sequenzen gibt es mindestens zwei Verfahren. Ein Verfahren ist die Ribozym-Spaltung. Das andere Verfahren ist die Spaltung durch die Ribonuclease H. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bevorzugen ersteres Verfahren, das auch zuerst beschrieben wird.

A. Ribozym-Spaltung

Ribozyme sind strukturierte RNA-Moleküle, die eine chemische Reaktion katalysieren können, insbesondere die Spaltung einer Phosphodiester- Bindung. Auf dem Fachgebiet ist es wohlbekannt, daß ein Ribozym durch die Wechselwirkung von zwei Oligoribonucleotiden konstruiert werden kann, wobei bei Inkubation unter bekannten geeigneten Bedingungen eines der beiden Oligoribonucleotide an einer bestimmten Phosphodiester-Bindung gespalten wird (Uhlenbeck, O.C., A Small Catalytic Oligoribonucleotide, Nature 328 (1987), 590-600; Haseloff, J. und Gerlach, W.L., Simple RNA Enzymes with New and Highly Specific Endoribonuclease Activities, Nature 334 (1988), 585- 591).
Die erforderlichen Eigenschaften der zwei Bereiche eines aktiven Ribozyms sind in den beiden vorstehend zitierten Literaturstellen umrissen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die zweite Umschaltsequenz der erfindungsgemäßen Sonde so entworfen, daß sie die erforderlichen Eigenschaften der gespaltenen Sequenz aufweist. Die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung für die weiteren Untersuchungen gewählte replizierbare RNA-Sequenz ist MDV-Poly(+)-RNA nach Lizardi et. al., vorstehend. Der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bevorzugte Entwurf ist in Figur 8 gezeigt. Wie in Figur 8 gezeigt, weist die zweite Umschaltsequenz eine Länge von 17 Nucleotiden auf, wobei 11 Nucleotide der 5'-Seite der MDV-Poly(+)-RNA gleichzeitig Nucleotide der 3'-Seite der zweiten Umschaltsequenz darstellen. Die zweite Umschaltsequenz umfaßt die Sequenz GUC, die zur Spaltung der an der 3'-Seite der Sequenz GUC, d.h. an der 5'-Seite der replizierbaren RNA-Sequenz, befindlichen Phosphodiester-Bindung erforderlich ist. Beim Entwurf der zweiten Umschaltsequenz bemühte man sich, sicherzustellen, daß die anschließende Hybridisierung zur Ribozymbildung mit größerer Wahrscheinlichkeit erfolgt als die möglicherweise auftretende Wechselwirkung zwischen den Seiten der replizierbaren RNA-Sequenz.
Die Sonde kann durch Transkription eines geeigneten rekombinanten Plasmid hergestellt werden. Ein solches Plasmid wird unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren unter Berücksichtigung der Kriterien von Lizardi et al., vorstehend, entworfen und mittels Verfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982), Gold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York).
Der nichtgespaltene Strang 28, der das benötigte Ribozym bilden kann, ist auch in Figur 9 gezeigt. Der Strang wird mittels Verfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind (Milligan, J.F., Duncan, R.G., Witherell, G.W. und Uhlenbeck, O.C., Oligoribonucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase and Synthetic DNA Templates, Nucleic Acids Research 15 (1987), 8783-8798). Figur 10 zeigt die Nucleotidsequenz des Ribozyms, das von der Umschaltsequenz 26 und dem Strang 28 von Figur 9 gebildet wird.
Nach der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bevorzugten Abtrennung nichtgebundener Sonden wurde der vorstehend beschriebene nichtgespaltene Strang 28 mit der Probe unter auf dem Fachgebiet bekannten Bedingungen inkubiert, die die Hybridisierung dieses Stranges mit der zweiten Umschaltsequenz in mit Zielsequenzen hybridisierten Sonden fördern, wobei das gewünschte Ribozym gebildet wurde. Durch eine Inkubation unter den vorstehend erwähnten bekannten Bedingungen wird die replizierbare RNA von diesen Sonden abgespalten, wodurch die replizierbare RNA als Matrize zur exponentiellen Replikation durch Q-beta -Replicase dienen kann. In Figur 10 erfolgt die Spaltung im Strang 26 zwischen dem sechsten und siebenten Nucleotid von links, wie in der Figur gezeigt. Exponentielle Replikation und Nachweis erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben.

B. Ribonuclease H-Spaltung

Die für diese Ausführungsform verwendete Sonde kann mit der in Figur 8 gezeigten und vorstehend beschriebenen Sonde identisch sein. In dieser Ausführungsform wurde die im Handel erhältliche Ribonuclease H von Escherichia coli verwendet, die einen RNA-Strang im Falle einer Hybridisierung mit einem kurzen DNA-Oligonucleotid innerhalb des hybridisierten Bereichs spaltet (Donis-Keller, H., Site Specific Enzymatic Cleavage of RNA, Nucleic Acids Res. 7 (1979), 179-192).
Um dies auszunutzen, wurde das kurze DNA-Oligonucleotid 29 (Figur 11) von etwa 12 Nucleotiden synthetisiert, das mit der zweiten Umschaltsequenz an beiden Seiten der Sequenz GUC hybridisiert.
Nach der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bevorzugten Abtrennung nichtgebundener Sonden wurde das kurze DNA-Oligonucleotid 29 mit der Probe unter wohlbekannten Bedingungen inkubiert, die seine Hybridisierung (Figur 11) mit der zweiten Umschaltsequenz fördern. Während einer Inkubation unter bekannten Bedingungen (Donis-Keller, vorstehend) wurde dann die Ribonuclease H zur Katalyse der Spaltung zugegeben. Die exponentielle Replikation durch Q-beta-Replicase und der Nachweis erfolgten wie in Beispiel I beschrieben.

Beispiel V

Dieses Beispiel ähnelt Beispiel IV-A, wobei allerdings beide Ribozymsequenzen Teile der Sonde sind. Die Sonde 30 (Figur 12) ist eine einzelsträngige RNA, die wie in Beispiel IV beschrieben hergestellt wurde, jedoch so entworfen wurde, daß sie fünf Sequenzen enthält: die Sondensequenz 31 mit einer Länge von etwa 34 Nucleotiden, die etwa 17 Nucleotide lange erste Umschaltsequenz 32, wobei der nichtgespaltene Strang 28 die in Figur 9 gezeigte Sequenz aufweist, die etwa 17 Nucleotide lange zweite Umschaltsequenz 33, die wie in Beispiel I zur ersten Sequenz komplemetär ist, die Spacersequenz 34 von etwa 45 Nucleotiden, die sich an der 3'-Seite der zweiten Umschaltsequenz erstreckt, und die replizierbare RNA-Einheit 35. Die sechs Nucleotide an der 3'-Seite der Spacersequenz sind mit den sechs Nucleotiden an der 5'-Seite der in Figur 9 gezeigten zweiten Umschaltsequenz identisch. Der Bereich, in dem die Spacersequenz an die replizierbare RNA gebunden ist, umfaßt daher ebenso wie die zweite Umschaltsequenz 26 in Beispiel IV-A den spaltbaren Strang eines Ribozyms. In der nichtgebundenen Sonde hybridisiert die erste Umschaltsequenz 32 mit der zweiten Umschaltsequenz 33. In mit Zielsequenzen hybridisierten Sonden, wobei der Schalter geöffnet ist, ist die erste Umschaltsequenz 32 jedoch einer Hybridisierung mit dem Bereich zugänglich, in dem die 3'-Seite der Spacersequenz 34 an die 5'-Seite der replizierbaren RNA-Sequenz 35 gebunden ist, wobei ein Ribozym gebildet wird. Der Spacer 34 ist ausreichend lang ausgebildet, um diese Hybridisierung zu ermöglichen.
Freilegung der Zielsequenz, Hybridisierung der Sonden mit Zielsequenzen und die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bevorzugte Abtrennung nicht gebundener Sonden erfolgten wie in Beispiel I beschrieben. Nach Hybridisierung der Sonde mit einer Zielsequenz (Figur 13), hybridisieren die Umschaltsequenzen 32 und 33 nicht miteinander und es wird das Ribozym 36 gebildet.
Freisetzung der replizierbaren RNA, exponentielle Replikation und Nachweis erfolgten wie in Beispiel IV-A beschrieben.
Wie vorstehend angegeben, können die erfindungsgemäßen Tests qualitativ oder quantitativ sein. Wie für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, müssen zum qualitativen Nachweis einer vorher bestimmten Zielsequenz mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Verfahren die bei den Tests verwendeten biologischen und chemischen Reagenzien in leicht nachweisbaren Mengen verwendet werden, die zur Erzeugung eines reproduzierbaren, nachweisbaren Signals in einem empfindlichen Test ausreichen.
Zur quantitativen Bestimmung sollte die zugesetzte Sondenmenge die höchste erwartete Zielsequenz-Menge wesentlich übersteigen und die Inkubation sollte unter solchen Bedingungen durchgeführt werden, unter denen nahezu alle Zielsequenzen mit Sonden hybridisieren. "Nahezu alle" Zielsequenzen bedeutet einen sehr hohen Prozentsatz, der ausreicht, um den Test reproduzierbar zu machen. Ebenso sollte jeder der anschließenden Schritte einschließlich des Signalnachweises quantitativ sein. Zur Reproduzierbarkeit und auch zur Beseitigung der unspezifischen Hintergrundsignale sollten beispielsweise nahezu alle nichtgebundenen Sonden durch den Abbau der nichtgebundenen Sonden abgebaut werden. Zur quantitativen Bestimmung sollten bei den Transkriptions- und Replikationsschritten Reagenzien in ausreichender Menge verwendet werden. Zur Reproduzierbarkeit sollte die Zeitdauer der durchgeführten Schritte festgesetzt sein.
Oft umfassen sowohl qualitative als auch quantitative Tests mindestens eine parallel durchgeführte Negativkontrolle, d.h. einen Kontrolltest, der keine Zielsequenz enthält, und manchmal auch eine Reihe von Proben, die bekannte Zielsequenz-Mengen enthalten, wie z.B. Reihen von Proben mit geometrisch zunehmenden Mengen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Test-Kits, die sich unter Verwendung erfindungsgemäßer Sondenmoleküle zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung mindestens einer vorher bestimmten spezifischen Nucleinsäure-Zielsequenz verwenden lassen. Die Test-Kits umfassen bestimmte Mengen einer oder mehrerer Sonden, die mindestens drei notwendige, vorstehend beschriebene Sequenzen und mindestens ein zusätzliches biologisch aktives Molekül umfassen, beispielsweise einen DNA- Strang, einen Ribozymbildner, einen RNA-Strang oder ein Enzym, das sich zur Erzeugung eines Signals verwenden läßt, das auf eine Schalteröffnung hinweist. Die Kits können auch zusätzliche Reagenzien umfassen, beispielsweise Waschlösungen, Reagenzien und Substanzen zum Insolubilisieren, Reagenzien zur Amplifikation und Nachweisreagenzien. Reagenzien zur Amplifikation können Enzyme und Nucleotide umfassen. Nachweisreagenzien können markierte Nucleotide und farbstoffbildende Substrate umfassen. Für die Forschung entworfene Kits können Plasmide umfassen, die einem Forscher die Herstellung erfindungsgemäßer Sonden, die beliebige gewünschte Sondensequenzen enthalten, ermöglichen.

Claims

1. Sonde zum Nachweis einer vorherbestimmten Nucleinsäure- Zielsequenz, die umfaßt

(a) eine Sondensequenz von etwa 20 bis etwa 60 Nucleotiden mit einer 5'-Seite und einer 3'-Seite, die zu der Zielsequenz komplementär ist,

(b) eine erste Umschaltsequenz von etwa 10 bis etwa 40 Nucleotiden, die der 5'-Seite der Sondensequenz benachbart ist und an die 5'-Seite der Sondensequenz gebunden ist;

(c) eine zweite Umschaltsequenz von etwa 10 bis etwa 40 Nucleotiden, die dem 3'-Ende der Sondensequenz benachbart ist, wobei die zweite Umschaltsequenz zu der ersten Umschaltsequenz komplementär ist und an der 3'-Seite der Sondensequenz gebunden ist,

wobei im Falle einer Nicht-Hybridisierung der Sondensequenz mit der Zielsequenz die erste Umschaltsequenz mit der zweiten Umschaltsequenz hybridisiert ist, aber im Falle einer Hybridisierung der Sondensequenz mit der Zielsequenz unter Bildung einer Doppelhelix die Starrheit der Doppelhelix verhindert, daß die erste Umschaltsequenz mit der zweiten Umschaltsequenz hybridisiert, und wobei die erste Umschaltsequenz, die zweite Umschaltsequenz oder die erste und zweite Umschaltsequenz in Kombination eine im voraus ausgewählte Nudeinsäuresequenz oder -sequenzen als erforderliches Element eines signalerzeugenden Systems umfassen, das zur selektiven Erzeugung eines nachweisbaren Signals wertvoll ist, wenn die Sondensequenz mit der Zielsequenz hybridisiert.

2. Sonde nach Anspruch 1, wobei die Sondensequenz, die erste Umschaltsequenz und die zweite Umschaltsequenz aus einem Strang bestehen, der vollständig einzelsträngige DNA oder vollständig einzelsträngige RNA ist.

3. Sonde nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Umschaltsequenz und die zweite Umschaltsequenz zu der Sondensequenz direkt benachbart sind.

4. Sonde nach Anspruch 3, wobei die erste und zweite Umschaltsequenz direkt mit der Sondensequenz über Phosphodiesterbindungen verknüpft sind.

5. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine der ersten und zweiten Umschaltsequenzen im Falle einer Nichthybridisierung miteinander eine biologisch funktionelle Nucleinsäureeinheit umfaßt, die ein erforderliches Element eines signalerzeugenden Systems ist.

6. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zweite Umschaltsequenz eine zu einem Promotor komplementäre Sequenz für eine DNA-gerichtete RNA-Polymerase einschließt.

7. Sonde nach Anspruch 6, die ein einzelsträngiger DNA- Strang ist.

8. Sonde nach Anspruch 5, die ein einzelsträngiger DNA- Strang ist und bei der die zweite Umschaltsequenz einen Primer für eine DNA-gerichtete DNA-Polymerase einschließt.

9. Sonde nach Anspruch 5, die ein einzelsträngiger DNA- Strang ist und bei der die zweite Umschaltsequenz einen Primer für eine DNA-gerichtete RNA-Polymerase einschließt.

10. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zusätzlich umfassend eine von der zweiten Umschaltsequenz sich erstreckende replizierbare RNA-Sequenz, die nur dann als Matrize für eine exponentielle Replikation durch eine RNA-Polymerase dienen kann, wenn sie von der Sonde abgespalten ist.

11. Sonde nach Anspruch 10, umfassend eine Spacersequenz zwischen der zweiten Umschaltsequenz und der replizierbaren RNA-Sequenz, wobei die Spacersequenz an die replizierbare RNA-Sequenz gebunden ist, wobei die erste Umschaltsequenz einen Teil eines Ribozyms umfaßt und die Spacersequenz und die replizierbare RNA-Sequenz in dem Bereich, in dem sie miteinander verbunden sind, den Rest des Ribozyms umfassen.

12. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die ein einzelsträngiger DNA-Strang ist.

13. Sonde nach Anspruch 12, bei der die erste und zweite Umschaltsequenz im Falle einer Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für ein spezifisches Protein umfassen.

14. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 10 bis 11, bei der der einzelsträngige Nucleinsäurestrang ein RNA- Strang ist.

15. Sonde nach Anspruch 14, bei der die erste und zweite Umschaltsequenz im Falle einer Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für ein spezifisches Protein umfassen.

16. Sonde nach Anspruch 14, bei der die erste oder zweite Umschaltsequenz im Falle einer Nicht-Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für ein Oligodesoxyribonucleotid mit einer Funktion in einem signalerzeugenden System umfassen.

17. Sonde nach Anspruch 14, bei der die erste oder zweite Umschaltsequenz im Falle einer Nicht-Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für eine DNA mit einer Funktion in einem signalerzeugenden System umfassen.

18. Sonde nach Anspruch 14, bei der eine der ersten und zweiten Umschaltsequenzen im Falle einer Nicht-Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für eine RNA mit einer Funktion in einem signalerzeugenden System umfaßt.

19. Sonde nach Anspruch 14, umfassend eine RNA-Sequenz, die sich von einer Sequenz, die die erste oder zweite Umschaltsequenz ist, erstreckt und zu dieser benachbart ist, wobei die RNA-Sequenz und die ausgewählte Umschaltsequenz zusammen eine Bindungsstelle für eine zur Signalerzeugung notwendigen Nucleinsäuresequenz umfassen.

20. Sonde nach Anspruch 19, bei der die zur Signalerzeugung notwendige Nucleinsäuresequenz eine FNA ist.

21. Sonde nach Anspruch 20, bei der die Bindungsstelle und die zur Signalerzeugung notwendige RNA im Falle einer Hybridisierung eine Bindungsstelle für ein Protein bilden.

22. Sonde nach Anspruch 20, bei der die Bindungsstelle und die zur Signalerzeugung notwendige RNA im Falle einer Hybridisierung zusammen ein Ribozym umfassen.

23. Sonde nach Anspruch 22, bei der das Ribozym von der Sonde ein zur Signalerzeugung notwendiges RNA-Sondenfragment abspaltet.

24. Sonde nach Anspruch 23, bei der das RNA-Sondenfragment eine replizierbare RNA umfaßt.

25. Sonde nach Anspruch 19, bei der die zur Signalerzeugung notwendige Nucleinsäuresequenz ein Oligodesoxyribonucleotid ist.

26. Sonde nach Anspruch 25, bei der die Bindungsstelle und die zur Signalerzeugung notwendige Nucleinsäuresequenz im Falle einer Hybridisierung eine Proteinbindungsstelle bilden.

27. Sonde nach Anspruch 26, bei der die Proteinbindungsstelle eine Bindungsstelle für Ribonuclease H ist.

28. Sonde nach Anspruch 14, umfassend eine RNA-Sequenz, die sich von einer Sequenz erstreckt, die die erste oder zweite Umschaltsequenz ist und davon durch eine Spacersequenz von etwa 30 bis 70 Nucleotiden getrennt ist, wobei die RNA-Sequenz und die Spacersequenz eine Bindungsstelle für die andere Umschaltsequenz in der Form bilden, daß im Falle einer Hybridisierung die Bindungsstelle und die andere Umschaltsequenz zusammen ein zur Signalerzeugung erforderliches Ribozym umfassen.

29. Sonde nach Anspruch 28, bei der das Ribozym von der Sonde ein zur Signalerzeugung notwendiges RNA-Sondenfragment abspaltet.

30. Sonde nach Anspruch 29, bei der das RNA-Sondenfragment eine replizierbare RNA umfaßt.

31. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül, das eine Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 10 oder 11 enthält.

32. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 31, bei dem die erste Umschaltsequenz und die zweite Umschaltsequenz im Falle einer Hybridisierung miteinander eine allosterische Konfiguration ergeben, die die Replikation der RNA verhindert.

33. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 31, bei dem die erste und zweite Umschaltsequenz im Falle einer Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für ein spezifisches Protein umfassen.

34. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 33, bei dem das spezifische Protein eine Ribonuclease ist.

35. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 31, bei dem eine der ersten und zweiten Umschaltsequenzen im Falle einer Nicht-Hybridisierung miteinander eine Bindungsstelle für ein spezifisches Protein umfaßt.

36. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 35, bei dem das spezifische Protein ein Bakteriophagenprotein ist.

37. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 36, bei dem das Bakteriophagenprotein ein Hüllprotein des Bakteriophagen R17 ist.

38. Replizierbares rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 34, bei dem die Ribonuclease Ribonuclease III ist.

39. Verfahren zum Nachweis mindestens einer vorherbestimmten Nucleinsäure-Zielsequenz in einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält, umfassend die Schritte:

(a) Zugabe von Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 31, 33, 34 oder 38 zu der Probe,

(b) Durchführung einer spezifischen Hybridisierung der

(c) Zerstörung der Fähigkeit der Sonden, die nicht spezifisch mit der Zielsequenz in Schritt (b) hybridisierten, ein Signal zu erzeugen,

(d) Erzeugung eines Signals von Sonden, die spezifisch mit der Zielsequenz in Schritt (b) hybridisierten, und

(e) Nachweis des Signals.

40. Verfahren zum Nachweis mindestens einer vorherbestimmten Nucleinsäure-Zielsequenz in einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält, umfassend die Schritte:

(a) Zugabe von Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 9 bis 11, 14, 18 bis 20, 22 bis 24 oder 28 bis 32 zu der Probe,

(b) Durchführung einer spezifischen Hybridisierung der Sonden mit der Zielsequenz,

(c) exponentielle Replikation einer replizierbaren RNA, die die Gegenwart von Sonden anzeigt, die spezifisch mit der Zielsequenz in Schritt (b) hybridisierten, und

(d) Nachweis der Replikationsprodukte.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Sonde ein erster DNA-Strang ist, umfassend den zusätzlichen Schritt der Hybridisierung eines zweiten DNA-Stranges mit der zweiten Umschaltsequenz der Sonde, wobei der zweite DNA- Strang eine Matrize für die Transkription einer replizierbaren RNA vor Schritt (c) ist;.

42. Verfahren zum Nachweis mindestens einer vorherbestimmten Nucleinsäure-Zielsequenz in einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält, umfassend die Schritte:

(a) Zugabe von Sonden nach einem der Ansprüche 10, 11, 14 oder 16 bis 30 zu der Probe,

(c) Spaltung des RNA-signalerzeugenden Segments von den Sonden, die mit Zielsequenzen in Schritt (b) hybridisierten,

(d) Erzeugung eines verstärkten Signals unter Verwendung des RNA-signalerzeugenden Segments, und

(e) Nachweis des verstärkten Signals.

43. Testkit zur Durchführung eines Tests nach einem der Ansprüche 39 bis 42, umfassend eine ausreichende Menge von mindestens einer der Sonden, die einen geeigneten Nachweis der vorherbestimmten Nucleinsäure-Zielsequenz erlaubt, und mindestens ein zusätzliches biologisch aktives Molekül, das zur Erzeugung eines die Öffnung der Umschaltsequenz anzeigenden Signals erforderlich ist, und gegebenenfalls zusätzliche Reagenzien, wie Waschlösungen, Insolubilisierungsreagenzien, Amplifizierungsreagenzien und Nachweisreagenzien.

44. Testkit nach Anspruch 43, der zusätzlich eine Menge einer geeigneten RNA-Replicase umfaßt.