JP2856804B2 - 標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系 - Google Patents

標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系

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Description

【発明の詳細な説明】 助成金の参照 本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute
s of Health）支給の助成金第HL−33555号および第AM−
25295号を得て実施された研究の過程でなされたもので
ある。
関連出願 本発明は、1987年11月30日に米国へ出願され、審査中
の出願番号第126,564号の一部継続出願に基づくもので
ある。
発明の背景 1.発明の分野 本発明は、生物学的および臨床的試料中の特定の核酸
（DNAおよびRNA）配列を高い感度で検出するための診断
用検査方法を提供する。本発明は特に、複写数の少ない
標的配列を、高度に特異的に検出することを課題を対象
としている。
DNAおよびRNAの検出に現在用いられている方法は、す
べて、標的配列に対する標識された相補的核酸プローブ
の化学量論的な（1:1の）ハイブリッド形成を基本原理
としている（第１図参照）。
本発明は、このような取り組み方とは著しく異なるも
のであって、標的配列を、触媒作用によってプローブを
開裂する反応の補因子として利用する。プローブ開裂後
は、標的配列は無傷で遊離し、反応を通じて反復的に再
循環して、応答の大規模な増幅が起こるようになる（第
２図参照）。発明者らは、このような反応様式を、触媒
的ハイブリッド形成増幅反応と称している。このような
検査法においては、標識プローブの開裂は、標的配列が
存在する指標となる。この方法の感度は、標的配列がわ
ずか１個のプローブ分子を捕捉するに過ぎない化学量論
的、すなわち、単一的ハイブリッド形成なる様式に基づ
く既存のすべての方法よりも、はるかに強力である。後
述で、触媒的ハイブリッド形成増幅法の実施例をいくつ
か記載する。
この検査法に必要な操作は、すべて単純であり、臨床
的研究室で容易に実施できるものばかりである。ヒトそ
の他の生物種における遺伝的障害、伝染病、および癌な
ど各種疾患の診断が、本発明の用途となる。
2.従来の技術 周知の通り、核酸、すなわちデオキシリボ核酸（DN
A）とリボ核酸（RNA）とは、すべての生物の基本的構成
単位である。これらは、高分子の重合体であって、塩基
（プリンまたはピリミジン）１個、糖（リボースまたは
デオキシリボースのいずれか）１個、および燐酸１分子
でそれぞれ構成されるヌクレオチド単位を多数用いて形
成されている。
DNAには、糖成分としてデオキシリボースが、塩基と
しては、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン
（それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔと表される。）が含まれてい
る。
RNAには、デオキシリボースの代わりにリボースが、
チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が含まれている。
DNAおよびRNAのヌクレオチド単位は、一定の線形の配
列で集合しており、これが特定の生物学的機能を規定す
る。
細菌の細胞において、またすべての高等生物の種にお
いては、DNAは自身の複製を指令し、またRNA分子合成の
鋳型としても働く。このRNA分子のヌクレオチド配列
は、DNAによって暗号化されている情報を運搬する。RNA
合成の過程は転写とよばれる。
RNA分子は、細胞内部のいくつかの異なった機能を担
っている。伝令RNA（mRNA）は、蛋白質合成を支配す
る。リボソームRNA（rRNA）は、リボソームの重要な構
成要素であって、細胞内のこの小器官でmRNAの読み取
り、すなわち翻訳を行ない、蛋白質が作られるのであ
る。
ある生物の遺伝情報を集合的に指す場合には、ゲノム
という用語が用いられる。細菌、およびすべての高等生
物種のゲノムは、DNAで構成されている。ウイルスのゲ
ノムには、DNAあるいはRNAのどちらもがなれる。いずれ
にせよ、いかなる特定の生物種のゲノムも、それがウイ
ルスであろうと、細菌、あるいは高等生物であろうと、
特徴的なヌクレオチド配列を有しており、これを単純化
して述べると、その生物種の「指紋」のように見なすこ
とができるのである。蛋白質をコードする、すなわち、
転写されて特定の機能を有するRNA、例えばrRNAを形成
するようなゲノム内の配列は、個々の遺伝子を表してい
る。エイズウイルスなど小型のウイルスは、わずか10個
の遺伝子を有するに過ぎないが、ヒトのゲノムには、お
よそ50,000もの遺伝子が含まれている。
公知のワトソン−クリックモデルによれば、DNA分子
は、軸を共有するコイル状の２本のポリヌクレオチド鎖
で構成されている。ここに形成される二重らせんは、各
鎖の相補的な塩基対間の水素結合によって互いに固定さ
れている。水素結合は、アデニン（Ａ）とチミン
（Ｔ）、および、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間
にのみ形成される。したがって、二重らせんの内部で
は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）とは、Ａ−Ｔとして
互いに結合する相補的塩基であると見なされる。同じこ
とが、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とに対しても、
Ｇ−Ｃとして当てはまる。
単一のポリヌクレオチド鎖においては、どのようなヌ
クレオチド配列も存在可能である。しかし、あるDNA分
子の一方の鎖における塩基の順序が特定されると、それ
とともに、上記の塩基対合の法則によって、他方の鎖の
配列は厳密に決定される。したがって、DNA分子のそれ
ぞれの鎖は、互いに相補的である。
２本の相補的なDNA鎖が互いに会合する過程は、ハイ
ブリッド形成とよばれる。鎖を分離する過程は、通常、
試料の加熱によって行われ、これは、二重鎖の融解、あ
るいは変性とよばれる。二重鎖には、長さ、組成、およ
び塩濃度にもっぱら依存する特徴的な融解温度（Tm）が
ある。
次の式によって、Tmの実用的な近似が与えられる。
Tm＝16.6×logCs＋0.41×（％Ｇ＋Ｃ）＋81.5−820
/L （Ｉ） （式中、Csは塩濃度、（％Ｇ＋Ｃ）はＧ−Ｃ含量の百分
比、Ｌは二重鎖の長さを表す。）［シー・シルトクラウ
ト（C.Schildkraut）およびエス・リフソン（S.Lifso
n）：バイオポリマーズ（Biopolymers）、第３巻（1965
年）195〜208ページ；シー・エイ・トマス・ジュニア
（C.A.Thomas,Jr.）およびビー・エム・ダンシス（B.M.
Dancis）：ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J.Molecul.Biol.）、第77巻（1973年）43〜55ペ
ージ］。
二重鎖の２本の鎖の間の誤対合（例えば、Ｃ−Ｔなる
塩基対）も起こり得るが、それによって、らせんの安定
性は、著しく減少し、融解温度は降下する。
DNA:DNA二重鎖の他に、RNA:RNA二重鎖も形成可能であ
って、自然界にも出現する。DNA:RNA二重鎖は、DNAがRN
A合成の鋳型として働く転写の過程で過渡的に形成され
る。RNA:RNA二重鎖は、ある種のウイルスの遺伝物質と
して出現し、また、リボソームRNA、および転移RNAのい
わゆるヘアピンループにおいても形成される。RNA鎖が
含まれる二重鎖では、ウラシル（Ｕ）がアデニン（Ａ）
と対合する。また、１本のポリヌクレオチド鎖内にRNA
とDNAの双方の配列が出現することもある。このようなR
NA−DNA共重合体は、DNAの複製の際の中間体として形成
される。DNA:RNA二重鎖、あるいはRNA:RNA二重鎖の融解
温度は、溶液の状態によっては同じ配列のDNA:DNA二重
鎖のそれと多少異なることもあるが、前記の式は、Tmの
近似としては依然として有効である。
これら各種のポリヌクレオチドの構造、およびその生
物学的機能に関する更に詳細な考察は、ベンジャミン・
ルーイン（Benjamin Lewin）著、「遺伝子、その３（Ge
nes III）」［ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Joh
nwiley and Sons）社1987年発行］を参照のこと。本書
は、本明細書における参照資料となるものである。
組換えDNAの手法を用いた分子生物学の最近の発展に
よって、新しい診断および治療の構想がもたらされてい
る。
DNAプローブによる診断の分野においては、試料中の
相補的な標的核酸配列の存在を検出するのに、DNAプロ
ーブが用いられる。その適用としては、伝染病、癌、お
よび遺伝的障害の診断がある。伝染病の場合であれば、
特定の細菌あるいはウイルスに特有のDNA、あるいはRNA
の配列が標的となり得る。
ある種の癌細胞においては、例えば、慢性骨髄性白血
病におけるｃ−ablなる癌遺伝子の転座のような、特有
の検出可能な遺伝子の並び換えがある。遺伝的欠陥に
は、DNAの大規模な欠失または挿入、あるいは、鎌状赤
血球状におけるような点突然変異が関与していることが
ある。後者の場合は、正常な遺伝子に見られるのと全く
同じ一連の側面配列中の、たった１個の塩基対の変化を
検出することが必要である。
核酸による診断用検査には常に、基本的な３段階が必
要とされる。
（１）試料からのDNAあるいはRNAの単離、およびそれに
続く調製 DNAは、単離後、一般的には機械的な力を用いて剪断
される。穏やかに操作すれば、最大で、約100,000塩基
対までの断片を得ることができる。また、制限酵素とよ
ばれる配列特異的なエンドヌクレアーゼを用いてDNAを
意図的に切断し、特定の大きさの断片を形成させること
もできる。いわゆるサザンブロット分析法がこの例であ
って、この方法では、その後、電気泳動を用いて断片を
その大きさに従って分離し、次いで、ある種のフィルタ
ー、例えば、ニトロセルロースまたはナイロンの膜に固
定化する［イー・エム・サザン（E.M.Southern）：ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第98巻
（1975年）503〜517ページ］。
（２）標識された相補的核酸プローブと標的配列とのハ
イブリッド形成 この段階では、通常、加熱によっては試料を変性さ
せ、標的配列が１本鎖となるようにする。次いで、標識
されたプローブを、標的とハイブリッド形成させる。そ
の後、試料内、あるいは、それを固定化しているフィル
ター内のもう一方の配列に弱く結合したプローブの分子
を洗い流す。特異性を適切に発揮させるには、試料中に
存在する他の配列をプローブとの間で、１個所ないしそ
れ以上の誤対合を含んで形成される可能性がある二重鎖
のそれよりも、プローブ：標的二重鎖の融解温度が、少
なくとも５〜10℃高くなければならない。
（３）試料中のDNAあるいはRNAを対合している標識プロ
ーブ量の測定 プローブを標識するのに用いることができる適当なリ
ポーター指示基としては、3H、32F、または121Iなどの
放射性同位元素、フルオレッセイン、テキサスレッド、
またはフィコビリン蛋白質などの螢光色素、あるいは、
アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース酸化酵素またはグリコースペルオキシダーゼな
どの酵素マーカーがある。
試料核酸をフィルターに固定化する診断用検査法の１
例を、第１図に示す［ファルコウ（Falkow）らによる米
国特許第4,358,535号明細書（1982年）を参照のこ
と］。診断用検査法のためには、フィルターの様式に加
え、他にも、各種の面での方策がある。実例に関して
は、ヘラー（Heller）らによるヨーロッパ特許公開公報
第0 070 685号、およびヨーロッパ特許公開公報第0 707
687号（1983年）、エム・レンツ（M.Rentz）およびシー
・クルツ（C.Kurz）による論文［ニュークレイック・ア
シズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第12巻（1984
年）、3,435〜3,444ページ］、ジェイ・エル・ルース
（J.L.Ruth）による国際公開番号WO84/03285（1984
年）、およびディー・コーネ（D.Kohne）による国際公
開番号WO84/027721（1984）を参照されたい。
これらの方式においては、検出に用いられるリポータ
ー指示基は、第１図に示す通り、すべてプローブに直接
結合する。これに代えて、間接的な標識方式を用いるこ
ともできる。ピー・コウリスキー（P.Kourlisky）らに
よる英国特許公報第2 019 408号に記載の方法では、ビ
オチンを用いてプローブを標識している。プローブを標
的配列とハイブリッド形成させた後、アビジンなる蛋白
質と共有結合させたβ−ガラクトシダーゼによる酵素複
合体を、試料に加えるのである。
アビジンは、プローブに結合してビオチンの標識と特
異的に、かつ非常に強い親和力で結合する。次いで、β
−ガラクトシダーゼに対する適当な基質を与えて加水分
解すると、螢光あるいは着色生成物が形成され、これを
用いて、プローブ：標的配列二重鎖を検出する。
ビオチン−アビジンによるプローブ系は、ウォード
（Ward）らによるヨーロッパー特許公開公報第0 063 87
9号（1982年）、およびエンゲルハルト（Engelhardt）
らによるヨーロッパ特許公開公報第0 097 373号（1984
年）にも記載されている。より新しくは、キャリコー
（Carrico）によるヨーロッパ特許公開公報第0 209 702
号（1987年）に、RNA:DNA二重鎖に特異的に結合する抗
体を用いて、RNA鎖とDNA鎖との間にプローブ：標的配列
二重鎖を形成するという間接標識の方策が記載されてい
る。
上記の従来の技術による方法はすべて、化学量論的、
すなわち単一のハイブリッド形成反応に基づいており、
標的配列は、わずか１個のプローブ分子と結合し、ある
いはこれを捕捉するに過ぎない。
本発明は、新規かつ改良されたハイブリッド形成によ
る検査方法を提供するものであって、標的配列は、一連
の反応を反復することによって、多数のプローブ分子を
捕捉することができる。これは、プローブ：標的配列二
重鎖に取り込まれた標的配列が無傷で遊離し、反応経路
中を繰返し再循環できるようなプローブ開裂反応によっ
て実行される。
発明者らは、このような方法を、触媒的ハイブリッド
形成増幅（CHA）反応と称している。CHA法の一般的な様
式を第２図に示す。このような検査法においては、検出
される指標は、プローブの開裂の結果として生じる。本
方法の感度は、標的配列とプローブとの間の化学量論
的、すなわち1:1の会合に基づくすべての従来のハイブ
リッド形成様式よりも、はるかに高い。
従来の文献に記載されている方法のいくつかでは、ハ
イブリッド形成による検査法にプローブの開裂が含まれ
てはいるが、本発明に不可欠の要素である標的配列の再
循環が除外されている。
例えば、アシハラ（Ashihara）らによるヨーロッパ特
許公開公報第0 142 299号（1985年）には、プローブと
標的配列との間にDNA:DNA二重鎖を形成し、制限酵素を
用いて標的配列を開裂する方法が記載されている。制限
酵素は、二重鎖内の、長さが通常４〜６塩基対である特
定の配列を認識し、プローブと標的鎖の双方を開裂す
る。標的も開裂されることから、反応経路中の再循環が
不可能となる。
DNAにおけるただ１個所の塩基対の変化、すなわち点
突然変異を検出する手順は、マイヤーズ（Myers）らに
よる論文［サイエンス（Science）、第230巻（1985年）
1,242〜1,246ページ］に記載されており、これは、RNA
プローブの開裂に基づいている。標識されたRNAプロー
ブは、まず、標的DNAと対合させられる。次いで、このD
NAとハイブリッド形成したRNAプローブをリボヌクレア
ーゼＡなる酵素を用いて開裂する。過剰な未結合プロー
ブ分子は、完全に減成される。
DNAとの塩基の誤対合が１個所もなく、RNAが完全な二
重鎖を形成している場合は、ハイブリッド形成したRNA
鎖が切断されることはない。塩基対の誤対合が１個所あ
るいはそれ以上存在する場合は、RNAプローブは、酵素
によって切断されることになる。
誤対合部位におけるRNAプローブの開裂は、多数の異
なる手段を用いて検査することができるので、DNA配列
の変化を検出するのに用いられる。リボヌクレアーゼＡ
は、遊離した未対合RNA分子を開裂するのであるから、
開裂された断片が、標的配列と対合したまま存在するこ
とが不可欠である。そのため、標的DNA配列がプローブ
の多数の複写と繰返し反応することは不可能になってし
まう。
同様な特徴をいくつか有する検査法が、ダック（Duc
k）らによって最近発表されている［ヨーロッパ特許公
開公報第0 227 976号（1987年）］。この事例では、ま
ず、プローブが標的配列との二重鎖として結合されてい
る場合は、これを開裂しないある種の酵素を用い、過剰
な未対合プローブを洗い流してしまう。次いで、標的配
列と対合しているプローブの残存分子を検出する検査法
を実施する。過剰な未対合プローブ分子を、最初に減成
することが不可欠であるから、標的配列は、本発明のよ
うな反応の間に代謝回転し、反復的に反応することはで
きない。
ハル・ベアリー（Hull Vary）らによるヨーロッパ特
許公開公報第0 200057号（1986年）には、標的配列とプ
ローブとのハイブリッド形成によって、プローブに結合
した第３のポリヌクレオチドを置換するという方式が記
載されている。ハイブリッド形成反応の終了時に、置換
されたポリヌクレオチドをモノヌクレオチドに減成し、
これを検出するのである。
この方式においても、やはり、標的配列の分子のそれ
ぞれが、わずか１個のプローブの複写とハイブリッド形
成するに過ぎないので、標的配列の再循環は起こり得な
い。
核酸のハイブリッド形成速度を高める方法が、ザポル
スキー（Zapolski）らによる国際公開番号WO 85/05685
（1985年）に記載されている。この方法によれば、レッ
クＡ（RecA）なる酵素、および、１本鎖DNAに結合する
蛋白質を用いて、プローブの標的配列とのハイブリッド
形成を促進する。この方法は、ハイブリッド形成の速度
を高めはするが、反応は、依然として、化学量論的であ
って、標的の分子とプローブ分子の1:1の結合が必要で
ある。本発明におけるような、プローブの多数の複写を
捕捉できる標的配列の代謝回転は起こらない。
上記の従来の技術は、プローブを標識し、ハイブリッ
ド形成反応を実行し、かつ指標の検出を促進するための
多数の異なる方策の代表例に過ぎない。しかし、核酸ハ
イブリッド形成による検査方式であって広汎に利用され
ているものは、依然として皆無である。
既存の方法は、数多くの臨床的用途に供するには適正
な感度が不足しており、また、臨床的研究室で定型的に
実施するには困難な、複雑な検査手順がしばしば必要と
なる。従来の方式には、すべて、プローブと標的配列と
の化学量論的な、すなわち単一のハイブリッド形成が関
与しており、標的分子はそれぞれわずか１個のプローブ
分子を捕捉できるに過ぎない。本発明は、このような構
想とは根本的に袂を分かつものである。
本発明の主目的は、改良されたハイブリッド形成によ
る検査方法を提供することにあり、標的配列を、標識さ
れた相補的核酸プローブの開裂における触媒的な補因子
として利用するものである。反応経路中の標的配列の再
循環によって、多数のプローブ分子の捕捉が可能とな
り、その結果、検査法の感度の大幅な増大がもたらされ
る。
また、本発明は、診断用試験に有用な、いわゆる触媒
的ハイブリッド形成増幅（CHA）反応に適した様式、試
薬、および検査条件の提供も目的としている。
図面の簡単な説明 第１図は、標的配列と標識された相補的核酸プローブ
との間の化学量論的（1:1）複合体の形成に基づく標的D
AN配列の検出に用いられる、ハイブリッド形成による標
準的な検査法の模式的に示す図である。この例では、試
料DNAは、フィルター形式の支持体に固定化されてい
る。
第２図は、特定のDNA配列の検出に用いられるCHA法の
実施の説明図である。標的DNA配列は、標識された相補
的核酸プローブの開裂に対する触媒的補因子として働
く。反応の際の標的配列の反復的再循環（点線の矢印）
によって、プローブと標的配列との化学量論的な、すな
わち単一のハイブリッド形成に基づく標準的な検査方式
として、より大幅な指標の増幅、および感度の増大がも
たらされる。
第３図は、支持体に取り付けられた相補的標識プロー
ブの開裂が、リボヌクレアーゼＨを介して行われる、固
形支持体によるCHA法を説明する図である。
第4A図乃至第4B図は、２種類のCHA反応が連動して、
指標の指数関数的な増幅を生起させるハイブリッド形成
検出方式を説明する図である。
第5A図乃至第5C図は、CHA法を用いて特定のRNA配列を
検出するための競合的検査法の利用の説明図である。
発明の要約 本発明の触媒的ハイブリッド形成増幅（CHA）は、診
断用検査法として有用な、新規かつ改良された核酸ハイ
ブリッド形成方法を提供する。標的配列は、従来のすべ
ての検査方式におけるような、プローブの化学量論的
（1:1）ハイブリッド形成に基づいて検出されるのでは
ない。
本発明は、標的とハイブリッドを形成した相補的標識
プローブを開裂させる触媒反応に対する高度に特異的な
補因子として働く標的核酸配列に関する。標的配列と対
合していないプローブ分子は切断されない。標識プロー
ブ：標的配列二重鎖を形成する標識プローブの開裂の際
に、標的配列は無傷で遊離し、反応経路中を反復的に循
環することができる。
このような検査法においては、プローブの開裂が指標
を生成し、これが検出される。標的配列の各分子が、プ
ローブの多数の複写を捕捉できることから、この方法の
感度の大幅な向上がもたらされる。臨床的診断試験にお
ける使用に適した、簡単な検査手順によるCHA法の好適
実施例がいくつかに示されている。これらの方法の適用
としては、伝染病、遺伝的欠陥、および癌の診断があげ
られるが、これに限定されるわけではない。１個所の点
突然変異、およびより長い独自的配列の双方が、ともに
検出可能である。
発明の詳細な説明 本発明の触媒的ハイブリッド形成増幅は、これが、非
化学量論的なハイブリッド形成法の最初の実例であると
ころに独自性がある。このような方式においては、標的
配列（DNA、RNAのいずれも）は、標識された相補的核酸
プローブを開裂させる触媒反応の補因子として働く。CH
A法の一般的な様式を第２図に示す。
工程の第１段階においては、塩基対合の常套的手段を
用いて、標的配列をプローブとハイブリッド形成させ
る。
標的配列と対合させた後で、プローブを、２本あるい
はそれ以上の小さな断片に開裂する。開裂反応は、酵素
を触媒として行うことも、あるいは、他の化学的手段を
用いて生起させることもできる。
標的配列とハイブリッド形成したプローブの分子だけ
が開裂される。標的配列とハイブリッド形成しなかった
過剰のプローブ分子は切断されない。開裂反応によって
生成された、より低分子のプローブ断片は、親分子より
も不安定な二重鎖を標的配列とともに形成するので、CH
A反応の条件下では、標的配列から解離する。
解離を急速に生起させるには、より低分子の断片で形
成された二重鎖の遊解温度を、通常、反応温度よりも10
℃あるいはそれ以上低くしなければならない。約15〜約
30ヌクレオチド長の短いオリゴヌクレオチドでは、プロ
ーブ配列中央の近傍で１回開裂した後に解離が起こる。
より長いプローブは、数千ヌクレオチド長に達すること
もあり、何回かの開裂を行って、約35ヌクレオチド長未
満の、好ましくは約10〜約20ヌクレオチド長の更に短い
断片を形成させる必要がある。
標的配列は、反応の際に開裂されてはならない。この
配列は、プローブ：標的配列二重鎖から無傷で遊離さ
れ、反応経路中を反復的に再循環する。CHA反応の終了
時には、プローブ開裂の度合いを測定する。これには一
般に、リポーター指示基の標識を担ったプローブ断片
を、無傷な分子から分離する必要がある。
標的配列の存在の指標となるのはプローブの開裂であ
る。標的配列の代謝回転が、分子がそれぞれプローブの
多数の複写を捕捉し、かつその開裂を促進することを可
能にして、この方法の感度を大幅に増大させる。以下、
CHA法の好適実施例をいくつか記述する。
DNA配列の検出に適用される本発明の主な好適実施例
においては、開裂反応は、リボヌクレアーゼＨなる酵素
によって触媒され、標的DNA配列が相補的なRNAプローブ
と対合して、RNA:DNA二重鎖を形成している場合にの
み、これが行われる。リボヌクレアーゼＨは非常に特異
的であって、標的DNA配列と対合していない遊離したプ
ローブ分子を切断することはなく、標的DNA配列を開裂
することもない。
従って、プローブの開裂に際して、標的配列は無傷で
遊離し、第２図に概略を示す通り、反応経路中を繰返し
循環することができるのである。CHA法のこの好適実施
例に関する構成要素（プローブ、標識等々）、手順、お
よび条件の詳細は、次の通りである。
本発明に用いることができるプローブは、約15〜約50
ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドから、それより長
い、数千ヌクレオチド長に達するようなポリヌクレオチ
ドまでの範囲のものである。
約15ヌクレオチド残基からなるプローブは、背景とな
るヒトDNAと区別して、相補的な標的配列（例えば、独
自のウイルス配列）と選択的にハイブリッドを形成させ
るのに用いることができる最短の配列である［シー・エ
イ・トーマス・ジュニア（C.A.Thomas,Jr）：プレグレ
ス・イン・ニュークレイック・アシド・リサーチ・アン
ド・モレキュラー・バイオロジー（Progr.Nucleic Acid
Res.Molecul.Biol.）、第５巻（1966年）315ページ参
照］。
高度な特異性を確保するには、少なくとも20〜約25ヌ
クレオチド長の配列を用いなければならないことの方が
多い。約25残基までの短いオリゴヌクレオチドに対して
は、ただ１個のリポーター指示基を用い、核酸鎖の５′
−あるいは３′−末端のいずれかの近傍を標識するのが
一般的である。
これにより長い配列に対しては、ほぼ15ヌクレオチド
残基につき、１リポーター指示基までの密度で標識する
ことができる。プローブの構成は、その全体をRNAとす
ることが可能である。これに代えて、チボヌクレアーゼ
Ｈによって開裂されない１個あるいはそれ以上の散在す
る配列をプローブに含有させることもできる。リボヌク
レアーゼＨによって開裂されないこのような配列は、DN
A、あるいは、この酵素による開裂を防ぐように、燐酸
基または糖の部分のいずれかを修飾したRNAを用いて、
これを構成することが可能である。
燐酸基の適切な修飾形態としては、アルキルまたはア
リール燐酸トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン
酸アルキルまたはアリール、ホスホラミド酸アルキルま
たはアリール、隣チオ酸塩、隣セレン酸塩などがある
が、これに限られるわけではない。リボヌクレアーゼＨ
による開裂を防ぐためのリボース糖の好適な修飾は、
２′−ヒドロキシル基のアルキルまたは芳香族エーテル
への転化である。リボヌクレアーゼＨに認識されるため
には、開裂可能なRNA配列は、長さが少なくとも３残基
でなければならない。
リボヌクレアーゼＨによって開裂されない散在する配
列を含有するプローブは、この酸素の活性を特定の領域
に集中させるので、好適である。全体がRNAで構成され
た26残基の長さのオリゴヌクレオチドを、プローブとし
て用いた場合は、非生産的な開裂、すなわち、標的配列
を遊離するに至らない開裂が、多くの部位で生じてしま
う。
例えば、23〜24残基の長さのヌクレオチド鎖が開裂さ
れる結果、長さが23残基の断片１個、および、わずか３
残基の第２の断片を生じることになる。このトリヌクレ
オチドは、標的配列から非常に急速に解離するが、23量
体の方は、親分子が形成するのとほとんど同程度に安定
な二重鎖を標的配列と形成し、それ故、遊離されること
がない。
これに代えて、仮に、オリゴヌクレオチドがDNA11RNA
4DNA11なる配列であるような場合、開裂は中央のRNA4残
基に限定されることになる。このようにして生成される
最長断片の長さは、15残基となるはずである。この断片
のTmは、親化合物である26量体のそれよりも約20〜25℃
低くなり（Ｉ式参照）、CHA反応の条件下で容易に標的
配列から解離する。このようにして、プローブが開裂さ
れる都度、標的配列は遊離し、反応経路中で再循環する
ことが可能となる。
純粋なRNAオリゴヌクレオチドをプローブとする場
合、標的配列を遊離するには、プローブの開裂が、２回
あるいはそれ以上必要となることがある。それより長い
プローブにおいて、リボヌクレアーゼＨを用いた開裂に
よって標的配列から生じる断片を急速に遊離させるに
は、散在する開裂不能な配列は、約35ヌクレオチド長未
満、好ましくは10〜20ヌクレオチド長でなければならな
い。
DNA−RNA−DNAの混成オリゴヌクレオチドによるプロ
ーブは、ある種の遺伝的疾患、例えば鎌状赤血球症の診
断に必要な点突然変異の検出には、特に有用である。こ
こで、正常な標的配列と完全な二重鎖を形成するプロー
ブ、および、変異遺伝子を用いた１個所の塩基の誤対合
を有する二重鎖について考察してみる。
DNA側面配列が含まれるプローブ全体には、通常は、
ハイブリッド形成によって得られる標的配列に対する特
異性がある。誤差対合が配列の中央付近に存在する比較
的短いオリゴヌクレオチドのプローブを用いると、２本
のらせん間の安定性の差を最大にすることができる。し
かし、このような場合でさえ、正常配列を用いて形成さ
れる完全な二重鎖の融解温度は、誤対合が含まれる変異
配列を用いて形成される二重鎖よりも、約５〜10℃上回
るに過ぎない。
このようなわずかな差異に基づき、第１図に示したよ
うな標準的なハイブリッド形成の図式を用いて、変異配
列から正常な配列を認識することは不可能ではないもの
の、この方法の信頼性は、定型的な診断に用いるのに充
分であるとは言えない。しかし、CHA反応の様式には、
これら２配列を容易に区別することを可能にする程に高
い水準の特異性を発揮する余地がある。
上記の通り、リボヌクレアーゼＨによるDNA−RNA−DN
Aなるプローブの開裂は、RNA配列の中央部に限定されて
いる。
RNA配列が４〜５残基の長さであれば、リボヌクレア
ーゼＨによるRNA鎖の開裂を防ぐには、１個所の塩基対
の誤対合がRNA:DNA二重鎖の構造を混乱させるだけで充
分である。
したがって、プローブは、正常な標的配列と対合した
場合には開裂されるが、変異配列と対合した場合には開
裂されない。正常な標的配列だけが、プローブの開裂の
ための触媒的補因子として働くことになる。中央部のRN
A配列の長さが６〜８残基である場合は、リボヌクレア
ーゼＨによる開裂を防ぐのに充分な程度に二重鎖構造を
乱すには、二重鎖のRNA:DNAの部分に、２個所の誤対合
が必要である。正常な配列中には、１個所に誤対合が存
在し、変異配列には、２個所の誤対合が存在するよう
な、例えば、式 ［式中、dN（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）は、デオキシリ
ボヌクレオチド（DNA）を、rNはリボヌクレオチド（RN
A）を意味し、＊は不適正塩基対を表す。］ で示されるプローブを用いて、これを行うことができ
る。
プローブ自体は、分子生物学および合成手法の双方を
用いて、これを作り出すことができる。60ヌクレオチド
長以上の長いプローブは、一般に、酵素的手法を用い
て、これを合成し、かつ標識することができる。
SP6、あるいはT7なるRNA重合酵素のいずれかを用いれ
ば、DNAの鋳型から長いRNA断片を合成することができ
る。オリゴヌクレオチドの合成には、化学的方法を用い
るのが一般的である。「オリゴヌクレオチド合成：実践
的アプローチ（Oligonucleotide Synthesis:A Practica
l Approach）」［エム・ジェイ・ゲイト（M.J.Gait）
編、イギリス国オックスフォードに所在のアイアールエ
ル・プレス（IRL Press）1984年発行］を参照のこと。
現在では、ホスホラミダイト法が好適な化学的方法で
ある。固形支持体、例えばポリスチレンまたはガラスビ
ーズに固着させた、あるいは溶液中に遊離したオリゴヌ
クレオチドの成長を利用して、その合成を行うこともで
きる。DNA、RNA、およびDNA−RNA−DNAなるオリゴヌク
レオチドは、これらの方式を用いて調製できる。更に、
T4RNAリガーゼなる酵素を用いれば、DNA、RNA、およびD
NA−RNA混在分子をいかなる組合わせで結び付けること
も可能である。本発明に有用なプローブの合成には、上
記の手法のいずれをも用いることができる。
放射性同位元素、螢光担体、発光担体（化学発光性、
あるいは生物発光性の基質）、および酵素は、すべて、
触媒的ハイブリッド形成増幅系におけるリポーター指示
基として用いることができる。この系が、ほとんどの場
合、実際に検出操作を行う前に大規模な増幅応答を生起
させるという事実は、用いられるリポーター指示基の感
度の必要性を著しく減少させるものである。単に感度が
最も高いからというばかりでなく、検査方式に便利であ
るから、すなわち、それが検査の様式（自動化器具によ
るか手動操作によるか）に良く適合するという理由か
ら、リポーター指示薬を選択することが可能となる。
例えば、32P、14C、125I、および3Hなどの放射性同位
元素は、分子生物学的手法を用いて、これを合成中、あ
るいはその完了後に、DNAプローブ、およびRNAプローブ
に容易に組み込むことができる。化学的に合成されたプ
ローブもまた、放射性同位元素を用いてこれを認識する
ことができる。放射能標識化は、実験的あるいは研究的
な目的にはある種の利点があるが、臨床研究室における
新規の試験および検査の目的には、適切な方法であると
は思われず、好適ではない。
同位元素によらない認識として選択されるものとして
は、（１）螢光担体、例えば、フルオレッセイン、テキ
サスレッド（Texas Red）、ルシファーイェロー（Lucif
er Yellow）、ピレン、ランタノイドキレート化物、お
よびフィコビリン蛋白質、その他多数、（２）発光担
体、例えば、ルミノール、およびその誘導体、および、
（３）酸素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペルオ
キシダーゼ、β−カラクトシダーゼ、およびルシフェラ
ーゼ、その他多数がある。
これらの多様な酵素を用いることによって、発色反応
（アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、）螢
光生成物（アルカリ性ホスファターゼ）、および化学的
発光（ルシフェラーゼ）を生起させることができる。
螢光担体および発光担体は、各種手法を用いて、これ
をRNA配列、およびDNA配列に共有結合で取り付けること
ができる。３′−末端のヌクレオチドがリボース残基で
ある核酸プローブの場合は、過ヨウ素酸塩を用いて、配
列の３′−末端ヌクレオチドのリボースジオールを酸化
して、反応性に富むジアルデヒドを形成することができ
る。こうすれば、還元的アルキル化反応を行うことが可
能となり、ジアルデヒドは、第一アミノ基を含有する各
種螢光性誘導体［ダンシルエチレンジアミン、Ｎ−（１
−ピレンスルホニル）エチレンジアミン、５−［（２−
アミノエチル）チオウリジル］−フルオレッセイン等
々］とともにシッフ塩基を形成することができる。
また、ルミノールおよびその他の発光担体の第一アミ
ン誘導体をカップリングさせることもできる。シッフ塩
基のアダクトは、水素化オフ素ナトリウム、あるいは水
素化シアノホウ素ナトリウムを用いて還元され、安定な
第二アミン結合を形成することができる。
また、ヒドラジン基を含有する螢光性誘導体（フルオ
レッセインチオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラ
ジド、クマリンヒドラジド、ルシファーイェローヒドラ
ジドCH等々）を過ヨウ素酸の酸化によって生じる末端ア
ルデヒドとカップリングさせることも可能である［オー
・ダブリュー・オドム・ジュニア（O.W.Odom,Jr.）ら：
バイオケミストリー（Biochemistry）、第19巻（1980
年）5,947〜5,954ページ参照］。
合成オリゴヌクレオチドの場合、脂肪族第一アミノ基
を、幾通りかの方法で、その５′−末端に容易に組み込
むことができる（一般に、オリゴヌクレオチドは、鎖の
３′−末端から５′−末端への合成される。）。
最終残基として、特別に保護された５′−アミノ−
５′−デオキシチミジンのホスホラミダイト誘導体を組
み込むことができる［エル・エム・スミス（L.M.Smit
h）ら：ニュークレイック・アシズ・リサーチ、第13巻
（1985年）2,399〜2,412ページ］。また、この特別なホ
スホラミダイト誘導体を経由して、第一アミンをオリゴ
ヌクレオチドに組み込むこともでき、この誘導体もま
た、合成手順の最後の段階で付加することができる。
このような２種類の誘導体の一つは、アプライド・バ
イオシステムズ社（Applied Biosystems,Inc.）から
［商品名：アミノリンク１番（Aminolink1、部品番号第
400498番］、また、他種は、ケムジーンズ社（ChemGene
s,Inc.）から購入可能であるが、これらにおいては、ア
ミノ基はモノメトキシトリチル基で保護されている。
第一アミンをオリゴヌクレオチドに組み込みさえすれ
ば、多数のアミン選択的螢光性誘導体（フレオレッセイ
ン−５−イソチオシアナート、テキサスレッド、スクシ
ンイミジル−１−ピレンブチラート等々）を、穏やかな
条件下で、第一アミン基にカップリングすることが容易
に可能となる。螢光性ランタノイド（ユウロピウム、テ
ルビウム等々）は、初めに第一アミンをジエチレントリ
アミン五酢酸無水物と反応させて、ランタノイドを結合
させるためのキレート化剤を生成することによって、こ
れをオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。
特に関心の持たれる酵素標識としては、アルカリ性ホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコース酸化酵素、細菌性（FMN/NADPH）ルシフ
ェラーゼ、および昆虫性（ATP）ルシフェラーゼ、その
他多数がある。その他の標識としては、ミクロペルオキ
シダーゼ、官能化されたヘム誘導体、およびその他の触
媒活性を有する金属キレートがある。
螢光性誘導体に関して上記で考察したのと同様の手順
を用いて、酵素を、RNA、DNA、およびRNA−DNA混合のプ
ローブに組み込むことができる。例えば、アルカリ性ホ
スファターゼは下記のようにして、５′−末端、第一ア
ミンを含むオリゴヌクレオチドのプローブに組み込むこ
とができる。第一アミンを含むオリゴヌクレオチドを、
過剰のスベリン酸ジスクシンイミジル（DSS:穏やかな条
件下で、第一アミンをカップリングさせるのに用いられ
る非常に特異的な試薬）なる二価性試薬と反応させて、
オリゴヌクレオチドとのモノアダクトを生成する。DSS
−オリゴヌクレオチドのモノアダクトは、容易にこれを
精製することができる。
次いで、DSS−オリゴヌクレオチドのモノアダクト
を、穏やかな条件下でアルカリ性ホスファターゼと反応
させる。ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー
を用いて、最終生成物である「アルカリ性ホスファター
ゼ−DSS−５′−オリゴヌクレオチド」を精製する。こ
のカップリングの手順の詳細は、イー・ヤブロンスキー
（E.Jablonski）らの論文［ニュークレイック・アシズ
・リサーチ、第14巻（1986年）6,115〜6,128ページ］に
記載されており、参照用として、本明細書に組み込まれ
る。
このCHA法の最初の好適実施例においては、プローブ
が標的配列とハイブリッド形成した後のその開裂を、リ
ボヌクレアーゼＨに触媒させている。この酵素は非常に
特異的であって、これは、RNA:DNA二重鎖中のRNA鎖だけ
を開裂するRNA分解酵素なのである。この酵素は、真核
細胞と細菌の双方から得られている。本実施例では大腸
菌のリボヌクレアーゼＨを用いているが、これは、分子
量が約17,500の単一のポリペプチド鎖である。この酵素
は、非常に安定であって、その蛋白質の遺伝子は、クロ
ーン化されて配列も決定されており、更に、この酵素を
大量に生成する過剰産生菌株が確立されている［カナヤ
（Kanaya）およびアール・ジェイ・クラウチ（R.J.Crou
ch）：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、第258巻（1983年）1,276〜1,281
ページ］。このような理由から、その使用は一般に好適
である。
約50℃以上の温度で行われるCHA反応に用いるには、
この酵素の更に温度に安定な形態が望ましい。酵素のこ
のような変種は、これを好熱性の生物から単離し、ある
いは、組換えDNAの手法を用いた（例えば、適当な位置
でのジスルフィド結合の架橋形成による）大腸菌リボヌ
クレアーゼＨに対する突然変異誘発によって生成させる
ことができる。
CHA反応の実行に最適の温度は、プローブ：標的二重
鎖の融解温度より約５℃〜約25℃下回るのが一般的であ
る。
このようにすれば、ハイブリッド形成が急速に行わ
れ、標的配列に対する高度の特異性が得られる。例え
ば、Ｇ−Ｃ断片が50％含まれる長さ26残基のDNA−RNA−
DNAプローブを想定すると、塩濃度が0.1モルの場合、式
（Ｉ）に従って予測されるプローブ：標的二重鎖の融解
温度は約55℃である。したがって、CHA反応の温度の上
限は約50℃となる。
配列中央部におけるプローブの開裂によって、それぞ
れ融解温度が約25℃の２本の断片が生じる。上記の通
り、これらの断片が標的配列から急速に解離するには、
CHA反応の温度は、この値よりも少なくとも10℃高くな
ければならない。すなわち35℃と等しいか、あるいはそ
れ以上でなければならない。したがって、これをプロー
ブに用いるCHA反応の最適温度範囲は、約35〜約50℃で
ある。
CHA反応の継続時間は、通常、約15分ないし約１時間
である。一般的には、プローブの長さと配列、および特
定の反応条件に応じて、この期間内に、100〜1,000回の
標的配列の各分子の代謝回転が行われる（実施例１参
照）。
検査試料中に存在する標的配列の複写のそれぞれに対
して、標識プローブの100〜1,000分子が、リボヌクレア
ーゼＨによって開裂されることになる。このように増幅
度が大きいために、化学量論的なハイブリッド形成様式
に基づく検査法と比較して、はるかに高い感度がもたら
される。CHA反応を更に長く進行させることによって、
更に高い増幅度を実現することが可能である。
CHA反応の際には、非特異的ヌクレアーゼによる、標
的配列のみならず、プローブの開裂をも抑止することが
必要である。このことは、標準的なハイブリッド形成様
式に基づく検査法においても重要である。通常、このよ
うなヌクレアーゼは、加熱または抽出操作によるDNAの
単離の間に試料から除去される。
バナジウム酸塩、インヒビット・エース［Inhibit−A
CE:ファイブプライム・スリープライム社（5Prime−3Pr
ime,Inc.）製の商品名］、およびリボヌクレアジン（胎
盤蛋白質の一種）など、１本鎖リボヌクレアーゼ阻害剤
の多くは、リボヌクレアーゼＨ活性に影響を及ぼすこと
がない。更に、プローブを非特異的減成から保護するた
めには、CHA反応の際にこのような阻害剤を混入させる
ことが望ましい。
CHA反応に続いて、プローブの開裂度の測定が必要と
なる。これは通常、残存する未開裂のプローブ分子から
標識を担う開裂生成物を分離することによって行われ
る。このような分離に用いる方法としては、 （１）CHA反応生成物に電気泳動を施し、大きさに基づ
いて、無傷なプローブから開裂断片を分離する、 （２）強酸、例えばトリクロロ酢酸を用いて、相対的に
高分子の未開裂標識プローブを、より低分子の開裂断片
から選択的に沈澱させる、 （３）リポーター指示基に加えて、高親和性標識をプロ
ーブに組み込み、CHA反応後に、親和性支持体を用いて
未開裂プローブの分離ができるようにする、 （４）CHA反応の実行後に、相補的なポリヌクレオチド
配列を含有する支持材を用いて未開裂標識プローブを固
定化し、開裂断片を溶液中に残す、 などの方法があるが、これらに限定されるわけではな
い。
（１）の分離法においては、ゲルを基質として、CHA
反応生成物に対する電気泳動を施し、標識を有する開裂
生成物を無傷なプローブから分離する。より低分子の断
片は、より高分子の無傷な分子よりも急速にゲル中を移
動する。約100ヌクレオチド長までのプローブに対して
は、ポリアクリルアミドのゲルが一般に用いられる。そ
れより長いプローブに対しては、ポリアクリルアミド、
アガロース、あるいはこの２成分からなる混成ゲルが概
して好適である。
分離完了後は、リポーター支持基の標識を担う断片、
および本来のプローブは別々の帯域に分離され、容易に
それらを特定し、かつ定量することができる。
（２）の分離法は、強酸による沈澱が必要であり、主
として、放射性同位元素または螢光物質の標識のいずれ
かを含む（約50ヌクレオチドを越える長さの）長いプロ
ーブを、CHA法を通じて多数の（10ヌクレオチド長未満
の）比較的低分子の標識断片へと開裂するような状況に
用いられる。溶液中への強酸（トリクロロ酢酸など）の
混入は、無傷なプローブを沈澱させるが、より低分子の
開裂断片は、溶液中に残っている。
この溶液に遠心分離を施し、あるいはこれを濾過すれ
ば、沈澱を除去することができる。このようにして、開
裂された標識断片を含有する上清を定量することができ
る。この方法に関する更に詳細な考察は、後述の実施例
１において行う。
（３）の分離方法は、高親和性の基とリポーター支持
基の双方を用いて標識されたプローブを必要とし、分離
操作を行うには親和性支持体を用いる。この場合に用い
られるプローブは、RNA配列であることも、あるいは、
リボヌクレアーゼＨによって開裂されない部分が散在す
る配列、例えばDNA−RNA−DNA混合配列であることも可
能である。プローブは、その一方の末端、あるいはその
近傍に親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン、レク
チン、ハプテン、あるいは抗体など）が組み込まれるよ
うに設計される。反対側の末端の部位、あるいはその近
傍には、リポーター指示基による標識（酵素、螢光担
体、発光担体、あるいは放射性同位元素）を組み込む。
長鎖ポリヌクレオチドのプローブを用いれば、散在する
多数またはすべての、リボヌクレアーゼＨによって開裂
されない配列を、リポーター支持基で標識することがで
きる。
このようにして、プローブ配列の開裂可能な部位は、
親和性の基とリポーター指示基との間に位置することに
なる。２個所の標識の間には、最小限約15ヌクレオチド
が必要であり、20〜50ヌクレオチドであれば更に理想的
である。上記に考察したリポーター指示基の標識を、プ
ローブに組み込むのと同じ方法が、親和性標識の取り付
けにも用いられる。
この分離操作においてはまた、プローブに組み込まれ
た親和性標識に対応して、これと特異的かつ強力に結合
する親和性の基を含有する支持材を備える必要もある。
例えば、親和性標識として、ビオチンがプローブに組み
込まれる場合は、適合する親和性支持材にはアビジン、
あるいはストレプタビジンが含まれていなければならな
い。共有結合によってアビジンを含有する、例えばガラ
スビーズ、ラテックスビーズ、架橋結合したデキストラ
ン（商品名：セファロース）ビーズ等々、多数の支持材
が市販品として入手可能である。
CHA反応を実行した後、支持材を試料に加える。無傷
なプローブ分子は、支持体に強固に結合する。リポータ
ー指示基を有するが、親和性標識は含まない開裂された
断片は、溶液中に残存し、これを定量することができ
る。
（４）の分離手段は、直前に述べた方法と大筋では酷
似しているが、CHA反応の際に開裂されなかったプロー
ブ中の核酸配列が、親和性標識として用いられる。相補
的な核酸配列を固形支持体に結合させ、捕捉用配列とし
て働かせる。
CHA反応の際のプローブの開裂が、リボヌクレアーゼ
Ｈを介して行われる場合は、親和性標識の役割を果たす
配列を、DNA、あるいは、リボヌクレアーゼＨによる開
裂を防ぐように、糖または燐酸が修飾されたRNA配列と
することができる。CHA反応の際に、リボヌクレアーゼ
Ｈによって開裂されるプローブの部分、例えば、５′−
DNA−RNA−DNA−（リポーター指示基）によって、親和
性標識配列は、リポーター指示基から分離される。この
例では、プローブの５′−末端のDNA配列、あるいはそ
の一部が親和性標識として働くのである。
20〜50ヌクレオチド長の親和性標識配列が最も理想的
であるが、それより長い配列を用いることもできる。15
ヌクレオチド長未満の配列は、最も有用性が少ない。親
和性標識配列の一部は、標的配列と相補的であるか、プ
ローブに固着した独立の分枝であることができる。
一般化された補足用配列を、その後に用いることがで
きるので、後者の方が好適である。この場合、１組の捕
捉用ビーズを、標的に特異的な多数の異なるプローブに
対して用いることができる。
捕捉用配列を固形支持体に取り付けるには、多数の異
なる化学的方法を用いることができる。その実例につい
ては、ピー・ティー・ジラム（P.T.Gilham）の論文［エ
ル・グロスマン（L.G6rossman）およびケイ・モルデイ
ブ（K.Moldave編、米国ニューヨークに所在のアカデミ
ック・プレス（Academic Press）1971年発行のメソッズ
・オブ・エンザイモロジー（Methods of Enzymolog
y）、第21巻、191〜197ページ］、エイチ・ポツザク
（H.Potzak）およびピー・ディー・ジー・ディーン（P.
D.G.Dean）の論文［ニュークレイック・アシズ・リサー
チ、第５巻（1978年）297〜303ページ］、ディー・エル
・ロバートソン（D.L.Robertson）およびエヌ・デイビ
ッドソン（N.Davidson）の論文［バイオケミストリー、
第11巻（1972年）533〜537ページ］、および、エル・ジ
ー・モス（L.G.Moss）らの論文［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、第256巻（1981年）12,65
5〜12,658ページ］を参照のこと。
捕捉用配列を固形支持体上に直接合成し、これを、そ
の後の検査の際に用いることも可能である。前述の通
り、オリゴヌクレオチドは一般に、ヌクレオチド鎖の
３′−末端から５′−末端へと合成される。固形支持体
上で合成を行う場合は、一般に、３′−末端の先頭のヌ
クレオチドを、その３′−ヒドロキシル基におけるエス
テル結合によって支持体を取り付ける。ヌクレオチド塩
基上の保護基を除去するのに必要な条件（濃アンモニア
による55℃で６〜10時間の処理）の下で、この結合は、
容易に開裂される。
オリゴヌクレオチドが支持体に結合したままである場
合は、３′−ヒドロキシル基との結合を、このような条
件下では開裂されないものに変えなければならない。
３′−ヒドロキシル基の取り付けに用いることができる
適当な官能基としては、エーテル結合、燐酸トリエステ
ル、燐酸ジエステル、および芳香族カルバミン酸エステ
ルがある。合成を簡素化するのに好適な官能基は、β−
シアノエチル燐酸トリエステルである。
取り付けは、遊離ヒドロキシル基を含有する固形支持
体に対する先頭のヌクレオチドの３′−β−シアノエチ
ル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト誘導体（４
種類の塩基のすべてに対して市販品が入手可能である）
の反応によって行われる。
このような支持体は、ガラス、ポリスチレン、ラテッ
クス、あるいは架橋結合したデキストラン（商品名：セ
ファロース）のビーズ、セルロース、あるいは、ナイロ
ンまたはテフロンの膜など、各種の材料から作成するこ
とができる。
先頭のヌクレオチドを支持体に固着させた後は、通常
のホスホラミダイト法を用いて、残りのヌクレオチドを
合成する。合成が最盛期に達すると、脱ブロック操作を
用いて、β−シアノエチル燐酸トリエステルを燐酸ジエ
ステルに転化し、この間に、オリゴヌクレオチドは支持
体に結合されて残る。
上記の方法のいずかによって支持材を作成した後、所
望の場合には、多数の異なる酵素的方法を用いて、固着
したオリゴヌクレオチドを伸長させることができ、これ
によって、支持体に結合した更に長いヌクレオチド配列
が得られる。これに適した手法としては、DNA重合酵
素、または末端転移酵素を用いたヌクレオチド残基の断
片への付加、および、支持体に固着した先頭配列に対す
るDNAまたはRNAリガーゼを用いたポリヌクレオチドの連
結反応などがあるが、これらに限られるわけではない。
前記４種類の分離方法のいずれにおいても、最初に、
溶液中でCHA反応を行う。これに代えて、標識プローブ
を固形支持体に取り付けることもできるが、その場合
は、CHA反応の際のプローブの開裂によって、リポータ
ー指示基を有する断片が溶液中に遊離される（第３図参
照）。
この方式の主な利点は、CHA反応終了後の分離段階が
比較的容易なことであって、物理的手段、例えば濾過、
あるいは遠心分離などを用いて、残存する無傷のプロー
ブ分子を含む固形支持体は、試料から容易に除去され、
かつ、リポーター指示基を有する開裂断片は溶液中に残
存して、これを定量することが可能である。これに適し
た固形支持体の材料としては、ガラス、ポリスチレン、
ラテックス、あるいは架橋結合したデキストラン（商品
名：セファロース）のビーズ、セルロース、あるいは、
ナイロンまたはテフロンの膜がある。磁化されたビーズ
を用いることもでき、その場合は、磁場を与えることに
よって、ビーズを溶液から分離する。
プローブは、共有結合または非共有結合（例えばビオ
チン−アビジン）のいずれを用いても、固形支持体に取
り付けることができるが、安定性が高いことから、共有
結合の方が好適である。次の段落では、化学的方法、お
よび酵素的方法のいずれかを用いて、ヌクレオチド配列
を固形支持体に共有結合させるのに適した手法を説明す
る。
固形支持体によるCHA法を用いる場合は、初めに、試
料DNAをより低分子の断片に切断し、その結果、標的配
列が容易にビーズの表面に向かって拡散し、結合されて
いるプローブとハイブリッドを形成できるようにするの
が好ましい。
これを行うには、機械的な力を用いたDNAの剪断（例
えば、音波処理）、あるいは、制限酵素を用いた特定の
部位でのDNAの開裂を用いることができる。これに代え
て、試料DNAを鋳型として利用し、DNA重合酵素を用い
て、標的配列を含む低分子の断片を合成することもでき
る。
この手法においては、まず、プライマーとして用いら
れるオリゴヌクレオチドに、標的配列から遡るように
（すなわち５′−末端へと）試料DNAとのハイブリッド
を形成させる。次いで、DNA重合酵素を用いてプライマ
ーを、標的配列を越えるように（相補的な鎖を複写しつ
つ）伸長させる。次いで、５′−プライマー・標的配列
なる生成物にCHA反応を行わせる。
DNA重合酵素を用いて反応を多数回反復し、標的配列
の複写数を増加させることも可能である。そのような手
法は、いわゆる重合酵素連鎖反応として実施される［ケ
イ・ビー・マリス（K.B.Mullis）ら：ヨーロッパ特許公
開公報0 200 362号（1986年）、および、マリス：ヨー
ロッパ特許公開公報第0 201 184号（1986年）］。
標的の増幅、およびCHA法は、検査方法における分離
段階全体を包含するので、両者を組み合わせて用いるこ
とができる。試料中に最初から極度に少ない複写数でし
か存在しない核酸配列を検出するには、このような手法
が有効なことがある。しかし、ほとんどの診断用途に対
しては、CHA法の感度が高いことだけで充分である。
CHA法の利用に関する前記の考察は、すべて、DNA標的
配列の検出を主目的とし行なったが、ある場合には、RN
A標的配列、例えばリボソームRNAの配列を検出する方が
有利なことがある。
逆転写酵素なる酵素を用いて、本来のRNA配列に対す
る相補的DNA（cDNA）の複写を最初に合成すれば、リボ
ヌクレアーゼＨを利用する前記のいかなるCHA反応の手
法を用いても、これを行うことができる。この手法にお
いては、初めに、オリゴデオキシヌクレオチドのプライ
マーを試料RNAと、標的配列から遡るように（すなわち
５′の方へと）ハイブリッド形成させる。逆転写酵素、
および４種類のデオキシリボヌクレオチド三燐酸（Ａ、
Ｇ、Ｔ、およびＣ）の付加によって、プライマーは、標
的RNAのcDNAによる複写を生成しつつ伸長する。このよ
うにして、５′プライマー・cDNA標的配列なる生成物が
CHA反応の基質を形成する。
逆転写酵素の利用に関する手法の更に詳細に記載につ
いては、ティー・マニアティス（T.Maniatis）、イー・
エフ・フリッチ（E.F.Fritsch）、およびジェイ・サム
ブルック（J.Sambrook）著、「分子クローニング：研究
室用マニュアル（Molecular Cloning:ALaboratory Manu
al）」［米国ニューヨークに所在のコールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab
oratory）1982年発行、128〜132ページ］を参照のこ
と。
ここで、標的配列の燐チオ酸誘導体を基質として用
い、制限酵素を用いて相補的標識DNAプローブを開裂す
る、CHA法の第２の実施例について説明する。
制限酵素は、一般に、４〜６ヌクレオチド長の特異的
DNA配列を認識し、その部位で、DNA二重鎖の鎖の双方を
切断する。多数の異なる認識部位について、このような
酵素が数百種類も知られている。
一般に、これらの酵素は、プローブとともに標的配列
も切断してしまい、したがって、これを反応経路中で再
循環させることが不可能となるので、CHA反応にこれを
用いることはできない。しかしながら、DNA二重鎖のう
ち一方の鎖の燐酸基が、通常の燐酸ジエステルではな
く、燐チオ酸ジエステルである場合は、制限酵素の多く
（例えば、Ava I、Ava II、Ban II、Hind II、Nci I、P
st I、およびPvu I）は、修飾されていない鎖だけを開
裂する［ジェイ・ダブリュー・テイラー（J.W.Taylor）
ら：ニュークレイック・アシズ・リサーチ、第13巻（19
85年）8,749〜8,764ページ］。
燐チオ酸の配列は切断されないので、制限酵素を用い
た相補的標識プローブの開裂の対する触媒的補因子とし
て、これを利用することができる。このような検査法に
用いられる標的配列に、制限酵素の認識部位が含まれて
いるのは当然である。
修飾されたDNA配列は、DNA重合酵素を用いてDNAの鋳
型からこれを調製する。試料がRNAである場合は、逆転
写酵素を用いる。これらの反応も、前記のようにして行
うが、正常なデオキシリボヌクレオチド三燐酸の代わり
に、デオキシリボヌクレオチドα−チオ三燐酸を用いる
点が異なる。４種類のデオキシリボヌクレオチドα−チ
オ三燐酸は、すべて市販品として入手可能である。
修飾された標的配列を調製したら、前記のいずれの検
査様式を用いても、CHA反応を行わせることができる。
プローブの合成および標識化にも、同一の方法が適用可
能である。修飾されたDNA配列、あるいはRNA配列は、制
限酵素の認識部位の側方に位置するように、これを、プ
ローブに組み込むことができるが、認識部位自体は、DN
Aで構成しなければならない。
ここに記載のCHA法の各種好適実施例、およびその様
式は、そのすべてにおいて、指標の多大な線形増幅が行
われる。標的配列の濃度は一定のままであるから、反応
速度も不変であり、開裂される標識プローブの分子数
は、時間とともに線形に増加するのである（実施例１参
照）。
上述の通り、代謝回転数、すなわち１標的配列につ
き、１時間ごとに開裂されるプローブ分子の数は、一般
的には100〜1,000の範囲にある。
指数関数的な増幅をもたらし、それ故、感度がはるか
に高くなるような、新規な仕方でCHA反応を行わせるこ
ともまた可能である。一般に、指数関数的な応答は、２
〜３種類のCHA反応を連動させて、標的配列の複写を余
分に生成することによって得られる。
多数の異なる指数関数的CHA反応の様式を設定するこ
とができる。
指数関数的CHA反応様式の１形態を第４図に示す。こ
の場合は、２組のプローブ配列が固形支持体に固定化さ
れている。支持体Ｉ上の第１のプローブ配列には、本来
の標的配列に相補的な開裂可能な配列（Ｔ′）、および
開裂不能な配列（Ｘ）が含まれている。
配列（Ｘ）は、支持体IIに固定化された開裂可能な配
列（Ｘ′）と相補的である。この方法の第１段階では、
試料に由来する標的DNAは、支持体Ｉ上の開裂可能な相
補的配列（Ｔ′）とハイブリッド形成する。標的配列と
ハイブリッド形成するや、（Ｔ′）は切断されて、配列
（Ｘ）をその支持体から遊離させる。次いで、（Ｘ）は
支持体から拡散し、支持体II上の開裂可能な配列
（Ｘ′）とハイブリッド形成する。（Ｘ）は支持体から
遊離されるまでは、これが起こることは不可能である。
配列（Ｘ）および（Ｘ′）は、分離された２個の巨視
的な支持体に固定化されている間は、互いにハイブリッ
ド形成することは不可能である。（Ｘ）と（Ｘ）′との
間に二重鎖が形成されると、（Ｘ′）は開裂される。こ
れによって、標的配列の第２の複写が遊離され、今度
は、これが支持体Ｉと作用し合って、反応を伝播する。
このようにして、CHA反応の１周期の間に標的配列の
複写が２個生成される。第２回目の周期の間には、４個
の標的配列の複写が、また、第３回目には８個が、等々
となる。
図示された配置においては、反応の際に生成された標
的分子のそれぞれに対して、１個のリポーター指示基の
標識が支持体IIから遊離される。支持体IIから遊離され
る遊離標識の量は、次式 Ｌ＝（A/2）×（ekt＋e-kt）−Ａ （II） （式中、Ａは、試料中に存在する標的の開始時の複写
数、ｋは、２種類の別個のCHA反応における代謝回転数
の積の平方根、ｔは、時間をそれぞれ意味する。） で与えられることが分かっている。
この式の最初の項（A/2×ekt）は、急速に支配的にな
る。遊離した標識の量は、時間とともに指数関数的に増
加し、これが、検査法の感度を極度に高めるのである。
CHA反応のそれぞれの代謝回転数が、毎分１に過ぎない
場合でも、標的配列の１個の複写は、溶液に遊離される
認識を、20分以内に、2.4×108個も生起させることにな
る。この数は、単純な螢光性の、あるいは酵素性の標識
基を用いて容易に測定することができる。毎分１を大き
く上回る代謝回転数を得ることも可能である（実施例１
参照）。
このように、連動するCHA検査系では、わずか数分間
という反応時間で、１個の複写標的を検出する能力がも
たらされる。
最後に、CHA法に基づくRNA標的配列検出のための競合
的検査法について説明する。
この場合は、DNA分子と標識されたプローブとの双方
を、分析すべき試料に加える（第５図）。プローブ配列
（Ａ′）は、全体をRNAで構成することも、あるいは、
リボヌクレアーゼＨで開裂し得ない散在する配列を、こ
れに含めることもできる。
DNA断片は、標識されたプローブに対して、相補的な
配列（Ａ）をそれ自身に含んでいる。
図示した実施例においては、プローブの中央部がRNA
であり、その両側方にDNAを配置してある。（Ａ）と
（Ａ′）とが互いに対合した場合に形成されるRNA:DNA
二重鎖は、リボヌクレアーゼＨの基質を形成する。リボ
ヌクレアーゼＨは、標識されたプローブを開裂すること
ができ、DNA断片を無傷で遊離させるが、これが、反応
を更に伝播するための触媒として働くのである。これ
は、標的RNA配列が試料中に存在しない場合に起こるこ
とである（第５図Ｂ）。標的RNA配列が存在する場合
は、この反応は阻害されることになる（第５図Ａ）。
標的配列には配列（Ａ′）が、DNA断片にも相補的な
隣接する配列（Ｂ′）とともに含まれている。したがっ
て、DNA断片は標的配列と、プローブよりも安定な二重
鎖を形成する。このようにすれば、標的分子は、DNA断
片の結合に対して非常に効果的に競合できるようにな
り、それによって、リボヌクレアーゼＨによる標識プロ
ーブの開裂を遮断するのである（第５図Ａ）。
このような標識プローブの開裂に対する競合阻害が、
この検査法の基本原理である。標的配列との間に形成さ
れるRNA−DNA二重鎖が、リボヌクレアーゼＨによって減
成されるのを防ぐことによって、この方法の感度を、更
に高めることができる。これはDNA断片を適切に修飾す
ることによって、実行することができる。
発明者らは、DNA鎖の燐酸骨格に対する各種の修飾
が、リボヌクレアーゼＨによる相補的RNA鎖の開裂を防
ぐことを見出した。このような修飾としては、アルキル
またはアリール燐酸トリエステル、あるいは、ホスホン
酸アルキルまたはアリールとの正常な燐酸ジエステルの
置換があるが、これに限られるわけではない。
こうした修飾は、Ｂの領域全体、および、プローブ中
央部のRNA配列とハイブリッドを形成する部分を除くＡ
領域の全部において、検査に用いられるDNA分子へと組
み込まれる。Ａ領域内のこの未修飾配列が、プローブ内
のRNA配列とは厳密に相補的であるが、標的配列に関し
ては、１個所またはそれ以上の誤対合を含む場合には、
プローブだけがリボヌクレアーゼＨによって開裂される
ことになる。
DNAと標的分子との間に形成された二重鎖中の誤対合
は、らせんを崩壊させ、それによって、リボヌクレアー
ゼＨによってこの領域内の標的鎖の開裂を阻害する。標
的配列の他の部分の開裂は、DNA分子の骨格となる燐酸
基に施された修飾によって阻害される。
誤対合は、標的配列とDNA分子との間に形成される二
重鎖の安定性を多少は低下させるが、Ｂ領域には、相補
的な配列が他にもあるので、二重鎖の安定性は、標識プ
ローブとの間に形成されるそれよりも、はるかに大きい
ままである。
以下の実施例は、本発明の手法、生成物、および技術
を更に詳細に説明し、本発明の有用性の根底をなす独自
の特徴の実証に役立てるためだけのものであり、本発明
を制約するものではない。
実施例１ リボヌクレアーゼＨを介して行われる触媒的ハイブリッ
ド形成増幅の実証 本実施例は、触媒的ハイブリッド形成増幅法の原理を
実証するものである。本実施例での標的配列は、長さが
12〜18ヌクレオチド残基のオリゴデオキシチミジル酸で
ある［米国ファルマシア（Pharmacia）社より購入の商
品名オリゴ（Oligo）dT12-18］。プローブとして働く分
子は、トリチウムで標識されたポリリボアデノシン（ポ
リrA）である［米国アマシャム（Amersham）社より入
手］。研究に用いたポリrAの比活性は、１ヌクレオチド
残基あたり574ミリキュリーで、ヌクレオチド鎖は、約4
0〜140残基の各種の長さのもの。標的配列の存在下で、
リボヌクレアーゼＨは、標識されたポリrAプローブの開
裂を触媒する。次いで、無傷な二重鎖からオリゴdTが遊
離され、第２図に図示した通り、反応中に反復的に再循
環する。
リボヌクレアーゼＨに触媒されたポリrAプローブの開
裂状況は、３通りの条件、すなわち、オリゴdTの不在
下、（ヌクレオチド残基を基準として）等価の濃度のオ
リゴdTの存在下、および、1,000分の１の濃度のオリゴd
Tの存在下においてこれを比較する。
反応はすべて、（ヌクレオチドを単位として）ポリrA
44ピコモル、pH8.0のトリス塩酸緩衝液50ミリモル、塩
化カリウム20ミリモル、塩化マグネシウム９ミリモル、
２−メルカプトエタノール１ミリモル、およびウシ血清
アルブミン25μｇを含有する最終体積100μｌの溶液中
で行わせる。大腸菌のリボヌクレアーゼＨ［ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Bet hesda Research Labor
atories）より入手］2.3単位の添加によって反応を開始
させ、30℃に保つ。
30分後に、反応混合液のアリコートを取り、担体DNA
溶液（サケ精子DNA0.5mg/ml、ピロ燐酸ナトリウム0.1モ
ル、およびエチレンジアミン四酢酸１ミリモル）0.2m
l、および10％トリクロロ酢酸0.3mlを加える。トリクロ
ロ酢酸は、約10ヌクレオチド長よりも高分子の核酸を沈
澱させる。より低分子の開裂生成物、すなわちモノヌク
レオチド、および短いオリゴヌクレオチドは、溶液中に
残存する。
試料を20分間氷上に放置した後、16,000×ｇ、15分間
の遠心分離を施して、沈澱した核酸をペレットする。開
裂された断片を含有する上清を注意深く除去し、シンチ
レーション用溶媒と混合して、放射能を計測する。
オリゴdTを用いない対照試料においては、90分間で開
裂されたポリrAは、0.5％未満である。等価濃度のオリ
ゴdTの存在下では、30分以内にほぼ100％のポリrAが、
トリクロロ酢酸に可溶な断片へと開裂された。1,000分
の１量のオリゴdTの存在下でのポリrAの開裂は、90分を
超えるまで線形に進行し、この時点では、21％のポリrA
がトリクロロ酢酸に可能な断片へと開裂された。オリゴ
dTは、ポリrA配列のわずかに0.1％とハイブリッド形成
するに足りる濃度で存在したに過ぎないことから、反応
の間にオリゴdTの各分子は、平均して少なくとも210回
（毎分2.3回）は再循環したことが確実である。
ポリrA鎖の開裂は、ある場合には比生産的であるこ
と、すなわち、トリクロロ酢酸の存在下で溶液中に残存
できる程に低分子の標識断片を遊離させるに至らないこ
とから、真の代謝回転数は、これよりはるかに高いこと
も確実である。CHA法に基づく診断用試験においては、
１時間あたり100を上回る代謝回転数は、化学量論的ハ
イブリッド形成様式に基づく検査法と比較して、感度の
多大な向上をもたらすことになる。
実施例２ 相補的な標的DNA配列の存在下におけるリボヌクレアー
ゼＨを用いたβ−グロビンmRNAの部位特異的な開裂 実施例２は、リボヌクレアーゼＨによるヌクレオチド
鎖の開裂の特異性を明確に立証する重要な例である。α
−およびβ−グロビンmRNAの混合液を用いて、このβ−
グロビンmRNAの一部分と相補的な、25残基の短い標的DN
A配列とハイブリッド形成させた場合に、リボヌクレア
ーゼＨが特定の１部位でβ−グロビンmRNAを開裂するこ
とが明らかにされる。
ベックマン自動DNA合成装置を用い、ホスホラミダイ
ト法によって、５′−TGTCCAAGTCATTCAGGCCATCGTT（COD
MB−25）なるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する。
これは、マウスβ−グロビンmRNAの259〜293番目の残基
と相補的なヌクレオチド配列である。
グーセンズ（Goosens）およびカン（Kan）の論文［イ
ー・アントニーニ（E.Antonini）、エル・ロッシ−ベル
ナルディ（L.Rossi−Bernardi）、およびイー・シャン
コーヌ（E.Chiancone）編、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー、第76巻（1981年）805〜817ページ］の記載に
従い、フェニルヒドラジンの投与によって貧血症を誘発
させたマウスより採取したの網状赤血球から、マウスβ
−グロビンmRNAを単離する。このRNA2μｇを、pH7.5の
トリス塩酸緩衝液10ミリモル、塩化マグネシウム５ミリ
モル、塩化ナトリウム25ミリモル、およびジチオトレイ
トール１ミリモルを含有する1.0ナノモルのCODMB−25溶
液に加えて、最終体積を25μｌとする。
オリゴヌクレオチドの濃度はmRNAよりも、モル濃度で
ほぼ100倍高い。大腸菌のリボヌクレアーゼH2単位の添
加によって反応を開始させ、37℃に30分間保って進行さ
せる。クロロホルムとフェノールの1:1（容積：容積）
混合液を用いて反応を停止させ、試料を抽出する。次い
で、リボヌクレアーゼＨを用いてRNAを消化し、残存す
るRNA種をエタノールによって沈澱させて単離し、ノー
ザンブロット法で分析する。
RNA試料を、10ミリモルのpH6.5の燐酸ナトリウムとジ
メチルスルホキシドの容積比で1:1の混合液に解かした
グリオキサール１モルと、50℃で１時間反応させ、次い
で、1.5％のアガロースゲル上で電気泳動を施す。
RNAを、ゲルからジーンスクリーンプラス（Gene Scre
en Plus:商品名）フィルター［デュポン（DuPont）−NE
N］に、製造者の記載による方法に従い、毛細管を用い
た吸収転移によって転移させる。
ドデシル硫酸ナトリウム１％、塩化ナトリウム１モ
ル、硫酸デキストラン10％、pH6.5の燐酸ナトリウム50
ミリモルの溶液中に35℃で２時間保って、フィルターの
ハイブリッド形成前処理を行う。次いで、α−またはβ
−グロビンのいずれかに特異的なオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて、フィルターのハイブリッド形成を行
う。
プローブは、長さが25残基で、反応させるべきRNAの
まさに５′−末端と対合する。ハイブリッド形成は、20
0μg/mlの変性させたサケ精子DNA、および、分子の５′
−末端に32Pで放射性標識を施した毎分２×106カウント
のプローブを含有するハイブリッド形成前処理用緩衝液
5ml中で、35℃に24時間保って行われる。
ハイブリッド形成後は、下記の順序でフィルターを洗
浄する。すなわち、２倍の濃度のSSC（SSCとは、塩化ナ
トリウム0.15モル、クエン酸ナトリウム0.015モル）を
用い、室温で５分間に１回、１％のドデシル硫酸ナトリ
ウムを加えた２倍の濃度のSSCを用い、35℃で30分間に
２回、0.1倍のSSCを用い、室温で５分間に１回の順であ
る。フィルターに吸収転移を施してから乾燥させ、コダ
ック社製オートラジオグラフィー用XAR−５番フィルム
に感光させる。
オリゴヌクレオチドの不在下では、リボヌクレアーゼ
Ｈとの反応の際にα−またはβ−グロビンmRNAのいずれ
の開裂も起こらない。α−またはβ−グロビンに特異的
なプローブは、それぞれ、ノーザンブロット法において
完全な長さのmRNAに対応する単一の帯域とハイブリッド
形成する。
CODMB−25の存在下での反応は、β−グロビンmRNAの
基本的には完全な開裂を生起させる。５′−β−グロビ
ンに特異的なプローブを用いて検出された開裂生成物の
大きさは、RNA:DNA二重鎖の部位におけるmRNAの切断に
関して予測されたもの、すなわち280±20ヌクレオチド
長と正確に一致する。これ以外の開裂生成物は認められ
なかった。更に、α−グロビンに特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブを用いても、α−グロビンmRNAの開裂は
証明されなかった。
したがって、リボヌクレアーゼＨには、CHA法に基づ
く診断試験に使用する際に必須の特異性がある。プロー
ブに用いられたRNA配列は、試料中の相補的な標的DNA配
列と遭遇した場合に、かつその場合にのみ、この酵素に
よって開裂され、一方、標的配列とハイブリッドを形成
しなかったプローブの遊離した１本鎖は、切断されない
ものと思われる。
実施例３ CHA法を用いたシトメガロウイルスの検出 シトメガロウイルス（CMV）は、大型の二重鎖DNAウイ
ルスである。CMVに対する感染は、免疫抑制患者におい
ては臨床的に重大であり、また、腎移植後の伝染性合併
症として最も頻度が高く、重篤な疾患である。
次に、CHA法を用いたCMVの検出法を説明する。用いる
プローブは、主要直接初期遺伝子に由来する25ヌクレオ
チド長のCMV特異的配列、すなわち、５′−TCTTGGCAGAG
GACTCCATCGTGTCである。中央部の６残基はRNAであり、
両翼の配列はDNAで構成されている。プローブを配列の
３′−末端でラテックスビーズに結合させる。アルカリ
性ホスファターゼを５′−末端の位置に結合させる。患
者から得た血液、尿、および咯痰試料からDNAを単離す
る。
これら試料のそれぞれにおけるCMVの検査法を、第３
図に示すCHA法を用いて実施する。大腸菌のリボヌクレ
アーゼＨ（100μｌあたり５単位）を介して標識プロー
ブの開裂を行わせる。CHA反応は、温度を約40℃とし
て、45分間にわたってこれを実行する。
リボヌクレアジン（100μｌあたり５単位）を反応混
合液に加えて、プローブの非特異的な開裂を抑制する。
試料中にCMVが存在すれば、標的配列はプローブとハイ
ブリッドを形成し、プローブは、リボヌクレアーゼＨに
よって開裂されるはずである。反応経路中の標的配列の
反復的循環によって、標的配列のすべての複写が、標識
されたプローブの多数の分子を捕捉し、かつその開裂を
促進することが可能となる。
CHA反応に引き続き、溶液中に遊離されたリポーター
指示基、すなわち、アルカリ性ホスファターゼの測定に
よって、プローブの開裂度を定量する。初めに、濾過あ
るいは遠心分離を用いて、試料からビーズを除去する。
次いで、溶液中のプローブ断片上のアルカリ性ホスファ
ターゼの標識を、比色定量分析または螢光発生試薬のい
ずれかによる検出方式を用いて測定する。
pH8.5で燐酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、これ
を、着色生成物であるｐ−ニトロフェノールに加水分解
することによって、波長405nmでの分光分析法を用いた
酵素の検査を行うことができる。これに代えて、燐酸４
−メチルウンベリフェニルを基質として、螢光測定法を
用いて酵素を定量することもできる。
検査に用いる螢光の励起波長、および放出波長は、そ
れぞれ、363nm、および447nmである。最終的な着色指
標、あるいは螢光指標は、最初の試料中に存在したCMV
の量の尺度となる。
以上を要約すると、ここに記載の実施例の結果は、特
定の核酸配列の検出用手段としてのCHA法の有用性を立
証するものである。このような検査方式においては、標
的配列は、標識された相補的核酸プローブを開裂する触
媒反応の補助因子として働く。したがって、標的配列の
各分子には、プローブの多数の複写を捕捉し、その開裂
を促進する能力がある。
その結果、わずか１個のプローブ分子に標的配列が結
合できるに過ぎない、化学量論的ハイブリッド形成反応
を基本原理とする現行のすべての診断用試験法と比較す
ると、本方法の感度は、はるかに高い水準まで高められ
るのである。
記載された実施例にある通り、プローブの開裂は、標
的配列とハイブリッドを形成した場合にのみ生起しなけ
ればならない。次いで、標的配列は、無傷の二重鎖から
遊離され、反応経路中を反復的に再循環する。直接的検
査法と競合的検査法の双方におけるCHA法の利用の様式
も提供されている。総体的には、単一のCHA反応に基づ
く検出方式では、時間とともに指標の線形の増幅が行わ
れる。適当な方法で、２種類またはそれ以上のCHA反応
を連動させることによって、指標の指数関数的な増幅を
行うことも可能であり、更に高い水準の感度を実現する
ことができる。
したがって、本発明が前記の目的のすべてを達成して
いることは明らかであると言える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォルダー，ロクサンヌ ワイ アメリカ合衆国 アイオワ州 52240 アイオワシティ スレイグルサークル 2107 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00

Claims (71)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】相補的核酸プローブを開裂し、かつこれを
    検出する触媒反応における補因子として核酸配列を利用
    する、核酸配列検出のための方法であって、 標的配列を核酸プローブとハイブリッド形成させ、プロ
    ーブ：標的配列二重鎖を形成させる段階と、 該プローブ：標的配列二重鎖中のプローブを開裂させ、
    無傷の標的配列を遊離させる段階と、 該標的配列を、反応経路中を反復的に再循環させる段階
    と、 プローブの開裂度を検知する段階とを含むことを特徴と
    する核酸配列検出のための方法。
  2. 【請求項２】前記核酸プローブが標識されている、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】ヒト、あるいは他の動物種における疾病ま
    たは遺伝的特徴の診断に用いる請求項１記載の検出方
    法。
  4. 【請求項４】工業的または農業的処理過程に用いる際
    に、核酸配列を同定するのに用いる請求項１記載の検出
    方法。
  5. 【請求項５】核酸配列プローブを、放射性、螢光性、電
    気化学的、発光性若しくは酵素性のマーカー又は他のリ
    ポーター指示基を用いて標識し、その検出を可能とさせ
    る請求項２記載の検出方法。
  6. 【請求項６】標識用の基を有する相対的低分子の開裂断
    片を、残存する無傷のプローブ分子から電気泳動を用い
    て分離することによって、プローブの開裂度を測定する
    請求項１記載の検出方法。
  7. 【請求項７】強酸、例えばトリクロロ酢酸を用いて、標
    識を有する相対的低分子の開裂断片を溶液中に存在させ
    つつ、相対的高分子の未開裂プローブ分子を、選択的に
    沈澱させることにより、プローブの開裂度を測定する請
    求項１記載の検出方法。
  8. 【請求項８】高親和性標識およびリポーター指示基の双
    方を用いて、プローブを修飾し、かつ、対応する親和性
    の基を取り付けた固形支持体を用いて、標識を有する開
    裂断片を溶液中に残存させつつ、無傷のプローブ分子を
    吸着させる段階が含まれ、ハイブリッド形成および開裂
    反応に引き続いて試料に固形支持体材料を添加する段階
    と、プローブに固定された高親和性標識を、固形支持体
    上の対応する親和性の基と会合させる段階と、リポータ
    ー指示基を有するプローブの開裂断片が含まれる溶液か
    ら、固形支持体を分離する段階と、溶液中のリポーター
    指示基を検出する段階とを含む請求項２記載の検出方
    法。
  9. 【請求項９】固形支持体を、ラテックス、ポリスチレ
    ン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビー
    ズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの
    膜で構成する請求項８記載の検出方法。
  10. 【請求項１０】固形支持体を磁化し、かつ、磁場の適用
    によって、その固形支持体を大量の溶液から分離する請
    求項８記載の検出方法。
  11. 【請求項１１】親和性標識が、ハイブリッド形成、およ
    び開裂反応の際に開裂されない核酸配列であり、かつ、
    固形支持体に取り付けた対応する親和性の基が、相補的
    な核酸配列である請求項８記載の検出方法。
  12. 【請求項１２】標識されたプローブを、ハイブリッド形
    成および開裂反応の際に固形支持体に取り付け、かつ、
    リボーター指示基を有する開裂断片を、溶液中に遊離さ
    せる請求項２記載の検出方法。
  13. 【請求項１３】固形支持体が、ラテックス、ポリスチレ
    ン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビー
    ズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの
    膜で構成される請求項12記載の検出方法。
  14. 【請求項１４】固形支持体を磁化し、かつ、磁場の適用
    によって、その固形支持体を大量の溶液から隔離する請
    求項12記載の検出方法。
  15. 【請求項１５】DNA配列の検出を目的とする方法であっ
    て、プローブの開裂を、リボヌクレアーゼＨ活性を有す
    る酵素、あるいは他の触媒を用いて仲介する請求項１記
    載の検出方法。
  16. 【請求項１６】１本鎖リボヌクレアーゼの阻害剤、例え
    ばバナジン酸塩、リボヌクレアジン、あるいはインヒビ
    ットエース（Inhibit−ACE）を用いることにより、プロ
    ーブの非特異的な開裂を抑制する請求項15記載の検出方
    法。
  17. 【請求項１７】プローブを、大腸菌リボヌクレアーゼＨ
    を用いて開裂する請求項15記載の検出方法。
  18. 【請求項１８】プローブを、熱に対して安定な形態のリ
    ボヌクレアーゼＨを用いて開裂する請求項15記載の検出
    方法。
  19. 【請求項１９】熱に対して安定なリボヌクレアーゼＨ
    が、好熱性生物に由来し、あるいは熱に対して不安定な
    リボヌクレアーゼＨにおける部位指向性の突然変異誘発
    によって生起させたものである請求項18記載の検出方
    法。
  20. 【請求項２０】プローブを、約15〜約50ヌクレオチド長
    のオリゴヌクレオチドとする請求項15記載の検出方法。
  21. 【請求項２１】オリゴヌクレオチドの全体が、RNAで構
    成される請求項20記載の検出方法。
  22. 【請求項２２】オリゴヌクレオチドに、リボヌクレアー
    ゼＨによって開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する
    配列が含まれている請求項20記載の検出方法。
  23. 【請求項２３】プローブ内のリボヌクレアーゼＨによっ
    て開裂可能なRNA配列の長さを、約３〜約15ヌクレオチ
    ド長の範囲で変える請求項20記載の検出方法。
  24. 【請求項２４】プローブとして、DNA−RNA−DNAなる配
    列で構成されるオリゴヌクレオチドを用いる請求項20記
    載の検出方法。
  25. 【請求項２５】点突然変異、例えば鎌状赤血球疾患に出
    現するそれの検出を目的として、DNA−RNA−DNA配列か
    らなるプローブを用いる請求項24記載の検出方法。
  26. 【請求項２６】RNA配列と、リボヌクレアーゼＨによっ
    て開裂不能な１あるいはそれ以上の追加的な配列とが含
    まれる15〜50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドでな
    る、請求項１記載の方法を実施するために有用なプロー
    ブ。
  27. 【請求項２７】RNA配列の長さが、約３〜約15ヌクレオ
    チド長である請求項26記載のプローブ。
  28. 【請求項２８】放射性、螢光性、電気化学的、発光性、
    または酵素性のマーカーあるいは他のリポーター指示基
    を用いて、ヌクレオチド鎖の５′−または３′−末端、
    あるいはその近傍が標識されている請求項27記載のプロ
    ーブ。
  29. 【請求項２９】ヌクレオチド鎖のリポーター指示基が取
    り付けられている部位と反対の末端、あるいはその近傍
    で、高親和性の基を用いて更に修飾されている請求項28
    記載のプローブ。
  30. 【請求項３０】ヌクレオチド鎖のリポーター指示基が取
    り付けられている部位と反対の末端、あるいはその近傍
    で、固形支持体と共有結合を用いて結合されている請求
    項28記載のプローブ。
  31. 【請求項３１】固形支持体が、ラテックス、ポリスチレ
    ン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビー
    ズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの
    膜で構成される請求項30記載のプローブ。
  32. 【請求項３２】固形支持体が、磁化されている請求項30
    記載のプローブ。
  33. 【請求項３３】RNA配列が、長さ約４〜約８のヌクレオ
    チド長であり、かつ標的DNA配列に対して１個所あるい
    はそれ以上の誤対合を含んでいる請求項26記載のプロー
    ブ。
  34. 【請求項３４】追加的な配列が、その燐酸基または糖の
    部分がリボヌクレアーゼＨによる開裂を防ぐように修飾
    されたRNAで構成されている請求項26記載のプローブ。
  35. 【請求項３５】燐酸基が、アルキルまたはアリール隣接
    トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン酸アルキル
    またはアリール、ホスホラミド酸アルキルまたはアリー
    ル、燐チオ酸塩、あるいは、燐セレン酸塩のいずれかと
    して修飾されている請求項34記載のプローブ。
  36. 【請求項３６】リボース環の２′−ヒドロシキル基を、
    アルキルまたは芳香族エーテルに転化することにより、
    糖の部分が修飾されている請求項34記載のプローブ。
  37. 【請求項３７】追加的な配列が、DNAで構成されている
    請求項26記載のプローブ。
  38. 【請求項３８】プローブが、約50ないし数千のヌクレオ
    チド長のポリヌクレオチドである請求項15記載の検出方
    法。
  39. 【請求項３９】ポリヌクレオチドの全体が、RNAで構成
    されている請求項38記載の検出方法。
  40. 【請求項４０】ポリヌクレオチドに、リボヌクレアーゼ
    Ｈによって開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配
    列が含まれている請求項38記載の検出方法。
  41. 【請求項４１】リボヌクレアーゼＨにより、開裂可能な
    プローブ内のRNA配列の長さが、３ヌクレオチド長ある
    いはそれ以上である請求項38記載の検出方法。
  42. 【請求項４２】RNAに加えて、リボヌクレアーゼＨによ
    り開裂不能な１回以上の散布する配列で構成される約50
    ないし数千ヌクレオチド長のポリヌクレオチドでなる、
    請求項１記載の方法を実施するために有用なプローブ。
  43. 【請求項４３】RNA配列の区画が、３ヌクレオチド長あ
    るいそれ以上の長さである請求項42記載のプローブ。
  44. 【請求項４４】リボヌクレアーゼＨにより開裂不能な１
    あるいはそれ以上の散在する配列が、放射性、螢光性、
    電気化学的、発光性、あるいは酵素性のマーカー、ある
    いは他のリポーター指示基を用いて標識されている請求
    項43記載のプローブ。
  45. 【請求項４５】ヌクレオチド鎖の５′−または３′−末
    端、あるいはその近傍で、高親和性の基を用いて更に修
    飾されている請求項44記載のプローブ。
  46. 【請求項４６】ヌクレオチド鎖の５′−または３′末
    端、あるいはその近傍で、固形支持体と共有結合により
    結合している請求項44記載のプローブ。
  47. 【請求項４７】固形支持体が、ラテックス、ポリスチレ
    ン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスのビー
    ズ、セルロース、あるいは、テフロンまたはナイロンの
    膜で構成されている請求項46記載のプローブ。
  48. 【請求項４８】固形支持体が、磁化されている請求項46
    記載のプローブ。
  49. 【請求項４９】散在する配列が、燐酸基または糖の部分
    のいずれかにおいて、リボヌクレアーゼＨによる開裂を
    防ぐように修飾されたRNAで構成されている請求項42記
    載のプローブ。
  50. 【請求項５０】燐酸基が、アルキルまたはアリール燐酸
    トリエステル、ホスホン酸水素塩、ホスホン酸アルキル
    またはアリール、ホスホラミド酸アルキルまたはアリー
    ル、燐チオ酸塩、あるいは燐セレン酸塩のいずれかとし
    て修飾されている請求項49記載のプローブ。
  51. 【請求項５１】リボース環の２′−ヒドロシキル基を、
    アルキルまたは芳香族エーテルに転化することにより、
    糖の部分が修飾されている請求項49記載のプローブ。
  52. 【請求項５２】散在する配列が、DNAで構成されている
    請求項42記載のプローブ。
  53. 【請求項５３】逆転写酵素を用いて標的配列に相補的な
    DNAによる複写を合成するための鋳型として初めに試料R
    NAを用いるRNA配列検出のための方法であって、DNAプラ
    イマーを試料RNAの標的配列に対して５′の側とハイブ
    リッド形成させる段階と、逆転写酵素を用いて標的配列
    を越えるようにプライマーを伸長させて、標的配列に相
    補的なDNAによる複写を生成させる段階と、触媒的ハイ
    ブリッド形成増幅法を用いて、この相補的DNA複写を検
    出する段階とを含む請求項１記載の検出方法。
  54. 【請求項５４】ハイブリッド形成および開裂の方法が、
    リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素あるいは他の触媒
    によるプローブの開裂に基づいている請求項53記載の検
    出方法。
  55. 【請求項５５】デオキシヌクレオチド−α−チオ三燐酸
    を反応の基質に用いた結果、合成されるDNA鎖の燐酸基
    が自然界で生じる燐酸ジエステルではなく燐チオ酸エス
    テルになるようにして、逆転写酵素を用いて標的配列の
    相補的DNA複写の燐チオ酸誘導体を合成する請求項53記
    載の検出方法。
  56. 【請求項５６】ハイブリッド形成および開裂の方法が、
    リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触
    媒によるプローブの開裂に基づいている請求項55記載の
    検出方法。
  57. 【請求項５７】ハイブリッド形成および開裂の方法が、
    制限酵素によるDNAプローブの開裂に基づいていて、合
    成された燐チオ酸誘導体を、相補的DNAプローブとハイ
    ブリッド形成させる段階と、制限酵素を用いてプロー
    ブ：燐チオ酸DNA二重鎖中のプローブを酵素の認識部位
    で開裂し、無傷な燐チオ酸DNA鎖を遊離させる段階と、
    燐チオ酸DNA鎖を、反応経路内を反復的に再循環させる
    段階と、反応後のプローブの開裂度を検知する段階とを
    含む請求項55記載の検出方法。
  58. 【請求項５８】試料DNAを鋳型として利用してDNA重合酵
    素を用いて初めに標的配列の複写を合成するDNA配列検
    出のための方法であって、DNA試料を変性させる段階
    と、DNAプライマーを試料DNAの標的配列に対して５′の
    側とハイブリッド形成させる段階と、DNA重合酵素を用
    いて標的配列を越えるようにプライマーを伸長させて相
    補的DNA鎖の複写を生成させる段階と、触媒的ハイブリ
    ッド形成増幅法を用いて、DNA複写を検出する段階とを
    含む請求項１記載の検出方法。
  59. 【請求項５９】触媒的ハイブリッド形成増幅法が、リボ
    ヌクレアーゼＨ活性を有する酵素あるいは他の触媒によ
    るプローブの開裂に基づいている請求項58記載の検出方
    法。
  60. 【請求項６０】デオキシヌクレオチド−α−チオ三燐酸
    を反応の基質に用いた結果、合成されるDNA鎖の燐酸基
    が自然界で生じる燐酸ジエステルではなく燐チオ酸エス
    テルになるようにして、DNA重合酵素を用いて標的配列
    の複写の燐チオ酸誘導体を合成する請求項58記載の検出
    方法。
  61. 【請求項６１】ハイブリッド形成および開裂の方法が、
    リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、あるいは他の触
    媒によるプローブの開裂に基づいている請求項60記載の
    検出方法。
  62. 【請求項６２】ハイブリッド形成および開裂の方法が、
    制限酵素によるDNAプローブの開裂に基づいていて、合
    成された燐チオ酸誘導体を、相補的DNAプローブとハイ
    ブリッド形成させる段階と、制限酵素を用いてプロー
    ブ：燐チオ酸DNA二重鎖中のプローブを酵素の認識部位
    で開裂する段階と、無傷な燐チオ酸DNA鎖を遊離させる
    段階と、燐チオ酸DNA鎖を、反応経路内を反復的に再循
    環させる段階と、反応後のプローブの開裂度を検知する
    段階とを含む請求項60記載の検出方法。
  63. 【請求項６３】２種類あるいはそれ以上のハイブリッド
    形成と開裂反応とを連動させて、指標の指数関数的増幅
    を達成する請求項１記載の検出方法。
  64. 【請求項６４】ハイブリッド形成および開裂反応のう
    ち、１種類あるいはそれ以上が、リボヌクレアーゼＨ活
    性を有する酵素あるいは他の触媒によるプローブの開裂
    に基づいている請求項63記載の検出方法。
  65. 【請求項６５】ハイブリッド形成および開裂反応のう
    ち、１種類あるいはそれ以上が、基質としての燐チオ酸
    誘導体の使用に基づき、かつ相補的DNA配列が、制限酵
    素によってその認識部位で開裂される請求項63記載の検
    出方法。
  66. 【請求項６６】試料RNAを、標的配列に相補的なDNA分子
    とハイブリッド形成させる段階と、そのDNA分子に相補
    的な標識されたRNAプローブ、およびリボヌクレアーゼ
    Ｈ活性を有する酵素、あるいは他の触媒を検査用試料に
    添加する段階と、検査用試料を温置して、ハイブリッド
    形成および開裂反応を進行させる段階と、RNAプローブ
    の開裂度を測定する段階とを含むことを特徴とする、競
    合的検査法を用いてRNA配列を検出するための方法。
  67. 【請求項６７】標識されたプローブが、リボヌクレアー
    ゼＨにより開裂不能な１あるいはそれ以上の散在する配
    列を含有する請求項66記載の検出方法。
  68. 【請求項６８】DNA分子が、標的RNA配列および標識され
    たプローブの双方に相補的な第１部分、および標的配列
    のみに相補的な第２部分を含有する請求項66記載の検出
    方法。
  69. 【請求項６９】DNA分子が、燐酸基が修飾されていない
    少なくとも４ヌクレオチド長の配列を含有し、かつ残余
    の燐酸基が、リボヌクレアーゼＨによる相補的標的配列
    およびプローブRNA配列の開裂を防ぐように修飾されて
    いる請求項68記載の検出方法。
  70. 【請求項７０】燐酸基が、アルキルまたはアリール燐酸
    トリエステル、ホスホン酸アルキルまたはアリール、あ
    るいはホスホラミド酸アルキルまたはアリールとして修
    飾されている請求項69記載の検出方法。
  71. 【請求項７１】DNA分子が、標識されたプローブに相補
    的であるが、標的RNA配列と１あるいはそれ以上の誤対
    合を有しつつ二重鎖を形成し、その結果、リボヌクレア
    ーゼＨによる標的RNA配列の開裂が阻害される請求項66
    記載の検出方法。
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