DE60027322T2

DE60027322T2 - Verfahren zur erkennung von zielnukleinsauren

Info

Publication number: DE60027322T2
Application number: DE60027322T
Authority: DE
Inventors: Isao Kawasaki-shi KARUBE; Teru Yokohama-shi KATO
Original assignee: Katayanagi Institute
Current assignee: Katayanagi Institute
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: EP1243659B1; US7303867B2; EP1243659A4; CA2394428A1; WO2001044509A1; JP4679022B2; AU1891701A; DE60027322D1; US20030170650A1; EP1243659A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Nucleotidsequenzen (nachstehend als "Ziel-Nucleotidsequenzen" bezeichnet) in einer Probe.
Stand der Technik
Verfahren zur Analyse von Nucleotidsequenzen auf der Grundlage ihrer Komplementarität ermöglichen die direkte Analyse von genetischen Merkmalen. So sind derartige Verfahren zur Diagnose von genetischen Krankheiten, der Krebsbildung, von Mikroorganismen usw. äußerst nützlich. Zusätzlich können Verfahren zur Amplifikation von Nucleotidsequenzen, wie PCR, angewandt werden, da derartige Verfahren einen Nachweis mit hoher Empfindlichkeit ohne Verfahrensweisen ermöglichen, anders als die Zellkultivierung, die viel Zeit und Mühe erfordert.
Verschiedene Verfahren zum Nachweis einer Hybridisierung von komplementären Nucleotidsequenzen sind mitgeteilt worden. Das grundlegendste Reaktionsprinzip, das in großem Umfang verwendet wird, ist die Southern-Blot-Analyse, bei der eine Proben-DNA auf einem Nitrocellulose-Filter immobilisiert wird, welcher mit einer markierten Sonde umzusetzen ist. Wenn die Proben-DNA eine zu der Sonde komplementäre Nucleotidsequenz enthält, wird die markierte Sonde durch Hybridisierung auf dem Nitrocellulose-Filter eingefangen. Eine Sonde zum Einfangen von Proben-DNAs kann verwendet werden, um sich die Mühe zu ersparen, die Proben-DNAs zu immobilisieren. In derartigen Fällen wird die markierte Sonde in der folgenden Reihenfolge eingefangen: [Festphase] – [Einfangsonde] – [Proben-DNA] – [markierte Sonde]. Unabhängig von der Art der zu verwendenden Methode ist ein übliches Problem die Adsorption von markierten Sonden auf der Festphase, unabhängig von der Ziel-Nucleotidsequenz. Die unspezifische Adsorption von markierten Sonden ist der Hauptfaktor für eine verringerte Nachweisempfindlichkeit. Demgemäß werden Hybridisierungen typisch in einer Reaktionslösung durchgeführt, die eine große Menge von Trägern mit nicht verwandten Nucleotidsequenzen umfasst. Weiter wird der Einfluss von unspezifischer Adsorption durch gründliches Durchführen eines Waschens nach der Hybridisierung unterdrückt. Jedoch sind diese Maßnahmen nicht ausreichend.
Weiter sind Verfahren zur Analyse von Nucleinsäuren in der Technik bekannt, welche nicht die Abtrennung von nicht-hybridisierten markierten Sonden vom Target erfordern. Zum Beispiel ist ein Verfahren zum Nachweis der Homogenität auf der Grundlage des Unterschieds des Signals einer fluoreszierenden Markierung, das sich aufgrund des Zustands der Ketten ändert (d.h. einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäuren), von praktischem Nutzen. Die Empfindlichkeit des Verfahrens wird durch das Hintergrundsignal beeinflusst. Deshalb ist das Problem des Verfahrens, dass es schwierig ist, mit diesem Verfahren eine hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Demgemäß wird das Verfahren typisch nur verwendet, wenn die zu analysierende DNA durch Verfahren wie PCR voramplifiziert worden ist.
Andererseits ist mit dem Fortschritt des Human Genome Project dem Einzelnucleotid-Polymorphismus (nachstehend als SNP abgekürzt) aufgrund der Möglichkeit, dass der Unterschied der therapeutischen Wirkung eines Arzneistoffs einschließlich Nebenwirkungen und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Prädisposition für verschiedene Krankheiten durch einen SNP erklärt werden kann, Aufmerksamkeit gewidmet worden. Zum Beispiel können, wenn eine ernsthafte Nebenwirkung eines Arzneistoffs durch eine genetische Prädisposition auf der Grundlage eines SNP beeinflusst wird, Unfälle aufgrund der Verabreichung des Arzneistoffes vermieden werden, indem die Patienten bezüglich der Anwesenheit des SNP, der mit der Nebenwirkung assoziiert ist, analysiert werden. Der Ausdruck "SNP" bezeichnet einen Einzelnucleotid-Polymorphismus in Nucleotidsequenzen des Genoms. Es ist vorgeschlagen worden, dass das menschliche Genom, das 3 Milliarden Nucleotide umfasst, etwa alle 1000 Nucleotide einen SNP enthält. Der Ausdruck "SNP" bezeichnet wörtlich einen Einzelnucleotid-Unterschied im Genom. Tatsächlich sind sehr fortschrittliche Techniken erforderlich, um Einzelnucleotid-Unterschiede präzise zu erfassen. Zwei Nucleinsäuren mit zueinander komplementären Nucleotidsequenzen hybridisieren selbst dann, wenn die zwei Sequenzen nicht perfekt zueinander komplementär sind. Deshalb wurde gefunden, dass der direkte Nachweis von Einzelnucleotid-Unterschieden durch das oben beschriebene Hybridisierungsverfahren schwierig ist.
Derzeit umfasst das Verfahren zum Nachweis bekannter SNPs das PCR-SSCP-Verfahren. Dieses Verfahren erfordert die Isolierung durch Elektrophorese und ist demgemäß nicht für die Behandlung von Personen in großem Maßstab geeignet. Demgemäß ist ein neues SNP-Nachweisverfahren ohne einen derartigen Nachteil in der Technik erforderlich.
In der Technik ist auch ein Phänomen bekannt, bei dem eine Nucleinsäure mit einer spezifischen Struktur spezifisch an Proteine bindet, und zwar auf der Grundlage eines anderen Prinzips als desjenigen der Wasserstoffbrücken-Bindungsbildung zwischen komplementären Nucleotidsequenzen. Eine derartige Affinität der Nucleinsäure wird in dem SELEX-Verfahren (systemische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) zur Selektion von Nucleinsäure-Molekülen mit hoher in-vitro-Affinität verwendet (Nature 355, 564–566, 1990). Eine Nucleinsäure mit einer hohen Bindungsaffinität zu einem Liganden kann durch das SELEX-Verfahren durch eine wiederholte Umsetzung erzielt werden, welche die Schritte des In-Kontakt-Bringens des Liganden mit einer Bibliothek von RNAs mit statistischen Nucleotidsequenzen, dann des Gewinnens der RNAs, die an den Liganden gebunden sind, des Amplifizierens der gewonnenen RNAs mittels RT-PCR, des Transkribierens der RNAs unter Verwendung der amplifizierten und gereinigten Produkte als Matrizen und des In-Kontakt-Bringens der transkribierten RNAs mit dem Liganden umfasst. Jedoch ist es nicht allgemein bekannt, dass derartige Nucleinsäure-Moleküle mit selektierter Affinität in verschiedenen Hybridisierungsassays verwendet werden können. Insbesondere gibt es keinen Bericht, der die Möglichkeit anzeigt, dass derartige Nucleinsäure-Moleküle beim Nachweis von SNPs anwendbar sind, bei dem die Unterscheidung eines einzigen Nucleotids erforderlich ist.
Offenbarung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Prinzip bereitzustellen, das auf einem neuen Konzept zum Nachweis einer Ziel-Nucleotidsequenz beruht, welche eine spezifische Sequenz umfasst. Spezieller ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, die Bindungsaffinität von Nucleinsäuren in einem Verfahren zum Nachweis von Ziel-Nucleotidsequenzen zu verwenden; die Bindung wurde von den gegenwärtigen Erfindern entdeckt, und es wurde gefunden, dass die Bindung auf einem anderen Prinzip als jenem der Hybridisierung zwischen komplementären Nucleotidsequenzen beruht. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von SNPs auf der Grundlage dieses neuen Prinzips bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Nucleinsäuren mit einer neuen Struktur bereitzustellen, die für eine Liganden-Bindungsaktivität verantwortlich ist, wodurch sie für den Nachweis von Nucleinsäuren nützlich ist.
Die gegenwärtigen Erfinder kamen auf die Idee, dass die Struktur einer Nucleinsäure, wie einer DNA, und verschiedene biochemische Aktivitäten derartiger Nucleinsäuren als neues Mittel verwendet werden können, um ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren auf Nucleotidsequenz-spezifische Weise zu errichten. Dann bestätigten sie, dass die Bindungsaffinität einer Nucleinsäure gegenüber Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht von der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure abhängt, die eine spezifische Struktur ausbildet, wobei die Bindungsaffinität in großem Maß durch die Substitution lediglich eines einzigen Nucleotids variiert wird. Auf der Grundlage dieses Befunds entdeckten die gegenwärtigen Erfinder, dass ein spezifischeres Verfahren zum Nachweis von Nucleotidsequenzen durch Verwenden der Liganden-Bindungsaffinität von Nucleinsäuren in Hybridisierungsassays erstellt werden kann. Weiter entdeckten die gegenwärtigen Erfinder auch, dass SNPs durch das Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren auf der Grundlage der Bindungsaktivität gegenüber den Liganden nachgewiesen werden konnten; und machten die vorliegende Erfindung. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren, die Anwendung dieses Verfahrens auf den Nachweis von SNPs und Nucleinsäuren mit einer neuen Struktur, welche die Nachweisverfahren ermöglichen, wie folgt:
[1] ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleotidsequenz, wie in Anspruch 1 definiert.
[7] ein Nucleinsäureaptamer, wie in Anspruch 7 definiert.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Oligonucleotids beim Nachweis einer Ziel-Nucleotidsequenz, wobei das Oligonucleotid ein Nucleinsäure-Aptamer mit Bindungsaffinität zu einem Liganden durch Hybridisierung mit der Ziel-Nucleotidsequenz bilden kann.
Hierin bezeichnet der Ausdruck "Nucleinsäure-Aptamer" eine Nucleinsäure mit einer Bindungsaktivität zu einen Liganden. Der Ausdruck "Nucleinsäure-Aptamer" bezeichnet ein Nucleinsäure-Molekül mit mindestens einem Paar intramolekularer oder intermolekularer komplementärer Nucleotidsequenzen und einer Affinität zu einem Liganden aufgrund der Hybridisierung der komplementären Nucleotidsequenzen. Ein repräsentatives Nucleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung besteht aus einem doppelsträngigen Abschnitt (Hybrid), der durch die Hybridisierung der oben erwähnten komplementären Nucleotidsequenzen gebildet ist, und einem einzelsträngigen Abschnitt, der kein Hybrid bildet. Das Nucleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung bildet im Allgemeinen durch Wasserstoffbrückenbindung, Basenstapelung oder hydrophobe Wechselwirkung eine für jedes Aptamer spezifische Konformation in dem oben erwähnten einzelsträngigen Abschnitt aus. Wechselwirkungen, die besonders für die Bildung der Konformation wichtig sind, sind Wasserstoffbrückenbindung und Basenstapelung. Darüber hinaus umfassen besonders wichtige Arten von Wasserstoffbrückenbindungen eine Basenpaarung, wie vom Watson-Crick-Typ, Nicht-Watson-Crick-Typ, und ein G-Quartett.
Die Bindungsaffinität eines Nucleinsäure-Aptamers zu einem Liganden hängt von seiner Konformation ab. So bildet unter Bedingungen, bei denen es schwierig ist, das Nucleinsäure-Hybrid aufrecht zu erhalten, das Aptamer die Konformation nicht aus, wobei es seine Bindungsaffinität verliert. Die Konformation von Nucleinsäure-Aptameren wird allgemein in drei Klassen eingeteilt: (1) Stamm (oder Stiel)-Schleife, (2) Stamm (oder Stiel)-Ausbauchung und (3) Pseudoknoten. Ein Nucleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt eine Nucleotidsequenz, die eine Nicht-Stamm-Struktur bildet, wie zum Beispiel eine Schleife, eine Ausbauchung, ein Basenpaar vom Nicht-Watson-Crick-Typ, in der Nähe der komplementären Nucleotidsequenz; und die Nicht-Stamm-Struktur stellt eine Liganden-Bindungsstelle oder einen Teil derselben dar. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Nicht-Stamm-Struktur" alle Konformationen außer dem Stamm, der aus dem Basenpaar vom Watson-Crick-Typ (DNA vom B-Typ) besteht. Spezieller weist ein Nucleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung bevorzugt eine Stamm-Verbindungs-Struktur (oder Stiel-Kreuzungs-Struktur) auf und bindet an der Verbindungs-Einheit an einen Liganden. Die Stamm-Verbindungs-Struktur ist eine Struktur, die sowohl die Stamm-Schleifen-Struktur als auch die Stamm-Ausbauchungs-Struktur umfasst.
Andererseits kann ein Ligand der vorliegenden Erfindung jede Verbindung außer Nucleinsäuren sein, die an die dreidimensionale Struktur eines Nucleinsäure-Aptamers binden kann. Speziell sind Nucleinsäure-Aptamere mitgeteilt worden, welche eine Bindungsaffinität zu verschiedenen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zusätzlich zu Proteinen zeigen. Früher mitgeteilte Liganden für Nucleinsäure-Aptamere sind nachstehend angeführt:
Aminosäuren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3680–3684, 1993);
Nucleotide (Nature 364, 550–553, 1993; Biochemistry 34, 656–655, 1995);
Coenzym A (Biochemistry 37, 4653–4663, 1998);
Theophyllin (Science 263, 1425–1429, 1994);
Aminoglycosid-Antibiotika (Biochemistry 35, 12338–12346, 1996);
Organische Farbstoffe (Nature 355, 850–852, 1992); und
Prophyrin-Derivate (Biochemistry 35, 6951–6922, 1996).
Es ist bekannt, dass einige Proteine und Farbstoffe an doppelsträngige Nucleinsäuren binden. Einige Proteine, wie MutS, erkennen Fehlpaarungen in doppelsträngigen Nucleinsäuren und binden sich an diese. Die Liganden der vorliegenden Erfindung umfassen nicht Liganden, welche eine Struktur erkennen, die nur aus einem Paar von komplementären Nucleotidsequenzen besteht. Bekannte Nucleinsäure-Aptamere, die an derartige Liganden binden, können im Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Weiter entdeckten die gegenwärtigen Erfinder, wie nachstehend beschrieben, dass Cholsäure durch eine Dreiwege-Verbindung, die aus Nucleinsäuren zusammengesetzt ist, als Ligand eingefangen wird. Eine Struktur, die durch die Nucleotide gebildet wird und mit fett gedruckten Buchstaben in 2 angezeigt ist, ist die Dreiwege-Verbindung (oder Drei-Stämme-Verbindung). Der Ausdruck "Dreiwege-Verbindung" (oder Dreiwege-Kreuzung) bezeichnet eine Struktur, bei der sich drei doppelsträngige Nucleinsäure-Ketten an einem einzigen Punkt als Ergebnis der Doppelstrang-Bildung zwischen den drei Nucleinsäure-Ketten schneiden. Speziell schneiden sich die drei Stämme (doppelsträngigen Ketten) an einem einzigen Punkt, und die drei komplementären Basenpaare, die aus sechs Nucleotiden bestehen, bilden die Dreiwege-Verbindung. Die drei Nucleinsäure-Ketten können eine einzelsträngige Nucleinsäure sein, die eine Stamm-und-Schleifen-Struktur umfasst (6b), oder alternativ kann sie aus drei unabhängigen Nucleinsäure-Ketten gebildet sein (6a).
Weiter kann eine Struktur erwähnt werden, in der ein Einzelstrang, der eine Stamm-Schleife umfasst, an einen weiteren Einzelstrang unter Bildung von zwei Stämmen hybridisiert ist (d.h., zwei willkürliche Nucleinsäure-Ketten der drei Ketten in 6a bilden eine Schleife). Obwohl es bekannt ist, dass tRNAs oder dergleichen eine ähnliche Struktur bilden, entdeckten die gegenwärtigen Erfinder zum ersten Mal, dass die Verbindungsregion einen Liganden einfängt. Das Nucleinsäure-Aptamer mit der neuen Struktur ist eines der bevorzugten Nucleinsäure-Aptamere, das im Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Um ein Nucleinsäure-Aptamer für den Nachweis einer Ziel-Nucleotidsequenz zu verwenden, ist das Aptamer so konstruiert, dass die Struktur des Nucleinsäure-Aptamers sich abhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Ziel-Nucleotidsequenz ändert, was die Änderung der Bindungsaffinität zu einem Liganden zur Folge hat. Zum Beispiel erfordert das Nucleinsäure-Aptamer, dass die oben beschriebenen Dreiwege-Verbindungs-Struktur bildet, die von den gegenwärtigen Erfindern neu gefunden worden ist, dass alle drei Basenpaare, die in der Verbindungs-Einheit ausgebildet sind, perfekt komplementär zueinander sind, um die Bindung des Liganden sicherzustellen. Weiter sind zum Erhalt einer hohen Affinität bevorzugt zwei der drei Basenpaare in der Verbindung G-C-Paare. Da entweder das eine oder das andere der zwei Paare mit einer Sonde versehen sein kann, sollte das verbleibende Paar unter Verwendung der G- oder C-Reste in der Ziel-Nucleotidsequenz gebildet werden. Mit anderen Worten ist es, um eine Ziel-Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung nachzuweisen, vorzuziehen, die Sonde so zu konstruieren, dass die Verbindung am G- oder C-Rest in der Ziel-Nucleotidsequenz gebildet wird und der Teil der Sonde, der der Verbindung entspricht, ein G-C-Paar ist.
Alternativ können, wenn ein Teil der Ziel-Nucleotidsequenz, der aus einer Sequenz von G und C besteht (d.h. GG, GC, CG oder CC), als die Nucleotide verwendet werden kann, welche die Verbindung darstellen, die Nucleotide der Sonde, welche die Verbindung bilden, ein willkürliches Basenpaar vom Watson-Crick-Typ sein. Natürlich kann, falls möglich, unzweifelhaft eine hohe Affinität erhalten werden, wenn G-C-Paare für alle drei Basenpaare der Verbindung verwendet werden.
Weiter ist festgestellt worden, dass eine höhere Affinität erhalten werden kann, indem die zwei Stränge, welche den Stamm-Teil ausmachen, vollständig komplementär zueinander sind. Andererseits üben die Nucleotide der Schleifen-Einheit nahezu keinen Einfluss auf die Affinität aus. So dient die Bindungsaktivität gegenüber den Liganden als ein Index, um die Existenz einer Ziel-Nucleotid sequenz zu erfassen, wenn das Erfordernis zur Aufrechterhaltung der Affinität der Bindungsaktivität von der Existenz der Ziel-Nucleotidsequenz abhängt.
Speziell wird irgendeine der drei DNA-Ketten, welche die Dreiwege-Verbindung bilden, als Ziel-Nucleotidsequenz bereitgestellt, und die verbleibenden zwei werden als Sonden bereitgestellt; so kann die Stamm-Verbindung nur gebildet werden, wenn die Ziel-Nucleotidsequenz und die Sonde miteinander hybridisieren. Zum Beispiel liefert eine Sonde, die eine Stamm-Schleifen-Struktur und komplementäre Nucleotidsequenzen, die für die Hybridisierung mit einer Ziel-Nucleotidsequenz erforderlich sind, in den einzelsträngigen Einheiten enthält, welche die Stamm-Schleifen-Struktur flankieren, eine Dreiwege-Verbindung durch Hybridisierung mit der Ziel-Nucleotidsequenz. Mit anderen Worten ist sie eine T-förmige Sonde, die eine intramolekulare doppelsträngige Struktur umfasst, die durch die komplementären Nucleotidsequenzen im zentralen Abschnitt zwischen den einzelsträngigen DNAs und den zwei flankierenden einzelsträngigen Einheiten gebildet ist, welche aus Nucleotidsequenzen bestehen, die komplementär zur Ziel-Nucleotidsequenz sind. Wenn derartige Sonden verwendet werden, besteht die Drei-Stämme-Schleifen-Struktur nur aus einer Schleife, die innerhalb der Sonde ausgebildet ist. Jedoch beeinflussen die Nucleotide der Schleifen-Abschnitte der Drei-Stämme-Schleifen-Struktur die Bindungsaffinität zu einem Liganden nicht, wie es im Beispiel bestätigt wird. Demgemäß ist die Schleife zum Erwerb der Bindungsaffinität zu einem Liganden nicht wesentlich.
Bevorzugte Strukturen der Sonden, die ein erfindungsgemäßes Nucleinsäure-Aptamer aufgrund der Hybridisierung mit einer Ziel-Nucleotidsequenz bilden können, sind nachstehend angegeben:
Sonde A: – [T1] + [C] – [c] + [T2] –
Sonde B: – [T1] + [C] – und – [c] + [T2] –
Hierin zeigen [T1] und [T2] Nucleotidsequenzen an, die komplementär zu Nucleotidsequenzen sind, die einer Ziel-Nucleotidsequenz benachbart sind. [C] und [c] sind Nucleotidsequenzen, die zueinander komplementär sind. Das Zeichen "+" zeigt an, dass es nicht erlaubt ist, dass dazwischenliegende Nucleotide in der Region zwischen den Regionen liegen, die rechts und links von "+" angegeben sind. Andererseits können willkürliche dazwischenliegende Nucleotidsequenzen für Regionen vorliegen, die mit "–" markiert sind. Im Vergleich zur Sonde A fehlt Sonde B die [C] – [c]-Verknüpfung in Sonde A und besteht aus zwei getrennten Oligonucleotid-Molekülen. Eine Sonde mit einer derartigen Struktur bildet eine Verbindung, wenn drei Stämme durch Hybridisierung mit der komplementären Nucleotidsequenz in Anwesenheit einer Ziel-Nucleotidsequenz einander überschneiden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Sonde mit der folgenden Struktur als Sonde verwendet werden, welche das Nucleinsäure-Aptamer bildet.
– [T1] + [T2] –
[T1] und [T2] stellen Nucleotidsequenzen dar, die zu den Nucleotidsequenzen komplementär sind, welche an die komplementäre Nucleotidsequenz angrenzen, die eine Stamm-Struktur in der Ziel-Nucleotidsequenz bilden kann. Speziell können, wenn die Ziel-Nucleotidsequenz selbst ein Paar von komplementären Nucleotidsequenzen enthält, um eine Selbsthybridisierung innerhalb des Moleküls zu ermöglichen, Nucleotidsequenzen, die komplementär zu den Nucleotidsequenzen sind, die an 3' und 5' des Paars von komplementären Nucleotidsequenzen angrenzen, als Regionen gewählt werden, mit denen [T1] bzw. [T2] hybridisieren.
Um unter Verwendung des Nucleinsäure-Aptamers mit der Dreiwege-Verbindungs-Struktur einen SNP in einer Ziel-Nucleotidsequenz nachzuweisen, wird die Sonde so konstruiert, dass der nachzuweisende SNP in eben der Region angeordnet ist, welche der Dreiwege-Verbindung entspricht. Das Nucleinsäure-Aptamer mit einer derartigen Struktur ermöglicht es, ein Reaktionssystem zu erstellen, in dem die Bindungsaffinität zu einem Liganden unterscheidungskräftig in Abhängigkeit von der Anwesenheit des SNP geändert wird. Durch die Verwendung eines Nucleinsäure-Aptamers mit der Dreiwege-Verbindungs-Struktur der vorliegenden Erfindung kann man die charakteristische Struktur verwenden, in der als Ergebnis einer Fehlpaarung aufgrund eines SNP in einem Basenpaar die Liganden-Bindungsaffinität im Wesentlichen verloren geht, verglichen mit dem Fall, in dem das Basenpaar der Verbindungs-Einheit perfekt komplementär ist. Es können eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit von den Nucleinsäure-Aptameren erwartet werden, deren Bindungsaffinität in Abhängigkeit von dem Unterschied eines Einzelnucleotids wesentlich verändert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Hybridisierung einer Sonde mit einer Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung der Liganden-Bindungsaffinität als Index nachgewiesen. Jedes der bekannten Prinzipien von Bindungsassays ist auf die Bindung eines Nucleinsäure-Aptamers an den Liganden anwendbar. Einige Nachweisprinzipien werden nachstehend speziell beschrieben.
Inhomogene Systeme:
Ein Nucleinsäure-Aptamer, das durch die Hybridisierung zwischen einer markierten Sonde und einer Ziel-Nucleotidsequenz gebildet wird, kann durch einen Liganden auf einer festen Phase eingefangen werden. Der Nachweis der Ziel-Nucleotidsequenz wird durch den Nachweis der markierten Sonde erzielt, die auf der festen Phase eingefangen ist (oder in der flüssigen Phase verbleibt). Der Schritt des Einfangens der markierten Sonde auf einer festen Phase gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein üblicher Schritt bei bekannten Nucleinsäure-Hybridisierungsassays. Jedoch beruht die Bindung an die feste Phase gemäß der vorliegenden Erfindung auf einem anderen Prinzip als jenem der Hybridisierung zwischen komplementären Nucleotidsequenzen und ermöglicht so die Verwendung von viel effizienteren Waschbedingungen. Das heißt, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann man leicht Bedingungen auswählen, welche eine ausreichende Entfernung der markierten Sonde sicherstellen, die unspezifisch auf der festen Phase adsorbiert oder an den Liganden gebunden ist, selbst wenn das Waschen unter Bedingungen niedriger Stringenz durchgeführt wird, die keinen Einfluss auf die komplementäre Basenpaarung ausüben. Dies ermöglicht einen spezifischeren Nachweis mit niedrigeren Hintergrundsignalen.
Homogenes System:
Es ist bekannt, dass das Binden eines Moleküls an eine fluoreszierende Substanz eine Fluoreszenz-Polarisation ergibt. Unter Verwendung dieses Phänomens kann das Verfahren zum Nachweis von Ziel-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in einem homogenen System durchgeführt werden. Speziell kann eine Ziel-Nucleotidsequenz nachgewiesen werden, indem zuerst eine Sonde oder ein Ligand mit Fluoreszenz markiert wird und dann die Fluoreszenz-Polarisation nachgewiesen wird, die wegen der Bindung des Nucleinsäure-Aptamers und eines Liganden erzeugt wird. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen umfassen Fluoresceinisothiocyanat usw. Eine Verbindung, die Fluoreszenz emittiert, kann ebenfalls als Ligand verwendet werden. Zum Beispiel umfasst einer der bekannten Liganden, der mit einem Nucleinsäure-Aptamer bindet, Porphyrin-Derivate, von denen viele Fluoreszenz emittieren.
Oberflächen-Plasmonresonanz:
Das Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR)-Verfahren ist als Technik bekannt, um optisch die Bindung von Substanzen auf direktem Weg nachzuweisen. Der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR)-Sensor weist die Wechselwirkung von biologischen Molekülen auf der Grundlage der Änderungen des Brechungsindex des Mediums in der Nähe eines Metalldünnfilms nach. SPR tritt auf, wenn das Oberflächen-Plasmon an der Metall/Flüssigkeits-Grenze (Sensor-Oberfläche) angeregt wird. Die andere Oberfläche, die ohne Probe ist, wird Licht ausgesetzt, und das von der Oberfläche reflektierte Licht wird nachgewiesen. Die Intensität des reflektierten Lichts wird gemäß der spezifischen Kombination von Winkel und Wellenlänge in Abhängigkeit von der SPR verringert (Erzeugung des SPR-Signals). Der Brechungsindex nahe der Oberfläche wird aufgrund der Anwesenheit von an die Sensor-Oberfläche gebundenen Molekülen verändert; die Änderungen können als Änderungen des SPR-Signals beobachtet werden. Weitere Änderungen des Brechungsindex und des SPR-Signals resultieren aus der Wechselwirkung von biologischen Molekülen. Die Wechselwirkung von biologischen Molekülen kann durch Nachweis derartiger Signaländerungen gemessen werden. Gemäß dem Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung kann die Menge des Nucleinsäure-Aptamers, die durch die Hybridisierung zwischen einer Ziel-Nucleotidsequenz und einer Probe erzeugt wird, auf der Grundlage der Änderungen des SPR-Signals bestimmt werden. Bei der Ziel-Nucleotidsequenz, die für die Hybridisierung mit der Sonde verwendet wird, kann es sich um amplifizierte Produkte handeln, die durch Amplifikationsverfahren, wie PCR, erhalten werden. Verfahren zur Immobilisierung von Liganden auf einem Chip umfassen die Avidin-Biotin-Reaktion, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verwendung von SPR ermöglicht einen hoch empfindlichen Nachweis ohne jegliche Markierungssubstanz.
Sowohl bei den Nucleinsäure-Molekülen (die als Ziel-Nucleotidsequenz dienen) als auch den Sonden der vorliegenden Erfindung kann es sich um irgendeine Art von Nucleinsäure-Molekülen oder Derivaten davon handeln, solange die zwei Moleküle unter Bildung eines Nucleinsäure-Aptamers hybridisieren können. Speziell umfassen derartige Moleküle natürliche oder chemisch synthetisierte Nucleinsäure-Moleküle, wie RNA und DNA; RNA- oder DNA-Derivate, die aus synthetischen Nucleotid-Derivaten bestehen; Derivate, deren Hauptkette Peptid-Bindungen oder Alkylketten umfassen; usw. Diese Nucleinsäure-Moleküle oder deren Derivate können neben jenen, die von biologischen Proben abstammen, Produkte sein, die durch enzymatische Amplifikationsreaktionen von Nucleinsäuren, wie PCR- und NASBA-Verfahren, unter Verwendung von Nucleinsäure-Molekülen, welche von Proben abstammen, als Matrizen erhalten werden.
Die Sonden und Liganden, die erforderlich sind, um das Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung durchzuführen, können als Kit vorformuliert sein. Das Verfahren zum Nachweis von Ziel-Nucleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung kann Reagenzien enthalten, die zum Nachweis von Markierungen, Kontrollproben und anderen erforderlich sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den Prozentsatz an eluierter einzelsträngiger DNA in jeder Selektionsrunde demonstriert. Die Ordinate zeigt den Prozentsatz der eluierten DNA zur geladenen DNA an, und die Abszisse zeigt die Zahl der Runden an.
2 zeigt die vorhergesagten Sekundärstrukturen der Klone 1 und 2. Die Nucleotidsequenzen der Deletionsmutanten ch1-39 und ch2-38, welche die minimale Sequenz enthalten, die für die Bindung jedes Klons mit Cholsäure erforderlich ist, sind kursiv gedruckt. Die Nucleotidsequenzen der Deletionsmutanten ch1-47 und ch2-40, welche die gesamte Dreiwege-Verbindungs-Region enthalten, sind durch in Umrissen dargestellte Buchstaben angezeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Cholsäure-Bindungskurven von ch1-47 (offene Kreise) und ch2-40 (offene Quadrate) zeigt. Die Ordinate zeigt die Konzentration (μM) von Cholsäure an, die an die einzelsträngige DNA gebunden ist, und die Abszisse zeigt die Konzentration von einzelsträngiger DNA (μM) in logarithmischem Maßstab an.
4 stellt die vorhergesagten Sekundärstrukturen von Deletionsmutanten, Klone 5, 7, 9 und 11, dar, welche eine Dreiwege-Verbindungs-Region enthalten. Der Pfeil zeigt die minimale Nucleotidsequenz an, die für die Bindung der Klone 5 oder 9 an eine mit Säule immobilisierter Cholsäure erforderlich ist.
5 stellt das Ergebnis der Mutationsanalyse von ch2-40 dar. Mutationen wurden (a) durch Basenpaar-Substitution, (b) durch Einzelnucleotid-Substitution oder (c) durch Deletion/Insertion in ch2-40 eingeführt. Die substituierten oder deletierten Nucleotide sind mit fett gedruckten Buchstaben angezeigt. Der Pfeil und die Zahl zeigt das substituierte oder deletierte Nucleotid bzw. den Prozentsatz der Affinität eines mutierten ch2-40 mit Bezug auf nicht-mutiertes ch2-40 an.
6 stellt die Strukturen der 2G-C-Verbindung und 3G-C-Verbindung dar. Schaubild (a) stellt eine schematische Veranschaulichung der Struktur jeder Verbindung dar. Schaubild (b) stellt die Strukturen von ch9-48 und ch16-40 als Beispiele für die Verbindungen dar.
7 stellt eine Fotografie dar, welche die Modifikation der Thymin-Reste von ch9-48 und ch9-48-C6 mit Osmiumtetraoxid demonstriert.
Bahn 1: Kontroll-Nucleinsäure, die zu einem Einzelstrang denaturiert wurde;
Bahn 2: ch9-48 ohne Cholsäure;
Bahn 3: ch9-48 mit Cholsäure;
Bahn 4: ch9-48-C6 ohne Cholsäure;
Bahn 5: ch9-48-C6 mit Cholsäure; und
Bahn 6: A + G-Leiter von ch9-48, erhalten durch das Maxam-Gilbert-Verfahren.
8 stellt die vorhergesagte Sekundärstruktur von ch9-48 dar. Thymin (T) ist mit fett gedruckten Buchstaben angezeigt.
Die 9–21 stellen die Quellcode-Liste des Software-Programms dar, das in dem Beispiel zur Selektion von Nucleotidsequenzen verwendet wurde, die ein Nucleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung bilden.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend speziell anhand von Beispielen erläutert.
[Beispiel 1] Auswahl von an Cholsäure bindenden DNA-Aptameren mittels des SELEX-Verfahrens
(1) Verfahren zur Auswahl von DNA-Aptameren, die an Cholsäure binden
DNA-Aptamere, die spezifisch an Cholsäure binden, wurden mittels des SELEX-Verfahrens (Nature 355, 564–566, 1990) aus einem Einzelstrang-DNA (nachstehend als "ssDNA" bezeichnet) -Pool ausgewählt, der einzelsträngige 100-mer Oligonucleotide enthielt, die statistische Inserte von 64 Nucleotiden einschlossen (5'-GTACCAGCTTATTCAATT-N₆₄-AGATAGTATGTTCATCAG-3'; SEQ ID NO: 1) (N₆₄ stellt eine statistische Sequenz mit 64 Nucleotiden dar). Die Einzelstrang-DNA-Bibliothek enthielt etwa 9 × 10¹⁴ unabhängige Sequenzen. Die ssDNAs wurden durch das Phosphoamidat-Verfahren synthetisiert und wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Die 100-mer DNAs wurden durch Festphasenextraktion unter Verwendung von Umkehrphasen-Harzen gereinigt.
Jede Runde der Selektion wurde wie folgt durchgeführt. Zuerst wurde 100-mer Einzelstrang-Oligonucleotid mit einem statistischen Insert von 64 Nucleotiden in Selektionspuffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 30 mM KCl, 5 mM MgCl₂, pH 7,6) 5 min bei 95°C denaturiert und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die gefaltete ssDNA (45 μg im ersten Zyklus und 2 bis 3 μg in den anschließenden Zyklen) im Selektionspuffer wurde auf eine 500 μl-Cholsäure-Agarose-Säure geladen (2 μMol Cholsäure/g Gel; SIGMA; nachstehend als Selektionssäule abgekürzt), die mit mehr als 10 ml Selektionspuffer äquilibriert worden war. Nach 30-minütiger Äquilibrierung wurde die Säule mit 5 bis 10 Säulenvolumina des Selektionspuffers gewaschen. Die verbleibende ssDNA wurde mit 1,5 ml Selektionspuffer, der 5 mM Cholsäure enthielt, eluiert, gesammelt und dann mit Ethanol in Anwesenheit von 20 μg/ml Glycogen gefällt. Die Menge an spezifisch mit 5 mM Cholsäure eluierter ssDNA wurde durch UV-Extinktion der gesammelten Fraktionen bei 260 nm abgeschätzt. Die ssDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert.
Affigel 102, auf dem Cholsäure immobilisiert worden war, wurde anstelle von Cholsäure-Agarose in den Selektionsrunden 10 und 12 verwendet, um die ssDNAs zu eliminieren, die an den Aminohexyl-Linker von Cholsäure-Agarose binden. Die Immobilisierung des Aminoethyl-Linkers durch Cholsäure an Affigel 102 wurde wie folgt durchgeführt:
20 mg Cholsäure wurden mit 100 mg EDC als Kondensationsmittel in 10 ml 20 mM HEPES (pH 7,5) an 3 ml Affigel 102 gekuppelt. Die Mischung wurde 10 h unter gelegentlichem Bewegen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konzentration an Cholsäure auf Affigel 102 (8 μMol/ml Gel) wurde durch die Reaktion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure bestimmt. Das Affigel 102 mit immobilisierter Cholsäure wurde mit 3 Volumina Affigel 102 gemischt, um die Konzentration der Cholsäure in der Säule auf etwa 2 μMol/ml einzustellen.
Nach den Selektionsrunden 5, 6, 7 und 14 wurden ebenfalls Gegenselektionen vorgenommen, um die ssDNAs zu entfernen, die direkt an die Agarosematrix binden. Spezieller wurde ssDNA auf die Sepharose 4B-Kontrollsäule (SIGMA) geladen, um die ssDNAs zu entfernen, die an die Agarosematrix gebunden waren.
(2) Amplifikation durch PCR
PCR wurde unter Verwendung der Primer 5'-Biotin-CTGATGAACATACTATCT-3' (SEQ ID NO: 2) und 5'-GTACCAGCTTATTCAATT-3' (SEQ ID NO: 3) durchgeführt. 100 μl PCR-Mischung, die 1 Einheit Ex Taq DNA-Polymerase (TaKaRa), 60 pMol jedes Primers, 20 nMol jedes dNTP und 0,4 bis 0,8 μg Perfect Match (E. coli-ssDNA-bindendes Protein) (Stratagene) enthält, wurde dazugegeben, um die Zuverlässigkeit der Polymerasereaktion zu verbessern. Das thermische Cycling der PCR war 94°C über 30 s, 46°C über 30 s und 72°C über 30 s. Die amplifizierte biotinylierte doppelsträngige DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und zur Erzeugung von ssDNA an das auf einer Säule immobilisierte Avidin gebunden. Die erhaltenen ssDNAs wurden als Ausgangsmaterial für die anschließende Selektionsrunde verwendet. Diese Schritte wurden wiederholt, um die ssDNAs mit einer Bindungsaffinität zu Cholsäure anzureichern.
(3) Klonierung und Nucleotidsequenz-Analyse
Die PCR-Produkte der doppelsträngigen DNA, die aus der Bibliothek der Selektionsrunde 13 amplifiziert wurde, wurden in den pGEM-T-Vektor (Promega) kloniert, um ihre Sequenzen durch das Didesoxy-Verfahren zu bestimmen. Eine Sequenzhomologie-Analyse und die Vorhersage der Sekundärstrukturen der ssDNAs gemäß dem Verfahren der Minimierung der freien Energie wurde mittels des MacDNASIS Pro v1.0-Programms (HITACHI Software Engineering) erzielt. Die Suche nach komplementären Sequenzen, die drei Stämme in jedem Sequenz-Klon bilden, wurde mit einem Original-Computerprogramm durchgeführt, das in der Sprache C geschrieben ist. Die 9–21 zeigen die Quellcode-Liste des Computerprogramms. Weiter ist der Algorithmus des Computerprogramms nachstehend zusammengefasst.
Dieser Algorithmus bestimmt alle potentiellen Dreiwege-Verbindungs-Strukturen in einer gegebenen Nucleotidsequenz. Wie vorstehend beschrieben, stellt eine Dreiwege-Verbindungs-Struktur eine Struktur dar, die Stamm 1, Stamm 2 und Stamm 3 enthält, welche sich an einem einzigen Punkt schneiden (8). Gemäß dem Algorithmus werden zuerst mögliche Nucleotidsequenzen, die den Stamm 1 bilden, durch Wiederholung der Suche nach komplementären Nucleotidsequenzen abgeschätzt. Im nächsten Schritt, wenn der Stamm 1 gebildet werden konnte, wird die Suche nach einer Nucleotidsequenz, die den Stamm 2 bilden kann, in der verbleibenden Region durchgeführt. Wenn der Stamm 2 ebenfalls gebildet werden konnte, wird die Suche nach einer Nucleotidsequenz, die den Stamm 3 bilden kann, in der verbleibenden Region durchgeführt. Jeder Schritt der Suche wird wie folgt durchgeführt:
1) Bestimmung des potentiellen Stamms 1.
Die Suche wird vom 5'-Ende einer gegebenen Nucleotidsequenz aus begonnen und verläuft in Richtung des 3'-Endes, Nucleotid um Nucleotid. Jedes Nucleotid wird als Ausgangspunkt von Stamm 1 genommen, auch als Stamm 1 b bezeichnet, und die Möglichkeit der Stamm 1-Bildung wird wie folgt beurteilt. Speziell wird nach einer zum Stamm 1 b komplementären Nucleotidsequenz ausgehend vom 3'-Ende gesucht, und das komplementäre Nucleotid wird als Stamm 1 e bezeichnet, der terminale Rest des Stamms 1. Wenn eine Nucleotidsequenz mit der gleichen Länge von "minimaler Stamm-Länge" vom Stamm 1 b in Richtung des 3'-Endes komplementär zu der Nucleotidsequenz ist, die vom Stamm 1 e aus beginnt und sich in Richtung 5'-Ende erstreckt, wird angenommen, dass der Stamm 1 gebildet ist. Die "minimale Stamm-Länge" kann irgendein willkürlicher Wert sein.
2) Erhalten des potentiellen Stamms 2 wie folgt.
Ob ein Stamm 2 in der Sequenz der Region gebildet werden kann, welche jene ausschließt, die dem Stamm 1 entspricht, wird durch das gleiche Verfahren wie oben in 1) bestimmt. Jedoch ist es erforderlich, dass die Länge des Schleifenabschnitts im Stamm 2 die "minimale Schleifenlänge" oder mehr aufweist. Weiter wird der Stamm 2b, die Ausgangsposition von Stamm 2, so gewählt, dass die Entfernung zwischen dem Stamm 2b und dem Stamm 1 die "Zwischenraumgröße" oder weniger ist. Die "minimale Schleifenlänge" und "Zwischenraumgröße" können willkürliche Werte sein.
3) Erhalten des potentiellen Stamms 3 wie folgt.
Ob ein Stamm 3 in der Sequenz der Region gebildet werden kann, welche jene Regionen ausschließt, die den Stamm 1 und den Stamm 2 darstellen, wird durch dasselbe Verfahren wie oben in 2) bestimmt. Jedoch werden die Ausgangsposition von Stamm 3, Stamm 3b, und die Terminationsposition von Stamm 3, Stamm 3e, so gewählt, dass die Entfernung zwischen dem Stamm 3b und dem Stamm 2 sowie die Entfernung zwischen dem Stamm 3e und dem Stamm 2 die oben beschriebene "Zwischenraumgröße" oder weniger sind.
4) Experimentelles Ergebnis
Nach der ersten Selektionsrunde, wie oben beschrieben, wurde 1% oder weniger der aufgeladenen ssDNAs auf der Selektionssäule eingefangen. In den anschließenden Runden nahm die Menge der an Cholsäure gebundenen ssDNAs deutlich zu. In der Selektionsrunde 13 und in späteren Runden wurden etwa 70% der geladenen ssDNAs auf der Säule eingefangen und dann eluiert (1).
Nach Runde 13 wurden die Nucleotidsequenzen von 19 Klonen bestimmt, um eine gemeinsame Motivsequenz zu definieren, die für die Bindung mit Cholsäure verantwortlich ist. Die Sequenzen der 19 Klone waren voneinander vollständig verschieden, und es konnte mittels einer Primärsequenz-Homologiesuche unter Verwendung des MacDNAISIS-Programms keine signifikante Homologie unter den Sequenzen entdeckt werden. Jedoch wurden, wie in Tabelle 1 dargestellt, Sequenzen beobachtet, von denen angenommen wurde, dass sie Dreiwege-Verbindungen als Sekundärstruktur ausbilden. Drei Paare von Dreiwege-Regionen (Regionen, welche die doppelsträngige Kette darstellen) sind in den in Tabelle 1 gezeigten Nucleotidsequenzen unterstrichen, mit fett gedruckten Buchstaben angezeigt bzw. mit in Umrissen dargestellten Buchstaben angezeigt. Die kursiven Buchstaben zeigen fehlgepaarte oder Wobble (T-G)-Positionen in dem Stammbereich an.
Die jeweiligen SEQ ID NOs der in Tabelle 1 angegebenen Nucleotidsequenzen sind wie folgt:

a) Klon 1: SEQ ID NO: 8 Klon 2: SEQ ID NO: 9 Klon 5: SEQ ID NO: 10 Klon 7: SEQ ID NO: 11 Klon 9: SEQ ID NO: 12 Klon 11: SEQ ID NO: 13
b) Klon 2: SEQ ID NO: 14 Klon 4: SEQ ID NO: 15 Klon 6: SEQ ID NO: 16 Klon 8: SEQ ID NO: 17 Klon 10: SEQ ID NO: 18 Klon 12: SEQ ID NO: 19 Klon 13: SEQ ID NO: 20 Klon 14: SEQ ID NO: 21 Klon 15: SEQ ID NO: 22 Klon 16: SEQ ID NO: 23 Klon 17: SEQ ID NO: 24 Klon 18: SEQ ID NO: 25 Klon 19: SEQ ID NO: 26

[Beispiel 2] Suche nach Cholsäure-bindenden Motivsequenzen unter Verwendung von Deletionsmutanten von verschiedenen DNA-Aptameren
(1) Dissoziationskonstanten-Bestimmung
Die Affinität von Cholsäure zu ssDNAs wurde durch das Gleichgewichts-Filtrations-Verfahren (Science 263: 1425–1429, 1994) analysiert. Cholsäure wurde im Selektionspuffer (200 μl) bei einer Endkonzentration von 50 μM zu den DNA-Proben gegeben. Jede Bindungsmischung wurde 5 min bei 25°C inkubiert. Die Mischung wurde dann in eine Microcon 10-Filtrationsvorrichtung (Amicon) gegeben und 15 min bei 850 × g zentrifugiert. Die Cholsäure-Konzentrationen in 20 bis 30 μl Filtrat wurden durch ein Diagnosekit (WAKO Chemical) für die quantitative Bestimmung unter Verwendung von 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Diaphorase, welches p-Nitrotetrazoliumblau-Farbstoff und Nikotinamidadenindinucleotid einschloss, bestimmt. Bei jeder ssDNA-Probe wurde die Konzentration an gebundener Cholsäure (C_b) durch den Unterschied der Cholsäure-Konzentration zwischen dem Filtrat und dem Retentat bestimmt, der durch die folgende Gleichung (Gleichung 1) berechnet wurde: Cb (μM) = Cr – Cf = (10000 – Vf × Cf)/(200 – Vf) – Cf (worin V_f (μl) das Volumen des Filtrats ist; und C_r und C_f (μM) die Konzentrationen von Cholsäure im Retentat bzw. Filtrat darstellen).
Die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_d) wurden aus der folgenden quadratischen Standard-Bindungsgleichung (Gleichung 2) berechnet: Cb = (1/2){Dt + 50 + Kd – [(Dt + 50 + Kd)2 – 200Dt]1/2}(worin D_t die Gesamtkonzentration an ssDNA ist).
(2) Bestimmung der Affinität (Bindungskonstanten) von verschiedenen DNA-Aptamer-Deletionsmutanten zu Cholsäure
Um die minimale Sequenz zu bestimmen, die für die Bindung an Cholsäure erforderlich ist, stellten die gegenwärtigen Erfinder eine Reihe von Deletionsmutanten her, die von den Klonen 1 und 2 durch Entfernen eines oder mehrerer Nucleotide vom 5'- und 3'-Ende der Aptamere voller Länge abgeleitet waren. 0,5 nMol von Klon 1, Klon 2 und jeder der Deletionsmutanten wurden auf die Selektionssäule aufgetragen, und die Menge an ssDNA, die mit 5 mM Cholsäure spezifisch aus der Selektionssäule eluiert wurde, wurde gemessen (75% und 77% von Klon 1 bzw. 2 wurden spezifisch eluiert). Gemäß einem Experiment unter Verwendung der 39 mer-Deletionsmutanten von Klon 1, ch1-39 (5'-GAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATC-3'; SEQ ID NO: 4), und der 38 mer-Deletionsmutanten von Klon 2, ch2-38 (5'-GCGCCGATTGACCCAAATCGTTTTGTATGCAAAAGCGC-3'; SEQ ID NO: 5), wurde bestimmt, dass die Deletionsmutanten den minimalen Sequenzen entsprachen, die für die Bindung mit Cholsäure wesentlich waren. 22% und 40% ch1-39 bzw. ch2-38 wurden aus der Selektionssäule eluiert. Jedoch konnte keine Elution bei Deletionsmutanten mit kürzeren Sequenzen beobachtet werden. Interessanterweise wiesen die Sekundärstrukturen der Klone 1 und 2, die durch das MacDNASIS-Programm vorhergesagt wurden, eine Struktur auf, die durch die Bindung von 3 Stämmen mit mehr als 4 Basenpaaren gebildet waren, und sowohl ch1-39 als auch ch2-38 umfassten diese "Dreiwege-Verbindungs-"Region (2).
Dann stellten die gegenwärtigen Erfinder Deletionsmutanten der Klone 1 und 2 her, welche die intakten Sequenzen dieser Region einschlossen, und bezeichneten sie als ch1-47 (5'-GATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTC-3'; SEQ ID NO: 6) und ch2-40 (5'-AGCGCCGATTGACCCAAATCGTTTTGTATGCAAAAGCGCT-3'; SEQ ID NO: 7). Die Affinität dieser Mutanten zu Cholsäure wurde gemessen (3). Diese Mutanten zeigten eine Affinität zur Selektionssäule, die nahezu die gleiche war wie jene der Klone voller Länge (70% bzw. 73%). Aus Gleichung 1 und 2 und den Ergebnissen in 3 wurde die Dissoziationskonstante (K_d) für Cholsäure zu 31,0 μM und 19,6 μM für ch1-47 bzw. ch2-40 bestimmt. Weiter umfassten unter den vorhergesagten Sekundärstrukturen von 17 anderen sequenzierten Klonen mit Sequenzen voller Länge 4 Klone (die Klone 5, 7, 9 und 11) eine Dreiwege-Verbindung ähnlich jener von ch2-40 (4). Die Deletionsmutanten ch5-63, ch7-69, ch9-48 und ch11-76, welche die intakten Dreiwege-Verbindungs-Regionen dieser 4 Klone enthielten, wurden hergestellt, um ihre Dissoziationskonstanten für Cholsäure zu bestimmen (Tabelle 2).
Tabelle 2
Die Affinität der Klone 5 und 9 zu der Selektionssäule ging durch die Deletion weniger Nucleotide vom 5'- und 3'-Ende der Dreiwege-Verbindungs-Region verloren.
Die vorhergesagte Sekundärstruktur von Klon 11 war komplexer als die der anderen 5 Klone. Ein 35 mer-Mutantenoligomer von Klon 11 wurde durch Entfernung von Nucleotiden außer jenen der Dreiwege-Verbindungs-Region hergestellt, um die Dissoziationskonstante für Cholsäure zu bestimmen. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass die Dissoziationskonstante 76,8 μM beträgt, was mit jener der 76 mer-Deletionsmutanten vergleichbar ist (52,1 μM).
Durch Vergleich der vorhergesagten Dreiwege-Verbindungs-Strukturen der oben beschriebenen 6 Klone ergaben sich zwei gemeinsame Merkmale. Erstens wird eine hohe Affinität bereitgestellt, wenn die 3 Stämme und 2 Schleifen aus 4 Basenpaaren oder mehr aufgebaut sind. Zweitens wird die Affinität erhöht, indem die 3 Basenpaare, welche die Verbindung flankieren, 2 oder 3 GC-Basenpaare darstellen.
Weiter wurden die Sequenzen von weiteren 13 Klonen mit dem Computerprogramm auf der Basis des oben erwähnten Algorithmus analysiert. Die Bedingung zur Analyse durch das Programm war wie folgt. Zuerst wurde jede Sequenz mit der Anforderung durchsucht, dass die minimale Stamm 2-Länge 2 beträgt, die minimale Schleifenlänge 4 beträgt und die Zwischenraumgröße 0 beträgt. Dann wurden Nucleotidsequenzen, deren Verbindungs-Einheit zwei oder mehr GC-Basenpaare enthält und deren Stämme der Dreiwege-Verbindung gleichzeitig 3 Basenpaare oder mehr ausmachen, visuell (d.h. ohne Verwendung eines Programms) aus den Nucleotidsequenzen ausgewählt, welche die Anforderungen erfüllen. In diesem Stadium wurde nicht erlaubt, dass der Stamm Fehlpaarungen aufweist. Das heißt, wie bei ch1-47 erlaubte man, dass die Sequenzen Fehlpaarungen im dritten und im nachfolgenden Basenpaaren ab der Verbindung des Stamms enthalten. In solchen Fällen werden Fehlpaarungen nicht als die Stamm-Länge gezählt. So wurden Sequenzen ausgewählt, deren jeweilige Stamm-Länge 3 Basenpaare oder mehr, ausgeschlossenen fehlgepaarte Basenpaare, betrug. Als Ergebnis fand man 12 Klone, die Sequenzen umfassten, welche die Dreiwege-Verbindungs-Struktur enthielten und jeweils Stämme mit 3 oder mehr Basenpaaren enthielten, wobei 2 oder 3 GC-Basenpaare nahe der Verbindung vorlagen. Der verbleibende 1 Klon umfasste ebenfalls eine Sequenz, die eine Dreiwege-Verbindungs-Struktur enthielt, während einer der drei Stämme nur 2 Basenpaare enthielt. Deletionsmutanten der 13 Klone, welche die normale Dreiwege-Verbindungs-Region enthielten, wurden hergestellt, und ihre Affinität zu Cholsäure wurde getestet. Tabelle 3 zeigt die Nucleotidsequenzen dieser Deletionsmutanten der 13 Klone und der oben erwähnten 6 Klone. Diese Nucleotidsequenzen entsprechen jenen, welche zwischen den Nucleotidsequenzen vorliegen, die in den in Tabelle 1 gezeigten Nucleotidsequenzen unterstrichen sind.
Die Dissoziationskonstanten der Deletionsmutanten der 13 Klone für Cholsäure sind in Tabelle 4 gezeigt. Alle Deletionsmutanten banden an Cholsäure.
Tabelle 4
Alle 19 Klone, deren Sequenzen bestimmt worden waren, enthielten die Cholsäure-bindende Sequenz, von der vorhergesagt worden war, dass sie die gemeinsame Sekundärstruktur (d.h. die Dreiwege-Verbindung) bildet.
[Beispiel 3] Einflüsse von Einzelnucleotid- und Einzelbasenpaar-Mutationen auf die Cholsäure-Bindungsaffinität
(1) Einfluss von Substitutionen im Stamm oder in der Schleife auf die Affinität
Um die wichtigen Komponenten, die für die Bildung der vorhergesagten Dreiwege-Verbindungs-Struktur und die Bindung an Cholsäure in den selektierten Klonen verantwortlich sind, zu bestimmen, wurde die Deletionsmutante ch2-40, welche die Dreiwege-Verbindungs-Region von Klon 2 enthält, einer Mutationsanalyse unterzogen. Eine Reihe von ch2-40-Mutanten wurden synthetisiert, die Einzelnucleotid-Substitution, Einzelbasenpaar-Substitution oder Einzelnucleotid-Deletion oder -Insertion enthalten. Die relative Bindungsaffinität jeder Mutanten zu Cholsäure wurde durch das "Gleichgewichts-Filtrations-Verfahren" bestimmt. 5a zeigt die Bindungsaffinität der Deletionsmutanten ch2-40, wenn das Nucleotid durch das mit einem Pfeil angezeigten Nucleotid substituiert worden ist. 5b zeigt die Bindungsaffinität von ch2-40, wenn ein Basenpaar, das der Stammereich der Dreiwege-Verbindung bildet, durch das Basenpaar substituiert worden ist, das durch einen Pfeil angezeigt ist.
Wie in 5a gezeigt, verringerten die paarweise kompensatorischen Substitutionen an den möglichen 3 Stämmen von einem G-C- zu einem A-T-Basenpaar die relative Bindungsaffinität auf 65,3% (C₆-G₂₁ zu T₆-A₂₁), demonstrierten aber immer noch etwas Affinität. Im Gegensatz dazu beseitigten mehrere Einzelbasen-Substitutionen um die Verbindung herum die Bindungsaffinität vollständig (5b; G₄ zu C₄, C₆ zu G₆, A₂₂ zu T₂₂ und G₃₆ zu C₃₆). Beim Vergleichen der Auswirkung der Einzelbasen- und paarweisen Substitutionen auf die Bindungsaffinität verringert die Erstgenannte, welche das vorgeschlagene Watson-Crick-Basenpaar in der vorhergesagten Sekundärstruktur zerstört, die Bindungsaffinität signifikanter als die Letztgenannte.
Dieses Ergebnis stützt die Bildung der vorhergesagten Sekundärstruktur und zeigt die Bedeutung der Bildung der Dreiwege-Verbindungs-Struktur für die Aufrechterhaltung der Affinität an. Sowohl eine Einzelbasen- als auch Basenpaar-Substitution um die Verbindung von ch2-40 herum verringert die Bindungsaffinität signifikant, wohingegen jene Basen- und Basenpaarsubstitutionen nahe dem 5'-Ende, dem 3'-Ende und in den 2 Schleifen sie nicht verringerten. Weiter beeinflussten Einzelbasen-Substitutionen in den 2 Schleifen sowie die Deletion von A₁₂ und A₂₈ und die Insertion eines Adenosins zwischen A₁₂ und C₁₃ oder A₂₈ und T₂₉ kaum die Bindungsaffinität. In Verbindung mit der Tatsache, dass unter den 19 Klonen keine offensichtliche Ähnlichkeit der Sequenz und Länge der Stamm- und Schleifen-Region beobachtet werden konnte, wurde gezeigt, dass die Bindungsstelle für Cholsäure die Verbindung der 3 Stämme ist.
(2) Einflüsse der Substitutionen der drei Basenpaare in der Verbindung auf die Affinität
Als nächstes konzentrierten sich die gegenwärtigen Erfinder auf die Abwandlung und Anordnung von 3 Basenpaaren in der Verbindung der selektierten 19 Klone. Die Verbindungen dieser Klone bestanden entweder aus 2 G-C- und 1 A-T- oder 3 G-C-Basenpaaren (als 2G-C- bzw. 3G-C-Verbindung bezeichnet) (6a). Die 2G-C-Verbindung und 3G-C-Verbindung, ch9-48 bzw. ch16-40, sind in 6b dargestellt. Von den selektierten 19 Klonen besaßen 9 Klone die 2G-C-Verbindung und die anderen 10 Klone die 3G-C-Verbindung. Als man die Anordnung der 3 Basenpaare an den G-C-Verbindungen verglich, wiesen 9 der 10 Klone die gleiche Anordnung auf. Sechs der 9 Klone mit der 2G-C-Verbindung wiesen eine ähnliche Anordnung auf, und die verbleibenden 3 Klone wiesen eine andere Anordnung auf.
Um weiter die strukturelle Anforderung der 3 Basenpaare an den Verbindungen für die beobachtete Wechselwirkung zu bewerten, wurden Basenpaar-Substitutionen an der Verbindung von ch16-40 und ch9-48 durchgeführt, die Deletionsmutanten sind, welche die Dreiwege-Verbindungs-Region von Klon 9 und Klon 16 einschließen und die niedrigsten K_d-Werte zeigen. Die relative Bindungsaffinität von ch16-40 und ch9-48, das eine Einzelnucleotid-Substitution enthält, zu Cholsäure ist in Tabelle 5 gezeigt. Die Zahl in der Tabelle zeigt die relative Affinität (%) an, wenn man die Bindungsaffinität von Klonen ohne Substitution als 100% annimmt.
Tabelle 5
Interessanterweise führten alle Substitutionen durch Watson-Crick-Basenpaare nicht zum Verlust der Affinität, wohingegen fehlgepaarte und Wobble-Basenpaare (G-T) den vollständigen Affinitätsverlust zur Folge hatten. Durch Konstruktion eines CPK-Modells der 6 Nucleotide, die die 3 Watson-Crick-Basenpaare bilden, wurde gezeigt, dass diese Nucleotide eine Cyclophan-artige cyclische Struktur bilden, die aus 3 Purin- und 3 Pyrimidin-Basen besteht, mit einem Hohlraum mit einem Innendurchmesser von 12 bis 17 Å. Weiter ist die Form und Größe dieses Hohlraums für den Einschluss von Cholsäure geeignet, deren Größe etwa 15 Å beträgt. Hierin ist ein CPK-Modell (raumfüllendes Corey-Pauling-Koltun-Molekülmodell) eine Art von Molekülmodell des räumlichen dreidimensionalen Modells. Eine verbesserte Moleküldynamik des Corey-Pauling-Molekülmodells wird von einem ad-hoc-Komitee zum Entwurf und der Entwicklung neuer Atom- und Bindungsmodelle des US National Institutes of Health (NIH) verkauft.
Mit einigen wenigen Ausnahmen beeinflusste die Substitution durch Watson-Crick-Basenpaare die Bindungsaffinität nicht. Substitutionen von G-C zu A-T verringerten die Bindungsaffinität (C₅-G₃₆ zu T₅-A₃₆: 56,1%; C₆-G₂₁ zu T₆-A₂₁: 34,7%), wohingegen fast keine Verringerung der Bindungsaffinität bei einer Substitution von A-T zu G-C (T₂₂-A₃₅ zu C₂₂-G₃₅: 95,2%) beobachtet wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit dem Merkmal der selektierten 19 Klone mit 2 oder 3 G-C innerhalb der Verbindung und ohne Verbindungen mit 1 oder keinem der G-C-Basenpaare überein.
[Beispiel 4] Affinität des erfindungsgemäßen DNA-Aptamers, das aus zwei Molekülen besteht
Die Änderungen der Ligandenaffinität aufgrund von Mutationen in der Nucleotidsequenz, welche die Dreiwege-Verbindung in dem Aptamer der vorliegenden Erfindung ausmacht, das durch zwei Moleküle, d.h. eine Ziel-Nucleotidsequenz und eine Sonde, gebildet ist, wurden überprüft. Spezieller wurde die Affinität der Dreiwege-Verbindungen, in denen eine Ziel-Nucleotidsequenz und eine Sonde mit den nachstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen hybridisiert wurden, zu Cholsäure mittels SPR gemessen. 5 μM Ziel-Nucleotidsequenz und 5 μM Sonde wurden gemischt, und die Mischung wurde mittels Wärme unter der gleichen Bedingung, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, denaturiert. Durch Laden von 20 μl der Sonde-Ziel-Nucleotidsequenz auf einen Sensor-Chip mit immobilisierter Cholsäure BIAcore2000 (BIAcore) wurde eine SPR-Signaländerung von 600 RE (RE = Resonanzeinheit) beobachtet. Andererseits kontte jedoch, wenn eine Einzelnucleotid-Mutation in die Ziel-Nucleotidsequenz eingeführt worden ist (das unterstrichene Segment in der Ziel-Nucleotidsequenz wurde zu CCTAGCAGCCGGAGCGGTGG abgeändert), keine SPR-Signaländerung beobachtet werden. Zusätzlich nahm die Bindungsaffinität nicht nur der obigen Sequenz-Kombination, sondern auch dann, wenn eine Fehlpaarung in die Basenpaare, die der Verbindung benachbart waren, eingeführt worden war, unter das nachweisbare Niveau ab.
Die Sequenz der Ziel-Nucleotidsequenz/SEQ ID NO: 27 (das mit kleinen Buchstaben angezeigte Segment ist komplementär zu der Sonde, und die Verbindung ist an der Position angeordnet, welche dem Nucleotid entspricht, das die einzige Leerstelle flankiert) 5'-GTACCAGCTTATTCAATTACAGATCGAGGGCAGCGATAGCcctagcagcgggagcggtggCATCGGTCCTGGACTTGGGACTAGATAGTATGTTCATCAG-3'; und die Sequenz der Sonde (CH3J-1-100)/SEQ ID NO: 28 (das mit kleinen Buchstaben angezeigte Segment ist komplementär zu der Ziel-Nucleotidsequenz) 5'-ccaccgctccACTCAACTGGTTTTCCAGTTGAGTcgctgctagg-3'.
Als nächstes wurde unter Verwendung von Cholsäure, Sonde und Ziel-Nucleotidsequenz (jeweils 50 μM) die Menge an Cholsäure, die an den Sonden-Ziel-Nucleotidsequenz-Komplex bindet, durch das in Beispiel 2(1) beschriebene Gleichgewichts-FiltrationsVerfahren bestimmt. Die Nucleotidsequenzen der verwendeten Ziel-Nucleotidsequenz und Sonde sind nachstehend gezeigt:
die Sequenz der Ziel-Nucleotidsequenz/SEQ ID NO: 29 5'-CCTAGCAGCGGGAGCGGTGG-3'; und
die Sequenz der Sonde/SEQ ID NO: 30 (das mit kleinen Buchstaben angezeigte Segment ist komplementär zu der Ziel-Nucleotidsequenz) 5'-ccaccgctccACTCAACTGGTTTTCCAGTTGAGTcgctgctagg-3'.
Die Ergebnisse der Messung demonstrierten, dass die Menge der gebundenen Cholsäure 36,6 μM war (bei ch2-40 betrug unter der gleichen Bedingung die Menge an gebundener Cholsäure 27,8 μM). Andererseits band, als eine Einzelnucleotid-Mutation in die Ziel-Nucleotidsequenz eingeführt worden wurde (5'-CCTAGCAGCcGGAGCGGTGG-3'/SEQ ID NO: 31; der Kleinbuchstabe entspricht der Mutation), die Sequenz unter der gleichen Bedingung nicht an Cholsäure (die Menge an gebundener Cholsäure betrug 0 μM).
[Beispiel 5] Bewertung auf der Basis der chemischen Modifikation der Sekundärstruktur des Aptamers
(1) Chemische Modifikation von Thymin mit Osmiumtetraoxid
Die gegenwärtigen Erfinder führten unter Verwendung eines Oxidationsmittels, Osmiumtetroxid, chemische Modifikationsstudien an ch9-48 durch, um weiter die Sekundärstruktur des Aptamers und der Basen zu bewerten, die mit der Wechselwirkung in Beziehung stehen. Osmiumtetroxid reagiert selektiv mit Thymin (T) in einzelsträngigem Zustand in Anwesenheit von Pyridin (Furlong J. C. et al., Biochemistry, 28, 2009–2017, 1989). Es wird vorgeschlagen, dass diese Selektivität das Ergebnis der Aktivität von Osmiumtetroxid ist, die C-5,6-Doppelbindung von Thymin anzugreifen (Nielsen P. E. et al., J. Mol. Recog., 3, 1– 25, 1990). Die Stellen der Osmylierung können durch alkalische Behandlung gespalten werden.
5 μM 3'-FITC markiertes ch9-48 oder ch9-48-C6 wurden 15 min bei 20°C mit 100 μl Bindungspuffer inkubiert, der 1 mM Osmiumtetroxid und 3% Pyridin mit oder ohne 5 mM Cholsäure umfasste. Die Kontrolle wurde bei 80°C inkubiert, um die Sequenz zu Einzelsträngen zu denaturieren. Die Reaktionen wurden durch zwei aufeinanderfolgende Ethanol-Fällungen gestoppt. Die Aptamere wurden durch 30-minütige Behandlung mit 15 μM 1 M Piperidin bei 90°C an den Stellen der Osmat-Addukte (an der Stelle von einzelsträngigem T) gespalten. Nach der Zugabe von 15 μl Formamid-Beladungspuffer wurden die gespaltenen Produkte einer Elektrophorese auf 10%-igem Polyacrylamid-Gelen unterzogen (19%; das Verhältnis von Monomer:Bis betrug 19:1), welches 7 M Harnstoff enthieltt. Das Puffersystem bestand aus 90 mM Tris-Borat (pH 8,0) und 2 mM EDTA. Die Gele wurden unter Verwendung des Fluorlmager 595 gescannt und analysiert. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
(2) Experimentelle Ergebnisse
Die Fotografie, die das Ergebnis der Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigt, ist in 7 dargestellt. Das Muster der Modifikationen bei ch9-48 unter der Faltungsbedingung (d.h. in Bindungspuffer bei 20°C) stand in hohem Einklang mit der vorgeschlagenen Sekundärstruktur (8). Eine starke Modifikation wurde am das die Verbindung flankierenden T43 beobachtet, obwohl die Ts in den Schleifenregionen ebenfalls hoch reaktiv waren. Die Ts in den Stamm-Regionen wurden wirksam geschützt, außer T23 und T46: T23 war aufgrund seiner Position am Ende des Stamm-Bereichs reaktiv, und T46 scheint aufgrund der Instabilität der kurzen Stamm-Struktur, der eine Schleife fehlt, reaktiv zu sein. Eine Mutante ch9-48-C6, eine Mutante von ch9-48, welcher die Fähigkeit fehlt, an Cholsäure zu binden, wurde hergestellt, indem das sechste G zu C substituiert wurde, und das Modifikationsmuster wurde mit ch9-48 verglichen. In Anwesenheit von Cholsäure wurde der Modifikationsgrad von T43 von ch9-48 am Verzweigungspunkt auf weniger als 40% verringert. Im Gegensatz dazu wurde die Reaktivität von T43 in ch9-48-C6 nur leicht durch Cholsäure unterdrückt. So scheint T43 in ch9-48 direkt an der Bindung an Cholsäure beteiligt zu sein.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Nachweisverfahren für Ziel-Nucleotidsequenzen bereit, die eine Nucleinsäure-Aptamer-Bildung verwenden. Ein spezifischer Nachweis eines SNP ist durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung auf der Basis der Verwendung eines Nucleinsäure-Aptamers möglich, dessen Liganden-Bindungsaffinität sich abhängig von der Anwesenheit einer Einzelnucleotid-Fehlpaarung in starkem Maß verändert. Im Stand der Technik ist kein Nachweisprinzip bekannt, in dem eine Einzelnucleotid-Fehlpaarung einen derartig signifikanten Unterschied liefert.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäure-Aptamere mit einer neuen Struktur bereit, die zum Nachweis von Ziel-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Die Liganden-Bindungsaffinität der Nucleinsäure-Aptamere der vorliegenden Erfindung, die an der Dreiwege-Verbindung einen Liganden wie Cholsäure einfangen, geht durch lediglich eine Fehlpaarung in irgendeinem der drei Basenpaare der Dreiwege-Verbindungs-Einheit verloren. So sind die Nucleinsäure-Aptamere, die die Dreiwege-Verbindung umfassen, für die Anwendung auf das Nachweisverfahren für SNPs stark vorzuziehen.
SEQUENZPROTKOLL

Claims

Verfahren zum Detektieren einer Ziel-Nucleotidsequenz, welches die Schritte umfasst: (a) Hybridisieren einer Sonde an die Ziel-Nucleotidsequenz, um ein Nucleinsäure-Aptamer mit Bindungsaffinität zu einem Liganden zu bilden, bei dem es sich um irgendeine Komponente außer Nucleinsäuren handeln kann; wobei das gebildete Aptamer eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen Nicht-Stammbereich in der Nähe der komplementären Nucleotidsequenz bildet, wobei der Nicht-Stammbereich ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Schleife, einer Ausbauchung, einem Basenpaar vom Nicht-Watson-Crick-Typ und einem Stamm-Verbindungs-Bereich und eine Liganden-Bindungsstelle oder einen Teil derselben darstellt, und (b) Detektieren der Anwesenheit der Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung der Affinität des Aptamers als Index.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Ziel-Nucleotidsequenz Einzel-Nucleotid-Polymorphismus enthält und die Affinität der Sonde zu dem Liganden abhängig von der Einzel-Nucleotid-Substitution in der Ziel-Nucleotidsequenz variiert.
Verwendung einer Sonde zum Detektieren einer Ziel-Nucleotidsequenz, wobei die Sonde durch Hybridisieren an die Ziel-Nucleotidsequenz eine Bindungsaffinität zu einem Liganden erwirbt, bei dem es sich um irgendeine Komponente außer Nucleinsäuren handeln kann, wobei das gebildete Aptamer eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen Nicht-Stamm-Bereich in der Nähe der komplementären Nucleotidsequenz bildet, wobei der Nicht-Stamm-Bereich ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Schleife, einer Ausbauchung, einem Basenpaar vom Nicht-Watson-Crick-Typ und einem Stamm-Verbindungs-Bereich und eine Liganden-Bindungsstelle oder einen Teil derselben darstellt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Sonde durch Hybridisierung mit der Ziel-Nucleotidsequenz eine Struktur bildet, bei der sich drei oder mehr Stämme kreuzen, und sich an dem Bereich an den Liganden bindet, wo sich die Stämme kreuzen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Aptamer drei Stämme umfasst und wobei mindestens zwei der drei Basenpaare, welche die Verbindung darstellen, G-C-Nucleotidpaare sind.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei jeder Stamm länger ist als drei Basenpaare.
Nucleinsäure-Aptamer, das aus drei Stämmen besteht und an der Stelle, an der die Stämme sich kreuzen, an Cholsäure bindet, wobei das Nucleinsäure-Aptamer eine Struktur aufweist, in der ein Einzelstrang, der eine Stammschleife umfasst, an einen weiteren Einzelstrang unter Bildung von zwei Stämmen hybridisiert ist.
Nucleinsäure-Aptamer nach Anspruch 7, wobei das Aptamer mindestens zwei der Basenpaare umfasst, welche die Verbindung bilden und die G-C-Nucleotidpaare sind.
Testsatz zum Detektieren einer Ziel-Nucleotidsequenz, umfassend eine Sonde und Cholsäure, wobei die Sonde und die Ziel-Nucleotidsequenz nach Hybridisierung das Nucleinsäure-Aptamer mit einer Bindungsaffinität zu Cholsäure bilden und wobei das gebildete Aptamer eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen Nicht-Stammbereich in der Nähe der komplementären Nucleotidsequenz bildet, wobei der Nicht-Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Schleife, einer Ausbauchung, einem Basenpaar vom Nicht-Watson-Crick-Typ und einer Stamm-Verbindungs-Struktur und eine Liganden-Bindungsstelle oder einen Teil derselben darstellt.
Testsatz nach Anspruch 9, in dem das Aptamer mindestens zwei der Basenpaare umfasst, welche die Verbindung darstellen und die G-C-Nucleotidpaare sind.