KR20150097764A - 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지 - Google Patents

휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지 Download PDF

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씨. 프레데릭 바트렐
트로이 디. 데이버
윌리엄 사무엘 헌터
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마이크로닉스 인코포레이티드.
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Abstract

액체 샘플들 내의 형광측정 분석들을 위한 소형의 마이크로프로세서-제어형 기구가 개시되고, 기구는 마이크로유체 카트리지를 수용하기 위한 도킹 베이를 갖는 부유 스테이지 및 검출기 헤드 내의 격리된 저노이즈, 고이득 환경에서 소스 LED들을 제어하고, 방출 신호 증폭 및 필터링하기 위한 검출기 헤드 내에 상주하는 ODAP 데몬의 제어 하에서 작동되는 온보드 매립형 마이크로프로세서를 갖는 스캐닝 검출기 헤드를 갖는다. 다수의 광학 채널들이 스캐닝 헤드 내에 합체될 수 있다. 바람직한 구성에서, 분석은 타겟 분석물과 연계된 제 1 형광체 및 제어부와 연계된 제 2 형광체를 모니터링하기 위한 이중 채널 광학 기기들을 사용하여 유효화된다. 용례들은 그 다수가 검출 중에 온도 제어를 필요로 하는 일반적으로 타겟 핵산들의 PCR 증폭에 기초하는 분자 생물학적 분석들 및 형광 분석들을 포함한다.

Description

휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지 {PORTABLE FLUORESCENCE DETECTION SYSTEM AND MICROASSAY CARTRIDGE}
본 발명은 일반적으로 미량분석 카트리지(microassay cartridge)에서 수행되는 진단적 분석들(diagnostic assays)에 사용을 위한 광학, 열, 기계식 및 공유압식 시스템들을 갖는 소형 형광 검출 기구에 관한 것이다.
생체내 진단적 분석들을 위한 프로브들로서 형광체들(fluorophores)의 사용의 이점들이 잘 알려져 있지만, 이러한 분석들을 위한 가장 통상적으로 이용 가능한 형태들의 장비는 대형이고, 사용이 복잡하고, 비교적 저속이고, 고가의 공초점 광학 기기들(confocal optics)에 의존한다. 이들 속성들은 원격 장소들에서 그리고 현장의 현지에서 완전 통합형 "샘플-투-앤서(sample-to-answer)" 시험을 위해 많은 장비를 부적합하게 하고, 여기서 이러한 장비는 강건하고, 고속이고, 소형이고, 저가이고, 사용이 용이하도록 요구된다. 마이크로유체 카트리지 내의 자동화 핵산 증폭이 수년전에 먼저 제안되었지만[윌딩(Wilding): 미국 특허 제 5304487호 및 제 5635358호 참조), 제어된 연구실 조건들 외부의 형광성 분석 타겟들은 여전히 휴대형 및 강인한 장비의 결여에 의해 방해되고 있다. 이들의 발단 이래로 20년 후에, 분자 진단학들은 이들 및 다른 미해결 문제점들에 기인하여 진보된 연구실 설비들의 부재시에 여전히 비교적 특이하다.
분자 진단학으로의 더 넓은 액세스를 촉진하기 위해 특정화된 연구실 설비들 외부에서 작동하도록 설계된 자립형 분석 시스템들이 요구된다. 핵산 분석들은 이들이 더 높은 감도 및 특이성(specificity)을 제공하기 때문에, 감염성 질병들을 포함하는 다수의 상이한 질병 유형들의 검출을 위한 "골드 표준(gold standard)"이 빠르게 되고 있다. 이러한 분석들은 광범위한 병원균 조건들에 매우 특정한 것으로 입증되었고, 예를 들어 다른 유형의 인플루엔자 A 또는 B로부터 H5N1 조류 인플루엔자를 구별하는데 있어서, 특정 병원균 타겟이 약물-저항성 스트레인을 갖는지 여부를 판정하는데 있어서, 그리고 이.콜리(E.coli) 0157:H7과 같은 장관 격리물의 독소발생 스트레인들을 검출하는데 있어서 역학에 기본적인 바와 같이 특정 질병의 유전적 스트레인들을 추적하는데 유용하다. 형광성 기반 분석들은 또한 일반적으로 당뇨병들, 심장병들, 응고병들, 면역분석들과 같은 조건들을 모니터링하기 위해 그리고 예를 들어 식품들 또는 약물 제품들 내의 내독소의 검출을 위해 유용한 것으로 나타나고 있다. 헬스케어로의 액세스가 제한되어 있고 다수의 감염성 질병들이 풍토병이고 건강 및 수명 예측이 열악한 개발도상국에서 다수의 이격된 건강 클리닉들 개량된 장비가 특히 요구된다.
통상적인 형광 분석 시스템에서, 형광성 프로브 또는 형광체는 파장 또는 파장들의 범위를 갖는 광을 흡수하고, 여기되게 되고, 형광체는 이어서 형광성 신호를 방출한다. 형광체의 활동도 또는 비활동도는 분석 결과를 지시한다. 방출 신호는 여기광보다 일반적으로 긴(그러나, "상향 컨버팅 형광체들"에서와 같이 더 짧을 수도 있음) 파장 또는 파장들의 범위를 갖는다. 2색 빔스플리터 또는 대역통과 필터 또는 이들의 조합이 이어서 다른 광으로부터 형광성 신호를 분리하는데 사용되고, 신호는 센서로 통과된다. 센서는 종종 포토다이오드이고, 분석을 스코어링하는데 사용될 수 있는 전기 신호를 발생한다. 실시간 또는 종단점 형광측정을 사용하는 정성적 및 정량적 분석들이 실행가능하다.
이러한 시스템들에서, 액체 샘플은 마이크로유체 채널을 거쳐 검출 챔버 또는 마이크로유체 카트리지의 채널 내로 반송되고 여기서 샘플과 혼합된 또는 네이티브한 형광성 프로브가 여기 소스에 의해 여기된다. 제어부들은 병렬로 실행되거나 분석 채널 내에서 멀티플렉싱될 수 있다. 방출된 광은 타겟의 존재 또는 부재를 결정하도록 측정된다. 복수의 검출 채널들이 마이크로유체 카트리지의 검출 영역 내에 배열될 수 있다. 분석들은 형광성의 하나 이상의 측정들을 행하는 것을 수반하고; 형광체들은 증폭 단계에서 형성된 핵산 앰플리콘들(amplicons)을 위한, 또는 더 일반적으로는 형광성 분석 타겟의 존재 또는 부재를 위한 마커들로서 사용될 수 있다. 실시간 형광측정, FRET, qPCR, 열적 용융 곡선들, 분석 스코어링 및 유효화를 위한 동적 및 레이트 종단점들이 또한 당 기술 분야에 알려져 있다.
공지의 형광성 검출기들은 통상적으로 마이크로유체 카트리지 또는 마이크로어레이 내에 존재하는 형광성 방출물들을 취출하여 국부화하기 위해 비교적 고가의 광학 부품들(공초점 광학 기기들, 레이저들 및 비구면 렌즈들과 같은)을 이용한다. 준코사(Juncosa)의 WO 98/049543호는 예를 들어, 단일 광학 트레인 내의 3개의 2색 빔스플리터들을 교시하고 있는데, 하나는 여기 소스 전력을 제어하기 위한 것이고, 다른 하나는 반사 신호를 제어하기 위한 것이고, 제 3 2색 빔스플리터는 프로브-특정 형광성 방출을 구별하기 위해 사용된다. 하나 이상의 렌즈들은 샘플 상에 여기빔을 포커싱하는 역할을 한다. 준코사는 또한 약 50 미크론에서 "마이크로 위치들"의 분해능을 갖는 이미징빔을 제어하기 위한 공초점 현미경의 광학 대물 렌즈 부품들 및 포토멀티플라이어의 입구에서 개구의 사용을 교시하고 있다. "바람직하게는 개구의 사용을 통해, 조명의 영역으로 검출기의 시야를 제한하는 것과 결합되어, 소정의 마이크로위치 또는 그 분율의 영역에 조명의 범주를 제한함으로써, 신호 대 노이즈비의 상당한 향상들이 성취될 수도 있다."[p.7, 10 내지 15행] 이들 교시들은 다른 것들 중에서도, 민스키(Minsky)의 US3013467호, 치엔(Tsien)의 US 특허 5296703호, 딕슨(Dixon)의 5192980호, 스턴(Stern)의 5631734호, 캄바라(Kambara)의 5730850호에 의해 전조되어 있고, 마허(Maher)의 미국 특허 제 6614030호 및 샴스(Shams)의 제 6731781호에 재반복되어 있다. 마허는 마이크로유체 챔버의 중심에서 10 미크론-크기의 스폿에서 포커싱 및 방출을 최적화하기 위해 미니-공초점 광학 시스템을 갖는 레이저들, 광파이버들, 석영 플레이트 및 비구면 렌즈들을 사용한다.
유사하게, 리(Lee)의 US6635487호는 샘플의 평면 상의 여기빔의 원추를 포커싱하는 것이 "분석 칩들 상의 분석적 검출 측정들을 향상시키기 위한 최고 강도를 제공하는 것"을 확인하였다. 이 교시는 따라서 종래 기술을 포함한다.
더 최근의 출원에서, 킴(Kim)의 미국 특허 출원 제 2008/0297792호는 마이크로유체 칩 내의 형광성 검출을 위한 광원으로서 기능하는 LED의 이미지가 대물 렌즈에 의해 "광학 스폿"으로서 샘플 상에 투영되는 것을 교시하고 있다. 광학 스폿은 마이크로유체 칩 내의 챔버 내의 유체의 깊이의 중간에 포커싱된다. 샘플에 의해 방출된 형광은 대물 렌즈에 의해 평행 광선들로 가능한 한 가깝게 시준되고 아발란쉐 포토다이오드(avalanche photodiode) 상에 포커싱된다. 정렬의 고정밀도를 위한 요구는, 잘 알려진 바와 같이, 저지대역이 45° 각도에서 미러에 진입하지 않는 광선들에 대해 시프트될 것이기 때문에 2색 미러에 관련한다. 따라서, 킴의 교시들은 일반적으로 인식된 기술 상태를 반영한다.
그룰러(Gruler)의 PCT 공보 WO2008/101732에는, 여기서 단일 광 경로 내의 다수의 여기 및 검출 파장들을 멀티플렉싱하기 위한 형광성 검출기 헤드가 설명되어 있고, "공초점 측정이라는 것은 조명 광학 기기들 또는 소스의 초점이 각각 고유적으로 검출 광학 기기들 또는 센서의 초점과 각각 동일한 것을 의미한다"라고 기재되어 있다. 그룰러는 "[본 발명의] 공초점 광학 기기들이...공초점 디자인의 최고 신호 및 최저 배경 고유 특징부들을 보장한다."라고 계속 기재하고 있는데, 즉 그룰러에 따르면 최고 가능한 신호 및 최저 노이즈는 공초점 광학 기기들에 의해 얻어진다.
종래 기술의 교감적인 교시는 낙사형광 현미경(epifluorescence microscopy)용 공초점 광학 기기들의 특별화된 사용으로부터 발생하였지만, 교시는 마이크로유체, 측류, 모세관 전기영동 및 마이크로어레이 용례들에 광범위하게 그리고 무비판적으로 적용되어 왔다. 그러나, 본 발명자들은 이 접근법이 유체 충전된 채널 내의 하나 이상의 분자 프로브들의 검출이 요구되는 액상 마이크로유체 진단 분석들에 양호하게 적합되지 않는다는 것을 발견하였다. 포스트켄칭, 열적 대류 및 유체 충전된 채널 내의 기포들 또는 구배들의 경우에 따른 존재와 같은 효과들에 기인하여, 샘플 챔버의 평면 내에 여기빔 및 방출 원추의 초점을 동시국부화하는 것은 허용 불가능한 불안정성, 신호의 손실, 켄칭, 노이즈, 재현 불가능성, 결과들의 감도의 전체적인 손실을 유도할 수 있다. PCR의 더 높은 온도들에 기인하여, 예를 들어 시약들 및 샘플의 탈가스가 통상적인 문제점이고, 액체 샘플 내에 혼입된 기포들로부터의 간섭이 빈번한 문제점이다. 종래의 접근법은 또한 더 고가의 광학 부품들을 필요로 하고, 따라서 이는 진보된 임상 실험실들 외부의 광범위한 적용을 위해 불리하다.
제 2 문제점은 분석 유효화이다. PCR에 의한 감염성 질병 분석들의 유효화를 위한 현재 표준들은 예를 들어, 장티푸스균 또는 이.콜리 0157과 같은 병원균들이 의심되는 대변들(stools) 내의 편재성 비병원균 대장균과 같은, 스파이크된 핵산 템플레이트들 또는 더 바람직하게는 내인성 정상균 무리의 동시 검출의 사용에 의존하게 되었다. 다른 편재성 내인성 템플레이트는 더 고품질 호흡 및 혈액 샘플들과 연계된 인간 18S rRNA이다. 내인성 템플레이트의 동시 증폭 및 검출은 분석 결과들의 확신을 보장하지만, 마커들로서 사용된 형광체들 사이의 가능한 누화에 기인하여 실제로 성취가 곤란하다. 고이득 증폭을 사용할 때, 멀티플렉스 PCR을 위해 통상적으로 선택된 형광체들의 여기 및 방출의 스펙트럼 내의 소정 레벨의 크로스오버는 통상적이고 예측된다. 따라서, 하류측 처리를 위해 공유된 저노이즈 전자 기기들을 갖는 스캐닝 검출기 헤드 내의 개별 광학 채널들을 사용함으로써 스펙트럼식으로 중첩하는 숄더들로 형광성 신호들을 격리할 것인 해결책은 당 기술 분야의 기술적인 이익의 진보일 것이다.
제 3 문제점은 휴대성이다. 1회용 카트리지들의 사용은 공유된 시약 저장조들 및 공유된 유체 접촉 표면들에 기인하는 교차 오염이 회피되기 때문에 유리한 것으로 입증되었다. 그러나, 1회용 카트리지들을 수락하기 위한 정밀한 광학 기구 플랫폼을 구성하는 것은 문제가 있다. 문제점들은 카트리지 정렬 및 검출기 헤드 위치설정에 영향을 미치는 기계적 공차들의 부정확성들 및 스택업, 플라스틱 1회용 카트리지들과 기구 내의 열원들 사이에 고도의 전도성 열적 인터페이스를 형성하기 위한 요구, 장치 상의 제어 서보들과 카트리지 상의 마이크로 밸브들 사이의 공압 인터페이스를 밀봉하기 위한 요구, 및 최적화 없이 감도의 손실을 유도할 수 있는 마이크로유체 카트리지 내에서 이용 가능한 필수적으로 더 짧은 광 경로(통상적으로 약 1 밀리미터 또는 그 미만)를 포함한다. 이들 인터로킹 문제점들의 동시 해결책은 단지 이 고도로 예측 불가능한 분야에서 시행착오에 의해 가장 종종 안내되는, 광대한 실험 및 개발에 의해서만 성취된다. 따라서, 그 요소들이 본 명세서의 개시 내용의 주제인 수많은 개량들에 대한 종래 기술의 요구가 존재한다.
본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서, 액체 샘플을 포함하는 검출 채널 또는 챔버의 이면에 열광학 윈도우와 접촉식으로 인터페이스하는 가열 블록 상에 형성된 반사 미러면을 제공함으로써, 액체 샘플 내의 기포들 및 다른 간섭성 불균질성들의 존재시에 마이크로유체 카트리지 내의 형광성 프로브들, 태그들, 형광체들 및 분석물들의 신뢰적이고 민감한 검출의 문제점을 다룬다. 미러면은 가열 블록의 상부면 상에 형성되고 사용 중에 검출 챔버의 하부 광학 윈도우에 접촉하여, 각각의 1회용 카트리지의 저부 상에 일체형 미러를 제조하는 복잡성 및 비용을 회피하고, 열전달에 대한 더 낮은 저항성 및 카트리지의 열광학 윈도우를 위한 투명한 광학 특성들을 갖는 더 얇고, 더 유연한 필름들을 사용할 수 있게 한다. 미러면은 광학적으로 편평하고, 열전달 및 형광성 방출 캡처의 모두를 향상시키도록 연마된다. 스캐닝 대물 렌즈가 마이크로유체 카트리지의 상부에서 상부 광학 윈도우 위에 위치된다. 여기광은 미러에 타격하여 재반사되기 전에 상부 광학 윈도우 및 하부 열광학 윈도우의 모두를 통해 전달된다. 직접 및 반사된 방출물들은 대물 렌즈에 의해 수집되고 포토다이오드, 포토셀, 광전 디바이스, CMOS 또는 CCD 칩과 같은 검출 센서 상에 포커싱된다.
또한, 종래 기술의 교시들에 완전히 대조적으로, 형광성 검출의 문제점은 여기 광학 기기들이 공통 광학 경로 상의 방출 광학 기기들로부터 디커플링되도록 광학 기기들을 구성함으로써 해결되는 것으로 보인다. 바람직한 실시예에서, 시행착오에 의해, 후방 미러를 사용할 때, 본 발명자들은 반사 미러의 평면 부근 또는 후방에 여기 원추의 초점을 배치하고 방출물들이 검출 센서 상에 우선적으로 포커싱되도록 방출 원추를 독립적으로 위치설정하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다. 선택적으로, 여기 원추는 대물 렌즈 상에 수렴 소스빔을 지향함으로써 근시야에서 재포커싱될 수 있다. 놀랍게도, 디커플링은 감도를 증가시키고, 검출의 한계들을 향상시키고, 샘플 내의 기포들 및 다른 불균질성들의 간섭 또는 노이즈를 감소시킨다.
종래 기술의 교시들과는 대조적으로, 본 출원인은 여기 및 방출 신호의 통상의 공초점 국부화가 광범위한 샘플 및 작동 조건들에 걸쳐 강인한 신호를 발생하는데 있어서 덜 효과적이라는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 신호 검출의 최적화는 샘플의 평면으로부터 샘플 후방의 점으로 여기의 초점의 변위에 의해 향상될 수 있고, 마이크로유체 형광 분석들과 함께 사용을 위한 저비용 광학 기기들의 분야의 기술적 진보가 발견되었다. 여기 및 방출 광학 기기들의 디커플링(decoupling)(즉, 여기광 및 방출 신호들을 위한 상이한 초점들)은 공초점 현미경, 낙사형광 검출, 및 마이크로유체 형광 분석들에서 통상의 실시의 기초를 형성하는 원리들(미국 특허 제 3013467호에서 민스키에 의해 최초로 주장됨)에 전용되는 수십년간의 종래 기술에 대해 훌쩍 뛰어넘는 것이다. 종래 기술의 교시들은 비구면 렌즈들, 레이저 다이오드들 및 여기 광학 기기들과 검출 광학 기기들의 정밀한 동일 초점거리 정렬의 사용을 유도하였다. 대조적으로, 여기에 설명된 바와 같은 여기 원추의 비국부화 초점을 위해 요구되는 광학 기기들은, 저비용의 휴대용 기구를 제조하기 위해 바람직한 바와 같이, 뜻밖에도 매우 저가이고 정밀한 조립 또는 유지보수를 요구하지 않는다.
검출 챔버 아래의 가열 블록의 상부면 상의 미러면은 대물 렌즈의 광 수집 능력을 향상시킴으로써 감도를 증가시키는데 사용된다. 대물 렌즈는 검출 챔버에 근접하여 배치되기 때문에, 규정된 각도 개구 및 개구수의 렌즈가 방출물들을 수집하는데 더 효율적이게 된다. 후방 미러가 없으면, 종래 기술의 통상의 시스템의 수집 효율은 2.5% 미만(예를 들어, 5 mm 평면볼록 렌즈를 가정함)이다. 후방 미러를 추가하는 것은 200%만큼, 이론적으로는 400%만큼 이 수집 효율을 향상시킬 수 있다. 샘플 챔버 후방에 여기빔을 포커싱하는 것은 미러를 사용하여 여기 경로길이를 증가시킴으로써 감도의 임의의 이득을 시너지 효과를 발휘하여 추가시킬 수 있다. 본 발명자들은 이러한 것이 작은 형상비의 마이크로유체 카트리지들에서 특히 유리하다는 것을 발견하였는데, 여기서 카트리지의 z-축 상의 광학 경로 길이는 통상적으로 표준 광학 큐벳에 대한 상당한 감소인 1 밀리미터 미만의 길이이다. 운좋게도, 이 조합은 작은 기포들의 존재와 같은 샘플 챔버 내의 불규칙성들에 기인하는 간섭들을 감소시키는 것으로 또한 판명되었다.
일 실시예에서, 미러는 알루미늄 또는 구리 가열 블록 상에 크롬 도금되거나 연마된 금속 표면이고, 또한 온도 제어된 분석들을 위한 열 또는 냉각을 전달하는데 사용되어, 따라서 디자인의 다른 시너지를 성취한다. 바람직한 실시예에서, 미러는 광학적으로 편평한 알루미늄 블록 상에 전해연마된 크롬면이고, 그 우수한 열전달 특성들 및 스케일가능한 열적 관성 때문에 알루미늄이 선택된다. 블록은 블록의 베이스와 접촉하는 저항성 가열 소자에 의해 가열된다. 미러면의 평활도 및 평탄도는 최적 열전달을 돕는다. 본 발명의 이 양태에서, 미러면은 예를 들어, PCR 앰플리콘들을 위한 형광성 프로브들의 열적 용융 분석 또는 FRET 검출을 위해 사용된 가열 소자의 상부면이다. 일 실시예에서, 미러면 가열 블록의 광학 및 열적 특성들의 조합된 용례는 분석 유체의 온도를 상승시키면서 형광성을 모니터링함으로써 취해진 FRET 용융 곡선들의 구성에 의해 예시된다. 다른 실시예에서, 미러면 가열 블록은 카트리지가 형광성 방출을 위해 스캐닝되는 동안 마이크로유체 카드의 검출 챔버 내의 반응 온도를 조정하거나 제어하는데 사용된다. 실시간으로 마이크로유체 카트리지들과 함께 사용을 위한 미러면 가열 블록 및 온도 조절된 형광성 분석들은 기술 분야의 진보를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명자들은 스캐닝 헤드 내에 치밀하게 장착된 하류측 신호 처리 펌웨어의 사용을 통해 증강된 노이즈 제거를 갖는 고이득 다단 증폭기를 이용하였다. 여기광 원추의 매우 고이득 증폭 및 평면외 비국부화는 액체 샘플 후방의 미러면으로부터 정반사를 혼란시키는 기포들의 존재시에도 분석 구별 및 감도를 최적화하는데 시너지 효과를 발휘하는 것으로 판명되었고, 운좋게도 비용의 증가 없이 구현되었다.
완전한 광학 경로는 3개의 렌즈들, 즉 광원으로부터 여기를 시준하기 위한 제 1 렌즈, 미러 상에 여기 소스를 투영하기 위한 그리고 시준된 방출물들로서 샘플 내의 임의의 형광체로부터 형광성 방출물을 수집하기 위한 제 2 렌즈, 및 검출기 상에 방출물들을 포커싱하기 위한 제 3 렌즈를 사용한다. 각각의 형광체는 측정을 위해 개별 광학 채널에 의해 광학적으로 격리된다. 스펙트럼 특정 LED들, 2색 미러들 및 배리어 필터들의 조합이 각각의 광학 채널 내의 근단색 여기광을 성취하는데 사용된다. 여기 및 방출 파장들 및 필터들을 분리하기 위한 광 경로를 교차하는 2색 미러를 포함하는, 렌즈들 및 관련 광학 부품들이 검출 챔버들을 가로질러 측방향으로 이동하는 가이드레일-장착된 스캐닝 헤드 내에 제공된다. 노이즈를 최소화하기 위해, 헤드는 신호를 증폭하기 위한 모든 전자 부품들 및 아날로그 및 디지털 신호 처리를 위한 온보드 매립형 마이크로프로세서를 또한 포함한다. 데이터 취득의 신호 평균화 및 기준선 차감 방법들을 좌절시키는 기포 포말 간섭들의 존재시에도, 각각의 광학 채널로부터 분석 스캐닝 데이터는 단일 비트 출력(즉, 1 또는 0)으로 변환에 의해 정확하게 평가되어 보고될 수 있다. 이는 검출기 헤드가 검출 챔버 또는 챔버들 상에 그리고 미러면을 가로질러 스캐닝되는 동안 액체 샘플 혼합물 내의 특정 형광체로부터 신호의 존재 또는 부재에 대한 정량적 스코어링을 위한 간단하고 현저하게 효과적인 수단인 것으로 판명되었다.
스캐닝 헤드 및 레일들은 스캐닝 중에 정확한 공간 분해능을 위해 스텝퍼 모터에 결합된 구동 체인을 갖고 구성된다. 전체 마이크로유체 카트리지 도킹 베이 및 광학 벤치는 피치가 있는 각도에서 기구 하우징 내에 장착되는데, 이는 본 발명자들이 마이크로유체 카트리지 상의 로딩, 습윤 및 혼합 작업들 중에 기포 혼입을 감소시키고 통기를 향상시키는데 있어서 유리한 것을 발견하였다. 바람직한 실시예에서, 전체 광학 벤치는 기포들이 마이크로유체 회로로부터 변위되도록 약 15도의 각도로 장착되어, 부유 광학 벤치 및 도킹 베이를 위한 완전한 서스펜션 장착부 및 카트리지가 기구 내로 로딩될 때 삽입가능한 카트리지와 광학 벤치 조립체의 저부 상의 도킹 베이에 장착된 온보드 가열 소자들 사이의 열전도성 인터페이스의 활발한 형성을 보장하기 위한 스프링 바이어스된 클램핑 메커니즘을 필요로 한다. 각형성된 카트리지와 가스켓이 있는 공압 인터페이스 포트 사이의 밀봉된 인터페이스는 또한 도킹 중에 설정되어야 한다.
검출기 헤드는 검출 챔버를 가로질러 스캐닝될 수 있고, 또는 역으로 마이크로유체 카트리지는 검출기를 가로질러 스캐닝될 수 있다. 여기에 구현되는 바와 같이, 검출기는 트윈 쌍을 이룬 가이드레일들 상의 스텝퍼 모터의 제어 하에서 웜기어- 또는 래크 및 피니언 기어-구동 스테이지를 갖고 장착된다. 샘플들은 모터 제어에 의해 데이터 취득을 동기화함으로써 요구시에 스캐닝될 수 있는데; 이는 검출기 헤드 내의 매립형 마이크로프로세서와 통신하는 온보드 또는 외부 호스트 제어기를 사용하여 수행될 수 있다. 놀랍게도, 온더플라이(on the fly)로 측정치들을 샘플링하고, 필터링하고, 평균화하기 위한 선형 운동 스테이지 상에 장착된 일체형 코프로세서를 갖는 이러한 검출기 헤드는 다수의 잠재적인 간섭들에도 불구하고 분석 결과들을 유효화하고 보고하기 위한 시스템의 능력을 향상시켰다.
샘플 우물, 검출 챔버, 검출 채널 또는 필드를 가로지르는 형광 강도의 편차가 존재할 것인데, 이는 1 밀리미터 내지 수 밀리미터의 폭일 수 있다는 것이 예측되었다. 이들 편차들은 예를 들어 혼합시에 불균질성들의 결과로서, 우물 두께의 차이들로부터, 광학 윈도우들 내의 불완전성들로부터, 작은 온도 편차들로부터(예를 들어, 검출되는 앰플리콘들의 혼성체화-의존성 형광성의 수반하는 편차들을 유발할 수 있음) 그리고 탈가스 및 혼합으로부터 발생할 수 있는 기포들 또는 포말로부터 발생한다. 이들 편차들은 검출 챔버를 가로지르는 샘플링 횡단에 걸쳐 신호 디지털화에 의해 최소화될 수 있는 것으로 판명되었다. 임계치가 이하에 더 설명되는 바와 같이, 포지티브 및 네거티브 테스트 결과들을 구별하는데 사용될 수 있다.
노이즈 제거를 더 제공하기 위해, 이질적인 노이즈가 AC 라인 변동들에 의한 간섭 및 다른 주위 전기 또는 RF 간섭을 방지하기 위해 알려진 주파수에서 여기빔을 스트로빙(strobing)함으로써 제거되어, 더 청결한 신호 변조, 기구 하우징 내로 누설하는 임의의 주위광의 효과들을 제거하도록 또한 필터링될 수 있는 변조된 신호를 생성한다. 본 발명자들은 전용 코프로세서를 갖는 광학 인쇄 회로 기판을 구성하고, 독립 클럭 주파수 및 펌웨어를 사용하여 이 결과를 성취하였는데, 이는 호스트 기구에 접속된 데이터버스 상의 트래픽을 효과적으로 최소화한다. 온보드 광학 신호 프로세서는 광학 카드 상에 상주하는 EEPROM 내에 저장된 전용 명령들을 갖고, 전자기 간섭을 제한하도록 선택된 주파수에서 센서 포토다이오드의 인터로게이션(interrogation)을 갖고 소스 LED에 송신된 펄스들을 동기화한다. 펌웨어는 여기광의 스트로브 조명 버스트들 사이의 신호의 차이 및 스트로브 버스트들 사이의 배경을 평가하고, 주위 또는 이질적인 광에 기인하는 임의의 배경이 이 방법에 의해 즉시 차감된다.
최종 광학 모듈은 밀봉된 검출기 하우징 내에서 패키징되고, 직렬로 또는 병렬로 다수의 샘플들 또는 형광체들을 동시에 스캐닝하기 위한 다수의 광학 채널들을 갖는 일련의 광학 모듈들로서 확장될 수 있다. 신호 처리는 검출기 헤드 내에 매립된 자율적 코프로세서로, 거기로부터 호스트 기구 제어기로 라우팅된다. 따라서, 본 발명은 단일 헤드/단일 채널 실시예들, 이중 헤드/이중 채널 실시예들, 및 멀티헤드/멀티채널 실시예들을 포함하고, 단일 샘플들 상에 또는 다수의 샘플들 상에서 병렬로 단일 및 멀티플렉스 분석들을 수행할 수 있다.
일반적으로, 분석 시스템은 샘플을 가로질러 검출기 헤드를 스캐닝하는 것이 가능한 기계적 시스템을 포함하고, 검출기 헤드는 적어도 하나의 검출 채널, 더 바람직하게는 복수의 검출 채널들을 수용하고, 각각의 검출 채널은 대물 렌즈에 의해 수신된 광학 신호들을 캡처하고 증폭하도록 구성된 대물 렌즈 및 광전 회로 소자들을 포함하고, 기계적 시스템은 검출기 헤드의 외부의 제어기 및 회로에 의해 작동되고, 광전 소자들은 상기 검출기 헤드 내에 매립된 마이크로프로세서와 연계된 펌웨어 내에 상주하는 자율적 데몬(daemon)의 제어 하에 있다. 유리하게는, 모든 구성요소들이 근접해 있는 경우에 차폐형 검출기 헤드 내에서 광학 신호 취득과 처리의 분리는, 그렇지 않으면 검출기 헤드 외부의 호스트 기구 내에서 발생하는 아날로그 기능들과 연계될 것인 무시할만한 신호 노이즈를 갖는 다단 증폭을 위한 시스템을 실현한다. 자율적 데몬의 제어 하에서 신호 처리 및/또는 신호 디지털화를 위해 구성된 광전 소자들을 포함하여, 광전 회로 소자들은 호스트 기구 내의 임의의 외부 회로로부터 전자적으로 격리하여 작동된다. 본 발명자들은 이러한 것이 기술의 진보라고 고려한다.
검출기들은 이중 헤드 및 멀티헤드 검출기들로서 수용될 때 양호하게 기능하는 것으로 발견되었고, 여기서 단일 하우징 내의 2개 이상의 채널들은 완전히 독립적인 광학 기기들, 형광체-특정 필터들, 2색 미러들 및 소스 LED들을 갖고 구성되어, 다수의 형광체들 사이의 누화를 감소시킨다. 헤드는 따라서 선택적으로 제 1 회로 기판 상에 장착된 복수의 광원들 및 제 2 회로 기판 상에 장착된 복수의 대물 렌즈 및 연계된 검출기들을 포함할 것이고, 공유된 신호 처리 능력 및 검출기 헤드 내에 매립된 펌웨어를 사용하여 독립적으로 복수의 형광체들의 각각을 위한 신호들을 수집할 것이다. 노이즈를 감소시키기 위해, 어떠한 아날로그 신호들도 검출기 헤드로부터 호스트 기구로 전송되지 않는다.
이 방식으로, 각각의 채널 내의 여기를 위한 광원들은 개별 형광체들에 정합될 수 있다. 샘플에 타격하는 여기광의 좁은 통과빔을 보장하기 위해 더 이상 백색광 및 여기 필터를 제공할 필요가 없다. 이 간단화는 "바이플렉스(biplex)" 또는 멀티플렉스 타겟 및 제어 신호들의 쌍을 이룬 수집을 호출하는 분석 프로토콜들에 유용한 것으로 입증되었다. FDA CLIA 웨이버(waiver) 요구들에 대해, 양 타겟 및 제어 템플레이트들이 병렬로 증폭되는 경우에, 포지티브 제어 신호는 테스트 샘플 상의 분석 결과가 보고되거나 빌링될 수 있기 전에 존재해야 한다. 검출가능한 제어 신호의 부재시에, 검출된 임의의 타겟 신호는 유효한 결과는 아니다. 이들 CLIA 웨이버 요구들에 부합하기 위해, 형광성 검출기는 동일한 PCR 반응 또는 기구 내에서 병렬로 행해진 PCR 반응에 의해 증폭되고 타겟과 공존하는 예를 들어 PCR에 의해 증폭된 타겟 감염 기관의 존재 뿐만 아니라, 내인성 인간 제어 기관의 존재를 검출하는 것이 가능해야 하는 것이 필요하다.
이러한 접근법은 바람직하게는 형광체 검출기가 공통 검출 챔버 내의 "바이플렉스"("듀플렉스") 증폭 반응 혼합물로서 타겟 및 제어 형광체들의 모두의 존재를 결정하는 능력을 갖는 것을 요구한다. 타겟 형광체(예를 들어, 도 25 참조)를 위한 형광성 여기 및 방출 스펙트럼으로부터 선택적 대역 통과 필터들에 의해 양호하게 해결되도록 시프트되는(파장에 있어서) 형광성 여기 및 방출 스펙트럼들을 갖는 포지티브 증폭 제어 형광체가 통상적으로 사용된다. 그러나, 본 발명에 따르면, 이중 헤드 검출기를 사용하여 그리고 각각의 헤드에 한번씩 각각의 검출 챔버를 2회 스캐닝함으로써 우수한 분해능을 성취하여, 먼저 제어 형광성 서명을, 이어서 타겟 샘플 형광성 서명을 검출하는 것이 가능한 것으로 입증되었고 - 각각의 스캐닝 통과는 개별 여기 및 방출 광학 기기들을 필요로 한다.
이익은 완전히 분리된 독립적인 광 경로들을 갖는 이들 검출기들을 구성함으로써 발견되었다. 본 발명의 본 양태에서, 듀플렉스 헤드 디자인의 사용은 샘플 내의 증폭 제어 형광체의 존재가 "누화"에 기인하여 타겟 채널 내에 신호를 부주의하게 생성하지 않는 것을 보장한다. 이러한 상황은 "거짓 양성"으로서 분류되는 샘플을 야기할 것이다. 역으로, 타겟 채널로부터 제어 채널로 누화가 존재하지 않는 것이 또한 중요한데, 이는 다수의 신호들이 공통 광학 경로를 공유할 때 가능성이 있다. 이러한 상황은 이것이 해당되지 않을 수도 있을 때, 포지티브 증폭 제어부가 부주의하게 존재하는 것으로 간주되는 것을 야기할 수 있고, 무효 분석 허용 불가능한 결과의 보고를 유도할 것이다.
이들 원리들은 타겟을 위한 분자 프로브로서 플루오로세인 또는 등가의 형광체, 및 제어부를 위한 분자 프로브로서 텍사스 레드(Texas Red) 또는 등가의 형광체들의 사용에 의해 예시된다. 개별 여기 및 검출 광학 기기들을 각각 갖는, 플루우로세인의 검출을 위해 최적화된 하나의 검출 채널 및 텍사스 레드에 대해 최적화된 다른 검출 채널을 갖는 이중 헤드 검출기가 놀랍게도 민감하고, 정확하고, 강인한 것으로 판명되었다. 검출기 헤드는 이후에 샘플 상에 각각의 광학 채널을 위치시키도록 이동되었고, 개별 형광성 판독들이 행해졌다. 놀랍게도, 이는 분해능을 향상시키고 누화를 최소화하지만, 검출기 헤드를 이동하는 기계 장치들에 기인하여 더 높은 노이즈 또는 민감도의 손실에 기여하지 않았다. 여기는 백색광으로 수행되지 않고, 대신에 개별 형광체에 대해 특정한 파장에서 수행되기 때문에, 제 2 형광체의 켄칭이 문제가 되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 출원인은 다수의 마이크로유체 채널들이 다수의 샘플 우물들을 가로질러 멀티헤드 검출기의 순차적인 횡단에 의해 스캐닝될 수 있고, 각각의 헤드는 단일의 형광체의 여기 및 방출을 위한 독립적인 광학 기기들을 갖고 구성된다는 것을 발견하였다. 여기 및 검출 광학 기기들은 각각의 광학 채널에 대해 분리되어 있지만, 신호 처리는 검출기 헤드 내에서 공유된 회로 내에서 수행된다. 검출기 헤드는 외부 제어기의 제어 하에서 스캔들을 수행하고, 반면에 검출기 헤드 내의 데몬은 스캔 중에 부닥치는 샘플 우물들의 맵을 자율적으로 구성하고, 맵은 적어도 하나의 기준점에 대한 위치의 함수로서 신호 강도를 표현하는 데이터쌍들을 갖는다. 일 예에서, 기준점은 검출기 헤드에 의해 취해진 규정된 스캐닝 경로 상의 공간 좌표이고, 여기서 기준점은 상기 카트리지 본체의 정합 특징부와 연계되고, 예를 들어 기계적, 전기적 또는 광학 스위치를 트리거링하는 특징부와 연계될 수 있다. 샘플 우물들은 우물의 벽 또는 에지와 연계된 광학 신호 강도의 변화, 또는 우물 에지를 식별하는 다른 기준에 의해 검출된다. 몇몇 경우들에서, 기준점은 제 1 우물의 제 1 에지로서 취해지고, 맵은 각각의 우물들의 제 1 에지로부터 제 2 에지까지의 폭에 대한 정보를 포함하여, 액체가 도입될 때, 각각의 맵 점에 대한 배경 스캔이 샘플과 연계된 임의의 광학 신호들로부터 차감될 수 있게 된다.
따라서, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 공통의 또는 병렬의 검출 챔버 내에 공존하는 타겟 및 핵산 증폭 제어부의 존재를 향해 지향된 고도의 특이성을 갖는 케어 분자 진단 분석의 점을 위한 강인한 멀티헤드 독립 채널 형광성 검출 시스템을 제공한다. 더 청결한 신호는 신호 대 노이즈비의 대응 감소 없이 더 높은 이득 전자 증폭을 허용한다. 본 발명의 제 1 실시예는 예를 들어 단일의 검출 챔버 내에서 혼합된 타겟 및 제어부를 검출하기 위한 2개 초과의 채널들을 갖는 그리고 다수의 타겟들의 검출을 위한 다수의 분석 채널들을 갖는 형광성 검출 시스템을 실현한다. 선택적으로, 헤드들은 실린더에서와 같이, 나란히, 어레이로, 또는 방사상으로 위치될 수 있다.
독립적인 광학 경로들의 사용은 뜻밖에도 렌즈들의 조립체, 2색 빔스플리터들, 및 연계된 필터 요소들을 위한 감소된 요구를 야기하여, 장치의 제조성을 향상시킨다. 본 발명의 실시예들은 저가의 비정밀 광학 기기들, 플라스틱 렌즈들, 샘플 윈도우 후방의 가열 블록 상의 미러, 가동 스테이지 요소들, 스트로브된 여기 및 방출, 노이즈 억제, 가동 검출 필드 상의 온보다 연속 신호 처리, 및 쌍을 이룬 타겟 및 제어 형광체들의 사용에 의한 바이플렉스 분석 유효화를 하나 초과의 광학 채널을 합체한다. 그 높은 증폭 이득에도 불구하고, 기구는 검출 챔버 내의 전기 노이즈 및 기포들과 같은 간섭들에 대해 유리하게 저항하는 것으로 입증되었다.
도 1은 도킹 베이 내의 마이크로유체 카트리지 및 본 발명의 기구의 사시도.
도 2는 도킹 베이 내의 마이크로유체 카트리지의 삽입을 도시하는 애니메이션화된 도면.
도 3은 장치의 기능 유닛들, 소프트웨어 및 펌웨어의 개요를 제공하는 블록도.
도 4a는 도킹 베이, 광학 벤치, 및 마이크로유체 카트리지를 히터 모듈과 열적으로 접촉하고 마이크로유체 카트리지를 스캐닝하기 위한 클램핑 메커니즘을 갖는 부유 스테이지의 개략도.
도 4b는 부유 스테이지, 도킹 베이, 광학 벤치 및 마이크로유체 카트리지가 접지 평면에 대해 규정된 각도("세타")에서 기구 섀시 내에 장착되어 있고, 여기서 접지 평면은 수평인 것을 개념적으로 설명하고 있는 도면.
도 5a 및 도 5b는 도킹 베이, 광학 벤치 및 스캐닝 검출기 헤드를 갖는 서스펜션-장착 스테이지를 도시하는, 위 및 아래로부터 본 정면 및 후면 내부 사시도.
도 6a는 하면 히터 모듈 및 냉각팬을 도시하는, 도킹 베이 아래로부터 본 정면 내부 사시도.
도 6b는 가열 블록 요소 및 미러면을 갖는 히터 모듈의 상세도.
도 7a 및 도 7b는 도킹 베이 내에 적소에 삽입 가능한 카트리지를 갖는 부유 스테이지의 사시도로서, 명료화를 위해, 도킹 샌들 및 부속 장착 요소가 제거되어 있는 사시도.
도 8은 도킹 새들의 하면으로부터 현수된 부유 스테이지 및 도킹 베이의 상세도로서, 부유 스테이지는 4점 스프링 서스펜션부를 구비하는 상세도.
도 9a 및 도 9b는 클램핑 메커니즘의 전방 서브조립체 도면이고, 도 9b는 클램핑 기어 래크 상의 웜 구동 작동을 도시하는 도면.
도 10a 및 도 10b는 클램핑 메커니즘의 후방 서브조립체 도면이고, 도 10b는 클램핑 기어 래크 및 플래튼 아암의 웜 구동 작동을 도시하는 도면.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 검출 시스템과 함께 사용을 위한 삽입 가능한 미량분석 카트리지의 사시도.
도 12는 미량분석 카트리지의 내부 부품을 도시하는 분해도.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 검출 시스템과 함께 사용을 위한 삽입 가능한 미량분석 카트리지의 평면도 및 입면도.
도 14a는 내부 공압 매니폴드, 공압 인터페이스 멀티포트, 및 히터 모듈을 갖는 장착 플레이트를 격리하여 도시하고, 도 14b는 사용시에 미량분석 카트리지에 의해 점유된 위치를 도시하는 도면.
도 15는 중앙 공압 입구 포트 어레이를 갖는 미량분석 카트리지 노즈의 분해도.
도 16은 공압 인터페이스 멀티포트를 통한 단면도의 위치를 도시하는, 미량분석 카트리지를 갖는 장착 플레이트의 평면도.
도 17은 공압 인터페이스 멀티포트를 통한 단면도.
도 18은 카트리지 및 히터 모듈을 통한 단면도의 위치를 도시하는, 미량분석 카트리지를 갖는 장착 플레이트의 평면도.
도 19는 가열 매니폴드 및 미량분석 카트리지를 통한 단면도.
도 20은 히터 모듈 조립체를 분해도로 도시하는 도면.
도 21은 도킹 베이 내의 카트리지 상에 인가된 스프링력의 개략도.
도 22는 카트리지 및 히터 모듈의 노즈에 지향된 팬출구를 갖는 케이스-장착 송풍기를 도시하는 장치의 부분 조립체의 도면.
도 23은 여기 및 배출 검출을 위한 전기 절연된 회로 기판 및 듀얼 광학 채널을 갖는 검출기 헤드의 사시도로서, 하우징의 일 반부는 내부 부품들을 도시하기 위해 제거되어 있는 사시도.
도 24a 및 도 24b는 이중 광학 채널들, 가열 블록 장착된 미러 및 마이크로유체 카트리지를 갖는 형광성 검출기의 내부 광학 구성요소들의 개략도로서, 여기 광학 기기들은 하나의 회로 기판 상에, 검출 광학 기기들은 다른 회로 기판 상에 장착되어 노이즈 간섭을 감소시키는 개략도.
도 25a 및 도 25b는 액체 샘플 내의 2개의 형광체들의 방출 및 여기 파장들을 도시하고, 누화의 제거를 위해 이중 헤드 광학 격리를 예시하고 있는 도면.
도 26a 내지 도 26d는 제어 및 타겟 신호들을 갖는 분석 조건들 하에서 검출기 헤드의 증폭기로부터 전자 트레이스들의 도면.
도 27은 형광성 여기를 제어하고, 형광성 방출 신호들을 수신하고, 처리하고, 호스트 기구에 디지털식으로 통신하기 위해 사용되는 검출기 헤드 전자 기기들의 블록도.
도 28a 및 도 28b는 기포 간섭의 디지털 제거를 도시하는 원시 입력 및 디지털화된 출력의 도면.
도 29a는 카트리지 검출 챔버 및 미러면 가열 블록에 대한 여기 원추 및 평면볼록 대물렌즈의 도면.
도 29b는 카트리지 검출 챔버 및 미러면 가열 블록에 대한 짧은 작업 거리에서 평면볼록 대물 렌즈를 갖는 방출물 수집의 도면으로서, 1차 및 반사된 형광성 방출물들이 도시되어 있는 도면.
도 30은 디커플링된 여기 및 방출 광학 기기들을 갖는 광학 경로의 개략도로서, L1'<L1이고, 소스빔이 분기하고 있는 개략도.
도 31은 디커플링된 여기 및 방출 광학 기기들을 갖는 광학 경로의 개략도로서, L1'>L1이고, 소스빔이 수렴하고 있는 개략도.
도 32a는 미러 위의 대물 렌즈의 높이를 변경함으로써 신호 출력의 향상을 설명하는 실험 결과들을 플롯팅하는 도면이고, 도 32b는 후방 미러를 갖는 그리고 갖지 않는 일체형 출력 신호 강도를 도시하는 도면으로서, 출력 신호는 도 29a에 도시된 바와 같이 미러 후방의 초점에서 여기빔을 포커싱하고 도 29b에 도시된 바와 같이 더 짧은 작업 거리에서 방출물들을 수집함으로써 최적화되는 것으로 판명되었던 도면.
도 33a는 온도의 함수로서 앰플리콘들에 혼성체화된 분자 비콘으로부터 발생하는 형광을 도시하는, 포지티브 분석 결과 및 제어를 위한 포개진 열적 용융 곡선 데이터를 도시하는 도면이고, 도 33b 및 도 33c는 Tm을 지시하는 제 1 도함수를 계산하는 열적 용융 프로파일을 분석하는 도면.
이하의 상세한 설명은 예시의 목적으로 특정 상세들을 포함하지만, 당 기술 분야의 숙련자는 이하의 상세들에 대한 다수의 변형들 및 변경들이 청구된 발명의 범주 내에 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이하의 정의들이 청구된 바와 같은 본 발명을 설명하는데 보조로서 설명된다.
정의들
"데몬"은 본 명세서에서 대화식(interactive) 사용자의 직접 제어 하에서보다는 자율적 배경 프로세스로서 매립형 마이크로프로세서에 의해 또는 호스트 제어기에 의해 실행된 펌웨어 내에 저장되는 광학 데이터 취득 및 처리(optical data acquisition and processing: ODAP)를 위한 프로그램가능 명령 세트의 동작을 칭한다. 데몬은 노이즈로부터 전자적으로 격리되고 검출기 헤드 내에 국부화되는 전자 회로를 작동하고 제어하는 가상 머신으로서 고려될 수 있다. 검출 광학 기기들과 연계된 다수의 증폭기들로부터 조절된 출력들은 3단 증폭기 내에서 조절되고 증폭되는데, 3개의 증폭기 출력들 중 하나는 디지털화에 이어서 신호 처리 및 위치 데이터의 표 작성을 위해 선택된다. 데몬은 이어서 광학 데이터를 배경 스캔들과 비교하고, 형광성이 사용자로의 표시를 위해 호스트 시스템에 데이터를 보고하기 전에 포지티브 분석 결과인지 여부에 대한 복합 판정을 행한다. 작동 중에, 호스트 시스템은 온도 및 공압 제어, 검출기 헤드 스캐닝, 사용자 인터페이스 작동성, 및 고장 모니터링과 같은 다양한 분석 기능들을 수행하기 위해 멀티태스킹하고, 방출 신호 취득 및 처리에 관련된 작업들은 본 명세서에서 "ODAP 데몬"이라 명명되는 데몬에 위임된다.
"각도 개구(angular aperture)"는 대물 렌즈에 진입하여 이미지 형성에 참여할 수 있는 단일점으로부터 가장 분기된 광선들 사이의 각도이다.
"후방 초점 길이"는 렌즈에 진입하는 시준된 광의 입사빔을 갖는 렌즈에 대해, 렌즈의 후방면으로부터 포커싱된 광의 원추의 초점까지의 거리(L)로서 정의된다. "후방 초점 위치들"은 비시준된 광선들이 렌즈의 네이티브(native) 초점 길이로부터 광학 기기들을 디커플링함으로써 렌즈의 후방으로부터 대안 거리들에 포커싱될 수 있는 것을 지시한다.
타겟 분석물 또는 "관심 분석물" 또는 "타겟 분자"는 핵산, 단백질, 항원, 항체, 탄수화물, 세포 성분, 지질, 수용체 리간드, 약물과 같은 작은 분자 등을 포함할 수 있다. 타겟 핵산들은 유전자들, 유전자들의 부분들, 유전자들의 조절 서열들, mRNA들, rRNA들, tRNA들, siRNA들, cDNA를 포함하고, 단일 가닥(stranded), 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다. 몇몇 핵산 타겟들은 다형태들, 결손들 및 대안 스플라이스 시퀀스들을 갖는다. 다수의 타겟 도메인들이 단일 분자 내에 존재할 수 있는데, 예를 들어 면역원은 다중 항원 결정자들을 포함할 수 있다. 항체는 가변 영역들, 일정 영역들 및 Fc 영역을 포함하고, 이는 항체들을 고정하는데 가치가 있다. 타겟 분석물들은 제조된 바와 같은 카트리지를 일반적으로 구비하지 않지만, 분석될 액체 샘플 내에 포함되고, 대조적으로 "제어 분석물들"은 통상적으로 카트리지를 구비하고 분석의 적절한 성능을 보장하기 위해 분석된다. 타겟 분석을 포함하는 스파이크된 샘플들은 당 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 특정 품질 제어 테스팅에서 캘리브레이션을 위해 사용될 수 있다.
증폭을 위한 수단: 시조 기술은 미국 특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호 및 제 4,800,159호, 아우스벨(Ausubel) 등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 미국 매릴랜드주(1989년), 및 이니스(Innis) 등의, ("PCR Protocols", Academic Press, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에이고, 1990년)에 상세히 설명된 중합효소 연쇄 반응(PCR이라 칭함)이었다. 중합효소 연쇄 반응 방법론들은 열순환을 필요로 하고, 당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 간략하게, PCR에서, 타겟 시퀀스의 대향하는 상보적 가닥들 상의 영역에 상보적인 2개의 프라이머 시퀀스들이 준비된다. 과잉의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트들이 DNA 중합효소, 예를 들어, Taq 중합효소와 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 타겟 시퀀스가 샘플 내에 존재하면, 프라이머들은 타겟에 결합할 것이고, 중합효소는 프라이머들이 뉴클레오타이드들을 첨가함으로써 마커 시퀀스를 따라 확장되게 할 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승 및 하강함으로써, 확장된 프라이머들은 템플레이트로부터 해리되어 반응 생성물들을 형성할 것이고, 과잉의 프라이머들은 템플레이트에 그리고 반응 생성물들에 결합할 것이고, 프로세스가 반복된다. 형광성 중격제들(intercalating agents)을 첨가함으로써, PCR 생성물들이 실시간으로 검출될 수 있다.
다른 증폭 프로토콜들은 LAMP(DNA의 loop-mediated isothermal amplification) 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction: "LCR"), 핵산 시퀀스 기반 증폭(NASBA)을 포함하는 전사-기반 증폭 시스템(TAS)을 포함하고, , "롤링 서클(Rolling Circle)", "RACE" 및 "비대칭 PCR"이라 또한 명명된 "편측 PCR"이 또한 사용되고, 검출가능한 프로브에 상보적인 가닥이 과도하게 합성되는 장점을 갖는다.
이들 다양한 비-PCR 증폭 프로토콜들은 진단 분석들에 다양한 장점들을 갖지만, PCR은 분자 생물학 실험실 및 임상 진단들에서 쓸모있는 것으로서 남아 있다. 마이크로유체 PCR을 위해 여기에 개시된 실시예들은 하나 또는 다양한 증폭 프로토콜들을 실행하는 것이 가능한 마이크로유체 디바이스들의 일반적인 클래스의 대표적인 것 및 예시적인 것으로 고려되어야 한다.
통상적으로, 핵산 증폭 또는 확장은 증폭 반응을 수행하고 이 반응 혼합물에 타겟 핵산의 증폭을 허용하는 온도 조건들을 인가하기 위해 반응 성분들을 포함하는 "마스터 혼합물"을 갖는 상이한 시퀀스들을 가질 수 있는 하나 이상의 타겟 핵산들을 혼합하는 것을 수반한다. 마스터 혼합물 내의 반응 성분들은 반응 혼합물의 pH를 조절하는 버퍼, 에너지를 제공하는 천연 뉴클레오타이드들(A, C, G 및 T 또는 U에 대응함 - 종종 동일한 농도들로 존재함) 중 하나 이상 및 핵산들의 합성을 위해 필요한 뉴클레오타이드들, 핵산 합성의 개시를 용이하게 하기 위해 템플레이트에 결합하는 프라이머들 또는 프라이머쌍들 및 합성되는 상보형 핵산 가닥에 뉴클레오타이드들을 첨가하는 중합효소를 포함할 수 있다. 그러나, 증폭을 위한 수단은 핵산 타겟을 검출하기 위한 보조로서 프루던트(Prudent)의 US 7514212 및 마샬(Marshall)의 US 7517651 및 7541147에 설명된 바와 같은 개질된 또는 "비표준" 또는 "비천연" 염기들의 사용을 또한 포함한다.
"검출을 위한 수단"은 본 명세서에 사용될 때, 종단점, 즉 분석의 결과를 표시하기 위한 장치를 칭하고, 분광광도계, 형광계, 조도계, 포토멀티플라이어 튜브, 포토다이오드, 탁도기, 광자 카운터, 전압계, 전류계, pH 미터, 용량성 센서, 무선 주파수 송신기, 자기저항계 또는 홀-효과 디바이스를 구비한 기구를 포함할 수 있다. 커버 플레이트 내의 배율 렌즈들, 광학 필터들, 착색 유체들 및 라벨링된 프로브들이 분석 결과들의 검출 및 해석을 향상시키는데 사용될 수 있다. "라벨들" 또는 "태그들"은 종래 기술에 알려진 바와 같이 발색체들 및 형광체들과 같은 염료들; 및 화학발광체를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 자기 비드들 상에 장식된 ZnS로 코팅된 CdSe와 같은 QDot들 또는 QDot들 및 파라미터식 Fe3O4 마이크로입자들의 아말감화들이 본 발명의 분석의 감도를 향상시키는 편리한 방법이다. 형광성 켄칭 검출 종단점들이 또한 예상된다. 효소-링크된 면역분석들과 연계된 다양한 기판 및 생성물 발색체들은 당 기술 분야에 또한 잘 알려져 있고, 예를 들어 "상향 컨버팅" 형광체들과 같은 분석의 감도를 향상시키기 위해 검출 신호를 증폭하기 위한 수단을 제공한다. 형광 및 광학 검출기들은 포토다이오드들, 광전 디바이스들, 포토트랜지스터들, 아발란쉐 포토다이오드들, 포토레지스터들, CMOS, CCD, CID들(전하 주입 소자들), 포토멀티플라이어들, 및 역바이어싱된 LED들을 포함할 수 있다. 검출 시스템들은 선택적으로, 정성적, 정량적 또는 반정량적이다.
"분자 비콘"은 용액 내의 특정 핵산들의 존재를 보고하도록 설계된 단일 가닥 머리핀형 올리고뉴클레오타이드 프로브이다. 분자 비콘은 4개의 구성요소들: 스템, 머리핀 루프, 엔드-라벨링된 형광체 및 대향 엔드-라벨링된 켄처로 이루어진다. 머리핀형 비콘이 타겟에 결합되지 않을 때, 형광체 및 켄처는 함께 근접하게 놓이고, 형광이 억제된다. 상보형 타겟 뉴클레오타이드 시퀀스의 존재시에, 비콘의 스템은 타겟으로 혼성체화하도록 개방한다. 이는 형광체 및 켄처를 분리하여, 형광체가 형광하게 한다. 대안적으로, 분자 비콘들은 엔드-라벨링된 도너의 부근에서 방출하는 형광체들을 또한 포함한다. '파장-시프팅 분자 비콘들'은 형광체가 더 강하게 방출하는 것을 가능하게 하는 부가의 하베스터 형광체를 구비한다. 분자 비콘들의 현재의 리뷰들은 왕 케이(Wang K) 등, 2009년, Molecular engineering of DNA:molecular beacons. Angew Chem Int Ed Engl, 48(5):856-870; 시셀 케이에이(Cissell KA) 등, 2009년, Resonance energy transfer methods of RNA detection, Anal Bioanal Chem 393(1):125-35 및 리 와이(Li Y) 등, 2008년, Molecular Beacons: an optimal multifunctional biological probe, Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61을 포함한다. 최근의 진보들은 캐디 엔씨(Cady NC), 2009년, Quantum dot molecular beacons for DNA detection. Methods Mol Biol 554:367-79를 포함한다.
형광성 핵산 분석물들은 태그된 프라이머들 및 프로브-기반 검출 화학물들로의 증폭을 포함한다. 형광성 생성물은 분석의 종료시에 또는 실시간으로 증폭된 생성물의 양을 측정함으로써 분석될 수 있다. 한정적인 것은 아니지만, 다른 것들 중에서도, 3' 켄처 구성을 갖는 5' 리포터 염료의 변위 및 중합효소-매개 가수분해에 의존하는 TaqMan 프로브(Applied Biosystems), FRET 혼성체화 프로브들, 듀얼 올리고 FRET-기반 프로브들(Roche), 마이너 그루브 바인더-공액 혼성체화 프로브들(MGB 프로브들, Applied Biosystems), 이클립스 프로브들, 로킹된 NA 프로브들(Exiqon/Roche), 앨플리플루오르 프라이머 화학물들, 스콜피온스 프라이머 화학물들, LUX 프라이머들, Qzyme 프라이머들, RT-PCR이 본 발명에서 모두 적합하다. 중격 염료들이 또한 사용될 수 있다. 역전사효소는 RNA 타겟들을 분석하는데 사용되고 cDNA를 형성하기 위한 개별 단계를 필요로 한다. 최근의 진보들은 크라스노페로프 엘엔(Krasnoperov LN) 등의 2010. Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids. Bioconjug Chem 2010년 1월 19일 epub를 포함한다.
화학 염료들에 추가하여, 프로브들은 녹색 형광성 단백질들, 양자 도트들 및 나노도트들을 포함하는데, 이들 모두는 형광성이다. 핵산들 및 항체들과 같은 분자들 및 분석 타겟을 위한 친화도를 갖는 다른 분자들은 본 발명의 형광성 분석들에 유용한 프로브를 형성하기 위해 형광체로 태그될 수 있다.
"FRET"(Fluorescence Resonance Energy Transfer)은 분자 상호작용들의 연구를 가능하게 하는 형광 기술이다. 이는 혼성체화될 때와 같이 2개의 분자들이 근접할 때 일 형광체로부터 다른 형광체로(즉, 도너 및 켄처) 에너지의 전달에 의존한다. 최근의 진보들은 카르모나 에이케이(Carmona AK) 등의 [2009, The use of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides for measurement of clinically important proteolytic enzymes, An Acad Bras Cienc 81(3):381-92]를 포함한다.
문맥상 달리 요구되지 않으면, 이어지는 상세한 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "포함한다" 및 "포함하고" 및 "포함하는"과 같은 그 변형은 "포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아닌"으로서 개방의 포함적인 개념으로 해석되어야 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 "일 실시예", "실시예", "일 양태", 또는 "양태"의 언급은 실시예 또는 양태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 일 실시예를 포함하지만 반드시 본 발명의 모든 실시예를 포함하는 것은 아닐 수도 있다는 것을 의미한다. 더욱이, 여기에 개시된 본 발명의 특징들, 구조들 또는 특성들은 하나 이상의 실시예들에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. "통상"이라는 것은 본 발명의 관련하는 종래 기술에 공지된 것을 지시하는 용어이다. "약" 및 "일반적으로"는 광범위한 부정확의 표현들이고, "단지 약"의 개념에서 "다소", "대략적으로" 또는 "거의"인 조건을 설명하고, 변형은 하찮은, 명백한 또는 등가적인 실용성 또는 기능일 것이고, 또한 규범, 규칙 또는 제한에 명백한 소수의 예외들의 존재를 지시한다.
"누화"는 형광성 이미징에서, 샘플 내의 2개 이상의 형광체들(및/또는 기판의 자가 형광)의 여기 및/또는 방출 스펙트럼들이 양호하게 중첩하여, 하나의 형광체만의 활동을 격리하는 것을 어렵게할 때 발생한다.
이제, 도면들을 참조하면, 도 1은 도킹 베이 내에 마이크로유체 카트리지(200)를 갖는 기구(100)의 사시도이다. 멤브레인 패널(104) 및 터치스크린 디스플레이 표면(108) 및 소형의 섀시 또는 하우징(106)이 도시되어 있다. 모든 시약들은 마이크로유체 카트리지 내에 제공되어 있기 때문에, 기구는 완전 자립형 작동성을 갖는다. 도 2는 도킹 베이(103) 내로의 마이크로유체 카트리지 전방 노즈(105)의 삽입을 애니메이션화함으로써 이 외관도를 완성하고 있다. 도킹 베이는 서스펜션 장착되어 있고, 이하에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 기구 베이스에 대해 소정 각도로 경사질 수도 있다.
도 3은 분석 장치의 기능 유닛, 소프트웨어 및 펌웨어의 개요를 제공하는 블록도이다. 기계식, 공유압식, 온도 제어, 광학 및 입출력(I/O) 시스템들이 2개의 디지털 프로세서들에 의해 조화되는데, 제 1 프로세서는 "호스트 제어기"라 명명되고, 사용자 명령들을 수신하고 분석 결과들을 출력하고, 또한 분석의 기계적, 열적 및 공유압적 프로세스 단계들을 지시하고, 제 2 프로세서는 "매립형 프로세서"라 명명되고, 검출기 헤드 내의 신호 취득 및 처리를 포함하는 광학 시스템들에 대한 국부화된 제어를 행하고, 디지털 데이터를 호스트 제어기에 통신한다. 매립형 프로세서에 의해 제어된 광학 시스템들은 장치 하우징 내의 노이즈가 있는 아날로그 회로들로부터 검출기 헤드 내에서 차폐되어, 비교적 무노이즈 환경에서 높은 이득 증폭을 허용한다. 각각의 프로세서는 개별 클럭, 휘발성 및 비휘발성 메모리를 구비하고, 다른 것으로부터 자율적으로 수행한다.
개요로서, 기구 내의 부유 스테이지(1000, 점선)가 마이크로유체 카트리지를 수용하고 가역적으로 클램핑하기 위해 도킹 베이(여기서 1001)를 지지하고 스캐닝 검출기 헤드(311)를 구비한다. 검출기 헤드는 호스트 제어기의 제어 하에서 마이크로유체 카트리지의 광학 윈도우들을 가로질러 스캐닝된다. 검출기 헤드는 여기광을 제공하기 위한 서브조립체들 및 매립형 프로세서(1841)와 연계된 펌웨어 내에 상주하는 데몬의 제어 하에서 형광성 방출 신호들을 검출하고, 증폭하고, 처리하기 위한 센서들을 포함한다. 부유 스테이지는 고정 베이스플레이트 및 기구 스탠드에 장착된 스프링 서스펜션 상에 올려진다.
호스트 제어기(1003)의 제어 하에서 개별적으로 제어 가능한 가열 블록들을 갖는 히터 모듈, 공압 분배 매니폴드로서 또한 기능하는 베이스 플레이트(330) 상에 장착된 공압 서보들에 접속된 공압 인터페이스, 및 클램프 및 마이크로유체 카트리지의 위치를 측정하기 위한 압력 스위치들, 바코드 리더, 및 온도 모니터들을 포함하여, 클램프 모터 및 관련 센서들을 위한 배선 하네스들이 고정 베이스플레이트에 부착되고 부유 스테이지와 상호 작용하기 위해 위치되어 있다. 전력은 기구 스탠드 내에 장착된 재충전가능 배터리로부터 또는 자동차와 같은 AC 컨버터 또는 DC 소스로의 직접 접속에 의해 모든 시스템들에 분배된다.
호스트 제어기(1003)는 기구의 조작을 위한 터치 패드 패널 및 LCD 디스플레이 패널을 또한 포함하는 머더보드 상에 장착된다. 기구는 무선 네트워킹 카드 또는 다른 원격 통신 디바이스를 포함하는 다양한 디지털 직렬 I/O 링크들을 거쳐 외부 네트워크 또는 디바이스에 데이터를 전송할 수 있다. 특정 디지털 접합이 고체 상태 ROM 내에 인코딩된 소프트웨어인 RAM 레지스터들 및 프로그래밍으로의 서비스 액세스를 위해 제공된다.
액체 샘플로부터 특정 질병 또는 병리를 진단하는 능력을 갖는 특정 미량분석 카드를 작동하도록 요구되는 공압 펄스들 및 밸브 로직의 시퀀스와 같은 기구의 작동을 위한 일반적인 명령들이 분석들을 실행하기 위해 휘발성 및 비휘발성 메모리가 공급된 호스트 제어기와 연계된 프로그램가능 소프트웨어에 의해 제공된다. 예를 들어, 바코드 리더가 특정 미량분석 카트리지를 검출하면, 디바이스는 그 바코드로부티 인식된 특정 분석을 수행하고 지정된 포맷으로 결과들을 표시하도록 프로그램된다.
그러나, 소스 강도의 변조, 신호 증폭 및 필터링을 포함하는 신호 취득 광학 기기는 검출기 헤드(311) 내의 센서 PCB 상의 매립형 마이크로프로세서(1841) 내에 상주하는 데몬의 제어 하에 있다. 따라서, 노이즈에 매우 민감한 전기 신호들은 호스트 기구의 더 노이즈가 있는 환경으로부터 검출기 헤드 내에서 차폐되고, 검출기 헤드로부터 호스트 A/D 컨버터들로의 아날로그 신호들의 전송이 완전히 회피된다. 이러한 기능들의 비통상적인 분리는, 완전한 휴대성 및 현장 작업을 위해 요구되는 바와 같이, 기구의 노이즈 민감성을 감소시키는데 있어서 매우 유리한 것으로 운좋게 입증되었고, 노이즈가 있는 전자 환경인 것으로 예측될 것들에서 고이득 3단 증폭기의 사용을 예기치 않게 허용한다.
기계적 시스템들
온보드 광학 벤치 및 도킹 베이를 갖는 부유 스테이지는 기구의 독특한 특징이다. 이 특징은 도 4에 개념적으로 소개되어 있다. 도 4a는 기구의 1차 광학열기계적 서브시스템들의 개념적 표현이다. 부유 스테이지(300)는 4점 스프링 장착된 서스펜션(302, 303에 의해 지시됨)에 의해 경사 평면 상에 현수되고 마이크로유체 카트리지(200)를 수용하기 위한 도킹 베이(103)를 지지하는 트레이형 섀시(301)(점선 박스)로 이루어진다. 부유 스테이지(300) 상에는 쌍을 이룬 가이드레일들(308, 309) 상에 장착된 스캐닝 검출기 헤드(311)가 또한 지지되어 있다. 카트리지는 기구(100)의 부분은 아니지만, 부유 도킹 베이(103) 내에 삽입 후에 기구와 인터페이스한다.
작동 중에, 부유 스테이지는 장착 플레이트(330)에 대해 클램핑되고(320에 의해 지시됨) 히터 모듈(340) 및 연계된 저항 가열 소자들 및 회로들의 구역 가열 블록들(341, 342, 343, 344)의 접촉면들에 결합한다. 팬(345)이 냉각 중에 과잉의 열을 소산하도록 제공된다. 경사진 장착 플레이트는 또한 마이크로유체 카트리지의 베이스에 밀봉식으로 도킹하기 위한 공압 인터페이스 포트(350)를 구비한다. 공압 압력은 경사진 장착 플레이트(330) 내에 매립된 일체형 공압 분배 "매니폴드" 또는 시스템으로부터 공압 인터페이스 포트를 통해 카트리지에 전달된다. 공압 매니폴드는 경사진 장착 플레이트 상에 장착된 소스들로부터 네거티브 및 포지티브 압력을 공급한다. 머더보드 장착형 프로그램가능 호스트 제어기는 베이스 플레이트(330) 및 공압 인터페이스 포트(350) 내의 내부 매니폴드를 거쳐 카트리지 상의 펌프들 및 밸브들에 공압 구동 압력, 진공 및 제어 펄스들을 지시한다.
검출기 헤드(311)는 전동식이고, 카트리지의 스캐닝은 호스트 제어기의 제어 하에서 수행된다. 쌍을 이룬 가이드레일들(308, 309)을 따라 검출기 헤드를 스캔하기 위해, 호스트 제어기는 스텝퍼 모터(307)에 의해 구동된 웜기어에 결합한다. 검출기 헤드는 마이크로유체 카트리지의 전방 노즈 내의 광학 윈도우들을 스캔하고 원래 광학 신호들을 수집하는 대물 렌즈(315)를 갖는 외부 윈도우를 구비한다. 검출기 헤드(311)는 광학 신호 취득을 위해 호스트 제어기에 독립적으로 기능하는 상주 데몬을 갖는 그 자신의 매립형 마이크로프로세서(1841)를 갖는다. 호스트 제어기는 또한 히터 모듈(340)의 가열 소자들(341, 342, 343, 344) 내의 온도를 조절하고, 공압 인터페이스에 연결된 솔레노이드 밸브들 및 포지티브 압력 및 진공 펌프 저장조들의 세트를 제어한다. 기구는 사용자 상호작용들을 위한 디스플레이 패널 및 터치 패널을 갖춘다. 파워 입력은 탄력적이고, 선택적으로, AC 어댑터, 차량 어댑터에 의해, 또는 기구 아래에 장착된 재충전가능 배터리로부터 공급된다. 선택적 무선 IO 및 디지털 IO 포트들이 또한 포함된다.
도 4b는 부유 스테이지(301), 도킹 베이(103), 검출기 헤드(311) 및 마이크로유체 카트리지(200)는 접지 평면에 대한 규정된 각도로 기구 섀시(106) 내에 장착될 수 있다. 접지 평면으로부터의 각도로 카트리지를 경사시키는 것은 유체 로딩 중에 통기를 향상시키고, 습윤 및 혼합 작업들 중에 공기 혼입을 최소화한다. 열전달 및 분석 결과들의 광학적 인터로게이션과 간섭하는 기포 축적은 여기에 개시된 이러한 및 다른 혁신들에 의해 회피된다. 경사진 장착 플레이트(330)는 부유 스테이지(301), 카트리지(200) 및 클램핑(800) 및 광학 스캐닝(310) 서브조립체들의 기계적 구성요소들의 각도를 설정한다. 본 발명자들은 기포 축적이 핵산 증폭과 간섭되고, 스테이지의 각도를 이룬 장착에 의해 제한되어 왔다는 것을 발견하였다. 이 각도 "세타"는 접지 평면으로부터 10 내지 45도의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 20도이고, 가장 바람직하게는 약 15도인 것이 유리한 것으로 판명되었다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 검출기 헤드(311)는 정합하는 반부 쉘들(312, 313)을 갖는 조개껍질형 하우징을 포함한다. 검출기 헤드는 횡방향 가이드레일들(308, 309) 상에서 슬라이드하고, 웜 드라이브를 갖는 스텝퍼 모터(307)의 호스트 제어 하에 있다. 부유 스테이지 섀시(301)는 4점 서스펜션으로 스프링식으로 장착되고, 클램핑될 때까지 경사진 장착 플레이트(330)로의 직접 연결부를 갖지 않는다. 클램핑 메커니즘은 화살표(320)에 의해 여기에 비유적으로 지시되어 있고, 이하에 더 상세히 설명될 것이다.
2개의 스캐닝 가이드레일들(308) 중 하나는 이 도면에서 즉시 볼 수 있고, 부유 스테이지 섀시 또는 트레이(301)에 의해 어느 한 단부에서 지지되어 있다. 도킹 베이는 점선 박스(103)에 의해 지시되어 있고, 도시된 바와 같이 측면간에 스캐닝하는 것이 가능한(이중 화살표) 검출기 헤드(311) 아래의 마이크로유체 카트리지의 노즈의 삽입을 위한 개구를 표시한다. 도킹 베이 아래의 상승된 플랫폼으로서 여기에 도시되어 있는 공압 인터페이스 포트(350)는 도킹 베이와 일렬로 바로 아래에 위치되어 있는 히터 모듈(340) 및 가열 블록들(341 내지 344)의 도시를 차단하고 있다. 전력 조정, AC 어댑터들 및 배터리 저장 기능들이 편평한 표면 상에 놓이도록 설계된 기구 스탠드(329)의 이면 위에 경사진 장착 플레이트(330) 아래에 장착된다.
도 5a 및 도 5b는 광학 벤치 및 검출기 헤드(311)를 갖는 부유 섀시(301)를 갖는 서스펜션 장착 스테이지, 및 마이크로유체 카트리지(200)에 의해 점유된 도킹 베이를 도시하는, 상부로부터의 정면 및 후면 내부 CAD 도면들이다. 부유 스테이지는 경사진 장착 플레이트(330)에 단단히 볼트 결합된 새들형 지지부, 즉 도킹 새들(400)로부터 현수된다. 이하에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 클램핑 압력을 제공하는 기어 래크(401)가 또한 도시되어 있다. 도 5b에서, 광학 벤치의 가이드레일들(308, 309) 및 스텝퍼 모터(307)가 즉시 인식된다. 경사진 장착 플레이트(330)는 카트리지 도킹 메커니즘 및 스캐닝 검출기 헤드를 제시하는 명료화를 위해 도시되어 있지 않은 펌프들, 진공 및 압력 저장 탱크들, 솔레노이드들 및 공압 제어 회로가 존재하고 있다.
도 6a는 이면측 히터 모듈(340) 및 냉각팬(345)을 도시하는 도킹 베이로부터의 정면 내부 사시도이다. 도킹 베이 내로의 마이크로유체 카트리지(200)의 삽입시에, 히터 모듈(340)은 도 6b에 도시된 바와 같이, 정렬핀들(510) 상에 카트리지의 이면과 정렬되게 되고 단차부(511) 상에 놓인다는 것을 볼 수 있다.
가열 시스템
도 6b는 가열 블록 소자들["열 소자들"(341, 342, 343, 344)] 및 미러면(500)을 갖는 히터 조립체(340)의 상세이다. 히터 모듈의 우수한 양태는 하나 이상의 가열 블록들로 이루어지고, 이들 가열 블록의 각각은 분석 중에 카트리지의 포위된 채널들 및 챔버들 내에서 발생하는 생화학적 또는 분자 생물학적 반응들의 적절한 동작을 위해 마이크로유체 카트리지의 이면 상에 규정된 구역과의 열적 인터페이스를 형성한다. 이들 반응들은 면역결합(immunobinding) 또는 혼성체화(hybridization)만큼 간단할 수 있고, 또는 니코틴아미드 아데나인 디뉴클레오타이드 및 아데노사인 트리포스페이트의 형성 또는 소비에 결합된 핵산 증폭 또는 효소 탈수소화 또는 캐스케이딩 응고 인자들만큼 복잡할 수 있고, 일반적으로 최적 반응성 및 특이성을 위한 비교적 엄중한 온도 제어를 필요로 한다. 가열 블록들(341, 342, 343, 344, 본 발명은 이 구성에 한정되는 것은 아님)은 스프링 장착될 수도 있고, 열전달을 위한 높은 열확산도 접촉 구역을 설정하기 위해 클램핑 메커니즘의 하향 압력에 대향하여 상향으로 압박된다. 각각의 가열 블록은 일반적으로 양호한 열전도도를 위한 유연한 열적 패드에 의해 저항성(쿨롱) 가열 소자와 열 접촉한다. 각각의 가열 블록은 마이크로유체 카트리지 내의 열적 윈도우에 접촉한다. 각각의 윈도우는 일반적으로 가요성 플라스틱 필름의 얇은층이고, 두께가 3 mil 미만일 수 있고, 가장 통상적으로 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Mylar®)와 같은 유연한 투명 재료로 이루어지지만, 선택적으로 이에 한정되는 것은 아니지만(공동 양도된 미국 특허 제 7416892호 참조) 양호한 광학적 투명성을 갖고 또한 양호한 열전도도를 갖는 고리형 폴리올레핀 또는 폴리이미드로 이루어진다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 검출 챔버 내의 액체 샘플의 온도를 제어하거나 조절하면서 마이크로유체 카드 내의 검출 챔버의 반사성 투조(transillumination)를 위한 열광학 인터페이스이다. 이 특징은 분석물과 연계된 광학 신호를 모니터링하면서 분석물과 연계된 반응 또는 반응들을 수행하기 위해 유리하다. 일 예시적인 용례에서, 열적 용융 곡선들은 FRET 혼성체화 결과들을 검증하는데 사용된다.
팬 하우징(345)이 또한 도시되어 있고, 이 팬 하우징은 가열 블록들 아래의 히트 싱크들로부터 열을 소산하는데 그리고 저항 가열 회로들(도 20)과 조합하여 블록들 내의 온도의 PID 제어를 위한 부속물로서 사용된다. 제 2 팬(도 22)은 이하에 설명되는 바와 같이, 분석 카트리지의 반응 챔버들을 냉각하는데 사용된다.
이 경우에 가열 블록(341)은 분석 중에 마이크로유체 카드(200) 내의 열광학 윈도우들과 접촉하여 정렬하는 상부 양태 상의 연마된 크롬 미러면(500)을 갖는 제조에 의해 수정된다. 이 경우에 열광학 윈도우는 카트리지 본체 내에 포위된 검출 챔버에 대응한다. 미러면은 이하에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 스캐닝식으로 카트리지를 투조하는 검출기 헤드(311)로부터 대물 렌즈(315) 내로 재차 광을 반사하고, 또한 카트리지 검출 챔버들로부터 검출기 헤드 내로 그리고 거기로부터 통상적으로 포토다이오드인 검출 센서로 임의의 형광성 방출물을 반사한다. 본 예에서 가열 블록(341)은 다른 가열 블록들과는 상이하고, 일반적으로 알루미늄으로부터 가공되고, 이어서 크롬 미러면의 적용 전에 니켈 아래 구리의 하위층으로 코팅된다. 전해연마 및/또는 버핑(buffing)이 크롬 표면 상에 매우 반사성의 광학 마감부를 형성하는데 사용될 수 있다. 블록의 광학적으로 편평한 상위면은 열전달을 보조하고, 형광성 분석들의 민감성을 향상시킨다. 운좋게도, 미러의 사용은 예를 들어 용융 곡선들을 광학적으로 분석하는데 유용한 바와 같이, 검출 챔버의 유체 내용물들의 동시 가열 및 광학 인터로게이션을 허용한다.
다른 가열 구역들은 유사하게 동시 온도 제어 또는 조절을 갖는 광학적 모니터링을 허용하도록 수정될 수 있다. 가열 구역들 및 미러들의 구성은 특정 분석/카트리지 요구들을 위해 수정되거나 적응될 수 있고, 여기에 개시된 구성에 한정되지 않는다.
도 6b는 여기서 10개의 출구들을 갖는 공압 인터페이스 포트(350)를 또한 도시하고 있고, 각각의 출구는 호스트 기구의 공압 분배 매니폴드로부터 프로그램가능 호스트 제어기의 제어 하에서 독립적으로 포지티브 또는 네거티브 압력의 소스에 독립적으로 연통된다. 이들 출구는 마이크로유체 카드의 이면의 정합 입구들에 인터페이스하여 밀봉되고, 상호연통하는 공압 압력, 진공 및 압력 펄스들의 시간조절된 패턴이 카트리지 내의 분석을 구동하고 제어하기 위해 공압 인터페이스를 통해 안내된다.
도 7a 및 도 7b는 도킹 베이(103) 내의 적소에 삽입가능한 카트리지가 있는 부유 스테이지 서브조립체(300)의 사시도들이다. 명료화를 위해, 도킹 새들(400) 및 부속 장착 요소들은 제거되어 있다. 어떻게 마이크로유체 카트리지(200)의 내부면이 도 6b의 히터 모듈(340)의 정합된 상위면들과 접촉되도록 성형되는지를 도 7a에서 볼 수 있다. 카트리지는 적소에 볼트결합되어 삽입을 안내하는 2개의 부착된 횡방향 플랜지들(609, 610)에 의해 부유 스테이지(301) 아래에 고정되어 지지된다.
클램핑 메커니즘
도 7b에서, 4점 서스펜션(600)의 수형 요소들을 형성하는 4개의 수직 기둥들(601, 602, 603, 604)이 부유 스테이지(300)의 전방 섹션에 보여진다. 이들 기둥들은 코일 스프링들(도 8에서 603a)을 구비하고 도킹 새들 부재(400)의 부분으로서 형성된 원통형 서스펜션 하우징들(605, 606, 607, 608) 내에 삽입된다. 서스펜션(600)은 다음의 도면, 도 8에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 부유 스테이지(300) 및 광학 스캐닝 조립체를 현수하는 역할을 한다. 전체 광학 벤치 및 도킹 베이 서브조립체(도 7a 및 도 7b에 도시됨)는 이 서스펜션 상에 부유하고, 도 9 및 도 10에 설명되는 바와 같이 클램핑 메커니즘의 하향 작용시에만 기구의 나머지와 단단히 접촉하게 된다.
도 8은 검출 헤드(311) 및 도킹 베이(103)가 도킹 새들(400)의 이면으로부터 현수되어 있는 부유 스테이지(300)의 분해도이다. 부유 스테이지는 4개의 지지 기둥들(601, 602, 603, 604)의 각각 상에 코일 스프링들(603a의 복제본들)을 갖는 4점 스프링 서스펜션을 구비한다. 각각의 기둥은 도킹 새들의 정합된 서스펜션 하우징(605, 606, 607, 608) 내에 수용된다. 마이크로유체 카트리지(200)는 도시되지 않았지만, 도킹 베이는 도킹 베이의 돌출 립(515)에서 카트리지의 노즈를 수용하도록 구성되어, 카트리지가 하부 횡방향 플랜지들(609, 610) 상에 놓이게 된다는 것을 이 도면에서 볼 수 있다. 정렬핀들(616, 617)은 히터 모듈(340)에 대해 아래로 가압될 때 도킹 베이가 실제로 안착하는 것을 보장한다. 가이드레일들(308, 309) 및 형광 스캐닝을 위한 검출기 헤드(311)를 포함하는 부유 스테이지의 후방 섹션은 도킹 새들에서 이외에 임의의 지지부도 갖지 않고, 작동 중에 도킹 새들로부터 외팔보형으로 지지된다. 스캐닝 검출 헤드(311)의 운동을 지지하는데 있어서 가이드레일들의 역할이 이 도면에서 명백하다.
도킹 새들은 이하에 설명되는 바와 같이 클램핑 메커니즘(800)을 부착하기 위한 브래킷들(712, 713)과, 자동화 작동을 위해 유용한 바와 같은 바코드 리더를 구비한다. 슬롯(711)을 갖는 링커 아암(710)이 이하에 설명된 바와 같이 클램핑 기어 메커니즘 및 단일 조립체로서 상승되거나 하강되는 부유 스테이지(300)에 의해 결합된다. 링커 아암(710)은 가열 블록들에 대해 카트리지를 작동적으로 가압한다.
도 9a는 클램핑 메커니즘의 정면도이다. 도킹 새들(400)의 브리징 형상은 부유 도킹 베이(103)의 전방 노즈(515) 위에 놓이는 것으로 보여진다. 도킹 베이 마우스 바로 아래에는 마이크로유체 카트리지(200)를 수용하기 위한 채널을 형성하는 횡방향 플랜지들(609, 610) 사이에서 볼 수 있는 공압 인터페이스 포트(350)가 있다. 로딩된 카트리지의 도킹 중에, 클램핑 메커니즘의 기능은 전술된 바와 같이 카트리지가 하향으로 삽입된 상태로 공압 인터페이스 포트 및 히터 모듈 상에 부유 스테이지 및 스프링 장착된 섀시(301)를 압박하는 것이다.
도킹 새들(400)은 장착 플레이트(330) 상에 볼트결합되고, 부유 스테이지 섀시(301)는 4점 서스펜션(600) 상에 현수된다. 서스펜션 스프링은 상승된 위치에 있을 때 클램핑 조립체(800)의 현수 작용에 의해 대향되는 부유 스테이지 상에 하향 압력을 인가한다. 다음에, 카트리지를 클램핑할 때, 클램프 기어편(804)은 웜기어(801) 및 웜기어 모터(802)에 의해 구동되어, 주행 액슬(803)을 하향 원호 형태로 구동한다. 액슬핀(803a)은 캠 블록(901, 도 9b에서 볼 수 있음)에 부착된다. 링커 아암(710, 도 8 및 도 10a에서 볼 수 있음)은 4점 서스펜션 상에서 상 또는 하로 클램핑 기어(401) 및 슬라이더 블록(901)의 캠 작용을 따른다. 카트리지를 분리할 때, 작용은 역전된다. 웜기어 모터(802)는 시계방향으로 운전하여, 핀(803a) 및 캠 블록(901)을 상승시키고, 따라서 스테이지 섀시 조립체(301)의 부분인 링커 아암(710)을 상승시키고, 이어서 역전된다(이중 화살표). 스테이지 섀시가 최상위 휴지 위치에 있을 때, 마이크로유체 카트리지는 기구로부터 제거될 수 있다. 기계적 기준들 또는 정렬핀들이 분석 중에 기구 도킹 베이 내에 카트리지를 정합하는데 사용된다.
도 9b는 기어 코움(804a) 및 웜 구동 기어(801)를 갖는 클램프 기어편(804)의 전방측의 상세도로서, 기어의 위치를 모니터링하고 호스트 제어기에 의해 조화된 기계적 기능들을 작동하기 위해 압력 스위치들에 의해 사용된 기어 부재의 전방 에지 상의 캠 종동자면들(805, 806)을 또한 도시한다. 간단화를 위해, 압력 스위치들은 도시되어 있지 않다. 액슬(810)은 편을 위한 회전의 중심이고, 핀(810a) 상에서 회전한다. 액슬(803)은 기어편의 회전 중에 이동하여, 이후의 도면에 도시된 바와 같이 스테이지 섀시와 결합하는 슬라이더 블록을 구동한다.
도 10a 및 도 10b는 클램핑 메커니즘 조립체(800)의 작용을 도시하는 기계적 도면들이다. 클램프 기어 구동 캠의 용도는 부유 스테이지(301)를 상승시키고 하강시키기 위한 것이다. 클램핑 기어편(804)은 정지 액슬(810) 상에서 피벗하여, 이동 액슬(803)이 상향 또는 하향 원호를 묘사하여, 링커 아암(710)을 수직으로 상 또는 하로 추진한다(이중 화살표). 핀(803a) 상에 포획된 슬라이더 블록(901)은 부유 스테이지(300)를 상승 또는 하강시키면서 클램프 기어의 운동의 횡방향 벡터를 수용하기 위해 링커 아암(710, 도 8 참조) 내의 슬롯(711) 내에서 좌측에서 우측으로 슬라이드한다. 부유 스테이지의 상향 이동은 이전의 도면들에 도시된 바와 같이, 스프링들(603a)에 의해 대향된다. 도 10b는 중심 액슬(810a) 및 편심 캠 블록 액슬(803a) 및 캠 슬라이더 블록(901)을 도시하는 클램프 기어편(804) 및 웜 구동 기어(801)의 후방측의 상세도이다.
여기에 도시된 메커니즘은, 본 발명이 예를 들어 위로부터 아래로보다는 아래로부터 위로 클램핑함으로써, 또는 기계적으로 클램핑하기보다는 자기적으로 클램핑함으로써, 대안적인 방식들로 실현될 수 있는 한, 한정적인 것은 아니다. 다른 스프링 수단은 코일 스프링, 판 스프링(leaf spring), 비틀림 스프링, 나선형 스프링, 및 공압 캐니스터들(예를 들어, 가스 스프링들) 및 탄성 중합 재료들 또는 당 기술 분야에 공지된 다른 등가의 수단과 같은 대안들로부터 선택될 수도 있다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 장치와 함께 사용을 위한 삽입가능한 미량분석 카트리지(1100)의 사시도들이다. 여기에 도시된 카트리지는 내부 작업부들을 갖는 하우징(1102) 및 커버플레이트(1103)로 이루어진다. 포트(1104)는 액체 샘플을 수용하기 위한 것이고, 전방 노즈(1105)는 호스트 기구의 도킹 베이 내로 삽입을 위한 것이다. 카트리지 하우징 내의 윈도우(1101)는 도 13에 도시된 바와 같이, 샘플 우물들(1201) 위에 형성된 광학 윈도우이다. 가스켓(1106)은 호스트 기구의 공압 인터페이스 멀티포트(350)와 밀봉식으로 인터페이스하기 위한 것이다. 아래로부터 도시된 것은 내장 회로 카드(1200) 및 외장 회로 카드(1204)이다.
공유압식 시스템들
도 12는 미량분석 카트리지(1100)의 내부 구성요소들을 도시하는 분해도이다. 이 특정 카트리지(1100)는 FRET 또는 분자 비콘 검출을 갖는 PCR을 위해 설계된다. 진단 용례에 따라 이용될 카트리지 디자인 및 분석 반응들 및 부합될 특정 요구들의 상세들을 결정하는 것은 당 기술 분야의 숙련자에게 바람직하게 남겨두고, 이하의 상세한 설명은 단지 예시로서만 제공된다.
샘플은 입구 포트(1104)를 통해 추가된다. 하우징 노즈(1105)의 노즈 상의 광학 윈도우(1101)는 호스트 기구 내에 삽입되고, 미량분석 내장 회로 카드(1200)의 분자 비콘 검출 챔버들(1201) 또는 FRET의 윈도우들이 검출기 헤드에 의해 스캐닝되고 이 검출기 헤드는 이어서 광학 윈도우 길이방향을 횡단하는 선형 경로를 따르도록 정렬된다. 샘플 준비에 관련된 추가된 처리는 외장 카드(1204) 상에 제공된다. 모든 액체 시약들은 밀봉된 파열가능한 파우치들(1206) 내에 포위되고, 공압 제어 하에서 요구될 때 분배된다. 다른 시약들이 건조 형태로 온카드(on-card)로 제공된다. 유체 폐기물은 플라스틱 커버플레이트(1103) 아래에 적소에 밀봉되어 있는 흡착성 배팅(batting)(1207) 내에 격리되어 있다. 임의의 특정 생화학적 또는 분자 미량분석의 상세들은 본 발명의 범주를 벗어나지만, 핵산 타겟을 열순환하고 증폭하기 위한 내부 미량분석 채널들 및 우물들을 갖는 미량분석 회로(1200)는 임의의 최종적인 앰플리콘의 FRET 검출을 위한 검출 챔버들(1201)을 포함한다.
가스켓(1106) 내의 10개의 포트들을 통해 유도되는 공압 공급물은 양 카드(1200, 1204) 내의 회로에 유동 접속된다. 카드(1204) 내의 초기 샘플 처리 중에, 카드(1200) 내의 공압 요소들이 작동되지만, 카드가 비어 있기 때문에 어떠한 효과도 없다. 다음에, 처리된 샘플이 분석을 위해 카드(1200)에 전달될 때, 카드(1204) 내의 공압 요소들이 작동되지만, 카드가 더 이상 요구되기 때문에 어떠한 효과도 없다. 뜻하지 않게, 이는 2개의 카드들(1200, 1204)을 개별적으로 제어하기 위해 과잉의 공압 포트들을 위한 필요성 없이 멀티플렉스 밸브 로직을 성취한다. 10개의 포트들이 대부분의 분석들에 충분한 것으로 판명되었고, 베이스플레이트(330) 내에 포함된 외부 공압 공급 매니폴드에 부가의 복잡성 및 중복성의 필요성 없이, 포지티브 압력 및 흡인 압력의 모두를 포함하여, 펌프들, 밸브들 및 통기구들을 위한 개별 압력들과 개별적으로 연계된다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 장치와 함께 사용을 위한 삽입가능한 미량분석 카트리지(1100)의 평면도 및 입면도이다. 카트리지의 전방 노즈(1105) 상에 광학 윈도우들(1101)이 도시되어 있다(노즈가 호스 기구 내에 삽입되고, 광학 윈도우들이 검출기 광학 기기들에 의해 스캐닝됨). 히터 조립체(340) 및 가스켓팅된 공압 제어 인터페이스 포트(350)에 대해 카트리지를 압축하기 위한 플래튼 표면(1107)이 또한 도시되어 있다.
도시된 바와 같은 카트리지는 사용시에 호스트 기구 내에 도킹 베이(103) 내에 삽입되는 1회용 카트리지(1100)이다. 카트리지 하우징의 횡방향 리브들(1110)은 구조적 보강을 위한 것이고 도킹 프로세스를 보조한다. 도 14a는 포위된 내부 공압 매니폴드, 히터 모듈(340), 및 공압 인터페이스 멀티포트(350)를 갖는 경사진 장착 플레이트(330)의 사시도이고, 도 14b는 호스트 기구 내에 도킹될 때 미량분석 카트리지를 도시한다. 이 도면에서, 카트리지는 공압 제어 인터페이스 멀티포트 상에 유동 결합되고, 히터 모듈(340)의 4개의 구역 히터들과 열적으로 접촉된다. 플래튼 표면(1107) 상의 압력은 열 및 공압 인터페이스들에 대해 카트리지를 압박한다. 장착 플레이트는 공압 인터페이스 멀티포트(350)를 통해 카트리지에 조절된 공압 압력을 공급하는 내부 공압 제어 매니폴드를 포함한다. 완전한 기구에서, 장착 플레이트(330)는 압력 조절기들, 어큐뮬레이터들, 및 카드 공압 기기들을 제어하기 위한 솔레노이드들이 존재하고 있다.
도 15는 미량분석 카트리지(1100)의 노즈(1105)의 분해도이고, 노즈는 광학 윈도우(1101) 및 내장 카드 부재(1200)를 포함한다. 포개진 내장 회로 카드(1200)와 외장 회로 카드(1204)는 공통 공압 제어 인터페이스(1111a, 1111b)를 공유하여, 여기서 밀봉 가스켓(1106)과 정렬하고, 비아들(vias)을 통해 내장 및 외장 유체 회로들의 모두에 입력들을 유동 접속함으로써 포트들을 공유한다. 이 경우에 외장 유체 회로는 샘플 전처리를 담당하고, 내장 회로는 전처리된 샘플을 수용하고 이를 타겟 분석물을 위해 분석한다. 감소된 인터페이스 복잡성은 내장 및 외장 카드들 사이의 공압 인터페이스 내에 공압 공급 포트들을 멀티플렉싱함으로써 성취된다. 공압 기기들은 먼저 외장 회로 내의 유체 동작을 위해, 그리고 이어서 내장 회로 내의 유체 동작을 위해 사용될 수도 있어, 복잡한 회로를 관리하는 문제점에 대한 경제적으로 놀라운 해결책이다.
더 일반적으로, 공압 인터페이스 어레이는 제 1 회로 카드 내의 공압 회로를 제 2 회로 카드 내의 공압 회로에 유동식으로 결합하는 비아에 의해 유동 접속된 복수의 공압 포트들을 포함하여, 복수의 공압 포트들이 프로그램가능 명령들에 따라 인가된 복수의 공압 펄스들을 수신하고 제 1 회로 카드 및 제 2 회로 카드의 유체 회로 소자들에 이들 공압 펄스들을 멀티플렉싱하는 것이 가능하여, 이에 의해 상기 제 1 및 상기 제 2 유압 회로들을 작동하도록 요구된 포트들의 수를 감소시키게 된다. 이하에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 예를 들어, 제 1 카드가 샘플로부터 핵산을 추출하기 위해 설계되고 제 2 카드가 분자 타겟을 증폭하고 검출하기 위해 설계될 때 유용한 바와 같이, 제 1 비아에서 공압 인터페이스에 인가된 공압 펄스는 외장 회로 카드로부터 내장 회로 카드로 유체 접합부를 통해 처리된 액체 샘플을 강제 이동한다.
보스들(1108)은 내장 카드 내의 원하지 않는 열전달을 제한하도록 좁은 단면을 갖고, 또한 더 큰 공압 다이어프램 부재들 주위에 규정된 원주에 압축 부하를 전달하는 기능을 한다. 핀 수용 구멍들(1109a, 1109b)은 새로운 카트리지를 호스트 기구 내에 로딩할 때 핀들(510a, 510b) 상에 도킹 베이(103) 내에 카트리지를 정렬하는데 사용된다.
도시된 특정 카트리지는 열순환 및 FRET 검출을 갖는 PCR을 위해 설계된다. 외장 카드(1204)는 샘플로부터 핵산 분획(fraction)을 격리하기 위해 의도된다. 열순환 및 핵산 타겟을 증폭하기 위한 내부 채널들 및 챔버들(1115, 1116)을 갖는 유체 회로 카드(1200)는 임의의 최종적인 앰플리콘의 FRET 검출을 위한 샘플 우물들(1201)을 포함한다. cDNA 합성을 위한 챔버들(1114)이 또한 도시되어 있다. 3개의 평행한 분석 채널들이 도시되어 있다. 다른 회로 구성들은 본 발명의 미량분석 검출 시스템과 함께 사용될 수 있고, 분석들은 3개의 채널들 또는 PCR에 의한 핵산 검출에 한정되지 않는다.
도 16은 공압 인터페이스 멀티포트(350)를 통한 단면도의 위치를 도시하는 미량분석 카트리지가 없는 장착 플레이트(330)의 평면도이다. 카트리지 및 히터 조립체(340)를 수용하기 위한 정렬핀들(510)이 또한 도시되어 있다. 다른 구멍들은 예를 들어 용매 용접에 의해 융착되어 있는 층상 아크릴로 제조되거나 3차원 인쇄의 프로세스에 의해 제조될 수 있는 장착 플레이트를 통해 연장하는 공압 매니폴드와 유체 연통하는 공압 시스템 구성요소들을 장착하는데 사용을 위해 의도된 포트들이다.
도 17은 내장 카드(1200) 내의 공압 채널들로 이어지는 비아들(1120a, 1120b 참조)을 결합하기 위한 포트들을 도시하는, 도 16에 절단된 섹션에서 공압 제어 인터페이스(350)를 통한 단면도이다. 10개의 포트들(351)은 비아들을 통해 장착 플레이트(330) 내에 포위된 공압 매니폴드에 접속되고, 이들 중 공압 채널(1121)이 대표적이다. 카드 공압 제어 인터페이스(350)에 대해 카드의 공압 인터페이스 포트를 안착하기 위한 카트리지 정합핀들(510a, 510b)이 또한 도시되어 있다.
여기에 블록 윤곽선으로 도시된 카드(1200)는 공압 분배 매니폴드(330)로부터 공압 인터페이스 멀티포트(350)를 거쳐 공급된 압축 가스 펄스들에 응답하여 작동하는 내부 공압 작업부들을 갖는다. 카드 내의 내부 공압 작업부들은 호스트 제어기에 의해 공급된 밸브 로직의 제어 하에서 작동 가능한 밸브 트리, 회로를 통해 유체들을 이동하기 위한 다이어프램 펌프들, 및 공압 제어 하에서 유체들을 분배하기 위한 유체 저장조들을 포함한다. 다수의 포트들을 위한 필요성은 밸브 로직이 카드 상에 배치되는 방식 및 다중 압력들을 위한 요구에 관련된다. 포지티브 및 네거티브 압력의 모두에서 공압 공급이 일반적으로 요구되고, 다수의 중간 압력 레벨들이 유리한 것으로 판명되었다. 유용한 것으로 판명된 압력들은 펌프들을 작동하기 위해 +10 psig, 밸브들(WO 공보 제 2002/081934호에 설명된 다이어프램 밸브들과 같은)을 개방하기 위해 -5 psig, 제로 압력 통기들을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 여기에는 도시되지 않았지만, 카트리지와의 10개 정도의 공압 상호접속부들이 결합될 수도 있다. 카트리지의 복잡성에 따라, 더 많거나 적은 포트들이 원한다면 공압 인터페이스를 리사이징하거나 재구성함으로써 사용될 수도 있다.
미량분석 카트리지(1100)의 공압 채널들과 공압 매니폴드(350)의 대응 포트들의 분리는 실리콘 고무 가스켓(1106), 일반적으로 유연한 탄성중합 가스켓이고, 이 가스켓은 카트리지가 기구 내에 로딩되고 스프링 압력이 인가될 때 압축 하에서 공압 상호접속부들을 밀봉한다. 가스켓(1106)은 종래의 지식에 따른 기구의 부분으로서가 아니라, 1회용 밀봉 가스켓으로서 기능하고, 1회용 카트리지가 유리하게 공급된다. 1회용 카트리지(1100)를 갖는 가스켓을 포함함으로써, 공압 인터페이스에서 더 양호하고 더 청결한 밀봉부가 얻어지고 가스켓을 주기적으로 교체하기 위한 요구가 배제된다. 가스켓들은 일반적으로 실리콘 고무 또는 다른 유연한 재료로 형성된다.
본 발명의 공압 회로들을 사용하여, 회로는 또한 호스트 기구 내의 다수의 공압 소스들을 공급함으로써 멀티플렉싱될 수도 있고, 여기서 접속 매니폴드(350) 내의 공압 공급 회로들은 부가의 공압 회로들을 위한 요구 없이, 포지티브 압력으로부터 네거티브 압력으로와 같이, 하나의 공압 압력으로부터 다른 공압 압력으로 스위칭될 수 있다. 따라서, 베이스플레이트(350) 내의 각각의 매니폴드 서브회로는 복수의 압력 상태들에서 작동될 수 있다. 이 방식으로, 공통 공압 인터페이스 포트 어레이를 거쳐 더 강한 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들에 더 강한 공압 "상태들" 및 더 약한 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들에 더 약한 공압 상태들의 분배를 멀티플렉싱하는 것이 가능하다. 유사하게, 공통 공압 인터페이스 포트 어레이를 거쳐 더 강한 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들에 더 강한 공압 "상태들" 및 진공 압력으로 작동하는 회로 소자들에 진공 공압 상태들의 분배를 멀티플렉싱하는 것이 가능하다. 제 1 회로 카드 및 제 2 회로 카드와 공통 공압 인터페이스를 결합함으로써, 공압 회로의 이중 기능성이 성취된다.
압력 상태들은 한정적인 것은 아니지만, -5 psi, +10 psi, +12 psi, +15 psi, +20 psi, +7 psi 및 0 psi를 포함하는 포지티브 및 네거티브 압력들의 범위로부터 선택되고, 여기서 더 높은 압력들이 예를 들어 시약 팩들을 파열하기 위해 사용되고, 네거티브 압력이 밸브들을 개방하기 위해 사용되는 등이다. 이들 압력들은 버퍼링된 압력 저장조들로부터 공급될 수 있다. 다이얼업 가변 압력 공급부들이 또한 사용될 수 있다. 공압 상태들은 마이크로프로세서 제어 하에서 매니폴드 서브회로들을 통해 카트리지에 공급된다. 각각의 분석은 유압 회로를 통해 유체를 이동시키는데 필요한 공압 밸브 및 펌프 로직에 따라 실행될 일련의 단계들로 이루어진다. 통기구들이 또한 회로의 필요 부분이고, 압축, 압력 역전 및 통기가 모두 각각의 개별 분석 유형의 요구들에 따른 기구 및 연계된 미량분석 회로의 용량 내에 있다.
도 18은 사용을 위한 위치에서 중첩된 카트리지(1100)를 갖는[미량분석 카트리지(1100)의 이면에 접촉하는 히터 모듈(340) 및 공압 인터페이스(350)가 카트리지 아래에 있음] 장착 플레이트(330)의 평면도로서, 카트리지 및 히터 모듈을 통해 절단된 단면도의 위치를 도시한다.
온도 제어 시스템들
도 19는 도 18에 표시된 단면 위치를 참조하여, 단면에서의 히터 모듈 및 카트리지(1100)의 노즈(1105)의 도면이다. 카트리지는 라벨링의 목적으로 가열 블록들(341 내지 344) 위로 상승되어 있다. 공압 상호접속 모듈(350)(포트들의 2개의 열들이 지시되어 있음)이 도 17 및 도 15를 참조하여 기능적으로 설명되었던 카트리지의 1회용 가스켓(1106)에 결합한다. 핵산 증폭 회로의 개별 챔버들에 접촉하도록 구성된 4개의 저항 구역 가열 블록들(341, 342, 343, 344)이 또한 도시되어 있다. 쌍을 이룬 정합핀들(510)이 블록들의 열 표면들이 유체 기기들에 적절하게 결합하도록 카트리지 하우징을 정렬한다. 단차부(511)는 카트리지의 노즈(1105)를 지지한다.
구역 가열 블록(341)은 열광학 인터페이스이고, 유체 회로 부재에 접촉하는 미러면(500)을 포함한다. 카트리지 하우징 내의 광학 윈도우(1101)는 미러면과 정렬하고 검출기 헤드가 레일(308, 309)(도 4)을 따라 슬라이드하여, 검출기 헤드(311)의 대물 렌즈 조립체(315)가 가열 블록(341)의 장축의 중간을 따라 아래로 연장하게 된다. 회로 내의 검출 우물들은 광학 윈도우 아래에서 열 블록 및 미러면 상에 정렬되도록 위치된다.
블록(341)은 FRET 결정들을 위해 온도 제어된다. 저항 가열 블록(342)은 분석이 시작되기 전에 이중 가닥 핵산 변성 언도로 조정되고, 블록(343)은 어닐링 온도로 설정된다. 어닐링 블록(343)은 변성 챔버들로부터 반송된 고온 유체가 급속하게 냉각될 수 있어, 따라서 열순환 시간을 가속화하도록 하는 냉각핀(343a) 및 송풍기(345)를 구비한다. 블록(344)은 필요하면 cDNA 합성을 위해 사용된다.
유체 회로는 가열 블록들(342, 343) 위에 놓인 한 쌍의 유체 챔버들을 포함할 수 있다. 쌍을 이룬 챔버들은 열순환에 의해 핵산들의 증폭을 위해 유용한 바와 같이, 변성 온도와 어닐링 온도 사이에서 유체 유동을 왕복하기 위한 미국 특허 제 7955836호 및 제 7763453호(공동 양도됨)에 설명된 바와 같이 협동적으로 작동되는 공압식으로 작동되는 다이어프램들을 포함한다. 각각의 가열 블록은 스프링 로딩되고, 유체 회로의 이면에 대해 가압한다. 여기에 도시된 스프링들은 이들의 치밀성을 위해 선택된 와이어 스프링들이다.
도 20은 히터 모듈의 분해도이다. 4개의 가열 블록들이 도시되어 있고, 각각의 블록은 저항 가열 소자들(347a) 및 중앙에 위치된 서미스터(347b)를 갖는 인쇄 회로 스트립(347)과 연계되고, 저항 히터들은 PID형 피드백 루프 제어 하에 있다. 인쇄 회로 상의 지지 회로는 개략적으로 제공되고 호스트 제어기로부터 제어된다.
각각의 블록은 스프링 지지부(348) 상에서 부유하고, 제한된 수직 범위에서 자유롭게 이동하기 위한 유연한 전기 접속부들을 구비한다. 블록들은 절결된 포켓들을 갖는 절연체 자켓(346)에 의해 서로 열적으로 절연된다. 가열 블록들은 지지 장착 플레이트(349) 내에 형성된 슬롯들 내에 클립 고정된다. 와이어 스프링들(348)은 열전달에 대한 저항을 감소시키기 위해 온건한 힘으로 카드(1200)(도 15)의 유연한 플라스틱 하면에 대해 블록을 압박하도록 구성된다.
도 21은 카트리지와 가열 블록들 사이의 열접촉을 담당하는 클램핑력과 스프링력의 균형을 도시하는 개략도이다. 도 5 내지 도 10을 참조하여 도시된 바와 같이, 부유 스테이지(301)의 도킹 베이(103)는 4개의 코너 기둥들(601, 602, 603, 604)의 각각 상에 장착된 스프링들이 일단 카트리지가 안착되면 카트리지 상에 가압되도록 편위되도록 4점 서스펜션(600)으로 장착된다. 클램핑 메커니즘(800)은 웜기어 구동되고, 가열 모듈 내의 정합핀들(510) 및 단차부(511)에 대해 카트리지를 압착한다. 각각의 가열 블록은 각각의 블록 아래의 독립적인 스프링 부재들에 의해 내장 회로 카드의 하면에 대해 상향으로 압박되는 부유 부재이다. 히터 모듈 내에 장착된 와이어 스프링들은 공압 분배 매니폴드(330) 상에 장착된 멀티포트(350)에 대해 카드 공압 인터페이스를 밀봉하기 위해 내장 유체 부재(1200) 및 가스켓(1106)의 이면에 대해 블록들을 위로 가압한다. 이 방식으로, 카트리지는 클램핑 조립체의 더 강한 서스펜션 스프링들에 의해 적소에 잠금되고, 가열 블록들은 히터 모듈 조립체의 더 약한 스프링들에 의해 내장 카드와 열적으로 접촉되어, 제조시에 적은 정밀도를 필요로 한다. 카트리지는 2개의 대향하는 스프링력들에 의해 도킹 베이 내에 개재된다(sandwiched). 횡방향 보강 리브들(1110)은 카트리지를 보강하는데, 더 유연한 내장 회로 카드들이 가열 부재들과 열접촉하는 것을 보장한다. 가열 부재의 표면을 가로질러 하향 스프링 현수력은 약 5 psi이고 상향 스프링력은 약 1 psi이고, 스프링들은 카트리지를 클램프하고 가열이 의도되는 내장 카드의 아래면에 대해 가열 블록들을 가압하도록 협동적으로 작용한다. 광학 윈도우(1101) 아래에 정렬된 cDNA 우물(1114), 어닐링 우물(1115), 변성 우물(1116), 및 검출 우물(1201)을 포함하는 카드(1200) 특징부들이 또한 예시를 위해 도시되어 있다.
도 21에 또한 도시된 바와 같이, 보스들(1108)은 유체 챔버들에 맞접하는(abutting) 카트리지 하우징의 내부면 상에 형성된다. 보스들은 압축이 회로의 유체 내용물들과 아래에 놓인 가열 블록들 사이의 낮은 열저항을 보장하는데 요구되는 유체 다이어프램 요소들 주위에 스프링 부하력들을 집중한다. 이들 보스들(1108)은 낮은 열적 단면을 위해 구성되고, 그렇지 않으면 cDNA 합성 및 열순환 챔버들 주위에 기생 열손실들 및 열 캐패시턴스를 증가시킬 것인 질량을 하우징으로부터 제거함으로써 형성된다. 낮은 열적 단면들은 또한 내장 유체 챔버가 증폭 회로들 위에 공기 간극을 갖고 카트리지 하우징 아래에 현수되기 때문에 횡방향으로 제시되고, 따라서 구역 히터들 사이의 전도 열 손실 및 열적 누화를 감소시킨다. 가열 블록들 사이에 삽입된 절연성 자켓(346)은 또한 각각의 열 구역을 격리하여 정확한 온도로 유지하고 저항 가열 소자들 사이의 대류 열적 누화를 회피하는데 사용된다.
샘플 우물들을 포함하는 미량분석 카트리지의 노즈(1105)는 또한 과잉의 열 질량을 회피하기 위해 얇게 형성된다. 도 22에 도시된 송풍기(360)는 배플이 있는 덕트(361)를 거쳐 카트리지의 노즈 상에 유도되고, FRET 결정들을 위해 유용하다. FRET에서, 분자 비콘이 타겟 분석물종들의 용융 온도를 초과하는 온도에서 검출 챔버 내의 단일 가닥 앰플리콘들과 혼합된다. 온도는 이어서 형광성 방출물들이 수집되는 동안 강제 냉각 공기를 사용하여 감소된다. 송풍기는 기구 섀시의 외부벽(359) 상에 장착된다.
일 예시적인 실시예에서, 혼합물이 냉각함에 따라, 분자 비콘은 타겟 시퀀스들로 어닐링하여, 프로브 내의 형광성을 켄칭한다. 형광성의 실시간 모니터링은 타겟 앰플리콘들의 아이덴티티를 유효화하기 위해 사용될 수 있는 용융 곡선을 생성한다. 테스트를 수행하기 위해, 구역 히터(341)는 타겟종들의 용융점을 초과하는 온도로 되고, 히터는 턴오프되고, 송풍기(360)는 턴온되고, 광학 윈도우(1101) 주위 및 아래에서 카트리지의 노즈(1105)로 유도된다. 반응 혼합물 및 형광성 내의 온도가 모니터링된다. 온도는 형광성의 변화들이 광학적으로 모니터링되는 동안 순환에 응답하여 매우 급속하게 저하하여, 복제 FRET 결정들이 각각의 샘플 우물 상에서 신속하게 수행되게 한다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 a) 듀플렉스 프로브의 용융 온도를 초과하는 온도로 FRET 프로브 및 타겟 핵산 시퀀스를 포함하는 샘플 챔버를 가열하는 단계; b) 상기 가열을 턴오프하는 단계; 및 c) 자율적 ODAP 데몬을 갖는 차폐된 검출기 헤드를 사용하여, 팬을 턴온함으로써 발생된 샘플 챔버의 온도의 변화에 응답하여 FRET 프로브의 형광성의 변화를 모니터링하는 동안 샘플 챔버를 가로질러 검출기 헤드를 스캐닝하여, 이에 의해 형광성을 모니터링하면서 상기 샘플 챔버를 급속하게 냉각하는 단계를 포함하는 FRET 용융 곡선 결정을 수행하기 위한 방법이다. 온도의 함수로서 형광성 강도의 도함수의 분석은 관심 애플리콘의 용융점 특성을 산출한다. 본 발명의 카트리지의 낮은 열적 질량을 사용하여 1분 미만에 이들 결정들을 행하는 것이 가능한 것으로 입증되었다. 가열 블록(341)은 냉각핀을 구비하고, 원한다면 측정을 가속화하도록 독립적으로 공기 냉각되지만, 일반적으로 이는 필요하지는 않았다.
광학 시스템들
도 23은 각각 여기를 위한 그리고 방출물 검출을 위한 2개의 광학 채널들 및 전자적으로 격리된 회로 기판들(1301, 1302)을 갖는 이중 채널 검출기 헤드(1300)의 사시도이다. 이 도면에서, 하우징(1303)의 상반부는 검출기 헤드의 내부 구성요소들을 도시하기 위해 제거되어 있다. 이중 채널들은 대물 렌즈들(1310, 1330) 및 광학 경로들(A, B)(A 및 B로 표시된 개방 화살표들)에 의해 표시되어 있다. SMD LED 여기 광원들(1311, 1331)이 에지형 저항성 핀-커넥터(1304)를 거쳐 센서 PCB(1302)에 직각들로 접속된 소스 LED 인쇄 회로 기판(1301) 상에 장착된다. 광검출 구성요소들이 센서 PCB(1302) 상에 장착된다. 패러데이 케이지 소자(1306)가 포토다이오드들(1317, 1337) 및 주변의 고이득 증폭 회로를 차폐하는데 사용된다.
형광성 여기는 타겟 형광체의 여기 스펙트럼에 정합하도록 선택된 표면 실장 LED(1331)에 의해 타겟 채널에 제공된다(화살표 A). 소스 LED(1331)는 분기광빔을 방출하고, 방사된 광빔은 이어서 소스 여기 렌즈(1332)에 의해 시준된다. 소스 렌즈(1332)는 LED에 대면하는 그 편평한 표면을 갖는 평면볼록 렌즈이다. 시준된 광빔이 이어서 여기 대역통과 필터(1333)를 통해 통과될 수 있고, 그 용도는 도 20과 연계된 설명에서 더 설명된다. 시준된 필터링된 여기광빔은 이어서 입사된 빔에 45도 각도로 설치된 2색 미러 요소 또는 빔스플리터(1334)로부터 반사되고, 평면볼록 대물 렌즈(1330)를 통해 그리고 검출기 하우징 내의 외부 윈도우를 통해 통과된다(화살표 A). 렌즈(1330)를 통과한 후에, 여기광은 임의의 타겟 형광체를 갖는 샘플 액체를 포함하는 미량분석 카트리지 내에 매립된 검출 챔버(도시 생략, 도 14 내지 도 17 참조)를 통해 포커싱된다. 샘플 액체를 통한 여기광의 경로 길이는 미량분석 카트리지 후방의 후방 미러의 사용에 의해 배가된다. 타겟 형광체는 입사광빔에 의해 여기된다. 형광체의 방출은 일반적으로 여기 파장보다 긴 파장에 있고, 타겟 형광체의 스톡스 시프트(Stokes shift)에 동일한 양만큼 시프트된다.
검출 챔버 내의 타겟 형광체로부터 복귀 방출물의 부분은 평면볼록 샘플링 렌즈(1330)에 의해 수집되고 2색 미러(1334)에 타격하기 전에 시준된다. 선택적으로, 프레넬 렌즈(Fresnel lens)는 방출된 광의 수집을 최적화하도록 렌즈와 샘플 사이의 작동 거리를 더 감소시키는데 사용될 수 있고, 이 방출된 광은 검출 챔버 후방의 가열 블록 상에 장착된 후방 미러에 의해 더 향상된다. 2색 빔스플리터(1334)는 여기 및 방출 파장 사이의 파장 컷오프를 갖기 때문에, 2색 미러(1334)는 이제 방출된 형광 광빔에 대한 통과대역 빔스플리터 및 여기광에 대한 저지대역 필터로서 작용한다. 이는 반사된 여기광 및 대물 렌즈 윈도우를 통해 광 경로에 진입한 임의의 주위광을 반사하면서 방출된 형광광을 전달한다. 2색 빔스플리터(1334)를 통해 통과하는 방출된 광은 이어서 방출 필터(1335)를 통해 통과하고, 그 목적은 도 20과 연계된 설명에 더 설명되어 있다. 방출 필터(1335)를 나오는 광은 이어서 평면볼록 센서 렌즈(1336)를 통해 통과하고, 여기서 PCB(1302)에 표면 실장된 포토센서(1337)의 표면 상에 포커싱되고 패러데이 케이지(1306)에 의해 전기 노이즈로부터 보호된다.
전술된 광학 경로들은 제어 여기 LED(1311), 평면볼록 여기 렌즈(1312), 여기 필터(1313), 2색 빔스플리터(1314), 대물 렌즈(1310), 제어 방출 필터(1315), 평면볼록 센서 렌즈(1316), 및 제어 포토다이오드(1317)를 갖는 제 2 (제어) 채널 내에서 반복된다. 양 포토다이오드들로부터의 출력들은 포토다이오드들 옆에 있는 기판 내에 내장되고 증폭기들로부터 주의깊게 차폐된 핀들을 거쳐 센서 PCB 상의 매립된 마이크로프로세서에 접지된 구성된 3단 트랜스-임피던스 증폭기들에 의해 증폭된다.
일 실시예에서, 형광체들로서 플루오레세인 및 텍사스 레드의 사용에 의해 예시된 바와 같이, 여기된 LED(1331)는 타겟 채널에 대해 사용된 485±12 nm의 본질적으로 단색광을 전달하기 위해 대역통과 여기 필터(1333)를 갖는 470 nm LED이고, 대역통과 필터(1313)를 갖는 590 nm LED(1311)가 제어 채널에 대해 사용되었다. 여기 LED들은 50 또는 60 Hz에서 그리고 형광성 오버헤드 조명과 연계된 조화 주파수들에서 AC 전력-관련 노이즈를 필터링하기 위해 130 Hz의 스트로브율을 사용하여 변조되거나 또는 "스트로브" 온 및 오프되어, 또한 30 또는 60 Hz에서 존재할 수 있는 스트레이 주위광 및 전기 노이즈에 관련된 팬텀 신호를 필터링한다. 로컬 피드백 센서들은 소스 LED 출력 강도를 모니터링하고 안정화하는데 사용된다. 형광체 방출의 검출 모니터링은 호스트 제어기에 의해 제어된 스텝퍼 모터의 동력 하에서 검출기 헤드의 레일들 상의 이동과 조화된다. 검출기 헤드 내의 매립형 마이크로프로세서 및 연계된 회로는 RAM 메모리, ROM 메모리, A-D 컨버터, 3단 트랜스-임피던스 증폭기, 및 이들 기능들을 취급하기 위한 신호 처리 및 명령 시퀀스 펌웨어를 구비한다.
각각의 포토센서들(1317, 1337)은 공통 PCB(1302) 상에 장착된다. 이들 포토센서들의 각각으로부터의 출력 신호 레그들은 각각의 3단 트랜스-임피던스 증폭기들(도시 생략)의 전치증폭기 또는 제 1 스테이지에 직접 접속된다. PCB(1302)는 입력 신호들 상의 임의의 RF 또는 전자기 간섭의 원치않는 효과들을 최소화하기 위해, 하드웨어 노이즈-감소 구성요소들, 특히 매립형 접지 평면 및 패러데이 케이지(1306)를 광대하게 사용한다. 증폭기는 패러데이 케이지, 바이패스 캐패시터, 신호 조절 전치증폭기, 개별 접지 평면, 금속화된 검출기 헤드 하우징, 또는 이들의 조합에 의해 전자 노이즈로부터 차폐되고, 증폭기는 센서에 전기적으로 접근한다. 광학 신호 취득, 사전조절, 증폭 및 디지털화는 차폐된 환경에서 동작하는 자율적 데몬에 의해 제어된다. 검출 헤드 내의 로컬 제어 하에서 광학 데이트 취득, 디지털화 및 처리 방법과 이들 하드웨어 노이즈-감소 요소들의 조합은 원치않는 노이즈의 효과들로부터 본질적으로 면역성인 검출기 디자인을 유도한다. 3단 증폭기는 요구된 바와 같이, 최대 1014의 이득을 위해 구성될 수 있고, 선택적으로 102, 103, 106, 1010, 또는 1012의 이득을 위해 구성된다.
본 발명자들은 스캐닝 헤드 내의 신호 처리의 패키징이, 센서 다이오드 도선들 주위 및 여기 및 센서 회로 기판들 사이의 접합부에서와 같은, 신호 경로 길이들을 최소화하고 필요하다면 패러데이 차폐의 효과적인 사용을 허용함으로써 향상된 신호-대-노이즈비 및 감도를 갖는 격리된 저노이즈 환경을 성취한다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 선택적으로, 검출기 하우징은 알루미늄으로부터 제조되고 도전성 폴리머로 코팅되고, 원치않는 간섭으로부터 내부 전자 기기들을 더 차폐하도록 접지될 수 있다. 유리하게는, 더 높은 신호 증폭이 이러한 환경에서 실현된다.
도 24a 및 도 24b는 형광성 검출기 헤드(1300)의 내부 광학 구성요소들의 개략도들로서, 카트리지 내에 포위된 검출 챔버들 내의 온도를 제어하거나 상승시키는데 사용된 가열 블록(1410)의 표면 상의 카트리지 후방에 장착된 후방 미러(1400) 및 미량분석 카트리지(1402) 내의 광학 윈도우들을 갖는 외부 광학 인터페이스를 도시한다. 비통상적으로, 다수의 독립형 광학 경로들 또는 "채널들"이 단일 검출 헤드 내에 형성되고, 전자 PCB들 및 하류측 신호 처리 회로를 공유하지만, 여기 광학 기기들은 일 회로 기판 상에 장착되고 검출 광학 기기들은 다른 회로 기판 상에 장착되어 노이즈 간섭을 감소시킨다. 2개의 기판들은 코너 장착된 핀 접합부(1304)에 의해 전기적으로 결합되고, 개별 접지 평면들 상에 장착된 바이패스 캐패시터들을 사용하여 전자적으로 격리된다.
도 24a에는 미량분석 카트리지(1402) 내에 매립된 검출 또는 샘플 우물(1403a 또는 1403b) 내의 형광체의 여기를 위한 광학 전이가 도시되어 있다. 헤드는 스캐닝 헤드이고, 미량분석 카트리지(1402)를 가로질러 이동한다(이중 화살표). PCB(1301) 상의 여기 LED(1331)로부터의 광은 렌즈(1332)에 의해 시준되고, 대역통과 필터(1333)에 의해 본질적으로 단색성이 된다. 검출 우물(1403a) 내의 임의의 형광체 또는 형광체들(제어 또는 타겟 형광체이건간에)은 대물 렌즈(1330)에 의해 샘플 상에 포커싱된 입사광(1420)에 의해 여기된다. 도 24b에서, 형광체(들)의 방출은 대물 렌즈(1330)에 의해 수집되고, 2색 빔스플리터(1334), 방출 필터(1335) 및 센서 렌즈(1336)를 통해 통과한 후에 센서(1337)로 전달된다. 센서(1337)는 출력 신호를 증폭하고 패러데이 케이지(1306) 내에 차폐된 고이득 트랜지스터의 베이스와 직접 전기 접촉한다. 방출된 형광광은 일반적으로 형광체의 스톡스 시프트에 따라 더 긴 파장에 있어, 방출된 광이 2색 대역통과 미러(1334) 및 방출 대역통과 필터(1335)를 통해 손실들 없이 통과할 수 있게 한다. 미러면(1400)은 타겟 상의 여기광의 양을 증가시켜 여기 경로 길이를 배가하고, 방출 수집 효율을 향상시키는데 사용된다. 샘플 챔버(1403a)로부터 대물 렌즈(1330)로 복귀된 광은 따라서 방출되고 반사된 형광물(1421)과 반사된 여기광(1420)의 혼합물이다. 광 트랩들(도시 생략)은 스트레이 반사들을 캡처하도록 제공된다. 반사된 광(1420)은 2색 미러(1334)를 통과하지 않고, 소스로 복귀되고, 센서(1337)에서 방출 강도의 측정과 간섭하지 않는다. 여기 소스, 소스 시준 렌즈, 여기 필터, 2색 미러, 대물 렌즈, 여기 필터, 센서 렌즈, 및 증폭기를 갖는 검출기를 포함하는 단일 채널의 광학 요소들은 본질적으로 단색성 소스 파장 및 타겟(또는 제어) 형광체의 특정 파장 특성에서 형광성을 검출하기 위한 매우 특정 센서를 갖는 광학 모듈을 구성한다. 하나의 광학 모듈 또는 채널은 분석 타겟을 위해 사용될 수 있고, 다른 모듈은 제어 채널을 위해 사용될 수 있다. 직렬 장착된 광학 채널들이 복수의 형광체들 상의 데이터를 수집하는데 사용될 수 있고, 여기서 전기 처리는 호스트 기구로의 전달 전에 상주 데몬의 제어 하에서 매립형 마이크로프로세서를 통해 멀티플렉싱된다. 도시된 바와 같이, 2개의 채널들의 각각은 2개의 회로 기판들의 각각 상의 회로를 공유하지만, 개별 광학 기기들을 갖는다. 선택적으로, 부가의 채널들이 도시된 광학 요소들의 복제의 프로세스에 의해 검출기 헤드 내에 합체될 수 있다.
미량분석 카트리지(1402)는 검출기 헤드(1300)에 대해 이동 가능하고(이중 화살표), 검출기 헤드 또는 카트리지 트레이 또는 장착 섀시의 전동화는 스캐닝을 허용하고, 카트리지(1402)를 가로지르는 횡단은 예를 들어 측정들이 샘플 챔버들(1403a, 1403b) 상에서 행해지는 것을 허용한다. 검출기 헤드 내에 나란히 장착된 다수의 검출 광학 모듈들을 사용함으로써, 샘플 챔버들은 다수의 형광체들에 대해 직렬로 스캐닝될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 여기 전자 기기들은 인쇄 회로 기판(1301) 상에 장착되고, 검출 전자 기기들은 제 2 PCB(1302) 상에 장착된다. 에지-커넥터(1304)가 기판들을 전기적으로 연결한다. 패러데이 케이지(1306)는 센서 및 연계된 고이득 증폭기를 스트레이 전자기 노이즈로부터 보호한다. 미러(1400)는 또한 열전달에서 기능하고 분석 중에 샘플 유체의 온도를 제어하는 가열 블록(1410)의 상부면 상에 제조된다. 가열 블록(1410)의 온도는 예를 들어, 호스트 제어기의 제어 하에서 온도 및 모터 기능들을 갖는 FRET 용융 결정에서와 같이, 스캐닝 중에 상승될 수 있고, 반면에 광학 데이터는 자율적 프로세스에서 검출 헤드 내의 매립형 프로세스에 의해 취득된다.
도 25a 및 도 25b는 플루오로세인 및 텍사스 레드에 의해 여기서 도시된 타겟 및 제어를 위한 혼합된 형광체들의 전형적인 시스템의 여기 및 방출 스펙트럼들을 도시한다. 도 25a에 도시된 곡선(2001)은 플루오로세인에 대한 여기 스펙트럼이고(점선); 곡선(2002)은 방출 스펙트럼이다(실선). 도 25b에 도시된 곡선(2003)은 텍사스 레드에 대한 여기 스펙트럼이고(점선); 곡선(2004)은 대응 방출 스펙트럼이다(실선). 여기서, 제어는 채널 B이고(도 25b), 타겟은 채널 A이지만(도 25a), 할당은 임의적이다.
박스로 나타낸 영역(ExA)은 타겟 여기 대역통과 필터(1333)를 통해 통과하도록 허용된 파장 대역을 지시한다. 박스(EmA)는 타겟 방출 대역통과 필터(1335)를 통해 통과하도록 허용된 방출 통과 대역을 지시한다. 박스(ExB)는 제어 여기 대역통과 필터(1313)를 통해 통과하도록 허용된 파장 대역을 지시한다. 박스(EmB)는 제어 방출 대역통과 필터(1315)를 통해 통과하도록 허용된 방출 통과 대역을 지시한다. 박스들은 최대값들의 어느 일측에서 저지대역들의 존재를 지시한다. 도시된 바와 같이 구성된 통과대역 특성들을 갖는 광학 필터들 및 이들 2개의 형광체들에 대한 스펙트럼들이 제공되면, 이하의 에러 조건들이 보정된다는 것을 도 25a 및 도 25b로부터 알 수 있는데: a) 타겟 LED(1331)로부터 긴 파장 여기광(LED 피크 여기의 파장보다 큼)은 LED 여기 필터(1333)에 의해 차단되는 이들 더 긴 파장들에 기인하여, 타겟 형광성 방출에 대해 잘못 혼란될 수 없고; b) 제어 LED(1311)로부터 긴 파장 여기광(LED 피크 여기의 파장보다 큼)은 LED 여기 필터(1313)에 의해 차단되는 이들 더 긴 파장들에 기인하여, 제어 형광성 방출에 대해 잘못 혼란될 수 없고; c) 타겟 형광성 방출물들은 (여기 필터링된) 제어 LED(1311)에 의해 부주의하게 트리거링될 수 없다. 이 에러 조건은 그렇지 않으면, 제어 포토센서(1317)가 타겟 및 제어 형광체들의 모두로부터 원치않는 동시 신호들을 수신하는 것을 유도할 것이고, d) 제어 형광성 방출물들은 (여기 필터링된) 타겟 LED(1331)에 의해 부주의하게 트리거링될 수 없다. 이 에러 조건은 그렇지 않으면 타겟 포토센서(1337)가 타겟 및 제어 형광체들의 모두로부터 원치않는 동시 신호들을 수신하는 것을 유도할 것이다.
분석 유효화
뜻하지 않게, 자율적인 검출기 헤드 기능들은 개별 형광체들의 검출을 위해 개별 광학 채널들을 포함하는 이중 헤드 및 멀티-헤드 검출기들 내에서 멀티플렉싱될 수 있어, 각각의 채널이 여기광을 조사하기 위한 LED, 여기 필터를 갖는 적어도 하나의 광 경로, 방출 필터, 규정된 통과대역 내의 형광체로부터 방출물들의 검출을 가능하게 하도록 동조된 2색 미러, 상기 여기광을 집광하기 위한 그리고 상기 방출물들을 수집하기 위한 대물 렌즈, 임의의 통과대역 방출물을 수신하기 위한 센서, 및 센서로부터 출력을 증폭하기 위한 고이득 증폭기를 포함하게 되고, 여기서 각각의 LED는 채널들의 조사 주파수들이 중첩하지 않도록 주파수 범위 내의 광을 조사하도록 구성되고, 각각의 광학 채널은 채널들의 방출 통과대역들이 중첩되지 않도록 구성되고, 상기 복수의 채널들의 상기 증폭기들의 출력들은 멀티플렉싱 방식으로 디지털화되고 검출기 헤드 내에 매립된 마이크로프로세서에 의해 실행된 펌웨어에 상주하는 자율적인 데몬의 제어 하에서 휘발성 메모리 내에서 표로 작성된다.
분석 유효화를 위해, 2개의 센서 채널들(또는 그 이상)이 2개 이상의 형광체들을 모니터링하기 위해 제공되고, 2개의 센서 채널들은 각각의 형광체로부터의 방출 통과대역들이 중첩하지 않도록 구성된다. 바람직한 실시예에서, 제 1 검출 채널은 타겟 신호를 검출하기 위한 것이고, 제 2 검출 채널은 제어 신호를 검출하기 위한 것이고, 분석 결과는 유효 제어 신호가 보고되는 경우에만 보고된다.
이 시스템은 "바이플렉스" 또는 멀티플렉스 타겟 및 제어 신호들의 쌍을 이룬 수집을 호출하는 분석 프로토콜들의 유효화에 유용한 것으로 입증되었다. FDA CLIA 웨이버 요구들에 대해, 양 타겟 및 제어 템플레이트들이 병렬로 증폭되는 경우에, 포지티브 제어 신호는 테스트 샘플 상의 분석 결과가 보고되거나 빌링될 수 있기 전에 존재해야 한다. 검출가능한 제어 신호의 부재시에, 검출된 임의의 타겟 신호는 유효한 결과는 아니다. 이 조건이 부합되면, 1988년의 임상 실험실 개선 수정법들(Clinical Laboratory Improvement Amendments: CLIA) 하에서, 간단한 저위험 테스트들을 지배하는 규제들이 보류될 수 있고, 테스트들은 의사의 사무실들 및 다양한 다른 위치들에서 간과 없이 수행된다. 이들 CLIA 웨이버 요구들에 부합하기 위해, 형광성 검출기는 동일한 PCR 반응 또는 기구 내에서 병렬로 행해진 PCR 반응에 의해 증폭되고 타겟과 공존하는 예를 들어 PCR에 의해 증폭된 타겟 감염 기관의 존재 뿐만 아니라, 내인성 인간 제어 기관의 존재를 검출하는 것이 가능해야 하는 것이 필요하다.
이러한 접근법은 이러한 분자 진단 분석을 위해 사용된 형광성 검출기가 공통 검출 챔버 내의 "바이플렉스" 증폭 반응 혼합물로서 타겟 및 제어 형광체들의 모두의 존재를 결정하기 위한 능력을 가질 수 있는 것을 요구한다. 일 양태에서, 타겟 형광체를 위한 형광성 여기 및 방출 스펙트럼들로부터 선택적 대역통과 필터들에 의해 양호하게 해석되도록(파장에 있어서) 위치된 형광성 여기 및 방출 스펙트럼들을 갖는 포지티브 증폭 제어 형광체가 사용된다(예를 들어, 도 25a 내지 도 25b 참조). 그러나, 본 발명에 따르면, 이중 헤드 검출기를 사용하여 그리고 각각의 헤드에 한번씩 각각의 검출 챔버를 2회 스캐닝함으로써 우수한 분해능을 성취하여, 먼저 제어 형광성 서명을, 이어서 타겟 샘플 형광성 서명을 검출하는 것이 가능한 것으로 입증되었고 - 각각의 스캐닝 통과는 개별 여기 및 방출 광학 기기들을 필요로 한다. 이익은 완전히 분리된 독립적인 광 경로들을 갖는 이들 검출기들을 구성함으로써 발견되었다. 본 발명의 이 양태에서, 듀플렉스 헤드 디자인의 사용은 샘플 내의 증폭 제어 형광체의 존재가 "누화"에 기인하여 타겟 채널 내에 신호를 부주의하게 생성하지 않는다. 이러한 상황은 "거짓 양성"으로서 분류되는 샘플을 생성할 것이다. 역으로, 타겟 채널로부터 제어 채널로 누화가 존재하지 않는데, 이는 다수의 신호들이 공통 광학 경로를 공유할 때 가능성이 있다. 이러한 상황은 이것이 존재하지 않을 때 포지티브 증폭 제어가 부주의하게 존재하는 것을 간주되는 것을 야기할 수 있다.
이들 원리들은 타겟에 대한 분자 프로브로서 플루오로세인 또는 등가의 형광체, 및 제어에 대한 분자 프로브로서 텍사스 레드 또는 등가의 형광체들의 사용에 의해 예시된다. 개별 여기 및 검출 광학 기기들을 각각 갖는, 플루오로세인의 검출에 대해 최적화된 하나의 검출 채널 및 텍사스 레드에 대해 최적화된 다른 검출 채널을 갖는 이중 헤드 검출기가 바이플렉스 증폭 혼합물들을 분석하기 위해 놀랍게도 민감하고, 정확하고, 강인한 것으로 판명되었다. 개별 형광 판독들이 각각의 광학 채널에 대해 상주 데몬에 의해 행해진다. 놀랍게도, 이 절차는 분해능을 향상시키고 누화를 최소화하지만, 검출기 헤드를 이동하는 기계 장치들에 기인하여 더 높은 노이즈 또는 민감도의 손실에 기여하지 않았다.
도 26a는 형광성 타겟(이 경우에, 분자 진단 분석으로부터 말라리아 핵산들의 존재를 지시함)이 마이크로유체 카트리지 내에 매립된 검출 챔버 내에 존재하는 경우에 검출기의 타겟 채널에 의해 수신된 신호 레벨의 플롯이다. 이 경우에, 타겟 채널은 범위 900 mV에서 검출 챔버로부터 형광 신호를 수신하는 것을 트레이스로부터 볼 수 있다. 타겟 채널로부터 이 경우에 "말라리아 포지티브" 신호는 비어 있는 검출 챔버의 "배경" 신호 레벨의 대략 14배에 동일하다. 트레이스들은 평활하고 차폐된 검출기 헤드 내의 증폭 회로 내의 저레벨의 전자 노이즈를 지시한다.
도 26b는 형광성 타겟(이 경우에, 분자 진단 분석으로부터 말라리아의 존재를 지시함)이 검출 챔버 내에 존재하는 경우에 검출기의 제어 채널에 의해 수신된 신호 레벨의 플롯이다. 이 경우에, 제어 채널은 단지 타겟 신호만을 갖고 제어 형광체를 갖지 않는 검출 우물을 스캐닝할 때 타겟 광학 채널과 제어 광학 채널 사이의 무시할만한 레벨의 누화를 지시하는 바와 같이, 본질적으로 사전 스캔 기준선에 동일한 범위 40 내지 50 mV에서 출력을 갖는다는 것을 트레이스로부터 볼 수 있다.
도 26c는 형광성 타겟(말라리아, 텍사스 레드 형광체) 및 형광성 제어(내인성 인간 제어, 플루오로세인 형광체)가 마이크로유체 카트리지 내에 매립된 단일의 검출 챔버 내의 혼합물로서 함께 증폭되는 경우에 검출기의 타겟 광학 채널에 의해 수신된 신호 레벨의 플롯이다. 이 경우에, 상부 트레이스는 대략 680 mV의 타겟 신호 레벨이 제 1 광학 채널 내에서 수신되었고, 여기서 타겟 신호는 텍사스 레드-태그된 말라리아 앰플리콘과 연계된다는 것을 나타낸다. 이는 블랭크 검출 챔버로부터의 신호(하부 트레이스)의 대략 10.5배의 레벨에 동일하다. 이는 검출기가 바이플렉스 샘플의 "말라리아 포지티브" 성분의 존재를 식별하는데 정확하게 기능하는 것을 지시한다.
도 26d는 형광성 타겟(말라리아) 및 형광성 제어(내인성 인간 제어)가 마이크로유체 카트리지 내에 매립된 검출 챔버 내에서 함께 존재하는 경우에 검출기의 제 2 광학 채널에 의해 수신된 신호의 플롯이다. 바이플렉스 샘플 혼합물은 도 26c에 대해 동일하고, 신호는 플루오로세인-태그된 내인성 제어 앰플리콘과 연계되어, 타겟 앰플리콘으로부터 어떠한 누화도 설명하지 않고 양호한 신호 안정성 및 전기 노이즈로부터의 자유를 설명한다.
이 경우에, 트레이스는 대략 160 mV의 신호 레벨이 제어 광학 채널에 의해 수신되었다는 것을 나타낸다. 이는 블랭크 검출 챔버로부터 신호의 대략 3.6배의 레벨에 대응한다. 이는 개별 광학 채널 내의 바이플렉스 샘플의 "제어 포지티브" 성분의 존재를 식별하는 견지에서 검출기가 정확하게 기능하는 것을 지시한다. 따라서, 타겟 앰플리콘들 및 제어 앰플리콘들은 CLIA 웨이퍼 요구들에 따라 성공적인 "바이플렉스" 분석을 지시하는 바와 같이, 단일 우물 내에서 검출된다.
여기는 백색광으로 수행되지 않고, 대신에 개별 형광체에 대해 특정한 파장에서 수행되기 때문에, 제 2 형광체의 켄칭은 문제가 되지 않는다. 여기에 설명된 시스템들은 임상 연구실의 제어된 환경 외부의 신뢰적인 작동을 위해 요구되는 바와 같은, 강인한 분석 성능을 성취하기 위해 물리적 방법들과 신호 처리 방법들의 조합을 사용한다.
도 27은 형광성 여기를 제어하기 위해 그리고 형광성 방출 신호들을 수신하고, 처리하고, 호스트 기구에 디지털식으로 통신하기 위해 사용되는 검출기 헤드(1300) 전자 기기들 및 광학 기기들의 블록도이다. 광학 채널들은 개방 화살표들 A 및 B에 의해 재차 식별되고, 센서들(1817, 1837) 내에서 종료한다. 채널 A는 제어 채널로서, 채널 B는 타겟 분석물 채널로서 취해지지만, 역할들은 상호 교환 가능하다. 각각의 채널, 소스(1811, 1831 및 연계된 회로 블록) 및 센서(1817, 1837 및 연계된 회로 블록) 내의 전자 기능 블록들은 동일하다(채널들 A 및 B가 상이한 파장들에 대해 구성된 것을 제외하고는).
검출 시스템은 UV, 가시 영역, 및 근적외선 스펙트럼 내의 파장들에 대해 구성될 수 있다. 근단색성 출력, 필터들, 발색체들 및 형광체들을 갖는 이용 가능한 광원들은 300 내지 900 nm의 범위에서 여기 및 방출 통과대역들을 동조하는 것을 허용한다. 본 발명의 바람직한 작동 모드들 중 하나인 형광성 검출 모드에서 용례들에 대해, 장치는 UV 및 가시 스펙트럼 내의 여기 스펙트럼을 갖는 특정 형광성 염료들에 대해 그리고 UV, 가시 및 근적외선 스펙트럼 내의 방출을 위해 구성될 수 있다. 레드 시프트가 더 통상적이지만, 상향 컨버팅 형광체들이 또한 사용될 수 있다.
검출기 헤드(1300) 내에서, 소스 여기 회로들(1811, 1831)과 연계된 LED들의 각각은 130 Hz의 주파수에서 사각파에 의해 변조된다. 이 변조의 이유는 이하의 잠재적인 노이즈 소스들: 1) 50/60 Hz AC 메인들; 2) 형광광들로부터 100/120 Hz 제 2 메인들 고조파; 3) 50/60 Hz AC의 제 3 및 더 높은 고조파들; 4) 130 Hz 이상의 차등 주파수들(럼블); 및 5) 포토다이오드 센서, 제 1 스테이지 피드백 저항기 및 증폭기로부터 광대역 화이트 노이즈로부터 노이즈 감소 측정들에 관련된다. 노이즈가 있는 소스로부터 유용한 신호를 검색하기 위해, 이하의 완화 방법들: 1) 앨리어싱(aliasing)을 회피하고 동시에 노이즈 대역폭을 제한하기 위해 취해진 데이터의 고속 샘플링 및 평균화; 2) 모든 미보정된 구성요소들을 거절하기 위해 130 Hz에서 LED 광의 변조 및 130 Hz에서 검출된 형광 신호와의 상관(130 Hz 변조 주파수는 50/60 Hz 메인들 및 100, 120, 150 및 180 Hz 이상의 고조파들로부터 적어도 10 Hz 차이를 제공하도록 선택되었음); 3) 50 Hz 또는 60 Hz의 메인 전원들 또는 이들의 고조파들로부터 전자기 노이즈를 제거하기 위해 상관된 데이터의 고속 필터링 및 처리가 이용된다. 여기 LED들은 FAN5612 LED-드라이버들에 의해 구동된 130 Hz 사각파를 사용하여 턴온 및 오프된다. 각각의 드라이버는 요구된 주파수에서 최대 120 mA(3개의 출력들의 각각에서 40 mA)의 전류를 싱킹하는 것이 가능하다. 검출기 헤드 마이크로프로세서의 클럭 주파수는 여기 LED들을 스트로브하고 센서 다이오드들 내의 펄스 수집을 동기화하는데 사용된다. 이들 특징들은 특정 형광 신호의 부재시에 센서들로부터 조용한 출력을 생성하고 더 높은 증폭을 가능하게 하는 것으로 판명되었다.
소스 LED들을 위한 회로 기판(1801)은 다수의 LED들을 지지할 수 있고, 센서 회로를 위한 회로 기판(1802)은 다수의 포토다이오드들을 지지할 수 있다. 여기 및 검출 회로는 개별 접지 평면들 상의 개별 PCB 기판들(1801, 1802) 상의 바이패스 캐패시터들을 사용하여 전자적으로 격리되어 핀 접합부(1804)를 통한 임의의 가능한 누화를 더 감소시킨다. 각각의 포토다이오드는 차폐되고 다단 고이득 증폭기(1818, 1838)와 친밀하게 연계되고, 2개의 회로 기판들은 개별 접지들과 전자적으로 격리된다. 검출기 헤드에서, 센서 광학 기기들로부터의 전기 출력은 전치증폭기 내에서 조절되고 3단 증폭기 내로 공급된다. 증폭기로부터 3개의 출력들의 각각은 최대 1014인 최고 증폭 인자를 갖는 다중 로그 스케일 이득을 갖는다. 3개의 출력들은 매립형 마이크로프로세서 내로 일체화된 A/D 컨버터들 내로 공급되고, 일 디지털 출력(펌웨어에 의해 선택된 출력)은 디지털화된 스코어로서 메모리에 버스된다.
유리하게, 차폐형 검출 헤드 내의 아날로그 및 디지털 신호 처리 회로의 격리는 최대 1014, 선택된 실시예들에서 3개의 스테이지들에서 1012 내지 1014인 매우 놀랍게도 고이득 인자를 허용하는 저노이즈 조건들을 실현한다. 센서들 옆의 검출 헤드 내의 디지털화 전자 기기들을 국부화함으로써, 고이득을 갖는 증폭된 신호들이 놀라운 노이즈 간섭의 결여를 갖고 성취된다. 버퍼링되고 필터링된 기준 전압들은 또한 매립형 마이크로프로세서(1841)와 연계된 A/D 컨버터 내에서 디지털화되는 증폭된 신호 출력 내에 최대 안정성을 보장하기 위해 연산 증폭기들로 공급되고, 따라서 디지털화가 스캐닝 검출기 헤드 내에서 발생한다.
상기 설명은 하드웨어의 설명이지만, 검출기 헤드 내의 증폭기 전자 광학 기기들 및 신호 처리 알고리즘들의 실제 동작은 "가상 머신"으로서 기능하는 펌웨어 내에 코딩된 "ODAP 데몬"에 의해 행해진다. 데몬은 본질적으로 명령들의 세트이지만, 매립형 마이크로프로세서와 디지털식으로 연계된 비휘발성 메모리 내의 검출기 헤드에 상주하고, 일단 호출되면 호스트 제어기에 독립적으로 동작한다. 펌웨어, 즉 신호 취득의 제어 및 스캐닝 검출기 헤드의 광전 기능들을 위한 전용 온보드 명령 세트는 통상적으로 소켓팅된 EEPROM 칩(1842) 내에 상주한다. 데몬은 검출기 헤드 내의 매립형 마이크로프로세서(1841)를 제어한다. 증폭된 신호의 디지털화 후에, 데몬은 예를 들어 광학 데이터와 배경 스캔들의 비교 및/또는 사용자에 표시를 위해 데이터를 호스트 시스템에 보고하기 전에 형광성이 포지티브 분석 결과인지 여부에 대한 복합 판정을 행하는 것과 같은 추가의 신호 처리가 가능하다.
놀랍게도, 본 발명자들은 검출기 헤드가 호스트 제어기의 외부 제어 하에서 이동되는 동안 ODAP 데몬이 샘플 영역의 공간맵을 구성하는 것이 가능하도록 2개의 프로세서들, 즉 호스트 제어기 및 검출기 헤드 내의 매립형 마이크로프로세서가 조화될 수 있다는 것을 발견하였다. ODAP 기능들은 예를 들어, 호스트 제어기가 검출 챔버 내의 온도에서 용융/어닐링 서브루틴을 수행하는 동안 신호 데이터를 수집하는데 있어서 자율적으로 진행하여, 호스트 제어기 루틴들 내의 분석 재프로그래밍이 데이터 취득의 동작에 영향을 미치거나 효과를 미치지 않고, 분석 카트리지로부터 바코드 판독치에 의존하여, 다수의 분석 프로토콜들 중 임의의 하나가 호스트 제어기에 의해 수행될 수도 있는 독특한 장점을 데몬의 제어 하에서 보고하게 한다.
검출기 헤드 내부에 매립형 마이크로프로세서(1841)를 사용하는 일 장점은, "광학 데이터 취득 및 처리"(ODAP)의 전용 방법이 청결한 디지털화된 신호를 호스트 제어기에 전달하기 전에 노이즈를 제거하기 위해 검출기 헤드 내의 펌웨어 내로 프로그램될 수 있다는 것이다. ODAP 데몬은 따라서 요구될 때 호스트 프로세서에 의해 호출되는 독립적인 서브루틴 또는 서브루틴들이지만 - 일단 개시되면 데몬 및 연계된 광전 기기들은 매립형 펌웨어의 독립적인 제어 하에서 자율적으로 실행된다. 실제로, 검출기 헤드 내의 전체 분석을 완료하고 요약 스코어 또는 분석 결과를 호스트 기구에 간단하게 통신하는 것이 가능한 것으로 입증되었다. 아날로그 신호들과는 달리, 검출기 헤드로부터 호스트 기구로의 디지털 전송들은 기구 하우징 내에서 발생하는 노이즈가 있는 아날로그 모사들에 의해 발생된 간섭에 민감하지 않다.
현재 실현되는 바와 같이, ODAP 데몬은 검출 헤드가 카트리지를 가로질러 선형으로 스캔됨에 따라 연속적으로 그리고 자율적으로 실행된다. "데몬"은 여기서 대화식 사용자의 직접 제어 하에서보다는 자율적 배경 프로세스로서 매립형 마이크로프로세서에 의해 또는 호스트 제어기에 의해 실행된 펌웨어 내에 저장되는 광학 데이터 취득 및 처리를 위한 프로그램가능 명령 세트의 동작을 칭한다. 데몬은 부분적으로 호스트 동작들과 연계된 외부 전자 노이즈로부터 보호될 수 있도록 검출기 헤드 내에 국부화된 전자 회로를 작동하고 제어하는 가상 머신이다.
따라서, 본 발명은 스캐닝 검출 헤드 내에 상주하는 자율적 데몬에 의해 제어된 호스트 제어기 및 광전 프로세스들에 의해 제어된 유체, 전기기계 및 열적 프로세스들로 분석을 작동적으로 분할하는 것을 포함하는 미량분석을 자동화하기 위한 방법을 포함하고, 여기서 상기 스캐닝 검출 헤드의 운동은 호스트 제어기에 의해서 제어되고 임의의 광 신호 취득 및 처리는 자율적 데몬에 의해서 제어된다.
예시 및 예로서, 액체 샘플을 각각 분석하기 위한 3개의 검출 챔버들은 검출 헤드에 의해 스캐닝되는 광학 윈도우 내에 배치된다. 스캔 시간은 약 30초이고, 스캔 길이는 약 500 스텝들로 분배된다. 검출기는 130 Hz에서 작동하지만, 디지털화 속도는 더 높아, 12000 내지 24000 형광성 측정들이 각각의 스캔 중에 취해질 수도 있다. 센서 다이오드 출력은 LED가 130 Hz에서 스트로브되어 비특정 포토다이오드 출력을 제거함에 따라 어두운 절반 사이클을 밝은 절반 사이클로부터 차감할 수 있도록 저장되고 평균화된다. 데이터세트는 또한 100 ms 증분들로 온보드 펌웨어의 제어 하에서 처리된다. 따라서, 검출 헤드 내의 로컬 메모리 내에 표로 작성된 디지털화된 스코어는 100 ms에 걸쳐 취득된 처리된 신호로 이루어지고, 스텝퍼 모터의 특성들 및 스캔의 길이에 따라, 선형 스캔 내의 하나 또는 단지 몇 개의 스텝들에 대응한다. 신호에 대응하는 "스폿 크기"는 따라서 매우 작지만 고분해능 디지털 화소만큼 미세하지는 않다. 각각의 디지털 스코어는 LED 오프 시간 간격들 중에 임의의 주위 신호보다 작은 LED 온 시간 간격들 중에 축적된 모든 증폭된 전류에 대응하는 값을 갖는다.
데몬은 스텝퍼 모터 작동들을 추적하도록 동기화되고 광학 윈도우의 폭에 걸쳐 스캔 거리(위치)에 대한 형광성 출력 스코어들의 테이블을 축적한다. 분석에 앞서 기준선 스캔을 수행함으로써, 분석 반응들과 연계된 염료들, 색원체들 또는 형광체들로부터 발생하는 임의의 "신규한" 신호(즉, 기준선에 걸친 임의의 변화)가 이어서 정량화된다. 배경 차감이 완료된 후에, 임계값은 또한 원한다면 기준선에 걸친 신호 변화들을 더 필터링하는데 사용될 수 있다.
데이터 샘플링, 필터링, 디지털 평활화 및 조절은 하드웨어 및 펌웨어 수단의 조합에 의해 성취될 수 있고, 펌웨어는 데몬 명령 세트를 칭한다. 샘플 우물을 가로질러 스캔 중에 취득된 디지털 스코어들의 프로그램가능 통계적 분석은 파라미터식 또는 비-파라미터식일 수 있다. 각각의 샘플 우물에 특정한 각각의 데이터세트로부터, 스캔이 횡단하는 스코어들의 분포는 우물에 걸쳐 취해진 평균, 중간 또는 모드값보다 분석 참값(타겟 분석물 또는 제어를 위한 "포지티브" 또는 "네거티브")의 더 양호한 예측자이다. 다수의 점들을 갖는 분포 함수에 기초하는 결과가 또한 낮은 분해능에서 우물을 인터로게이팅함으로써 취해진 광학적으로 평균화된 신호에 비해 우수하다. 평균들은 거짓 음성들을 유도할 수 있고, 반면에 본 발명자들은 우물의 특정 부분에 대해 국부화되더라도, 높은 신호 스파이크들의 패턴이 포지티브 분석에 대응할 가능성이 매우 높다는 것을 발견하였다. 펌웨어는 디지털 스코어들의 강도 및 포지티브 대 네거티브 분석 결과들에 대한 예측된 범위들을 갖고 신호 스파이크들의 주파수를 평가하고 상관하도록 구성된다. 데이터세트들은 모집단 통계들로서 고려될 수 있고, 예를 들어 강도에 따라 랭킹된 30개의 측정들의 모집단이 편차의 통계 분석에 따라 널 가설에 따라 예측된 분포에 비교된다. 데이터를 비-파라미터식으로 분석하기 위한 통계적 도구들이 또한 적용 가능하고, 펌웨어 내에 인코딩될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 검출 헤드의 온보드 능력들은 분석물이 검출되는지 여부에 대응하는 디지털 "1" 또는 "0"으로서, 참 또는 거짓으로서 또는 대응 제어들의 상태로서 분석 결과를 출력하는 것을 포함한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 기포들 및 다른 불규칙부들에 기인하는 데이터세트들의 수차들이 일반적으로 매립형 펌웨어를 갖는 데몬의 제어 하에서 1-비트 디지털 스코어로의 변환에 의해 관리될 수 있다는 것을 발견하였다.
매립형 마이크로프로세서 내로의 입력들은 다수의 타겟 분석물들 및 제어들이 동시에 분석될 수 있도록 멀티플렉싱된다. 검출기 헤드는 이산 파장들에서 작동하는 독립적인 여기 광학 기기들 및 방출 광학 기기들을 각각 갖는 적어도 2개 이상의 광학 채널들을 구비한다. 백색 여기광은 예를 들어, 타겟 형광체 및 내부 제어 형광체가 공통 액체 샘플 내에서 혼합될 때, 멀티플렉싱된 분석 내의 상이한 형광체들 사이의 가능한 누화를 제거하는데 사용되지 않는다. 타겟 및 제어에 대한 "하나의 단지(one pot)" 조건들의 사용은 포지티브 제어 신호를 위한 조건들이 각각의 샘플 우물 내에 존재하는 것을 입증해야 하는 필요성으로부터 발생한다. 그러나, 타겟 및 제어 채널 광학 기기들을 분리함으로써, 무효 제어 결과들에 기인하는 거짓 양성 테스트들 또는 테스트 거절을 유도할 수 있는 누화가 제거되었다.
비교를 위해, 호스트 제어기(1800)는 결과들의 표시를 포함하는 조작자 인터페이스와, 온-카트리지 분석 및 검출기 헤드 스캔을 수행하도록 요구된 기계적 및 공압 기능들의 작동을 담당한다. 호스트 제어기 내의 개별 클럭은 스캐닝 중에 스텝퍼 모터를 구동하는데 사용된다. 스캔 중에 취득된 형광성 신호들과 검출기 헤드 위치를 상관하기 위해, 스텝퍼 모터 활동도가 검출기 헤드 내의 펌웨어에 의해 모니터링된다.
우물 위치 인식은 스캐닝 검출기 헤드 내의 매립형 데몬의 제어 하에서 작동되는 "에지 검출" 프로세스에 의해 성취된다. 제 1 경우에, 한 쌍의 기계적 스위치들이 매립형 제어기에 디지털식으로 통신하는 도선들을 갖고 검출기 헤드의 이면 상에 장착된다. 비어 있는 카트리지의 제 1 스캔에서, 검출기 헤드는 스텝퍼 모터의 호스트 기구 제어 하에서 그 레일을 따라 미끄러지고, 제 1 기계적 스위치가 레일을 따라 기구 섀시 내에 형성된 멈춤쇠에 의해 트립될 때, 전자 신호는 데몬에 송신된다. 데몬은 그 활동들을 개시하도록 프로그램되고 호스트 기구로부터 스텝퍼 모터 데이터를 캡처링하기 시작할 것이고, 이 데이터를 사용하여 카트리지의 광학 윈도우들을 가로질러 횡단하는 x-축을 맵핑하도록 프로그램되고, 여기서 모터의 각각의 스텝은 기준점(x0)으로부터 임의의 거리(x)에 대해 (xi = x0 + (ni))가 되도록 스텝퍼 모터에 의해 규정된 위치 및 거리 증분(n)에 대응한다. 데몬은 또한 제 1 스캔 중에 광학 출력을 저장한다. 따라서, 데몬은 스텝퍼 모터가 검출기 헤드를 전진시킴에 따라, 위치(x0) 및 강도(I0) 데이터 쌍을 표로 작성하고 증분(xi)을 계속한다. 샘플 우물들과 연계된 카트리지 광학 기기들 내의 불연속성들에 의해, x-횡단부를 따른 카트리지의 광학 스캔은 우물 에지 검출을 위해 유용한 신호들을 생성한다. 이들 신호들은, 검출 헤드가 우물의 가까운측 에지 상에서 교차함에 따라 기준선 광학 출력의 급격한 단계적 변화(저하 또는 증가)에 의해 또는 피크 조건 dx/dt = 0에 의해 포지티브 기울기가 네거티브 기울기로부터 분리되는 피크에 의해 특징화된다. 임계값이 교차되면, 우물 내로의 입구와 연계된 에지 효과가 선형 맵 또는 x-횡단부 상에서 x-좌표(모터 스텝 번호)를 갖는 우물 시작 위치로서 데몬에 의해 스코어링된다. 검출기 헤드가 강성 가이드웨어 상에 장착되기 때문에, x-횡단부 경로는 역전될 수 있고, 스캐닝 헤드는 동일한 시작점(x0)으로부터 우물을 가로지르는 후속의 스캔에서 그 루트를 정확하게 재추적할 수 있다. 이 방식으로, 기계적 멈춤쇠가 우물 에지로 트립되는 레일 상의 위치로부터 맵핑 프로세스에 의해 유한 물리적 거리가 설정된다. 유사하게, 우물의 먼측 에지가 식별된다. 가까운측 에지와 먼측 에지 위치들 사이의 비어 있는 우물의 배경 광학 판독치들이 이어서 처리되어 대표적인 배경 신호로서 저장된다. 이 프로세스는 모든 우물들에 대해 반복되고, 검출기 헤드 내의 각각의 광학 채널에 대해 재차 반복된다. 적절한 오프셋들에 의해, 기계적 스위치들이 하나 초과의 채널에 대해 사용될 수도 있어, x-횡단부가 단일의 스캔 중에 각각의 광학 채널에 대해 수집된다. 유사하게, 다수의 우물들이 스캐닝 헤드가 광학 윈도우를 따라 스캔함에 따라 동시에 스캔될 수 있다.
검출기 헤드는 이어서 그 휴지 위치로 복귀하고, 명령시에, 우물들을 충전하는 샘플과 연계된 광학 출력의 임의의 변화들을 검출할 스캔을 시작한다. 데몬은 메모리 내에 사전 규정된 우물 에지 위치들에 따른 검출 우물들로부터 데이터를 수집하고, 우물들의 내용물들과 연계된 형광성(또는 다른 광학 신호)의 변화들을 평가하기 위한 계산들을 수행한다. 이들 데이터는 데몬에 의해 작동된 신호 처리 알고리즘들에 의해 또한 처리된다. 샘플의 도입 후에 우물들의 각각 내의 형광성의 변화들 또는 변화들의 결여는 분석 디자인에 따라 제어 신호의 존재 및/또는 타겟 분석물 신호의 존재 또는 부재를 지시할 수도 있다.
에지 검출은 삼각형 필터 또는 당 기술 분야에 공지된 다른 신호 필터들과 같은 필터들을 포함할 수 있다. 카트리지 우물들의 에지들과 연계된 기준들은 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 우물들 주위에 침착되거나 배치된 착색된 층들, 광학 산란을 야기하는 물리적 에지들, 자동 형광성을 갖는 카세트 재료들 등을 포함할 수 있다. 따라서, 맵핑 루틴이 대안적으로 초기 기준점이 광학적으로, 전기적으로 또는 기계적으로 설정되도록 카트리지 본체 또는 샘플 우물과 연계된 기준에 인덱싱될 수 있다. 초기 위치(x0) 및 연계된 강도(I0)에 대한 데이터쌍들의 세트가 기록된다. 후속의 데이터쌍들(xi, Ii)이 우물 맵핑이 단계식으로 진행됨에 따라 수집되고(xi = x0 + (ni)), 여기서 n은 스텝퍼 모터의 스텝들의 수이고, i는 스텝 거리이다. 알고리즘들은 샘플 우물 에지들의 신호 변화들 특성을 검출하는데 사용되고, 이들은 스캐닝 횡단부 내의 하나 이상의 샘플 우물들이 인덱싱되도록 인덱싱된다. 따라서, 사전 스캔이 수행되고 수집된 기준선 광학 신호 데이터를 디지털화할 수 있고, 이어서 샘플 우물들은 관심 분석물들을 포함하는 액체로 플러딩되고, 제 2 스캔이 수행되고; 2개의 스캔들 사이의 차이가 타겟 분석물 및/또는 관심 제어 분석물을 표현한다. 신호 처리 및 디지털화 및 후속의 분석은 검출기 헤드 내의 자율적인 데몬의 제어 하에서 수행된다.
도 28a 및 도 28b는 원시 입력 및 디지털화된 출력의 표현들이고, 데몬에 의한 기포 간섭의 디지털 제거를 위한 방법을 설명한다. 도 28a에서, 증폭 후에 포토다이오드로부터의 출력(1900)이 표현된다. 노이즈의 레벨은 일반적으로 낮지만, 신호는 예시를 위해, 검출 챔버(1501, 도 29 참조) 내의 2개의 소형 기포들의 존재에 기인하여 1901, 1902에서 열화한다. 데몬은 출력 신호에 임계치를 인가하고, 신호가 임계치를 초과하면 "하이"(즉, 1)로, 신호가 임계치 미만이면 "로우"(즉, 0)로 신호를 스코어링한다. 방출 광학 기기들 및 필터들에 정합되는 형광체의 존재를 제외하고는 어떠한 신호 출력도 임계치를 초과할 수 없기 때문에, 임의의 포지티브 신호(1903)는 형광체의 존재에 대해 포지티브 분석이다. 임계치 비교기는 분석시에 임상 샘플들의 경험에 기초하여 조정될 수 있다. 따라서, 스캐닝 이미지 데이터의 "1-비트" 디지털 변환이 기포들로부터 임의의 간섭을 제거한다. 본 발명자들은 형광체가 존재하지만 다수의 기포들이 챔버를 충전할 때, 기포들 주위에 또는 기포들을 통해 굴절된 광이 포지티브 신호를 생성할 것이라는 것을 놀랍게도 발견하였다. 시스템은 따라서 감염성 질병에 대한 진단 분석들에서 요구되는 바와 같이, 정량적 테스팅에 대해 매우 에러 저항성이며 강인하다. 신호 비교기는 검출기 헤드 내에 매립된 마이크로프로세서 및 펌웨어의 디지털 기능이고, 호스트 제어기 기능에 독립적이다.
호스트 제어기 기능들
재차 도 27을 참조하면, 호스트 제어기(1800)는 데몬을 작동하는 것을 담당하지만, 그 작동들을 제어하지 않는다. 데몬의 작동 중에, 호스트 시스템은 온도 및 공압 제어, 검출기 헤드 스캐닝, 사용자 인터페이스 작동성, 및 고장 모니터링과 같은 다양한 분석 기능들을 수행하기 위해 멀티태스킹한다.
다른 기능들 중에서, 호스트 제어기는 미량분석 카트리지 내의 밸브들 및 다이어프램 펌프들, 샘플의 열적 순환과 연계된 임의의 저항 또는 펠티에형 가열 소자들을 포함하는, 분석을 수행하는데 필요한 공압 로직 및 펄스 트레인 루틴들을 제어하기 위한 시스템 하드웨어를 작동하고, 선택적으로 용융 중에 저항 가열 소자들 및 냉각 중에 송풍기(도 22)를 작동함으로써 검출 챔버 내의 용융 곡선들을 수행할 수도 있다. 호스트 제어기와 인터페이스하는 선택적 구성요소들은 삽입가능한 미량분석 카트리지 상에 인쇄된 정보를 감지하기 위한 바코드 리더를 포함한다.
호스트 제어기는 비휘발성 메모리 및 분석 프로세스의 단계들을 조정하기 위한 그리고 사용자에 이용 가능하게 될 형태로 머신-판독가능 또는 그래픽적으로 표시가능한 보고로 매립된 데몬으로부터 신호를 변환하고 포맷팅하기 위한 프로그램가능 명령들을 구비한다. 테스트 데이터를 표시하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스(1820)가 여기에 도시된 바와 같이 검출 시스템 내에 일체화될 수 있고, 또는 네트워크, 인트라넷 또는 인터넷의 부분으로서 데이터 라인들 또는 무선 인터페이스들을 통해 이에 접속될 수 있다. 일반적으로, 직렬 비동기식 통신들 인터페이스가 기구 머더보드 상에 또는 외부 네트워크 상에 호스트 제어기와 통신을 위해 제공된다.
유사하게, 결과들, 데이터, 에러 코드들, 상태 업데이트들 등은 USB, RS232 또는 FireWire와 같은 공통 전자 인터페이스 및 데이터 라인들을 거쳐 그리고 IR-전송, 블루투스, GSM, GPRS 및 RSID와 같은 무선 전송 시스템을 거쳐 송신될 수 있다. 프로그래밍, 리프로그래밍, 캘리브레이션 및 리캘리브레이션 뿐만 아니라 디바이스의 시스템 진단이 USB, RS232 또는 FireWire와 같은 공통 전자 인터페이스들 및 데이터 라인들을 거쳐 그리고 IR-전송, 블루투스, GSM, GPRS 및 RSID와 같은 무선 전송 시스템을 거쳐 가능하다.
디커플링된 광학 기기들
도 29a는 여기 모드에서 평면볼록 대물 렌즈(1500)의 표현이다. 여기 원추(1501)가 카트리지 검출 챔버(1403) 및 미러면(1400)을 갖는 가열 블록(1410)에 대해 도시되어 있다. 수렴 여기 원추는 소스로부터 대물 렌즈를 조명하는 광선들을 분기함으로써 형성되고, 이에 의해 초점 위치 거리(L2')가 렌즈의 네이티브 초점 길이(L2)보다 크다. 대류에 의해, 렌즈의 네이티브 후방 초점 길이(L2)가 시준된 광을 사용하여 결정된다. 초점을 시프트하는 것은 "디커플링"이라 명명되고, 이 경우에 소스 렌즈에 더 근접한 소스를 이동시킴으로써 성취되었지만, 더 일반적으로 디커플링은 비시준된 광을 사용하여 성취될 수 있다.
렌즈(1500)와 미러면(1400) 사이에는 검출 챔버(1403)를 갖는 미량분석 카트리지(200)가 개재되어 있다. 검출 챔버는 상부 광학 윈도우(1502) 및 하부 열광학 윈도우(1503)에 의해 경계형성된다. 작동시에, 개입 체적은 2개의 혼입된 기포들(1505)을 갖고 여기서 도시된 액체 샘플에 의해 점유된다. 초점 원추는 미러면으로부터 반사되어 검출 챔버 내의 소스의 실제 이미지(1510, 실선 광선들) 및 미러면 아래의 소스의 가상 이미지(1511, 점선 광선들)를 형성하는 것으로 보인다. 후방 초점 위치(L2')는 따라서 일반적으로 렌즈와 미러 사이의 거리와 같거나 크다. 미러에 타격하는 여기광은 검출 챔버의 유체 체적 내의 포커싱된 빔으로서 반사되어, 따라서 샘플을 통한 여기광의 광 경로의 길이를 배가하고 여기 형광성 수율을 증가시킨다. 후방 초점 위치(L2')는 렌즈(1500)의 후방 초점 길이(L2)에 동일하지 않고, 2개는 일반적으로 소스(1512)로부터 분기 빔으로 렌즈를 조명함으로써 디커플링된다.
도 29b는 방출물 수집 모드에서 도 28의 대물 렌즈의 표현이다. 1차 및 반사된 형광성 방출물들이 도시되어 있다[실제 이미지(1510) 및 가상 이미지(1511)로부터 실선 및 점선들]. 챔버(1403) 내의 기포들이 재차 도시되어 있다. 대물 렌즈(1500)의 평면 후방면에 타격하는 광선들이 시준되고(1522) 검출기에 전달될 것이다. 캡처된 형광성 신호의 양은 렌즈의 각도 및 개구수들에 의존한다. 렌즈(1500)의 네이티브 후방 초점 길이는 L2이다. 렌즈의 후방 초점 위치는 도 30 및 도 31에 도시된 바와 같이 소스를 재위치시킴으로써 또는 소스 렌즈의 형상 또는 굴절률을 변화시킴으로써 렌즈의 네이티브 초점 길이에 대해 조작되거나 "디커플링될" 수 있다(L2 대 L2').
도 30은 디커플링된 여기 및 방출 광학 기기들을 갖는 광학 경로(1700)의 개략도이다. 이 도면에서, 여기 광선들은 실선들로서 도시되고, 방출 광선들을 점선들로 도시되어 있다. 여기서, 광원(1701)은 도시된 바와 같이 LED, 렌즈 하우징 및 반사기 링을 갖지 않는 SMD LED, SLED, 펌핑 레이저 다이오드, 리지-도파로(Fabry Perot) 레이저 다이오드, 동조가능 레이저 등, 예를 들어 바람직하게는 좁은 대역폭을 갖는 조명의 소스일 수 있다. 예를 들어, 630 nm(적), 470 nm(청), 525 nm(녹), 601 nm(주황), 588 nm(황) 등에서 피크 방출을 갖는 다양한 좁은 대역폭들의 LED들이 이용 가능하다. 백색광 LED들이 원한다면 사용될 수 있지만, 일반적으로 LED 출력은 분석시에 타겟의 형광체와 정합되고, 선택적 여기 배리어 필터(도시 생략)가 요구된 바와 같이 대역통과를 날카롭게 하는데 사용될 수 있다. 광원(1701)의 광 출력은 평면볼록 렌즈로서 여기에 도시된 소스 렌즈(1702)에 의해 전달되지만, 성형된 비구면체들이 또한 2색 미러 요소(1704)를 타격하기 전에 사용될 수 있고, 여기서 여기 빔은 대물 렌즈(1705) 상에 반사된다. 미량분석 카트리지(1402) 내의 샘플 유체 체적(1720)에 타격하는 여기 원추는 실선들로 도시된다. 비통상적으로, 여기 원추의 초점은 소스(1701)를 소스 렌즈(1702)에 더 근접하여[즉, 거리(L2')를 증가시키기 위해 거리(L1')를 단축시킴, 여기서 거리(L1)는 렌즈(1702)의 네이티브 후방 초점 길이일 것임] 이동시킴으로써 샘플 챔버 및 후방 미러(1400)를 지나 투영되어 있다. 거리(L1')가 단축됨에 따라, 대물 렌즈를 타격하는 소스 광선들은 소스 렌즈에 의해 시준되지 않고 분기되어, 따라서 거리(L2')를 증가시킨다. 대물 렌즈(1705)의 네이티브 후방 초점 길이는 L2이고, 여기서 L2는 대물 렌즈의 후방과 미러를 분리하는 거리보다 작거나 같은데, 즉 샘플 챔버의 평면 내에 있어, 샘플 챔버 내의 형광체로부터의 임의의 방출물들 및 미러 내의 형광체의 가상 이미지를 형성하는 임의의 반사된 방출물들이 대물 렌즈에 진입하게 될 것이다. 방출물 원추는 여기광(미러 후방에 포커싱됨)의 초점으로부터 디커플링되는 초점을 갖는다. 초점 평면(L2) 내의 형광성 방출물들 및 초점 평면에서 발생하는 광의 임의의 가상 이미지는 대물 렌즈에 의해 효과적으로 시준되고, 2색 미러(1704), 대역통과 필터(1706)를 통해 효과적으로 전달되고, 이어서 통상적으로 PCB 또는 다른 고체 지지부(1709) 상에 장착된 센서(1708) 상에 센서 렌즈(1707)에 의해 포커싱된다. 렌즈(1707)는 일반적으로 대물 렌즈(1705)의 후방 초점 길이(L2)에 동일한 후방 초점 길이(L3)를 갖는다. 그러나, 더 대형 렌즈(1707)가 예를 들어 포토다이오드 또는 CCD 칩인 센서(1707)의 표면적을 더 양호하게 이용하는데 사용될 수 있다. 신호의 최적화는 여기에 개략 설명된 디커플링된 광학 시스템들의 원리들에 따라 각각의 렌즈의 독립적인 조정을 필요로 할 수 있고, 종래 기술의 교시들에 대조적으로, 비시준된 여기광을 사용할 수 있다.
공통 광축 상의 대물 렌즈(1705)로부터 나오는 여기광의 원추 및 대물 렌즈(1705)에 진입하는 방출광의 원추는 상이한 초점들에서 작동적으로 디커플링된다[초점 위치들 L2' 대 L2 각각에 의해 지시됨). 거리는 여기광의 실제 초점 평면과 대물 렌즈의 네이티브 초점 길이를 분리한다. 대물 렌즈는 여기 원추(1501)의 연장된 초점 위치 및 미러를 사용하여 여기될 때 형광성 방출물들의 원점의 넓은 평면에서 광을 캡처할 것이다. "디커플링"이라 명명된 이 현상은 후방 미러가 사용될 때 형광성 방출물들의 캡처를 증가시키고, 종래 기술의 공초점 접근법에 따른 조기의 교시들을 부정하는 것으로 발견되었다.
종래 기술의 교시들은 여기 및 방출을 공초점이 되게 하는 것을 강력하게 지원하지만, 실제로 방출물 원추로부터 소스의 초점을 디커플링하고 후방 미러(1400)를 사용하는데 있어 이전에 볼 수 없었던 장점이 있다. 방출된 광은 샘플 카트리지 전체에 걸쳐 더 큰 면적 및 깊이로부터 발생하여, 따라서 소형 기포들, 미혼합 영역들, 또는 켄칭된 프로브에 기인할 수 있는 바와 같은 데드 스폿들(dead spots) 또는 불균질성들로부터 신호의 임의의 결여를 극복한다. 더 큰 신뢰성이 초점에서 발생하는 여기를 위한 소정의 선택도를 희생하여 성취되지만, 여기를 위한 공간 선택도는 실제로 분석 디바이스 내에서 바람직하지 않다. 이는 종래 기술의 기술적 진보이다.
요약하면, 특정 실시예들에서, L2'는 L2 및 L3보다 클 수 있다. L1은 여기광의 원추가 샘플 챔버(1403) 후방으로 그리고 가장 바람직하게는 후방 미러(1400)에 근접하여 또는 후방으로 떨어지도록 구성될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 여기 원추의 초점은 후방 미러 상에 또는 후방에 떨어진다. 대물 렌즈는 일반적으로, 방출된 광이 센서 렌즈(1707)로부터 방출된 광의 대칭 원추에 의해 검출 센서 상에 투영을 위해 효과적으로 수집되어 시준되도록(즉, L2=L3) 구성된다.
이에 따라, 다른 실시예에서, 본 발명의 장치는 여기 광학 기기들 및 방출 광학 기기들이 디커플링되도록 구성된 렌즈들을 이용한다. 이 장치의 제 1 실시예에서, 광원은 소스 렌즈로부터 거리(L1')에 위치되고, 여기서 L1'<L1이고, 이에 의해 여기 광학 기기들 및 방출 광학 기기들은 L2'>L2가 되도록 미러면에서 또는 미러면 후방에서 초점 위치(L2')로 여기 원추를 전이함으로써 디커플링된다. 더 일반적으로, 소스 렌즈는 대물 렌즈 상에 입사된 광의 분기빔을 형성하도록 구성되어, 이에 의해 초점 위치(L2')에 여기 원추를 위치시키고, 여기서 L2'>L2이다.
유리하게는, L2는 L3에 대칭이도록 구성되어(즉, L2=L3), 검출기(1708)의 작동이 최적화되고 강인하게 된다. 센서 포토다이오드는 바람직하게는 분석 유효성의 손실 없이 몇몇 오정렬도를 수용하도록 렌즈들(1705, 1707)의 초점의 원추를 참조하여 충분히 크도록 구성된다.
디커플링된 광학 기기들의 대안 실시예에서, 대물 렌즈의 네이티브 초점 및 여기광의 실제 초점은 L2>L2'가 되도록 거리만큼 분리된다. 이는 도 31에 도시되어 있고, 여기서 소스(1701)는 렌즈의 네이티브 후방 초점 길이가 초과되도록(L1'>L1) 소스 렌즈(1702)로부터 이격하여 이동된다. 이러한 재위치설정의 효과는 도시된 바와 같이 소스 렌즈로부터 방출된 광선들이 대물 렌즈(1705)에 접근함에 따라 수렴하게 하는 것이고, 최종 효과는 L2'를 단축하는 것이다. 광학 윈도우들(1502, 1503) 사이에서 샘플 챔버(1403)의 중간에 직접 여기 원추 초점 위치를 배치함으로써, 그리고 미러(1400)를 사용함으로써, 샘플 액체 내의 형광체들의 여기가 성취된다. 그러나, 디커플링된 광학 기기들의 사용의 이 경우에, 대물 렌즈는 또한 샘플 챔버에 더 근접하여 이동되고, 렌즈의 네이티브 후방 초점 길이(L2)는 이제 미러의 후방에 위치된다. 이 효과는 렌즈의 겉보기 각도 개구를 증가시키는 것인데, 즉 형광체들에 더 근접하여 렌즈를 이동시킴으로써, 더 많은 광이 수집되고 센서에 재지향된다. 이전과 같이, 대물 렌즈로부터 시준된 출력은 센서(1708) 상에 포커싱되고, 따라서 통상적으로 L2는 L3와 같을 수 있다. 따라서, 디커플링의 원리들이 또한 본 발명의 양태인 미러가 있는 열광학 인터페이스와 함께 사용될 때 신호 수집 효율을 최적화하기 위해 비-시준된 여기광을 사용하기 위해 2개의 상보적인 방법들을 포함하도록 도 30 및 도 31에 도시되어 있다.
디커플링은 포지티브 및 네거티브 분석 결과의 구별이 요구되는 분석들 뿐만 아니라, 예를 들어 열대열원충의 경우에 분열체 또는 분열소체 카피 번호로서 소정 레벨의 정량화가 요구되는 분석들에서도 유용하다. 그 발명자, 1957년의 민스키(Minsky)(미국 특허 제 3013467호)에 의해 관절연결된 바와 같이, 공초점 광학 기기들의 원래 목적은 여기 원추가 임의의 소정의 시간에 포커싱되는 시편의 영역으로부터만 방출물을 모니터링하면서, 시편을 가로질러 그리고 시편을 통해 여기의 초점을 래스토링(rastoring)함으로써(xyz축 래스토링) 두꺼운 고체 시편의 3차원 이미지를 생성하는 것이었다는 것이 주목되어야 한다. 대조적으로, 일반적으로 균질한 유체 혼합 시편에서, 최고 가능한 형광성 캡처를 갖는 시편의 전체 형광성을 측정하는 것인 대조적인 효과가 요구된다. 다중 측정치들이 시편의 횡단 중에 취해지는 시스템들에서, 통계적 방법들은 기포들에 의해 발생되는 것과 같은 간섭들을 극복하는데 사용될 수 있고, 샘플 챔버 내에서 어디서 발생하는지에 무관하게 강한 포지티브 신호가 포지티브 분석 결과를 지시하는 가능성이 있다. 따라서, 문제점을 재공식화함으로써, 본 발명자들은 형광성 검출이 더 민감하고 임시 간섭들의 존재시에 더 강인한 운좋은 결과를 갖고, 여기 및 방출물의 초점 평면의 디커플링에 의해 후방 미러를 갖는 신규한 광학 시스템을 설계하는 것이 가능하였다.
도 32a는 미러 위에 대물 렌즈의 높이를 변경함으로써 형광성 신호 출력의 향상을 설명하는 실험 결과들을 플롯팅하고 있다. 간략하게, 형광성 비드들(미국 팬실베니아주 피츠버그 소재의 Thermo Fisher Scientific, 부품 번호 G0300)은 미량분석 검출 챔버 및 검출기의 대물 렌즈(315) 아래에 장착된 검출 챔버 내에 삽입되었다. 디지털 마이크로미터를 사용하여, 미량분석 카트리지 위의 검출기 헤드의 높이는 이어서 플롯을 구성하도록 변경되었다. 제 2 쌍을 이룬 실험에서, 미러가 있는 표면은 제거되었다. 실선(2100)은 가열 블록 상의 미러의 존재시에 렌즈 높이를 변경하는 효과를 도시하고, 점선(2101)은 후방 미러의 부재시에 렌즈 높이를 변경하는 효과를 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, 미러의 존재는 미러 평면 후방에서 최적 방출 최대값으로 시프트하는 것으로 보인다(즉, 렌즈 내에 캡처된 실제 및 가상 형광성 방출물들의 합성물).
도 32b는 후방 미러를 갖는(2103) 및 갖지 않는(2102) 출력 신호 강도를 도시하는 막대그래프이다. 출력 신호는 도 29a에 도시된 바와 같이 미러 후방에 초점에서 여기빔을 포커싱하고 도 29b 및 도 30에 도시된 바와 같이 더 짧은 작업 거리에서 방출물들을 수집함으로써 최적화되는 것으로 판명되었다.
제 2 실험에서, 검출기 챔버는 가용 형광체를 포함하는 액체 샘플로 충전되고, 켄칭 아티팩트를 회피하기 위해 일정한 속도로 챔버를 통해 펌핑된다. 검출기 헤드 높이는 이어서 이전과 같이 변경되고 최적 검출기 높이가 결정된다. 관련된 실험들에서, 소스 렌즈로부터 광원의 작업 거리는 또한 검출의 감도 및 한계를 최적화하기 위해 변경된다. 본 발명자들은 대물 렌즈가 검출 챔버 내에 중심설정되고 다른 렌즈들이 공초점으로 이루어질 때 성취되지 않는다. 미러가 사용될 때, 디커플링된 광학 기기들은 유리한 결과들, 필드에서 기술적 진보를 성취한다.
도 33a는 앰플리콘에 혼성체화된 분자 비콘에 대해 수집된 스캐닝 데이터를 도시한다. 스캐닝축은 각각 포지티브 및 네거티브 테스트 조건들을 표현하는 검출 우물들(2200, 2201)을 횡단하고, 신호가 검출 우물들에 한정되는 것을 알 수 있다. 샘플은 검출 또는 샘플 챔버 내의 온도가 계통적으로 변형됨에 따라 반복적으로 스캐닝된다. 스캔들은 데이터의 공간 분해능을 예시하기 위해 플롯 내에 중첩된다. 35℃, 65℃, 70℃, 75℃ 및 80℃ 테스트 조건들에 대한 형광성 스캔들이 표시된다. 40, 45, 50, 55 및 60℃에서의 테스트 플롯들 및 85 및 90℃ 플롯들은 예측된 바와 같이 양호하게 구별되지 않고, 개별적으로 표시되지 않았다. 형광 신호는 온도의 함수인 것을 알 수 있다. 형광성 켄칭은 이중 가닥 프로브-타겟이 용융됨에 따라 증가되는 것으로 관찰되는데, 즉 신호는 35℃에서 최대이고 본질적으로 80℃에서 존재하지 않는다. 도 33b에서, 데이터는 포지티브(2301, 실선) 및 네거티브(2302, 점선) 테스트 조건들에 대해 신호 대 온도에 대해 플롯팅된다. 도 33c에서, 제 1 도함수가 플롯팅되어, 약 70℃의 FRET 용융 온도를 지시한다.
예 I
본 예에서, 본 발명의 장치는 혈액과 같은 인간 샘플 내의 병원체의 핵산들의 검출에 의해 감염성 질병의 진단에 유용한 것으로 개시되었다. 온보드 건조 및 액체 시약들을 사용하여, 혈액 샘플이 처리되고, 열대열원충과 연계된 DNA가 약 30분 이하로 검출된다. 샘플로부터 정화된 DNA는 공동 양도된 미국 특허 제 7544506호, 제 7763453호, 및 제 7955836호에 설명된 바와 같은 이중 온도 구역들을 갖는 2개의 챔버들을 사용하여 PCR을 받게 된다. 앰플리콘은 이어서 증폭된 타겟에 유도된 FAM 형광성-태그된 분자 비콘을 사용하여 검출된다. 선택적으로, 멀티플렉스 증폭을 갖는 캘리포니아 레드-태그된 RNA아제 P 루코사이트 엑손 시퀀스로 이루어진 제어가 분석을 유효화하는데 사용된다. 본 발명의 열광학 인터페이스를 사용하는 대표적인 열적 용융 곡선이 도 33b에 도시되어 있다.
예 II
본 발명의 장치는 응고병들의 진단에 유용하다. 온보드 건조 및 액체 시약들을 사용하여, 혈액 샘플은 (미국 버몬트주 에섹스 정션 소재의 Haematologic Technologies의 D-Phe-Pro-Arg-ANSNH-사이클로헥실-2HCl; F.W. = 777.81)과 같은 형광성 기판을 갖는 플라즈마를 배양함으로써 응고 인자 빌라 결핍을 위해 분석되고, 여기서 ANSN은 염료와 펩타이드 사이의 아미드 결합이 분할될 때 점등하는 형광체 6-아미노-1-나프탈렌-설폰아미드이다. 조직 인자(TF)는 Calbiochem(미국 캘리포니아주 라호야)로부터 얻어지고, 사용 전에 포스파티딜클로린 또는 포스파티딜세린 수포들 내에 합체된다. TF는 초과로 사용된다. 5 nM TF를 갖고 20 uM EDTA를 포함하는 20 mM 헤페스 버퍼, pH 7.4의 0.15 M Nacl로 이루어진 100 uL 기판 반응 혼합물이 활성 효소 복합물을 형성하기 위해 10분 동안 플라즈마 샘플로 배양된다. ANSH 기판이 이어서 첨가된다. 기판의 수소분해의 비율은 인자 빌라의 정규 범위에 걸쳐 선형적이고, 표준 곡선으로부터 결정될 수 있다. 분석 전개의 설명들은 미국 특허 출원 공개 제 2009/0325203호 및 다른 실험 문헌에서 발견될 수 있다.
상기 설명은 본 발명의 특정 실시예들의 설명이지만, 다양한 대안들, 수정들 및 등가물들을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명을 참조하지 않고 결정되어야 하고, 대신에 이들의 등가물의 최대 범주와 함께, 첨부된 청구범위를 참조하여 결정되어야 한다. 첨부된 청구범위는 이러한 한정이 구문 "~하기 위한 수단"을 사용하여 소정의 청구항에서 명시적으로 언급되지 않으면, 기능식 제한들(means-plus-function limitations)을 포함하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
이에 한정되는 것은 아니지만 미국 특허 출원 제 61/745,329호를 포함하는 첨부된 출원 데이터 시트에 언급되고 그리고/또는 본 명세서에 언급된 모든 미국 특허들, 미국 특허 출원 공개들, 미국 특허 공개들, 외국 특허들, 외국 특허 출원들 및 비특허 공개들은 그대로 참조로서 본 명세서에 합체되어 있다. 실시예들의 양태들은 필요하다면 또 다른 실시예들을 제공하기 위해 다양한 특허들, 출원들 및 공개들의 개념들을 이용하기 위해 수정될 수 있다.

Claims (73)

  1. 샘플 내의 광학 신호를 검출하기 위한 미량분석 시스템으로서, 상기 샘플을 가로질러 검출기 헤드를 스캐닝하는 것이 가능한 기계적 시스템을 포함하고, 상기 검출기 헤드는 적어도 하나의 검출 채널을 포함하고, 상기 검출 채널은 대물 렌즈 및 상기 대물 렌즈에 의해 수신된 광학 신호들을 캡처하여 증폭하도록 구성된 광전 회로 소자들을 포함하고, 상기 기계적 시스템은 상기 검출기 헤드의 외부의 제어기 및 회로에 의해 작동되고, 상기 광전 소자들은 상기 검출기 헤드 내에 매립된 마이크로프로세서와 연계된 펌웨어 내에 상주하는 자율적 데몬(autonomous daemon)의 제어 하에 있는 미량분석 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 광전 회로 소자들은 상기 외부 회로로부터 전자적으로 격리하여 작동을 위해 구성되는 미량분석 시스템.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 광전 소자들은 상기 데몬의 제어 하에서 신호 처리 또는 신호 디지털화를 위해 구성되는 미량분석 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출기 헤드는 상기 외부 제어기에 디지털 형태로 상기 신호를 전송하는 것이 가능한 적어도 하나의 디지털 송신기를 포함하는 미량분석 시스템.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출기 헤드는 상기 외부 제어기의 제어 하에서 상기 샘플을 가로질러 스캔을 수행하는 것이 가능하고, 상기 검출기 헤드 내의 상기 데몬은 상기 스캔 중에 캡처된 임의의 광학 신호들의 맵을 자율적으로 구성하도록 구성되고, 상기 맵은 적어도 하나의 기준점에 대한 위치의 함수로서 신호 강도를 표현하는 데이터쌍들을 갖는 미량분석 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 검출기 헤드는 카트리지 본체를 가로지르는 규정된 경로 상에서 샘플 우물을 스캔하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 기준점은 상기 카트리지 본체의 정합 특징부와 연계된 상기 규정된 경로 상의 공간 좌표인 미량분석 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 정합 특징부는 상기 맵의 상기 기준점을 초기화하기 위해 기계, 전기 또는 광학 스위치를 트리거링하는 미량분석 시스템.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 샘플 우물의 위치는 광학 신호의 제 1 변화가 검출되는 상기 규정된 경로를 따른 상기 기준점으로부터의 거리로서 결정되고, 상기 광학 신호의 제 1 변화는 비어있는 샘플 우물의 제 1 에지와 상관하고, 광학 신호의 제 2 변화가 검출되고, 상기 제 2 변화는 상기 자율적 데몬의 제어 하에서 비어있는 샘플 우물의 제 2 에지와 상관하는 미량분석 시스템.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 카트리지 본체를 가로지르는 상기 스캔은 상기 샘플 우물 내의 샘플로 반복되고, 상기 제 1 에지와 상기 제 2 에지 사이의 맵 좌표들과 연계된 광학 신호의 변화가 상기 자율적 데몬의 제어 하에서 분석 결과를 지시하는 신호의 변화에 대해 분석되는 미량분석 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 상기 자율적 데몬의 제어 하에서 디지털화된 신호를 생성하기 위해 디지털화 전에 전자 조절 및 증폭을 받게되는 미량분석 시스템.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 디지털화 전에 임계치 차감을 받게되는 미량분석 시스템.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 단일-비트 디지털화를 받게되는 미량분석 시스템.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 디지털화된 신호는 상기 우물을 가로지르는 상기 스캔 중에 일련의 데이터쌍들로서 레지스터에 축적되고, 상기 스캔을 위한 신호들의 합이 상기 외부 제어기에 보고되는 미량분석 시스템.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 디지털 신호는 상기 외부 제어기에 보고되는 미량분석 시스템.
  15. 제 5 항에 있어서, 상기 검출기 헤드는 카트리지 본체를 가로지르는 규정된 경로 상의 샘플 우물을 스캔하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 기준점은 상기 샘플 우물의 정합 특징부와 연계된 상기 규정된 경로 상의 공간 좌표인 미량분석 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 데몬은 샘플 우물의 제 1 에지와 연계된 광학 신호의 변화를 검출함으로써 상기 맵 상의 상기 기준점을 취득하도록 구성되고, 상기 샘플 우물의 위치는 상기 기준점으로부터 상기 규정된 경로를 따라 상기 광학 신호의 제 2 변화가 검출되는 점까지의 거리로서 결정되고, 상기 제 2 변화는 비어있는 샘플 우물의 제 2 에지와 상관하는 미량분석 시스템.
  17. 제 8 항에 있어서, 상기 카트리지 본체를 가로지르는 상기 스캔은 상기 샘플 우물 내의 샘플로 반복되고, 상기 제 1 에지와 상기 제 2 에지 사이의 맵 좌표들과 연계된 광학 신호의 변화는 상기 자율적 데몬의 제어 하에서 분석 결과를 지시하는 신호의 변화에 대해 분석되는 미량분석 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 상기 자율적 데몬의 제어 하에서 디지털화된 신호를 생성하기 위해 디지털화 전에 전자 조절 및 증폭을 받게되는 미량분석 시스템.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 디지털화 전에 임계치 차감을 받게되는 미량분석 시스템.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 신호의 변화는 단일-비트 디지털화를 받게되는 미량분석 시스템.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 디지털화된 신호는 상기 우물을 가로지르는 상기 스캔 중에 일련의 데이터쌍들로서 레지스터에 축적되고, 상기 스캔을 위한 신호들의 합이 상기 외부 제어기에 보고되는 미량분석 시스템.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 디지털 신호는 상기 외부 제어기에 보고되는 미량분석 시스템.
  23. 제 15 항에 있어서, 상기 정합 특징부는 자가 형광성을 갖는 에지이고, 상기 에지는 상기 샘플 우물을 경계 형성하는 미량분석 시스템.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광학 신호는 형광성 신호이고, 상기 검출기 채널은 여기광과의 혼합물을 조사하기 위한 LED, 여기 필터를 갖는 광 경로, 방출 필터, 규정된 통과대역에서 형광체로부터 방출물들의 검출을 가능하게 하도록 동조되는 2색 미러, 상기 여기광을 집광하기 위한 그리고 상기 방출물들을 수집하기 위한 상기 대물 렌즈, 상기 통과대역 방출물들을 수신하기 위한 센서 렌즈를 갖는 센서, 및 상기 센서로부터 출력을 증폭하기 위한 차폐형 전치증폭기 및 다단 증폭기 회로를 포함하는 미량분석 시스템.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 증폭기는 3단 증폭기이고, 상기 증폭기는 패러데이 케이지, 바이패스 캐패시터, 신호 조절 전치증폭기, 개별 접지 평면, 금속화된 검출기 헤드 하우징, 또는 이들의 조합에 의해 전자 노이즈로부터 차폐되고, 상기 증폭기는 상기 센서에 전기적으로 근접해 있는 미량분석 시스템.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 3단 증폭기는 최대 1014의 이득을 갖는 미량분석 시스템.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 3단 증폭기는 1012 내지 1014의 이득을 갖는 미량분석 시스템.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 대물 렌즈는 형광체들의 혼합물을 갖는 액체 샘플 상에 상기 여기광을 포커싱하도록 구성되고, 상기 여기광은 상기 샘플 우물보다 작은 스폿 상에 포커싱되는 미량분석 시스템.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 검출기 헤드는 복수의 검출기 채널들을 포함하고, 각각의 상기 검출기 채널은 여기광으로 상기 샘플 우물을 조사하기 위한 소스 LED, 여기 필터를 갖는 광 경로, 방출 필터, 규정된 통과대역에서 형광체로부터 방출물들의 검출을 가능하게 하도록 동조되는 2색 미러, 상기 여기광을 집광하기 위한 그리고 상기 방출물들을 수집하기 위한 상기 대물 렌즈, 상기 통과대역 방출물들을 수신하기 위한 센서 렌즈를 갖는 센서, 상기 센서로부터 출력을 증폭하기 위한 차폐형 전치증폭기 및 다단 증폭기 회로를 포함하고; 상기 데몬은 2개의 소스 LED가 동시에 턴온되지 않도록 주파수에서 각각의 상기 소스 LED를 스트로브(strobe)하기 위해 그리고 대응 LED가 온 또는 오프인지 여부에 따라 상기 복수의 검출기 채널들의 각각의 센서로부터 신호를 멀티플렉싱 방식으로 분석하도록 구성되는 미량분석 시스템.
  30. 제 29 항에 있어서, 각각의 상기 LED는 130 Hz의 주파수에서 턴온 및 턴오프되는 미량분석 시스템.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 대물 렌즈는 형광체들의 혼합물을 포함하는 액체 샘플 상에 여기광을 포커싱하도록 구성되는 미량분석 시스템.
  32. 제 29 항에 있어서, 상기 데몬은 상기 검출기 헤드 내의 휘발성 메모리 내에 디지털화된 증폭기 출력 및 스캐닝 위치를 표로 작성하도록 구성되는 미량분석 시스템.
  33. 제 29 항에 있어서, 상기 데몬은 혼합물을 포함하는 상기 샘플 우물의 스캔과 상기 샘플 우물의 기준선 스캔을 비교하고, 적어도 하나의 형광체-특정 방출물의 검출과 연계된 검출 이벤트를 지시하는 차이를 보고하기 위한 명령들을 포함하는 미량분석 시스템.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 데몬은 상기 호스트 제어기에 상기 검출 이벤트를 디지털식으로 보고하는 것이 가능한 미량분석 시스템.
  35. 제 29 항에 있어서, 상기 시스템은 그래픽 사용자 인터페이스 및 상기 외부 제어기의 제어 하에서 상기 검출 이벤트를 표시하기 위해 비휘발성 메모리 내의 프로그램가능 명령들을 포함하는 미량분석 시스템.
  36. 제 29 항에 있어서, 상기 시스템은 I/O 포트 및 상기 외부 제어기의 제어 하에서 원격 디바이스에 상기 검출 이벤트를 통신하기 위한 비휘발성 메모리 내의 프로그램가능 명령들을 포함하는 미량분석 시스템.
  37. 제 29 항에 있어서, 상기 형광체들의 혼합물은 타겟 분석물을 검출하기 위한 제 1 형광체 및 제어 분석물을 검출하기 위한 제 2 형광체를 포함하고, 또한 상기 타겟 분석물 및 상기 제어 분석물은 상기 혼합물 내에 함께 존재하는 미량분석 시스템.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센서는 포토다이오드인 미량분석 시스템.
  39. 제 24 항에 있어서, 상기 대물 렌즈에 의해 수신된 상기 조사된 광은 분기빔, 수렴빔, 또는 그를 통한 전이를 위한 시준된 빔으로서 형성되는 미량분석 시스템.
  40. 미량분석을 자동화하기 위한 방법으로서,
    호스트 제어기에 의해 제어된 유체 전기기계적 및 열적 프로세스들과 스캐닝 검출 헤드 내에 상주하는 자율적 데몬에 의해 제어된 광전 프로세스들로 미량분석 시스템을 작동적으로 분할하는 단계를 포함하고, 샘플을 가로지르는 상기 스캐닝 검출 헤드의 운동은 상기 호스트 제어기에 의해 제어되고, 상기 샘플 내에 발생된 신호의 광학 신호 취득, 사전 조절, 증폭 및 디지털화 모두는 상기 자율적 데몬에 의해 제어되는 방법.
  41. 미량분석을 수행하기 위한 장치로서,
    호스트 제어기에 의해 제어된 유체 전기기계적 및 열적 프로세스들과 스캐닝 검출 헤드 내에 상주하는 자율적 데몬에 의해 제어된 광전 프로세스들로 작동적으로 분할된 분석 시스템을 포함하고, 샘플을 가로지르는 상기 스캐닝 검출 헤드의 운동은 상기 호스트 제어기에 의해 제어되고, 스캔 중에 상기 샘플로부터 수집된 하나 이상의 신호들의 광학 신호 취득, 사전 조절, 증폭 및 디지털화 모두는 상기 자율적 데몬에 의해 제어되는 장치.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 데몬은 복수의 광학 채널들을 통해 상기 하나 이상의 신호들을 멀티플렉싱 방식으로 수집하는 것이 가능한 장치.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 데몬은 상기 스캔 중에 상기 신호들을 조절하고 디지털화하고, 위치 또는 시간의 함수로서 단일 비트 자료를 기록하는 것이 가능한 장치.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 데몬은 상기 복수의 광학 채널들로부터 디지털화된 광학 신호들을 조절하고 통계적으로 평가하고 상기 샘플 내의 제어 신호의 검출에 의해 상기 스캔의 유효화 후에 검출 이벤트를 보고하는 것이 가능한 장치.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 데몬은 상기 검출 이벤트를 외부 디바이스에 보고하는 것이 가능한 장치.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 복수의 광학 채널들은 타겟 분석물을 검출하기 위한 제 1 형광체 및 제어 분석물을 검출하기 위한 제 2 형광체를 포함하는 복수의 형광체들을 검출하도록 구성되고, 또한 상기 타겟 분석물 및 상기 제어 분석물은 상기 샘플 내에서 함께 존재하는 장치.
  47. 샘플 분석을 수행하기 위한 미량분석 카트리지로서,
    a) 포위된 유압 회로를 내부에 갖는 제 1 회로 카드로서, 상기 제 1 회로 카드의 상기 유압 회로는 제 1 샘플 처리 단계를 수행하도록 구성되는, 상기 제 1 회로 카드;
    b) 포위된 유압 회로를 내부에 갖는 제 2 회로 카드로서, 상기 제 1 회로 카드의 상기 유압 회로는 제 2 샘플 분석 단계를 수행하도록 구성되는, 상기 제 2 회로 카드;
    c) 상기 제 1 회로 카드 내의 상기 유압 회로와 상기 제 2 회로 카드 내의 상기 유압 회로 사이의 적어도 하나의 유체 접합부;
    d) 공압 인터페이스를 형성하는 공압 포트들의 어레이로서, 각각의 포트는 그에 인가된 공압 펄스를 수신하기 위한 것이고, 적어도 하나의 상기 포트는 상기 제 2 회로 카드 내의 공압 회로를 상기 제 1 회로 카드 내의 공압 회로에 유동 연결하는 비아를 갖고, 상기 제 1 회로 카드 내의 상기 공압 회로는 그 내부의 유압 회로를 작동하기 위한 것이고, 상기 제 2 카드 내의 상기 공압 회로는 그 내부의 유압 회로를 작동하기 위한 것인, 상기 공압 포트들의 어레이를 포함하고,
    상기 카트리지는 상기 제 1 비아에서 상기 공압 인터페이스에 인가된 공압 펄스가 외장 회로 카드로부터 내장 회로 카드로 상기 유체 접합부를 통해 상기 처리된 샘플을 강제 이동하도록 가능화되는 미량분석 카트리지.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 어레이는 상기 제 1 회로 카드 내의 공압 회로를 상기 제 2 회로 카드 내의 공압 회로에 유동 연결하는 비아들에 의해 유동적으로 접속된 복수의 공압 포트들을 포함하여, 상기 복수의 공압 포트들은 프로그램가능 명령들에 따라 인가된 복수의 공압 펄스들을 수신하고 이들 공압 펄스들을 상기 제 1 회로 카드 및 상기 제 2 회로 카드의 유체 회로 소자들에 멀티플렉싱하는 것이 가능하여, 이에 의해 상기 제 1 및 상기 제 2 유압 회로들을 작동하도록 요구되는 포트들의 수를 감소시키는 미량분석 카트리지.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 공압 인터페이스는 상기 제 1 회로 카드 및 상기 제 2 회로 카드 내의 더 강한 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들로의 더 강한 공압 펄스들 및 더 약한 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들의 더 약한 공압 펄스들의 멀티플렉싱된 분배를 가능하게 하도록 구성되는 미량분석 카트리지.
  50. 제 48 항에 있어서, 상기 공압 인터페이스는 포지티브 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들로의 포지티브 압력 공압 펄스들 및 진공 공압 압력으로 작동하는 회로 소자들로의 진공 압력 공압 펄스들의 멀티플렉싱된 분배를 가능하게 하도록 구성되는 미량분석 카트리지.
  51. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공압 인터페이스를 호스트 기구에 연결하도록 구성된 1회용 밀봉 가스켓을 포함하는 미량분석 카트리지.
  52. 제 47 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카트리지는 상기 공압 회로들에 공압 압력 상태들을 인가함으로써 제어되도록 구성되고, 상기 공압 압력 상태들은 포지티브 및 네거티브 압력들의 범위로부터 선택되는 미량분석 카트리지.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 공압 압력 상태들은 약 -5 psi, +10 psi, +12 psi, +20 psi, +7 psi 및 0 psi로부터 선택되는 미량분석 카트리지.
  54. 제 52 항에 있어서, 상기 제 1 카드의 적어도 하나의 공압 회로 및 상기 제 2 카드의 적어도 하나의 공압 회로는 상기 공압 인터페이스 포트 어레이의 공통 포트에 접속되고, 상기 제 1 카드 내의 상기 적어도 하나의 공압 회로는 상기 제 1 카드가 상기 샘플을 수용할 때 상기 샘플에서 작동하고, 상기 제 2 카드의 상기 적어도 하나의 공압 회로는 상기 샘플이 상기 제 1 카드로부터 상기 제 2 카드로 전달된 후에 상기 샘플에서 작동하는 미량분석 카트리지.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 제 1 카드는 샘플로부터 핵산 추출물을 추출하도록 구성되고, 상기 제 2 카드는 타겟 분석물을 위한 상기 핵산 추출물을 분석하도록 구성되는 미량분석 카트리지.
  56. 샘플 분석을 수행하기 위한 미량분석 장치로서,
    a) 호스트 기구와 도킹을 위해 구성된 1회용 미량분석 카트리지로서, 상기 카트리지는 그 내부에 배치된 적어도 하나의 유압 회로를 갖고, 상기 적어도 하나의 유압 회로는 그에 인터페이스된 적어도 하나의 공압 회로의 제어 하에서 작동하도록 구성되는, 상기 1회용 미량분석 카트리지;
    b) 공압 인터페이스 포트 어레이를 형성하는 하나 이상의 공압 포트들의 어레이로서, 각각의 포트는 상기 호스트 기구로부터 공압 회로로 공압 압력 상태를 반송하는 것이 가능한, 상기 하나 이상의 공압 포트들의 어레이;
    c) 상기 호스트 기구 내에 배치된 적어도 하나의 매니폴드로서, 상기 매니폴드는 그에 유동적으로 결합된 복수의 공압 압력 소스들을 갖고, 제 1 압력 소스가 분석 시퀀스의 제 1 시간 간격에 상기 매니폴드 내의 제 1 압력 상태를 형성하도록 작동되고 제 2 압력 소스가 상기 분석 시퀀스의 제 2 시간 간격에 상기 매니폴드 내의 제 2 압력 상태를 형성하도록 작동되고, 상기 매니폴드는 상기 공압 인터페이스 포트 어레이의 포트를 통해 상기 공압 회로에 유동식으로 접속되는, 상기 적어도 하나의 매니폴드; 및
    d) 상기 적어도 하나의 유압 회로를 공압식으로 제어하기 위한 명령들로서, 상기 명령들은 하나 이상의 메모리 요소들을 갖는 마이크로프로세서의 제어 하에서 실행되고, 상기 명령들은 상기 분석 시퀀스에 따라 상기 제 1 압력 소스 및 상기 제 2 압력 소스를 작동하기 위한 단계들을 포함하는, 상기 명령들을 포함하는 미량분석 장치.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 카트리지는 그에 인터페이스된 복수의 공압 회로들의 제어 하에서 작동하도록 구성된 적어도 하나의 유압 회로를 포함하고, 상기 공압 인터페이스 포트 어레이는 상기 적어도 하나의 매니폴드로의 유체 접속부들을 갖고, 상기 적어도 하나의 매니폴드는 복수의 압력 상태들에서 작동되도록 구성되는 미량분석 장치.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유압 회로는 복수의 공압 회로들에 의해 반송된 압력 상태들의 공압 제어 하에서 작동되도록 구성되고, 상기 공압 회로들 중 적어도 하나는 복수의 압력 상태들을 갖는 미량분석 장치.
  59. 제 56 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카트리지의 상기 공압 인터페이스 포트 어레이를 상기 호스트 기구에 연결하도록 구성된 1회용 밀봉 가스켓을 포함하는 미량분석 장치.
  60. 미량분석 카트리지를 제거가능하게 수용하기 위한 호스트 기구로서,
    a) 지지 베이스플레이트;
    b) 미량분석 카트리지를 수용하기 위한 도킹 베이로서, 상기 도킹 베이는 상기 베이스플레이트 상에 장착되는, 상기 도킹 베이;
    c) 상기 베이스플레이트 내에 배치된 공압 제어 매니폴드로서, 상기 매니폴드는 그 위에 배치된 공압 인터페이스 포트 어레이를 상기 도킹 베이 내에 가지는, 상기 공압 제어 매니폴드;
    d) 상기 도킹 베이 내에서 상기 베이스 플레이트에 부착되고, 스프링 장착부 및 상기 카트리지의 하부면과 인터페이스하기 위해 치수설정된 상위면을 갖는 적어도 하나의 가열 부재를 포함하는 히터 조립체를 포함하고,
    상기 도킹 베이는 상기 공압 인터페이스 포트 어레이 위의 제 1 위치로부터 제 2 위치로 상기 도킹 베이 내에서 상기 카트리지를 재위치설정하도록 구성된 클램핑 메커니즘을 포함하고, 상기 카트리지는 상기 공압 인터페이스 포트 어레이와 작동적으로 결합되고, 또한 상기 스프링 장착부는 상기 가열 부재의 상기 상위면에 대해 상기 제 2 위치에서 마이크로유체 카트리지의 하부면을 가압하도록 구성되는 호스트 기구.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 스프링 장착부는 상기 카트리지 및 상기 가열 부재에 가역적으로 접촉하는 열전달면에 걸쳐 약 1 psi의 스프링력을 인가하는 호스트 기구.
  62. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서, 클램핑 메커니즘을 갖는 상기 도킹 베이는 상기 베이스플레이트의 공압 인터페이스 포트 어레이를 상기 미량분석 카트리지의 정합 포트들과 동시에 결합하고 상기 적어도 하나의 스프링 장착된 가열 부재에 대해 상기 카트리지를 가압하도록 구성되는 호스트 기구.
  63. 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호스트 기구는 상기 가열 부재에 대해 상기 도킹 베이 내에 클램핑되는 동안 상기 공압 제어 매니폴드를 거쳐 상기 미량분석 카트리지의 작동들을 공압식으로 제어하도록 구성되는 호스트 기구.
  64. 제 60 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클램핑 메커니즘은 상기 공압 인터페이스 포트 어레이 및 상기 베이스플레이트의 상기 가열 메커니즘으로부터 상기 카트리지를 분리하도록 구성되어 상기 카트리지가 상기 도킹 베이로부터 제거될 수 있게 되는 호스트 기구.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 카트리지는 상기 도킹 베이의 상기 공압 인터페이스 포트 어레이에 상기 카트리지를 밀봉식으로 연결하도록 구성된 1회용 가스켓을 포함하는 호스트 기구.
  66. 제 60 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열 부재는 전해연마되고 크롬 도금되는 호스트 기구.
  67. 제 60 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열 부재는 저항 가열되는 호스트 기구.
  68. 제 60 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열 부재 상에 배치된 냉각 부재로부터 열을 대류식으로 소산하기 위한 제 1 팬을 더 포함하는 호스트 기구.
  69. 제 60 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미량분석 카트리지 내에 배치된 샘플 우물을 대류식으로 냉각하기 위한 제 2 팬을 더 포함하는 호스트 기구.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 제 2 팬은 상기 샘플이 형광식으로 모니터링되는 동안 상기 샘플 우물을 냉각함으로써 열적 어닐링 기능을 수행하도록 구성되는 호스트 기구.
  71. 병원균 조건과 연계된 타겟 형광성 신호 및 샘플의 내인성 비병원균 성분과 연계된 제어 형광성 신호에 대해 상기 샘플을 동시 분석하기 위한 방법으로서,
    a) 제 1 항의 검출기 헤드로 샘플 우물을 스캐닝하는 단계로서, 상기 타겟 형광성 신호는, 존재하면, 상기 검출기 헤드의 제 1 광학 채널 내에서 검출되고, 상기 제어 형광성 신호는, 존재하면, 상기 검출기 헤드의 제 2 광학 채널 내에서 검출되는, 상기 샘플 우물 스캐닝 단계; 및
    b) 상기 제 2 형광성 신호가 검출되면 그리고 상기 제 2 형광성 신호가 검출되는 경우에만 상기 분석의 유효한 결과를 보고하는 단계를 포함하는 방법.
  72. 형광 공명 에너지 전이(FRET) 용융 곡선 결정을 수행하기 위한 방법으로서,
    a) FRET 프로브 및 타겟 핵산 시퀀스를 수납하는 샘플 챔버를 듀플렉스 프로브의 용융 온도 초과의 온도로 가열하는 단계;
    b) 상기 가열을 턴오프하는 단계;
    c) 제 1 항의 검출기 헤드를 사용하여, 팬을 턴온하고 주위 공기의 스트림을 상기 샘플 챔버 상으로 지향함으로써 발생된 상기 샘플 챔버의 온도의 변화에 응답하여 상기 FRET 프로브의 형광성의 변화를 모니터링하여, 이에 의해 형광성을 모니터링하면서 상기 샘플 챔버를 급속하게 냉각하는 단계를 포함하는 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 용융 곡선은 1분 미만에 완료되는 방법.
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