DE69706183T2

DE69706183T2 - Multiplex-verfahren zum einfangen von polynukleotiden und zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69706183T2
Application number: DE69706183T
Authority: DE
Inventors: Jer-Kang Chen; Claudia Chiesa; George Fry; A. O'neill
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2002-04-11
Anticipated expiration: 2017-10-03
Also published as: AU4741797A; WO1998014610A3; CA2267214A1; EP0929693B1; DE69706183D1; WO1998014610A2; EP0929693A2; AU738607B2; ATE204334T1; US6124092A; JP2001503973A; US6514699B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Polynukleotidsequenzierung und -amplifikation.

Hintergrund

Die Sequenzierung von Polynukleotiden ist ein gut etabliertes Verfahren in der Molekularbiologie. Gegenwärtig verwendete Verfahren für eine Sequenzierung erfolgen im wesentlichen gemäß Sanger et al., Proc. Nett Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977) oder gemäß Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499-559, Academic Press, San Diego, CA (1980). Die Polynukleotidsequenzierung wurde ein integraler Bestandteil von scheinbar allen Aspekten der Molakulargenetik. Das Human Genome Project und die Sequenzierung gesamter Genome aus einer Vielzahl von Organismen bereitete Problemem für die Forscher, die herkömmliche Sequenzierverfahren verwenden. Ferner ist zu erwarten, dass die vergleichende Sequenzierung bekannter Gene für diagnostische Zwecke immer wichtiger wird.
Die Amplifikation von Polynukleotidsequenzen, typischerweise durch Verfahren wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist auch ein gut etabliertes Verfahren in der Molekularbiologie. Der Bedarf für eine steigende Zahl von Amplifikationsreaktionen für die genetische Analyse, zum Teil hervorgerufen durch den erhöhten Bedarf für eine Sequenzierung, verstärkte den Bedarf, große Anzahlen von Polynukleotid-Amplifikationen durchzuführen.
Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um PCR-amplifizierte Sequenzen nachzuweisen und zu isolieren. Die WO 94/21820 beschreibt die Verwendung von Primern mit 5'-Teilen, die vom Rest des Primers durch eine nicht-replizierbare Region getrennt sind, und die Verwendung dieser Primer bei der PCR-Amplifikation. Die offengelegte europäische Patentanmeldung EP 0 416 817 beschreibt ein Verfahren zur Amplifikation der Zielsequenz unter Verwendung von Primern, die einen Polynukleotidschwanz aufweisen. Die US-PS 5,200,314 beschreibt die Reinigung und den Nachweis von Zielsequenzen unter Verwendung von einem oder mehreren Oligonukleotiden mit einem Tag, wobei die Oligonukleotide mit dem Tag in ein Duplex hybridisiert werden, das spezifisch an einen Festträger gebunden ist.
Im Hinblick darauf, dass der Bedarf für eine Polynukleotidsequenzierung rasch ansteigt, steigt allmählich der Druck, die Zeit und die Kosten zu senken, die mit der Gewinnung von Polynukleotidsequenzen verbunden sind. Häufig wurde versucht, parallel zu sequenzieren, d. h. durch eine Multiplex-DNA-Sequenzierung. Verfahren einer Mulitplex-Sequenzierung sind in der WO 96/41011 und in der US-PS 5,149,625 beschrieben. Diese Verfahren sind entweder schwierig bei der Durchführung, schaffen kleine Mengen an Sequenzinformation oder bieten keine merkliche Einsparung von Zeit oder Geld. In ähnlicher Weise sind etablierte Verfahren einer Multiplex-PCR wie die in der US-PS 5,582,989 beschriebenen schwierig in einem großen Maßstab durchzuführen.
Herkömmliche Sequenzierverfahren sind für eine Sequenzierung mit einem hohen Durchsatz aus mehreren Gründen impraktikabel wie aufgrund der Reagenzienkosten und der großen Anzahl von erforderlichen Proben-Behandlungsschritten. In ähnlicher Weise sind herkömmliche Polynukleotid-Amplifizierungsverfahren aus einer Reihe von Gründen für eine Sequenzierung mit einem hohen Durchsatz impraktikabel wie aufgrund der Reagenzienkosten und der großen Anzahl an erforderlichen Proben-Behandlungsschritten. Die Erfindung kann für eine Erhöhung der Menge an genetischer Information, die in einem bestimmten Zeitraum erhalten wird, und für die Senkung der Kosten für die Gewinnung der genetischen Information eingesetzt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1. Diese Figur ist eine schematische Darstellung von Beispielen verschiedener Ausführungsformen von Paaren aus wiedergewinnbaren Primern und Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen. Die Wiedergewinnungs-Tags und die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind beide Polynukleotidsequenzen. Die Sequenzen sind aneinander gelegt, um die Orientierung darzustellen und sollten nicht als Triplex-Sequenzen aufgefasst werden. Eine herkömmliche Duplex-A-T- und -C-G-Paarung ist dargestellt. Die Sternchen stellen nicht-spezifizierte Basen in der Matrize dar. In Fig. 1A besitzt der wiedergewinnbare Primer eine balancierende Sequenz und die Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung hybridisiert mit der balancierenden Sequenz. In Fig. 1B besitzt der wiedergewinnbare Primer eine balancierende Sequenz und die Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung hybridisiert mit der balancierenden Sequenz und mit der Matrizen-hybridisierenden Region des wiedergewinnbaren Primers. In Fig. 1C besitzt der wiedergewinnbare Primer keine balancierende Sequenz und die Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung hybridisiert mit der Matrizen-Hybridisierungs-Region des wiedergewinnbaren Primers. In Fig. 1D besitzt der wiedergewinnbare Primer keine balancierende Sequenz. Neu synthetisierte DNA ist durch fette Buchstaben in Kursivschrift dargestellt und die Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung hybridisiert mit einer Matrizen-Hybridisierungs-Region des wiedergewinnbaren Primers und mit dem neu synthetisierten DNA-Strang. In Fig. 1E besitzt der wiedergewinnbare Primer keine balancierende Sequenz. Neu synthetisierte DNA ist durch Fettbuchstaben in Kursivschrift dargestellt und die Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung hybridisiert mit dem neu synthetisierten DNA-Strang.
Fig. 2. Diese Figur ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Ausführungsform für eine Multiplex-Polynukleotid-Amplifikation. 2A zeigt doppelsträngige DNA. 2B zeigt denaturierte DNA. 2C zeigt zwei wiedergewinnbare Amplifkations-Primer, die mit den denaturierten DNA-Matrizen hybridisiert sind. Die wiedergewinnbaren Primer besitzen Wiedergewinnungs-Tags, die nicht mit der Matrize hybridisieren. 2D zeigt eine Primer-Verlängerung, ausgehend von den hybridisierten Wiedergewinnungs-Primern. 2E zeigt einen Denaturierungsschritt in der PCR. 2F zeigt das Nettoergebnis wiederholter Amplifikationsrunden. 2G zeigt einen der Stränge des Amplifikationsprodukts, der an eine Wiedergewinnungs-Tagbindende Verbindung gebunden ist. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind an einen Festträger (durch ein Rechteck dargestellt) gebunden. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind durch kurze Linien dargestellt, die an den Festträger gebunden sind. 2H zeigt die gereinigte amplifizierte DNA nach Freisetzung (Denaturierung) von dem Festträger.
Fig. 3. Diese Figur ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Ausführungsform für eine Vierfach-Multiplex-Polynukleotidsequenzierung. In 3A erfolgen die DNA- Sequenzierungsreaktionen zugleich in dem gleichen Röhrchen, wobei wiedergewinnbare Sequenzierleitern hergestellt werden. Die wiedergewinnbaren Primer besitzen eine balancierende Sequenz und die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen hybridisieren mit der balancierenden Sequenz. Die vier Matrizen sind durch die Nummern 1-4 verdeutlicht. Die verschiedenen wiedergewinnbaren Primer, jeder mit einem unterschiedlichen Wiedergewinnungs-Tag, sind durch die Buchstaben C, G, Y und M verdeutlicht. 3B zeigt vier verschiedene Sequenzierleitern, die sich in dem gleichen Röhrchen befinden. 3C zeigt getrennte Sequenzierleitern, die an verschiedene Vorsprünge eines Gel-Kamms zur Beladung von Taschen hybridisiert sind. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind an verschiedenen Zähnen (Vorsprüngen) des Kamms immobilisiert.
Fig. 4. Diese Figur ist ein Diagramm einer Mikrokanal-Vorrichtung für die Auftrennung von Polynukleotiden. Die Einlassöffnungen 10 und Auslassöffnungen 20 sind dargestellt. Die Region mit Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen 30, die in der Nähe der Einlassöffnungen immobilisiert sind, ist ebenfalls dargestellt. Die Kanäle 40 sind dargestellt. Eine schematische Darstellung von Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen ist durch gerade Linien, die sich bei 30 anschließen, angedeutet. Wiedergewinnbare Polynukleotide sind durch die gekrümmten Linien in der Nähe der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen angedeutet.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur gleichzeitigen Herstellung mehrerer Sequenzierleitern (oder anderer Polynukleotid-Verlängerungsprodukte), typischerweise in einem einzigen Reaktionsgefäß, und zur Analyse der gleichzeitig hergestellten Sequenzierleitern. Jede Sequenzierleiter wird ausgehend von einem wiedergewinnbaren Primer hergestellt, d. h. einem Oligonukleotid-Primer, der einen Wiedergewinnungs-Tag umfasst, der für die Reinigung oder Konzentration einer einzelnen Sequenzierleiter verwendet werden kann. Alternativ können anstelle von Wiedergewinnungs-Tags funktionelle Äquivalente von Wiedergewinnungs-Tags verwendet werden. Vorzugsweise sind die Wiedergewinnungs-Tags Oligonukleotide. Jede Sequenzierleiter zeichnet sich durch einen einzigartigen Wiedergewinnungs-Tag aus, der ursprünglich auf dem wiedergewinnbaren Primer vorhanden war. Nach Herstellung der mehrfachen Sequenzierleitern werden die verschiedenen Polynukleotid-Sequenzierleitern voneinander durch Bindung an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen, die auf einem oder mehreren Festträgern immobilisiert wurden, getrennt, d. h. aufgereinigt. Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen sind Verbindungen, die spezifisch an Wiedergewinnungs-Tags binden. Vorzugsweise sind die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Oligonukleotide, die zu Oligonukleotid-Wiedergewinnungs-Tags komplementär sind. Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen werden auf dem Festträger in einer adressierbaren Weise immobilisiert; z. B. weisen die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen bestimmte Stellen auf dem Festträger auf oder können durch Zuordnung zu einem bestimmten Festträger lokalisiert werden. Die Bindung der Polynukleotid-Sequenzierleitern an die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen dient der Auftrennung der in einer bestimmten Lösung vorhandenen verschiedenen Polynukleotid-Sequenzierleitern. Die aufgetrennten Polynukleotid-Sequenzierleitern können sodann von dem Festträger freigesetzt und darauf in die einzelnen Bestandteile, d. h. Polynukleotide, der Sequenzierleitern aufgelöst werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders wertvoll beim Einsatz in Verbindung mit einem automatischen, auf Fluoreszenz basierendem Sequenziergerät. Die wiedergewinnbaren Primer können für eine Verwendung in solchen Geräten fluoreszenzmarkiert werden. Die Matrizen für eine Sequenzierung durch die erfindungsgemäßen Sequenzierverfahren können Polynukleotid-Amplifikationsprodukte sein. Die Sequenzierleitern können durch eine Vielzahl von DNA-Sequenzierverfahren hergestellt werden, einschließlich Zyklus-Sequenzierung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen für die Auftrennung mehrerer zugleich hergestellter Polynukleotid-Amplifikationsprodukte, wie die durch Multiplex-PCR hergestellten Amplifikationsprodukte. In den erfindungsgemäßen Verfahren zur Auftrennung mehrerer gleichzeitig hergestellter Polynukleotid-Amplifikationsprodukte wird jedes Amplifikationsprodukt ausgehend von wenigstens einem wiedergewinnbaren Primer mit einem einzigartigen Wiedergewinnungs-Tag (oder dem funktionellen Äquivalent eines Wiedergewinnungs-Tags) hergestellt. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der gleiche Wiedergewinnungs-Tag auf verschiedenen Amplifikationsprodukten vorkommen, um für die Reinigung unterschiedlicher Sets an Amplifikationsprodukten zu sorgen.
Nach Herstellung von Amplifikationsprodukten werden die verschiedenen Amplifikationsprodukte voneinander durch Bindung an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen aufgetrennt, die auf einem oder mehreren Festträgern immobilisiert wurden. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen werden auf dem Festträger in einer adressierbaren Weise immobilisiert. Die Bindung der Amplifikationsprodukte an die Wiedergewinnungs-Tagbindenden Verbindungen dient der Auftrennung, Reinigung oder Konzentration der verschiedenen Polynukleotid-Amplifikationsprodukte. Die aufgetrennten Polynukleotid-Amplifikationsprodukte können sodann von dem Festträger freigesetzt und darauf aufgelöst werden, z. B. durch Elektrophorese aufgetrennt werden. Die Erfindung umfasst auch Verfahren, die die erfindungsgemäßen Multiplex-Sequenzierungs- und Multiplex-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren vereinigen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Bereitstellung wiedergewinnbarer Primer, die als Wiedergewinnungs-Tag ein Oligonukleotid besitzen, das während einer Amplifikationsreaktion nicht repliziert werden kann. Solche wiedergewinnbaren Primer werden hier als "Gelenk-Primer" bezeichnet. Beispiele von Gelenk-Primern umfassen wiedergewinnbare Primer, die eine nicht-basische Region zwischen der Matrizen-Hybridisierungs-Region des Primers und dem Wiedergewinnungs-Tag umfassen. Ein weiteres Beispiel eines Gelenk- Primers ist ein wiedergewinnbarer Primer, der eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) als Wiedergewinnungs-Tag umfasst, wobei die PNA mit dem 5'-Ende der Matrizen-Hybridisierungsregion des Primers verbunden ist. Die Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotide von Gelenk- Primern können auch zu einer Replikation während einer Amplifikationsreaktion unfähig gemacht werden, dadurch, dass das Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotid mit dem Primer durch nicht-replizierbare Linker (Verbindungsstücke) verbunden wird. Gelenk-Primer sind insbesondere in Multiplex-Polynukleotid-Amplifikationsreaktionen verwendbar, da es nicht notwendig ist, ein doppelsträngiges Polynukleotid, das das Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotid umfasst, zu denaturieren (und somit eine Renaturierung zu verhindern). Erfindungsgemäß werden auch Verfahren zur Verwendung von Gelenk-Primern in Multiplex- Polynukleotid-Amplifikationsreaktionen bereitgestellt.
Andere erfindungsgemäße Aspekte sind Kits für die Herstellung oder Wiedergewinnung mehrerer Polynukleotid-Sequenzierleitern oder -Amplifikationsprodukte. Die Kits umfassen mehrere wiedergewinnbare Primer mit einzigartigen Wiedergewinnungs-Tags. Die wiedergewinnbaren Primer können in einer einzigen Lösung bereitgestellt werden. Vorzugsweise sind die Wiedergewinnungs-Tags Polynukleotide mit im wesentlichen derselben Denaturierungstemperatur bei einer Bindung an geeignete Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen, d. h. die Primer bilden einen integrierten Satz. Die Kits können ferner Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen umfassen. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen werden bevorzugt immobilisiert an Festträger in einer räumlich adressierbaren Weise bereitgestellt. Die Kits können ferner markierte Ketten-Terminatoren, DNA-Polymerasen, Pyrophosphatasen, nicht-markierte Ketten-Terminatoren, DNA-Polymerase, Pyrophosphatase oder andere Bestandteile umfassen, die für PCR- oder Sequenzierungsreaktionen erforderlich sind.
Andere erfindungsgemäße Aspekte umfassen Sätze von Sequenzierungs- oder Amplifikations-Primern, die für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren optimiert sind. Beispiele solcher Sätze von Primern sind Sätze mit wiedergewinnbaren Sequenzier-Primern, die von den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen bei ähnlichen Denaturierungsbedingungen freigesetzt werden können. Die in solchen Sätzen enthaltenen Primer können ein Gelenk besitzen oder sie können kein Gelenk besitzen.
Andere erfindungsgemäße Aspekte umfassen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen. Solche Vorrichtungen können in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen umfassen mehrere Wiedergewinnungs- Tag-bindende Verbindungen, die an einem oder mehreren Festträgern, in manchen Ausführungsformen in einer räumlich adressierbaren Weise, immobilisiert sind. Vorzugsweise sind die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Polynukleotide. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtungen ist der Festträger eine Reihe von Kapillarkanälen. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der Festträger auch die Form von Partikeln oder einer Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtung (z. B. ein Gel-Kamm) oder anderer Mehrfachprojektions-Vorrichtungen für einen Umgang mit den Proben besitzen.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Definitionen

Die Begriffe "Polynukleotid" und "Oligonukleotid" haben hier eine breite Bedeutung und umfassen natürlich vorkommende Polynukleotide wie DNA oder RNA und auch Analoga natürlich vorkommender Polynukleotide. Solche Analoga umfassen in nicht begrenzender Weise Phosphoramidate, Peptid-Nukleinsäuren, Phosphorothioate, Methylphosphonate und ähnliches. Außer einem nicht-natürlich auftretenden Rückgrat können die Analoga natürlich auftretender Polynukleotide Nukleinsäure-Basen-Analoga wie 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin, Inosin und ähnliches umfassen. Eine Beschreibung der Synthese von Polynukleotiden findet sich unter anderem in den US-PSen 4,373,071, 4,401,796, 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679, 5,047,524, 5,132,418, 5,153,319 und 5,262,530.
Der Begriff "Sequenzierleiter" betrifft hier einen Satz von Polynukleotiden, der in einer Sequenzierreaktion produziert wird, die entweder eine Ketten-Terminations-Sequenzierreaktion wie Didesoxy-Sequenzierung oder eine Sequenzierung durch chemische Spaltung wie Maxam und Gilbert-Sequenzierung ist. Das Verfahren zur Schaffung einer Sequenzierleiter wird hier als "Sequenzierleiter-Herstellung" oder "Herstellung einer Sequenzierleiter" bezeichnet. Verfahren zur Herstellung von Polynukleotid-Sequenzierleitern sind bekannt. Beispiele von Verfahren zur Herstellung einer Sequenzierleiter finden sich unter anderem in Sambrook et al., Molecular Cloning Methods: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press (1989). Die verschiedenen Polynukleotide, d. h. Mitglieder einer spezifischen Sequenzierleiter unterscheiden sich voneinander in der Länge. Jedoch umfassen alle Mitglieder derselben Leiter denselben Oligonukleotid-Primer, von dem die Sequenzierleiter abgeleitet ist. Somit sollte die Herstellung von Sequenzierleitern, ausgehend von einem ersten wiedergewinnbaren Primer und einem zweiten wiedergewinnbaren Primer, die an dieselbe Matrizen-Initiierungsstelle (priming site) hybridisieren, sich jedoch im Hinblick auf die Identität der Wiedergewinnungs-Tags unterscheiden, zur Synthese zweier verschiedener Sequenzierleitern führen. Zusätzlich zu einer Ableitung von demselben Primer sind die Mitglieder einer bestimmten Polynukleotid-Sequenzierleiter auch von derselben Sequenziermatrize abgeleitet. Bei einer markierten Primer-Sequenzierung werden vier verschiedene Sequenzierleitern, von denen jede eine andere Didesoxy-Terminationsbase verwendet, getrennt hergestellt (und können sodann vor einer Analyse kombiniert werden), selbst wenn nur eine einzige vervollständigte Sequenz aus der Kombination der Information in den vier einen Bestandteil bildenden Sequenzierleitern erhalten wird. Falls derselbe wiedergewinnbare Sequenzier-Primer und dieselbe Matrize für die Herstellung von Sequenzierleitern in getrennten Reaktionsgefäßen verwendet werden, sollen die produzierten Sequenzierleitern verschiedene Sequenzierleitern sein.
Der Begriff "spezifisches Bindepaar" betrifft ein Paar von Molekülen, die sich spezifisch gegenseitig binden. Beispiele spezifischer Bindepaare umfassen in nicht begrenzender Weise Antikörper-Antigen (oder Hapten)-Paare, Ligand-Rezeptor-Paare, Biotin-Avidin- Paare, Polynukleotide mit komplementären Basenpaaren und ähnliches. Jedes spezifische Bindepaar umfasst zwei Mitglieder. Jedoch kann es möglich sein, zusätzliche Verbindungen aufzufinden, die spezifisch an ein Mitglied eines bestimmten spezifischen Bindepaars binden können.
Der Begriff "Wiedergewinnungs-Tag" betrifft hier eine Verbindung (oder einen Teil einer Verbindung), die ein Mitglied eines spezifischen Bindepaars von Molekülen ist. Der Wiedergewinnungs-Tag kann zu irgendeiner Klasse von Makromolekülen wie Polynukleotide, Kohlenhydrate, Polypeptide und ähnliches gehören. Vorzugsweise ist der Wiedergewinnungs- Tag ein Oligonukleotid. Wiedergewinnungs-Tags können auch zu einer Molekülklasse gehören, die nicht natürlicherweise auftritt. Falls der Wiedergewinnungs-Tag ein Oligonukleotid ist, kann der Wiedergewinnungs-Tag keine, einen Teil der oder die gesamte Matrizen-Hybridisierungssequenz des wiedergewinnbaren Primers umfassen.
Falls der Wiedergewinnungs-Tag ein Oligonukleotid ist, kann der Wiedergewinnungs-Tag gegebenenfalls eine balancierende Polynukleotidsequenz umfassen. Der Begriff "balancierendes Polynukleotid" betrifft Polynukleotide, die mit der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung hybridisieren, jedoch nicht spezifisch mit der Sequenzierungs-(oder Amplifikations)-Matrize hybridisieren Balancierende Polynukleotide sind gegebenenfalls auf wiedergewinnbaren Primern vorhanden. Das balancierende Polynukleotid kann für einen Ausgleich, d. h. eine Balancierung der Schmelztemperaturen des Duplex (oder Triplex) verwendet werden, das zwischen den verschiedenen Paaren des Wiedergewinnungs-Tags und der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung gebildet wird, die zusammen in dem gleichen Reaktionsgefäß verwendet werden. In ähnlicher Weise kann das balancierende Polynukleotid für einen Ausgleich, d. h. eine Balancierung der Schmelztemperaturen des Duplex (oder Triplex) verwendet werden, das zwischen den verschiedenen Paaren des Wiedergewinnungs-Tags und der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung gebildet wird, die unter ähnlichen Bedingungen denaturiert werden sollen.
Der Begriff "Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung" betrifft hier das Mitglied eines spezifischen Bindepaars, das nicht der Wiedergewinnungs-Tag auf einem bestimmten wiedergewinnbaren Primer ist. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, bei denen Polynukleotide als Wiedergewinnungs-Tags verwendet werden, umfasst die Wiedergewinnungs- Tag-bindende Verbindung eine Polynukleotidsequenz, die zu dem interessierenden Wiedergewinnungs-Tag-Polynukleotid komplementär oder teilweise komplementär ist. Einzelne Moleküle von Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen können mehrfache Kopien der komplementären (oder teilweise komplementären) Polynukleotidsequenz umfassen. Verzweigte Polynukleotide, wie z. B. in der WO 96/016104 und in der EP 646 595 beschrieben, können für eine Erhöhung der wirksamen Konzentration von Bindestellen für Wiedergewinnungs-Tags verwendet werden.
Der Begriff "wiedergewinnbarer Primer" betrifft einen Oligonukleotid-Primer, der ein Wiedergewinnungs-Tag umfasst. Wiedergewinnbare Primer können für die spezifische Initiierung (Priming) einer Polynukleotid-Sequenzierungsreaktion oder einer Polynukleotid-Amplifikationsreaktion verwendet werden, d. h. wiedergewinnbare Primer umfassen eine Polynukleotidsequenz, die spezifisch an eine spezifische (gewöhnlich vorbestimmte) Stelle auf einer Sequenzier-(oder Amplifikations)-Matrize binden kann. Der Teil des wiedergewinnbaren Primers, der stellenspezifisch an eine Matrize hybridisieren kann, wird hier als "Matrizenhybridisierende Sequenz" des wiedergewinnbaren Primers bezeichnet. Die Matrizen-hybridisierende Sequenz ist ausreichend lang, um spezifisch an eine Stelle oder an Stellen auf der interessierenden Matrize, typischerweise 18-36 Nukleotide lang, zu hybridisieren. Matrizenhybrisierende Sequenzen für eine Verwendung bei der Polynukleotid-Sequenzierung müssen an einzigartige Stellen auf der interessierenden Matrize hybridisieren. Der Wiedergewinnungs-Tag wird mit den Primern gekoppelt, so dass vermieden wird, dass der Wiedergewinnungs-Tag mit der Fähigkeit des wiedergewinnbaren Primers interferiert, stellenspezifisch an die Initiationsstelle zu hybridisieren. Zum Beispiel kann der Wiedergewinnungs-Tag am 5'- Ende oder in der Nähe des 5'-Endes mit dem wiedergewinnbaren Primer verbunden werden. Die spezifischen Maßnahmen, um einen Wiedergewinnungs-Tag an eine Oligonukleotid- Primer zu koppeln, hängen von der Verbindungsklasse ab, zu der der wiedergewinnbare Tag gehört. Falls der Wiedergewinnungs-Tag ein Polynukleotid ist, wird der Wiedergewinnungs-Tag vorzugsweise durch eine Polynukleotid-Bindung gekoppelt. Falls der Wiedergewinnungs-Tag ein Protein ist, wird der Wiedergewinnungs-Tag vorzugsweise durch ein bifunktionelles Vernetzungsmittel wie DSS (Disuccinimidylsuberat), SPDP (N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithiopropionat)), SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat) oder ähnliches gekoppelt. Genaue Verfahren zur Bindung von Marker an Polynukleotide finden sich unter anderem in G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996).
Falls der Wiedergewinnungs-Tag auf einem wiedergewinnbaren Primer ein Polynukleotid ist, kann der Wiedergewinnungs-Tag die gesamte, einen Teil der oder keine Matrizen-Hybridisierungssequenz des wiedergewinnbaren Primers umfassen. In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der Wiedergewinnungs-Tag aus einem Teil der oder der gesamten Sequenz des wiedergewinnbaren Primers bestehen. In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst der Wiedergewinnungs-Tag keinen Teil der Matrizenhybridisierenden Sequenz des wiedergewinnbaren Primers. In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst der Wiedergewinnungs-Tag ein balancierendes Polynukleotid. Der gesamte Wiedergewinnungs-Tag kann ein balancierendes Polynukleotid sein. Alternativ kann der Wiedergewinnungs-Tag aus einem balancierenden Polynukleotid und einem Teil der Matrizen-hybridisierenden Sequenz bestehen, die benachbart zu dem balancierenden Polynukleotid liegt.
Die wiedergewinnbaren Primer für die Polynukleotid-Sequenzierungs- oder Polynukleotid- Amplifikations-Ausführungsformen der Erfindung können spezifisch an Ziel-Polynukleotidsequenzen unter einem bestimmten Satz an Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Die Kriterien für das Entwerfen sequenzspezifischer Primer sind bekannt. Eine detaillierte Darstellung der Kriterien für das Entwerfen von Primern, um für eine stellenspezifische Hybridisierung zu sorgen, findet sich unter anderem in Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press (1995) und Kwok et al., Nuc. Ac. Res. 18: 999-1005 (1990). Die Matrizen-hybridisierenden Sequenzteile des Primers sind ausreichend lang, um eine stellenspezifische Hybridisierung an interessierende Matrizenstellen zu erlauben. Primer für eine Sequenzierung werden so entworfen, dass sie auf eine einzige Art und Weise an eine einzelne Matrizenstelle hybridisieren. Die Matrizen-hybridisierende Sequenz der wiedergewinnbaren Primer kann entweder vollständig komplementär oder teilweise komplementär zu den Basen der Zielsequenz, d. h. der Hybridisierungsstelle sein. Vorzugsweise ist die Matrizen-hybridisierende Sequenz der wiedergewinnbaren Primer vollständig zu den Basen der entsprechenden Zielsequenz komplementär.
Eine ausgehend von einem wiedergewinnbaren Primer hergestellte Sequenzierleiter kann als "wiedergewinnbare Sequenzierleiter" bezeichnet werden. Ferner umfasst der Begriff "wiedergewinnbare Sequenzierleiter" Sequenzierleitern, die das funktionelle Äquivalent von Wiedergewinnungs-Tags umfassen wie Sequenzierleitern, die während Nicht-Wiedergewinnungs-Tag-Multiplex-Verfahren hergestellt wurden. Ein ausgehend von einem wiedergewinnbaren Primer hergestelltes Polynukleotid-Amplifikationsprodukt kann als "wiedergewinnbares Amplifikationsprodukt" bezeichnet werden. Ferner umfasst der Begriff "wiedergewinnbares Amplifikationsprodukt" Sequenzierleitern, die das funktionelle Äquivalent von Wiedergewinnungs-Tags umfassen wie Sequenzierleitern, die während Nicht-Wiedergewinnungs-Tag-Multiplex-Verfahren hergestellt wurden.
Der Begriff "Polynukleotid-Amplifikationsreaktion" betrifft hier ein breites Spektrum von Verfahren für die Amplifikation spezifischer Polynukleotidsequenzen. Beispiele solcher Amplifikationsverfahren umfassen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion, LCR (Guatelli et al., Pröc. Natt Acad. Soh USA 87: 1874-1878 (1990), Nukleinsäuresequenzbasierende Amplifikation (NASB) (von Gemen et al., J. Virol. Methods 45: 177-188 (1993). PCR ist die bevorzugte Polynukleotid-Amplifikationsreaktion für die erfindungsgemäßen Zwecke.

Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die gleichzeitige Herstellung mehrerer Polynukleotid-Sequenzierleitern, typischerweise in einem einzelnen Reaktionsgefäß, und zur Analyse der Sequenzinformation, die von den gleichzeitig hergestellten Sequenzierleitern abgeleitet ist. Jede Sequenzierleiter wird ausgehend von einem wiedergewinnbaren Primer gebildet, der einen einzigartigen Wiedergewinnungs-Tag besitzt. Jedes Polynukleotid-Mitglied eines Polynukleotid-Satzes, der eine Sequenzierleiter darstellt, ist mit im wesentlichen demselben Wiedergewinnungs-Tag (oder einem funktionellen Äquivalent eines Wiedergewinnungs-Tags) markiert. Nach der gleichzeitigen Herstellung mehrerer Sequenzierleitern werden die verschiedenen Polynukleotid-Sequenzierleitern voneinander durch Bindung der Wiedergewinnungs-Tags (oder der funktionellen Äquivalente von Wiedergewinnungs-Tags) an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen getrennt, die auf Festträgern immobilisiert wurden. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen werden auf dem Festträger in einer adressierbaren Weise immobilisiert, d. h. die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen besitzen bestimmte Positionen auf den Festträgern. Die Bindung der Polynukleotid-Sequenzierleitern an die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen dient der Auftrennung der verschiedenen Polynukleotid-Sequenzierleitern. Die aufgetrennten Polynukleotid-Sequenzierleitern können sodann von dem Festträger freigesetzt werden und sodann in die einzelnen Polynukleotid-Bestandteile der Sequenzierleitern aufgelöst werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Auftrennung von Sequenzierleitern können einfach für eine Auftrennung oder ein Einfangen von mehreren zugleich hergestellten Polynukleotid-Amplifikationsprodukten angepasst werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders wertvoll bei einer Verwendung in Verbindung mit einer auf Fluoreszenz basierenden Polynukleotid-Analysevorrichtung, z. B. einem automatischen Sequenziergerät.
Die Bedeutung der Einsparungen in der Anzahl an Behandlungen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt werden, wird besonders wichtig, falls eine Sequenzherstellung oder eine Nukleinsäure-Amplifikation mit einem hohen Durchsatz erforderlich ist. Es soll das nachstehende Beispiel betrachtet werden, bei dem 108 Sequenzen aus jeder Blutprobe von 96 Lebewesen untersucht werden. Herkömmliche Verfahren umfassen die nachstehenden Schritte: 96 Präparationen der Matrize, 10 368 PCR-Reaktionen (108 · 96), 10 368 DNA-Aufreinigungen, 31 104 (3 · 10 368) Transfers von gereinigter DNA zu Sequenzierreaktionen (unter der Annahme, dass im Durchschnitt drei Sequenzen aus jeder PCR-Amplifikation hergestellt werden sollen), 31 104 Aufreinigungen der Sequenzierreaktionen und 31 104 Beladungen der Spuren des Sequenziergels. Die gleiche Menge an Sequenzinformation kann wie folgt durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden: 96 DNA-Präparationen, 864 PCR-Reaktionen (neun 12-fache Reaktionen für jede Probe), 27 Hybridisierungsreaktionen (96 Proben gleichzeitig), um die PCR-Amplifikationsprodukte zu reinigen und in 27 96-Loch-Platten, 4 Amplikons/Loch zu transferieren, 2592 12- fache Sequenzierreaktionen, 312 Selektionen der Sequenzierungs-Reaktionsprodukte (96 gleichzeitig) und Beladungen auf Auftrennvorrichtungen (96 gleichzeitig). Somit kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren einer Multiplex-Sequenzierung und Polynukleotid-Amplifikation die Anzahl an Verfahrensschritten mehr als 30-fach gesenkt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen weisen unzählige Aspekte auf, die im Vergleich zu früheren Verfahren einer Polynukleotidsequenzierung vorteilhaft sind. Ein wichtiger vorteilhafter Aspekt der Erfindung ist, dass mehr Sequenzinformation aus derselben oder ähnlichen Mengen von Reagenzien erhalten werden kann, wodurch signifikant die Kosten gesenkt werden, die mit der Herstellung einer bestimmten Einheit von Sequenzinformation verbunden sind. Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist, dass mehrere Sequenzleitern zugleich in demselben Reaktionsgefäß gebildet werden können. Durch die gleichzeitige Herstellung mehrerer Sequenzierleitern im gleichen Reaktionsgefäß wird die Anzahl an Proben-Behandlungsschritten gesenkt. Eine Senkung der Anzahl an Proben- Behandlungsschritten erhöht die Geschwindigkeit für die Herstellung der Sequenzleitern und verringert die Möglichkeit für Fehler bei der Probenbehandlung. Andere erfindungsgemäße Aspekte, die die Erfindung besser als herkömmliche Multiplex-Sequenzierverfahren, z. B. das Verfahren von Church et al. (US-PS 5,149,625), machen, umfassen eine fehlende Notwendigkeit für einen Membrantransfer (Blotting)-Schritt und das Fehlen der Notwendigkeit für eine Subklonierung der Polynukleotide für eine Sequenzierung in spezielle Vektoren. Weitere Vorteile der Erfindung sind, dass Sequenzierleitern, Amplikons (Polynukleotid-Amplifikationsprodukte) oder andere Primer-Verlängerungsprodukte mit einer minimalen Behandlung gereinigt, aufgetrennt oder einkonzentriert werden können.
Der Grad einer Verringerung des Reagenzienverbrauchs, der durch die erfindungsgemäßen Verfahren erreicht wird, wird zum großen Teil durch den Grad der Mehrfachbehandlung bestimmt. Zum Beispiel kann eine Sequenzierungsreaktion, die aus zwei Behandlungen besteht, d. h. zwei Sequenzierleitern werden zugleich in einem einzigen Reaktionsgefäß hergestellt, das Erfordernis für manche Sequenzierreagenzien bis zu zweifach senken. In ähnlicher Weise kann eine Sequenzierungsreaktion mit einer achtfachen Behandlung, d. h. acht Sequenzierleitern werden zugleich in einem einzelnen Reaktionsgefäß hergestellt, das Erfordernis für manche Reagenzien bis zu achtfach senken. Somit wird erfindungsgemäß das "überschüssige" Polynukleotid-Synthesepotential in einer Reaktion der Herstellung einer einzigen Sequenzierleiter genutzt. Unerwartet war, dass große Mengen (zweifach oder mehr) von zusätzlicher Sequenzinformation durch Verwendung ähnlicher Mengen DNA- Polymerase und anderer Reagenzien, die für die Herstellung einer einzigen Sequenzierleiter in herkömmlichen Sequenzierungsverfahren verwendet wurden, erhalten werden konnten. Für die Herstellung einer Sequenzierleiter mit einem geeigneten Längenbereich sind relativ hohe Mengen von Enzymen, dNTPs, Ketten-Terminatoren (markiert oder nicht-markiert), usw. erforderlich. Die einfache Senkung der für die Herstellung einer einzigen Polynukleotidleiter verwendeten Reagenzienmenge kann nicht für eine Senkung der Reagenzienkosten genutzt werden, die so drastisch wie bei den erfindungsgemäßen Verfahren ausfällt, da wertvolle Information aus den Sequenzierleitern verloren gehen wird. Zum Beispiel wird eine zu starke Senkung der Konzentration an Polymerase die Signalstärke verringern, wodurch die Leselänge verkürzt wird. Ein weiteres Problem bei der einfachen Senkung der Reagenzienkonzentration ergibt sich, falls die Konzentration eines Reagenzes sich auf einen Wert senkt, der in der Nähe oder unter dem Km-Wert der DNA-Polymerase liegt.
Obwohl die vorstehende Diskussion primär Multiplex-Verfahren einer Sequenzierung und Polynukleotid-Amplifikation betrifft, können die allgemeinen Prinzipien der Erfindung einfach an scheinbar alle molekularbiologische Verfahren angepasst werden, die eine Verlängerung von Primern umfassen. Durch die Verwendung mehrerer wiedergewinnbarer Primer, wobei jeder einen einzigartigen Wiedergewinnungs-Tag (oder ein funktionelles Äquivalent davon) aufweist, können mehrere Primer-Verlängerungsreaktionen zugleich erfolgen und die Reaktionsprodukte sodann auf der Basis der Bindung an immobilisierte Wiedergewinnungs-Tagbindende Verbindungen voneinander getrennt werden. Diese unzähligen Multiplex-Verfahren von Primer-Verlängerungsreaktionen sind Ausführungsformen der Erfindung. Ketten-Terminationssequenzierung (Sanger-Verfahren) und PCR sind Beispiele von Primer-Verlängerungsreaktionen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch für die Bereitstellung von Multiplex-Oligonukleotid-Ligationstests wie dem in den US-PSen 4,883,750, 4,988,617 und 5,242,794 beschriebenen Typen, verwendet werden.
Die Erfindung erlaubt die Mehrfachbehandlung von Sequenzierungsreaktionen oder Amplifikationsreaktionen oder anderer Typen von Primer-Verlängerungsreaktionen in einem unterschiedlichen Ausmaß. Die Sequenzierungsreaktionen können aus einer Mehrfachbehandlung eines Faktors von 2 oder mehr bestehen. Typischerweise wird die Mehrfachbehandlung einem Faktor von 2 bis 20 entsprechen. Jedoch sind erfindungsgemäß auch Ausführungsformen umfasst, bei denen eine Mehrfachbehandlung eines Faktors von mehr als 20 erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren einer Multiplex-Sequenzierung umfassen die gleichzeitige Herstellung mehrerer Polynukleotid-Sequenzierleitern in der gleichen Lösung. Das Verfahren umfasst den Schritt des Mischens mehrerer wiedergewinnbarer Sequenzier-Primer mit einer oder mehreren Sequenziermatrizen. Das Mischen kann in einem einzigen Reaktionsgefäß erfolgen. Das Mischen umfasst das Einbringen der wiedergewinnbaren Primer und der Matrizen in dieselbe Lösung, wodurch die Primer mit spezifischen Stellen auf der Matrize (oder auf den Matrizen) hybridisieren können, so dass die Primer verlängert werden können. Gegebenenfalls können die Reaktionsgefäße geschüttelt werden, um ein Durchmischen der Bestandteile in der Lösung zu verbessern. Das Reaktionsgefäß dient als Behälter für die Primer, Matrizen, Enzyme, dNTPs, Ketten-Terminatoren und anderen Reagenzien, die für die Herstellung einer Sequenzierleiter erforderlich sind. Das Reaktionsgefäß kann verschiedene Formen und Größen aufweisen, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Formen in nicht begrenzender Weise Eppendorf-Röhrchen, verschlossene Kapillarröhrchen, abgedeckte Vielfach-Loch-Platten und ähnliches umfassen. Nach oder gleichzeitig mit dem Mischen werden die wiedergewinnbaren Sequenzier-Primer Bedingungen ausgesetzt, die erlauben, dass die wiedergewinnbaren Primer an ihren jeweiligen Matrizen hybridisieren (sich anlagern). Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mehrzahl von Matrizen kann auf demselben oder auf verschiedenen Polynukleotid-Molekülen vorliegen. Zum Beispiel kann ein einzelnes Chromosom oder Plasmid eine Mehrzahl von Sequenziermatrizen umfassen, falls die wiedergewinnbaren Primer derart ausgewählt werden, dass sie an mehrere Regionen desselben DNA-Moleküls hybridisieren. Alternativ können einzelne wie- dergewinnbare Primer derart entworfen werden, dass sie an mehrere Matrizen hybridisieren, die als getrennte DNA-Moleküle vorliegen. Wiedergewinnbare Primer, die für eine Sequenzierung entworfen wurden, können für eine Initiierung (ein Priming) beider Stränge derselben Polynukleotidsequenz während derselben Sequenzherstellungsreaktion verwendet werden. Beispiele von Sequenziermatrizen umfassen chromosomale DNA, cDNA, RNA oder in Klonierungsvektoren inserierte DNA und ähnliches. Gegebenenfalls können die Matrizen für eine Sequenzierung Polynukleotide sein, die durch Nukleotid-Amplifikationsreaktionen wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) hergestellt wurden.
In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, bei denen die wiedergewinnbaren Primer an denselben Strang derselben Matrize hybridisieren, können die Hybridisierungsstellen auf den Matrizen ausreichend nahe zusammen liegen, so dass Interaktionen zwischen den beiden Stellen während der Herstellung der Sequenzierleiter nachgewiesen werden können. Zum Beispiel können ein erster Sequenzier-Primer und ein zweiter Sequenzier-Primer derart ausgewählt werden, dass sie an dasselbe Chromosom hybridisieren, so dass der erste Primer etwa 400 Basen 5' in Bezug auf die Hybridisierungsstelle des zweiten Primers hybridisiert. Die Intensität des Signals der Sequenzierleiter, d. h. die Menge von Polynukleotid- Bestandteilen der Sequenzierleiter, das von dem ersten Primer ausgeht, fällt abrupt ab (wenn auch nicht zu nicht-nachweisbaren Mengen), falls die Sequenzierleiter sich in die Hybridisierungsstelle des zweiten Primers erstreckt. Diese Verringerung der Intensität kann eingesetzt werden, um zu bestimmen, wann die von zwei Primern erhaltene Sequenzinformation kontinuierlich ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren einer gleichzeitigen Herstellung mehrerer Polynukleotid- Sequenzierleitern umfassen den Schritt der Bildung von Sequenzierleitern. Jede der gebildeten Sequenzierleitern ist von den wiedergewinnbaren Primern abgeleitet, die in dem Mischschritt hinzugegeben werden. Verfahren zur Bildung von Sequenzierleitern sind bekannt. Ketten-Terminationssequenzierung ist das bevorzugte Verfahren für eine Herstellung von Sequenzierleitern in den erfindungsgemäßen Verfahren. In der bevorzugtesten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Sequenzierleitern durch Zyklus-Sequenzierung gebildet. Zyklus-Sequenzierung ist unter anderem in Murray V., Nucl. Acid. Res. 17: 8889 (1989) beschrieben. Typischerweise ist die Zyklus-Sequenzierung ein Verfahren zur Herstellung einer Sequenzierleiter, das folgende Schritte umfasst: (a) Hybridisieren eines Primer-Oligonukleotids an eine Sequenziermatrize für die Bildung einer mit einem Primer versehenen (primed) Matrize, (b) Verlängerung des Primers mit einer DNA-Poylmerase, (c) Beenden der Verlängerungsreaktion mit einem Ketten-Terminator (z. B. einem Didesoxy- Nukleotid-Terminator), (d) Denaturierung der mit einem Primer versehenen Matrize, (e) Wiederholung der Schritte (a) bis (d) für mehrere Zyklen. Eine Erhöhung der Anzahl an Zyklen kann für die Erhöhung der Menge an hergestelltem markierten Polynukleotid eingesetzt werden, wodurch relativ geringe Mengen an Startmaterial kompensiert werden.
Viele verschiedenen Verfahren einer Ketten-Terminationssequenzierung können eingesetzt werden, um die Sequenzinformation einer bestimmten Matrize zu erhalten. Die verschiedenen Verfahren können Veränderungen in den Parametern umfassen wie die Markierungsstelle (auf dem Primer oder auf dem Ketten-Terminator), die Art der eingesetzten Marker, die Anzahl eingesetzter Marker und ähnliches.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, z. B. Sequenzierung mit einem markierten Terminator, kann die Sequenzinformation ausgehend von einer bestimmten Matrize und einem einzigen wiedergewinnbaren Primer durch Verwendung von vier Ketten-Terminatoren erhalten werden, wobei jeder Ketten-Terminator einer anderen Nukleotidbase entspricht und mit einem unterschiedlichen fluoreszierenden Marker markiert ist. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können nicht-fluoreszierende Marker wie Enzymmarker, radioaktive Marker und ähnliches für eine Markierung von Sequenzier-Primern oder Ketten-Terminatoren verwendet werden.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform, wie Sequenzierung mit einem markierten Primer, werden die wiedergewinnbaren Primer markiert und vier verschiedene wiedergewinnbare Primer, die alle an dieselbe Matrizenstelle hybridisieren, jedoch einen unterschiedlichen Fluoreszenzmarker besitzen, in vier getrennten Reaktionsgefäßen verwendet, um die Sequenz jeder Matrize in der Multiplex-Sequenzierungsreaktion zu erhalten. Zum Beispiel wird ein erster Satz von vier markierten wiedergewinnbaren Primern hergestellt, um dieselbe Stelle auf einer bestimmten Matrize mit einem Primer zu versehen. Jeder dieser Primer in dem Satz besitzt ein Tag mit einem unterschiedlichen nachweisbaren Marker (vier spektral unterschiedliche Marker werden verwendet). Der Wiedergewinnungs-Tag auf jedem der Primer in einem Satz wird mit demselben oder verschiedenen Wiedergewinnungs-Tags (vorzugsweise wird derselbe Wiedergewinnungs-Tag für jedes Mitglied des Satzes verwendet) markiert. Weitere vier Primer-Sätze werden für jede zu sequenzierende Matrize hergestellt. Die verschiedenen Mitglieder aller Primer-Sätze werden sodann auf vier Reaktionsgefäße verteilt, so dass jedes Gefäß mehrere Primer (und Matrizen) enthält, jedoch nur einen Primer aus jedem Primer-Satz. Eine Ketten-Terminations-Sequenzleiter-Herstellungsreaktion wird sodann in jedem Gefäß angesetzt, wobei ein einziger Typ eines Ketten-terminierenden Didesoxynukleotids in jedem Gefäß verwendet wird (A, G, C oder T). Nach Abschluss der Sequenzierungsreaktionen wird ein Festträger, wie ein makroskopisches Partikel (oder mehrere Partikel) mit immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen, die für die Wiedergewinnungs-Tags auf allen wiedergewinnbaren Primern eines bestimmten Primer-Satzes spezifisch sind, sequenziell zwischen den Lösungen in jedem Gefäß transferiert. Alternativ kann der Inhalt der verschiedenen Gefäße vor einer Kontaktierung mit dem makroskopischen Partikel gemischt werden. Das Verfahren der Kontaktierung des Inhalts der Reaktionsgefäße wird unter Verwendung verschiedener immobilisierter Wiedergewinnungs-Tag-bindender Verbindungen wiederholt, um für die Isolierung jedes Sequenzierleiter-Satzes zu sorgen.
Für die Herstellung von Sequenzierleitern, die auf einer automatischen Vorrichtung für die Auftrennung und den Nachweis von fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden wie dem ABI 377 oder ABI 310 (verfügbar von Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) aufgetrennt und untersucht werden können, können die hergestellten Polynukleotid-Sequenzierleitern fluoreszenzmarkiert werden. Automatische Sequenziervorrichtungen sind unter anderem in den US-PSen 4,232,769, 4,603,114, 4,704,256, 4,811,218, 5,277,780, 5,290,419, 5,307,148, 5,366,608, 5,384,024 und 5,543,026 beschrieben. Der Fluoreszenzmarker kann an den wiedergewinnbaren Primer oder an den Ketten-Terminator gebunden werden. Geeignete Fluoreszenzmarker umfassen in nicht begrenzender Weise 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), 6-Carboxy-4,7-2',7'-tetrachlorfluorescein (TET), 6-Carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorfluorescein (HEX), 5-(und 6) Carboxy-4',5'-dichlor- 2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE) und 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein (ZOE), Tetramethylrhodamin (TAMRA), 4,7-Dichlortetramethylrhodamin (DTAMRA), Rhodamin X (ROX), Rhodamin 6G (R6G), Rhodamin 110 (R110) und ähnliches. Geeignete Fluoreszenzmarker sind unter anderem in den US-PSen 5,366,860 (Bergot), 5,188,934 (Menchen) und 5,840,999 (eingereicht am 1. April 1996) und in Lee et al., 20(10): 2471-2483 (1992) beschrieben. Wie in der WO 95/21266 (Mathies) beschrieben, können mehrere Fluoreszenzmarker zusammen verwendet werden, um für einen Resonanz-Energietransfer zwischen Fluoreszenzmarkern zu sorgen, wodurch die gewünschten spektralen Eigenschaften erhalten werden. Besonders bevorzugte Farbstoffe sind die in den US-PSen 5,863,727, eingereicht am 3. Mai 1996, und 5,800,996, 4. Oktober 1996, beschriebenen Farbstoffmoleküle.
Unzählige Protokolle für eine Ketten-Terminationssequenzierung von Polynukleotiden wurden veröffentlicht und sind bekannt. Diese veröffentlichten Verfahren können zusammen mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung mehrerer Polynukleotid- Sequenzierleitern (und Auftrennen der hergestellten Leitern) verwendet werden, um signifikante Einsparungen in Bezug auf teure Reagenzien wie thermostabile Enzyme, fluoreszenzmarkierte Primer und fluoreszenzmarkierte Terminatoren Vorzunehmen. Bei herkömmlichen Polynukleotid-Sequenzierungsverfahren werden gewöhnlich mindestens 8 bis 12 Einheiten Taq-DNA-Polymerase für jede hergestellte Sequenzierleiter eingesetzt. Der Begriff "Einheit", der hier im Hinblick auf die thermostabile Polymerase verwendet wird, die den handelsüblichen Namen AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) trägt, ist als die Enzymmenge definiert, die 10 nM dNTPs in saures unlösliches Polynukleotid-Material innerhalb 30 Minuten bei 74ºC einbauen wird. Diese Definition kann für die Bestimmung entsprechender Mengen anderer thermostabiler DNA-Polymerasen verwendet werden. Der Fachmann weiß, dass die vorstehende Definition für "Einheit" auf viele DNA-Polymerasen übertragbar und nicht begrenzt auf AmpliTaq-DNA-Polymerase ist. Somit können durch einen Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren Sequenzierleitern unter Verwendung von etwa 4 bis 6 Einheiten (für eine Zweifachbehandlung) oder weniger DNA-Polymerase für jede hergestellte Sequenzierleiter produziert werden. Der Fachmann weiß auch, dass viele verschiedene DNA-Polymerasen, sowohl thermostabile als auch hitzelabile, für eine Herstellung der Sequenzierleitern verwendet werden können und dass ein ähnliches Ausmaß einer Werringerung des Reagenzienverbrauchs mit verschiedenen DNA-Polymerasen erreicht werden kann. Unzählige verschiedene DNA-Polymerasen oder Gemische von DNA-Polymerasen können für die Herstellung von Sequenzierleitern verwendet werden. Falls die Sequenzierleitern durch Zyklus-Sequenzierung hergestellt werden, ist die verwendete DNA-Polymerase vorzugsweise eine thermostabile DNA-Polymerase. Beispiele geeigneter thermostabiler DNA-Polymerasen umfassen TaqTM (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), VentTM (New England Biolabs, Beverly, MA), Deep VentTM (New England Biolabs, Beverly, MA), DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Stratagene, La Jolla, CA), DNA-Polymerase aus Thermotaga maritima und AmpliTaq-DNA-Polymerase, FSTM-Polymerase und Ampli-DNA-Polymerase, Taq-FS-DNA-Polymerase. TaqTM-FS-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) ist besonders bei der Zyklus-Sequenzierung bevorzugt.
Nach der Bildung einer ausreichenden Menge eines Polynukleotids, d. h. eine Menge, die einfach durch das ausgewählte Analysegerät nachgewiesen werden kann, werden die Wiedergewinnungs-Tags auf den Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukten) an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen gebunden, die auf einem Festträger in einer räumlich adressierbaren Weise immobilisiert wurden. Zur Vereinfachung kann dieser Schritt als "herausziehen" oder "das Herausziehen" bezeichnet werden. Durch Binden der Wiedergewinnungs-Tags an die dazugehörigen immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen werden die Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) voneinander getrennt und durch Immobilisierung auf einem Festträger aufgereinigt. Eine Bindung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und ihren dazugehörigen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen kann durch In-Kontakt-Bringen von immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen mit der Lösung (oder den Lösungen) erfolgen, in der die Sequenzierleiter hergestellt wurde (oder Nukleinsäure amplifiziert wurde). Eine Bindung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und ihren dazugehörigen Wiedergewinnungs-Tagbindenden Verbindungen erfordert nicht, dass 100% (oder sogar ein wesentlicher Teil) der markierten Polynukleotide binden, um wirksam für die erfindungsgemäßen Zwecke zu sein. Die Menge des gebundenen Polynukleotids muss nur ausreichend sein, um ein nachweisbares Signal durch den Marker auf den Polynukleotiden bereitzustellen, die in den darauffolgenden Schritten freigesetzt werden. Eine Kontaktierung zwischen den Wiedergewinnungs- Tag-bindenden Verbindungen und den Wiedergewinnungs-Tags auf den Sequenzierleitern kann entweder nach Abschluss der Sequenzierleiterbildung oder zugleich mit der Herstellung von Sequenzierleitern (oder Herstellung von Amplifikationsprodukten) eingeleitet werden. Vorzugsweise wird die Kontaktierung nach Abschluss der Herstellung der Sequenzierleitern (oder der Nukleinsäure-Amplifikation) eingeleitet. Lösungen, die die wiedergewinnbaren Sequenzierleiter-Polynukleotide (oder Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte) enthalten, können durch Zugabe von Reagenzien verändert werden, um die Bindung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen zu verstärken (z. B. für eine Veränderung des pH-Werts, der ionischen Stärke oder der Salzkonzentration der Lösung). Die Bindung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen kann auch durch die Zugabe von DNA-bindenden Proteinen oder von anderen DNA-bindenden Verbindungen modifiziert werden. Eine Kontaktierung zwischen den immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen und den Wiedergewinnungs-Tags sollte für einen Zeitraum erfolgen, der ausreicht, um die Bindung einer nachweisbaren Menge eines Polynukleotids an die immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen zu erlauben. Die Zeit, die erforderlich ist, um eine ausreichende Bindung von Wiedergewinnungs-Tags zu erlauben, wird in Abhängigkeit von dem spezifischen Wiedergewinnungs-Tag und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen, die für die Verwendung in einer bestimmten Ausführungsform ausgewählt wurden, unterschiedlich sein. Die Zeit, die erforderlich ist, um eine ausreichende Bindung der Wiedergewinnungs-Tags zu erlauben, kann auch in Abhängigkeit von den wirksamen Konzentrationen des spezifischen Wiedergewinnungs-Tags und der Wiedergewinnungs- Tag-bindenden Verbindungen unterschiedlich sein. In ähnlicher Weise werden die Bedingungen, die erforderlich sind, um eine Bindung der Wiedergewinnungs-Tags zu erlauben, in Abhängigkeit von dem spezifischen Wiedergewinnungs-Tag und den Wiedergewinnungs- Tag-bindenden Verbindungen, die für eine Verwendung in einer bestimmten Ausführungsform ausgewählt wurden, unterschiedlich sein. Falls die Wiedergewinnungs-Tags und die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen beides Polynukleotide sind, können gut etablierte empirische Formeln und andere Informationsquellen, die eine Bildung von Nukleinsäure-Duplexen (oder Triple-Helix) betreffen, für eine Optimierung der Bedingungen und der Zeit für die Bindung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen eingesetzt werden. Die Kinetiken einer Nukleinsäure- Hybridisierung und -Denaturierung sind gut bekannt und können für die Berechnung der Zeit und der Bedingungen, die für eine Bindung und Freisetzung erforderlich sind, eingesetzt werden. Information über die Kinetiken einer Nukleinsäure-Hybridisierung findet sich unter anderem in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego (1987), Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry, Part III: The Behavior of Biological Macromolecules, W.H. Freeman, NY (1980), Saenger, Principles of Nucleic Acids Structure, Springer-Verlag, New York (1989), und ähnlichen.
Der Schritt einer Bindung von Wiedergewinnungs-Tags an ihre dazugehörigen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen kann in einer Sequenz oder gleichzeitig erfolgen. Bei einer sequenziellen Bindung wird z. B. ein Gemisch mit mehreren Wiedergewinnungs- Tags mit einer ersten immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung in Kontakt gebracht und sodann mit einer zweiten immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung in Kontakt gebracht. Das Wiedergewinnungs-Tag-enthaltende Gemisch kann wiederholt mit weiteren immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen in Kontakt gebracht werden. Bei einer gleichzeitigen Bindung wird ein Gemisch mit mehreren Wiedergewinnungs-Tags mit einem Satz von immobilisierten Wiedergewinnungs-Tagbindenden Verbindungen in Kontakt gebracht, die mehr als eine unterschiedliche immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung umfassen. Sequenzielle und gleichzeitige Bindeverfahren können durch eine sequenzielle Bindung mit Sätzen von immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen, die mehr als eine Wiedergewinnungs- Tag-bindende Verbindung umfassen, kombiniert werden.
Ein Freisetzungsschritt erfolgt, um die Analyse der Polynukleotid-Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) zu ermöglichen, die an die immobilisierten Wiedergewinnungs-Tagbindenden Verbindungen gebunden wurden. Der Freisetzungsschritt dient der Freisetzung der Polynukleotid-Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte), die an den Festträger durch ihre spezifische Bindung an ihre dazugehörigen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen gebunden wurden. Typischerweise werden die Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) durch Dissoziieren der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen von den Wiedergewinnungs-Tags freigesetzt. Jedoch kann eine Freisetzung auch durch eine Durchtrennung der Verbindung (entweder kovalent oder nicht-kovalent) zwischen der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung und dem Festträger erfolgen. In jedem Fall ist es wichtig, dass der Freisetzungsschritt derart erfolgt, dass die Trennung der verschiedenen Sequenzierleitern beibehalten wird, die während der Bindung der Wiedergewinnungs- Tags an die immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen eingebracht wurde. Um zu ermöglichen, dass bei dem Freisetzungsschritt die Trennung der Sequenzierleitern beibehalten wird, werden die getrennten, freigesetzten Sequenzierleiter-Polynukleotide (oder Amplifikationsprodukte) einzeln gleichzeitig mit der Freisetzung gesammelt. Ein Sammeln der freigesetzten Polynukleotid-Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) kann durch unzählige verschiedene Verfahren und Vorrichtungsanordnungen erfolgen, die für ein Sammeln der freigesetzten Polynukleotide eingesetzt werden. Der Bereich geeigneter Sammelverfahren hängt zum Teil von der spezifischen Konfiguration des für die Immobilisierung der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen verwendeten Festträgers ab. Vorzugsweise ist das Sammeln der freigesetzten Polynukleotid-Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) direkt mit dem Beladen der freigesetzten Polynukleotid-Sequenzierleitern in eine Polynukleotid-Auftrennungsvorrichtung wie ein Elektrophoresegel integriert. Zum Beispiel kann eine Freisetzung der wiedergewinnbaren Sequenzierleitern in den Beladeregionen eines Sequenzierungs-Plattengels oder von Kapillaren erfolgen, wobei eine unterschiedliche Sequenzierleiter in jeder getrennten Laderegion abgelegt wird. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden die freigesetzten Sequenzierleitern getrennt voneinander in einzelnen Sammelgefäßen wie Röhrchen oder den Löchern von Mikrotiterplatten gesammelt und temporär vor einem Beladen einer Polynukleotid-Auftrennvorrichtung gelagert. Zum Beispiel können makroskopische Partikel mit auf ihren Oberflächen immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen in Eppendorf-Röhrchen nach der Bindung an wiedergewinnbare Sequenzierleitern überführt werden, um für die Freisetzung der Sequenzierleitern in den Eppendorf-Röhrchen zu sorgen. Die freigesetzten Sequenzierleitern können sodann auf eine Elektrophorese-Auftrennvorrichtung für eine Analyse überführt werden.
Die spezifischen Mittel, die für eine Freisetzung der Wiedergewinnungs-Tags von dem Festträger ausgewählt werden, werden in Abhängigkeit von den spezifischen Wiedergewinnungs-Tags und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen unterschiedlich sein, die für eine bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsform gewählt wurden. Der Freisetzungsschritterfordert nicht, dass 100% der gebundenen Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) freigesetzt werden, um wirksam zu sein. Die Menge des freigesetzten Polynukleotids muss nur ausreichen, um ein nachweisbares Signal des Markers auf den freigesetzten Polynukleotiden bereitzustellen. Eine Freisetzung kann durch eine Vielzahl von Möglichkeiten erfolgen, die an die spezifischen Wiedergewinnungs-Tags und Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen, die in den spezifischen Ausführungsformen eingesetzt werden, angepasst wurden. Verschiedene Wiedergewinnungs-Tags können durch dasselbe oder unterschiedliche Freisetzungsverfahren in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen freigesetzt werden. Vorzugsweise werden alle Wiedergewinnungs-Tags in einer bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsform durch dasselbe Verfahren freigesetzt. Falls die Wiedergewinnungs-Tags und Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen beides Polynukleotide sind, erfolgt eine Freisetzung vorzugsweise durch Denaturierung des Duplex (oder möglicherweise der Triple-Helix) zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und ihren entsprechenden Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen. Faktoren, die die Denaturierungstemperatur mehrfach-strängiger Polynukleotide steuern, wie die Kationenkonzentration, sind bekannt. Entsprechend kann eine Freisetzung der Polynukleotid- Wiedergewinnungs-Tags dadurch erfolgen, dass die gebundenen Polynukleotide erhöhten Temperaturen oder Denaturierungsmitteln wie Harnstoff oder Formamid in geeigneten Konzentrationen ausgesetzt werden. Ferner können Polynukleotid-Wiedergewinnungs-Tags durch enzymatische Mittel freigesetzt werden. Zum Beispiel können durch die Bereitstellung spezifischer Nukfeotid-Erkennungssequenzen in einer doppelsträngigen Form Restriktionsendonukleasen für eine Freisetzung verwendet werden. Typ II S-Restriktionsendonukleasen sind besonders für diese Aufgabe geeignet, da die Erkennungssequenz einer Typ II S- Restriktionsendonuklease von der Spaltstelle getrennt liegt, wodurch die Möglichkeit gegeben wird, dass die Erkennungssequenz in Polynukleotiden liegt, die als Wiedergewinnungs- Tag-bindende Verbindungen diener. Andere Nukleasen, die spezifisch für die doppelsträngige Region einer Wechselwirkung zwischen den Wiedergewinnungs-Tags und den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind, können für eine Freisetzung gebundener Sequenzierleitern oder Amplikons von Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen eingesetzt werden. Eine Kombination von Nuklease-resistenten Nukleotiden (oder Nukleotid- Analoga) in den Sequenzierleitern und von Nuklease-sensitiven Nukleotiden (oder Nukleotid- Analoga) in dem Wiedergewinnungs-Tag und/oder den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen kann für eine Erhöhung des Bereichs an Nukleasen eingesetzt werden, die für eine Freisetzung geeignet sind. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Freisetzung der Sequenzierleiter-Polynukleotide durch herkömmliche chemische Reaktionen im Gegensatz zu enzymatisch katalysierten chemischen Reaktionen erfolgen. Zum Beispiel kann ein Ribonukleotid (im Gegensatz zu einem Desoxyribonukleotid) in die Wiedergewinnungs-Tags und die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen eingebaut werden, um für eine Spaltung (und somit Freisetzung) durch Exposition gegenüber einem alkalischen Milieu zu sorgen. Falls Antikörper als Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen eingesetzt werden, kann eine Freisetzung durch hohe Salzkonzentrationen, eine erhöhte Temperatur oder Anpassung des pH-Werts erfolgen. In anderen Ausführungsformen können die Wiedergewinnungs-Tags von dem Festträger durch Aufbrechen der Bindung (typischerweise kovalent) zwischen der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung und dem Festträger freigesetzt werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Wiedergewinnungs- Tags und Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Polynukleotide. Die Freisetzung von Polynukleotid-Wiedergewinnungs-Tags erfolgt vorzugsweise durch Denaturierung. Die Verwendung von Sätzen an Wiedergewinnungs-Tags, die gleichzeitig unter ähnlichen Denaturierungsbedingungen freigesetzt werden können, vereinfacht stark die für den Freisetzungsschritt erforderliche Instrumentierung, da es nicht nötig ist, verschiedene Denaturierungsumgebungen für jeden gebundenen Wiedergewinnungs-Tag bereitzustellen. Sätze an wiedergewinnbaren Primern mit Wiedergewinnungs-Tags, die unter denselben oder ähnlichen Denaturierungs- oder Freisetzungsbedingungen freigesetzt werden können, werden hier als "integrierte" Sätze von wiedergewinnbaren Primern bezeichnet. Für die Bereitstellung eines integrierten Primer-Satzes werden die Wiedergewinnungs-Tags auf den Primern derart ausgewählt, dass sie Tm-Werte besitzen, die innerhalb von 15ºC, vorzugsweise innerhalb von 10ºC und besser innerhalb von 5ºC voneinander entfernt liegen. Der Tm-Wert ist die Denaturierungstemperatur wie gemessen zwischen der immobilisierten Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung und dem Wiedergewinnungs-Tag. Der Tm-Wert kann entweder empirisch oder durch empirisch bestimmte Formeln für eine Berechnung des Tm- Werts bestimmt werden. Beispiele solcher Formeln finden sich unter anderen in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego (1987), Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry, Part III: The Behavior of Biological Macromolecules, W.H. Freeman, NY (1980) und Saenger, Principles of Nucleic Acids Structure, Springer-Verlag, New York (1989) und ähnlichen. Die Verwendung von integrierten Sätzen von wiedergewinnbaren Primern ist besonders bei Kits für eine Multiplex-Sequenzierung oder für Multiplex-Amplifikationstests hilfreich. Zum Beispiel können integrierte Sätze wiedergewinnbarer Primer für die gleichzeitige Sequenzierung mehrerer Loci verwendet werden, die mit genetischen Erkrankungen korreliert sind. In ähnlicher Weise können integrierte Sätze wiedergewinnbarer Primer in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Verfahren einer Auftrennung mehrerer Polynukleotid-Amplifikationsprodukte, die ausgehend von wiedergewinnbaren Primern hergestellt werden, verwendet werden.
Um für die Bindung von Wiedergewinnungs-Tags an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen zu sorgen, können bei den erfindungsgemäßen Verfahren Festträger eingesetzt werden, die eine oder mehrere immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen umfassen. Derartige Festträger werden hier als Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen bezeichnet. Der Begriff "Festträger" umfasst hier einzelne Strukturen und Ansammlungen einzelner Bestandteile wie eine Ansammlung von Partikeln oder Fasern. Die Festträger für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen können aus einer Vielzahl von Materialien gebildet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Metalle, Polymere (wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylamid und ähnliches), Gläser oder Polysaccharide (wie Agarose, Cellulose). Festträger können aus einem Material oder aus Materialien gebildet werden, die derart ausgewählt werden, dass sie mit der Immobilisierung der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen kompatibel sind. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen werden auf dem Festträger in einer adressierbaren Weise immobilisiert. Der Begriff "adressierbar" wird verwendet, um darzustellen, das die Position der Wiedergewinnungs-Tags auf dem Träger vorbestimmt ist, so dass der gewünschte Wiedergewinnungs-Tag durch Auswahl einer spezifischen Position, d. h. einer "Adresse", auf dem Festträger (oder durch Auswahl einer spezifischen Einheit des Festträgers) aufgefunden werden kann. Der Begriff "adressierbar" umfasst hier in Bezug auf Festträger die Partikel und andere ähnliche Einheiten des Festträgers, die eine Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung oder Verbindungen umfassen, die gleichmäßig über den Träger verteilt sind. Jede Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung besitzt eine einzigartige Position auf dem Festträger (oder ist an einen einzigartigen Festträger gebunden). Die verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen sind voneinander auf dem Festträger in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen getrennt, bei denen mehrere Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen auf dem gleichen Festträger immobilisiert sind. Vorzugsweise sind die verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen voneinander durch Regionen des Festträgers getrennt, die keine Wiederge- winnungs-Tag-bindenden Verbindungen aufweisen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtung wie ein Lochbeladender Gelkamm als Festträger verwendet werden. Geeignete Mehrfachprojektions- Elektrophorese-Ladevorrichtungen weisen mehrere Vorsprünge auf, wobei auf jedem Vorsprung ein anderer Wiedergewinnungs-Tag immobilisiert ist. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der Festträger die Form eines planaren "Chips" aufweisen, der verschiedene räumlich adressierbare Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen umfasst. Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden an vorbestimmten Positionen auf Chips finden sich in den US-PSen 5,527,681, 5,424,186, 5,143,854, 5,405,783, 5,445,934 und 5,510,270. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Ansammlung mehrerer Partikel, vorzugsweise poröser makroskopischer Partikel, als Festträger eingesetzt, wobei alle Partikel eine einzigartige immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung umfassen. Die makroskopischen Partikel und somit die Wiedergewinnungs-Tagbindenden Verbindungen können voneinander durch Bereitstellung eines identifizierenden Markers auf jedem Partikel (oder auf einer Ansammlung ähnlicher Partikel) wie Farbkodierung, Symbole, Transponder-Markierung, Form, Größe, magnetische Markierung, Dichte und ähnliches unterschieden werden. Alternativ dazu können die Partikel voneinander, basierend auf der Polynukleotid-Sequenzinformation unterschieden werden, die von den auf den Partikeln immobilisierten Sequenzierleitern erhalten wird (oder von der Größe der Amplifikationsprodukte). Die Partikel können eine Vielzahl von Formen einnehmen, einschließlich sphärisch, kubisch, pyramidal, planar oder unregelmäßig. Vorzugsweise besitzen die Partikel eine Form und eine Größe, die die Packung unzähliger Partikel in ein kleines Volumen ermöglicht, wodurch der Kontakt zwischen der Lösung, die den Wiedergewinnungs-Tag enthält, und den Partikeln maximiert wird. Zusätzlich zu makroskopischen Partikeln können unterschiedlich markierte mikroskopische Partikel auch verwendet werden. Der Unterschied zwischen mikroskopischen Partikeln und makroskopischen Partikeln ist ein Hinweis auf die Verfahren, durch die die Partikel physikalisch handgehabt werden können. Im allgemeinen besitzen makroskopische Partikel eine Größe, die eine Handhabung einzelner Partikel ermöglicht, während mikroskopische Partikel zu klein sind, um die einfache Handhabung einzelner Partikel zu erlauben. Letztere können jedoch in Gruppen durch Verfahren wie magnetischer Transfer oder Zentrifugation handgehabt werden. Im allgemeinen besitzen makroskopische Partikel einen ungefähren mittleren Durchmesser (größte Dimension) von etwa 0,5 mm bis 5 mm, wobei 1 mm bis 3 mm bevorzugt ist. Mikroskopische Partikel besitzen im allgemeinen einen mittleren Durchmesser von weniger als 0,5 mm.
Die Wiedergewinnungs-Tags der Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte, d. h. Amplikons) können voneinander durch sequenzielle Bindung der Wiedergewinnungs-Tags auf mehreren Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukten) an verschiedene Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen getrennt werden, die auf verschiedenen Festträgern wie Partikeln immobilisiert sind. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung, die vier Sequenzierleitern umfasst, wobei jede Leiter einen einzigartigen Wiedergewinnungs-Tag besitzt, mit mehreren makroskopischen Partikeln (magnetisch oder andersartig) inkubiert werden, wobei jedes Partikel eine immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung umfasst, die für einen Wiedergewinnungs-Tag auf einer der Sequenzierleitern spezifisch ist. Die Partikel werden nach Eindung an Wiedergewinnungs-Tags sodann entfernt. Die entfernten Partikel können sodann gewaschen werden, um nicht spezifisch gebundene Polynukleotide zu entfernen. Das Verfahren wird sodann für zweite, dritte und vierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen wiederholt, die auf verschiedenen Partikeln immobilisiert sind und in dieselben die Sequenzierleitern enthaltenden Zusammensetzungen wie das erste Partikel eingebracht werden. Nach Abschluss des Waschens können die Wiedergewinnungs-Tags freigesetzt werden. In einem weiteren Beispiel einer sequenziellen Wiedergewinnung werden die Partikel, die immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen umfassen, mit einer ersten Lösung in Kontakt gebracht, die wiedergewinnbare Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) umfasst, aus der Lösung entfernt, gewaschen und mit einer zweiten Lösung in Kontakt gebracht, die wiedergewinnbare Sequenzierleitern (oder Amplifikationsprodukte) umfasst. Derartige Schritte können mehrfach wiederholt werden, bis die Wiedergewinnungs-Tags von den Partikeln freigesetzt werden.
In den erfindungsgemäßen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen sind die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen an den Festträger in einer Weise angebracht, die erlaubt, dass die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen mit ihren jeweiligen Wiedergewinnungs-Binde-Tags interagieren. Eine Vielzahl von Verfahren kann für die Immobilisierung der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen an den Festträger eingesetzt werden. Die spezifischen ausgewählten Verfahren werden von der Wahl der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen und der Festträger-Materialien abhängen. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen und Polynukleotiden sind bekannt. Zum Beispiel können Proteine an Festträger durch Formaldehyd, DMS (Dimethylsuberimidat) und reduktive Aminierung gebunden werden. Polynukleotide können an Festträger durch Stoffe wie 1,3-Diaminopropan, 3,3'-Iminobispropylamin, EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid, SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiopropionat)) und SATA (N-Succinimidyl- S-acetylthioacetat) gebunden werden. Beispiele von Resten für eine Kopplung von Oligonukleotiden an Festträger finden sich in Pon et al., Biotechniques 6: 768-775 (1988), Webb, US-PS 4,659,774, Barany et al., PCT-Patentanmeldung PCT/US91/06103, Brown et al., J Chem. Soc. Commun., 1989: 891-89.3, Dahma et al., Nucleic Acids Res. 18: 3813-3821 (1990), Beattie et al., Clinical Chemistry 39: 719-722 (1993), Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20: 1679-1684 (1992). Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen können an den Träger durch direkte oder indirekte Bindungen gebunden werden. Der Begriff "direkte Bindung" betrifft die kovalente Bindung der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung an den Festträger, einschließlich der kovalenten Bindung durch einen Linker (Verbindungsstück) (und gegebenenfalls einen Abstandshalter-Arm (spacer-arm)). Der Begriff "indirekte Bindung" betrifft die Bindung der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung an den Festträger durch ein spezifisches Bindepaar wie Biotin-Avidin (oder Streptavidin)- Paare, wobei ein Mitglied des Paars mit der Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindung und das andere Mitglied des Paars mit dem Festträger verbunden wird.
Zusätzlich zur Bereitstellung von Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung mehrerer Sequenzierleitern und darauffolgenden Auftrennung der Leitern werden erfindungsgemäß auch Verfahren zur Auftrennung mehrerer zugleich hergestellter Polynukleotid-Amplifikationsprodukte bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Auftrennungsverfahren von Polynukleotid- Amplifikationsprodukten können durch Modifizieren der erfindungsgemäßen Multiplex-Verfahren der Herstellung und Auftrennung von Sequenzierleitern erfolgen, so dass wiedergewinnbare Polynukleotid-Amplifikationsprodukte im Gegensatz zu wiedergewinnbaren Sequenzierleitern hergestellt werden. Verfahren zur Polynukleotid-Amplifikation sind bekannt. Detaillierte Protokolle für eine Polynukleotid-Amplifikation finden sich unter anderem in Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor Press, Coldspring Harbor (1995), AcPherson et al., PCR, A Practical Approach, Bd. 1, IRL Press Oxford, England (1991), McPherson et al., PCR, A Practical Approach, Bd. 2, IRL Press Oxford, England (1995) und in den US-PSen 4,683,202, 483,195 und 4,965,188. Ferner finden sich detaillierte Protokolle für eine Multiplex-PCR unter anderem in Shuber et al., Genome Research 5: 488-493 (1995), Eggerding, PCR Methods and Applications 4: 337-345 (1995), Cuppens et al., Molecular and Cellular Probes 6: 33-39 (1992) und in der US-PS 5,582,489. Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Auftrennung mehrerer zugleich hergestellter Polynukleotid-Amplifikationsprodukte umfassen die Durchführung von Polynukleotid- Amplifikationsreaktionen, wobei mindestens ein Mitglied eines Paars von Amplifikations-Primern ein wiedergewinnbarer Amplifikations-Primer ist. Falls beide Mitglieder eines Paars von Amplifikations-Primern wiedergewinnbare Primer sind, werden die hergestellten Amplifikationsprodukte zwei Wiedergewinnungs-Tags besitzen. Falls beide Mitglieder eines Paars von Amplifikations-Primern wiedergewinnbare Primer sind, können die Wiedergewinnungs-Tags gleich oder voneinander verschieden sein. Die Erfindung umfasst auch Ausführungsformen, bei denen Wiedergewinnungs-Tags und Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen derart ausgewählt werden können, um für die Isolierung von ausgewählten Sätzen an Nukleinsäure-Amplifikationsfragmenten im Gegensatz zu der Isolierung einzelner Amplifikationsfragmente zu sorgen. Im allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Auftrennung mehrerer zugleich hergestellter Polynukleotid-Amplifikationsprodukte (durch Multiplex-PCR oder ähnliche Amplifikationsverfahren) die Schritte des Mischens mehrerer wiedergewinnbarer Amplifikations-Primer mit Wiedergewinnungs-Tags mit mehreren Amplifikationsmatrizen. Nach dem Mischschritt werden die Amplifikationsmatrizen unter Verwendung von mindestens einem wiedergewinnbaren Primer amplifiziert, so dass mehrere Amplifikationsprodukte gebildet werden, wobei jedes Produkt einen Wiedergewinnungs-Tag aufweist und die Amplifikationsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß stattfindet. Sodann werden die Wiedergewinnungs-Tags und somit die Amplifikationsprodukte an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen gebunden, die auf einem Festträger in einer räumlich adressierbaren Weise immobilisiert wurden. Sodann werden die gebundenen Amplifikationsprodukte von den Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen freigesetzt.
Erfindungsgemäß werden auch wiedergewinnbare Primer mit Oligonukleotid-Wiedergewinnungs-Tags bereitgestellt, die während einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion nicht repliziert werden können. Somit wird, falls solche Primer in Polynukleotid-Amplifikationsreaktionen verwendet werden, ein zu dem Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotid komplementäres Verlängerungsprodukt nicht hergestellt. Diese wiedergewinnbaren Primer werden hier als "Gelenk-Primer" bezeichnet. Gelenk-Primer sind besonders wertvoll in hier beschriebenen Multiplex-Polynukleotid-Amplifikationen, da ein doppelsträngiges Polynukleotid, das den Wiedergewinnungs-Tag umfasst, nicht denaturiert (oder eine Renaturierung verhindert) werden muss, um für die Bindung eines Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotids an eine Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung, die ein komplementäres Oligonukleotid ist, zu sorgen. Wiedergewinnbare Primer, die einen Wiedergewinnungs-Tag umfassen, der während der Nukleinsäure-Amplifikation repliziert werden kann, schaffen während des Verlaufs der Polynukleotid-Amplifikation eine Polynukleotidsequenz, die zu der Wiedergewinnungs- Tag-Sequenz komplementär ist. Diese komplementäre Sequenz kann signifikant mit der Bindung eines Wiedergewinnungs-Tags an eine immobilisierte Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung (z. B. ein immobilisiertes komplementäres Oligonukleotid) kompetitieren. Dem entsprechend können Gelenk-Primer vorteilhafterweise in vielen erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, wo eine wirksame Wiedergewinnung der Amplifikationsprodukte durch Bindung an Verbindungen, die an Festträger immobilisiert sind, gewünscht ist.
Gelenk-Primer sind wiedergewinnbare Primer, die Oligonukleotid-Wiedergewinnungs-Tags aufweisen, die durch eine DNA-Polymerase während einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion nicht repliziert werden können. Es gibt viele verschiedene Oligonukleotide, die als Wiedergewinnungs-Tags verwendet und während einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion nicht repliziert werden können. In einer Ausführungsform von Gelenk-Primern ist der Wiedergewinnungs-Tag ein Oligonukleotid-Analogon, das nicht durch die in der Amplifikationsreaktion verwendete DNA-Polymerase repliziert werden kann. Beispiele solcher nicht-replizierbarer Oligonukleotid-Analoga umfassen in nicht begrenzender Weise Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) und ähnliches. Die Synthese von PNAs und die Struktur ist unter anderem in Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 1895-1897 (1992), Kosynkina et al., Tet. Lett. 35: 5173-5176, Dueholm et al., J Org. Chem. 59: 5767-5773 (1994) beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform von Gelenk-Primern kann der Wiedergewinnungs-Tag ein Oligonukleotid sein, das durch eine DNA-Polymerase repliziert werden könnte, jedoch durch einen nicht-replizierbaren Linker blockiert ist, der den Wiedergewinnungs-Tag mit dem Matrizen-hybridisierenden Sequenzteil des wiedergewinnbaren Primers verbindet. Ein solcher nicht-replizierbarer Linker kann ein Oligonukleotid-Analogon sein. Alternativ können in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen die nicht-replizierbaren Linker geringe oder keine strukturelle Ähnlichkeit mit natürlich auftretenden Polynukleotiden besitzen. Beispiele nicht-replizierbarer Linker, die Oligonukleotid-Analoga sind, umfassen Poly-5'→3'-desoxyribose (d. h. DNA ohne Nukleosidbasen), Peptid-Nukleinsäuren und ähnliches. Beispiele nicht replizierbarer Linker, die keine Oligonukleotid-Analoga sind, umfassen Polyethylenglykol, Kohlenwasserstoffe und ähnliches. Verfahren zur Bindung von Linkem an Polynukleotide sind bekannt und Beispiele für solche Bindungsverfahren finden sich in G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996). Typischerweise liegt der nicht-replizierbare Linker am 5-Ende der Matrizen-hybridisierenden Region des Gelenk-Primers, wodurch eine Wechselwirkung mit der Aktivität der DNA-Polymerase, die die Verlängerungsreaktion katalysiert, minimiert wird. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung kann der Wiedergewinnungs-Tag eines Gelenk-Primers in einer Amplifikationsreaktion durch die Bindungsstelle (oder Orientierung) des Wiedergewinnungs-Tags an den Primer wie an einer Position, die nicht das 5'-Ende des Primers ist, nicht-teplizierbar gemacht werden.
Erfindungsgemäß werden auch Verfahren einer Polynukleotid-Amplifikation unter Verwendung von Gelenk-Primern bereitgestellt. Diese Amplifikationsverfahren können eine Mehrfachbehandlung darstellen, um die Eigenschaften von Gelenk-Primern vollständig auszunutzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen den Schritt des Mischens von mindestens einem Gelenk-Primer mit einer oder mehreren Polynukleotid-Matrizen für eine Amplifikation unter Polynukleotid-Amplifikationsbedingungen. Im allgemeinen können Gelenk-Primer in der gleichen Weise wie andere wiedergewinnbare Primer in erfindungsgemäßen Multiplex- Polynukleotid-Amplifikationsreaktionen eingesetzt werden.
Obwohl die vorstehende Beschreibung der Erfindung primär die Verwendung wiedergewinnbarer Primer für eine Multiplex-Polynukleotid-Amplifikation betraf, wird dem Fachmann klar sein, dass die Verfahren leicht für eine Verwendung ohne wiedergewinnbare Primer angepasst werden können. Oligonukleotid-Primer ohne Wiedergewinnungs-Tags können für die Herstellung wiedergewinnbarer Sequenzierleitern oder wiedergewinnbarer Polynukleotid- Amplifikationsprodukte verwendet werden. Diese Verfahren werden als "Nicht-Wiedergewinnungs-Tag-Multiplex-Verfahren" bezeichnet. Nicht-Wiedergewinnungs-Tag-Multiplex-Verfahren verwenden die funktionellen Äquivalente von Wiedergewinnungs-Tags. In den Ausführungsformen von auf Nicht-Wiedergewinnungs-Tags basierenden Multiplex-Verfahren der erfindungsgemäßen Verfahren können wiedergewinnbare Primer gegen Primer ohne Wiedergewinnungs-Tags ausgetauscht werden, wobei Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen verwendet werden, die Polynukleotide sind, die eine Polynukleotidsequenz umfassen, die spezifisch an eine während der Herstellung einer Sequenzierleiter oder während des Verfahrens der Herstellung eines Polynukleotids neu gebildete Polynukleotidsequenz hybridisieren kann (vgl. Fig. 1D und 1E). Die neu hergestellten Polynukleotidsequenzen sind die Teile der Polynukleotidleiter oder des Amplikons, die keine Primer- Sequenz sind. Geeignete Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen für eine Verwendung mit derartigen Primern können spezifisch an ein neu synthetisiertes Polynukleotid oder an eine Kombination aus neu synthetisiertem Polynukleotid und Primer-Polynukleotid binden, das unmittelbar benachbart zu dem 3'-Ende des Primers liegt. Die Wiedergewinnungs- Tag-bindenden Verbindungen können derart gestaltet werden, dass sie an neu hergestellte Polynukleotidsequenzen binden, die auf dem Polynukleotidstrang liegen, der zu dem Polynukleotidstrang komplementär ist, der den Primer umfasst. Zum Beispiel kann eine Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung ein Polynukleotid sein, das zu der Polynukleotidsequenz in einem Amplikon komplementär ist, das ein Duplex mit einem der Amplifikations- Primer bildet. Für die Herstellung von Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen für eine Verwendung in den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Ausführungsformen muss Information bezüglich der Sequenz eines Teils der neu hergestellten Sequenz entweder bekannt sein oder vermutet werden. Multiplex-Verfahren, die nicht auf Wiedergewinnungs-Tags basieren, sind besonders interessant, da sie eine Verwendung von Primern mit "universellen" Matrizen-hybridisierenden Sequenzen in den erfindungsgemäßen Multiplex- Sequenzierungs- und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren erlauben. Der Begriff "universell" wird verwendet, um anzugeben, dass eine bestimmte Matrizen-hybridisierende Region eines Primers mit einem breiten Spektrum von Matrizen verwendet werden kann, da die Region der Matrize, an die der Primer hybridisiert, mehreren Matrizen gemeinsam ist.
Erfindungsgemäß werden auch Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen sind derart gestaltet, dass sie die erfindungsgemäßen Verfahren durch Ermöglichen der Bindung der Wiedergewinnungs-Tags (oder funktionellen Äquivalente von Wiedergewinnungs-Tags) an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen erleichtern. Die erfindungsgemäßen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen umfassen mehrere Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen, wobei jede Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung auf dem Festträger in einer adressierbaren Weise immobilisiert ist. Verschiedene Wiedergewinnungs-Tags, die auf derselben Vorrichtung vorhanden sind, sind voneinander getrennt, vorzugsweise getrennt durch das Festträgermedium. Im allgemeinen liegen die verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen in gleichen Mengen vor. Jedoch können Mengen der verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen normalisiert werden, um Unterschieden in der Bindeaffinität zwischen den verschiedenen spezifischen Bindepaaren Rechnung zu tragen. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen können einheitlich voneinander in einer regelmäßigen Anordnung getrennt sein. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Festträger eine Anordnung von Kapillarkanälen (Fig. 4). Die Kapillarkanäle sind parallel zueinander positioniert. Die Kapillarkanäle können in Form von Kapillarröhren vorliegen oder können Kanäle in einem Block sein, im Gegensatz zu einzelnen Kapillarröhren. Vorzugsweise sind die Kapillarkanäle untereinander in allen Dimensionen identisch. Der Durchmesser der Kapillarkanäle beträgt typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise, 25 bis 75 um. Kapillarkanäle mit vergleichbaren Querschnittsflächen können verwendet werden. Vorzugsweise besitzen die Kanäle einen einheitlichen Durchmesser entlang ihrer Länge. Jeder Kapillarkanal hat eine Einlassöffnung 10 und eine Auslassöffnung 20. Jeder Kapillarkanal bildet einen durchgängigen Weg für eine elektrophoretische Auftrennung. Die Einlassöffnungen dienen der Einbringung von Polynukleotiden für eine Auftrennung. Die Auslassöffnungen dienen der Entfernung der aufgetrennten Polynukleotide und stellen einen Stromweg für eine Elektrophorese bereit. Die erfindungsgemäßen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen umfassen mehrere Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen, wobei jede Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung proximal zu den Einlassöffnungen der Kapillarkanäle immobilisiert ist. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen können innerhalb der Einlassöffnung oder benachbart zur Einlassöffnung immobilisiert sein. Jede Einlassöffnung besitzt eine andere Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung. Vorzugsweise sind die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Polynukleotide.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen ist der Festträger eine Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtung wie ein Gelkamm mit mehreren lochfüllenden Mitgliedern, d. h. Vorsprünge sind lochfüllende Mitglieder (Fig. 3C). Die Vorsprünge können für ein Einbringen von Polynukleotiden in Elektrophoresegele verwendet werden. Jeder lochfüllende Vorsprung umfasst mindestens eine Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindung in Bindung an die Oberfläche des Vorsprungs, so dass die Bindung der Wiedergewinnungs-Binde-Tags durch die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen ermöglicht wird. Die lochfüllenden Vorsprünge können dieselben oder verschiedene Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen aufweisen. So können durch ein In-Kontakt-Bringen eines Reaktionsgemisches, das mehrere Sequenzierleitern oder Polynukleotid-Amplifikationsprodukte umfasst, die ausgehend von wiedergewinnbaren Primern synthetisiert wurden, mit den Vorsprüngen einer erfindungsgemäßen Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtung die verschiedenen Sequenzierleitern oder Amplifikationsprodukte aufgetrennt, gereinigt und auf den verschiedenen Vorsprüngen immobilisiert werden. Die erfindungsgemäßen Mehrfachprojektions- Elektrophorese-Ladevorrichtungen können eine oder mehrere flexible Regionen umfassen, so dass sich die Form der Vorrichtung derjenigen der Vorsprünge entspricht. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtungen sind die Vorsprünge derart positioniert, dass sie auf die Löcher (oder andere Flüssigkeitsbehälter), in denen die Primer-Verlängerungsreaktionen erfolgen, eingestellt sind. Zum Beispiel können, falls die Sequenzierungsreaktionen in Löchern von 96 Loch (8 · 12)-Mikrotiterplatten erfolgen, Mehrfachprojektions-Elektrophorese-Ladevorrichtungen mit 96 Vorsprüngen in einer 8 · 12-Anordnung verwendet werden, um die Polynukleotid-Reaktionsprodukte aus dem Loch zu entfernen und in eine Elektrophorese-Auftrennvorrichtung zu überführen.
Andere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen umfassen Sätze von zwei oder mehreren leicht handhabbaren Festträgereinheiten wie makroskopischen Partikeln, wobei jede Einheit eine oder mehrere Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen aufweist. In Ausführungsformen dieser Einheiten-Sätze mit mehreren verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen auf derselben Einheit können die verschiedenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen voneinander getrennt sein oder sie können nicht voneinander getrennt sein. Die Einheiten können identifizierende Marker (z. B. Farben, Nummern oder Marker) aufweisen. Die einzelnen Einheiten eines Satzes können miteinander verbunden werden, um für die einfache Handhabung jedes Mitglieds des Satzes zu sorgen. Die Einheiten können miteinander durch ein flexibles Verbindungsstück verbunden werden und ein solches Verbindungsstück kann leicht gebrochen werden, nachdem die Festträger aus der Lösung (oder den Lösungen) mit den Wiedergewinnungs-Tags entfernt wurden. Zum Beispiel kann die Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtung die Form makroskopischer Partikel besitzen, die miteinander durch eine "Schnur" verbunden sind (nicht unähnlich zu einem Perlenstrang). Somit würde das Herausziehen von einem der verbundenen Partikel aus einer die Wiedergewinnungs-Tags enthaltenden Lösung zum Herausziehen aller Partikel aus der Lösung führen. Die Verbindungen zwischen einzelnen Partikeln könnten selektiv getrennt werden, wodurch die gesteuerte Handhabung der einzelnen Partikel ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß werden auch Kits bereitgestellt, die zur Beschleunigung der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geschaffen wurden. Kits dienen der Beschleunigung der Durchführung von interessierenden Verfahren durch Zusammenfügen zweier oder mehrerer Bestandteile, die für eine Durchführung der Verfahren erforderlich sind. Kits enthalten vorzugsweise Bestandteile in vorgemessenen Einheitsmengen, so dass die Notwendigkeit für Messungen durch den Endverbraucher der Kits minimiert wird. Kits umfassen vorzugsweise Anleitungen für die Durchführung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Verfahren. Vorzugsweise sind die Bestandteile von Kits optimiert, so dass sie in Verbindung zusammenarbeiten. Die erfindungsgemäßen Kits können für die Herstellung und/oder Auftrennung mehrerer Amplifikationsprodukte oder Sequenzierleitern eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Kits umfassen einen Satz von mindestens zwei Primern, die für die Herstellung mehrerer wiedergewinnbarer Sequenzierleitern oder wiedergewinnbarer Amplifikationsprodukte angepasst wurden. Vorzugsweise sind die Primer-Sätze in den erfindungsgemäßen Kits integrierte Sätze wiedergewinnbarer Primer. Die Primer der erfindungsgemäßen Kits können getrennt oder in der gleichen Lösung bereitgestellt werden. Die wiedergewinnbaren Primer können oder können nicht markiert sein. Kits für die Herstellung mehrerer wiedergewinnbarer Amplifikationsprodukte umfassen mindestens zwei Paare von Amplifikations-Primern, wobei mindestens ein Mitglied jedes Paars ein wiedergewinnbarer Primer ist. Zusätzlich zu den wiedergewinnbaren Primern können die erfindungsgemäßen Kits ferner Primer-Oligonukieotide umfassen, die keinen Wiedergewinnungs-Tag umfassen. Die erfindungsgemäßen Kits für die Herstellung mehrerer wiedergewinnbarer Sequenzierleitern oder wiedergewinnbarer Amplifikationsprodukte können ferner Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen umfassen, die ausgewählt wurden, um spezifisch an die Wiedergewinnungs-Tags (oder funktionellen Äquivalente davon) zu binden, die auf den wiedergewinnbaren Polynukleotid- Amplifikationsprodukten oder wiedergewinnbaren Sequenzierleitern vorliegen, die unter Einsatz der Primer des Kits hergestellt wurden. Die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen können frei in Lösung oder immobilisiert an Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen bereitgestellt werden. Die erfindungsgemäßen Kits können ferner weitere Reagenzien umfassen, die für eine Polynukleotidsequenzierung oder -Amplifikation erforderlich sind. Solche Reagenzien umfassen konzentrierte Reaktionspuffer, dNTPs (alle vier Basen in der Nukleotid-Triphosphat-Form), Ketten-Terminatoren (entweder farbmarkiert oder nichtfarbmarkiert) und eine thermostabile DNA-Polymerase. Die erfindungsgemäßen Kits können ferner erfindungsgemäße Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen oder Festträger umfassen, die leicht in Polynukleotid-Wiedergewinnungsvorrichtungen wie lochfüllende Elektrophoresegel-Kämme, die mit Avidin beschichtet wurden, umgewandelt werden können.
Die vorstehend beschriebene Erfindung kann im Hinblick auf die nachstehenden Beispiele besser verstanden werden. Die Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht begrenzend zu verstehen.

BEISPIELE

Experiment #1

Multiplex-Primer-Seauenzierung dreier verschiedener Matrizen unter Verwendung Matrizenspezifischer Primer.

Drei verschiedene Plasmide, pGEM, pCDNA II 1.9 und pBSK, wurden gleichzeitig mit Hilfe des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens (Sanger et al., 74 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 5463, 1977) sequenziert.
Das verwendete Sequenz-herstellende Verfahren erfolgte im wesentlichen gemäß der Anleitung aus dem ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kits, F5 (PN402114) mit der Ausnahme, dass FAM-SP6, d. h. FAM-markierter SP6-Primer (A-, C- und G-Reaktionen) oder ROX-SP6, d. h. ROX-markierte SP6-Primer (T-Reaktion) (spezifisch für pGEM), JOE- 25T(C), d. h. JOE-markierter 25T(C)-Primer (spezifisch für pCDNA II 1.9) und TAMRA KS (spezifisch für pBSK)-Primer, alle zu jeder der A-, C-, G-, T-Stammlösungen hinzugegeben wurden.
Die Primer-Sequenzen waren wie folgt:
SP6: 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3' [SEQ ID NO: 1]
25T(C): 5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TC 3' [SEQ ID NO: 2
KS: 5' CCT CGA GGT CGA CGG TAT CG 3' [SEQ ID NO: 3]
Alle Matrizen (pGEM, pCDNA II 1.9 und pBSK) wurden zu jeder Multiplex-Reaktion hinzugegeben, ohne dass anderweitig die Sequenzierung modifiziert wurde. Nach einer Zyklisierung wurden die A-, C-, G- und T-Sequenzierungsgemische nicht miteinander (wie in dem Protokoll beschrieben) kombiniert, sondern getrennt voneinander mit Ethanol gefällt und elektrophoretisch auf einem Sequenziergel mit einem ABI 373 DNA-Sequenziergerät untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass in jeder der A-, C-, G- und T-Spuren alle drei Einfarben- Sequenzierleitern gleichzeitig nachgewiesen wurden. Durch die Auswahl einer Farbe zu einer bestimmten Zeit und die Kombination der A-, C-, G- und T-Spuren über das Gel wurden gute Sequenzierungsdaten für alle Matrizen erhalten, was zeigt, dass alle drei Reaktionen zugleich ohne offensichtliche Interferenz erfolgten.

Experiment #2

Multiplex-Terminationssequenzierung unter Verwendung von 12 verschiedenen Seguenzier- Primern mit einem Anhängsel, die 5 verschiedene Matrizen ansteuern, gefolgt von dem seguenzselektiven Herausziehen der Seguenzierfeitern.

Eine Multiplex-Sequenzierungsreaktion von 5 verschiedenen Matrizen wurde durchgeführt, gefolgt von dem auf selektiver Hybridisierung basierenden Herausziehen, das eine komplementäre Einfangsequenz auf einem Festträger verwendet.
7 der 12 Primer (MC12-F2, -F3, -F4, -F5, -F6, -RC1, -RC2) wurden derart entworfen, dass sie eine kontinuierliche Region in dem PCR-Produkt eines MC12 Blue Script-Vektors (~3000 bp-Fragment, das das gesamte Insert umfasst) ansteuern, so dass sich eine Überlappung in den Sequenzen der hergestellten Sequenzierungs-Verlängerungsprodukte (~400-700 Basen lang) ergab. Ein anderer Primer (5B5F5) war gegen einen Teil des Inserts eines 5B5-Vektors gerichtet, während die übrigen Primer (MSH2-7, -12, -13, -15) derart gestaltet waren, dass sie kurze PCR-Produkte (~200-500 bp) aus menschlicher genomischer DNA (Exons 7, 12, 13, 15 des MSH2-Gens) sequenzieren. Alle Matrizen wurden zugleich mit Hilfe des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens sequenziert (Sanger et al., 74 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 5463, 1977).
Das Protokoll entsprach im wesentlichen der Anleitung aus dem ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, FS (PN402116), mit der Ausnahme, dass die Konzentrationen der Sequenzierungsreagenzien und die Zyklusparameter optimiert wurden, um eine erfolgreiche Sequenzierung aller Matrizen unter denselben Bedingungen sicherzustellen. Die doppelte Konzentration an Sequenzierpuffer (~80 mM) und die dreifache Konzentration an Polymerase (~0,053 uM) und Pyrophosphatase (3 Einheiten), dNTPs (~2,4 mM) und Farb- Terminatoren (~1,2 mM) wurden für ein 12-faches Verfahren (d. h. 12-fache Multiplex- Sequenzierung) verwendet (Vergleich mit den empfohlenen Konzentrationen für eine einfache Reaktion). Die Gesamtkonzentration an Magnesium betrug ~7 mM und das Gesamtvolumen der Reaktion 30 ul. Die Konzentrationen der Matrizen betrugen ~0,013 uM für das MC12-PCR-Amplikon, ~0,02 uM für den 5B5-Klon bzw. ~0,01 uM für alle MSH2-PCR-Amplikons. Die Primer-Konzentrationen betrugen 0,05 bis 0,17 uM bei einer Gesamtkonzentration von ~1,2 uM. Die Zykluszahl und die Temperaturen waren 96ºC für 5 sec -53ºC für 10 sec - 60ºC für 4 min). 25 Zyklen wurden durchgeführt. Am Ende der Zyklen wurden die Röhrchen 8 min auf 99,9ºC erhitzt, um die gesamte enzymatische Aktivität zu zerstören.
Alle Sequenzier-Primer (wiedergewinnbare Primer) wurden derart synthetisiert, dass sie eine einzigartige 6 Basen lange DNA-Leitsequenz, d. h. eine balancierende Sequenz, am 5'-Ende aufwiesen. Die balancierende Sequenz hybridisierte nicht mit der Sequenzier-Matrize. Die Basenzusammensetzung der 12 verschiedenen 6 Basen langen Leitsequenzen war derart, dass die Schmelztemperatur für alle Primer- und komplementären Herauszieh-Sequenzen ähnlich wäre. Die komplementäre Herauszieh-Sequenzen (d. h. Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen) waren 15 Basen lang und derart gestaltet, dass sie zu der 6mer-Leitsequenz zusammen mit 9 Basen der Hybridisierungsregion komplementär waren, die. benachbart zu dem 6mer lagen. Die Oligos für das Herausziehen besaßen ein gebundenes 3'-Biotin, so dass sie an einen Festträger durch eine Biotin/Streptavidin-Bindung gekoppelt werden konnten. Ein solches System ermöglicht die Auftrennung und einfache Handhabung der spezifisch hybridisierten Sequenzierungs-Verlängerungsprodukte während Hybridisierungs-, Wasch- und Elutionsschritten.
Die Sequenzen der wiedergewinnbaren Primer und der Wiedergewinnungs-Tag-Verbindungen waren wie folgt:
1) MC12-F2: 5' TTG GCT (Anhängsel) ACT TAG TGC ATA TTT TAA CGG TAC 3' (Primer) [SEQ ID No: 4]
5' GCA CTA AGT AGC CAA 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 5]
2) MC12-F3: 5 CTC TCT (Anhängsel) CCC AAG AGC AGT TAC ATT ACA AGG 3' (Primer) [SEQ ID NO: 6]
5' GCT CTT GGG AGA GAG 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 7]
3) MC12-F4: 5' GGG TTT (Anhängsel) ATT CAG TGG TAC CCC TAC TCA GAG 3' (Primer)
5' CCA CTG AAT AAA CCC 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 8]
4) MC12-F5: 5' CCA CCT (Anhängsel) AAA TAA GCT TTA ATG TAA AAT ATG 3' (Primer) [SEQ ID NO: 9]
5' AGC TTA TTT AGG TGG 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 10]
5) MC12-F : 5' GAA GCT (Anhängsel) TCT TCT AAA AAG TAC TAA TGT TTG 3' (Primer) [SEQ ID NO: 11]
5' TTT AGA AGA AGC TTC 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 12]
6) MC12-RC1: 5' AGA GAG (Anhängsel) TGT TAT AGA ATC TTC ATG GAC ATC 3' (Primer) [SEQ ID NO: 13]
5' ACT ATA ACA CTC TCT 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 14]
7) MC12-RC2: 5' AAT TAA (Anhängsel) ATG GTC CTA GTT AAT AAA GAT CAC 3' (Primer) [SEQ ID NO: 15]
5' TAG GAC CAT TTA ATT 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 16]
8) 5B5-F5: 5' ATC AGG (Anhängsel) TAA CAG TCA TCA TAT TGT GTA TGC 3' (Primer) [SEQ ID NO: 17]
5' TGA CTG TTA CCT GAT 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 18]
9) MSH-7: 5' ATT AGA (Anhängsel) CGA CTT AGT TGA GAC TTA CGT GC 3' (Primer) [SEQ ID NO: 19]
5' ACT AAG TCG TCT AAT 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 20]
10) MSH-12: 5' GAA GCA (Anhängsel) TCA GTA TTC CTG TGT ACA TTT 3' (Primer) [SEQ ID NO: 21]
5' GAA TAC TGA TGC TTC 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 22]
11) MSH-13: 5' GCG ATA (Anhängsel) GTA GCA GAA AGA AGT TTA AAA CTT GC 3' (Primer) [SEQ ID NO: 23]
5' TTC TGC TAC TAT CGC 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 24]
12) MSH-15: 5' AGA CAT (Anhängsel) TGC TGT CTC TTC TCA TGC TG 3' (Primer) [SEQ ID NO: 25]
5' GAG ACA GCA ATG TCT 3' (Einfang-Sequenz) [SEQ ID NO: 26]
Nach Durchführung der Sequenzierungsreaktion wurde jede der 12 Sequenzierleitern sequenziell aus dem Gemisch durch selektive Hybridisierung herausgezogen. Der Hybridisierungsschritt erfolgte auf folgende Weise. Zuerst wurde der Festträger (Streptavidinbeschichtete Kieselerde-Partikel) mit den gebundenen Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen dreimal mit 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% Tween® 20 und sodann einmal in 100 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, 2 mM NaCl, 0,1% Tween® 20 vorgewaschen. Die Partikel wurden sodann mit der Multiplex-SequenzierungsreaktiOn bei 32ºC 30 min inkubiert. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion wurde das Röhrchen kurz abzentrifugiert, um die Partikel mit dem Herausziehkomplex zu fällen, und die SequenzIerungsreaktion wurde in das nächste Hybridisierungsröhrchen übergeführt. Die Partikel mit Dem Herausziehkomplex wurden zweimal in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% Tween® 20 und einmal in 70% Ethanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Vor einer elektrophoretischen Analyse wurden die durch Hybridisierung gebundenen Sequenzierungs-Verlängerungsprodukte in 2,5 ul Standard-Ladepuffer (deionisiertes Formamid und Dextranblau/EDTA-Gemisch 5 : 1) durch Erhitzen für 4 min auf 60ºC freigesetzt.
Gute Sequenzierdaten wurden für alle angesteuerten Matrizen erhalten, was zeigt, dass alle Reaktionen zugleich erfolgreich erfolgten und wirksam eingefangen werden konnten. Die Gesamtsignale waren ausreichend, um eine gute Genauigkeit bis zu etwa 600 Basen zu gewährleisten. Im Falle von überlappenden Primern stellte sich heraus, dass das Signal an Intensität verlor (während es immer noch redundante Sequenzinformation bereitstellte), falls die Sequenz die Hybridisierungsreaktion des nächsten Primers erreichte. Das sehr geringe Hintergrundsignal zeigte, dass keine nicht-spezifische Bindung auftrat.

Experiment #4

Multiplex-PCR-Reinigung unter VerNendungvon Gelenk-PCR-Primern.

Als Modell für das Herausziehen einer Multiplex-PCR-Reaktion erfolgten drei einzelne PCR- Reaktionen getrennt voneinander und wurden sodann in ein Röhrchen vereinigt. Ein Gelenk- Primer wurde in jedem der drei Paare von Amplifikations-Primern verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden selektiv aufgereinigt, wobei ein auf Hybridisierung basierendes Herausziehen eingesetzt wurde, das spezifisch für die Wiedergewinnungs-Tag-Oligonukleotide auf den Gelenk-Primern war. Die PCR erfolgte im wesentlichen gemäß PCR Protocols, Michael A. Innis et al., 1990, Academic Press Inc., und den US-PSen 4,683,195 und 4,683,202, Juli 1987.
Drei verschiedene PCR-Amplifikationen erfolgten getrennt, wobei der GeneAmpTM PCR Reagent Kit mit AmpliTaq GoIdTM DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, PN# N801- 0055) verwendet wurde. Das verwendete Verfahren entsprach im wesentlichen der Anleitung aus dem PCR-Kit, mit der Ausnahme, dass die Konzentration der PCR-Reagenzien und die Zyklusparameter für eine erfolgreiche Amplifikation optimiert wurden.
Standard-PCR-Reaktionsbedingungen waren: 111 ng DNA aus der Raji-Zelllinie, 200 fM der Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 100 nM dNTP-Gemisch, 175 nM MgCl&sub2;, 1 · PCR-Puffer aus dem Kit, 2,5 Einheiten AmpliTaq GoldTM Polymerase und destilliertes Wasser, um das Endvolumen der Reaktion auf 50 ul zu bringen.
Das PCR-Temperaturprofil war: 95ºC - 10 Minuten für eine Aktivierung des AmpliTaq GoldTM-Enzyms, sodann 28 Zyklen von 97ºC für 8 Sekunden, 5900 für 40 Sekunden und 72ºC für 72 Sekunden. Die Zyklen wurden von einem Erhitzen für 10 Minuten bei 99,9ºC gefolgt, um das Taq Gold-Enzym zu inaktivieren und zuletzt wurde die Reaktion auf 4ºC für eine Lagerung abgekühlt.
Die drei verschiedenen verwendeten PGR-Primer-Sätze wurden derart gestaltet, dass drei verschiedene Regionen menschlicher genomischer DNA amplifiziert wurden. Die angesteuerten MSH-2-Regionen von menschlicher genomischer DNA wurden einzeln hergestellt, wodurch kurze Amplikon-Produkte (200-500 bp) produziert wurden. Ein Primer aus jedem PCR-Primer-Satz war ein wiedergewinnbarer Gelenk-Primer, bei dem ein 15 Basen langes Oligonukleotid an seinem 3'-Ende an das 5'-Ende des Matrizen-spezifischen PCR-Primers gebunden war. Die zwei Oligenukleotide, die beide Gelenk-Primer darstellen, wurden physikalisch durch (eine) "Nicht-DNA"-Linker-Einheit(en) gekoppelt, die durch eine DNA-Polymerase nicht repliziert werden konnte(n). Das einzigartige 15 Basen lange Oligonukleotid, das an die PCR-Primer gebunden war, war nicht verlängerbar und stellte keine Matrize für das Polymerase-Enzym dar, das für die Katalyse der PCR eingesetzt wurde. Dadurch verblieb ein Teil des Primers einzelsträngig und war für ein Einfangen, d. h. eine Hybridisierung an das an einen Festträger gebundene komplementäre 15 Basen lange Oligonukleotid verfügbar.

PCR-Primer-Sätze

EXON7
Exon7-Gelenk-Vorwärts-Primer:
5' TTG GCT AGT TAG TGC 3'-Linker 5' CGA CTT AGT TGA GAC TTA CGT GC 3' [SEO ID NO: 27]
Wiedergewinnungs-Tag-Sequenz-Linker-Vorwärts-Primer
Tag-Bindesequenz:
5' GCACTAACTAGCCAA 3' [SEQ ID NO: 28]
Exon 7-reverser Primer: 5' TTT ATG AGG ACA GCA CAT TGC 3' [SEQ ID NO: 29]
EXON12
Exon12-Gelenk-Vorwärts-Primer
5' GGG TTT ATT CAG TGG 3'-Linker 5' TCA GTA TTC CTG TGT ACA TTT 3'
Wiedergewinnungs-Tag-Sequenz-LÜnker-Vorwärts-Primer
[SEQ ID NO: 30]
Tag-Bindesequenz:
5' CCACTGAATAAACCC 3'
[SEQ ID NO: 31]
Exon 12-reverser Primer:
5' TTA CCC CCA CAA AGC CCA A3'
[SEQ ID NO: 32]
EXON13
Exon 13-Gelenk-Vorwärts-Primer:
5' CCA CCT AAA TAA GCT 3'-Linker- 5' GTAGCAGAAAGAAGTTTAAAACTT GC3'
Wiedergewinnungs-Tag-Sequenz-Linker-Vorwärts-Primer [SEQ ID NO: 33]
Wiedergewinnungs-Tag-bindende Sequenz:
5' AGCTTATTTAGGTGG 3' [SEQ ID NO: 34]
Exon 13-reverser Primer:
5' GGACAGAGACATACATTTCTATCTTC 3' [SEQ ID NO: 35]
Die Amplifikationsergebnisse wurden durch Agarosegelelektrophorese verifiziert. Die drei verschiedenen PCR-Amplifikationsreaktionen wurden gemischt. Partikel, die die komplementären Einfang-Sequenzen (d. h. Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen) umfassten, wurden mit 1 · TE und 0,1% Tween® 20-Lösung zweimal vorgewaschen, zentrifugiert, um die Partikel zu fällen und Waschflüssigkeit zu entfernen. Das Multiplex-PCR- Gemisch wurde zu dem ersten Satz an Einfang-Pärtikeln in einem Röhrchen hinzugegeben und gemischt. Dieses Reaktionsgemisch wurde 2 Minuten auf 8000 vorerhitzt und sodann auf 32ºC für eine 30-minütige Inkubation abgekühlt, um das selektive, auf Hybridisierung basierende Einfangen zu ermöglichen. Das Gemisch wurde sodann zentrifugiert, um die Partikel zu fällen. Die Lösung wurde in das nächste spezifische Einfangträger-Röhrchen überführt und die Hybridisierungsreaktion sequenziell für jedes andere Amplikon wiederholt. Die Partikel mit den gebundenen Amplikons wurden in 1 · TE und 01% Tween® 20-Lösung zweimal und einmal in 70% Ethanol gewaschen und sodann in einer SpeedVac unter vermindertem Druck getrocknet. Aus einer Verdünnung der Trägerpartikel wurden die eingefangenen Amplikons mit Hilfe des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens sequenziert (Sanger et al., 74 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 5463, 1977). Die Sequenzierungsreaktionen erfolgten mit dem ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, PN# 402078) unter Verwendung von 2 umol spezifischem Sequenzier-Primer. Das Temperaturprofil der Sequenzierungsamplifikation erfolgte über 25 Zyklen (96ºC für 8 Sekunden, 53ºC für 15 Sekunden, 60ºC für 4 Minuten). Gute Sequenzierdaten wurden für alle drei angesteuerten Matrizen erhalten, was zeigt, dass die ReakTion erfolgreich in einer ausreichenden Konzentration und Reinheit aus dem Multiplex-PCR-Gemisch der Amplikons eingefangen wurde. Die Gesamtsignale waren ausreichend, um eine gute Genauigkeit bereitzustellen. Das niedrige Hintergrundsignal zeigte das Fehlen einer nicht-spezifischen Bindung bei dem Einfangen. Die einzelnen PCR-Herausziehprodukte wurden ebenfalls durch Gelelektrophorese vor ihrer Verwendung als Matrizen für Sequenzierreaktionen analysiert, was zeigte, dass tatsächlich einzelne PCR-Produkte eingefangen worden waren.

ÄQUIVALENTE

Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen stellen das Fachwissen auf dem Gebiet dar, zu der die Erfindung gehört.
Die vorstehende Beschreibung sollte ausreichen, um dem Fachmann die Durchführung der Erfindung zu ermöglichen. Tatsächlich sollen verschiedene Modifikationen der vorstehend beschriebenen Möglichkeiten einer Durchführung der Erfindung, die für den Fachmann offensichtlich sind, innerhalb des Umfangs der nachstehenden Ansprüche liegen.

Claims

1. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung mehrerer Sequenzierleitern aus mehreren Sequenzier-Matrizen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

Mischen mehrerer wiedergewinnbarer Primer, die einzigartige Wiedergewinnungs- Tags umfassen, mit mehreren Polynukleotid-Matrizen,

Herstellen mehrerer Polynukleotid-Sequenzierleitern, wobei jedes Verlängerungsprodukt von einem der wiedergewinnbaren Primer abgeleitet ist,

Binden der Verlängerungsprodukte an Wiedergewinnungs-Tag-bindende Verbindungen, wobei die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen in einer adressierbaren Weise auf einem oder mehreren Festträgern immobilisiert sind.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Freisetzens der Verlängerungsprodukte von den Festträgern umfasst, wobei mehrere gereinigte Polynukleotid-Sequenzierleitern hergestellt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wiedergewinnungs-Tags Oligonukleotide sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei wenigstens einer der Wiedergewinnungs-Tags eine balancierende Polynukleotidsequenz umfasst.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der die Sequenzierleiter bildende Schritt den Schritt der Zugabe eines markierten Ketten-Terminators umfasst.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die wiedergewinnbaren Primer markiert sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenzier-Matrizen auf dem gleichen Polynukleotid liegen.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenzier-Matrizen auf verschiedenen Polynukleotiden liegen.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Polynukleotide sind.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Festträger eine Mehrfachprojektions- Elektrophorese-Ladevorrichtung ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Festträger aus mehreren Partikeln besteht.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei jede Sequenzier-Matrize durch eine Polynukleotid-Amplifizierungsreaktion hergestellt wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Polynukleotid-Sequenzierleitern durch Zyklus-Sequenzierung gebildet werden.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wiedergewinnungs-Tag-bindenden Verbindungen Polynukleotide sind, die zu Polynukleotiden komplementär sind, die während der Herstellung der Sequenzierleitern synthetisiert werden.