DE69603723T2

DE69603723T2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69603723T2
Application number: DE69603723T
Authority: DE
Inventors: Charles Cantor; Cassandra Smith; Przemyslaw Szafranski; Ron Yaar
Original assignee: Boston University
Current assignee: Boston University
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: DE69603723D1; US5753439A; WO1996036731A3; ATE183244T1; CA2221467A1; EP0827551A2; EP0827551B1; AU6248696A; WO1996036731A2

Description

Rechte an der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten mit der vom US- Energieministerium bereitgestellten Subvention DE-FG02- 93ER61609 und der vom US-Verteidigungsministerium bereitgestellten Subvention AIBS2154 gemacht, und die Regierung der Vereinigten Staaten hat an der Erfindung bestimmte Rechte.[0001]

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von repetitiven und anderen identifizierbaren Nucleinsäuresequenzen. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Bestimmung und Kartierung von bestimmten Nucleinsäuresequenzen gegen einen komplexen Hintergrund.[0002]

2. Hintergrund der Erfindung

Früher war man bei der Diagnose von Erbkrankheiten auf die Identifikation anormaler Genprodukte oder ihrer klinischen Auswirkungen wie Anämie, geistiges Zurückbleiben und gewisse Arten der Schizophrenie angewiesen. Aufgrund der direkten Analyse des Genoms ist es nun möglich, genetische Mutationen zu identifizieren und eine Behandlung anzubieten, bevor sich die Symptome manifestieren. Heutzutage durchgeführte genetische Analysen reichen von Grobanalysen wie der Karyotypbestimmung bis zur Analyse einzelner Basenpaare durch Sequenzieren. Obwohl bereits große Fortschritte gemacht wurden, ist die Sequenzierung von Nucleinsäuren nach wie vor für den Diagnosealltag zu arbeits- und kostenaufwendig, außer wenn es sich um ein medizinisch-experimentelles Forschungslabor handelt.[0003]
Viele genetische Defekte wie Burkitt-Lymphom und gewisse Mutationen der Sichelzellanemie und Thalassemie lassen sich nachweisen, ohne daß man auf ein Sequenzieren zurückgreifen muß. Zu solchen Techniken zählen Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) sowie die Chromosomen- Karyotypbestimmung. Die allgemeine Anwendbarkeit dieser Verfahren ist jedoch insofern beschränkt, als die meisten genetischen Defekte weniger stark ausgeprägt sind und die Restriktionsstellen nicht verändern bzw. keine Chromosomenumlagerungen verursachen. Durch die Polymerasekettenreaktion und die Ligasekettenreaktion läßt sich die Empfindlichkeit vieler Nachweisverfahren erhöhen und sich so Veränderungen bei einem einzelnen Basenpaar einer Nucleinsäure nachweisen. Sind jedoch wiederholte Sequenzen an der Mutation beteiligt, so sind sogar Nachweisemittel PCR und LCR aufgrund der Degeneriertheit der Sequenzwiederholungen unverläßlich.[0004]
Dinukleotid- und Trinukleotidsequenz-wiederholungen werden bei der genetischen Analyse immer wichtiger. Diese Wiederholungen sind im menschlichen Genom weit verbreitet und polymorph und bieten sich dazu an, Gene, die mit bestimmten Phenotypen assoziiert sind, bequem zu lokalisieren (M. S. Wehnert et al., Nuc. Acids Res. 22 : 1701-4, 1994; G. Benson et al., Nuc. Acids Res. 22 : 4828-36, 1994).[0005]
Bei mindestens vier Erbkrankheiten des Menschen wurden Ausdehnungsmutationen von repetitiven Trinukleotidsequenzenen identifiziert (C. T. Caskey et al., Sci. 256 784-89, 1992). Jede wird von Mutationsmechanismen verursacht, durch die sich normalerweise polymorphe repetitive Exon- Trinukleotide über den normalen Größenbereich hinaus ausdehnen und die Genexpression oder die Stabilität der mRNA verändern oder bestimmte Funktionen übernehmen. Beim "Fragile X"- Syndrom (FraX; D. L. Nelson et al., Nature Genetics 4 : 107- 108, 1993), der zweithäufigsten genetischen Form des geistigen Zurückbleibens sowie bei der myotonischen Dystrophie (MD; D. J. Brook et al., Cell 68 : 799-808, 1992) kann die Ausweitung der repetitiven Sequenzen ziemlich groß sein, was zu tausenden Triplets führt. Bei der spinalen und bulbären Muskelatrophie (SBMA oder Kennedy-Syndrom) sowie bei der Huntington- Krankheit kann diese Ausweitung nur aus dem Zweifachen der normalen Anzahl repetitiver Sequenzen bestehen.[0006]
Bei dem bei "Fragile X" ausgeweiteten genetischen Element handelt es sich um ein Triplet, das mit FMR-1 bezeichnet wird. Diese Sequenz, nämlich CGG, ist in der allgemeinen Bevölkerung hochpolymorph und bewegt sich zwischen ungefähr 6 bis ungefähr 42 Triplets pro Person. Familienmitglieder, die nicht unter der Krankheit leiden, können bis zu 50 repetitive Sequenzen enthalten. Beträgt die Anzahl der repetitiven Sequenzen zwischen 50 und 200, so bezeichnet man die betroffenen als Prä-Mutations-Fälle. Bei kranken Patienten ist bekannt, daß Ausweitungen bis zu mehreren tausend repetitiven Sequenzen vorliegen.[0007]
Bei der myotonen Dystrophie handelt es sich um eine autosomale dominante Störung, die durch Muskelschwäche gekennzeichnet ist und bei der es sich um die häufigste Form des Auftretens im erwachsenen Alter handelt. Das hierfür verantwortliche Gen, nämlich DM-1, wurde identifiziert.[0008]
Zum Nachweis von Unterschieden bei der Anzahl der repetitiven Sequenzen existieren viele Verfahren. Bei traditionellen Analysen werden elektrophoretische Trennungsschritte durchgeführt. Solche Schritte sind Zeit- und aufwandmäßig stark beschränkend und es fehlt ihnen die Empfindlichkeit, kurze Deletionen in langen Sequenzen nachzuweisen (M. B. White et al., Genomics 5 : 301-6, 1992). Obwohl der chemische Nachweis und die Spaltung von Fehlpaarungen schlagkräftig sind, werden dazu im allgemeinen gefährliche Verbindungen verwendet (P. M. Smooker et al., Mutant. Res. 288 : 65-77, 1993). Die Entdeckung, daß DNA wirkungsvoll an feste Oberflächen gekoppelt werden kann, sowie Fortschritte, die bezüglich Fluoreszenzmarkierung und Fluoreszenz-nachweis gemacht wurden, haben den Weg für die Entwicklung von Assays geebnet, mit denen sich die Länge dieser repetitiven Di- und Trinukleotidsequenzen rasch und genau bestimmen läßt.[0009]
Aus WO-A-91/15600 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine Zielsequenz dadurch nachgewiesen wird, daß man sie mit einer Sonde mit 5'- und 3'-komplementären Regionen und einer internen variablen Region hybridisiert, diesen hybridisierten Komplex aus Zielsequenz und Sonde mit einer einzelsträngigen spezifischen Nuklease verdaut und die Zielsequenz nachweist. Hierbei wird weder eine Sondenreihe noch eine Behandlung mit Nucleinsäurepolymerase vor dem Nachweisschritt durchgeführt.[0010]
In Nuc. Ac. Res., Band 22, 1994, S. 1701-1704 beschreiben Wehnert et al. die Verwendung von Reihen zum Nachweis von kurzen Sequenzwiederholungen in Tandemanordnung.[0011]
Aus EP-A-0 497 272 ist die Verwendung einer Polymerase zur Verdrängung eines Strangs mit Einzelstrangbruch von einer doppelsträngigen Nucleinsäure bekannt.[0012]
Aus w0-A-93/22462 ist die Verwendung von Polymerasen nach dem Einführen von Einzelstrangbrüchen in doppelsträngigen Nucleinsäuren in Positionen mit Fehlpaarungen für Markierungszwecke bekannt.[0013]
Aus WO-A-94/28175 ist ein Verfahren zur Feststellung der Anzahl der in einer gegebenen Zielsequenz vorliegenden Sequenzwiederholungen bekannt.[0014]

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung löst die mit den gebräuchlichen Strategien und Ansätzen einhergehenden Probleme und Nachteile und stellt neue Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Nucleinsäuresequenzen bereit, wie dies in den Ansprüchen definiert ist.[0015]
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz innerhalb einer Nucleinsäure. Die Nucleinsäure wird mit einer Sondenreihe hybridisiert, wobei jede Sonde eine dieser Nucleinsäure komplementäre 5'-Region, eine dieser Nucleinsäure komplementäre 3'-Region und eine interne variable Region enthält. Die hybridisierte Reihe wird mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease verdaut und mit einer Nucleinsäurepolymerase behandelt. Länge oder Sequenz der Zielsequenz können unterschiedlich sein und zum Beispiel mehrere kurze repetitive Sequenzen oder eine homologe Sequenz von Basen mit unterschiedlicher Länge enthalten. Sequenz und Länge des Ziels können durch Hybridisieren mit einer spezifischen Sonde und Widerstand gegen die einzelstrangspezifische Nuklease identifiziert werden.[0016]
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich zur Bestimmung der Länge einer Zielsequenz innerhalb einer Nucleinsäure verwenden. Bei der Nucleinsäure kann es sich um ein PCR-Produkt, wie eine amplifizierte Nucleinsäuresequenz, oder um ein DNA- oder RNA-Makromolekül, das gegebenenfalls direkt aus einer biologischen Probe aufgereinigt wird, handeln. Die interne variable Region kann eine homologe Basensequenz wie zum Beispiel eine Sequenz von Inosinresten, die mit Nucleinsäuren unspezifisch hybridisieren, enthalten. Hybridisierte Sonden, die gegen Nukleaseverdau resistent sind, weisen die gleiche Länge wie die Zielsequenz auf.[0017]
Eine weitere Anwendung der Erfindung ist die Bestimmung der Anzahl repetitiver Sequenzen innerhalb einer Nucleinsäure. Die Nucleinsäure wird mit einer Sondenreihe hybridisiert, wobei jede Sonde eine dieser Nucleinsäure komplementäre 5'-Region, eine dieser Nucleinsäure komplementäre 3'- Region und eine interne Region, die eine oder mehrere repetitive Sequenzen enthält, hybridisiert. Die hybridisierte Reihe wird mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease verdaut und mit einer Nucleinsäurepolymerase behandelt. Hybridisierte Sonden, die gegen Nukleaseverdau resistent sind, enthalten die gleiche Anzahl repetitiver Sequenzen wie die Zielsequenz.[0018]
Die Erfindung läßt sich für das Screenen eines Patienten, bei dem eine genetische Störung vermutet wird, verwenden. Man entnimmt von dem Patienten eine Gewebeprobe und erhält eine Nucleinsäuresequenz zum Beispiel mittels PCR- Amplifikation oder durch direkte Aufreinigung einer Zielsequenz. Die Nucleinsäure wird mit einer Sondenreihe hybridisiert, wobei jede Sonde eine der Nucleinsäure komplementäre 5'-Region und 3'-Region sowie eine variable interne Region enthält. Die hybridisierte Reihe wird mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease verdaut und mit einer Nucleinsäu repolymerase behandelt. Hybridisierte Sonden, die gegen Nukleaseverdau resistent sind, enthalten eine spezifische Anzahl repetitiver Sequenzen. Aus der Anzahl der repetitiven Sequenzen, die vorliegen, läßt sich das Vorliegen bzw. die Abwesenheit der genetischen Störung bestimmen.[0019]

Beschreibung der Zeichnungen

[0020]

Fig. 1 Schema der Reaktionsstrategie
Fig. 2 Ergebnisse der Fehlpaarungsspaltung mit S1- Nuklease
Fig. 3 Markierung der 51-Spaltprodukte mit radioaktiv-markierten Nukleotiden
Fig. 4 Radioaktive Markierung von mit 51 gespaltenen gepaarten und fehlgepaarten Substraten mittels DNA- Polymerase
Fig. 5 Schema zum Nachweis von Fehlpaarungen unter Verwendung von verankerten einzelsträngigen Oligonukleotidsonden
Fig. 6 Zweidimensionale Reihe zum Nachweis von 10 bis 109 repetitiven Sequenzen

Beschreibung der Erfindung

[0021] Die Erfindung, die wie im vorliegenden Text beschrieben ausgeführt und grob beschrieben ist, bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation von Zielsequenzen aufgrund der Größe oder Basensequenz und auf Reihen von Nucleinsäuresonden, die sich für diese Verfahren verwenden lassen.
[0022] Das Screenen von Nucleinsäuren zum Nachweis und zur Identifikation von Nucleinsäuren ist weitverbreitet. Vorliegen bzw. Fehlen dieser spezifischen Nucleinsäuren, was aufgrund ihrer Sequenzen identifiziert wird, kann häufig als Beweis von Störungen wie Infektionen, Neoplasmen und Erbkrankheiten angesehen werden. Obwohl zur Zeit verschiedenste Verfahren verfügbar sind, handelt es sich beim Nachweis von Sequenzen im allgemeinen um ein langswieriges und teures Unternehmen, das materialintensiv ist und hochgeschulte Arbeitskräfte erfordert.
[0023] Es wurde gefunden, daß durch Kombinieren bestimmter mikrochemischer Werkzeuge wie Nucleinsäuresonden, Nucleinsäurehybridisierung und enzymatische Spaltung von Heteroduplex- Hybriden, Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielsequenzen entwickelt werden können. Charakteristische Sequenzen, wie sie bei Variationen zwischen Mikroorganismenstämmen und zwischen einigen repetitiven Sequenzen vorkommen, lassen sich rasch und genau nachweisen und identifizieren.
[0024] Nucleinsäuren, die diese Zielsequenzen enthalten, können mit Oligonukleotidsonden, die Sequenzvariationen wie eine unterschiedliche Länge repetitiver Sequenzen enthalten, hybridisiert werden. Durch fehlgepaarte repetitive Sequenzen gebildete Schleifenstrukturen können durch Inkubation mit einer Nuklease gespalten werden, wodurch man mit Einzelstrangbrüchen versehene Doppelstränge erhält. Diese Einzelstrangbrüche werden von einer Nucleinsäurepolymerase, die einen der Stränge abbaut oder verdrängt, erkannt. Durch Analyse der Produkte mittels z. B. differenzieller Markierung erhält man eine Auskunft über die Art der Fehlpaarung sowie über die Länge der perfekt gepaarten repetitiven Sequenzen. Da alle Reaktionen in situ und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden können, lassen sich die Verfahrensschritte leicht automatisieren. Viele Assays könnten parallel durchgeführt werden, was die rasche Analyse von Zielsequenzen unterschiedlicher Herkunft gestattet.
[0025] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielsequenz innerhalb einer Nucleinsäure. Nucleinsäuren, die nachzuweisende Zielsequenzen enthalten, können direkt oder indirekt aus natürlichen oder synthetischen Quellen gewonnen werden. Zu den synthetischen Quellen zählen durch chemische Synthese erzeugte Sequenzen wie Oligonukleotide oder PNA-Sequenzen. Zu natürlichen Quellen von Nucleinsäuresequenzen zählen von einem Patienten entnommene Körpergewebe- oder
- flüssigkeitsproben, oder Umweltproben wie Biomasse, Boden oder Wasser. Direkt aus solchen Quellen gewonnene Nucleinsäuren können gegebenenfalls durch Techniken wie Zentrifugation, Chromatographie, chemische Extraktion, Fällung oder andere Techniken, oder Kombinationen von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden. Da die Sequenzinformation leicht transkribiert oder repliziert werden kann, kann es sich bei der Nucleinsäure entweder um RNA oder um DNA handeln, und sie kann entweder in Sense- oder in Antisense- Orientierung vorliegen.
[0026] Die Nucleinsäuren sind vorzugsweise einzelsträngig, können jedoch teilweise einzelsträngig und teilweise doppelsträngig sein. Einzelsträngige Regionen hybridisieren mit Sondensequenzen, und doppelsträngige Regionen können Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme oder Stellen für andere nucleinsäuremodifizierende Enzyme enthalten, oder für die chemische Kopplung von nachweisbaren Markern verwendet werden. Falls erforderlich lassen sich einzelsträngige Nucleinsäuren leicht durch eine Vielzahl von Verfahren ausgehend von Zielsequenzen herstellen. Die Stränge der meisten Doppelheli ces können, wenn sie einmal durch Behandlung mit 8M Harnstoff, niedrigem oder hohem pH oder Temperaturen von 95ºC denaturiert worden sind, getrennt werden, zum Beispiel durch denaturierende Elektrophorese. Man kann jedoch auch eine Polymerasekettenreaktion mit einem Primer bzw. einem Überschuß eines Primers unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize durchführen, wodurch das Produkt hauptsächlich aus einem Strang besteht. Zum Beispiel mit einem biotinylierten Primer gebildete Elongationsprodukte lassen sich mit einer Streptavidinsäure isolieren. mRNA oder Einzelstrang-cDNA lassen sich ebenfalls isolieren und können als Einzelstrang-Ziel verwendet werden.
[0027] Die die Zielsequenz enthaltende Nucleinsäure wird vorzugsweise als Polymerasekettenreaktion (PCR)-Produkt hergeste llt. Das Prinzip des PCR-Verfahrens ist in US-Patent Nr. 4,683,195 beschrieben. Varianten des PCR-Verfahrens sind in den US-Patenten Nr. 5,043,272, 5,057,410 und 5,106,727 beschrieben. Als PCR-Produkt verfügt die Nucleinsäure sowohl über 5'- als auch über 3'-terminale Sequenzen, die mit den Sequenzen der in der PCR-Reaktion verwendeten Primer identisch sind. Diese Primer flankieren die zu amplifizierende Sequenz, die die Zielsequenz enthält. Typischerweise sind die Primer unter etwa 35 Nukleotide lang, können jedoch je nach Bedarf, um die Nucleinsäure zu erzeugen, kleiner oder größer sein. Obwohl dies nicht erforderlich ist, sind die Sequenzen der Primer im allgemeinen bei den Primern, die mit einem relativ einzigartigen Teil der Nucleinsäure spezifisch hybridisieren, bekannt und führen zu identifizierbaren Nucleinsäuren bei PCR-Amplifizierung. PCR-Produkte können praktisch beliebige Längen aufweisen und lassen sich von unspezifischen und unerwünschten Amplifikations-produkten aufgrund ihrer Größe unterscheiden.
[0028] Bei der PCR und bei jedem beliebigen Polymeraseamplifikationsverfahren können die 5'-Termini eines Primers mit Verlängerungen versehen werden, um das Produkt nach der Amplifikation manipulieren zu können, ohne daß dies wesentliche Auswirkungen auf die Amplifikationsreaktion hat. Bei diesen 5'-Verlängerungen kann es sich um Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, um Struktursequenzen oder um andere Sequenzen, die für das Verfahren wünschenswert sind, handeln. Kurz gesagt wird Template-DNA zuerst durch Erhitzen in Gegenwart eines großen molaren Überschusses jedes der beiden Oligonukleotide und der vier dNTPs denaturiert. Die Reaktionsmischung wird auf eine Temperatur abgekühlt, bei der der Oligonukleotid-Primer mit den Zielsequenzen reassoziieren kann, wonach die reassoziierten Primer mit DNA-Polymerase verlängert werden können. Der Zyklus bestehend aus Denaturierung, Reassoziierenlassen und DNA-Synthese, das Prinzip der PCR- Amplifizierung, wird viele Male wiederholt, wodurch man das Produkt, das leicht identifiziert werden kann, in großen Mengen erzeugt. Diese Temperaturzyklen sind aufgrund der Verwendung einer DNA-Polymerase möglich, die bei den zur Denaturierung erforderlichen höheren Temperaturen nicht zerstört wird. Sowohl DNA- als auch RNA-Polymerasen zählen zu den Nucleinsäurepolymerasen, die zur Amplifizierung verwendet werden können. Viele nützliche hitzestabile Polymerasen für die PCR- Amplifikation sind im Handel erhältlich, wie zum Beispiel Taq-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) sowie AmpliTaq- DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT).
[0029] Das Hauptprodukt dieser exponentiell verlaufenden Reaktion ist ein Stück einer doppelsträngigen Nucleinsäure, das leicht z. B. durch chemische Denaturierung, pH- Denaturierung oder Hitzedenaturierung in Einzelstränge zerlegt wird, wobei die Termini der Einzelstränge durch die 5'- Termini der Oligonukleotid-Primer definiert sind und deren Länge durch die Distanz zwischen den Primern definiert ist. Unter normalen Reaktionsbedingungen wird die Polymerasemenge nach 25 bis 30 Zyklen oder ungefähr einmillionenfacher Amplifikation limitierend. Eine weitere Amplifikation wird dadurch erzielt, daß man die Probe 1000-fach verdünnt und als Template für weitere Amplifikationszyklen in einer anderen PCR verwendet. Nach diesem Verfahren lassen sich Amplifikationsniveaus von 10&sup9; bis 10¹&sup0; während 60 aufeinanderfolgender Zyklen erzielen. So kann durch Hybridisierung mit radioaktiven Sonden eine einzige Kopie der Zielsequenz in Gegenwart von DNA- Kontamination nachgewiesen werden. Ohne Verwendung der sequentiellen PCR kann die praktische Nachweisgrenze der PCR auch nur 10 DNA-Kopien pro Probe sein.
[0030] Obwohl die PCR ein verläßliches Verfahren zur Amplifikation von Zielsequenzen darstellt, können auch viele andere Techniken verwendet werden, wie zum Beispiel isothermische Amplifikation, Ligasekettenreaktion (LCR), "selfsustained sequence replication" (3SR), "polymerase chain reaction linked ligase chain reaction" (pLCR), "gaped ligase chain reaction" (gLCR), "ligase chain detection" (LCD). Das Prinzip der Ligasekettenreaktion beruht teilweise auf der Ligation zwei benachbarter synthetischer Oligonukleotid-Primer, die nur mit einem Strang der Ziel-DNA oder -RNA hybridisieren. Ist das Ziel vorhanden, so können die beiden Oligonukleotide mittels Ligase kovalent gebunden werden. Ein zweites Primer-Paar, das zu dem ersten Primer-Paar beinahe vollständig komplementär ist, wird ebenfalls bei einer Ligasekettenreaktion bereitgestellt. Bei einer Ligasekettenreaktion werden das Template und die vier Primer zusammen mit einer thermostabilen Ligase in einen Thermocycler gegeben. Beim Erhöhen und Erniedrigen der Temperatur werden die Oligonukleotide ne beneinander auf dem Template renaturiert und ligiert. Das ligierte Produkt einer Reaktion dient als Template für einen darauffolgenden Ligationszyklus. Das Vorhandensein eines Ziels wird als DNA-Fragment nachgewiesen, dessen Länge gleich der Summe der beiden benachbarten Oligonukleotide ist. Zu zusätzlichen PCR-Varianten zählen die in-situ-PCR und die Immun-PCR-Amplifikation, wobei Nucleinsäurefragmente verwendet werden, die mit pathogenspezifischen Antikörpern gekoppelt sind, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird.
Nucleinsäuren können jedoch auch nach der Reinigung unter Verwendung von z. B. DNA- oder RNA-Polymerasen, PCR oder einer anderen Amplifikationstechnik analysiert werden. Bei der PCR- Analyse von RNA, RT-PCR genannt, wird die RNA, wie zum Beispiel mRNA-Sequenzen, reverse transkribiert, wodurch man cDNA-Kopien erhält. Diese Ziel-cDNA-Sequenzen werden mit Primern hybridisiert, die die Nucleinsäure mittels PCR- Amplifikation amplifizieren.
[0031] Obwohl eine starke Amplifikation möglich sein kann, mag sie nicht immer erforderlich oder sogar erwünscht sein, zum Beispiel wenn es wahrscheinlich ist, daß die amplifizierte Sequenz während des Amplifikationsvorgangs mutiert oder auf andere Weise verändert wird. In solchen Fällen kann die PCR auf einige wenige Amplifikationszyklen beschränkt werden oder überhaupt nicht verwendet werden, und die Sequenz kann unter Verwendung konventionellerer Nucleinsäurepolymerasen repliziert werden.
[0032] Die Sequenz der Nucleinsäure inklusive Zielsequenz wird von der Sequenz der von der Probe erhaltenen Nucleinsäure bestimmt. Synthetische Sequenzen können jedoch hinzugefügt werden, oder die gesamte Nucleinsäure kann synthetisch hergestellt werden. Die Nucleinsäuren als solche können eine beliebige Kombination von Purinen oder Pyrimidinen, Purin- oder Pyrimidinmodifikationen oder -derivate oder andere chemische Molekülteile, die mit einer Nucleinsäuresequenz spezifisch oder unspezifisch hybridisiert werden können, enthalten. Zum Beispiel können neutrale Basen, diejenigen, die mit beinahe allen anderen Basen unspezifisch hybridisieren, wie zum Beispiel Inosin oder Inosin mit Modifikationen oder -derivate, eingebaut werden. Außerdem kann der Einbau von Resten wie mit Thiolgruppen versehenen Basen, mit Bor versehenen Basen, Polyamiden und Peptidnucleinsäuren, zu Sequenzen führen, die gegen Enzym abbauresistent sind.
[0033] Sequenzen der Nucleinsäure inklusive der Zielsequenz können Protein kodieren, oder es kann sich um völlig nichtkodierende Sequenzen wie Struktursequenzen oder Expressionsregulationssequenzen handeln. Zu den Struktursequenzen zählen ribosomale RNA und Telomere. Zu den Kontrollsequenzen zählen Promotersequenzen, Enhancer, 5'- und 3'- nichttranslatierte Sequenzen sowie Sequenzen, die nicht bei der Expression agieren, wie Ribozyme. Die Identifikation von Varianten innerhalb solcher Sequenzen kann bei der Bestimmung von Behandlungen wichtig sein, wie beim Identifizieren der Anzahl der repetitiven Sequenzen, bei der Bestimmung der Molekülstruktur und bei der Schaffung von Verbindungen. Zum Beispiel kann es sich bei Zielsequenzen innerhalb der Nucleinsäure um Sequenzen handeln, die für eine bestimmte Art oder einen bestimmten Stamm eines Organismus, wie eines Bakteriums, eines Virus, eines Parasiten oder eines Pilzes oder für die Sequenz eines translatierten oder nichttranslatierten Teils eines Eukaryonten- oder Prokaryontengens, spezifisch sind. Dadurch, daß man solche Sequenzen identifiziert, kann man den Organismus nachweisen und häufig auch identifizieren. Die Zielsequenz kann jedoch auch eine homologe Sequenz wie Inosin, Uracil (U) oder Desoxyuracil (dU) enthalten, wenn nur die Länge der Zielsequenz zu bestimmen ist.
[0034] Nucleinsäuren werden mit einer Sondenreihe durch beliebige Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, hybridisiert. Zum Beispiel können Hybridisierungen in einer gepufferten Salzlösung wie SSC (3M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) oder SSPE (3M NaCl, 0,2 M Natriumphosphat, 0,02 M EDTA, pH 7,4) durchgeführt werden. Wenn die Schmelztemperatur der Doppelhelix von der Basenzusammensetzung unabhängig ist und nur von der Länge abhängig ist, können andere Lösungen verwendet werden. Zu Lösungen mit dieser Eigenschaft zählen Lösungsmittel, die quartäre Alkylammoniumsalze enthalten, wie Tetramethyl-ammoniumchlorid- oder Tetraethylammonium-chloridlösungen. Bei quartären Alkylammoniumlösungen sind die Bindungsstärken der AT-Basenpaare und der GC-Basenpaare ungefähr gleich.
[0035] Jede Sonde der Reihe enthält Regionen, die zu einem oder mehreren Teilen der Nucleinsäure komplementär sind. Vorzugsweise enthalten die Sonden 5'- und 3'-Regionen, die zu Teilen der Nucleinsäuren komplementär sind, sowie eine interne variable Region. Die Sequenz und/oder Länge der variablen Region kann unterschiedlich sein, und eine der Sequenzen der variablen Region der Reihe ist vorzugsweise zu der Zielsequenz komplementär oder hybridisiert auf andere Weise vollständig mit der Zielsequenz. Varianten der Sondensequenz hindern bestimmte Sonden daran, vollständig mit der Nucleinsäure, die die Zielsequenz enthält, zu hybridisieren. Diese Heteroduplex-Sonden, die entweder in der Sonde oder in der Nucleinsäure einen nichthybridisierten Teil enthalten, können mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease verdaut werden.
[0036] Sonden und Nucleinsäuren können auf gleiche oder unterschiedliche Weise mit nachweisbaren Markern markiert werden. Zu den nachweisbaren Markern zählen Radioisotope wie ¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ³&sup5;P oder ³H, stabile Isotope oder chemische Molekülteile wie eine fluoreszierende, lumineszierende oder chemolumineszierende Verbindung. Zu zusätzlichen Markern, die verwendet werden können, zählen chromogene Chemikalien, Metalle, Kopplungsmittel wie Biotin/Streptavidin oder Avidin, massenmodi-fizierende Molekülteile, magnetische Mittel oder Chemikalien, die mittels kernmagnetischer Resonanz oder Elektronenspinresonanz nachgewiesen werden können. Die Marker können enzymatisch eingebaut werden, zum Beispiel während der Schaffung der Nucleinsäure oder dadurch, daß man die Endstruktur chemisch modifiziert. Besonders nützliche Markerverbindungen sind solche, die die Polymerasereaktion nicht stören, zum Beispiel Rhodamin, Fluorescein, Dansylchlorid, Cumann, Digoxin, Fluorescamin sowie Derivate und Modifikationen dieser Verbindungen.
[0037] Sonden oder Zielnucleinsäuren können auch auf einen festen Träger aufgebracht oder frei in Lösung sein. Sind sie frei in Lösung, so kann die Hybridisierung auf geordnete Weise wie zum Beispiel in gut getrennten Näpfchen einer Mikrotiterplatte oder Multiwellplatte oder gemeinsam in einem einzigen Näpfchen oder einer kleinen Anzahl Näpfchen erfolgen. Auf diese Weise können die Hybride batchweise der Reihe nach analysiert werden, um die Anzahl Sonden, die zum Identifizieren einer unbekannten Zielsequenz erforderlich ist, so gering wie möglich zu halten. Es ist jedoch auch möglich, Sonden mit Nucleinsäuren auf geordnete Weise so zu hybridisieren, daß die einzelnen Hybridisierungsvorgänge genau gezählt werden können. Geeignete feste Träger sind zum Beispiel Kunststoffe, Gläser, Keramiken, Metalle, Harze, Gele, Membranen, Chips wie Hybridisationschips sowie Kombinationen dieser Materialien und Strukturen.
[0038] Diese hybridisierte Reihe, die entweder fixiert oder frei in Lösung ist, wird mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease verdaut, um Einzelstrangregionen wie Heteroduplexe und endständige Elongationen zu spalten. Zu den Nukleasen, die sich für den Verdau von hybridisierten Sonden eignen, zählen diejenigen Nukleasen, die vorzugsweise einzelsträngige Nucleinsäuren spalten. Zu den bevorzugten Nukleasen zählen die Endonukleasen wie 51-Nuklease, Mungbohnennukleasen, Ribonuklease A und Rinonuklease T1. Nucleinsäuren oder Sonden, die endständige Einzelstränge erzeugen, können mit Exonukleasen wie T4- und T7-Phagen-Nukleasen verdaut werden. Falls erwünscht, kann durch Behandlung mit einem Überschuß an Nuklease eine Doppelstrangspaltung erzeugt werden, und zwar dadurch, daß man den Einzelstrangbruch zu einer Lücke ausweitet und so auf dem gegenüberliegenden Strang eine einzelsträngige Region erzeugt. Solche Doppelstrang-schnitte können sich bei Verfahren mit fragmentierten Sonden als nützlich erweisen.
[0039] Mit Einzelstrangbrüchen versehene Hybride können mit einer endständigen Desoxytransferase oder mit einem anderen geeigneten Enzym, das Nucleinsäure modifiziert, markiert werden, und Vorstufen von dNTPs oder ddNTP können nachweisbar mit einem Radioisotop, einem stabilen Isotop oder einem chemischen Molekülteil wie einem fluoreszierenden, lumineszierenden oder chemolumineszierenden Molekülteil markiert werden. Zu zusätzlichen Markern, die verwendet werden können, zählen chromogene Chemikalien, Metalle, Kopplungsmittel wie Biotin/Streptavidin oder Avidin, massenmodi-fizierende Molekülteile, magnetische Mittel oder Chemikalien, die mittels kernmagnetischer Resonanz oder Elektronenspinresonanz nachgewiesen werden können.
[0040] Die verdauten hybridisierten Sonden werden dann mit einer Nucleinsäurepolymerase in Kontakt gebracht, um Stränge mit Einzelstrangbrüchen zu verlängern und so einen Strang des Heteroduplex zu verdrängen. Zu Polymerasen, die sich für die Elongation eignen, zählen beliebige Polymerasen, die ein Template nach einem Einzelstrangbruch verlängern können. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen sich die meisten DNA-Polymerasen der meisten Organismen. Beispiele geeigneter Polymerasen sind zum Beispiel die menschliche DNA- Polymerase I, II und III, die DNA-Polymerase I, II und III aus E, coli, die T7-, T3- und SP6-Polymerase, thermostabile DNA-Polymerase, Sequenase sowie Amplitaq-Polymerase.
[0041] Die vorliegende Erfindung kann zur Messung der Länge einer Zielsequenz verwendet werden. Sonden, die für Längenmessungen konstruiert sind, enthalten vorzugsweise neutrale Basen, wie Inosinreste, die durch zwei konstante Regionssequenzen flankiert sind. Neutrale Basen verfügen über den Vorteil, daß einem die Zielsequenz nicht bekannt sein muß. Neutrale Basen bilden stabile Basenpaare mit allen vier konventionellen Basen, und die Paarungsstärke ist in jedem Fall ungefähr gleich. Wird eine neutrale Base verwendet, so ist der Assay nur gegenüber der Länge, jedoch nicht gegenüber der Sequenz, des Ziels empfindlich.
[0042] Die Erfindung läßt sich zum Nachweis der Anzahl der repetitiven Sequenzen in einer Zielnucleinsäure verwenden. Eine Zielsequenz kann von einer natürlichen Quelle oder einer synthetischen Quelle stammen. Zu den natürlichen Quellen von Zielsequenzen können DNA und RNA eines Organismus zählen. Die Nucleinsäure kann von Sequenzen stammen, die ein Protein kodieren, wie Exons und mRNA. Die Nucleinsäure kann auch von strukturellen und von nichtkodierenden Sequenzen stammen, wie ribosomale RNA und Telomeren. Gene, die repetitive Sequenzen aufweisen, wie Human-TFIID und die größte Untereinheit der Human-DNA-Polymerase II, weisen interne repetitive Trinukleotidsequenzen auf, die Homopeptidstränge kodieren, deren Länge von Organismus zu Organismus schwankt. Zu nicht kodierenden repetitiven Sequenzen zählen repetitive DNA sowie telomere Sequenzen. Synthetische Nucleinsäurequellen können von einer Reaktion im Labor, einem Nucleinsäure-Synthesizer stammen. Zu weiteren Nucleinsäurequellen zählen Nucleinsäuren, mit denen Industrie- und Konsumgüter versetzt werden.
[0043] Zur Bestimmung der Anzahl der repetitiven Sequenzen in einer Zielsequenz wird die Zielsequenz mit mehreren Sonden hybridisiert, wobei jede keine repetitive Sequenz, eine repetitive Sequenz oder mehr als eine repetitive Sequenz enthält. Entspricht die Anzahl der repetitiven Sequenzen in dem Ziel nicht der Anzahl der repetitiven Sequenzen in der Sonde, so können auf dem Hybrid zwischen Ziel und Sonde eine oder mehrere Einzelstrangschleifen vorliegen. Nur bei Hybriden mit perfekter Paarung liegen keine Einzelstrangschleifen vor. Perfekte Paarungen sind Hybride zwischen Nucleinsäureziel und Sonden mit der gleichen Anzahl repetitiver Sequenzen. Eine Behandlung mit Einzelstrangnuklease nach der Hybridisierung verdaut alle Einzelstrangschleifen, wodurch Hybride mit Einzelstrangbrüchen sowie Hybride ohne Einzelstrangbrüche zurückbleiben. Eine Polymerase-behandlung nach dem Verdau elongiert und verdrängt Stränge von allen Hybriden mit Einzelstrangbrüchen. Die einzigen Hybride, auf die eine Behandlung mit Polymerase keinen Einfluß hat, sind Hybride mit perfekter Paarung und ohne Einzelstrangbrüche. Durch Verfolgen der Polymerasereaktion läßt sich der Hybrid mit perfekter Paarung identifizieren, und die Anzahl der repetitiven Sequenzen in dem Ziel kann bestimmt werden.
[0044] Die Polymerasereaktion läßt sich mit verschiedenen Methoden verfolgen. Die Polymeraseelongationsreaktion kann in Gegenwart von Nukleotidtriphosphaten mit einem nachweisbaren Molekülteil durchgeführt werden. Ein solcher nachweisbarer Molekülteil ist ein radioaktiver Marker wie ³²P oder ³&sup5;S am α- Phosphat. Alle Hybride mit einer falschen Anzahl repetitiver Sequenzen werden markiert, während der Hybrid mit der gleichen Anzahl repetitiver Sequenzen unmarkiert bleibt. Der Assay gestattet so die genaue Identifikation der Basenzahl oder der Zahl der repetitiven Sequenzen in einer Zielsequenz. Diese Verfahren sind als solche schneller und empfindlicher als zur Zeit verfügbare Verfahren.
[0045] Die Erfindung kann zum Screenen eines Patienten verwendet werden, von dem vermutet wird, daß er eine Erbkrankheit trägt. Eine Gewebeprobe wie zum Beispiel eine Gewebsprobe oder eine Körperflüssigkeitsprobe wird entnommen, und die Nucleinsäure wird mittels PCR amplifiziert, gereinigt oder kloniert. Die Zielnucleinsäuresequenz wird mit einer Sondenreihe hybridisiert, mit Nuklease und Polymerase behandelt, und das Vorliegen bzw. Fehlen des genetischen Defekts wird nachgewiesen. Zu Störungen, die nachgewiesen werden können, zählen zum Beispiel die myotone Dystrophie, Huntington- Krankheit, Kennedy-Krankheit und "Fragile X"-Syndrom. Bei den Patienten kann es sich um ein beliebiges Säugetier wie zum Beispiel einen Menschen handeln. Die Patientenproben können gewonnen und gepoolt werden, um die Anzahl der Tests, die zur Identifizierung eines positiven Trägers erforderlich sind, zu reduzieren, oder sie können der Reihe nach im Vergleich zu verschiedenen unterschiedlichen Sondenreihen untersucht werden, um die Anzahl der erforderlichen Tests und Sonden weiter zu beschränken.
[0046] Bei der Erfindung werden Sondenreihen verwendet, wobei jede Sonde eine konstante 5'-Region, eine konstante 3'- Region und eine variable interne Region aufweist, wobei die variable Region eine oder mehrere repetitive Sequenzen enthält. Die repetitive Sequenz enthält heterologe oder homologe Sequenzen, die bezüglich Länge oder Basensequenz variieren. Die Sequenzen enthalten Purin- oder Pyrimidinbasen oder neutrale Basen wie Inosin. Entweder die Nucleinsäuren oder die Sonden der Reihe können mit einem nachweisbaren Marker markiert oder an einem festen Träger angebracht sein. Die Reihen können nach Struktur oder Sequenz räumlich geordnet sein, wobei die Sequenzen der Sonden bekannt oder zu bestimmen sind. Die Sonden können einzelsträngig, teilweise einzelsträngig und teilweise doppelsträngig sein. Die Sonden können ebenfalls mit nachweisbaren Markern markiert werden. Die Reihen können zwischen ungefähr 100 und ungefähr 10,000 unterschiedliche Sonden umfassen, vorzugsweise zwischen ungefähr 50 und 5,000 unterschiedliche Sonden, oder je nach Bedarf mehr oder weniger.

Beispiele

Beispiel 1 Synthese, Reinigung und Charakterisierung der Oligonukleotide

[0047] Synthetische Oligonukleotide mit der folgenden Sequenz wurden mit einem Oligonukleotid-Synthesizer (Operon Technologies, Inc.) synthetisiert. Die Oligonukleotide weisen die folgenden Sequenzen auf:

T1 (78-mer)

5'-CCAGATCTGA TGCGTCGGAT CATCCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGTC ACGCTAACCG AATCCCTGGT CAGATCTT-3'
(SEQ 1D NO 1)

T2 (78-meti

5'-AAGATCTGAC CAGGGATTCG GTTAGCGTGA CTGCTGCTGC TGCTGCTGCT GCTGGATGAT CCGACGCATC AGATCTGG-3'
(SEQ 1D NO 2)

CTG6 (72-mer)

5'-AAGATCTGAC CAGGGATTCG GTTAGCGTGA CTGCTGCTGC TGCTGCTGGA TGATCCGACG CATCAGATCT GG-3'
(SEQ ID NO 3)
[0048] Die Oligonukleotide T1 und T2 wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt, während CTG6 mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gereinigt wurde. Die Konzentration jeder Vorratslösung wurde durch Extinktion bei 260 nm bestimmt.
[0049] T1, T2 und CTG6 enthalten 8 repetitive GACs, 8 repetitive CTG5, bzw. 6 repetitive CTG5. Die repetitiven GACs liegen 30 Basen vom 5'-Ende und 30 Basen vom 3'-Ende entfernt. Die repetitiven CTG5 sind 24 Basen vom 5'-Ende und 24 Basen vom 30-Ende entfernt.

Beispiel 2 Bestimmung der Spezifität und Wirksamkeit von 51-Nuklease

[0050] Spezifität und Wirksamkeit der 51-Nuklease wurde unter Verwendung von am 5'-Ende radioaktiv markierten Oligonukleotiden verfolgt. Kurz gesagt wurden 3,5 uM Oligonukleotid in Kinasepuffer gegeben (70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol), der 6,4 pM ³²P-ATP (spezifische Aktivität 60 Cl/mMol enthielt. Die Markierung der Enden wurde durch Zugabe von 0,35 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs; Beverly, MA) pro pMol Oligos inizüert. Man markierte 45 Minuten bei 37ºC. Die markierten Oligonukleotide wurden von nicht eingebautem ³²P-ATP mit einer CHROMA- SPINTM+TE 10 Säule (Clonetech) getrennt.
[0051] Heteroduplizes wurden dadurch erzeugt, daß man 1 uM ³²P-markiertes Oligonukleotid T1 mit einer gleichmolaren Menge T2 oder CT66 in 50 pL 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 reassoziieren ließ (Fig. 1). Die Oligonukleotide wurden 4 Minuten auf 96ºC erhitzt und langsam im Lauf von 2 Stunden auf 30ºC abgekühlt, um ein spezifisches Reassoziieren zu garantieren.
[0052] Die Spezifität von 51 in Abhängigkeit der Enzymkonzentration wurde unter Verwendung von T1-T2- und T1-CTG6- Heteroduplizes, die in Fig. 1 mit H&sub1; bzw. H&sub2; bezeichnet sind, geprüft. Kurz gesagt versetzte man die Heteroduplizes in einer Lösung aus 200 mM NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 4, 5, 1 mM ZnSO&sub4;, 0,5% Glycerin mit 0,1-1,0 Einheiten pro Picomol 51-Nuklease (Promega; Madison, WI). Der Nukleaseverdau wurde bei Temperaturen von ungefähr 0ºC, ungefähr 24ºC und ungefähr 37ºC durchgeführt. Die Temperaturen der Lösungen wurden vor Zugabe des Enzyms auf die Reaktionstemperatur eingestellt. Nach einer 60-minütigen Reaktionszeit wurde der weitere Verdau durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 12 mM gestoppt. Die erwarteten Reaktionsprodukte sind in Fig. 1C und D schematisch dargestellt. Jedes Reaktionsprodukt wurde mittels nativer 12%-iger Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Mit den entstandenen Gelen wurden Autoradiographien angefertigt, die in Fig. 2A und 2B dargestellt sind. Fig. 2A stellt ein Autoradiogramm des Reaktionsprodukts des perfekt gepaarten Heteroduplex T1-T2 dar. Die Bahn 1 ist eine Kontrolle ohne 51. Die Bahnen 2 bis 5 enthalten steigende 51- Konzentrationen (0,2, 0,5, 0,8 und 1,0 Einheiten pro Picomol Oligos), die alle bei 0ºC inkubiert wurden. Die Bahnen 6 bis 9 enthalten identische Konzentrationen, wurden jedoch bei Raumtemperatur inkubiert, und die Bahnen 10-13 wurden bei 37ºC inkubiert. Obwohl bei den höheren Temperaturen 51 die endständige Markierung von dem Duplex abschnitt, wurden keine weiteren Schnitte beobachtet. Bahn 0 enthält den Größenstandard (Verdau mit φX174/HinfI).
[0053] Bei Fig. 2B handelt es sich um ein Autoradiogramm des Reaktionprodukts des fehlgepaarten Heteroduplex T1- CTG6. Die Bahnen 14 enthielten 51 in steigenden Konzentrationen (wie oben), die alle bei 0ºC inkubiert wurden. Bei den Bahnen 5-8 ist die 51-Konzentration gleich, die Inkubation erfolgte jedoch bei Raumtemperatur, während die Bahnen 9-12 bei 37ºC inkubiert wurden. Sowohl die Bahn 13 als auch die Bahn 14 enthalten den T1-CTG6-Komplex ohne irgendeine S1- Nuklease. Die oberste Bande in jeder Bahn (Bande A) entspricht der T1-CTG6-Kontrolle und ist nur die ungeschnittene Schleifenstruktur. Die zweite Bande (Bande B) ist die Schleife mit dem Einzelstrangbruch, während es sich bei Bande C um eine Schleife mit Einzelstrangbruch, die teilweise verdaut wurde, zu handeln scheint. Bahn D ist sehr schwach, könnte jedoch eine vollständig verdaute Schleife enthalten, wodurch eine mit Einzelstrangbruch versehene Duplex-DNA zurückbleibt. Bahn 15 enthält einen Größenstandard.
[0054] Bei 0ºC wurden über 60% der 6 Basenschleifen, die durch die fehlgepaarten repetitiven Sequenzen in dem T1- CTG6-Hybridkomplex geschaffen wurden, von der 51-Nuklease bei einer Konzentration von 0,6 Einheiten pro Picomol geschnitten (Fig. 2). Das Vorliegen multipler Banden war am ehesten darauf zurückzuführen, daß die 51-Nuklease die Schleifenstruktur spaltete und so mehrere ungepaarte Nukleotide abbaute. Außerdem scheint es, daß die 51-Nuklease mehrere ungepaarte Nukleotide schnitt und nicht nur eines, da bei Trennungen von mehr als einem Basenpaar unterschiedliche Banden erschienen. Im Gegensatz dazu wurde bei dem perfekt gepaarten T1-T2- Hybridkomplex keine Spaltung beobachtet.
[0055] Bei höheren Temperaturen erschienen in jeder Bahn der gepaarten und fehlgepaarten Proben weniger Marker. Am wahrscheinlichsten ist, daß die 51-Nuklease die atmenden Enden des DNA-Doppelstrangs spaltete, als Einzelstrangstrukturen gebildet wurden. Dieses Problem wurde bei Proben, die bei 0ºC inkubiert wurden, nicht beobachtet, da die DNA-Enden weniger atmen konnten. Diese Versuche wiesen nach, daß die 51-Nuklease den Hybrid, der eine Fehlpaarung enhielt, am Locus der Fehlpaarung spaltete.

Beispiel 3 Markierung und Strangverdrängung

[0056] Es wurde ein verbessertes Verfahren zur Unterscheidung zwischen gepaarten und fehlgepaarten Oligonukleotiden untersucht. Die Markierungs- und Strangverdrängungsreaktionen wurden mit Templates geprüft, die aus nichtmarkierten T1-T2- und T1-CTG6-Heteroduplizes bestanden. Diese Duplizes wurden mit 0,6 Einheiten 51-Nuklease pro Picomol Oligonukleotid bei 0ºC verdaut. Die Reaktionen wurden abgebrochen und die Produkte mit einer Spin-Säule (CHROMA-SPINTM+ TE 10) gereinigt. Nachdem die Oligonukleotide an der Säule gereinigt worden waren, war aufgrund dessen, daß ZnSO&sub4; entfernt wurde, die 51-Nuklease inaktiviert.
[0057] Versuchsplan und die erwarteten Resultate sind in Fig. 3 dargestellt. Die erwarteten Verdauungsprodukte des fehlgepaarten Heteroduplex sind mit A1 bezeichnet, während das erwartete Verdauungsprodukt des Heteroduplex mit der perfekten Paarung mit A2 bezeichnet wird. Das erwartete Reaktionsprodukt nach Behandlung als Polymerase ist als B1 bzw. B2 gezeigt.
[0058] Die mit 51 verdauten Heteroduplizes wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I markiert. Kurz gesagt wurden 0,08 Einheiten Enzym pro Picomol zu einem Reaktionspuffer mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, je 30 pM dNTPs sowie mit ³²P markiertes dCTP (spezifische Aktivität 1,74 Cl/mMol) in einem Volumen von 50 pl gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) auf eine Endkonzentration von 0,5% gestoppt.
[0059] Das Produkt der Markierungsreaktion wurde mittels Acrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie untersucht. Eine Kopie des Autoradiogramms ist in Fig. 4 darge stellt. Bei Bahn 0 handelt es sich um einen Molekulargewichtsmarker. Die Bahnen 1 und 2 stellen Heteroduplizes mit Fehlpaarungen dar, die mit 51 verdaut und mit Polymerase behandelt wurden und in Gegenwart (Bahn 1) bzw. Abwesenheit (Bahn 2) von radioaktiven Nukleotidtriphosphaten elongiert wurden. Die Bahnen 3 und 4 stellen Heteroduplizes mit perfekter Paarung, die mit 51 verdaut und mit Polymerase behandelt wurden und in Gegenwart (Bahn 3) und Abwesenheit (Bahn 4) von radioaktiven Nukleotidtriphosphaten elongiert wurden, dar.
[0060] Der Einbau von mit 32p markiertem dCMP in den mit 51 gespaltenen, Fehlpaarungen enthaltenden Hybrid (T1-CTG6) mittels Klenow-Fragment ergab ein starkes Signal an der Stelle, die erwartet wurde, wenn die S1-Spaltung an der Stelle der Fehlpaarung stattfand (Fig. 4). Bei dem Hybrid (T1-T2) mit perfekter Paarung wurde nur ein sehr schwaches Signal nachgewiesen, und dieses Signal war nicht als unterschiedliche Banden lokalisiert. Eine gewisse unspezifische Markierung des Hybrid mit perfekter Paarung und des T1-CTG6-Komplexes könnte aufgrund der Tendenz, daß die S1-Nuklease Einzelstrangbrüche in Doppelstrang-DNA einführt, stattgefunden haben. Die schleifenschneidende Wirkung der S1-Nuklease ist jedoch wesentlich stärker als ihre Fähigkeit, in Doppelstrang- DNA mit perfekter Paarung Einzelstrangbrüche einzuführen, was in diesen Versuchen nachgewiesen wird.

Beispiel 4 Nachweis einer repetitiven genomischen Sequenz

[0061] Eine einzelsträngige Nucleinsäure mit einer internen repetitiven Zielsequenz wird aus genomischer DNA zur Analyse produziert. Ein Schema des Plans ist in Fig. 5 dargestellt. Kurz gesagt werden ein 5'-biotinmarkierter Oligonu kleotid-Primer und ein nichtbiotinmarkierter Primer mit einem Oligonukleotid-Synthesizer hergestellt. Die Primer flankieren eine Region genomischer DNA, die eine variable Anzahl repetitiver Nukleotide enthält. Mit den beiden Primern und der genomischen DNA als Template wird eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt (Fig. 5A). Das doppelsträngige Reaktionsprodukt wird von den nichteingebauten Nukleotidtriphosphaten an einer Größenausschlußsäule gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wird mit 8M Harnstoff denaturiert und der biotinmarkierte Strang wird entfernt. Der nichtbiotinmarkierte Strang wird am 3'-Ende mit Fluorescein markiert und als Zielnucleinsäure verwendet.
[0062] Mehrere Sonden, die jeweils eine zu der Zielnucleinsäure komplementäre 5'- und 3'-Sequenz und zwischen 10 und 109 interne repetitive Sequenzen enthalten, werden mit einem Oligonukleotid-Synthesizer produziert. Sonden mit 80 Basen oder darunter werden produziert und direkt verwendet. Sonden, die über 80 Basen groß sind, werden als Fragmente produziert und zusammenligiert. Nach der Synthese werden die Sonden am 3'-Terminus mit Rhodamin markiert. Alle Sonden werden mit einem 5'-Biotin hergestellt, und diese biotinmarkierten Sonden werden an den Boden einer mit immobilisiertem Streptavidin beschichteten Platte angeheftet. Die Sonden werden als 10 · 10-Anordnung angeheftet und nach Größe geordnet (Fig. 5B).
[0063] Die Zielnucleinsäure wird mit der Sondenreihe hybridisiert (Fig. 5C) und mit 51-Nuklease verdaut (Fig. 5D). Die Reihe wird mit DNA-Polymerase versetzt und man läßt elongieren und die Stränge verdrängen (Fig. 5E), bis die Reaktion beendet ist (Fig. 5F). Enthält die Sonde mehr interne repetitive Sequenzen als das Ziel, so geht der Rhodaminmarker bei der Strangverderdrängung verloren und das entstandene Produkt ist rot. Enthält das Ziel mehr interne repetitive Sequenzen als die Sonde, so geht der Fluoresceinmarker verloren und das Produkt ist analog zu dem oben gesagten grün. Enthalten sowohl Sonde als auch Ziel gleiche Anteile repetitiver Sequenzen, so bleiben sowohl Rhodamin als auch Fluorescein erhalten und die entstandene Farbe ist gelb.
[0064] Nach der Strangverdrängung wird die Reihe optisch beurteilt. Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt. Vor der Strangverdrängung sind alle Sonden gelb (Fig. 6A). Nach Schneiden mit 51 und Strangverdrängung sind die Sonden mit weniger repetitiven Sequenzen als das Ziel rot und die Sonde mit mehr repetitiven Sequenzen grün. Die Sonde mit der gleichen Anzahl repetitiver Sequenzen ist gelb. Die Ergebnisse von Versuchen mit der gleichen Sondenreihe, jedoch mit einer Ziel-DNA mit 88, 55 und 17 repetitiven Sequenzen ist in Fig. 6B dargestellt. Dieser Versuch zeigt, wie ein colorimetrischer Assay durchgeführt werden kann, um die Anzahl repetitiver Sequenzen in einer Zielsequenz zu bestimmen.

Beispiel 5 Nachweis von repetitiven Sequenzen eines Patienten mit myotoner Dystrophie.

[0065] Zur Bestimmung des Ausmaßes der Ausweitung von repetitiven Trinukleotidsequenzen bei einem Myotoniker wird dem Patienten eine Blutprobe von 5 ml für Analysezwecke entnommen. Ganzzell-DNA wird aus dem Blut isoliert und eine DNA mit einer Region mit repetitiven Trinukleotidsequenzen, die als Ursache für die Störung myotone Dystrophie angesehen wird, wird mittels Polymerasekettenreaktion amplifiziert und isoliert. Die Polymerasekettenreaktionsprodukte werden dena turiert, und einer der DNA-Stränge wird als Nucleinsäure mit der nachzuweisenden Zielsequenz verwendet.
[0066] Mit Hilfe eines Oligonukleotid-Synthesizers erzeugt man einen Satz Oligonukleotidsonden. Jede Sonde in dem Satz verfügt über eine 5'-Sequenz mit 20 Basenpaaren und eine 3'-Sequenz mit 20 Basenpaaren, die der die repetitive Trinukleotidregion flankierenden Sequenz komplementär sind. Außerdem verfügt jede Sonde in diesem Satz über eine interne repetitive Trinukleotidsequenz zwischen der 5'- und der 3'- Sequenz. Eine Reihe von 20 Sonden, die von 1 bis 20 repetitive Trinukleotidsequenzen enthält, wird hergestellt.
[0067] Drei Picomol jeder Sonde, also insgesamt 60 Picomol, werden mit 200 pMol der amplifizierten Zielnucleinsäure hybridisiert. Kurz gesagt werden Sonden und Ziel 4 Minuten mit 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, auf 96ºC erhitzt und langsam im Lauf von zwei Stunden auf 30ºC abgekühlt, um für ein spezifisches Reassoziieren unter Bildung von Heteroduplizes mit Fehlpaarungen und perfekten Paarungen zu sorgen. Die Heteroduplizes wurden 5 Minuten bei 0ºC mit 0,3 Einheiten S1- Nuklease pro Picomol behandelt. Die Reaktion wird dadurch gestoppt, daß man die Reaktionsmischung an einer Spin-Säule chromatographiert.
[0068] Die mit 51 verdauten Heteroduplizes werden 15 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I behandelt. Kurz gesagt versetzt man mit 0,08 Einheiten Enzym pro Picomol DNA in einem Reaktionspuffer mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, und jeweils 30 pM der dNTPs. Die Reaktion wird durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) auf eine Endkonzentration von 0,5% gestoppt.
[0069] Das Produkt dieser Reaktion wird auf einem denaturierenden Sequenziergel analysiert, und zwar mit dem Satz DNA-Sonden als Molekulargewichtsmarker. Nach der Elektrophorese wird das Gel 30 Minuten mit Wasser behandelt, um den Harnstoff zu entfernen, und mit SBYR oder FBIR gefärbt. Die Banden werden durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht nachgewiesen. Das größte beobachtete Produkt ist eine Bande mit 61 Basen, was 7 repetitiven Trinukleotidsequenzen entspricht.

Übersetzung der Zeichnungen

Fig. 1

REASSOZIIEREN LASSEN
MIT S1-NUKLEASE SCHNEIDEN
(HAUPTPRODUKT)
(HAUPTPRODUKT)
(NEBENPRODUKT)
(NEBENPRODUKT)

Fig. 3

(HAUPTPRODUKT)
(HAUPTPRODUKT)
(NEBENPRODUKT)
(NEBENPRODUKT)
(HAUPTPRODUKT)
(HAUPTPRODUKT)
(NEBENPRODUKT)
KLENOW-FRAGMENT

Fig. 6C

(88 REPETITIVE SEQUENZEN)
(55 REPETITIVE SEQUENZEN)
(88 REPETITIVE SEQUENZEN)
REPETITIVE SEQUENZEN)

Fig. 6A

SCHNEIDEN MIT S1, STRANGVERDRÄNGUNG

Figur. 5

GENOMISCHE DNA
PCR-AMPLIFIKATION MIT EINEM MARKIERTEN PRIMER DENATURIEREN,
REASSOZIIEREN LASSEN
SCHNEIDEN
SCHNEIDEN
NICK-TRANSLATION MIT DNA-POLYMERASE
ANALYSE DER FLUORESZIERENDEN PRODUKTE
GRÜN
GRÜN
GELB
ROT
ROT

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz innerhalb einer Nukleinsäure, umfassend die folgenden Schritte:

a. Hybridisieren der Nukleinsäure mit einer Sondenreihe, wobei jede Sonde eine dieser Nukleinsäure komplementäre 5'-Region, eine dieser Nukleinsäure komplementäre 3'- Region und eine interne variable Region enthält;

b. Verdauen der hybridisierten Sondenreihe mit einer einzelstrangspezifischen Nuklease;

c. Behandeln dieser Sondenreihe mit einer Nukleinsäurepolymerase; sowie

d. Nachweisen der Zielsequenz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsequenz mehrere repetitive Sequenzen enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei "mehrere" ungefähr 2 bis ungefähr 2000 repetitive Sequenzen bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die repetitiven Sequenzen jeweils ungefähr 2 bis ungefähr 25 Nukleotide lang sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA, RNA, PNA oder deren Modifikationen oder Derivate handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure an einem 5'-Terminus oder einem 3'-Terminus mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der nachweisbare Marker aus der Gruppe der Radioisotopen, stabilen Isotopen, lumineszierenden und elektrolumineszierenden Chemikalien, fluoreszierenden Chemikalien, chromogenen Chemikalien, Metalle, Kopplungsmittel und magnetischen Mittel ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure aus einer biologischen Probe stammt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei der biologischen Probe um eine Biomasse-, Körpergewebe- oder Flüssigkeitsprobe oder um eine Kombination davon handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Nukleinsäure um ein Polymerasekettenreaktionsprodukt handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 5'-Region und die 3'-Region jeweils ungefähr 15 bis ungefähr 100 Nukleotide lang sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die variable Region mehrere repetitive Sequenzen enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei "mehrere" ungefähr 2 bis ungefähr 2000 repetitive Sequenzen bedeutet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die repetitiven Sequenzen jeweils ungefähr 2 bis ungefähr 25 Nukleotide lang sind.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die variable Region bezüglich Sequenz oder Länge variabel ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Länge ungefähr 10 bis ungefähr 2000 Nukleotide beträgt.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die variable Region eine Sequenz neutraler Basen enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei den neutralen Basen um Inosinbasen handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure und die Sonden mit unterschiedlichen chromogenen Chemikalien markiert sind.

20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sondenreihe an einem festen Träger fixiert ist.