DE68911648T2

DE68911648T2 - Katalytische hybridisierungs-systeme zum nachweis von nukleinsäuresequenzen, die auf deren aktivität als kofaktoren in katalytischen reaktionen basieren in denen eine komplementäre, markierte nukleinsäureprobe gespalten wird.

Info

Publication number: DE68911648T2
Application number: DE68911648T
Authority: DE
Inventors: Joseph Walder; Roxanne Walder
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1989-03-13
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2009-03-14
Also published as: EP0365627B1; DE68911648D1; AU623642B2; EP0365627A4; JP2856804B2; EP0365627A1; WO1989009284A1; JPH02503515A; AU3294489A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine diagnostische Testmethodologie für den empfindlichen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen (DNA und RNA) in biologischen und klinischen Proben. Die Erfindung nimmt insbesondere das Problem in Angriff, niedrige Kopienzahlen einer Zielsequenz mit hoher Spezifität nachzuweisen.
Alle gegenwärtigen Verfahren zum Nachweis von DNA und RNA beruhen auf der stöchiometrischen (1:1) Hybridisierung einer komplementären, markierten Nukleinsäuresonde an die Zielsequenz (siehe Figur 1). Die vorliegende Erfindung stellt eine merkbare Abweichung von diesem Ansatz dar: die Zielsequenz dient als ein Cofaktor für eine Reaktion, in der die Sonde katalytisch gespalten wird. Nach dem Spalten der Sonde wird die Zielsequenz intakt freigesetzt und kann wiederholt durch die Reaktion geführt werden, was zu einer großen Amplifikation der Reaktion führt (siehe Figur 2). Wir haben solche Reaktionsschemata katalytische Hybridisierungsamplifikationsreaktionen genannt. In solchen Tests signalisiert die Spaltung der markierten Sonde das Vorhandensein der Zielsequenz. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist weit größer als bei bestehenden Verfahren, die alle auf stöchiometrischen oder einheitlichen Hybridisierungsschemata beruhen, in denen die Zielsequenz ein, und nur ein, Molekül der Sonde einfängt. Mehrere Ausführungsformen des katalytischen Hybridisierungsamplifikationsverfahrens sind weiter unten beschrieben. Alle Vorgänge, die für derartige Tests erforderlich sind, sind einfach und können leicht in einem klinischen Labor ausgeführt werden. Die Erfindung wird Anwendungen in der Diagnose einer Vielzahl von Erkrankungen bei Menschen und anderen Spezies haben, einschließlich genetischen Störungen, Infektionskrankheiten und Krebs.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Es ist gut bekannt, daß Nukleinsäuren, d.h. Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA), wesentliche Bausteine aller Organismen sind. Diese sind hochmolekulare Polymere, die aus vielen Nukleotideinheiten zusammengesetzt sind, wobei jede solche Nukleotideinheit aus einer Base (einem Purin oder einem Pyrimidin), einem Zucker (der entweder Ribose oder Desoxyribose ist) und einem Molekül Phosphorsäure besteht. DNA enthält Desoxyribose als die Zuckereinheit und die Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin (die als A, G, C bzw. T dargestellt werden können). RNA enthält Ribose anstelle von Desoxyribose und Uracil (U) anstelle von Thymin.
Die Nukleotideinheiten in DNA und RNA werden in bestimmten linearen Sequenzen zusammengebaut, die spezifische biologische Funktionen festlegen. In Bakterienzellen und in allen höheren Spezies steuert DNA seine eigene Replikation und dient auch als die Matrize für die Synthese von RNA-Molekülen, deren Nukleotidsequenzen die Information tragen, die von dar DNA kodiert ist. Der Vorgang der RNA-Synthese wird Transkription genannt. RNA-Moleküle erfüllen mehrere unterschiedliche Funktionen in der Zelle. Boten-RNAs (mRNAs) steuern Proteinsynthese. Ribosomale RNAs (rRNAs) sind wichtige Bestandteile von Ribosomen, den Organellen in der Zelle, in denen mRNAs gelesen, oder translatiert, werden und Proteine hergestellt werden.
Zusammengenommen wird die genetische Information eines Organismus das Genom genannt. Das Genom von Bakterien und allen höheren Spezies besteht aus DNA. Das Genom von Viren kann entweder DNA oder RNA sein. In jedem Fall hat das Genom einer bestimmten Spezies, ob ein Virus, Bakterium oder ein höherer Organismus, eine charakteristische Nukleotidsequenz, die, einfach gesagt, als der "Fingerabdruck" dieser Spezies angesehen werden kann. Sequenzen in einem Genom, die für Proteine kodieren oder die transkribiert werden, um RNAs mit spezifischen Funktionen zu bilden, wie etwa ribosomale RNA, repräsentieren einzelne Gene. Kleine Viren, wie etwa das AIDS-Virus, haben so wenig wie 10 Gene. Das menschliche Genom enthält urgefähr 50.000 Gene.
Entsprechend dem gut bekannten Watson-Crick-Modell bestehen DNA-Moleküle aus zwei Polynukleotidsträngen, die um eine gemeinsame Achse gewickelt sind. Die resultierende Doppelhelix wird durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenpaaren in jedem Strang zusammengehalten. Wasserstoffbindungen werden nur zwischen Adenin (A) und Thymin (T) und zwischen Guanin (G) und Cytosin (C) gebildet. Daher werden in der Doppelhelix Adenin (A) und Thymin (T) als komple,mentäre Basen angesehen, die sich aneinander als A-T binden. Dasselbe trifft zu auf Guanin (G) und Cytosin (C) als G-C.
In einer einzelnen Polynukleotidkette ist jede Sequenz von Nukleotiden möglich. Wenn jedoch die Reihenfolge von Basen in einem Strang eines DNA-Moleküls spezifiziert ist, wird die genaue Sequenz des anderen Stranges aufgrund der abgegebenen Regeln der Basenpaarung gleichzeitig festgelegt. Dementsprechend ist jeder Strang eines DNA-Moleküls das Komplement des anderen. Der Prozeß, durch den zwei komplementäre DNA-Stränge sich miteinander assoziieren, wird Hybridisierung genannt. Der Prozeß der Strangtrennung, der im allgemeinen durch Erhitzen der Probe erreicht wird, wird Schmelzen oder Denaturieren der Duplex genannt. Duplices haben eine charakteristische Schmelztemperatur (Tm), die primär von Länge, Zusammensetzung und Salzkonzentration abhängt. Die folgende Gleichung liefert eine nützliche Näherung für die Tm:
Tm = 16,6Xlog Cs+0,41x(%G+C)+81,5-820/L (1),
in der Cs die Salzkonzentration, (%G+C) der prozeni-uale G-C- Gehalt und L die Länge der Duplex ist (Schildkraut C. und Lifson, S. (1965) Biopolymers 3, 195-208; und Thomas, C.A. Jr. und Dancis, B.M. (1973) Journal of Molecular Biology 77, 43- 55). Mismatches zwischen den zwei Strängen einer Diplex (z.B. ein C-T-Basenpaar) können auftreten, erniedrigen aber die Stabilität der Helix signifikant und senken die Schmelztemperatur.
Zusätzlich zu DNA:DNA-Duplices können sich auch DNA: RNA-Duplices und RNA:RNA-Duplices bilden und natürlich auftreten. DNA:RNA-Duplices werden übergangsweise im Transkriptionsprozeß gebildet, in dem DNA als eine Matrize für die RNA-Synthese dient. RNA:RNA-Duplices treten als das genetische Material bestimmter Viren auf und werden auch in sogenannter Haarnadelschleifen aus ribosomaler RNA und Transfer-RNA gebildet. In Duplices, die einen RNA-Strang umfassen, paart sich Uracil (U) mit Adenin (A). In einem einzelnen Polynukleotidstigang können auch sowohl RNA- als auch DNA-Sequenzen auftreten. Solche RNA- DNA-Copolymere werden als Zwischenstufen bei der Replikation von DNA gebildet. Die Schnelztemperatur einer DNA:RNA- oder einer RNA:RNA-Duplex kann, abhängig von den Lösungsbedingungen, etwas von derjenigen einer DNA:RNA-Duplex derselben Sequenz abweichen, aber die oben angegebene Gleichung bleibt eine nützliche Näherung an die Tm. Für eine weitere Diskussion dieser verschiedenen Polynukleotidstrukturen und ihrer biologischen Funktionen, siehe "Genes III" von Benjamin Lewin, John Wiley and Sons, 1987.
Kürzliche Fortschritte in der Molekularbiologie unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken haben zu neuen diagnostischen und therapeutischen Strategien geführt. Im Bereich der DNA-Sonden- Diagnostika werden DNA-Sonden verwendet, um das Vorhandensein einer komplementären Ziel-Nukleinsäuresequenz in dar Probe nachzuweisen. Anwendungen schließen die Diagnose von Infektionskrankheiten, Krebs und genetischen Störungen ein. Im Falle von Infektionskrankheiten kann das Ziel eine DNA- oder RNA- Sequenz sein, die für ein bestimmtes Bakterium oder Virus einzigartig ist.
In bestimmten Krebszellen gibt es spezifische Gen-Umlagerungen, die nachgewiesen werden können, z.B. die Translokation des c-abl-Onkogens bei chronischer myelogener Leukämie. Genetische Defekte können große Deletionen oder Insertionen von DNA umfassen oder eine einzelne Punktmutation wie im Fall von Sichelzellenanämie. Im letzteren Fall ist es notwerdig, die Änderung eines einzelnen Basenpaares im Zusammenhang von flankierenden Sequenzen nachzuweisen, die identisch zu denjenigen sind, die im normalen Gen angetroffen werden.
Alle Nukleinsäure-Diagnosetests umfassen drei grundlegende Schritte:

(1) Isolierung und weitere Aufbereitung von DNA odei RNA aus der Probe.

Wenn DNA isoliert wird, wird sie im allgemeinen durch mechanische Kräfte geschert. Unter vorsichtiger Manipulation kann die größte Fragmentgröße bis zu etwa 100.000 Basenpaare betragen. DNA kann auch zielgerichtet mit sequenzspezifischen Endonukleasen geschnitten werden, die Restriktionsenzyme genannt werden, um Fragmente diskreter Größen zu ergeben. Solches ist der Fall in der sogenannten Southern-Blot- Analyse, in der die Fragmente anschließend entsprechend ihrer Größe durch Elekrophorese getrennt und dann auf eirem Filter, wie etwa Nitrocellulose oder einer Nylonmembran, inmobilisiert werden (Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology 98, 503-517).

(2) Hybridisierung einer komplementären, markierten Nukleinsäuresonde an die Zielsequenz.

In diesem Verfahren wird die Probe denaturiert, im allgemeinen durch Erhitzen, um sicherzustellen, daß die Zielsequenz einzelsträngig ist. Die markierte Sonde läßt man dann an das Ziel hybridisieren. Moleküle der Sonde, die schwach an andere Sequenzen in der Probe gebunden sind, oder an den Filter, auf dem sie immobilisiert ist, werden dann weggewaschen. Um angemessene Spezifität zu erreichen, muß die Schmelztemperatur der Sonden/Ziel-Duplex wenigstens 5 bis 10 Grad oberhalb derjenigen von Duplices lieger, die zwischen der Sonde und anderen in der Probe vorliegenden Sequenzen gebildet werden können, mit denen ein oder mehrere Mismatches bestehen.

(3) Nachweis der Menge der markierten Sonde, die an die DNA oder RNA in der Probe hybridisiert ist.

Geeignete Reporter- Gruppen, mit denen die Sonde markiert werden kann, schließen Radioisotope, wie etwa ³H, ³²P oder ¹²¹I, fluoreszieiende Farbstoffe, wie etwa Fluoreszen, Texasrot oder die Phycobiliproteine, oder Enzymmarkierungen, wie etwa alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase oder Peroxidasen, ein. Ein Beispiel für einen Diagnosetest, in dem die Proben-Nukleinsäure auf einem Filter immobilisiert wird, ist in Figur 1 dargestellt (siehe Falkow et al. (1982) U.S.-Patent Nr. 4,358,535).
Zusätzlich zum Filterformat sind eine Vielzahl anderer Strategien für diagnostische Hybridisierungstests beschrieben worden, siehe zum Beispiel Heller et al. (1983) EP-A-0 070 685 und EP-A-0 070 687; Rentz, M. und Kurz, C. (1984) Nucleic Acids Research, 12, 3435-3444; Ruth, J.L. (1984) P.C.T. WO84/03285; und Kohne, D. (1984) P.C.T. WO84/02721. In jedem dieser Systeme ist die Reporter-Gruppe, die nachzuweisen ist, direkt an die Sonde gebunden, wie in Figur 1 dargestellt. Alternativ kann ein indirektes Markierungsschema verwendet werden. In der von P. Kourlisky et al. (1979) GB 2 019 408 beschriebenen Methode wird die Sonde mit Biotin markiert. Nachdem die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert ist, wird ein Komplex des Enzyms β-Galactosidase, kovalent gebunden an das Protein Avidin, zur Probe zugegeben. Avidin bindet sich spezifisch und mit sehr hoher Affinität an die Biotin-Markierung, die an die Sonde gebunden ist. Die Sonden/Ziel-Duplex wird dann nachgewiesen, indem ein geeignetes Substrat für β-Galactosidase bereitgestellt wird, das hydrolysiert wird, um ein fluoreszierendes oder gefärbtes Produkt zu ergeben. Biotin- Avidin-Sondensysteme sind auch von Ward et al. (1982) EP-A-0 063 879 und von Engelhardt et al. (1984) EP-A-0 097 373 beschrieben worden. Vor kurzem hat Carrico (1987) EP-A-0 209 702 eine indirekte Markierungsstrategie beschrieben, in der eine Sonden/Ziel-Duplex, die zwischen einem RNA-Strang und einem DNA-Strang gebildet ist, unter Verwendung eines Antikörpers nachgewiesen wird, der sich spezifisch an RNA:DNA-Duplices bindet.
Alle obigen Verfahren nach dem Stand der Technik umfassen eine stöchiometrische oder einheitliche Hybridisierungsreaktion, in der die Zielsequenz sich an ein und nur ein Molekül der Sonde bindet oder dieses abfängt. Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges und verbessertes Hybridisierunstestverfahren zur Verfügung, in dem die Zielsequenz in der Lage ist, viele Moleküle der Sonde in einer Wiederholungsserie von Reaktionen abzufangen. Dies wird erreicht durch Spaltung der Sonde innerhalb der Sonden/Ziel-Duplex in der Art, daß die Zielsequenz intakt freigesetzt wird und wiederholt im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt werden kann. Wir nennen solche Verfahren katalytische Hybridisierungsamplifikations (CHA)-Reaktionen. Eine verallgemeinerte Version des CHA-Verfahrens ist in Figur 2 dargestellt. In solchen Tests stammt das Signal, das nachgewiesen wird, aus der Spaltung der Sonde. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist weit größer als diejenige früherer Hybridisierungsschemata, die alle auf einer stöchiometrischen, d.h. 1:1, Assoziation zwischen der Zielsequenz und der Sonde beruhen.
Mehrere früher beschriebene Verfahren umfassen die Spaltung der im Hybridisierungstest verwendeten Sonde, schließen aber das Führen der Zielsequenz im Kreislauf, das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung, aus. So beschreiben Ashihara et ah. (1985) EP-A-0 142 299 ein Verfahren, in dem die DNA:DNA-Duplex, die zwischen der Sonde und der Zielsequenz gebildet ist, von einem Restriktionsenzym gespalten wird. Das Restriktionsenzym erkennt eine spezifische Sequenz, im allgemeinen 4 bis 6 Basenpaare lang, innerhalb der Duplex und spaltet sowohl den Sonden- als auch den Zielstrang. Weil das Ziel gespallen wird, ist es für dieses unmöglich, im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt zu werden. Ein Verfahren zum Nachweis einzelner Basenänderungen, d.h. Punktmutationen, innerhalb von DNA ist von Myers et al. (1985) Science 230, 1242- 1246, beschrieben worden, das auf der Spaltung einer RNA-Sonde beruht. Eine markierte RNA-Sonde wird zunächst an die Ziel-DNA hybridisiert. Die RNA-Sonde, die an die DNA hybridisiert ist, wird dann einer Spaltung durch das Enzym RNaseA unterzogen. Überschüssige, nicht-gebundene Moleküle der Sonde werden vollständig abgebaut. Wenn die RNA eine perfekte Duplex mit keinerlei Basenpaar-Mismatches mit der DNA bildet, wird der hybridisierte RNA-Strang nicht geschnitten werden. Wein es ein oder mehrere Basenpaar-Mismatches gibt, wird die RNA-Sonde von dem Enzym geschnitten werden. Spaltung der RNA-Sonde an der Stelle des (der) Mismatches (e), was durch eine Anzahl unterschiedlicher Mittel untersucht werden kann, wird somit verwendet, um die geänderte DNA-Sequenz nachzuweisen. Da RNaseA freie, nicht-hybridisierte RNA-Moleküle spalten wird, ist es für die gespaltenen Fragmente wesentlich, an die Zielsequenz hybridisiert zu bleiben. Dies macht es für die Ziel-DNA-Sequenz unmöglich, wiederholt mit Mehrfachkopien der Sonde zu reagieren. Ein Test, der ähnliche Eigenschaften besitzt, ist vor kurzem von Duck et al. (1987) EP-A-0 227 976 beschrieben worden. In diesem Falle wird zunächst überschüssige, nicht- hybridisierte Sonde mit einem Enzym wegverdaut, das die Sonde nicht spalten wird, wenn sie in der Sonden/Ziel-Duplex gebunden ist. Ein Test wird dann durchgeführt, um die übriggebliebenen Moleküle der Sonde, die an die Zielsequenz hybridisiert sind, nachzuweisen. Weil es für überschüssige, nicht-hybridisierte Sondenmoleküle wesentlich ist, zunächst abgebaut zu werden, kann die Zielsequenz sich in der Reaktion nicht wiederholt umsetzen und reagieren wie bei der vorliegenden Erfindung.
Hull Vary et al. (1986) EP-A-0 200 057 hat ein System beschrieben, in dem Hybridisierung der Zielsequenz an die Sonde ein drittes Polynukleotid verdrängt, das an die Sonde gebunden ist. Am Ende der Hybridisierungsreaktion wird das verdrängte Polynukleotid zu Mononukleotiden abgebaut, die nachgewiesen werden. Auch in diesem System hybridisiert jedes Molekül der Zielsequenz wieder mit einer und nur einer Kopie der Sonde. Rückführung der Zielsequenz kann nicht auftreten. Ein Verfahren zur Erhöhung der Rate der Nukleinsäurehybridisierung ist von Zapolski et al. (1985) P.C.T WO 85/05685 beschrieben worden. In diesem Verfahren werden das Enzym RecA und ein Einzelstrang-DNA-Bindungsprotein verwendet, um die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz zu beschleunigen. Dies erhöht die Hybridisierungsrate, aber die Reaktion ist immer noch stöchiometrisch, indem sie die Bindung eines Einzelmoleküls der Sonde durch jedes Molekül der Zielsubstanz betrifft. Turnover der Zielsequenz, der dieser ermöglicht, mehrere Kopien der Sonde einzufangen, tritt nicht auf wie in der vorliegenden Erfindung.
Der oben dargestellte Stand der Technik stellt eine Anzahl von unterszhiedlichen Strategien zur Markierung von Sonden, Durchführung von Hybridisierungsreaktionen und Erhöhung des Signalnachweises dar. Bisher gibt es jedoch keine Nukleinsäurehybridisierungstestsysteme in weit verbreiteter Anwendung. Bestehenden Verfahren fehlt eine adäquate Empfindlichkeit für viele klinische Anwendungen und sie umfassen oft komplexe Testverfahren, die in einem klinischen Labor routinemäßig schwierig durchzuführen sind. Alle bekannten Systeme umfasser eine stöchiometrische oder einheitliche Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz, dergestalt daß jedes Zielmolekül ein und nur ein Molekül der Sonde einfangen kann. Die vorliegerde Erfindung stellt eine grundlegende Abkehr von diesem Korzept dar.
Das primäre Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Hybridisierungstestverfahren zur Verfügung zu stellen, in dem die Zielsequenz als ein katalytischer Cofaktor für die Spaltung einer komplementären, markierten Nukleinsäuresonde dient. Führen der Zielsubstanz im Kreislauf durch den Reaktionsweg ermöglicht es, viele Moleküle der Sonde einzufangen, was zu einem großen Anstieg in der Empfindlichkeit des Tests führt.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Formate, Reagenzien und Testbedingungen für solche katalytischen Hybridisierungsamplifikations (CHA)-Reaktionen bereitzustellen, die in diagnostischen Tests nützlich sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahrer zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung gestellt, bei dem besagte Sequenzen als ein Cofaktor für eine katalytische Reaktion dienen, in der eine komplementäre markierte Nukleinsäuresonde gespalten und nachgewiesen wird, wobei besagtes Verfahren umfaßt:
Hybridisieren einer Zielsequenz an einer markierter Nukleinsäuresonde, um eine Sonden/Zielsequenz-Duplex bereitzustellen;
Spalten der markierten Sonde innerhalb der Sonden/Zielsequenz- Duplex, um die Zielsequenz intakt freizusetzen;
wiederholtes Führen der Zielsequenz im Kreislauf durch den Reaktionsweg; und
Nachweis des Umfangs der Spaltung der markierten Sonde.
Die Erfindung stellt auch eine zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung brauchbare Sonde zur Verfügung, hergestellt aus einem 15 bis 50 Nukleotide langem Oligonukleotid, das eine RNA-Sequenz und eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen enthält, die nicht von RNaseH spaltbar sind, oder ein von 50 bis mehrere Tausend Nukleotide langes Polynukleotid, das aus RNA plus einer oder mehreren eingestreuten Sequenzen besteht, die nicht von RNaseH spaltbar sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine schematische Darstellung eines Standard-Hybridisierungstests für den Nachweis einer DNA-Zielsequenz, der auf der Bildung eines stöchiometrischen (1:1) Komplexes zwischen der Zielsequenz und einer komplementären, markierten Nukleinsäuresonde beruht. In diesem Falle wird die Proben-DNA auf einem Filterträger immobilisiert.
Figur 2 stellt die Verwendung des CHA-Verfahrens für den Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz dar. Die Ziel-DNA-Sequenz dient als ein katalytischer Cofaktor für die Spaltung einer komplemenetären, markierten Nukleinsäuresonde. Wiederholtes Führen der Zielsequenz im Kreislauf durch die Reaktion (gestrichelter Pfeil) führt zu eienr großen Amplifikation des Signals und erhöhter Empfindlichkeit, verglichen mit Standard- Testsystemen, die auf einer stöchiometrishen oder eineheitlichen Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz beruhen.
Figur 3 veranschaulicht das CHA-Verfahren in einem Festkörperträgerformat, in dem die Spaltung der komplementären markierten Sonde, die an den Träger gebunden ist, durch RNaseH mediatisiert wird.
Figur 4 veranschaulicht ein Hybridisierungsnachweissystem, in dem zwei CHA-Reaktionen gekoppelt sind, um eine exponentielle Signalamplifikation zu erzeugen.
Figur 5 belegt die Verwendung eines Konkurrenztests, um eine spezifische RNA-Sequenz mit dem CHA-Verfahren nachzuweisen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung der katalytischen Hybridisierungsamplifikation (CHA) stellt ein neuartiges und verbessertes Nukleinsäurehybridisierungsverfahren zur Verfügung, das in diagnostischen Tests nützlich ist. Die Zielsequenz wird nicht auf der Basis stöchiometrischer (1:1) Hybridisierung an die Sonde nachgewiesen wie in allen früheren Testsystemen. Die Erfindung betrifft die Zielnukleinsäuresequenz, die als ein hochspezifischer Cofaktor für eine katalytische Reaktion dient, die zur Spaltung einer komplementären, markierten Sonde, die an die Zielsubstanz hybridisiert ist, führt. Moleküle der Sonde, die nicht an die Zielsequenz hybridisiert sind, werden nicht geschnitten. Bei Spaltung der markierten Sonde in der markierten Sonden/Zielsubstanz-Duplex wird die Zielsequenz intakt freigesetzt und kann wiederholt im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt werden. In solchen Tests erzeugt die Spaltung der Sonde das Signal, das nachgewiesen wird. Die Fähigkeit jedes Moleküls der Zielsubstanz, mehrere Kopien der Sonde einzufangen, führt zu einer großen Erhöhung in der Empfindlichkeit des Verfahrens. Mehrere Ausführungsformen des CHA-Verfabrens werden zur Verfügung gestellt, die einfache Testverfahren einsetzen, die zur Verwendung in klinischen Diagnosetests geeignet sind. Anwendungen dieser Verfahren schließen die Diagnose von Infektionskrankheiten, genetischen Defekten und Krebs ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Sowohl Einzelpunktmutationen als auch längere einzelne Sequenzen können nachgewiesen werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung der katalytischen Hybridisierungsamplifikation ist insofern einzigartig, als sie das erste Beispiel eines nicht-stöchiometrischen Hybridisierungsverfahrens darstellt. In solchen Systemen dient die Zielsequenz (entweder DNA oder RNA) als ein Cofaktor in einer katalytischen Reaktion, in der eine komplementäre, markierte Nukleinsäuresonde gespalten wird. Eine verallgemeinerte Version des CHA-Verfahrens ist in Figur 2 dargestellt.
Im ersten Schritt des Verfahrens hybridisiert die Zielsequenz an die Sonde nach den üblichen Regeln der Basenpaarung. Einmal an die Zielsequenz hybridisiert wird die Sonde dann in zwei oder mehr kleinere Fragmente gespalten. Die Spaltungsreaktion kann durch ein Enzym katalysiert werden oder durch andere chemische Verfahren eintreten. Nur Moleküle der Sonde, die an die Zielsequenz hybridisiert sind, werden gespalten. Überschüssige Moleküle der Sonde, die nicht an das Ziel hybridisiert sind, werden nicht geschnitten. Die kleineren Fragmente der Sonde, die durch die Spaltungsreaktion erzeugt werden, bilden weniger stabile Duplices mit dem Ziel, als dies das Stamm-Molekül tut, und dissoziieren unter den Bedingungen der CHA-Reaktion vom Ziel. Damit die Dissoziation schnell eintritt, sollte die Schmelztemperatur der Duplices, die mit den kleineren Fragmenten gebildet werden, im allgemeinen 10ºC oder mehr unterhalb der Reaktionstemperatur liegen. Für kurze, von etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide lange Oligonukleotidsonden wird dies im Anschluß an eine einzelne Spaltung nahe der Mitte der Sondensequenz eintreten. Für längere Sonden, die bis zu mehrere Tausend Nukleotide lang sein können, müssen mehrere Spaltungen auftreben, die Fragmente erzeugen, die kürzer als etwa 35 Nukleotide lang sind, vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Nukleotide lang. Die Zielsequenz darf in der Reaktion nicht gespalten werden. Sie wird intakt aus der Sonden/Ziel-Duplex freigesetzt und wiederholt im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt. Nach Abschluß der CHA-Reaktion wird das Ausmaß der Spaltung der Sonde gemessen. Dies umfaßt im allgemeinen die Trennung des Sondenfragments, das die Reporter-Gruppen-Markierung trägt, vom intakten Molekül. Es ist die Spaltung der Sonde, die das Vorhandensein der Zielsequenz signalisiert. Turnover der Zielsequenz, der es ermöglicht, daß jedes Molekül viele Kopien der Sonde einfängt und deren Spaltung beschleunigt, erhöht im großen Maße die Empfindlichkeit des Verfahrens. Mehrere Ausführungsformen des CHA-Verfahrens werden nunmehr beschrieben werden.
In der grundlegenden Ausführungsform dieser Erfindung, wie sie für den Nachweis einer DNA-Sequenz angewendet wird, wird die Spaltungsreaktion durch das Enzym RNaseH katalysiert und findet nur statt, wenn die Ziel-DNA-Sequenz an eine komplementäre RNA-Sonde hybridisiert ist, wodurch eine RNA/DNA-Duplex gebildet wird. RNaseH ist hochspezifisch: es wird keine freien Moleküle der Sonde schneiden, die nicht an die Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert sind, noch wird es die Ziel-DNA-Sequenz spalten. Daher wird die Zielsequenz bei Spaltung der Sonde intakt freigesetzt und kann wiederholt im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt werden, wie in Figur 2 angegeben. Eine detaillierte Beschreibung der Komponenten (Sonden, Markierungen, etc.), Verfahren und Bedingungen für diese Ausführungsform des CHA- Verfahrens folgt.
Sonden, die in der Erfindung verwendet werden können, reichen von 15 bis 50 Nukleotide langen Oligonukleotiden bis zu längeren Polynukleotiden, die bis zu mehrere Tausend Nukleotide lang sein können. Ein Sonde mit etwa 15 Resten ist die kürzeste Sequenz, die verwendet werden kann, um gegen dem Hintergrund menschlicher DNA an eine komplementäre Zielsequenz (z.B. eine einzelne Virus-Sequenz) zu hybridisieren (siehe Thomas, C. A., Jr. (1966) Progress in Nucleic Research and Molecular Biology 5, 315). Häufiger müssen Sequenzen mit wenigstens 20 bis 25 Nukleotiden verwendet werden, um ein hohes Spezifitätsniveau sicherzustellen. Kurze Oligonukleotide bis zu etwa 25 Resten werden im allgemeinen mit einer einzigen Reporter-Gruppe markiert, entweder nahe dem 5'- oder 3'-Ende des Strangs. Längere Sequenzen können bis zu einer Dichte von etwa einer Reporter-Gruppe pro 15 Nukleotidreste markiert werden. Die Zusammensetzung der Sonde kann vollständig RNA sein. Alternativ kann die Sonde eine oder mehrere eingestreute Sequenzen enthalten, die nicht durch RNaseH spaltbar sind. Solche nicht durch RNaseH gespaltene Sequenzen können bestehen als DNA oder aus RNA, in der entweder die Phosphatgruppen oder die Zuckereinheiten so modifiziert sind, daß die Spaltung durch das Enzym verhindert wird. Geeignete Modifikationen der Phosphatgruppen schließen Alkyl- oder Arylphosphotriester, Hydrogenphosphonate, Alkyl- und Arylphosphonate, Alkyl- oder Alrylphosphoramidate, Phosphorothioate oder Phosphoroselenate ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die bevorzugte Modifikation des Ribosezuckers, um Spaltung durch RNaseH zu verhindern, ist die Umwandlung der 2'-OH-Gruppe in einen Alkyl- oder aromatischen Ether. Um die Erkennung durch RNaseH zu ermöglichen, muß (müssen) die spaltbare(n) RNA-Sequenz(en) wenigstens 3 Reste lang sein.
Sonden, die eingestreute Sequenzen enthalten, die nicht durch RNaseH spaltbar sind, fokussieren die Aktivität des Enzyms auf spezifizierte Regionen und sind daher bevorzugt. Wenn ein 26 Reste langes Oligonukleotid, das vollständig aus RNA besteht, als eine Sonde verwendet würde, wäre die Spaltung an vielen Stellen unproduktiv, d.h. würde nicht zur Freisetzung der Zielsequenz führen. Spaltung des Stranges zwischen den Resten 23 und 24 würde z.B. ein 23 Reste langes Fragment und ein zweites nur 3 Reste langes Fragment erzeugen. Das Trinukleotid würde sehr leicht von der Zielsequenz dissoziieren, aber das 23mer würde mit der Zielsequenz eine fast so stabile Duplex bilden, wie sie mit dem Stamm-Molekül gebildet wird, und würde daher nicht freigesetzt werden. Alternativ wäre, wenn das Oligonukleotid die Sequenz DNA&sub1;&sub1;RNA&sub4;DNA&sub1;&sub1; hätte, die Spaltung auf die zentralen vier RNA-Reste beschränkt. Das längste, so erzeugte Fragment, wäre 15 Reste lang. Die Tm dieses Fragments wäre etwa 20ºC bis 25ºC unterhalb derjenigen des ursprünglichen 26mers (siehe Gleichung 1) und würde unter den CHA-Reaktionsbedingungen leicht von der Zielsequenz dissoziieren. Jedesmal wenn die Sonde gespalten würde, würde somit die Zielsequenz freigesetzt werden und wäre in der Lage im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt zu werden. Im Falle der reinen RNA-Oligonukleotidsonde könnten zwei oder mehr Spaltungen der Sonde notwendig sein, um die Zielsubstanz freizusetzen. Für längere Sonden sollte die Länge der eingestreuten, nichtspaltbaren Sequenzen weniger als etwa 35 Nukleotide und vorzugsweise zwischen 10 und 20 Nukleotide lang sein, um schnelle Freisetzung der Fragmente zu ermöglichen, die durch RNaseH- Spaltung aus der Zielsequenz erzeugt werden.
Eine gemischte DNA-RNA-DNA-Oligonukleotidsonde ist besonders nützlich für den Nachweis von Einzelpunktmutationen, wie dies für die Diagnose bestimmter genetischer Erkrankungen, wie etwa Sichelzellenanämie, erforderlich ist. Man betrachte eine Sonde, die eine perfekte Duplex mit der normalen Zielsequenz bildet, und eine Duplex mit dem mutanten Gen, in dem es ein einzelnes Basenpaar-Mismatch gibt. Die vollständige Sonde, einschließlich der flankierenden DNA-Sequenzen, liefert die Spezifität für die Zielsequenz, die normalerweise durch Hybridisierung erreicht wird. Der größte Unterschied in der Stabilität der zwei Helices wird mit einer relativ kurzen Oligonukleotidsonde erhalten, in der das Mismatch nahe der Mitte der Sequenz liegt. Selbst in diesem Fall jedoch ist die Schmelztemperatur der perfekten Duplex, die mit der normalen Sequenz gebildet wird, nur etwa 5ºC bis 10ºC höher als diejenige für die Duplex, die mit der mutanten Sequenz gebildet wird, die das Mismatch aufweist. Obgleich es möglich ist, die normale von der mutanten Sequenz auf der Grundlage dieses kleinen Unterschiedes unter Verwendung eines Standardhybridierungsformates, wie desjenigen, das in Figur 1 dargestellt ist, zu unterscheiden, ist die Verläßlichkeit des Verfahrens für routinemäßige Diagnoseanwendung nicht ausreichend. Das CHA-Reaktionsschema liefert jedoch ein weiteres Spezifitätsniveau, das es ermöglicht, daß diese zwei Sequenzen leicht differenziert werden können. Wie oben angegeben ist die Spaltung einer DNA- RNA-DNA-Sonde durch RNaseH auf die zentrale RNA-Sequenz beschränkt. Wenn die RNA-Sequenz vier oder fünf Reste lang ist, unterbricht ein einzelnes Basenpaar-Mismatch die Struktur der RNA/DNA-Duplex ausreichend, um Spaltung des RNA-Stranges durch die RNaseH zu verhindern. Somit würde die Sonde gespalten werden, wenn sie an die normale Zielsequenz hybridisiert ist, aber nicht wenn sie an die mutante Sequenz hybridisiert ist. Nur die normale Zielsequenz würde als ein katalytischer Cofaktor für die Spaltung der Sonde dienen. Wenn die zentrale RNA- Sequenz zwischen sechs und acht Resten liegt, können zwei Mismatches im RNA/DNA-Abschnitt der Duplex erforderlich sein, um die Struktur ausreichend zu unterbrechen, um Spaltung durch RNaseH zu verhindern. Dies kann erreicht werden, indem eine Sonde verwendet wird, die es mehr als ein einzelnes Mismatch bei der normalen Sequenz und zwei Mismatches bezüglich der mutanten Sequenz gibt, z.B. Sonde normale Zielsequenz mutante Sequenz
wobei dN (N = A, C, T oder G) ein Desoxyribonukleotid (DNA), rN ein Ribonukleotid (RNA) und * ein Mismatch-Basenpaar ist.
Sonden selbst können hergestellt und modifiziert werden durch sowohl molekularbiologische als auch synthetische Techniken. Lange Sonden, die länger sind als etwa 60 Nukleotice, werden im allgemeinen synthetisiert und durch enzymatische Verfahren markiert. Lange RNA-Fragmente können aus einer DNA-Matrize unter Verwendung von entweder SP6- oder T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden. Oligonukleotide werden im allgemeinen mit chemischen Verfahren synthetisiert, siehe "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (Gait, M.J., Hrg.) IRL Press, Oxford (1984). Das Phosphoramiditverfahren ist die gegenwärtig bevorzugte Chemie. Die Synthese kann so durchgeführt werden, daß die wachsende Oligonukleotidkette an einen festen Träger gebunden ist, wie etwa Polystyrol oder Glasperlen, oder frei in Lösung. DNA-, RNA- und DNA-RNA-DNA-Oligonukleotide können mit diesen Ansätzen hergestellt werden. DNA-, RNA- und gemischte DNA-RNA-Moleküle können auch weiter in jeder Kombination unter Verwendung des Enzyms T&sub4;-RNA-Ligase zusammenligiert werden. Jede der obigen Techniken kann für die Synthese von bei dieser Erfindung nützlichen Sonden eingesetzt werden.
Radioisotope, Fluorophore, Lumiphore (chemilumineszierende oder biolumineszierende Substrate) und Enzyme können alle als Reporter-Gruppen in katalytischen Hybridisierungsamplifikationssystemen verwendet werden. Die Tatsache, daß das System eine große Amplifikationsreaktion erzeugt, bevor das eigentliche Nachweisverfahren durchgeführt wird, verringert in den meisten Fällen die Anforderung an die Empfindlichkeit der Reporter-Gruppe, die verwendet werden soll, signifikant. Reporter können passend zum Testsystem ausgewählt werder oder weil sie besser an das Testformat angepaßt sind (Instrumentierung gegenüber manuellen Verfahren), sowie für größtmögliche Empfindlichkeit.
Radioisotop, wie ³²P, ¹&sup4;C, ¹²&sup5;I und Tritium, kann mit molekularbiologischen Techniken entweder während der Synthese oder nach deren Abschluß leicht in DNA- und RNA-Sonden eingebaut werden. Chemisch synthetisierte Sonden können ebenfalls mit Radioisotopen markiert werden. Obgleich radioaktive Markierung bestimmte Vorteile für experimentelle und Forschungszwecke hat, erscheint es nicht als das geeignete Verfahren für neue Tests und Assays im klinischen Labor und ist daher nicht bevorzugt.
Nicht-isotopische Markierungen der Wahl schließen ein: (1) Fluorophore, wie etwa Fluorescein, Texasrot, Luzifergelb, Pyrene, chelatisierte Lanthanide und Phycobiliproteine, um einige zu nennen; (2) Lumiphore, wie etwa Luminol und Derivate; und (3) Enzyme, wie etwa alkalische Phosphatase, Peroxidase, β-Galactosidase und Luciferasen, um einige zu nennen. Die verschiedenen Enzyme können verwendet werden, um Farbreaktionen (alkalische Phosphatase, Peroxidase), fluoreszierende Produkte (alkalische Phosphatase) und Lumineszenz (Luciferase) zu erzeugen.
Fluorophore und Lumiphore können durch eine Vielzahl von Techniken kovalent an RNA- und DNA-Sequenzen gebunden werden. Im Falle einer Nukleinsäuresonde, in der das 3'-terminale Nukleotid ein Riboserest ist, kann das Ribosediol am 3'-Ende der Sequenz mit Periodat oxidiert werden, um ein reaktives Dialdehyd zu bilden. Eine reduktive Alkylierungsreaktion kann nun durchgeführt werden, in der das Dialdehyd mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Derivaten, die eine primäre Aminogruppe enthalten (Dansylethylendiamin, N-(1-Pyrensulfonyl)ethylendiamin, 5-((2-Aminoethyl)thiouridyl)fluorescein, etc.), eine Schiffsche Base bilden kann. Primäre Aminderivate von Luminol und anderen Lumiphoren können ebenfalls gekoppelt werden. Die Schiffschen Basenaddukte können zu einer stabilen sekundären Aminbindung unter Verwendung von Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid reduziert werden. Fluoreszierende Derivate, die Hydrazingruppen enthalten (Flouresceinthiosemicarbazid, Texasrot-Hydrazid, Cumarin-Hydrazid, Lucifergelb CH, etc.), können ebenfalls an terminale Aldehyde gekoppelt werden, die durch Periodatoxidation hergestellt werden (siehe Odom O.W., Jr., et al. (1980) Biochemistry 19, 5947-5954).
Im Falle synthetischer Oligonukleotide kann eine aliphatische primäre Aminogruppe auf verschiedene Arten leicht am 5'-terminalen Ende des Moleküls eingebaut werden. ¹ Ein speziell geschütztes Phosphoramiditderivat von 5'-Amino-5'-desoxythymidin kann als der letzte Rest eingebaut werden (Smith, L.M. et al. (1985) Nucleic Acids Research 13, 2399-2412). Primare Amine können ebenfalls über spezielle Phosphoramiditderivate, die auch im letzten Schritt im Syntheseverfahren zugegeben werden können, in Oligonukleotide eingebaut werden. Zwei solche Derivate sind kommerziell erhältlich, eines von Applied Biosystems, Inc. (Aminolink 1, Part Number 400498) und eines von ChemGenes, Inc., bei dem die Aminogruppe mit der Monomethoxytritylgruppe geschützt ist. Wenn erst einmal ein primäres Amin in das Oligonukleotid eingebaut ist, kann eine Anzahl von Aminselekiven fluoreszierenden Derivaten (Fluorescein-5-isothiocyanat, Texasrot, Succinimidyl-1-pyrenbutyrat, etc.) unter milden Bedingungen leicht an die primäre Amingruppe gekoppelt werden. Fluoreszierende Lanthanide (Europium, Terbium, etc.) können in Oligonukleotide eingebaut werden, indem das primäre Amin zunächst mit Diethylentriaminpentaessigsäureanhydrid zur Reaktion gebracht wird, um einen Chelator zur Bindung der Lanthanide herzustellen. ¹ Oligonukleotide werden im allgemeinen vom 3'- zum 5'-Ende der Kette synthetisiert.
Enzymmarkierungen von besonderem Interesse schließen ein: alkalische Phosphatase, Peroxidase, β-Galactosidase, Glucose- Oxidase, Bakterien(FMN/NADPH)-Luciferasen und Insekten(ATP)- Luciferasen, um einige zu erwähnen. Andere Markierungen schließen Mikroperoxidasen, funktionalisierte Hämderivate und andere Metallchelate mit katalytischer Aktivität ein Enzyme können in RNA-, DNA- und gemischte RNA-DNA-Sonden unter Verwendung von zu den oben für fluoreszierende Derivate diskutierten ähnlichen Verfahren eingebaut werden. Als ein Beispiel kann alkalische Phosphatase in eine Oligonukleotidsonde, die ein 5'-terminales primäres Amin enthält, in der folgenden Art und Weise eingebaut werden. Das primäres Amin enthaltende Oligonukleotid wird mit einem Überschuß des bifunktionellen Reagenz Disuccinimidylsuberat (DSS ist ein hochspezifisches Reagenz zur Kopplung primärer Amine unter milden Bedingungen) zur Reaktion gebracht, um das Monoaddukt mit dem Oligonukleotid herzustellen. Das Monoaddukt DSS-Oligonukleotid kann leicht gereinigt werden. Das Monoaddukt DSS-Oligonukleotid wird nun unter milden Bedingungen mit alkalischer Phosphatase zur Reaktion gebracht. Das Endprodukt "alkalische Phosphatase-DDS-5'- Oligonukleotid" wird durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die Besonderheiten des Kopplungsverfahrens sind in Jablonski, E. et al. (1986) Nucleic Acid Research 14, 6115-6128 angegeben.
In dieser ersten Ausführungsform des CHA-Verfahrens ist RNaseH verantwortlich für das Katalysieren der Spaltung dem Sonde, wenn sie erst einmal an die Zielsequenz hybridisiert. Das Enzym ist hochspezifisch; es ist eine Ribonuklease, die nur den RNA-Strang innerhalb einer RNA/DNA-Duplex spaltet. Das Enzym kann sowohl aus eukaryontischen als auch bakteriellen Quellen gewonnen werden. Das E. coli-RNaseH-Enzym, das in den Beispielen verwendet wird, ist eine einzelne Polypeptidkette mit einer relativen Molekülmasse von etwa 17.500. Das Enzym ist sehr stabil, das Gen für das Protein ist kloniert und sequenziert worden und überproduzierende Stämme sind konstruiert worden, die das Enzym in großen Mengen produzieren (Kanaya, S. und Crouch, R.J. (1983) Journal of Biological Chemistry 258, 1276-1281). Aus diesen Gründen ist seine Verwendung bevorzugt. Für CHA-Reaktionen, die oberhalb einer Temperatur von etwa 50ºC geführt werden, ist eine thermostabilere Form des Enzyms wünschenswert. Solche Varianten des Enzyms können aus thermophilen Organismen isoliert oder durch Mutagenese aus E. coli-RNaseH unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken produziert werden (z.B. durch die Einführung einer in geeigneter Weise angeordneten Disulfidbrücke).
Die optimale Temperatur für die Durchführung der CHA-Reaktion liegt im allgemeinen von etwa 5ºC bis etwa 25ºC unterhalb der Schmelztemperatur der Sonden/Ziel-Duplex. Dies sorgt für eine schnelle Hybridisierungsrate und einen hohen Spezifitätsgrad für die Zielsequenz. Man betrachte z.B. eine 26 Reste lange DNA-RNA-DNA-Sonde, in der die G-plus-C-Fraktion 50% beträgt. Bei einer Salzkonzentration von 0,1 M liegt die vorhergesagte Schmelztemperatur der Sonden/Ziel-Duplex, gemäß Gleichung 1, bei etwa 55ºC. Die obere Grenze für die CHA-Reaktionstemperatur ist daher etwa 50ºC. Spaltung der Sonde nahe der Mitte der Sequenz erzeugt zwei Fragmente, von denen jedes eine Schmelztemperatur von etwa 25ºC besitzen. Wie oben angegeben, sollte die CHA-Reaktionstemperatur, damit diese Fragmente schnell von der Zielsequenz dissoziieren, wenigstens 10ºC höher sein als dieser Wert, d.h. gleich zu oder größer als 35ºC. Eer optimale Bereich für die CHA-Reaktionstemperatur mit dieser Sonde liegt daher von etwa 35ºC bis etwa 50ºC.
Die CHA-Reaktion wird üblicherweise für etwa 15 Minuten bis etwa 1 Stunde durchgeführt. Im allgemeinen wird jeces Molekül der Zielsequenz in diesem Zeitraum zwischen 100- und 1.000mal umgesetzt, in Abhängigkeit von der Länge und Sequenz der Sonde und den spezifischen Reaktionsbedingungen (siehe Beispiel 1).
Für jede Kopie der Zielsequenz, die in der Testprobe vorliegt, werden 100 bis 1.000 Moleküle der markierten Sonde durch RNa- seH gespalten werden. Dieses Amplifikationsniveau führt zu einem enormen Anstieg in der Empfindlichkeit, verglichen mit Tests, die auf einem stöchiometrischen Hybridisierungsformat beruhen. Sogar noch höhere Amplifikationsniveaus können erhalten werden, wenn man die CHA-Reaktionen länger fortschreiten läßt.
Während der CHA-Reaktion ist es notwendig, die Spaltung der Sonde sowie der Zielsequenz durch nicht-spezifische Nukleasen zu unterdrücken. Dies ist auch für Tests, die auf Standardhybridisierungsformaten beruhen, wichtig. Solche Nukleasen werden im allgemeinen während der Isolierung der DNA durch Erhitzen oder Extraktionsverfahren aus der Probe entfernt. Eine Anzahl von Inhibitoren von einzelsträngigen Ribonukleasen, wie etwa Vanadat, Inhibit-ACE (5 Prime -3 Prime, Inc.) und RNAsin, ein Plazentaprotein, beeinflussen die Aktivität dem RNaseH nicht. Um die Sonde weiter vor nicht-spezifischem Abbau zu schützen, ist es wünschenswert, solche Inhibitoren während der CHA-Reaktion miteinzubeziehen.
Im Anschluß an die CHA-Reaktion ist es notwendig, das Ausmaß der Spaltung der Sonde zu bestimmen. Dies wird üblicherweise erreicht, indem die Spaltprodukte, die die Markierung tragen, von den restlichen nicht-gespaltenen Molekülen der Sonde getrennt werden. Verfahren für eine solche Trennung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf:
(1) Elekrophorese der CHA-Reaktionsprodukte, um die gespaltenen Fragmente von Molekülen der intakten Sonde auf Größenbasis zu trennen,
(2) Die Verwendung von starken Säuren, wie Trichloressigsäure, um die relativ großen, nicht-gespaltenen, markierten Sonden von den kleineren, gespaltenen Fragmenten selektiv auszufällen.
(3) Der Einbau einer Markierung mit hoher Affinität in die Sonde, zusätzlich zu der Reporter-Gruppe, um für die Trennung der nicht-gespaltenen Sonden nach der CHA-Reaktion unter Verwendung eines Affinitätsträgers Sorge zu tragen.
(4) Die Verwendung eines Trägermaterials, das eine komplementäre Polynukleotidsequenz enthält, um die nicht-gespaltene markierte Sonde zu immobilisieren, nachdem die CHA- Reaktion durchgeführt ist, was die gespaltener Fragmente in Lösung zurückläßt.
Im ersten Trennverfahren wird Elektrophorese der CFA-Reaktionsprodukte durch eine Gelmatrix verwendet, um die gespaltenen Fragmente, die die Markierung tragen, von der intakten Sonde zu trennen. Die kleineren Fragmente wandern schneller durch das Gel als das größere intakte Molekül. Für Sonden, die bis zu etwa 100 Nukleotide lang sind, wird im allgemeinen eine Polyacrylamidgelmatrix verwendet. Für längere Sonden ist im allgemeinen Polyacrylamid, Agarose oder ein aus diesen zwei Komponenten hergestelltes Mischgel bevorzugt. Nachdem die Trennung erreicht worden ist, sind Fragmente, die die Reporter-Gruppen-Markierung tragen, und die ursprüngliche Sonde in getrennte Banden aufgelöst, die leicht lokalisiert und quantifiziert werden können.
Das zweite Trennverfahren, das Ausfällung mit starker Säure umfaßt, wird hauptsächlich in den Situationen verwendet, in denen eine lange Sonde (länger als etwa 50 Nukleotide), die entweder Radioisotop- oder Fluoreszenzmarkierungen enthält, über das CHA-Verfahren in eine Anzahl relativ kleiner markierter Fragmente (< 10 Nukleotide lang) gespalten. Einbringen einer starken Säure (Trichloressigsäure, etc.) in die Lösung bewirkt daß die intakte Sonde ausfällt, während die kleineren gespaltenen Fragmente in Lösung verbleiben. Die Lösung kann zentrifugiert oder filtriert werden, um den Niederschlag zu entfernen. Der Überstand, der die gespaltenen markierten Fragmente enthält, kann nun quantifiziert werden. Eine detailliertere Diskussion dieses Verfahrens ist in Beispiel 1 unten angegeben.
Das dritte Trennverfahren umfaßt eine Sonde, die sowohl mit einer Gruppe mit hoher Affinität als auch mit einer Reporter- Gruppe markiert ist, und ein Affinitätsträger wird verwendet, um das Trennverfahren durchzuführen. Die in diesem Fall verwendeten Sonden können entweder eine RNA-Sequenz sein oder eingestreute Sequenzen enthalten, die nicht von RNaseH gespalten werden, wie etwa eine gemischte DNA-RNA-DNA-Sequenz. Die Sonde wird mit einer Affinitätsmarkierung konstruiert (wie etwa Biotin, Avidin, Lectine, Haptene oder Antikörper), die an oder nahe einer der terminalen Positionen der Sonde eingebaut ist. Die Reporter-Gruppen-Markierung (Enzym, Fluorophor, Lumiphor oder Radioisotop) ist an oder nahe der entgegengesetzten terminalen Position eingebaut. (Bei einer langen Polynukleotidsonde können viele oder alle der eingestreuten Sequenzen, die nicht von RNaseH spaltbar sind, mit der Reporter-Gruppe markiert sein). Der spaltbare Teil der Sondensequenz liegt somit zwischen der Affinitätsgruppe und der Reporter-Gruppe. Ein Minimum von etwa 15 Nukleotiden ist zwischen den beiden Markierungen notwendig, wobei 20 bis 50 Nukleotide idealer sind. Dieselben Verfahren, wie oben für den Einbau von Reporter-Gruppen-Markierungen in Sonden diskutiert, werden auch für die Anlagerung von Affinitätsmarkierungen verwendet. In diesem Trennverfahren ist es auch notwendig, Trägermaterial zu haben, das eine entsprechende Affinitätsgruppe enthält, die sich spezifisch und stark an die Affinitätsmarkierung bindet, die in die Probe eingebaut ist. Wenn zum Beispiel die Affinitätsmarkierung Biotin in die Sonde eingebaut ist, sollte dann das geeignete Affinitätsträgermaterial Avidin oder Streptavidin enthalten. Viele Trägermaterialien, wie etwa Glasperlen, Latexperlen, Perlen aus quervernetztem Dextran (Sepharose ), etc., die kovalent gebundenes Avidin enthalten, sind kommerziell erhältlich.
Nachdem die CHA-Reaktion durchgeführt ist, wird das Trägermaterial zur Probe zugegeben. Moleküle der intakten Sande binden sich fest an den Träger. Gespaltene Fragmente, die die Reporter-Gruppe tragen, aber nicht die Affinitätsmarkierung, bleiben in Lösung und können quantifiziert werden,
Das vierte Trennverfahren ist im Prinzip sehr ähnlich zu dem gerade beschriebenen, verwendet aber eine Nukleinsäuresequenz innerhalb der Sonde, die während der CHA-Reaktion nicht gespalten wird, als die Affinitätsmarkierung. Eine komplementäre Nukleinsäuresequenz wird an einen festen Träger gebenden und dient als eine Fängersequenz. Wenn die Spaltung der Sonde während der CHA-Reaktion durch RNaseH mediatisiert wird, kann die Sequenz, die die Rolle der Affinitätsmarkierung spielt, DNA sein oder eine RNA-Sequenz, in der die Zucker- oder Phosphatgruppen modifiziert sind, um Spaltung durch RNaseH zu verhindern. Die Affinitätsmarkierungssequenz ist von der Reporter- Gruppe durch einen Teil der Sonde getrennt, die während der CHA-Reaktion von RNaseH gespalten wird, zum Beispiel
5'-DNA-RNA-DNA-(Reporter-Gruppe),
wobei in diesem Fall die DNA-Sequenz am 5'-Ende der Sonde, oder ein Teil derselben, als die Affinitätsmarkierung dient. Eine Affinitätsmarkierungssequenz, die 20 bis 50 Nukleotide lang ist, ist am idealsten, aber längere Sequenzen können auch verwendet werden. Sequenzen mit weniger als 15 Nukleotiden sind am wenigsten brauchbar. Ein Teil der Affinitätsmarkierungssequenz kann komplementär zur Zielsequenz sein oder es kann ein separates Anhängsel sein, das an die Sonde gebunden ist. Das letztere ist bevorzugt, weil dann eine generalisierte Fängersequenz verwendet werden kann. In diesem Fall kann ein Satz von Fängerperlen mit vielen verschiedenen zielspezifischen Sonden verwendet werden.
Eine Anzahl unterschiedlicher chemischer Verfahren kann verwendet werden, um die Fängersequenz an einen festen Träger zu binden, siehe zum Beispiel Gilham, P.T. (1971) Metbods of Enzymology, Vol. 21 (Grossman, L. und Moldave, K., Hrg.) S. 191- 197, Academic Press, New York; Potuzak, H. und Dean, P.D.G. (1978) Nucleic Acids Research 5, 297-303; Robertson, D.L. und Davidson, N. (1972) Biochemistry 11, 533-537; und Moss, L.G. et al. (1981) Journal of Biological Chemistry 256, 12655- 12658.
Es ist auch möglich, die Fängersequenz direkt auf dem festen Träger zu synthetisieren, der später im Test verwendet werden wird. Wie oben angegeben, werden Oligonukleotide im allgemeinen vom 3'- zum 5'-Ende der Kette synthetisiert. Wenn die Synthese auf einem festen Träger durchgeführt wird, wird das erste Nukleotid vom 3'-terminalen Ende im allgemeinen an den Träger über seine 3'-Hydroxylgruppe durch eine Esterbindung gebunden. Bedingungen, die erforderlich sind, um Schutzgruppen auf den Nukleotidbasen zu entfernen (Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55ºC für 6 bis 10 Stunden), spalten diese Bindung leicht. Wenn das Oligonukleotid an den Träger gebunden bleiben soll, muß die Bindung an die 3'-Hydroxylgruppe zu einer verändert werden, die unter diesen Bedingungen nicht gespalten wird. Geeignete funktionale Gruppen, durch die das 3'-OH gebunden werden kann, schließen Etherbindungen, Phosphattriester, Phosphatdiester und aromatische Carbamate ein. Die funktionale Gruppe, die wegen der Einfachheit der Synthese bevorzugt ist, ist ein β-Cyanoethylphosphotriester. Die Anlagerung wird erreicht durch die Reaktion eines 3'-β-Cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramiditderivats des ersten Nukleotids (kommerziell erhältlich für alle vier Basen) an einen Träger, der freie OH-Gruppen enthält. Solche Träger können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich Perlen aus Glas, Polystyrol, Latex oder quervernetzem Dextran (Sepharose ), Membranen aus Cellulose oder Nylon oder Tetrafluorethylen-Homopolymer(Teflon ). Nachdem das erste Nukleotid an den Träger gebunden ist, wird die restliche Sequenz mit dem normalen Phosphoramiditverfahren synthetisiert. Auf dem Höhepunkt der Synthese wandeln die Deblockierungsverfahren den β- Cyanoethylphosphotriester in einen Phosphodiester um, durch den das Oligonukleotid mit dem Träger verbunden bleibt. Nachdem ein Trägermaterial durch eines der obigen Verfahren hergestellt ist, kann das gebundene Oligonukleotid, falls gewünscht, durch eine Anzahl unterschiedlicher enzymatischer Methoden verlängert werden, wodurch längere Nukleotidsequenzen bereitgestellt werden, die an den Träger gebunden sind. Geeignete Verfahren schließen die Addition von Nukleotidresten an das Fragment mit DNA-Polymerase oder terminaler Transferase oder die Ligation von Polynukleotiden an die anfängliche Sequenz, die an den Träger gebunden ist, unter Verwendung von DNA- oder RNA-Ligase ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
In jedem der gerade beschriebenen vier Trennverfahren wird die CHA-Reaktion zunächst in Lösung durchgeführt. Alternativ kann die markierte Sonde an einen Festkörperträger gebunden sein, wobei in diesem Fall die Spaltung der Sonde während der CHA- Reaktion Fragmente, die die Reporter-Gruppe tragen, in Lösung freisetzt (siehe Figur 3). Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die relative Leichtigkeit des Trennschrittes, nachdem die CHA-Reaktion abgeschlossen ist; das Festkörperträgermaterial, das übriggebliebene Moleküle der intakten Sonde enthält, wird einfach aus der Probe mit physikalischen Mitteln, wie etwa Filtration oder Zentrifugation, entfernt; die gespaltenen Fragmente, die die Reporter-Gruppe tragen, werden in Lösung zurückgelassen und können quantifiziert werden. Geeignete feste Trägermaterialien schließen Perlen aus Glas, Polystyrol, Latex oder quervernetztem Dextran (Sepharose ), Membranen aus Cellulose oder Nylon oder Teflono ein. Magnetisierte Perlen können ebenfalls verwendet werden, wobei in diesem Falle die Perlen aus der Lösung durch die Anwendung eines Magnetfeldes abgetrennt werden. Die Sonde kann an den Festkörperträger entweder durch eine kovalente oder eine nicht-kovalente (z.B. Biotin-Avidin) Bindung gebunden sein. Eine kovalente Bindung ist wegen ihrer größeren Stabilität bevorzugt. Geeignete Verfahren zur kovalenten Anlagerung von Nukleotidsequenzen an Festkörperträger sowohl mit chemischen als auch enzymatischen Verfahren sind im vorstehenden Absatz beschrieben.
Wenn das Festkörperträger-CHA-Verfahren eingesetzt wird, ist es wünschenswert, zunächst die Proben-DNA in kleinere Fragmente zu schneiden, so daß die Zielsequenz leicht zur Oberfläche der Perlen diffundieren kann, um mit der gebundenen Sonde zu hybridisieren. Dies kann erreicht werden, indem die DNA durch mechanische Kräfte (z.B. Beschallung) gescheit oder die DNA an spezifischen Stellen unter Verwendung eines Restriktionsenzyms gespalten wird. Alternativ kann ein kleines Fragment, das die Zielsequenz enthält, mit DNA-Polymerase unter Verwendung der Proben-DNA als einer Matrize synthetisiert werden. In diesem Verfahren wird ein als Primer verwerdetes Oligonukleotid zunächst flußaufwärts (d.h. 5') von dei Zielsequenz an die Proben-DNA hybridisiert. Der Primer wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase über die Zielsequenz verlängert (wobei der komplementäre Strang kopiert wird). Das Produkt:
5'-Primer-Zielsequenz
wird dann in die CHA-Reaktion eingebracht. Es ist auch möglich, die Reaktion mit DNA-Polymerase mehrmals zu wiederholen, um die Anzahl von Kopien der Zielsequenz zu erhöhen. Solch ein Verfahren wird in der sogenannten Polymerasekettenreaktion durchgeführt (Mullis, K.B. et al. (1986) EP-A-0 200 362; und Mullis, K.B. (1986) EP-A-0 201 184). Da Zielamplifikation und das CHA-Verfahren vollständig getrennte Schritte im Testverfahren umfassen, können die zwei in Kombination verwendet werden. Dies kann nützlich ein, um eine Nukleinsäuresequenz nachzuweisen, die ursprünglich in der Probe in extrem niedriger Kopienzahl vorliegt. Für die meisten diagnostischen Anwendungen jedoch ist der hohe Empfindlichkeitsgrad des CHA-Verfahrens allein ausreichend.
Sämtliche der obigen Diskussionen über die Verwendung des CHA- Verfahrens haben sich um den Nachweis von DNA-Zielsequenzen gedreht. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, RNA-Zielsequenzen nachzuweisen, wie etwa ribosomale RNA-Sequenzen. Dies kann mit irgendeinem der obigen CHA-Reaktionsverfahren unter Verwendung von RNaseH leicht erreicht werden, indem zunächst eine komplementäre DNA-Kopie (cDNA) der ursprünglichen RNA-Sequenz mit dem Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert wird. In diesem Verfahren wird zunächst ein Oligodesoxynukleolid-Primer an die Proben-RNA stromaufwärts (d.h. 5') der Zielsequenz hybridisiert. Mit der Zugabe von Reverser Transkriptase und den vier Desoxynukleotidtriphosphaten (A, G, T und C) wird der Primer verlängert, wodurch eine cDNA-Kopie der Ziel-RNA produziert wird. Das Produkt:
5'-Primer-cDNA-Zielsequenz
bildet nun das Substrat für die CHA-Reaktion. Für eine detailliertere Beschreibung von Vorschriften für die Verwendung von Reverser Transkriptase siehe Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 128-132, 1982.
Eine zweite Ausführungsform des CHA-Verfahrens wird nun beschrieben werden, in der ein Phosphorothioatderivat der Zielsequenz als das Substrat verwendet wird und eine komplementäre markierte DNA-Sonde von einem Restriktionsenzym gespalten wird.
Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische DNA-Sequenz, im allgemeinen 4 bis 6 Nukleotide lang, und schneiden beide Stränge der DNA-Duplex an dieser Stelle. Mehrere hundert dieser Enzyme sind heute bekannt, mit vielen verschiedenen Erkennungssequenzen. Diese Enzyme können im allgemeinen nicht beim CHA-Verfahren verwendet werden, da die Zielsequenz, ebenso wie die Sonde, geschnitten werden würde und daher nicht in der Lage wäre, im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt zu werden. Wenn Phosphatgruppen von einem der zwei Stränge der DNA- Duplex jedoch Phosphorothioate statt normaler Phosphatdiester sind, werden viele Restriktionsenzyme (z.B. Ava I, Ava II, Ban II, Hind II, Nci I, Pst I und Pvu I) nur den nicht-modifizierten Strang spalten (Taylor, J. W. et al. (1985) Nucleic Acids Research 13, 8749-8764). Die Phosphorothioatsequenz wird nicht geschnitten und kann daher als ein katalytischer Cofaktor für die Spaltung an der komplementären, markierten Sonde durch ein Restriktionsenzym dienen. Die Zielsequenz, die in solch einem Test verwendet werden sollte, muß natürlich die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym enthalten. Die modifizierte DNA-Sequenz wird aus einer DNA-Matrize unter Verwendung von DNA-Polymerase hergestellt. Wenn die Probe RNA ist, wird Reverse Transkriptase verwendet. Diese Reaktionen werden durchgeführt, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß Desoxynukleotid-α-thiotriphosphate als Substrate anstelle der normalen Desoxynukleotidtriphosphate verwendet werden. Alle vier der Desoxynukleotid-α-thiotriphosphate sind kommerziell erhältlich. Wenn die modifizierte Zielsequenz erst einmal hergestellt ist, kann die CHA-Reaktion unter Verwendung von jedem der oben beschriebenen Testformate durchgeführt werden. Dieselben Verfahren zur Synthese und Markierung der Sonde sind ebenfalls anwendbar. Modifizierte DNA- oder RNA-Sequenzen können, die Restriktionsenzymstelle flankierend, in die Sonde eingebaut werden, aber die Erkennungsstelle selbst muß aus DNA bestehen.
Sämtliche der bisher beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen und Formate des CHA-Verfahrens stellen eine lineare Amplifikation des Signals zur Verfügung. Da die Konzentration der Zielsequenz konstant bleibt, bleibt die Geschwindigkeit der Reaktion unverändert, und die Anzahl von Molekülen der markierten Sonde, die gespalten werden, steigt linear mit der Zeit an (siehe Beispiel 1). Wie oben erwähnt, liegt die Turnover-Zahl, d.h. die Zahl von Molekülen der Sonde, die pro Zielsequenz pro Stunde gespalten werden, im allgemeinen im Bereich zwischen 100 und 1.000.
CHA-Reaktionen können auch in neuartigen Weisen durchgeführt werden, die eine exponentielle Amplifikation liefern und daher eine noch größere Empfindlichkeit bieten. Im allgemeinen wird eine exponentielle Reaktion erreicht, indem zwei oder mehr CHA-Reaktionen gekoppelt werden, um zusätzliche Kopien der Zielsequenz zu produzieren. Eine Anzahl verschiedener exponentieller CHA-Formate kann konstruiert werden. Eine Version eines exponentiellen CHA-Formats ist in Figur 4 dargestellt. In diesem Fall werden zwei Sätze Sondensequenzen auf Festkörperträgern immobilisiert. Die erste Sondensequenz auf Träger I enthält eine spaltbare Sequenz (T'), die zur ursprünglichen Zielsequenz komplementär ist, und eine nicht-spaltbare Sequenz (X). Die Sequenz (X) ist komplementär zu einer spaltbaren Sequenz (X'), die auf Träger II immobilisiert ist. Im ersten Schritt des Verfahrens hybridisiert Ziel-DNA aus der Probe an die komplementäre spaltbare Sequenz (T') auf Träger I. Einmal an dffie Zielsequenz hybridisiert, wird (T') geschnitten, wodurch die Sequenz (X) vom Träger freigesetzt wird. (X) diffundiert dann vom Träger weg und hybridisiert mit der spaltbaren Sequenz (X') auf Träger II. Dies kann nicht auftreten, bis (X) vom Trager freigesetzt wird. Die Sequenzen (X) und (X'), können, obgleich sie auf zwei getrennten mikroskopischen Trägern immobilisiert sind, nicht miteinander hybridisieren. Wenn die Duplex zwischen (X) und (X') erst einmal gebildet ist, wird (X') gespalten. Dies setzt eine zweite Kopie der Zielsequenz frei, die ihrerseits mit Träger I reagieren kann und die Reaktion weiter fortpflanzt. So liefert ein Zyklus der CHA-Reaktion zwei Kopien der Zielsequenz; der zweite Zyklus liefert vier Kopien der Zielsequenz; der dritte Zyklus liefert acht Kopien; etc.. In der dargestellten Konfiguration wird eine Reporter-Gruppen-Markierung von Träger II für jedes Zielmolekül freigesetzt, das in der Reaktion erzeugt wird. Es kann gezeigt werden, daß die Menge der freien Markierung, die von Träger II freigesetzt wird, durch die folgende Formel gegeben ist:
in der A die anfängliche Zahl von Kopien der in der Probe vorhandenen Zielsubstanz ist, k die Quadratwurzel des Produkts der Turnover-Zahlen für die zwei getrennten CHA-Reaktionen ist und t die Zeit ist. Der erste Term des Ausdrucks (A/2 x ekt) wird schnell beherrschend. Die Menge an freier Markierung steigt exponentiell mit der Zeit an, was dem Test einen extrem hohen Empfindlichkeitsgrad verleiht. Wenn die Turnover-Zahl für jede der CHA-Reaktionen nur 1 pro Minute ist, wird eine einzige Kopie der Zielsequenz 2,4 X 10&sup8; Markierungen bewirken, die innerhalb von 20 Minuten in Lösung freigesetzt werden. Diese Zahl kann mit einfachen Fluoreszenz- oder Enzymmarkierungsgruppen leicht nachgewiesen werden. Turnover-Zahlen, die sehr viel größer als 1 pro Minute sind, können erreicht werden (siehe Beispiel 1). Gekoppelte CHA-Testsysteme stellen somit die Möglichkeit bereit, in einer einzigen Kopie vorhandene Zielsubstanz mit einer Reaktionszeit von nur ein paar Minuten nachzuweisen.
Schließlich beschreiben wir einen Konkurrenztest, dar auf dem CHA-Verfahren beruht, um eine RNA-Zielsequenz nachzuweisen. In diesem Fall werden sowohl ein DNA-Molekül als auch eine markierte Sonde zur zu analysierenden Probe zugegeben (Figur 5). Die Sondensequenz (A') kann vollständig aus RNA bestehen oder eingesreute Sequenzen enthalten, die nicht durch RNaseH gespalten werden können. Das DNA-Fragment enthält in sich eine Sequenz (A), die komplementär zur markierten Sonde ist. In dem dargestellten Beispiel ist der zentrale Teil der Sonde RNA und dieser ist auf jeder Seite von DNA-Sequenzen flankiert. Die RNA/DNA-Duplex, die gebildet wird, wenn (A) und (A') miteinander hybridisieren, bildet ein Substrat für RNaseH. RNaseH kann die markierte Sonde spalten, wodurch das DNA-Fragment intakt freigesetzt wird, das als ein Katalysator dient, um die Reaktion weiter fortzupflanzen. Dies würde eintreten, wenn die Ziel-RNA-Sequenz nicht in der Probe vorhanden wäre (Figur 5C). Wenn die Ziel-RNA-Sequenz vorhanden wäre, würde diese Reaktion inhibiert werden (Figur 5B). Die Zielsequenz enthält die Sequenz (A'), sowie eine benachbarte Sequenz (B'), die außerdem zum DNA-Fragment komplementär ist. Das DNA-Fragment bildet so eine stabilere Duplex mit der Zielsequenz als mit der Sonde. Dies ermöglicht es, daß das Zielmolekül sehr effektiv um die Bindung des DNA-Fragments konkurriert und dadurch die Spaltung der markierten Sonde durch RNaseH blockiert (Figur 5B). Diese kompetitive Inhibition der Spaltung der markierten Sonde ist die Grundlage für den Test. Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann weiter erhöht werden, indem verhindert wird, daß die RNA- DNA-Duplex, die mit der Zielsequenz gebildet wird, durch RNaseH abgebaut wird. Dies kann durch geeignete Modifikation des DNA-Fragmentes erreicht werden. Wir haben festgestellt, daß eine Vielzahl von Modifikationen des Phosphat-Rückgrates des DNA-Stranges Spaltung des komplementären RNA-Stranges durch RNaseH verhindern wird. Solche Modifikationen schließen Ersatz der normalen Phosphatdiester durch Alkyl- oder Arylphosphotriester oder durch Alkyl- oder Arylphosphonate ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Diese Modifikationen würden in das DNA-Molekül, das im Test verwendet wird, über die ganze Region B und in die Gesamtheit von Region A, mit Ausnahme desjenigen Teils, der an die zentrale RNA-Sequenz der Sonde hybridisiert, eingebaut werden. Wenn diese nicht-modifizierte Sequenz innerhalb von Region A genau komplementär zur RNA-Sequenz in der Sonde ist, aber ein oder mehrere Mismatches bezüglich der Zielsequenz enthält, wird nur die Sonde durch RNaseH gespalten werden. Das (Die) Mismatch(es) innerhalb der zwischen dem DNA- Strang und dem Zielmolekül gebildeten Duplex unterbricht (unterbrechen) die Helix, wodurch Spaltung des Zielstranges innerhalb dieser Region durch RNaseH verhindert wird. Spaltung des Zielstranges anderswo wird durch die Modifikationen verhindert, die in das Phosphat-Rückgrat des DNA-Moleküls eingeführt sind. Das (Die) Mismatch(es) würde(n) die Stabilität der zwischen der Zielsequenz und dem DNA-Molekül gebildeten Duplex etwas verringern, aber die Stabilität der Duplex würde wegen der zusätzlichen komplementären Sequenz in Region B, viel größer bleiben als die mit der markierten Sonde gebildete.
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um das Verfahren, das Produkt und die Techniken der Erfindung weiter zu veranschaulichen, nicht aber zu beschränken, und dienen dazu, die einzigartigen Merkmale der Erfindung nachzuweisen, die die Grundlage für ihre Brauchbarkeit bilden.

BEISPIEL 1

Demonstration katalytischer Hybridisierungsamplifikation, mediatisiert durch RNaseH

Das folgende Beispiel demonstriert das Prinzip des katalytischen Hybridisierungsamplifikationsverfahrens. Die Zielsequenz in diesem Fall war Oligodesoxythymidylsäure mit 12 bis 18 Nukleotidresten Länge (oligo dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;, geliefert von Pharmacia) Das Molekül, das als die Sonde dient, war Polyriboadenosin, das mit Tritium markiert war (Amersham). Die spezifische Aktivität des poly rA, das in der Studie verwendet wurde, betrug 574 mCi/Nukleotidrest; die Kettenlänge variierte von etwa 40 bis 140 Reste. In der Gegenwart der Zielsequenz katalysiert RNaseH die Spaltung der markierten poly rA-Sonde. Oligo dT wird dann aus der Duplex intakt freigesetzt und wiederholt im Kreislauf durch die Reaktion geführt, wie in Figur 2 angegeben.
Spaltung der poly rA-Sonde, katalysiert durch RNaseH, wurde unter drei Bedingungen verglichen: in der Abwesenheit von oligo dT; mit einer äquivalenten Konzentration von oligo dT (bezogen auf Nukleotidreste); und in der Gegenwart von 1/1000 der Konzentration von oligo dT. Jede Reaktion wurde in einem Endvolumen von 100 ul durchgeführt, das 44 Picomol poly rA (nach Nukleotideinheiten), 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0, 20 mM KCl, 9 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 25 ug Rinderserumalbumin enthielt. Die Reaktion wurde eingeleitet durch die Zugabe von 2,3 Einheiten E. coli-RNaseH (Bethesda Research Laboratories) und wurde bei 30ºC gehalten. Aliquote der Reaktionsmischung wurden nach 30 Minuten entfernt und zu 0,2 ml einer Träger-DNA-Lösung (0,5 mg/ml Lachssperma-DNA, 0,1 M Natriumpyrophosphat und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure) und 0,3 ml 10%iger Trichloressigsäure zugegeben. Trichloressigsäure bewirkt die Ausfällung höhermolekularer Nukleinsäuren über etwa 10 Nukleotide Länge. Kleinere Spaltprodukte, d.h. Mononukleotide und kurze Oligonukleotide, bleiben in Lösung. Nach Inkubation der Proben auf Eis für 20 Minuten wurden die ausgefällten Nukleinsäuren durch Zentrifugation bei 16.000 X g für 15 Minuten pelletiert. Die Überstände, die die gespaltenen Fragmente enthielten, wurden sorgfältig entfernt, mit Szintillations-Cocktail vermischt und auf Radioaktivität gezählt.
In der Kontrollprobe ohne oligo dT wurden weniger als 0,5% des poly rA im Verlauf von 90 Minuten gespalten. In der Gegenwart einer äquivalenten Konzentration von oligo dT wurden nahezu 100% dies poly rA innerhalb von 30 Minuten zu in Trichloressigsäure löslichen Fragmenten gespalten. Spaltung von poly rA in der Gegenwart von 1/1000 der Menge an oligo dT war linear über 90 Minuten, wobei zu diesem Zeitpunkt 21% des poly rA zu in Trichloressigsäure löslichen Fragmenten gespalten waren. Da oligo dT in einer ausreichenden Konzentration vorhanden war, um an nur 0,1% der poly rA-Sequenz zu hybridisieren, muß jedes Molekül des oligo dT im Mittel wenigstens 210mal (2,3-mal/Minute) im Kreislauf durch die Reaktion gegangen sein. Da Spaltung des poly rA-Stranges in einigen Fällen nicht-produktiv ist, d.h. nicht zur Freisetzung von markierten Fragmenten führt, die klein genug sind, um in der Gegenwart von Trichloressigsäure in Lösung zu bleiben, muß die wahre Turnover-Zahl sogar noch höher sein. In diagnostischen Tests, die auf dem CHA-Verfahren beruhen, liefern Turnover-Zahlen, die 100/Stunde übersteigen, eine große Erhöhung in der Empfindlichkeit, verglichen mit Tests, die auf einem stöchiometrischen Hybridisierungsformat beruhen.

BEISPIEL 2

Ortsspezifische Spaltung von β-Globin-mRNA durch RNaseH in der Gegenwart einer komplementären DNA-Zielsequenz

Das folgende ist ein wichtiges Beispiel, in dem die Spezifität der Strangspaltung durch RNaseH deutlich belegt wird. Es wurde gezeigt, daß RNaseH β-Globin-mRNA an einer einzigen Stelle spaltet, wenn eine Mischung aus sowohl α- als auch β-Globin- mRNA an eine kurze DNA-Zielsequenz mit 25 Resten hybridisiert wurde, die komplementär zu einem Teil der β-Globin-mRNA war.
Das Oligodesoxynukleotid 5'-TGTCCAAGTGATTCAGGCCATCGTT (CODMB- 25) wurde mit dem Phosphoramiditverfahren unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers von Beckman synthetisiert. Es ist komplementär zur Nukleotidsequenz von Mäuse-β- Globin-mRNA von Rest 269 bis 293. Mäuse-Globin-mRNA wurde aus Reticulocyten isoliert, die von Mäusen erhalten wurden, die durch Behandlung mit Phenylhydrazin anämisch gemacht worden waren, wie beschrieben von Goosens und Kan (Methods in Enzymology (Antonini, E., Rossi-Bernardi, L. und Chiancone, E., Hrg.) Vol. 76, S. 805-817, 1981). Zwei Mikrogramm der RNA wurden zu 1,0 Nanomol CODMB-25 in einem Endvolumen von 25 Mikrolitern zugegeben, das 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 25 mN NaCl und 1 mM Dithiothreit enthielt. Die Konzentration des Oligonukleotids ist ungefähr 100mal größer als die mRNA auf einer molaren Basis. Die Reaktion wird eingeleitet durch die Zugabe von 2 Einheiten E. coli-RNaseH, und man ließ sie für 30 Minuten bei 37ºC fortschreiten. Die Reaktion wurde durch Extraktion der Probe in einer 1:1-Mischung (Volumen: Volumen) aus Chloroform und Phenol gestoppt. Die RNA-Spezies, die nach Verdauung mit RNaseH zurückblieben, wurden dann durch Ausfällung mit Ethanol isoliert und auf Northern-Blots analysiert.
Die RNA-Proben wurden mit 1 M Glyoxal in einer 1:1-Mischung (Volumen/Volumen) aus 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 und Dimethylsulfoxid für 1 Stunde bei 50ºC zur Reaktion gebracht und dann einer Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel unterzogen. Die RNAs wurden vom Gel auf einer Filter Gene Screen Plus (DuPont-NEN) mit Kapillar-Blotting gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Verfahren überführt. Vorhybridisierung des Filters wurde in 1% Natriumdodecylsulfat, 1 M NaCl, 10% Dextransulfat, 50 mM Natriumphosphat pH 6,5 für 2 Stunden bei 35ºC durchgeführt. Der Filter wurde daran entweder mit einer α- oder mit einer β-Globin-spezifischen Oligonukleotidsonde hybridisiert. Die Sonden waren 25 Reste lang und hybridisierten an das äußerste 5'-Ende der entsprechenden RNAs. Hybridisierung wurde in 5 ml des Vorhybridisierungspuffers, der 200 Mikrogramm/ml denaturierte Lachssperma-DNA plus 2 X 10&sup6; Zählungen/min der Sonde, radioaktiv markiert mit ³²P am 5'-Ende des Moleküls, enthielt, für 24 Stunden bei 35ºC durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde der Filter in der folgenden Reihenfolge gewaschen: einmal in 2X SSC (1X SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) für 5 Minuten bei Raumtempeiatur, zweimal in 2X SSC plus 1% Natriumdodecylsulfat für 30 Minuten bei 35ºC und einmal in 0,1X SSC für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Der Filter wurde trockengetupft und einem Kodak XAR-5-Film für Autoradiographie ausgesetzt.
In der Abwesenheit von Oligonukleotid trat weder Spaltung von α- noch von β-Globin-mRNA während der Reaktion mit RNaseH auf. Die α- oder β-Globin-spezifischen Sonden hybridisierten jeweils an eine einzelne Bande auf den Northern-Blots, die der Vollängen-mRNA entsprach. Die Reaktion in der Gegerwart von CODMB-25 führte zu im wesentlichen vollständiger Snaltung der β-Globin-mRNA. Die Größe des Spaltproduktes, nachgewiesen mit der 5'-β-Globin-spezifischen Sonde, war exakt die für das Schneiden der mRNA an der Stelle der RNA/DNA-Duplex vorhergesagte, d.h. 280+/-20 Nukleotide. Keine anderen Spaltprodukte wurden beobachtet. Zusätzlich war unter Verwendung der α-Globin-spezifischen Oligonukleotidsonde keine Spaltung der α-Globin-nRNA zu beobachten. RNaseH besaß somit die notwendige Spezifität zur Verwendung in diagnostischen Tests auf der Grundlage des CHA-Verfahrens. Eine RNA-Sequenz, die als Sonde verwendet wird, wird dann und nur dann von dem Enzym gespalten werden, wenn es die komplementäre Ziel-DNA-Sequenz innerhalb der Probe antrifft; und freie einzelsträngige Moleküle der Sonde, die nicht an die Zielsequenz hybridisiert sind, werden nicht geschnitten werden.

BEISPIEL 3

Nachweis von Cytomegalovirus unter Verwendung eines CHA-Verfahrens

Cytomegalovirus (CMV) ist ein großes Virus mit doppelsträngiger DNA. Infektion mit CMV ist klinisch sehr wichtig bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Es ist die häufigste schwere Infektionskrankheitskomplikation im Anschluß an Nierentransplantation.
Das folgende veranschaulicht die Verwendung des CHA-Verfahrens um CMV nachzuweisen. Die verwendete Sonde ist eine CMV- spezifische, 25 Nukleotide lange Sequenz, abgeleitet vom major-immediate-early-Gen:
5'-TCTTGGCAGAGGACTCCATCGTGTC
Die zentralen sechs Reste sind RNA; die flankierenden Sequenzen bestehen aus DNA. Die Sonde ist gebunden an Latexperlen am 3'-Ende der Sequenz. Alkalische Phosphatase ist gebunden an die 5'-terminale Position. DNA wird aus vom Patienten erhaltenen Blut-, Urin- und Sputumproben isoliert. Der Test auf CMV in jeder dieser Proben wird mit dem in Figur 3 dargestellten CHA-Verfahren durchgeführt. Spaltung der markierten Sonde wird durch E. coli-RNaseH (5 Einheiten/100 Mikroliter) mediatisiert. Die CHA-Reaktion wird für einen Zeitraum von 45 Minuten bei einer Temperatur von etwa 40ºC durchgeführt. RNasin (50 Einheiten/100 Mikroliter) wird zur Reaktionsmischung zugegeben, um nicht-spezifische Spaltung der Sonde zu unterdrücken. Wenn CMV in der Probe vorhanden ist, wird die Zielsequenz an die Sonde hybridisieren und die Sonde wird durch RNaseH gespalten werden. Wiederholtes Führen der Zielsequenz im Kreislauf durch den Reaktionsweg ermöglicht es, daß jede Kopie der Zielsequenz viele Moleküle der markierten Sonde einhängt und deren Spaltung beschleunigt. Im Anschluß an die CHA-Reaktion wird das Ausmaß der Spaltung der Sonde durch Messung der Menge der Reporter-Gruppe, d.h. alkalischer Phosphatase, die in Lösung freigesetzt ist, quantifiziert. Die Perlen werien zunächst durch Filtration oder Zentrifugation aus der Probe entfernt. Die Markierung aus alkalischer Phosphatase auf den Sondenfragmenten in Lösung wird dann unter Verwendung entweder eines kolorimetrischen Nachweissystems oder eines Nachweissystems mit fluoreszenzproduzierendem Reagenz gemessen. Das Enzym kann spektrophotometrisch bei 405 nm durch Verfolgen der Hydrolyse des Substrats p-Nitrophenylphosphat zum gefärbten Produkt p-Nitrophenol bei pH 8,5 untersucht werden. Alternativ kann das Enzym fluorometrisch unter Verwendung des Substrats 4-Methylumbelliferylphosphat gemessen werden. Die Fluoreszenzanregungs- und -emissionswellenlängen, die für den Fest verwendet werden, sind 363 nm bzw. 447 nm. Die endgültige Farbe oder das Fluoreszenzsignal liefern ein Maß für die Menge an in der ursprünglichen Probe vorhandenem CMV.
Zusammengefaßt belegen die vorgelegten Ergebnisse der Studien die Brauchbarkeit des CHA-Verfahrens als ein Mittel zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen. In solchen Testsystemen dient die Zielsequenz als ein Cofaktor für eine katalytische Reaktion, in der eine komplemetäre, markierte Nukleinsäuresonde gespalten wird. Jedes Molekül der Zielsequenz ist somit in der Lage, mehrere Kopien der Sonde einzufangen und deren Spaltung zu beschleunigen. Dies führt zu einem großen Anstieg im Empfindlichkeitsniveau des Verfahrens, verglichen mit gegenwärtigen diagnostischen Tests, die alle auf einer stöchiometrischen Hybridisierungsreaktion beruhen, in der die Zielsequenz sich an ein und nur ein Molekül der Sonde binden kann. Wie in den beschriebenen Beispielen muß die Spaltung der Sonde nur auftreten, wenn sie an die Zielsequenz hybridisiert ist. Die Zielsequenz wird dann intakt aus der Duplex freigesetzt und wiederholt im Kreislauf durch den Reaktionsweg geführt. Formate werden bereitgestellt zur Verwendung des CHA- Verfahrens sowohl in direkten als auch in Konkurrenztests. Im allgemeinen liefert ein Nachweissystem, das auf einer einzelnen CHA-Reaktion beruht eine mit der Zeit lineare Signalamplifikation. Durch Zusammenkopplung von zwei oder mehr CHA-Reaktionen in einer geeigneten Art und Weise kann eine exponentielle Signalamplifikation erreicht werden, was zu einem noch größeren Empfindlichkeitsniveau führt.
Man kann daher sehen, daß die Erfindung alle die hier zuvor angegebenen Ziele erreicht.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, bei dem besagte Sequenzen als ein Cofaktor für eine katalytische Reaktion dienen, in der eine komplementäre markierte Nukleinsäuresonde gespalten und nachgewiesen wird, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Hybridisieren einer Zielsequenz an eine markierte Nukleinsäuresonde, um eine Sonden/Zielsequenz-Duplex bereitzustellen;

Spalten der markierten Sonde innerhalb der Sonden/Zielsequenz- Duplex, um die Zielsequenz intakt freizusetzen;

wiederholtes Führen der Zielsequenz im Kreislauf durch den Reaktionsweg; und

Nachweis des Umfangs der Spaltung der markierten Scnde.

2. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, wobei besagtes Nachweisverfahren für die Diagnose einer Erkrankung oder eines genetischen Merkmals bei Menschen oder anderen Spezies verwendet wird.

3. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, wobei besagtes Nachweisverfahren verwendet wird, um eine Nukleinsäuresequenz in einem industriellen oder landwirtschaftlichen Verfahren zu identifizieren.

4. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, 2 oder 3, wobei besagte Nukleinsäuresonde mit einer anderen radioaktiven, fluoreszierenden, elektrochemischen, lumineszierenden oder Enzym-Markierung oder einer Reporter-Gruppe markiert wird, um ihren Nachweis zu ermöglichen.

5. Verfahren wie beansprucht in irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei der Umfang der Spaltung der Sonde durch elektrophoretische Trennung der kleineren Spaltungsfragmente, die die Markierungsgruppe tragen, von den restlichen Molekülen der intakten Sonde bestimmt wird.

6. Verfahren wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Umfang der Spaltung der Sonde bestimmt wird, indem starke Säuren, wie etwa Trichloressigsäure, verwendet werden, um die größeren, nicht-gespaltenen Moleküle der Sonde selektiv auszufällen, was die kleineren gespaltenen Fragmente, die die Markierung tragen, in Lösung zurückläßt.

7. Verfahren wie beansprucht in irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei die Sonde sowohl mit einer Markierung mit hoher Affinität als auch mit einer Reporter-Gruppe modifiziert wird und bei dem ein fester Träger, an den eine entsprechende Affinitätsgruppe gebunden ist, verwendet wird, um Moleküle der intakten Sonde zu adsorbieren, was die gespaltenen Fragmente, die die Markierung tragen, in Lösung zurückläßt, wobei besagtes Verfahren die zusätzlichen Schritte umfaßt:

Zugeben eines festen Trägermaterials zur Probe im Anschluß an die Hybridisierungs- und Spaltungsreaktion;

Assoziieren der Markierung mit hoher Affinität, die an die Sonde mit der entsprechenden Affinitätsgruppe auf dem festen Träger gebunden ist;

Trennen des festen Trägers von der Lösung, die die gespaltenen Fragmente der Sonde enthält, die die Reporter-Gruppe tragen; und

Nachweis der Reporter-Gruppen in Lösung.

8. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 7, bei dem besagter fester Träger aus Latex, Polystyrol, vernetztem Dextran oder Glasperlen, Cellulose oder einer Tetrafluorethylen- Homopolymer- oder Nylonmembran besteht.

9. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 7 oder 8, bei dem besagter fester Träger magnetisiert ist und der feste Träger von der Hauptlösung durch das Anlegen eines Magnetfeldes getrennt wird.

10. Verfahren wie beansprucht nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei besagte Affinitätsmarkierung eine Nukleinsäuresequenz ist, die in der Hybridisierungs- und Spaltungsreaktion nicht gespalten wird, und die entsprechende Affinitätsgruppe, die an den festen Träger gebunden ist, eine komplementäre Nukleinsäuresequenz ist.

11. Verfahren wie beansprucht in irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei besagte markierte Sonde während dei Hybridisierungs- und Spaltungsreaktion an einen festen Träger gebunden wird und gespaltene Fragmente, die die Reporter- Gruppe tragen, in Lösung hinein freigesetzt werden.

12. Verfahren wie beansprucht in irgendeinem vorangehenden Anspruch, zum Nachweis einer DNA-Sequenz, bei dem Spaltung der markierten Sonde indirekt durch ein Enzym mit RNaseH-Aktivität bewirkt wird.

13. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 12, bei dem nicht- spezifische Spaltung der markierten Sonde durch die Verwendung einzelsträngiger Ribonuklease-Inhibitoren unterdrückt wird.

14. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 12 oder 13, wobei die markierte Sonde durch eine wärmestabile Form von RNaseH gespalten wird.

15. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 12, wobei die markierte Sonde ein von 15 bis 50 Nukleotide langem Oligonukleotid ist.

16. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 15, wobei besagtes Oligonukleotid vollständig aus RNA besteht.

17. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 15, wobei besagtes Oligonukleotid eine oder mehrere eingestreute Sequenzen enthält, die nicht durch RNaseH spaltbar sind.

18. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 15, wobei ein Oligonukleotid, das aus einer DNA-RNA-DNA-Sequenz besteht, als die Sonde verwendet wird.

19. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 18, wobei besagte DNA-RNA-DNA-Sonde verwendet wird, um eine Punktmutation nachzuweisen, wie sie bei Sichelzellenanämie auftritt.

20. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 12, wobei die markierte Sonde ein von 50 bis mehrere Tausend Nukleotide langes Polynukleotid ist.

21. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 20, wobei besagtes Polynukleotid vollständig aus RNA besteht.

22. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 20, wobei besagtes Polynukleotid eine oder mehrere eingestreute Sequenzen enthält, die nicht von RNaseH spaltbar sind.

23. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, zum Nachweis einer RNA-Sequenz, bei dem die Proben-RNA zunächst als Matrize für die Synthese einer komplementären DNA-Kopie der Zielsequenz mit Reverser Transkriptase verwendet wird, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Hybridisieren eines DNA-Primers an die Proben-BNA 5' zur Zielsequenz;

Extendieren des Primers mit Reverser Transkriptase über die Zielsequenz, um eine komplementäre DNA-Kopie der Zielsequenz herzustellen; und

Nachweis der komplementären DNA-Kopie.

24. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 23, bei dem das Hybridisierungs- und Spaltungsverfahren auf der Spaltung einer markierten Probe durch ein Enzym mit RNaseH-Aktivität beruht.

25. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 23 oder 24, bei dem ein Phosphorothioat-Derivat der komplementären DNA-Kopie der Zielsequenz mit Reverser Transkriptase unter Verwendung von Desoxynukleotid-α-Thiotriphosphaten als Substraten für die Reaktion synthetisiert wird, so daß die Phosphatgruppen des synthetisierten DNA-Stranges Phosphorothioate statt der natürlich auftretenden Phosphodiester sind.

26. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 25, bei dem das Hybridisierungs- und Spaltungsverfahren auf der Spaltung einer markierten Sonde durch ein Enzym mit RNaseH-Aktivität beruht.

27. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 25, bei dem das Hybridisierungs- und Spaltungsverfahren auf der Spaltung einer markierten DNA-Sonde durch ein Restriktionsenzym beruht, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Hybridisieren des synthetisierten Phosphorothioat-Derivats an eine komplementäre markierte DNA-Sonde;

Spalten der markierten Sonde innerhalb der Sonden/Phosphorothioat-DNA-Duplex durch ein Restriktionsenzym an seiner Erkennungsstelle, um den Phosphorothioat-Strang intakt freizusetzen;

wiederholtes Führen des Phosphorothioat-Stranges im Kreislauf durch den Reaktionsweg; und

Nachweis des Umfangs der Spaltung der Sonde im Anschluß an die Reaktion.

28. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, zum Nachweis einer DNA-Sequenz, bei dem eine Kopie der Zielsequenz zunächst mit DNA-Polymerase unter Verwendung der Proben-DNA als einer Matrize synthetisiert wird, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Denaturieren der Proben-DNA;

Hybridisieren eines DNA-Primers an die Proben-DNA 5' zur Zielsequenz;

Extension des Primers mit DNA-Polymerase über die Zielsequenz, um eine Kopie des komplementären DNA-Stranges herzustellen;

Nachweis der DNA-Kopie.

29. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 28, bei dem ein Phosphorothioat-Derivat der Kopie der Zielsequenz mit DNA- Polymerase unter Verwendung von Desoxynukleotid-α- Thiotriphosphaten als Substraten für die Reaktion synthetisiert wird, so daß die Phosphatgruppen des synthetisierten DNA-Stranges Phosphorothioate statt der natürlich auftretenden Phosphodiester sind.

30. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 29, bei dem das Hybridisierungs- und Spaltungsverfahren auf der Spaltung einer markierten Sonde durch ein Enzym mit RNaseH-Aktivität beruht.

31. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 29, bei dem das Hybridisierungs- und Spaltungsverfahren auf der Spaltung einer markierten DNA-Sonde durch ein Restriktionsenzym beruht, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Hybridisierung des synthetisierten Phosphorothioat-Derivats an eine komplementäre markierte DNA-Sonde;

Spaltung der markierten Sonde innerhalb der Sonden/Phosphorothioat-DNA-Duplex durch ein Restriktionsenzym an seiner Erkennungsstelle;

Freisetzung des intakten Phosphorothioat-Stranges;

Nachweis des Umfangs der Spaltung der Sonde im Anschluß an die Reaktion.

32. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, bei dem zwei oder mehr Hybridisierungs- oder Spaltungsreaktionen gekoppelt werden, um eine exponentielle Signalverstärkung zu erreichen.

33. Verfahren zum Nachweis einer RNA-Sequenz unter Verwendung eines Kompetitions-Tests, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

Hybridisierung der Proben-RNA an ein zur Zielsequenz komplementäres DNA-Molekül;

Zugabe einer zu besagtem DNA-Molekül komplementärer, markierten RNA-Sonde plus eines Enzyms mit RNaseH-Aktivität zur Testprobe;

Inkubation der Testprobe, um das Fortschreiten der Hybridisierungs- und Spaltungsreaktion zu ermöglichen; und

Messen des Umfangs der Spaltung der RNA-Sonde.

34. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 33, wobei besagtes DNA-Molekül ein zu sowohl der Ziel-RNA-Sequenz als auch der markierten Sonde komplementäres Segment und ein zweites, nur zur Zielsequenz komplementäres Segment enthält.

35. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 34, wobei das DNA- Molekül eine wenigstens 4 Nukleotide lange Sequenz enthält, in der die Phosphatgruppen nicht-modifiziert sind, und die restlichen Phosphatgruppen modifiziert sind, um Spaltung der komplementären Ziel- und Sonden-BNA-Sequenzen durch die RNaseH zu verhindern.

36. Verfahren wie beansprucht in Anspruch 33, bei dem besagtes DNA-Molekül zu der markierte Sonde komplementär ist, aber mit der Ziel-RNA-Sequenz eine Duplex mit einem oder mehreren Mismatches bildet, so daß Spaltung der Ziel-RNA-Sequenz durch RNaseH gehemmt ist.

37. Zur Durchführung des Verfahrens, wie beansprucht in irgendeinem vorangehenden Anspruch, brauchbare Sonde, hergestellt aus einem 15 bis 50 Nukleotide langen Oligonukleotid, das eine RNA-Sequenz und eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen enthält, die nicht von RNaseH spaltbar sind.

38. Sonde wie beansprucht in Anspruch 37, in der besagte DNA- Sequenz von 3 bis 15 Nukleotide lang ist und in dei das Nukleotid an oder nahe dem 5'- oder 3'-Ende der Kette mit einer radioaktiven, fluoreszierenden, elektrochemischen, lumineszierenden oder Enzym-Markierung oder einer anderen Reporter-Gruppe markiert ist.

39. Sonde wie beansprucht in Anspruch 38, in der das Oligonukleotid außerdem mit einer Gruppe mit hoher Affinität an oder nahe dem entgegengesetzten Ende der Kette zu demjenigen an das besagte Reporter-Gruppe gebunden ist, modifiziert ist.

40. Zur Durchführung des Verfahrens, wie in einem cer Ansprüche 1 bis 35 beansprucht, brauchbare Sonde, hergestellt aus einem von 50 bis mehrere Tausend Nukleotide langen Polynukleotid, das aus RNA plus einer oder mehreren eingestreuten Sequenzen besteht, die nicht von RNaseH spaltbar sind.

41. Sonde wie beansprucht in Anspruch 40, in der die Strecken der RNA-Sequenz 3 Nukleotide lang oder länger sind und in der eine oder mehrere der eingestreuten Sequenzen, die nicht durch RNaseH spaltbar sind, mit einer radioaktiven, fluoreszierenden, elektrochemischen, lumineszierenden oder Enzym-Markierung oder einer anderen Reporter-Gruppe markiert sind.