DE69430485T2 - Immobilisierte fehlpaarung - bildendes protein zur detektion oder reinigung von mutationen oder polymorphismen - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
• Diese Erfindung in den Gebieten der Molekularbiologie und der Medizin betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen, die so wenig wie einen Basenaustausch oder die Addition oder Deletion einer einzigen Base zu/von der Wildtyp-DNA-Sequenz umfaßt, ebenso wie Verfahren das Entfernen von Fehlpaarung enthaltender DNA von Ansätzen an amplifizierter DNA.
Beschreibung des Standes der Technik
• Der Fortschritt in der molekularen und medizinischen Genetik des Menschen hängt von dem effizienten und genauen Nachweis von Mutationen und Sequenzpolymorphismen ab, deren weitaus größter Teil von Substitutionen einer einzigen Base und kleinen Additionen oder Deletionen resultieren. Tests, die in der Lage sind, die Anwesenheit einer speziellen Mutation oder mutierten Nucleinsäuresequenz in einer Probe nachzuweisen, sind deshalb von größer Bedeutung bei der Vorhersage und Diagnose von Krankheiten, der Gerichtsmedizin, der Epidemiologie und dem öffentlichen Gesundheitswesen. Solche Tests können zum Beispiel zum Nachweis der Anwesenheit eines mutierten Gens in einem Individuum verwendet werden, was die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit ermöglicht, daß das Individuum an einer genetischen Krankheit leidet. Die Möglichkeit des Nachweises einer Mutation hat seit der Entdeckung, daß diskrete Mutationen bei zellulären Oncogenen in einer Aktivierung dieses Oncogens resultieren können, was zur Transformation dieser Zelle zu einer Krebszelle führen kann (Nishimura, S. et al., Biochem. J. 243: 313-327 (1987); Bos, J.L., Cancer Res. 49: 4682-4689 (1989)), beim frühen Nachweis von Krebs oder bei der Feststellung einer Empfänglichkeit für Krebs an Bedeutung gewonnen.
• Der Wunsch, den Nutzen und die Anwendbarkeit solcher Tests zu erhöhen, wird oft durch die Testempfindlichkeit ebenso wie die Komplexität und die Kosten vereitelt. Deshalb wäre es sehr wünschenswert, empfindlichere und auch einfache und relatv billige Tests für den Nachweis von Veränderungen in DNA zu entwickeln.
• Tests zum Nachweis von Nucleinsäuren können auf einem aus einer Anzahl von Charakteristika eines Nucleinsäuremoleküls basieren, wie ihre Größe, ihre Sequenz, ihre Zugänglicheit gegenüber Verdau mit Restriktionsendonucleasen, usw. Die Empfindlichkeit solcher Tests kann durch Veränderung der Art erhöht werden, mit der der Nachweis dem Beobachter mitgeteilt oder signalisiert wird. So kann zum Beispiel die Testempfindlichkeit durch die Verwendung von nachweisbar markierten Reagentien erhöht werden, wobei die Markierungen Enzyme (Kourilsky et al., U.S.-Patent 4,581,333), Radioisotope (Falkow et al., U.S.-Patent 4,358,535; Berninger U.S.-Patent 4,446,237), fluoreszierende Markierungen (Albarella et al., U.S.-Patent 4,582,789; Albarella et al., U.S.-Patent 4,563,417), modifizierte Basen (Miyoshi et ad., EP 119448) und dergleichen sein können.
• Die meisten Verfahren, die geplant sind, um den Nachweis von genetischen Veränderungen zu erreichen, die nur aus einer oder wenigen Basen bestehen, umfassen die Hybridisierung zwischen einer Standardnucleinsäure (DNA oder RNA) und einer Test-DNA, so daß sich die Mutation als eine fehlgepaarte oder nicht gepaarte Base in einem HeteroDoppelstrangmolekül offenbart. Der Nachweis dieser fehlgepaarten oder nicht gepaarten Basen wurde durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht. Fehlpaarungen wurden mittels Enzymen (RnaseA, MutY) nachgewiesen, die einen oder beide Stränge des Doppelstrangs an der Stelle der Fehlpaarung schneiden (Myers, R.M. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 275-284 (1986); Gibbs, R. et al., Science 236: 303-305 (1987); Lu, A.S. et al., 1992, Genomics 14: 249-255 (1992)). Doppelstränge ohne Fehlpaarungen werden nicht geschnitten. Bei der Verwendung von radioaktiv markierten Nucleinsäurefragmenten zur Anlagerung an eine Test-DNA ist es möglich, diese Enzyme zu verwenden, um Fragmente spezifischer Größe zu bilden, wenn in der Test-DNA eine Mutation vorhanden ist. Die Fragmente werden von nicht geschnittenen Fragmenten mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterschieden. Die Hauptprobleme mit diesen Verfahren sind, daß sie die Verwendung von RNA erfordern (RNase-Verfahren) oder in der Lage sind, nur eine beschränkte Anzahl an Fehlpaarungen nachzuweisen (MutY-Verfahren).
• DNA-Doppelstränge, die Fehlpaarungen enthalten, wurde von perfekt gepaarten Doppelsträngen auch mittels denaturierender Gelelektrophorese unterschieden. Bei diesem System werden Doppelstränge auf einem Polyacrylamid-Gel in einem denaturierenden Gradienten unter Bedingungen laufen gelassen, bei denen DNA, die Fehlpaarungen enthält, leichter denaturiert als der identische Doppelstrang ohne Fehlpaarung, so daß die zwei Arten an Doppelsträngen verschieden wandern. Während dieses Verfahren empfindlich und genau ist, ist es extrem aufwendig und verlangt ein hohes Maß an technischer Perfektion.
• Zwei andere Verfahren des Nachweises von Mutationen beruhen auf der Unfähigkeit, Fragmente von DNA zu verlängern oder zu verknüpfen, wenn Fehlpaarungen vorhanden sind. Beide erfordern die Verwendung von Standard-DNA-Oligonucleotiden, die präzis an der Stelle der fraglichen Mutation enden, so daß, wenn sie sich an die Test-DNA anlagern, es die letzte Base des Oligonucleotids ist, die fehlgepaart ist. Der Nachweis der Fehlpaarung hängt entweder von (a) der Unfähigkeit von DNA-Polymerase ab, ein Oligonucleotid mit einer fehlgepaarten terminalen Base zu verlängern, oder (b) der Unfähigkeit von DNA-Ligase, zwei Oligonucleotide zu verknüpfen, wenn an ihrer Verbindungsstelle eine Fehlpaarung ist. Die Fragmentlänge wird mittels Gelelektrophorese bestimmt. Die Anwesenheit von längeren Fragmenten als den Ausgangsoligonucleotiden zeigt, daß eine Fehlpaarung, d. h. Mutation, in der Test-DNA nicht vorhanden war. Diese Verfahren sind ebenfalls etwas aufwendig, verlangen, daß die genaue Lage der Mutation bekannt ist, und sind schwer zu interpretieren, wenn die Proben-DNA für die fragliche Mutation heterozygot ist. Deshalb sind sie zur Verwendung bei der Durchmusterung auf Polymorphismen nicht praktisch.
• Ein chemisches Verfahren zur Spaltung von DNA mit Fehlpaarungen (Cotton, R.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1988); Cotton, R.G., Nuc. Acids Res. 17: 4223-4233 (1989)) basiert auf der chemischen an einer fehlgepaarten Stelle in einem DNA/DNA- HeteroDoppelstrang unter Verwendung einer Anzahl an Agentien, insbesondere Osmiumtetroxid und Hydroxylamin. Bei diesem Verfahren werden DNA-Sonden durch Spaltung der DNA von Interesse mittels Restriktionsenzymen hergestellt. Plamid-DNA, die die Sequenz von Interesse enthält, wird mit markierter Sonden-DNA (mit ³²P entweder endmarkiert oder intern markiert) hybridisiert. Hydroxylamin modifiziert fehlgepaarte Cytosine chemisch; Osmiumtetroxid modifiziert fehlgepaarte Tymine. Danach wird Piperidin verwendet, um die DNA an den modifizierten Stellen zu spalten, gefolgt von Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) und Autoradiographie, um die gespaltenen Produkte zu identifizieren. Von diesem Verfahren wird gesagt, daß es den Vorteil hat, alle möglichen Einzelbasenpaarfehlpaarungen nachzuweisen, weil das Verfahren auch in der Spaltung an einem gepaarten Basenpaar in der Nähe einer Fehlpaarung resultiert.
• Publikationen aus dem Labor von Caskey (Caskey, C.T. et al., Europäische Patentoffenlegungsschrift 333,465 (20.09.89.); Groupe, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5888-5892 (1989)) offenbaren ein Verfahren zur Lokalisation einer Mutation, welches PCR-amplifizierte cDNA als Quelle der Matrize für die Spaltreaktion an der Fehlpaarung verwendet. Diese Technik wurde erfolgreich beim Studium von Patienten mit einem Mangel bei der Ornithin-Transcarbamoylase (OTCase) verwendet, um die Mutationen zu kartieren.
• Kung et al., U.S.-Patent 4,963,658 offenbart den Nachweis von einzelsträngiger DNA (ssDNA) durch Bindung mit einem ssDNA-Bindungsprotein hoher Affinität wie Topoisomerase oder DNA-Entwindungsprotein, welches selbst an eine Markierung gebunden werden kann, wie β-D-Galactosidase.
FEHLPAARUNGS-REPARATURSYSTEM UND FEHLPAARUNGS- BINDUNGSPROTEINE
• DNA-Fehlpaarungs-Reparatursysteme verwenden eine Familie von Proteinen, die Proteine umfassen, die Fehlpaarungen enthaltende DNA erkennen und daran binden, die als Fehlpaarungs-Bindungsproteine (MBPs) bezeichnet werden. Für einen Überblick vgl. Radman, M. et al., Annu. Rev. Genet. 20: 523-538 (1986); Radman, M. et al., Sci. Amer., August 1988, S. 40-46; Modrich, P., J. Biol. Chem. 264: 6597-6600 (1989)). Das MutS- Protein wurde als solch eine Komponente des E. coli-Fehlpaarungsreparatursystems identifiziert. Vgl. zum Beispiel Lahue, R.S. et al., Science 245: 160-164; Jiricny, J: et al., Nucl. Acids Res. 16: 7843-7853 (1988); Su, S.S. et al., J. Biol. Chem. 263: 6829-6835 (1988); Lahue, R.S. et al., Mutat. Res. 198: 37-43 (1988); Dohet, C. et al., Mol. Gen. Genet. 206: 181-184 (1987); und Jones, M. et al., Genetics 115: 605-610 (1987). Analoge Proteine sind in anderen bakteriellen Spezies bekannt, einschließlich MutS in Salmonella typhimurium (Lu, A.L. et al., Genetics 118: 593-600 (1988); Haber, L.T. et al., J. Bacteriol. 170: 197-202 (1988); Pang, P.P. et al., J. Bacteriol. 163: 1007-1015 (1985)) und das hexA-Protein von Streptococcus pneumoniae (Priebe, S.D. et al., J. Bacteriol. 170: 190-196 (1988); Haber et al., vgl. vorstehend).
• Gereinigtes MutS-Protein bindet DNA, die fehlgepaarte Basen enthält, bindet aber nicht DNA ohne Fehlpaarungen oder einzelsträngige DNA. Die Wechselwirkung MutS-DNA resultiert nicht in irgendeinem Abbau oder irgendeiner Modifikation der DNA. Keine der vorstehenden Literaturstellen offenbart die Möglichkeit der Verwendung von MBP oder immobilisiertem MBP als Teil des Nachweistests für Mutationen oder zum Zweck der Entfernung von fehlgepaarter DNA von amplifizierten DNA-Proben.
• Die WO-A-95/12688 (US Biochemical Corporation), offengelegt am 11. Mai 1995, betrifft ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis einer Basenpaarfehlpaarung in einem DNA-Doppelstrang, wobei ein erstes DNA-Molekül mit einem zweiten DNA-Molekül in Kontakt gebracht wird, um einen Doppelstrang zu bilden, und zum Nachweis jeglicher Basenpaarfehlpaarungen unter Verwendung eines Fehlpaarungen erkennenden Proteins in Lösung erfolgt.
• Jiricny, J. et al., Nucl. Acids Res. 16(16): 7843-7853 (1988) betrifft Untersuchungen der Bindung eines mutS-Genprodukts mit einer Serie von synthetischen DNA- Doppelsträngen, die Fehlpaarungen oder Fehlpaarungsanaloga vom Purin/Pyrimidin-Typ enthalten.
• WO-A-93/02216 (Upstate Biotechnology) betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen unter Verwendung des DNA-Fehlpaarung-bindenden Proteins MutS, wobei ein DNA-HeteroDoppelstrangmolekül vor dem Inkontaktkommen mit dem Fehlpaarungbindenden Protein auf einem festen Träger immobilisiert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Der Erfinder hat sich die Verwendung von immobilisiertem, Fehlpaarung bindendem Protein (MBP), zum Beispiel dem MutS-Protein von E. coli, für (1) den Nachweis von genetischen Mutationen oder genomischen Polymorphismen, (2) die Reinigung von amplifizierten DNA-Proben durch Entfernung von verunreinigenden Sequenzen und Sequenzen, die während des Amplifikationsverfahrens eingeführte Fehler enthalten, und (3) die Identifikation von spezifischen Allelen in multi-allelischen Systemen ausgedacht.
• Die analysierte Nucleinsäure, vorzugsweise DNA, kann von jeder Quelle gewonnen werden, einschließlich Blutzellen, Tumorgeweben, Zellen in Kultur oder jedes Gewebe, und kann von jeder Art einschließlich dem Menschen erhalten werden. Die DNA kann mittels jedes einer Reihe von bekannten Verfahren markiert werden, unter Verwendung von kolorimetrischen, chemielumineszierenden oder radioaktiven Markern. Es ist jedoch tatsächlich nicht erforderlich, die DNA überhaupt zu markieren.
• Zum Nachweis von Mutationen oder Polymorphismen kann der Test mit einem markierten, konkurrierenden Oligonucleotid durchgeführt werden. Für die Reinigung von amplifizierter DNA ist keine Markierung erforderlich. Für die Identifikation von Allelen muß die Markierung in einer synthetisierten, einzelsträngigen Oligonucleotidsonde sein.
• Die Verfahren der vorliegenden Erfindung hängen von der Bildung von Fehlpaarungen in der Test-DNA ab, die durch Denaturierung der Test-DNA und der Möglichkeit zur Wiederanlagerung offenbar werden. Wenn in einer Test-DNA-Probe auf Heterozygosität oder Polymorphismus getestet wird, kann die Test-DNA einfach mit sich selbst zusammenlagern, was in der Bildung von Fehlpaarungen resultiert, wenn die Einzelstränge mit einem Strang zusammenlagern, der von dem anderen elterlichen Chromosom abstammt. Wenn keine Heterozygosität existiert, werden keine Fehlpaarungen gebildet. In diesem Fall kann die Markierung in den Primern sein, die für die Amplifikation verwendet werden, oder sie kann zu den Enden der Test-DNA hinzugefügt werden, wenn eine Amplifikation nicht erforderlich ist.
• Ein ähnliches Verfahren und Markierungsschema wird verwendet, um Sequenzen zu entfernen, die Fehler enthalten, die während der Amplifikation von DNA oder der Minoritätssequenzarten eingeführt wurden. In diesen Fällen wird das Material, das nicht an das MBP bindet, gewonnen, und es enthält nur die Doppelstrangsequenzen ohne Fehlpaarungen. Diese Sequenzen werden daher mit der Mehrheitssequenz in der amplifizierten Population stark angereichert. Wenn das Ausgangsmaterial nur eine Sequenz enthält, enthält das nicht gebundene Material diejenigen Sequenzen, die mit dem Ausgangsmaterial identisch sind, während diejenigen Sequenzen, die Fehler enthalten, die während der Amplifikation eingeführt wurden, wenn sie relativ selten sind, Fehlpaarungen eingegangen sind, die durch das immobilisierte MBP festgehalten werden.
• Um homozygote Mutationen nachzuweisen, ist es notwendig, die Test-DNA in der Gegenwart von bekannten Wildtyp-Sequenzen anzulagern. Solche Sequenzen können künstlich synthetisiert werden oder während der Amplifikation durch Zugabe von bekannten Wildtyp-Sequenzen zum Ausgangsmaterial vor der Amplifikation erzeugt werden. Wenn die Anlagerung in der Gegenwart von bekannten Wildtyp-Sequenzen durchgeführt wird, wird der Test homozygote und heterozygote Mutationen nachweisen,
• Zur Identifikation von Allelen ist es notwendig, nach der Amplifikation eine markierte, einzelsträngige Sonden-DNA zu der Test-DNA zuzugeben. Die Sondensequenz muß identisch mit dem Allel von Interesse sein, so daß sie keine Fehlpaarungen gebildet werden, wenn sie an die DNA des Allels anlagen. Die Sequenz der Sonde wird so ausgewählt, daß sie Fehlpaarungen bildet, wenn sie an die DNA jedes anderen Allels anlagert. Wenn die Test- DNA an eine solche Sonde anlagert (mit einem Überschuß an Test-DNA, so daß die Sondensequenzen alle anlagern, um einen Doppelstrang zu bilden) und einem Überschuß an immobilisiertem MBP ausgesetzt wird, zeigt die Anwesenheit von nicht gebundener Markierung, daß das fragliche Allel in der Test-DNA-Probe anwesend ist.
• Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer doppelsträngigen Ziel-DNA in einer Probe, welches umfaßt:
• (a) Denaturieren einer doppelsträngigen DNA in einer Probe, gefolgt von Wiederanlagernlassen der DNA-Stränge;
• (b) Inkubieren der denaturierten und wieder angelagerten Doppelstränge nach Schritt (a) mit einem eine Fehlpaarung bindenden Protein, das durch Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert ist, entweder
• (i) in Anwesenheit einer nachweisbar markierten DNA mit einer Fehlpaarung, die an das MBP binden kann; oder
• (ii) wobei das MBP zuvor mit einer nachweisbar markierten DNA mit einer Fehlpaarung inkubiert wurde und an diese binden konnte;
• (c) Nachweis der Menge an nachweisbar markiertem Oligonucleotid mit einer Fehlpaarung, die an das eine Fehlpaarung bindende Protein gebunden ist, wobei das Vorahndensein einer Mutation in der doppelsträngigen Ziel-DNA aus der Probe in einer Abnahme der Bindung der nachweisbar markierten DNA an das eine Fehlpaarung bindende Protein resultiert.
• Ein bevorzugtes MBP bei den vorstehenden Verfahren ist das MutS-Protein aus E. coli oder ein fuktionelles Derivat davon.
• Bevorzugte feste Träger, auf denen das eine Fehlpaarung bindende Protein immobilisiert ist, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, modifizierte Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamid und Agarose. Ein am meisten bevorzugter fester Träger ist eine Nitrocellulosemembran.
• Eine bevorzugte nachweisbare Markierung für die nachweisbar markierte DNA bei den vorstehenden Verfahren ist Biotin.
• Ebenfalls wird ein Verfahren zur Entfernung von Minoritätssequenzen und Sequenzen, die einen während des Amplifikationsverfahrens eingeführten Sequenzfehlers enthalten, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
• (a) Aussetzen der amplifizierten DNA-Probe Denaturierungsbedingungen, gefolgt von Wiederanlagern, so daß die Minoritätssequenz oder die Fehler enthaltende Sequenzen Fehlpaarungen enthaltende DNA-Doppelstränge bilden, wodurch eine Mischung hergestellt wird, die fehlgepaarte Doppelstränge enthält;
• (b) Inkubieren der Mischung nach Schritt (a) mit einem eine Fehlpaarung bindende Protein, wobei das Protein durch Adsorption an einem festen Träger immobilisiert wurde, so daß die fehlgepaarten Doppelstränge an das MBP binden, und
• (c) Entfernen des immobilisierten MBP, an das die eine Fehlpaarung enthaltende DNA gebunden ist, aus der amplifizierten DNA,
• wobei die Sequenz, die Sequenzfehler enthält, entfernt wird.
• In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren für die Identifizierung eines spezifisches Allels in einem Multi-Allel-System in einer Probe amplifizierter DNA bereitgestellt, welches umfaßt:
• (a) Mischen einer nachweisbar markierten DNA-Sonde, die genau komplementär zu einer DNA-Sequenz des spezifischen Allels ist, mit einem Überschuß an amplifizierter Test-DNA unter Denaturierungsbedingungen, gefolgt von Anlagern, so daß jede Kopie der DNA-Sonde nach dem Denaturieren und Anlagern in einem DNA-Doppelstrang vorliegt;
• (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Mischung mit einem Überschuß an immobilisiertem MBP, wobei das Protein durch Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert ist, so daß die gesamte DNA mit einer Fehlpaarung auf dem immobilisierten MBP zurückgehalten wird;
• (c) Entfernen des immobilisierten MBP, an das jegliche eine Fehlpaarung enthaltende DNA aus der amplifizierten Test-DNA gebunden hat; und
• (d) Nachweis des Vorhandenseins einer nachweisbar markierten DNA-Sonde in der Probe, aus der das immobilisierte MBP entfernt wurde,
• wobei das Vorhandensein von markierter DNA in der Probe anzeigt, daß die Sonde genau komplementär zu einem Allel in der Test-DNA ist.
• Bei den vorstehenden Verfahren kann das immobilisierte MBP (a) in einer Form sein, die mittels Zentrifugation entfernt werden kann, oder (b) an einem Säulenträgermaterial immobilisiert sein, wobei das Durchflußmaterial keine Fehlpaarungen enthaltenden Doppelstränge enthält, oder (c) an einem Filterträger immobilisiert sein, so daß das Filtrat keine Fehlpaarungen enthaltenden Doppelstränge enthält.
• Die vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Kit, der für den Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Probe von Nutzen ist, wobei der Kit umfaßt:
• (a) einen ersten Behälter, der das durch Adsorption an einem festen Träger immobilisierte eine Fehlpaarung bindende Protein enthält, wobei das Protein die Fähigkeit, DNA mit einer Fehlpaarung zu binden, beibehält;
• (b) einen zweiten Behälter, der eine DNA mit einer Fehlpaarung enthält; und
• (c) einen dritten Behälter oder eine Vielzahl an Behältern, die ein Reagens oder Reagenzien enthalten, die die Bindung der DNA mit einer Fehlpaarung an das eine Fehlpaarung bindende Protein nachweisen können.
• Ebenfalls wird ein Kit bereitgestellt, der für den Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Probe von Nutzen ist, wobei der Kit umfaßt:
• (a) einen ersten Behälter, der das durch Adsorption an einem festen Träger immobilisierte eine Fehlpaarung bindende Protein enthält, wobei das Protein die Fähigkeit, DNA mit einer Fehlpaarung zu binden, beibehält; und
• (b) einen zweiten Behälter oder eine Vielzahl an Behältern, die ein Reagens oder Reagenzien enthalten, die die Bindung der DNA mit einer Fehlpaarung an das eine Fehlpaarung bindende Protein nachweisen können.
• In den vorstehenden Kits ist das MBP vorzugsweise MutS oder ein funktionelles Derivat davon. Der feste Träger ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus natürlicher Cellulose, modifizierter Cellulose, am meisten bevorzugt Nitrocellulose, oder Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamid und Agarose besteht.
• Ebenfalls bereitgestellt wird ein eine Fehlpaarung bindendes Protein, vorzugsweise das MutS-Protein oder ein funktionelles Derivat davon, immobilisiert auf einem festen Träger, so daß das besagte immobilisierte, eine Fehlpaarung bindende Protein in der Lage ist, an eine Fehlpaarung enthaltende Polynucleotidmoleküle zu binden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines direkten Tests auf Fehlpaarungen unter Verwendung von an Nitrocellulose gebundenem MutS. Wachsende Mengen von biotinylierter, eine Fehlpaarung enthaltender DNA (die oberen beiden Linien) oder fehlpaarungsfreier DNA (die unteren beiden Linien) wurden zu den Reaktionsgemischen zugegeben.
• Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Kompetitionstests von fehlgepaarten Doppelsträngen unter Verwendung von an Nitrocellulose gebundenem MutS-Protein. Wachsende Mengen von nicht markiertem, eine Fehlpaarung enthaltendem 30-mer (die oberen beiden Linien) oder fehlpaarungsfreiem 30-mer (die unteren beiden Linien) wurden zu 5 ng biotinyliertem, eine Fehlpaarung enthaltendem 30-mer zugegeben. Ganz rechts in der Figur sind die Mulden dargestellt, die kein MutS enthalten.
• Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Bindung von eine Fehlpaarung enthaltender DNA an E. coli-MutS, das auf Nitrocellulose immobilisiert ist. Eine Fehlpaarung enthaltende DNA- Doppelstränge (2157 und Bio-Het+) zeigen dunklere (oder sichtbare) Banden bei Konzentrationen, wo Homoduplex-DNA hellere (oder keine) Banden zeigt.
• Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenzen eines synthetischen Oligonucleotids (30-mer), die mit einer einzigen Fehlpaarung an der Position 15 oder 16 oder mit 1-4 nicht gepaarten Basen zwischen den Positionen 15 und 16 hergestellt worden waren. Fehlgepaarte oder nicht gepaarte Basen sind dick dargestellt. Die Ergebnisse von Untersuchungen zum Nachweis dieser fehlgepaarten oder nicht gepaarten Basen sind in Fig. 5 gezeigt.
• Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Bindung von DNA-Doppelsträngen, die die angezeigten Fehlpaarungen oder nicht gepaarten Basen enthalten, an auf Nitrocellulose immobilisiertem E. coli-MutS.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Der hier genannte Erfinder hat sich ein neues, breit anwendbares und relativ einfaches Verfahren zum Nachweis eines einzelnen Basenaustausches in einer DNA-Sequenz oder von mehreren solchen Basenaustäuschen ausgedacht. Dieses Verfahren basiert auf der Bildung eines eine Fehlpaarung enthaltenden Heterodoppelstrangs, wenn ein Strang an mutierter DNA und ein "komplementärer" Wildtyp-DNA-Strang hybridisieren.
• Die Anwesenheit der Fehlpaarung wird in hoch spezifischer Weise dadurch nachgewiesen, daß der DNA zunächst gestattet wird, an ein immobilisiertes, eine Fehlpaarung bindendes Protein (MBP) wie das MutS-Protein von E. coli zu binden. Die Anwesenheit der an das MBP gebundenen DNA wird dann mittels einer Vielzahl an Wegen nachgewiesen, in Abhängigkeit von der verwendeten Markierung und ob der Test ein direkter Test oder ein kompetitiver Test ist. Dieses Verfahren steht in völligem Gegensatz zu Verfahren im Stand der Technik, die eine Fehlpaarung spaltende Nuclease-Enzyme verwenden, die in der Lage sind, die DNA an oder in der Nähe von einem fehlgepaarten Basenpaar zu spalten.
• Die hier beschriebenen Verfahren stellen ein Nachweissystem für Mutation/Polymorphismus bereit, das die Vorteile von (a) Einfachheit, (b) Genauigkeit, (c) die Fähigkeit der Verwendung ohne Radioaktivität, (d) die Fähigkeit zum Nachweis aller Mutationen durch Substitution einer einzigen Base und Additions- oder Deletionsmutationen von 1-4 Basen hat.
• Standardliteratur, die die generellen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technik und Zellbiologie darstellt und die die Bedingungen für die Isolierung und Handhabung von Nucleinsäuren, für die Denaturierung und Anlagerung von Nucleinsäuren, Hybridisierungstests und dergleichen beschreibt, umfassen: Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Albers, B. et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 2. Ausgabe, Garland Publishing, Inc., New York, NY, 1989; Watson, J.D., et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, Bände I und II, Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA, 1987; Darnell, J. E. et al., MOLECULAR CELL BIOLOGY, Scientific American Books, Inc., New York, NY, 1986; Lewin, B.M., Genes 11, John Wiley & Sons, New York, NY, 1985.
• MBPs sind Proteine von etwa 100 kDa; sie wurden in Bakterien und höheren Organismen identifiziert und daraus isoliert und binden selektiv DNA, die fehlgepaarte Basen enthält. MBPs wurden in Hefe (Valle G. et al., 1991 Yeast 7: 981-988; Miret J.J. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 3507-3513) und auch in Menschen (Stephenson, C. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 21177-21782; Karran, P. et al., 1990, Mutat. Res. 236: 269-275; Hughes M.J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 23876-23882; Reenan, A. G. et al., 1993, Genetics 132: 963-973; Reenan, A.G. et al., 1993, Genetics 132: 975-985) gefunden. Eine Fehlpaarung bindende Proteine von Xenopus und von der Maus wurden von M. Radman und Kollegen cloniert.
• Ein bevorzugtes MBP wird durch seine Fähigkeit charakterisiert, DNA-DNA (oder DNA-RNA oder RNA-RNA)-Doppelstränge zu binden, die fehlgepaarte oder nicht gepaarte Basen enthalten, mit dem signifikanten Ausschluß von einzelsträngigen Polynucleotiden oder perfekt passenden Doppelsträngen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das intakte, native MutS-Protein von E. coli verwendet. Wie hier verwendet, ist der Ausdruck "Fehlpaarung bindendes Protein" oder "MBP" jedoch so gemeint, daß er ein funktionelles Derivat des intakten, nativen Proteins umfaßt. Mit "funktionelles Derivat" ist ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analogon" oder ein "chemisches Derivat" des Proteins gemeint, das die Fähigkeit beibehält, einen eine Fehlpaarung enthaltenden Nucleinsäureheterodoppelstrang zu binden, was seinen Nutzen gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt.
• Ein "Fragment" von einem MBP betrifft jede Untereinheit des Moleküls, das heißt ein kürzeres Peptid. Eine "Variante" des Proteins betrifft ein Molekül, das im Wesentlichen ähnlich dem gesamten Protein oder einem DNA-Hybrid-bindenden Fragment davon ist. Eine Variante eines eine Fehlpaarung bindenden Proteins, zum Beispiel von MutS, kann mittels rekombinanter, im Stand der Technik bekannter DNA-Verfahren hergestellt werden.
• Ein bevorzugtes funktionelles Derivat von MutS ist ein Homologes von E. coli-MutS in einer anderen Art wie das MutS-Protein von Salmonella typhimurium (Lu, A.L. et al., vorstehend; Haber L.T. et al., vorstehend; Pang, P.P. et al., vorstehend) oder das hexA-Protein von Streptococcus pneumoniae (Priebe S. D. et al., vorstehend; Haber et al., vorstehend). Außerdem können auch mögliche eukaryontische Homologe von MutS oder HexA verwendet werden, so wie diejenigen, die von den homologen Sequenzen codiert werden, die in DNA von Mensch, Maus, Frosch oder Hamster (Shimada, T. et al., J. Biol. Chem. 264 : 20171 (1989); Linton, J. et al., Molec. Cell. Biol. 7: 3058-3072 (1989); Fujü, H. et al., J. Biol. Chem. 264: 10057 (1989)) identifiziert wurden.
• Ein "chemisches Derivat" von MBP enthält zusätzliche chemische Gruppen, die üblicherweise nicht Teil des Proteins sind, einschließlich zusätzlicher Abschnitte von Aminosäuren wie in einem Fusionsprotein. Kovalente Modifikationen des Peptids sind im Umfang der Erfindung enthalten. Solche Modifikationen können durch Reaktion des Ziel- Aminosäurerrests des Proteins mit einem organischen, derivatisierenden Agens, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder Endgruppen zu reagieren, in das Molekül eingeführt werden.
• Wenn man ein Protein als nützliches MBP für die Verfahren der vorliegenden Erfindung auswählt, können von einem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet unter Verwendung herkömmlicher Verfahren Tests durchgeführt werden. Wenn man zum Beispiel eine Probe auf die Anwesenheit eines bei der vorliegenden Erfindung nützlichen MBP bewerten will, kann man einen Fehlpaarungsbindungstest durchführen, wie den von Jiricny et al. für MutS beschriebenen. Vorzugsweise wird ein Filterbindungstest verwendet. Um den Oligonucleotid-Heterodoppelstrang herzustellen, wird ein Oligonucleotid vorzugsweise von etwa 16 Basen unter Verwendung einer Kinase-Reaktion mit ³²P markiert und unter Verwendung einer Kinase wie T4-Polynucleotid-Kinase mit γ-³²P-ATP. Das 5'-markierte Oligonucleotid (das bei -20ºC aufbewahrt werden kann) wird dann mit einem komplementären Oligonucleotid zusammengelagert, das unter Standardbedingungen ein einziges fehlgepaartes Basenpaar hat. Der zusammengelagerte Heterodoppelstrang von 16 Basenpaaren wird mit einem Überschuß des zu testenden Proteins gemischt und 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Das Gemisch wird dann auf ein Nitrocellulosefilter aufgebracht, das zuvor in dem Testpuffer angefeuchtet wurde. Für mehrere Sekunden wird ein schwacher Sog ausgeübt, und das Filter wird ausführlich mit eiskaltem Testpuffer gewaschen. Das Filter wird dann an der Luft getrocknet, in Szintillationsflüssigkeit suspendiert und gezählt. Wegen des an dem Filter haftenden Proteins können alle Impulse auf dem Filter der Bindung an das mutmaßliche MBP zugerechnet werden. In der Abwesenheit eines solchen Proteins wird der markierte Oligonucleotid-Heterodoppelstrang das Filter passieren. Somit kann man durch Verwendung eines so einfachen Tests ein bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches MBP einfach nachweisen und auswählen.
• Wie bei der vorliegenden Erfindung verwendet, wird das MBP an einer festen Unterstützung oder einem festen Träger immobilisiert. Mit "fester Unterstützung" oder "Träger" ist jede Unterstützung gemeint, die in der Lage ist, ein Protein zu binden. Bekannte Unterstützungen oder Träger umfassen natürliche Cellulose, modifizierte Cellulose wie Nitrocellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamid und Agarose oder Sepharose®. Auch magnetische Kügelchen sind von Nutzen. Das Unterstützungsmaterial kann im Prinzip jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, so lange das immobilisierte MBP in der Lage ist, an die Ziel-Nucleinsäuremoleküle zu binden. Somit kann die Unterstützungskonfiguration Mikropartikel, Kügelchen, poröse und undurchlässige Streifen und Membranen, die innere Oberfläche eines Reaktionsgefäßes wie Reagensgläser und Mikrotiterplatten und dergleichen umfassen. Bevorzugte Unterstützungen umfassen Nitrocellulosescheiben oder -streifen. Dem Durchschnittsfachmann werden viele andere geeignete Träger für die Bindung von MBP bekannt sein, oder er wird in der Lage sein, diese durch Routineversuche festzustellen.
• Am meisten bevorzugt ist eine feste Unterstützung, an die das MBP mittels kovalenter oder nicht kovalenter Bindungen gebunden oder fixiert ist. Vorzugsweise ist die nicht kovalente Bindung durch Adsorption unter Verwendung von Verfahren, die eine geeignete, stabile und starke Bindung bereitstellen. Das MBP wird unter Verwendung von Verfahren immobilisiert, die im Stand der Technik als geeignet für die spezielle feste Unterstützung bekannt sind, unter der Maßgabe, daß die Fähigkeit des MBP, Fehlpaarung enthaltende DNA zu binden, nicht zerstört wird.
• Das immobilisierte MBP wird dann einfach verwendet, um Heterozygosität (oder Polymorphismus) ebenso wie Einzelbasen-Mutationen nachzuweisen, oder um aus einem Gemisch Fehlpaarung enthaltende DNA zu isolieren oder um ein Gemisch von Fehlpaarung enthaltender DNA zu reinigen.
• In einer Ausführungsform dient die Oberfläche von Platten mit vielen Mulden aus Polystyrol oder anderem, Plastik als feste Unterstützung. In einer anderen Ausführungsform wird die feste Unterstützung, an die das MBP gebunden ist, am Grund von Mulden von Platten mit vielen Mulden fixiert.
• In einer bevorzugten Ausführungsform können die Immobilisierung und Bindung der DNA in einem Blot-Gerät mit 96 Mulden durchgeführt werden, und der resultierende Nitrocellulose (oder andere Unterstützungs)-Papierbogen kann entfernt werden, um die Reaktionen zu bewerten. Zum Beispiel kann die Farbentwicklung auf der Nitrocellulose verwendet werden, um die Bindung zu bewerten, basierend auf einem Enzym als Teil des Nachweissystems und einem chromogenen oder chemilumineszierenden Substrat für das Enzym, das als Vorläufer der Farbreaktion dient.
• Nach erfolgter Anheftung des MBP an die Unterstützung wird die Unterstützung unter Verwendung von Verfahren und Reagentien, die im Stand der Technik bekannt sind, behandelt ("blockiert"), um die weitere Bindung von Proteinen oder Nucleinsäuren zu verhindern.
• Das immobilisierte MBP wird mit kleinen Oligonucleotid- Heterodoppelstrangmolekülen in Kontakt gebracht und darf sie (bis zur Sättigung) binden. Die Oligonucleotide haben vorzugsweise etwa 30 Basenpaare. Für die Testung wird ein DNA- Doppelstrang verwendet, der eine Fehlpaarung enthält, die vom MBP gut erkannt wird (d. h. gebunden).
HERSTELLUNG VON OLIGONUCLEOTIDEN, DIE FEHLPAARUNGEN ENTHALTEN ODER NICHT
• Solche Oligonucleotide werden unter Verwendung eines Nucleotids hergestellt, das am 5'-Ende mit einer nachweisbaren Markierung modifiziert ist, so daß sie mit den geeigneten Nachweisverfahren quantitativ nachgewiesen werden können, vorzugsweise Spektrophotometrie oder Chemilumineszenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonucleotid mit Biotin modifiziert und ist unter Verwendung eines Nachweissystems nachweisbar, das auf Avidin oder Streptavidin basiert, das mit hoher Affinität an Biotin bindet. Das Streptavidin kann mit einem Enzym konjugiert werden, dessen Vorhandensein unter Verwendung eines chromogenen Substrats und mittels Messung der gebildeten Farbe bestimmt wird.
• Beispiele für nützliche Enzyme bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease, delta-V-Steroidisomerase, Hefe- Alkoholdehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
• Die nachweisbare Markierung kann auch ein Radioisotop sein, das unter Verwendung solcher Mittel wie eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder mittels Autoradiographie nachgewiesen werden kann.
• Die nachweisbare Markierung kann auch eine fluoreszierende Verbindung sein. Wenn das fluoreszierend markierte Molekül Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann sein Vorhandensein wegen der Fluoreszenz unter Verwendung von Mikroskopie oder Fluorometrie nachgewiesen werden. Unter den am meisten verwendeten fluoreszierenden Markierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, O-Phthaldehyd und Fluorescamin.
• Die nachweisbare Markierung kann ein Fluoreszenz emittierendes Metall sein, wie ¹&sup5;²Eu oder andere aus der Gruppe der Lanthaniden. Diese Metalle können unter Verwendung einer Metall chelatierenden Gruppe wie Diethylentriaminpentaessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure an das Oligonucleotid gebunden werden.
• Die nachweisbare Markierung kann eine chemiluminezierende Verbindung sein. Das Vorhandensein des chemilumineszierend markierten Moleküls wird dann durch das Vorhandensein von Lumineszenz bestimmt, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele für besonders nützliche chemiluminezierende Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
• In vergleichbarer Weise kann eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen gefunden wird, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Das Vorhandensein eines biolumineszierenden Proteins wird durch den Nachweis des Vorhandenseins von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen zum Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
• Ein MBP, das an das DNA-DNA-, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybrid gebunden ist, kann entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Zum direkten Nachweis wird der Poly- oder Oligonucleotiddoppelstrang unter Verwendung der hier diskutierten Markierungen nachweisbar markiert.
• Zum indirekten Nachweis verwendet der Test die Konkurrenz der Bindung der Test- DNA mit einem bereits gebundenen oder gleichzeitig eingesetzten, eine Fehlpaarung enthaltenden Doppelstrang an das MBP. Somit wird ein markiertes, eine Fehlpaarung enthaltendes Oligonucleotid an das MBP vorgebunden oder wird mit dem MBP und der Test- DNA zusammen inkubiert. Je mehr eine Fehlpaarung enthaltende DNA in der Testprobe vorhanden ist, desto weniger Bindung des markierten Oligonucleotids an das MBP wird eintreten.
• Die zu testende Testprobe kann in jedem Medium von Interesse sein und wird im allgemeinen eine Probe von medizinischer, Veterinär-, Umwelt-, Ernährungs- oder industrieller Bedeutung sein. Menschliche und tierische Proben und insbesondere Körperflüssigkeiten können mittels des vorliegenden Verfahrens unter der Maßgabe getestet werden, daß sie Zellen enthalten, aus denen Nucleinsäuren gewonnen werden können. Bevorzugte Quellen umfassen Blut, Sperma, anderes Gewebe, Milch, Urin, cerebrospinale Flüssigkeit, Speichel, fäkales Material, Lungenabsaugungen, Halsabstrich, genitalen Abstrich und Exsudat, rektalen Abstrich und nasopharyngeale Absaugungen.
NACHWEIS VON HETEROZYGOSITÄT ODER POLYMORPHISMUS
• Um Heterozygosität oder Polymorphismus in DNA von einem diploiden Organismus nachzuweisen, wird Test-DNA bevorzugt durch Denaturierung und Anlagerung von PCRamplifizierter DNA von einem diploiden Organismus hergestellt. Die Test-DNA wird mit markierten Primern hergestellt, angelagert und in eine Mulde oder ein anderes Reaktionsgefäß gegeben, das immobilisiertes MBP enthält, das bereits an fehlgepaarte Oligonucleotide gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann die Test-DNA mit fehlgepaarten Oligonucleotiden gemischt werden und das Gemisch zu einer Mulde oder einem anderen Gefäß zugegeben werden, das immobilisiertes MBP enthält.
• Eine spektrophotometrische Auswertung wird bei der für den quantitativen Nachweis der Test-DNA geeigneten Wellenlänge gemacht. Nach einer Inkubationszeit, die geeignet ist, um entweder (1) die Bindung der Test-DNA an das immobilisierte MBP oder (2) die Verdrängung des fehlgepaarten Oligonucleotids von dem immobilisierten MBP zuzulassen, wird die DNA-Lösung entfernt, die Mulde gewaschen, und eine spektrophotometrische Auswertung wird bei der für den quantitativen Nachweis des gebundenen, fehlgepaarten Oligonucleotids geeigneten Wellenlänge gemacht.
• Das Verhältnis der Auswertung für die Test-DNA zu der Auswertung für das fehlgepaarte Oligonucleotid wird über einen weiten Bereich an DNA-Konzentrationen deutlich unterschiedlich sein für eine Fehlpaarung enthaltende und Fehlpaarung-freie Test- DNA. Standardkurven werden unter Verwendung bekannter Mengen an DNA hergestellt, um die Charakterisierung der Test-DNA als homozygot oder heterozygot zu erlauben, ohne die Test-DNA vor dem Test quantifizieren zu müssen. Somit reicht eine einzige DNA-Probe aus, um Heterozygosität zu bestimmen, und eine einzige Mikroplätte mit 96 Mulden wird die Testung von mindestens etwa 80 verschiedenen DNA-Proben zulassen.
NACHWEIS VON HOMOZYGOTEN MUTATIONEN
• Um homozygote Mutationen nachzuweisen, muß bekannte homozygote Wildtyp-DNA vor der Denaturierung und Anlagerung mit der Test-DNA-Probe kombiniert werden. Nur Test-DNA, die eine Mutation (homozygot) enthält, wird eine Fehlpaarung enthaltende DNA bilden, die mit dem fehlgepaarten Oligonucleotid um die Bindung an das immobilisierte MBP konkurrieren kann.
• Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden mit (a) nur dem eine Fehlpaarung enthaltenden Oligonucleotid mit Markierung oder (b) nur der Test-DNA mit Markierung. Beide Verfahren erfordern jedoch, daß die Nucleinsäurekonzentration bestimmt wird und daß der Test mit mehreren verschiedenen Test-DNA-Konzentrationen durchgeführt wird.
• Wenn die fehlgepaarten Oligonucleotide markiert sind, basiert der Test auf der Konkurrenz mit verschiedenen Konzentrationen der Test-DNA und dem Vergleich der resultierenden Kurve (wobei die Konzentration in Mol Doppelstrangmolekül ausgedrückt wird) mit Standardkurven für fehlgepaarte und nicht fehlgepaarte Standards.
• Wenn die Test-DNA markiert ist, umfaßt der Test die Messung des Ausmaßes der Bindung an MBP bei mehreren Konzentrationen unterhalb der Sättigung und den Vergleich der resultierenden Kurven mit Standardkurven für fehlgepaarte und nicht fehlgepaarte Standards.
REINIGUNG VON AMPLIFIZIERTEN DNA-PROBEN
• Eine der revolutionärsten und am meisten gegenwärtig verwendeten Technologien in der modernen Molekularbiologie ist das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), das DNA-Sequenzen von äußerst geringen Mengen, so daß sie fast nicht nachweisbar sind, amplifiziert. Für einen Überblick über PCR vgl.: Mullis, K. B., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273; Saiki, R.-K. et al., 1985, Bio/Technology 3: 1008-1012; und Mullis, K.B. et al., 1987, Meth. Enzymol. 155: 335-350. Weil PCR außerdem spezifische Sequenzen amplifizieren kann, erlaubt sie die Reinigung von spezifischen Sequenzen, im Grunde genommen mit einem einzigen Schritt, aus genomischer DNA. PCR ist eine essentielle Komponente von eigentlich allen Untersuchungen des menschlichen Genoms, ist eine zentrale Komponente der Identifikation und Clonierung von Genen, wird vermehrt verwendet bei der Diagnose von genetischen und infektiösen Krankheiten und wird in der Gerichtsmedizin breit verwendet.
• Bei einigen Anwendungen jedoch, besonders bei der Clonierung von Genen und beim Nachweis von Mutationen leidet die PCR unter der inhärenten Tendenz der Polymerase, durch den Einbau von nicht korrekten, nicht komplementären Basen während der Synthese Fehler zu machen. Obwohl die Zuverlässigkeit der meisten replikativen Polymerasen in vivo so ist, daß sie nur eine nicht korrekte Base pro 10¹&sup0; replizierten Basen einbauen, können die bei der PCR verwendeten Polymerasen eine Fehlerrate aufweisen, die so hoch ist wie eine nicht korrekte Base pro 104 replizierten Basen. Eine so hohe Fehlerrate kann bedeuten, daß ein signifikanter Anteil der amplifizierten Moleküle nicht mit der Sequenz des Ausgangsmaterials identisch sein wird.
• Die vorliegenden Verfahren sind bei der Reinigung von amplifizierten DNA-Proben unter Verwendung eines immobilisierten MBP von Nutzen, um Minoritätssequenzen und Moleküle zu entfernen, die Sequenzveränderungen enthalten, die während des Amplifikationsverfahrens eingeführt wurden. Wenn zum Beispiel ein DNA-Segment über 20 Runden Replikation amplifiziert wird (ein allgemeines Ausmaß an Amplifikation) kann eine signifikante Fraktion der endgültigen Moleküle eine oder mehrere inkorrekte Basen enthalten. Bei Clonierungsexperimenten erhöht das erheblich das Risiko, eine Nucleotidsequenz zu clonieren, die von der Ausgangssequenz verschieden ist.
• Bei Tests zum Nachweis von Mutationen, die Denaturierung und Anlagerung einer PCR-amplifizierten Probe umfassen, können während der PCR unkorrekt eingebaute Basen so gewertet werden, als seien sie Mutationen in der Originalprobe. Deshalb ist es für den genauen Nachweis von Mutationen erforderlich, alle DNA-Moleküle mit Sequenzveränderungen zu eliminieren, die durch PCR-Kopierfehler eingeführt wurden. Das hier beschriebene Verfahren erreicht diese Reinigung auf eine einfache und direkte Weise.
• Immobilisiertes MBP kann verwendet werden, um amplifizierte DNA-Proben zu reinigen. MBP wird durch Bindung an Unterstützungen in fester Phase immobilisiert, vorzugsweise Nitrocellulosefilter, Sepharosekügelchen oder magnetische Kügelchen. Die Filter oder Kügelchen werden, falls erforderlich, behandelt, um die Bindung von doppelsträngiger DNA zu verhindern. Die amplifizierte DNA-Probe wird durch Erhitzen denaturiert und die Wiederanlagerung zugelassen. Angesichts der zufälligen Natur der PCR- Fehler werden praktisch alle unkorrekten Basen nach der Anlagerung in fehlgepaarten Basenpaaren gefunden.
• Das immobilisierte MBP wird zu der Probe zugegeben und die Lösung durch vorsichtiges Schütteln gemischt. Das immobilisierte MBP und jegliche gebundene, eine Fehlpaarung enthaltende DNA werden entfernt, zum Beispiel durch Entfernen des Filters, durch Absetzenlassen der Kügelchen aus der Lösung oder durch magnetische Entfernung der Kügelchen, in Abhängigkeit von der Natur der verwendeten festen Unterstützung. Es bleiben präzis gepaarte DNA-Doppelstränge zurück.
• Zusätzlich zu der Reinigung von amplifizierten DNA-Proben durch Entfernen von Molekülen, die während der Amplifikation eingeführte Fehler enthalten, wird die Reinigung unter Verwendung von immobilisiertem MBP verwendet, um Majoritätssequenzen anzureichern, wenn Proben von divergenten, wiederholten DNA-Sequenzen wie die Immunglobulingene untersucht werden.
• Um eine Minoritätsart vollständig aus einer von einer gemischten Population an DNA (in Bezug auf die Sequenz) amplifizierten Probe zu entfernen, kann es erforderlich sein, mehr als eine der hier beschriebenen Runde an Reinigung durchzuführen und möglicherweise mehr als eine Runde an Amplifikation.
• Man beachte, daß das vorliegende Verfahren verwendet werden kann, um Sequenzen von sowohl homozygoten als auch heterozygoten amplifizierten Sequenzen zu reinigen, da sich die Hälfte der elterlichen Sequenzen in einer heterozygoten Probe an den komplementären Strang desselben elterlichen Erbmaterials anlagern wird und damit ein Molekül ohne Fehlpaarungen bilden wird. In anderen Worten, wenn das Ausgangsmaterial heterozygot ist, wird die Hälfte der zusammengelagerten Moleküle aus der Probe entfernt werden, weil sie wegen der Unterschiede bei den Ausgangssequenzen eine Fehlpaarung enthalten. Die Hälfte der zusammengelagerten Moleküle wird jedoch keine solchen Fehlpaarungen enthalten und wird daher nur dann aus der Probe entfernt, wenn sie Fehlpaarungen enthalten, die als Ergebnis eines Fehlers während der Amplifikation erzeugt wurden. In jedem Fall benötigt ein Nachweistest für Mutationen eine zweite Runde an Denaturierung und Anlagerung.
ALLEL-IDENTIFIZIERUNG IN MULTI-ALLELISCHEN SYSTEMEN
• Da immer mehr Allele von Krankheits-verursachenden Genen identifiziert werden und angesichts der Aufgabe, eine Polymorphismus-Karte des menschlichen Genoms zu entwickeln, gewinnt die Identifizierung spezieller Allele eines gegebenen Gens zunehmend an Bedeutung. Immobilisierte MBPs stellen ein einfaches und direktes Mittel für die Allel- Identifizierung bereit.
• Einmalige, markierte Oligonucleotidsonden werden für jedes Allel eines gegebenen Gens hergestellt, so daß die Sonde nur zu einem Allel perfekt komplementär ist, d. h. die Sonde wird eine oder mehrere Fehlpaarungen bilden, wenn sie mit dem unkorrekten Allel gepaart wird. Die Sonde wird mir einem Überschuß an amplifizierter Test-DNA gemischt, so daß nach Denaturierung und Anlagerung jede Kopie der Sonde in einem Doppelstrang gefunden wird. Das Verfahren wird mit Sonden für jedes fragliche Allel wiederholt. Das zusammengelagerte DNA-Gemisch wird dann entweder:
• (1) mit dem immobilisierten MBP auf einer Unterstützung gemischt, die durch Zentrifugation aus der Suspension entfernt werden kann;
• (2) durch eine Mikrosäule von immobilisiertem MBP auf einer geeigneten Säulenunterstützung gegeben; oder
• (3) durch eine Filterunterstützung gegeben, die immobilisiertes MBP enthält.
• In jedem Fall muß das immobilisierte MBP im Überschuß sein, so daß die gesamte, eine Fehlpaarung enthaltende DNA zurückgehalten wird. Der Überstand, der Säulenausfluß oder das Filtrat werden auf das Vorhandensein von Markierung untersucht. Nur in den Fällen, in denen die Sonde perfekt komplementär zu einem Allel in der Test-DNA ist, wird Markierung nachgewiesen.
• Um sicher zu sein, daß keine einzelsträngigen Sondensequenzen vorhanden sind, kann es erforderlich oder mindestens wünschenswert sein, eine Bindungskomponente für einzelsträngige DNA auf der Unterstützung für das immobilisierte MBP einzuschließen. Dieses System arbeitet unter homozygoten und heterozygoten Bedingungen gleichermaßen gut.
KITS
• Die vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Kit oder ein Reagenssystem, das für die Durchführung der hier beschriebenen Verfahren von Nutzen ist. Ein solcher Kit wird eine Reagenskombination enthalten, die die essentiellen Elemente umfaßt, die erforderlich sind, um einen Test gemäß den hier offenbarten Verfahren durchzuführen. Das Reagenssystem wird angeboten in einer kommerziell verpackten Form, als eine Zusammensetzung oder Beimischung, wo es die Kompatibilität der Reagentien zuläßt, in einer Konfiguration als Testvorrichtung oder typischer als Testkit, d. h. eine verpackte Kombination mit einem oder mehreren Behältnissen, Vorrichtungen oder dergleichen, die die erforderlichen Reagentien enthalten, und üblicherweise unter Einschluß von schriftlichen Anweisungen zur Durchführung der Tests. Der Kit der vorliegenden Erfindung kann alle Konfigurationen und Zusammensetzungen zur Durchführung der verschiedenen, hier beschriebenen Testformate umfassen.
• In allen Fällen wird das Reagenssystem (1) ein immobilisierbares oder immobilisiertes MBP oder ein funktionelles Derivat, vorzugsweise MutS und (2) zusätzliche Reagentien, die bei der Durchführung des Tests von Nutzen sind, umfassen. Der Kit kann gegebenenfalls markierte, eine Fehlpaarung enthaltende Oligonucleotide umfassen. Zum Nachweis einer speziellen Mutation kann ein Kit auch markierte Primer zur Durchführung einer PCR enthalten. Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich Hilfschemikalien umfassen, wie Komponenten der Lösung, in der die Bindung der Doppelstränge an das immobilisierte MBP stattfindet.
• Nachdem die Erfindung nun im allgemeinen beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele einfacher zu verstehen sein, die nur zum Zwecke der Erläuterung dargeboten werden und nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht sind, außer es ist anders angegeben.
BEISPIEL I BINDUNG VON EINE FEHLPAARUNG ENTHALTENDER DNA DURCH IMMOBILISIERTES EINE FEHLPAARUNG BINDENDES PROTEIN A. Materialien und Methoden 1. Herstellung von immobilisiertem MBP
• Ein Nitrocelluloseblatt (0,45 um, Schleicher & Schüll) wurde mit Reaktionspuffer angefeuchtet (20 mM Tris pH 7,6, 0,01 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DDT) und in einen Dot-Blot-Apparat (Bio-Rad) gegeben.
• Gereinigtes MBP, E. coli-MutS, mit einer Konzentration von 0,5 ug/10 ul Reaktionspuffer wurde auf das Nitrocellulosepapier in jeder Mulde aufgetupft. Die Mulden wurden bei Raumtemperatur inkubiert und die verbleibende Flüssigkeit unter Vakuum durchgesaugt. Jede Mulde wurde durch Zugabe der Lösung zu der Mulde und anschließendem Ausschütten zweimal mit 100 ul Reaktionspuffer gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurde die verbleibende Flüssigkeit mit Vakuum durchgesaugt.
2. Blockierung
• Das Nitrocellulosefilter wurde mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, um die Bindung anderer Proteine oder Nucleinsäuren zu verhindern. Zu jeder Mulde wurde Reaktionspuffer (200 ul) zugegeben, der 1% (Gew./Vol.) BSA enthielt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die Lösung ausgegossen, und jede Mulde wurde durch Zugabe der Lösung zu der Mulde und anschließendem Ausschütten mit 2 · 100 ul Reaktionspuffer gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurde die verbleibende Flüssigkeit unter Vakuum durchgesaugt.
3. Oligonucleotide
• Die Sequenz der bei diesen Untersuchungen verwendeten Oligonucleotide wurde von dem Bereich von 30 Basenpaaren genommen, der die Stelle der Sichelzell-Mutation im menschlichen β-Globingen umgibt. Die Fehlpaarung ist an der Stelle der Sichelzell-Mutation, obwohl die mutierte Sequenz, die zur Bildung der Fehlpaarung verwendet wurde, nicht die Sichelzell-Mutation ist (die tatsächliche Sichelzell-Mutation ist eine A : T → T : A- Transversion). Biotinylierte Oligonucleotide wurden am 5'-Ende des mutierten Strangs biotinyliert. Die Biotinylierung wird während der Synthese durch Zugabe von mittels Biotin modifizierten Nucleotiden zum 5'-Ende der Oligonucleotide erreicht. G : T-Fehlpaarung: Ohne Fehlpaarung:
4. Bindung von DNA
• Biotinylierte Oligonucleotide in 20 ul Reaktionspuffer, der 1% BSA enthielt, wurden zu jeder Mulde zugegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die verbleibende Flüssigkeit ausgegossen. Jede Mulde wurde durch Zugabe der Lösung zu der Mulde und anschließendem Ausschütten mit 5 · 100 ul Reaktionspuffer gewaschen. Nach dem fünften Waschen wurde die verbleibende Lösung unter Vakuum durchgesaugt.
5. Bindung von Streptavidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase (HRP)
• Die Anwesenheit von Biotin wurde mittels seiner Bindung an Streptavidin nachgewiesen. Ein Volumen von 100 ul von Streptavidin-konjugierter HRP (Pierce Chemicals) mit einer Konzentration von 50 mg/ml in Reaktionspuffer + 1% BSA wurde zu jeder Mulde zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung ausgegossen, und jede Mulde wurde durch Zugabe der Lösung zu der Mulde und anschließendem Ausschütten mit 5 · 100 ul Reaktionspuffer gewaschen. Nach dem fünften Waschen wurde die verbleibende Lösung unter Vakuum durchgesaugt.
6. Entwicklung von erhöhter ChemiLumineszenz® (ECL)
• Das Nitrocelluloseblatt wurde aus dem Dot-Blot-Apparat entfernt und in einer Petrischale 3 mal mit 10 ml Reaktionspuffer gewaschen. Fünf ml ECL-Entwicklungslösung (Amersham) wurden über die Nitrocellulose gegossen. Bei diesem Reagens ist das Substrat für HRP eine chemilumineszierende Verbindung. Nach einer Minute wurde die Lösung entfernt. Die Nitrocellulose wurde trocken einem Blotverfahren unterzogen und zwischen zwei klare Plastikblätter gelegt. Die so geschützte Nitrocellulose wurde in der Dunkelheit für verschiedene Zeiträume gegen einen Röntgenfilm exponiert. Bei den hier berichteten Experimenten war der Belichtungszeitraum 1 Minute.
7. Kompetition
• Bei Kompetitionsuntersuchungen war die DNA-Bindung wie vorstehend beschrieben, außer daß eine konstante Menge an biotinyliertem, eine Fehlpaarung enthaltendem Oligonucleotid (5 ng) mit verschiedenen Mengen an nicht markierter DNA, mit oder ohne Fehlpaarung, gemischt und zu den Mulden zugegeben wurde.
B. ERGEBNISSE 1. Spezifische Bindung von eine Fehlpaarung enthaltender DNA durch immobilisiertes MBP
• Fig. 1 zeigt die Ergebnisse (doppelt) der Zugabe von wachsenden Mengen an biotinylierter, eine Fehlpaarung enthaltender DNA (die oberen beiden Linien) oder fehlpaarungsfreier DNA (die unteren beiden Linien).
• Das immobilisierte MBP kann so wenig wie 0,2 ng an Fehlpaarung enthaltendem 30- mer nachweisen, während sogar mit 200 ng DNA keine nachweisbare Bindung von fehlpaarungsfreiem 30-mer beobachtet wurde. (Die Linien um die unteren Flecke sind Artefakte von unvollständigem Waschen).
2. Kompetitionstest
• Fig. 2 zeigt die Ergebnisse (doppelt) der Zugabe von wachsenden Mengen an nicht markiertem, eine Fehlpaarung enthaltendem 30-mer (die oberen beiden Linien) oder fehlpaarungsfreiem 30-mer (die unteren beiden Linien) zu 5 ng an biotinyliertem, eine Fehlpaarung enthaltendem 30-mer. Obwohl bei 50 ng an eine Fehlpaarung enthaltender DNA die Kompetition deutlich sichtbar war, trat bei der fehlpaarungsfreien DNA bis zu 500 ng keine Kompetition auf, wenn sie überhaupt auftrat. Die gesamte rechte Spalte in der Figur enthält kein MBP.
• Diese Ergebnisse zeigen, daß immobilisiertes MBP zumindest bei den vorstehend verwendeten 30-meren zwischen eine Fehlpaarung enthaltender und perfekt gepaarter DNA mit einer Effizienz von mindestens drei Größenordnungen unterscheidet. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von 54-meren mit einer Sequenz erhalten, die von der V3-Schleife von HIV abgeleitet war. Selbst wenn daher die Unterscheidung abnimmt, wenn die Menge an perfekt gepaarten Doppelsträngen zunimmt, sollte die Unterscheidungseffizienz bei der Verwendung von 300-meren, der vermutlich maximalen Länge von Nutzen bei Polymorphismus-Untersuchungen des menschlichen Genoms, in der Größenordnung eines Faktors von 100 sein.
BEISPIEL II DER NACHWEIS VON HETEROZYGOTE IN MENSCHLICHER GENOMISCHER DNA
• Die vorstehend beschriebenen Verfahren wurden verwendet, um an einem spezifischen Ort in menschlicher - genomischer DNA Heterozygosität nachzuweisen. Eine PCR- Amplifikation wurde mit einem Teil von Exon 3 des menschlichen Glucokinasegens von Codon 98 (codiert Glutamin) bis zum Stop-Codon (Soffel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7689-7702 (1992)) durchgeführt. Die doppelsträngige Wildtyp-Sequenz von 100 Basen (SEQ ID NR: 4 und SEQ ID NR: 5), die dem Exon 3 von menschlicher Glucokinase entspicht, ist wie folgt:
• In der heterozygoten DNA (vgl. nachstehend) war das C des unterstrichenen CAG- Codons zu T mutiert. Die getesteten DNA-Sequenzen wurden mittels PCR von genomischer DNA amplifiziert, die erhalten worden war von: (1) einer bekannten an dieser Position heterozygoten DNA, (2) einer bekannten an dieser Position homozygoten DNA und (3) einer vermuteten an dieser Position homozygoten DNA.
• Die Test-DNAs wurden durch Erhitzen denaturiert, die Wiederanlagerung zugelassen und mittels Testung ihrer Bindung in einem Test mit immobilisiertem, eine Fehlpaarung bindendem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von E. coli-MutS auf das Vorhandensein von Fehlpaarungen (d. h. Heterozygoten) getestet.
A. Materialien und Methoden: 1. PCR-Amplifikation
• Die folgenden Matrizen wurden verwendet:
• (a) 2157 - Heterozygot am Exon 3 des Glucokinasegens
• (b) DGK-101 - menschliche genomische DNA (homozygot am Exon 3 des Glucokinasegens)
• (c) Menschliche genomische DNA, männlich (vermutlich homozygot am Exon 3 des Glucokinasegens), als Sigma-DNA bezeichnet (kommerziell erhalten von Sigma Chemical Co.)
• Die Primer (von Operon erhalten) waren HPLC-gereinigt und hatten die folgenden Sequenzen, entsprechend den 5'-Enden der zwei DNA-Stränge SEQ ID NR: 4 und SEQ ID NR: 5:
• Der PCR-Primer #1 enthielt Biotin, das an das 5'-Ende gebunden war, um den Nachweis in dem nachstehend beschriebenen ECL-Nachweissystem zuzulassen. Der Primer #2 war mit einem 5-³²P-Phosphat radioaktiv markiert, um nach Entfernung der nicht verbrauchten Primer eine Quantifizierung der verschiedenen PCR-Produkte zuzulassen. Der Primer #2 wurde unter Verwendung einer Kinasereaktion vor der Verwendung bei der Amplifikation mit ³²P markiert. Das Kinase-Reaktionsgemisch enthielt: 70 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl&sub2;; 5 mM DTT; 20 uCl ³²P-ATP; 30 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase; und 500 ng DNA (Primer #2). Die Kinasereaktion wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 ul bei 37ºC 30 Minuten durchgeführt. Die Kinase wurde durch 10 Minuten Erhitzen bei 70ºC inaktiviert. Die DNA wurde bei -20ºC aufbewahrt.
• Die PCR-Reaktion umfaßte: 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl&sub2;; 0,001% Gelatine (Gew./Vol.); 0,05 mM dATP; 0,05 mM dTTP; 0,05 mM dGTP; 0,05 mM dCTP; 0,1 uM Primer #1; 0,075 uM Primer #2; 0,025 uM ³²P-Primer #2; 200 ng Matrizen- DNA und 2,5 Einheiten AmpliTaq®-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer). Das Reaktionsvolumen war 100 ul. Die Amplifikation wurde 30 Zyklen in einem Perkin-Elmer- Thermocycler durchgeführt mit 1 min Denaturierung bei 90ºC, 1 min Anlagerung bei 55ºC und 2 min Verlängerung bei 72ºC. Nicht verbrauchte Primer wurden durch Zentrifugal- Dialyse unter- Verwendung eines Centricon®30 Mikrokonzentrators (Amicon) gemäß dem PrQtokoll des Herstellers entfernt. Die PCR-Produkte wurden durch Lauf von gleichen Mengen (gemessen als CpM an Radioaktivität) auf nicht denaturierendem 8%-igem Polyacrylamidgel, Färben mit Ethidiumbromid und Vergleich mit Standard-DNA quantifiziert.
2. Tests mit immobilisiertem, eine Fehlpaarung bindendem Protein:
• DNA wurde (in einem Perkin-Elmer-Thermocycler) gemäß dem folgenden Schema denaturiert und angelagert: 4 min 100ºC; 1 Stunde 50ºC; 4 min 75ºC; 30 min 50ºC, gefolgt von Abkühlung auf Raumtemperatur.
• Ein Nitrocelluloseblatt (0,45 Mm, Schleicher und Schuell, BA85) wurde durch Schwimmen in Reaktionspuffer befeuchtet (20 mM Tris-HCl, pH 7,6; 5 mM MgCl&sub2;; 0,1 mM DTT; 0,01 mM EDTA) und in einen Slot-Blot-Apparat (Hoefer Scientific Instruments) über drei Blätter Blot-Papier (Schleicher und Schuell GB002) gegeben. 100 ul Reaktionspuffer wurden zu jeder Mulde zugegeben. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde mittels Vakuum verbleibender Puffer durchgesaugt. MutS (500 ng in 20 ul Reaktionspuffer) wurde zu jeder Mulde zugegeben. Das gleiche Volumen an Reaktionspuffer wurde zu jeder "Kein MutS"- Mulde zugegeben. Der Apparat wurde vor dem Fortgang zum nächsten Schritt 20 min bei Raumtemperatur gehalten.
• Die Nitrocellulose wurde durch Zugabe von 200 ul HRP-freiem BSA zu jeder Mulde blockiert. Nach einer Std. bei Raumtemperatur wurde mittels Vakuum jegliche verbleibende Lösung durchgesaugt.
• DNA-Präparationen wurde in 20 ul Reaktionspuffer zugegeben, der 3% HRP-freies BSA enthielt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden die Mulden 5-mal mit 100 ul Reaktionspuffer durch Zugabe der Lösung zu den Mulden und Dekantieren gewaschen.
• Das Vorhandensein von Biotin-markierter, an das Nitrocelluloseblatt gebundener DNA wurde durch Sichtbarmachung der Bindung von Streptavidin an Biotin nachgewiesen. 100 ul Streptavidin-HRP in Reaktionspuffer, der 3% HRP-freies BSA enthielt, wurde zu jeder Mulde zugegeben. Nach 20 min bei Raumtemperatur wurde die gesamte verbleibende Lösung dekantiert. Die Mulden wurden 5-mal mit 100 ul Reaktionspuffer durch Zugabe der Lösung zu den Mulden und anschließendem Dekantieren gewaschen. Jegliche Lösung, die nach dem fünften Waschen zurückblieb, wurde unter Vakuum entfernt.
3. Entwicklung erhöhter Chemilumineszenz (ECL)
• Das Nitrocelluloseblatt wurde aus dem Apparat entfernt und 4-mal 1 min mit 50 ml Reaktionspuffer in einem kleinen Trog gewaschen. Die Nitrocellulose wurde trocken einem Blotverfahren unterzogen und in 10 ml ECL-Entwicklungslösung (Amersham) getaucht. Nach 1 min wurde das Nitrocelluloseblatt entfernt, trocken einem Blotverfahren unterzogen und zwischen zwei klare Plastikblätter gelegt. Die so geschützte Nitrocellulose wurde in der Dunkelheit 30 sec gegen einen Röntgenfilm exponiert.
B. ERGEBNISSE
• Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Bio-Het bezieht sich auf einen synthetischen 30-mer Doppelstrang mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 3. Dieser Doppelstrang enthält eine G:T-Fehlpaarung an Position 15. Bio-Homo bezieht sich auf einen synthetischen 30-mer Doppelstrang mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2, dem die Fehlpaarung an Position 15 fehlt. Für Bio-Homo wurde keine Bindung nachgewiesen, sogar bei 10 ng DNA, wohingegen Bio- Het bei so kleinen Mengen wie 0,1 ng nachgewiesen wurde. In Abwesenheit von MutS ("Kein MutS-Spalten) wurde keine Bindung beobachtet, was anzeigt, daß die gesamte beobachtete DNA-Bindung von MutS abhängig ist.
• Die Bindung von heterozygoter Nucleinsäure (2157) an MutS war bei 0,6 ng klar zu sehen. Homozygote Bindung (unabhängig von der Quelle der DNA) war bei 1,25 ng schwach nachweisbar und bei 2,5 ng klar nachzuweisen. Somit war in diesen Tests heterozygote DNA mindestens 2-4 mal besser nachzuweisen als homozygote DNA. Die Bindung von homozygoter DNA bei höheren Konzentrationen wurde als das Ergebnis von Fehlern betrachtet, die während der Amplifikation durch die Taq-Polymerase eingeführt wurden. Eine solch hohe Fehlerrate beim Einbau von Nucleotiden durch diese Polymerase ist ein bekanntes Phänomen. Somit stellte eine solche unangemessene Bindung noch eine Bindung von Fehlpaarung durch das immobilisierte MutS dar.
• Die Verwendung von Tests mit immobilisiertem, eine Fehlpaarung bindendem Protein für den Nachweis von Mutation, Heterozygosität oder Polymorphismus werden nur durch die Fähigkeit beschränkt, Substrate bereitzustellen, die frei sind von zufälligen Fehlpaarungen, wie diejenigen, die durch Fehler der Polymerase während der PCR-Amplifikation erzeugt werden.
BEISPIEL III NACHWEIS VON SPEZIFISCHEN FEHLPAARUNGEN UND NICHT GEPAARTEN BASEN DURCH IMMOBILISIERTES, EINE FEHLPAARUNG BINDENDES PROTEIN
• Untersuchungen wurden durchgeführt, um Fehlpaarungen einzelner Basen und eine bis vier nicht gepaarte Basen in Heterodoppelstrang-DNA nachzuweisen. Diese Untersuchungen verwendeten synthetische Oligonucleotide (30-mere, die SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2 und SEQ ID NR: 3 umfaßten), die mit einer einzigen Fehlpaarung an Position 15 oder 16 oder mit 1-4 nicht gepaarten Basen zwischen den Positionen 15 und 16 hergestellt worden waren. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide sind in Fig. 4 gezeigt. Wie vorstehend beschrieben, sind diese Sequenzen vom menschlichen β-Globin-Gen in der Region der Mutation entnommen, die für die Sichelzellanämie verantwortlich ist, oder sind nahe damit verwandt. Die Oligonucleotide wurden mit einer 5'-Biotin-Markierung hergestellt (um den Nachweis durch das ECL-Nachweissystem zuzulassen) und wurden mit nicht markierten Oligonucleotiden zusammengelagert, so daß nur ein Strang von jedem Doppelstrang markiert war. Die Doppelstränge wurden in einem Nachweissystem für Fehlpaarungen unter Verwendung von immobilisiertem, eine Fehlpaarung bindendem Protein (MutS) verwendet, im Wesentlichen wie vorstehend im den vorigen Beispielen beschrieben.
• Die Oligonucleotide wurden in TNE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,01 M NaCl, 1 mM EDTA) verdünnt. Mit Biotin markierte Oligonucleotide wurden auf 10 mg/ul und nicht markierte Oligonucleotide wurden auf 100 ng/ul verdünnt. Gleiche Volumina von verdünnten Oligonucleotiden wurden gemischt und 10 min bei 70ºC und 30 Min bei Raumtemperatur zusammengelagert, gefolgt von Abschrecken auf Eis, und sie wurden bei -20ºC aufbewahrt. Die nicht markierten Oligonucleotide waren in 10-fachem Überschuß, um sicherzustellen, daß alle mit Biotin markierten Stränge in Doppelsträngen vorlagen.
• Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt. Alle Fehlpaarungen außer C : C und G : A wurden bei diesen Tests nachgewiesen. T : C- und C : A-Fehlpaarungen wurden in diesem Experiment nicht getestet. Nicht alle nachgewiesenen Fehlpaarungen werden gleich gut nachgewiesen. Die Ordnung der Nachweisempfindlichkeit scheint
• G : T > G : G > C : T > A : C > T : T > A : A = A : G > C : C
• zu sein.
• Die Tatsache, daß A : G-Fehlpaarungen besser nachgewiesen wurden als G : A- Fehlpaarungen, legt nahe, daß die Sequenz der einzelnen Stränge das Ausmaß des Nachweises von Fehlpaarungen beeinflussen könnte, zumindest bei relativ kurzen Oligonucleotiden wie den hier verwendeten. G : T- und T : G-Fehlpaarungen wurden jedoch gleich gut nachgewiesen, was nahe legt, daß gut nachgewiesene Fehlpaarungen unabhängig von der Strangorientierung nachgewiesen werden.
• Hetero-Doppelstränge mit 1-4 nicht gepaarten Basen wurden ebenfalls nachgewiesen. Ein Hetero-Doppelstrang mit zwei nicht gepaarten Basen wurde leichter nachgewiesen als ein Hetero-Doppelstrang mit einer nicht gepaarten Base. Hetero-Doppelstränge mit drei nicht gepaarten Basen wurden weniger gut nachgewiesen als jede der nachweisbaren Fehlpaarungen, und Hetero-Doppelstränge mit vier nicht gepaarten Basen wurden noch weniger gut nachgewiesen.
• Diese Ergebnisse zeigen an, daß Tests mit immobilisiertem, eine Fehlpaarung bindendem Protein alle Mutationen nachweisen, die auf einem einzigen Basenaustausch beruhen. Obwohl C : C unerkannt blieb, wäre somit die entsprechende G : G-Fehlpaarung, die notwendigerweise bei jeder Paarung Mutante : Wildtyp auftreten würde, die eine C : C- Fehlpaarung hat, leicht nachweisbar. Zusätzlich kann das Nachweissystem leicht Mutationen nachweisen, die von der Addition von 1-3 Basen resultieren.

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer doppelsträngigen Ziel-DNA in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Denaturieren einer doppelsträngigen DNA in einer Probe in Einzelstränge und Wiederanlagernlassen der Einzelstränge zu Doppelsträngen;

(b) Inkubieren der denaturierten und wieder angelagerten Doppelstränge nach Schritt (a) mit einem eine Fehlpaarung bindenden Protein, das durch Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert ist, entweder

(i) in Anwesenheit einer nachweisbar markierten DNA mit einer Fehlpaarung, die an das eine Fehlpaarung bindende Protein binden kann, oder

(ii) wobei das eine Fehlpaarung bindende Protein zuvor mit einer nachweisbar markierten DNA mit einer Fehlpaarung inkubiert wurde und an diese binden konnte; und

(c) Nachweis der Menge an nachweisbar markierter DNA mit einer Fehlpaarung, die an das eine Fehlpaarung bindende Protein gebunden ist,

wobei das Vorhandensein einer Mutation in der doppelsträngigen Ziel-DNA aus der Probe in einer Abnahme der Bindung der nachweisbar markierten DNA an das eine Fehlpaarung bindende Protein resultiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger natürliche Cellulose, modifizierte Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamid oder Agarose ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der feste Träger eine Nitrocellulose- Membran ist.

4. Verfahren zur Entfernung von Minoritätssequenzen und Sequenzen, die einen während des Amplifikationsverfahrens eingeführten Sequenzfehler enthalten, aus einer amplifizierten DNA-Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Aussetzen der amplifizierten DNA-Probe Denaturierungsbedingungen, gefolgt vom Wiederanlagern, so dass die Minoritätssequenz oder die Fehler enthaltenden Sequenzen Fehlpaarungen enthaltende DNA- Doppelstränge bilden, wodurch eine Mischung hergestellt wird, die fehlgepaarte Doppelstränge enthält;

(b) Inkubieren der Mischung nach Schritt (a) mit einem eine Fehlpaarung bindenden Protein, wobei das Protein durch Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert wurde, so dass die fehlgepaarten Doppelstränge an das eine Fehlpaarung bindende Protein binden; und

(c) Entfernen des immobilisierten eine Fehlpaarung bindenden Proteins, an das die eine Fehlpaarung enthaltende DNA gebunden hat, aus der amplifizierten DNA-Probe,

wobei die Sequenz, die Sequenzfehler enthält, entfernt wird.

5. Verfahren zur Identifizierung eines spezifischen Allels in einem Multi-Allel- System in einer Probe amplifizierter DNA, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Mischen einer nachweisbar markierten DNA-Sonde, die genau komplementär zu einer DNA-Sequenz des spezifischen Allels ist, mit einem Überschuss an amplifizierter Test-DNA unter Denaturierungsbedingungen, gefolgt vom Anlagern, so dass jede Kopie der DNA-Sonde nach dem Denaturieren und Anlagern in einem DNA- Doppelstrang vorliegt;

(b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Mischung mit einem Überschuss an immobilisiertem eine Fehlpaarung bindenden Protein, wobei das Protein durch Adsorption auf einem festen Träger immobilisiert ist, so dass die gesamte DNA mit einer Fehlpaarung auf dem immobilisierten eine Fehlpaarung bindenden Protein zurückgehalten wird:

(c) Entfernen des immobilisierten eine Fehlpaarung bindenden Proteins, an das jegliche eine Fehlpaarung enthaltende DNA aus der amplifizierten Test-DNA gebunden hat; und

(d) Nachweis des Vorhandenseins einer nachweisbar markierten DNA-Sonde in der Probe, aus der das immobilisierte eine Fehlpaarung bindende Protein entfernt wurde,

wobei das Vorhandensein von markierter DNA in der Probe anzeigt, dass die Sonde genau komplementär zu einem Allel in der Test-DNA ist.

6. Kit zum Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer Ziel- DNA-Sequenz in einer Probe, wobei der Kit die folgenden Bestandteile enthält:

(a) einen ersten Behälter, der das durch Adsorption an einem festen Träger immobilisierte eine Fehlpaarung bindende Protein enthält, wobei das Protein die Fähigkeit, DNA mit einer Fehlpaarung zu binden, beibehält;

(b) einen zweiten Behälter, der einen DNA-Doppelstrang mit einer Fehlpaarung enthält; und

(c) einen dritten Behälter oder eine Vielzahl an Behältern, die ein Reagens oder Reagenzien enthalten, die die Bindung der DNA mit einer Fehlpaarung an das eine Fehlpaarung bindende Protein nachweisen können.

7. Kit zum Nachweis einer Mutation von einer nicht mutierten Sequenz einer Ziel- DNA-Sequenz in einer Probe, wobei der Kit die folgenden Bestandteile enthält:

(a) einen ersten Behälter, der das durch Adsorption an einem festen Träger immobilisierte eine Fehlpaarung bindende Protein enthält, wobei das Protein die Fähigkeit, DNA mit einer Fehlpaarung zu binden, beibehält; und

(b) einen zweiten Behälter oder eine Vielzahl von Behältern, die ein Reagens oder Reagenzien enthalten, die die Bindung der DNA mit einer Fehlpaarung an das eine Fehlpaarung bindende Protein nachweisen können.

8. Kit nach Anspruch 6 oder 7, wobei das eine Fehlpaarung bindende Protein ein MutS-Protein oder ein funktionelles Derivat davon ist.

9. Kit nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der feste Träger natürliche Cellulose, modifizierte Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamid oder Agarose ist.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei der feste Träger eine Nitrocellulose-Membran ist.

11. Kit nach Anspruch 6, wobei die DNA mit einer Fehlpaarung nachweisbar markiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 4 oder 5, wobei das eine Fehlpaarung bindende Protein ein MutS-Protein oder ein funktionelles Derivat davon ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, wobei die nachweisbar markierte DNA mit einer chromogenen Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer fluoreszierenden Verbindung, einer radioaktiven Markierung oder Biotin markiert ist.