JP3563140B2 - キャピラリーアレイ電気泳動装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、電気泳動装置に関し、特に蛍光標識ＤＮＡの分離分析に好適なキャピラリーアレイ電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ塩基配列決定ニーズの高まりと共に、高速・高スループットＤＮＡシーケンサー及びＤＮＡ分析装置の開発が望まれている。従来、ＤＮＡシーケンシングあるいはＤＮＡ分析には、平板状のゲルを分離媒体に用いて蛍光検出する電気泳動装置が用いられていた。しかし、平板状のゲルを用いたのでは高速化、高スループット化に限界があり、ゲルを充填したキャピラリーを多数本並べて計測するキャピラリーアレイ方式の電気泳動装置が提案されている（Ｎａｔｕｒｅ ３５９， １６７−１６８， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３６１， ５６５−５６６， １９９３）。
【０００３】
前記キャピラリーアレイ方式の電気泳動装置では、計測部のキャピラリーアレイは一直線上に並べられ、光照射を受ける。蛍光標識ＤＮＡから発せられた蛍光は、光電子増倍管を具備した検出器をキャピラリーアレイに対して相対的にスキャンしたり、ラインセンサーあるいはエリアセンサーと結像レンズを用いて一直線上に並んだ点状蛍光像を検出器上に結像することによって検出している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリーアレイ中のキャピラリーの数は全体のスループットに大きな影響を与えるため、アレイ中のキャピラリー数を増加してスループットの向上を図ることが考えられるが、取り扱い等の実用面からすると５０〜１００本が限界である。
検出器あるいはキャピラリーをスキャンする方式では、キャピラリーからの背景蛍光を除去するため共焦点蛍光検出器を使用している。このため、スキャン時の検出器と被計測部の間隔を高精度に保つ必要があり、スキャンスピードを速くしにくい難点があり、一度に測定できるキャピラリー数は５０本程度と見積もられる。
【０００５】
一方、蛍光ライン像をレンズでラインセンサー等の検出器上に結像させる方式では、並んだキャピラリーから溶出する試料をレーザで同時に照射するので前述の方式と異なりスキャンスピードの問題はなくなる。しかし、被計測部の長さがキャピラリー数に比例して長くなると、検出器上に縮小像を結像させる必要があるため、受光量が減少する難点がある。通常、検出器の長さは１６ｍｍ〜２４ｍｍであり、キャピラリー径は０．２ｍｍ程度、キャピラリーの中心間隔は０．４ｍｍ程度である。受光量を考えると像倍率は１／２程度が限度であり、この時使用できるキャピラリー数は８０〜１２０本である。
本発明は、より多くのキャピラリーを用いて計測できるキャピラリーアレイ電気泳動装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、計測部のキャピラリーの端部を２次元的に配置し、試料を各キャピラリーの端から２次元平面内に溶出させ、光照射し、２次元蛍光画像をエリアセンサーで受光することにより達成される。
すなわち、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、複数のキャピラリー電気泳動路を有し、その複数のキャピラリー電気泳動路は末端が２次元的に配列され、各キャピラリー電気泳動路で分離された試料に励起光を照射し、発せられた蛍光を２次元検出器で同時に検出することを特徴とする。
【０００７】
キャピラリー電気泳動路にはゲル状物質を満たすことができ、励起光はキャピラリーからバッファー液流中に溶出した試料に照射するのが好適である。
複数のキャピラリーの端部を略同一平面上に位置させ、前記平面と平行に励起光を照射する手段、及び前記平面と垂直な方向から２次元蛍光像を結像して検出する手段を備えると好都合である。
【０００８】
試料の蛍光検出は、複数のキャピラリーの端部が形成する平面と対向しておかれた光学窓との間にバッファー液流を形成し、そのバッファー液中に溶出した試料を蛍光検出してもよいし、複数のキャピラリーの軸方向にバッファー液を流出せしめてキャピラリーの延長軸方向に流れる層流を形成し、その層流中に励起光を照射して試料を蛍光検出してもよい。その際、複数のキャピラリーの端部が形成する平面とほぼ平行な平面を通過する試料に対して励起光を照射するのが好都合である。
【０００９】
より具体的には、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液に接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて支持体上に所定間隔で配置して固定したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を光学窓に対向させて複数枚積層され、キャピラリー先端と光学窓の間の空間にキャピラリーアレイシートの積層方向にバッファー液を流し、励起光照射光学系はキャピラリーアレイからバッファー液中に溶出される試料の流れと交差するように各キャピラリーアレイシートのキャピラリー配列方向に励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。前記支持体の光学窓と対向する端部は、キャピラリーが配置された面と反対側の面の角を面取り加工するのが好適である。
【００１０】
また、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液に接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて所定間隔で配置し上部支持体と下部支持体で挟持したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を光学窓に対向させて複数枚積層され、キャピラリーアレイシートの上部支持体及び下部支持体は平坦な端面と該端面から突出する縁部を有すると共に前記端面に開口するバッファー液流路を有し、支持体の縁部は光学窓と接触して各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間を形成し、励起光照射光学系は各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間に励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。計測セルのバッファー液入口に連通する上部支持体のバッファー液流路の前記端面における開口部は、隣接するキャピラリー端部のほぼ中間線上に位置するのが好適である。
【００１１】
また、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液入口とバッファー液出口の間に配置された複数の平行なスリットを有する隔壁部材、隔壁部材に対して略平行に所定の間隔をおいて配置されたバッファー液が接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて支持体上に所定間隔で配置して固定したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を隔壁部材のスリットに挿入して複数枚積層され、バッファー液はバッファー液入口から隔壁部材のスリットを通ってキャピラリー軸方向に流れ次いで隔壁と光学窓の間の空間を通ってバッファー液出口から排出され、励起光照射光学系は隔壁部材のスリット方向に沿って励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。
【００１２】
励起光は隔壁部材のスリット中を通過させることができる。また、キャピラリーアレイシートは、表面にバッファー液を流通させる溝を有する上部支持体と下部支持体によって挟持し、上部支持体及び下部支持体の先端部分を隔壁のスリットに挿入することができる。バッファー液を流通させる溝はキャピラリーシートの支持体に形成せずに、隔壁の支持体挿入面に形成してもよい。
【００１３】
【作用】
キャピラリーアレイの端部を１次元でなく２次元的に配列させることにより、蛍光画像の一辺の長さを大幅に縮小することができる。たとえば中心間隔を０．４ｍｍとして２００本のキャピラリーを並べると全体の長さは８０ｍｍとなるが、同じ２００本のキャピラリーでも１ｍｍの中心間隔で４段重ねにすると４ｍｍ×２０ｍｍ、８段重ねにすると８ｍｍ×１０ｍｍと小さな像になり、像を縮小せずに大きな受光量で検出することができる。
【００１４】
また、キャピラリーを２次元配列したことにより、１つのキャピラリーアレイシート中のキャピラリー数を減らすことができ、取り扱いが容易になる。支持体上に固定したキャピラリーアレイシートを用い、それを複数積層して２次元のキャピラリーアレイを形成することにより、キャピラリーの取り扱いが更に容易になるとともに、キャピラリーの位置精度を上げることができるため、励起光照射を効率的に行うことができる。
【００１５】
キャピラリーから溶出した試料をバッファー液の流れに乗せて運ぶことにより、キャピラリーを２次元的に配列したにもかかわらず複数のキャピラリーから溶出する試料を相互の干渉なく測定することができる。バッファー液の流れをキャピラリーの軸方向として各キャピラリーから溶出した試料が混合する前の位置で励起光を照射することにより、あるいはバッファー液を各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間に流して励起光を照射することにより、複数のキャピラリーから溶出する試料同士の干渉を完全に防止することができる。バッファー液をキャピラリーの軸と直交する方向に流す場合にも、キャピラリーアレイシート間の間隔を広めに設定することにより、あるいは隣接するキャピラリーアレイシートの間にバッファー液が滞留する領域を設けて試料の拡散・希釈を促進することによりキャピラリーから溶出した試料同士の干渉を回避することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
〔実施例１〕
図１は、多数本のキャピラリーを並べてシート状に保持したキャピラリーアレイシート１を示す。キャピラリーは石英製で、内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍｍのものを使用した。キャピラリーの長さは３０ｃｍであり、内部にポリアクリルアミドゲル（５％Ｔ、４％Ｃ）を詰めてある。キャピラリー内部のゲル組成は、用途により種々変更可能である。キャピラリーの右端側は２４本ずつ厚さ１．５ｍｍのステンレス板からなるキャピラリーホルダー２に先端を揃えて保持し、厚さ０．１ｍｍのポリエチレンテレフタレート製キャピラリーアレイカバー３を載せて接着固定してある。また、キャピラリーホルダー２先端部のキャピラリー保持面と反対側の面の角は、図示のように面取り加工してある。
【００１７】
図２は、図１に示したキャピラリーアレイシートを複数枚重ねて２次元アレイとしたキャピラリーアレイ電気泳動装置の概略図である。キャピラリーホルダー２に保持されたキャピラリーアレイシート１は、計測セル１７内に３〜５ｍｍ間隔で４段の階層状に重ねられ、キャピラリー先端と受光用石英窓６の間の間隔が約０．２ｍｍ〜０．３ｍｍとなるようにして固定される。計測セル１７の上部にはバッファー液入口４が設けられており、このバッファー液入口から注入されたバッファー液は線速度０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ／秒程度の流速でキャピラリーシートの先端部と受光用石英窓６の間の空間を図中上から下へ流れ、計測セルの下部に設けられたバッファー液出口５から流出する。バッファー液流路中には電極１４が設けられている。
【００１８】
多種蛍光体でそれぞれ修飾されたＤＮＡ試料は、９６穴のタイタープレート７の各試料ウエル１５に保持され、キャピラリーアレイの各キャピラリーに電界注入される。電界注入は、図２の円内に拡大して示すように、キャピラリーアレイの試料注入端をタイタープレート７の各ウエル１５に入れ、ウエル１５の底部に設けられた電極１３と計測セル１７に設けられた電極１４を介して、試料１６とキャピラリーの他端の間に８ｋＶの電圧を約５秒間加えることによって行う。試料側の電極１３は、試料ウエル１５の底部に固定せず、キャピラリーの試料注入端と共にタイタープレートの上方から試料ウエル１５中に挿入するようにしてもよい。
【００１９】
試料注入後は、キャピラリーの試料注入端をタイタープレートから取り出して図示しないバッファー液に浸し、そのバッファー液中に浸漬した電極と計測セル１７の電極１４の間に１００Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍの電界強度となるように５ｋＶ程度の電圧を印加する。ＤＮＡ試料はキャピラリー中を図の左から右へ泳動し、長さに応じて分離されたＤＮＡ断片はキャピラリー右端から計測セル１７のバッファー液中に溶出し、バッファー液流に乗って下方に移動する。
【００２０】
キャピラリーホルダー２と石英窓６の間のバッファー液流路には、図３に示すように、液流に対して直角方向（図２では、紙面と交差する方向）からレーザ光が照射されている。発光波長の異なる２個のレーザ光源２１，２２から出た光は、光反射部と光透過部を交互に有する回転チョッパー２３によって同一光路上に交互に通される。レーザ光は計測セル１７の側部に設けられた光透過窓２６，２７を透過し、金蒸着ミラーあるいはプリズム等の光路変更部材２４によって折り返されて各キャピラリーアレイ１の下流側０．５〜１ｍｍのところを通過し、最後は光トラップ２５によって吸収される。
【００２１】
各キャピラリーアレイ１の下流側を通過するレーザ光は、図２に×印で示す励起光照射位置１２において蛍光体で標識されたＤＮＡを励起し、蛍光を発生させる。標識蛍光体から発生した蛍光はレンズ８で集光され、励起光除去フィルター２９を通り、ダイクロイックミラー９で波長分離された後、レンズ１０ａ，１０ｂによって２次元検出器１１ａ，１１ｂ上に結像され、計測される。
【００２２】
キャピラリーアレイから溶出したＤＮＡ断片はバッファー液流にのって他のキャピラリーアレイの端部の前方を通過することになるが、隣接するキャピラリーアレイの位置に到達するまでにバッファー液中で拡散して十分に希釈されるため、隣接するキャピラリーアレイから溶出するＤＮＡ断片の検出を妨害することはない。キャピラリーホルダー２の面取り部に滞留しているバッファー液は、この溶出ＤＮＡ断片の拡散希釈を助ける作用をする。
【００２３】
ＤＮＡシーケンシングでは３’末端塩基種が、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）に応じて４種の異なる蛍光体でＤＮＡ断片を標識し、波長分離して計測する。波長選別検出法には種々あるが、ここでは波長４８８ｎｍのＡｒ＋ レーザと波長５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザの２本のレーザ光を交互に照射するのと、図４に示す透過波長特性を有するダイクロイックミラー９及び２個の２次元検出器１１ａ，１１ｂを用いる方法によった。標識蛍光体にはＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ 、発光波長約５２０ｎｍ）、ＪＯＥ（商品名、発光波長約５４５ｎｍ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（発光波長約６１５ｎｍ）及びＣｙ−５（商品名、発光波長約６６７ｎｍ）を用いた。以下、上記蛍光体を発光波長の短波長側からＦ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４と呼ぶことにする。
【００２４】
蛍光体Ｆ１及びＦ２はＡｒ＋ レーザで効率良く励起でき、蛍光体Ｆ３及びＦ４はＨｅ−Ｎｅレーザで励起される。一方、ダイクロイックミラー９はＦ２及びＦ３からの蛍光を透過し、Ｆ１及びＦ４からでる光を主として反射する。従って、Ａｒ＋ レーザ照射時には、検出器１１ｂにはＦ１からの光が、検出器１１ａにはＦ２からの光が入る。一方、Ｈｅ−Ｎｅレーザ照射時には、検出器１１ｂにはＦ４からの光が、検出器１１ａにはＦ３からの光が入る。受光光路上に配置された励起光除去フィルター２９は、波長４８８ｎｍの光線を除去して長波長側の光線を透過する色ガラスフィルターとＨｅ−Ｎｅレーザ光を遮断するノッチ型フィルターとすることができる。こうして、キャピラリーアレイの各キャピラリーから溶出するＤＮＡ断片を分離して検出することができる。
【００２５】
レーザ光源としては発光ダイオードアレイ、面発光型半導体レーザアレイ等を用いることもできる。この場合には、反射ミラー等で光路を折り曲げる必要がない。また、高強度レーザ光源を使用する場合には、レーザ光を複数個のビームスプリッタで順次分割して複数本の平行レーザ光として用いてもよい。
なお、励起光照射方法及び蛍光検出方法は、ここで説明した方法に限らず既知の任意の方法を採用できるのはもちろんである。
【００２６】
〔実施例２〕
キャピラリーアレイシートの他の例を図５及び図６に示す。本実施例のキャピラリーアレイシート３０は、図５に全体図を示すように、ステンレス製の厚さ２ｍｍの２枚のキャピラリーホルダー３１，３２の間に内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍｍのキャピラリーを０．４ｍｍピッチで４０本並べて保持したものである。また、図６に、その先端部を拡大して示すように、ホルダー３１，３２の端面は突出縁部３４，３５を有し、２つの突出縁部３４，３５に挟まれた溝状部分にキャピラリーアレイ３０の先端部分が露出している。上下のホルダー３１，３２には、バッファー液流路となる直径０．２ｍｍの孔３６，３７の列が前記溝状部分に開口するように設けられている。上部ホルダー３１に設けられた流路３６は全てホルダー内部でキャピラリーアレイの配列方向に形成された１本のバッファー液流入孔３８に連通しており、下部ホルダー３２に設けられた流路３７は同様にキャピラリーアレイの配列方向に形成された１本のバッファー液流出孔３９に連通している。
【００２７】
図７に示すように、本実施例のキャピラリーアレイシート３０は、端面の突出縁部３４，３５を石英製の光学窓６に密着させて計測セル中に複数枚積層して配置される。多種蛍光体でそれぞれ修飾されたＤＮＡ断片試料はキャピラリーアレイの試料注入端に電界注入され、そののち試料注入端を浸したバッファー液中に配置される電極とシースフロー用バッファー槽中に配置した電極との間に電圧を印加することによってキャピラリー中を泳動する。キャピラリーアレイ先端から溶出したＤＮＡ断片は、上部ホルダー３１に設けられたバッファー液流入孔３８から導入されてバッファー液流路３６から流れ出るバッファー液の流れにのって移動し、その途中で図３に示したのと同様の励起光照射光学系によってホルダー端部の溝状部分を走るレーザビームの照射を受けて蛍光を発する。発生された蛍光は、光学窓６から計測セル外に取り出され、前記実施例１と同様の蛍光検出光学系で計測される。蛍光測定後の試料は、下部ホルダー３２に設けられたバッファー液流路３７を通してバッファー液流出孔３９から計測セル外に排出される。
【００２８】
キャピラリーアレイシート３０中の各キャピラリー先端と、上部ホルダー３１に形成されるバッファー液流路３６及び下部ホルダー３２に形成されるバッファー液流路３７の位置関係は、図８に示すように、バッファー液流路３６の流出口を隣接する２本のキャピラリーの間に位置させ、バッファー液流路３７の流入口は各キャピラリーの位置と整列させて配置するのが有利である。この様な配置にすると、バッファー液は孔３６から広がるようにして流れ出るため、キャピラリーから溶出する試料はそのキャピラリーの両側から広がってくるバッファー液の流れに閉じこめられて拡散が抑制され、高濃度を保ったまま励起光照射位置に到達することができる。
【００２９】
ただし、図８のような配置とすることは有利ではあるが必ずしも必要ではなく、バッファー液流路３６，３７は、各キャピラリーの位置に整列させて配置してもよいし、各キャピラリーの位置と整列させることなくランダムに配置しても、あるいは上部ホルダー３１の全ての流路３６の流出口あるいは下部ホルダー３２の全ての流路３７の流入口を連絡させてスリット状の流入口あるいはスリット状の流出口とすることもできる。
【００３０】
また、キャピラリーアレイシート３０の端面の突出縁部３４，３５は、両方設けず一方のみを設けるようにしてもよい。
本実施例によると、１つのキャピラリーアレイシートから溶出する試料が他のキャピラリーアレイシートによる検出に影響を与える可能性を完全に排除して、複数枚のキャピラリーアレイシートから溶出するＤＮＡを同時に計測することができる。
【００３１】
〔実施例３〕
次に、試料溶出側のキャピラリー軸方向にバッファー液によるシースフローを形成させた実施例について説明する。図９は、本実施例による２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の概略断面図、図１０はキャピラリー右端付近の詳細図である。
【００３２】
外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍのキャピラリーを０．４ｍｍピッチで４０本並べて１ｍｍ厚のステンレス製キャピラリーホルダー４１上に保持したキャピラリーシート４０を計測用セル１７中に挿入する。本実施例では８枚のキャピラリーシートを０．５ｍｍ離して重ねて用いた。シートのピッチは１．５ｍｍとした。すなわち、１６ｍｍ×１２ｍｍの領域に３２０本のキャピラリーを収納している。シートピッチは０．５ｍｍにすることもでき、その場合には９６０本のキャピラリーを収納することとなる。
【００３３】
キャピラリー先端部はキャピラリーホルダー４１の端部から５ｍｍ突出させ、キャピラリーアレイカバーを載せて接着固定してある。シート状になったキャピラリーアレイは、ステンレス製の固定板４３に設けられたスリットに挿入される。スリットは幅０．２ｍｍ、長さ１６ｍｍで、キャピラリーアレイが挿入しやすいようにキャピラリーアレイ側の開口部は三角溝状に広げられている。
【００３４】
キャピラリー端から１ｍｍ離れた位置に厚さ０．３ｍｍの石英製の中板４４が設置されている。この中板４４にはキャピラリーの延長線との交点に直径０．２ｍｍの細孔あるいはスリット４５が設けられている。更に、この板の外側２ｍｍの位置に厚さ１ｍｍの石英製の光学窓６が設けられている。キャピラリーシートの厚さはキャピラリーアレイカバーを含めて約１．３ｍｍで、シート間の０．２ｍｍの間隔からシース液が流れる。バッファー液入口４から計測セル１７中に流入したバッファ液は、中板４４に設けられた細孔４５からバッファー液排出路４７に流出し、バッファ液出口５から計測セル外に排出される。中板４４は、各キャピラリーを軸にシースフローを形成する流路形成の役を果たす。
【００３５】
シースフローをスムーズにするため各シート４０間のキャピラリー端側にシートを区画する石英板４８を設けてある。シート区画用石英板４８には、各キャピラリーアレイシートに対応した位置にスリット４９が設けられている。このシート区画用石英板４８と前記固定板４３は、単一の石英板から一体化して作製してもよい。
【００３６】
励起光照射光源にはレーザを用い、計測セルの側方からシート区画用石英板４８に設けられたスリット４９内にレーザ光を通した。このとき、図３と同様の光学系によって、１つのキャピラリーシート照射毎にレーザを折り返し、図１０に黒丸で示す全てのキャピラリーアレイシート４０の溶出端前方０．５〜１ｍｍの位置１２を同時に照射した。図１１に示すように、光源には発光ダイオードアレイ５０や面発光型半導体レーザアレイなどを用いてもよい。
【００３７】
励起光照射によって２次元マトリックス状に配列した点状蛍光像が得られるが、前記実施例と同様に光学窓６を通して２個の２次元検出器で検出した。なお、キャピラリーアレイシートの間隔（本実施例では１．５ｍｍ）を大きくし、図１２に示したような像分割プリズム６０で結像位置のズレた２つの２次元点状蛍光像を形成して１個の２次元検出器で受光してもよい。光路上には適当な透過波長帯域を有するフィルター６１，６２を配置する。
計測セル１７は、全体を９０°回転させて、石英窓２０を下方に向けた配置としても良い。その場合には、計測セル１７からキャピラリーシートが出る部分のシールの負担を軽減することができる。
【００３８】
上記実施例では、キャピラリーアレイの先端をキャピラリーホルダーから突出させたが、図１３に示すように、キャピラリーアレイ７０の先端を２枚の面取りしたキャピラリーホルダー７１，７２で挟む構成とすることもできる。図１４に示すように、このキャピラリーアレイシートは固定板４３に設けた溝にホルダーの面取りした先端部分を挿入して固定する。このような構造とすると、キャピラリーアレイの先端部分が突出していないため、取扱中にキャピラリーが損傷する危険が少なく、装置組立も簡単になる。バッファー液は、ホルダー表面に設けた溝７３，７４を通り、固定板４３に設けられたスリット７６に流入する。なお、ホルダー７１，７２の表面に溝７３，７４を設ける代わりに固定板４３のホルダー先端挿入溝の表面に細かい溝を設け、その溝を通してバッファー液をスリット７６に流通させるようにしてもよい。
【００３９】
〔実施例４〕
本発明による２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置は、単に多数キャピラリーをアレイ化してスループットを上げるだけに留まらない。生体切片にｍ−ＲＮＡ等とハイブリダイズする蛍光標識ＤＮＡプローブを作用させ、相補配列を持つｍ−ＲＮＡの組織中での分布を見ることは重要である。この場合、従来はもっぱら蛍光顕微鏡が用いられているが、多数のＤＮＡプローブを同時に検出できない。精々蛍光体の色を変化させて数種を観測するだけである。ＤＮＡプローブの長さを変えてこれを識別できれば非常に多くのＤＮＡプローブを同時に計測できる。本発明はこのような用途にも有効に活用できる。
【００４０】
図１５はこの様子を示したものである。前例と異なりキャピラリーアレイ８０は垂直に保持されている。内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍのキャピラリーの上部は最も緻密に配置されている。キャピラリー下部は相似形に配置されているが、間隔は２倍となっている。これは各キャピラリーからの蛍光信号を区別して計測するためである。キャピラリー上部端面に接してＤＮＡプローブがハイブリダイズした組織切片８１をおき、昇温して遊離してくるＤＮＡプローブをキャピラリーアレイ８０に電界注入する。電界注入は、組織切片８１の上にバッファ液を含浸した濾紙を載せ、その上に電極を重ね、その電極とキャピラリー下端を浸したバッファー液中に設置した電極の間に電圧を印加することによって行う。
【００４１】
ＤＮＡプローブは組織内でハイブリダイズしていた位置に近いキャピラリー内に注入され、ゲル電気泳動により分離される。ＤＮＡプローブは種類に応じてその長さを変化させてあり、泳動時間からその種類を特定でき、二次元蛍光像の位置から組織内でハイブリダイズしていた場所が分かる。計測セル、励起光照射光学系及び蛍光検出光学系には前記実施例で説明したものをいずれも使用することができる。
本実施例によると、２次元的に分布した被計測対象についてその２次元分布情報を保持したまま計測できる。これは２次元状にプローブを配置したオリゴチップ上に捕獲されたＤＮＡの分布測定その他にも応用可能である。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、非常に多くのキャピラリーをアレイ化して電気泳動路を形成し、感度を損なうことなく多数の蛍光標識ＤＮＡ試料などの分析を行うことができる。すなわち、キャピラリーアレイの配列を２次元的にすることにより、非常に多くの点状蛍光像を像縮小などによる感度低下なく検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリーアレイシートの一例の斜視図。
【図２】２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の説明図。
【図３】蛍光励起光照射光学系の一例の説明図。
【図４】蛍光体及びダイクロイックミラーの発光強度及び透過率特性図。
【図５】キャピラリーアレイシートの他の例の斜視図。
【図６】図５に示したキャピラリーアレイシートの詳細説明図。
【図７】図５に示したキャピラリーアレイシートを用いた計測セルの部分拡大図。
【図８】バッファー液の流れを説明する図。
【図９】２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の他の実施例の説明図。
【図１０】図９の部分拡大図。
【図１１】発光ダイオードアレイを用いた蛍光励起光照射光学系の説明図。
【図１２】像分割プリズムを用いた蛍光検出光学系の説明図。
【図１３】キャピラリーアレイシートの他の例の説明図。
【図１４】図１３に示したキャピラリーアレイシートを用いた計測セルの部分拡大図。
【図１５】組織切片から直接ＤＮＡ等をキャピラリーに注入し計測する装置の説明図。
【符号の説明】
１…キャピラリーアレイシート、２…キャピラリーホルダー、３…キャピラリーアレイカバー、４…バッファ液入口、５…バッファ液出口、６…光学窓、７…タイタープレート、８…レンズ、９…ダイクロイックミラー、１０ａ，１０ｂ…レンズ、１１ａ，１１ｂ…２次元検出器、１２…レーザ照射位置、１３…電極、１４…電極、１５…ウェル、１６…ＤＮＡ試料、１７…計測セル、２１，２２…レーザ光源、２３…回転チョッパー、２４…光路変更部材、２５…光トラップ、２６，２７…光透過窓、２９…励起光除去フィルター、３０…キャピラリーアレイシート、３１，３２…ホルダー、３４，３５…突出縁部、３６，３７…バッファー液流路、３８…バッファー液流入孔、３９…バッファー液流出孔、４０…キャピラリーアレイシート、４３…固定板、４４…中板、４５…細孔、４７…バッファー液排出路、４８…シート区画用石英板、４９…スリット、５０…発光ダイオードアレイ、７０…キャピラリーアレイ、７３，７４…溝、７６…スリット、６０…像分割プリズム、６１，６２…光学フィルタ、８０…キャピラリーアレイ、８１…組織切片
【産業上の利用分野】
本発明は、電気泳動装置に関し、特に蛍光標識ＤＮＡの分離分析に好適なキャピラリーアレイ電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ塩基配列決定ニーズの高まりと共に、高速・高スループットＤＮＡシーケンサー及びＤＮＡ分析装置の開発が望まれている。従来、ＤＮＡシーケンシングあるいはＤＮＡ分析には、平板状のゲルを分離媒体に用いて蛍光検出する電気泳動装置が用いられていた。しかし、平板状のゲルを用いたのでは高速化、高スループット化に限界があり、ゲルを充填したキャピラリーを多数本並べて計測するキャピラリーアレイ方式の電気泳動装置が提案されている（Ｎａｔｕｒｅ ３５９， １６７−１６８， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３６１， ５６５−５６６， １９９３）。
【０００３】
前記キャピラリーアレイ方式の電気泳動装置では、計測部のキャピラリーアレイは一直線上に並べられ、光照射を受ける。蛍光標識ＤＮＡから発せられた蛍光は、光電子増倍管を具備した検出器をキャピラリーアレイに対して相対的にスキャンしたり、ラインセンサーあるいはエリアセンサーと結像レンズを用いて一直線上に並んだ点状蛍光像を検出器上に結像することによって検出している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリーアレイ中のキャピラリーの数は全体のスループットに大きな影響を与えるため、アレイ中のキャピラリー数を増加してスループットの向上を図ることが考えられるが、取り扱い等の実用面からすると５０〜１００本が限界である。
検出器あるいはキャピラリーをスキャンする方式では、キャピラリーからの背景蛍光を除去するため共焦点蛍光検出器を使用している。このため、スキャン時の検出器と被計測部の間隔を高精度に保つ必要があり、スキャンスピードを速くしにくい難点があり、一度に測定できるキャピラリー数は５０本程度と見積もられる。
【０００５】
一方、蛍光ライン像をレンズでラインセンサー等の検出器上に結像させる方式では、並んだキャピラリーから溶出する試料をレーザで同時に照射するので前述の方式と異なりスキャンスピードの問題はなくなる。しかし、被計測部の長さがキャピラリー数に比例して長くなると、検出器上に縮小像を結像させる必要があるため、受光量が減少する難点がある。通常、検出器の長さは１６ｍｍ〜２４ｍｍであり、キャピラリー径は０．２ｍｍ程度、キャピラリーの中心間隔は０．４ｍｍ程度である。受光量を考えると像倍率は１／２程度が限度であり、この時使用できるキャピラリー数は８０〜１２０本である。
本発明は、より多くのキャピラリーを用いて計測できるキャピラリーアレイ電気泳動装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、計測部のキャピラリーの端部を２次元的に配置し、試料を各キャピラリーの端から２次元平面内に溶出させ、光照射し、２次元蛍光画像をエリアセンサーで受光することにより達成される。
すなわち、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、複数のキャピラリー電気泳動路を有し、その複数のキャピラリー電気泳動路は末端が２次元的に配列され、各キャピラリー電気泳動路で分離された試料に励起光を照射し、発せられた蛍光を２次元検出器で同時に検出することを特徴とする。
【０００７】
キャピラリー電気泳動路にはゲル状物質を満たすことができ、励起光はキャピラリーからバッファー液流中に溶出した試料に照射するのが好適である。
複数のキャピラリーの端部を略同一平面上に位置させ、前記平面と平行に励起光を照射する手段、及び前記平面と垂直な方向から２次元蛍光像を結像して検出する手段を備えると好都合である。
【０００８】
試料の蛍光検出は、複数のキャピラリーの端部が形成する平面と対向しておかれた光学窓との間にバッファー液流を形成し、そのバッファー液中に溶出した試料を蛍光検出してもよいし、複数のキャピラリーの軸方向にバッファー液を流出せしめてキャピラリーの延長軸方向に流れる層流を形成し、その層流中に励起光を照射して試料を蛍光検出してもよい。その際、複数のキャピラリーの端部が形成する平面とほぼ平行な平面を通過する試料に対して励起光を照射するのが好都合である。
【０００９】
より具体的には、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液に接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて支持体上に所定間隔で配置して固定したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を光学窓に対向させて複数枚積層され、キャピラリー先端と光学窓の間の空間にキャピラリーアレイシートの積層方向にバッファー液を流し、励起光照射光学系はキャピラリーアレイからバッファー液中に溶出される試料の流れと交差するように各キャピラリーアレイシートのキャピラリー配列方向に励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。前記支持体の光学窓と対向する端部は、キャピラリーが配置された面と反対側の面の角を面取り加工するのが好適である。
【００１０】
また、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液に接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて所定間隔で配置し上部支持体と下部支持体で挟持したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を光学窓に対向させて複数枚積層され、キャピラリーアレイシートの上部支持体及び下部支持体は平坦な端面と該端面から突出する縁部を有すると共に前記端面に開口するバッファー液流路を有し、支持体の縁部は光学窓と接触して各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間を形成し、励起光照射光学系は各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間に励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。計測セルのバッファー液入口に連通する上部支持体のバッファー液流路の前記端面における開口部は、隣接するキャピラリー端部のほぼ中間線上に位置するのが好適である。
【００１１】
また、本発明によるキャピラリーアレイ電気泳動装置は、バッファー液入口及びバッファー液出口、バッファー液入口とバッファー液出口の間に配置された複数の平行なスリットを有する隔壁部材、隔壁部材に対して略平行に所定の間隔をおいて配置されたバッファー液が接する光学窓、及び複数本のキャピラリーの一方の端部を先端を揃えて支持体上に所定間隔で配置して固定したキャピラリーアレイシートを備える計測セルと、励起光照射光学系と、蛍光検出光学系とを含み、キャピラリーアレイシートはキャピラリー先端を隔壁部材のスリットに挿入して複数枚積層され、バッファー液はバッファー液入口から隔壁部材のスリットを通ってキャピラリー軸方向に流れ次いで隔壁と光学窓の間の空間を通ってバッファー液出口から排出され、励起光照射光学系は隔壁部材のスリット方向に沿って励起光を照射し、蛍光検出光学系は試料から発せられた蛍光を計測セルの光学窓を介して２次元検出器で検出することを特徴とする。
【００１２】
励起光は隔壁部材のスリット中を通過させることができる。また、キャピラリーアレイシートは、表面にバッファー液を流通させる溝を有する上部支持体と下部支持体によって挟持し、上部支持体及び下部支持体の先端部分を隔壁のスリットに挿入することができる。バッファー液を流通させる溝はキャピラリーシートの支持体に形成せずに、隔壁の支持体挿入面に形成してもよい。
【００１３】
【作用】
キャピラリーアレイの端部を１次元でなく２次元的に配列させることにより、蛍光画像の一辺の長さを大幅に縮小することができる。たとえば中心間隔を０．４ｍｍとして２００本のキャピラリーを並べると全体の長さは８０ｍｍとなるが、同じ２００本のキャピラリーでも１ｍｍの中心間隔で４段重ねにすると４ｍｍ×２０ｍｍ、８段重ねにすると８ｍｍ×１０ｍｍと小さな像になり、像を縮小せずに大きな受光量で検出することができる。
【００１４】
また、キャピラリーを２次元配列したことにより、１つのキャピラリーアレイシート中のキャピラリー数を減らすことができ、取り扱いが容易になる。支持体上に固定したキャピラリーアレイシートを用い、それを複数積層して２次元のキャピラリーアレイを形成することにより、キャピラリーの取り扱いが更に容易になるとともに、キャピラリーの位置精度を上げることができるため、励起光照射を効率的に行うことができる。
【００１５】
キャピラリーから溶出した試料をバッファー液の流れに乗せて運ぶことにより、キャピラリーを２次元的に配列したにもかかわらず複数のキャピラリーから溶出する試料を相互の干渉なく測定することができる。バッファー液の流れをキャピラリーの軸方向として各キャピラリーから溶出した試料が混合する前の位置で励起光を照射することにより、あるいはバッファー液を各キャピラリーアレイシート毎に隔離した空間に流して励起光を照射することにより、複数のキャピラリーから溶出する試料同士の干渉を完全に防止することができる。バッファー液をキャピラリーの軸と直交する方向に流す場合にも、キャピラリーアレイシート間の間隔を広めに設定することにより、あるいは隣接するキャピラリーアレイシートの間にバッファー液が滞留する領域を設けて試料の拡散・希釈を促進することによりキャピラリーから溶出した試料同士の干渉を回避することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
〔実施例１〕
図１は、多数本のキャピラリーを並べてシート状に保持したキャピラリーアレイシート１を示す。キャピラリーは石英製で、内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍｍのものを使用した。キャピラリーの長さは３０ｃｍであり、内部にポリアクリルアミドゲル（５％Ｔ、４％Ｃ）を詰めてある。キャピラリー内部のゲル組成は、用途により種々変更可能である。キャピラリーの右端側は２４本ずつ厚さ１．５ｍｍのステンレス板からなるキャピラリーホルダー２に先端を揃えて保持し、厚さ０．１ｍｍのポリエチレンテレフタレート製キャピラリーアレイカバー３を載せて接着固定してある。また、キャピラリーホルダー２先端部のキャピラリー保持面と反対側の面の角は、図示のように面取り加工してある。
【００１７】
図２は、図１に示したキャピラリーアレイシートを複数枚重ねて２次元アレイとしたキャピラリーアレイ電気泳動装置の概略図である。キャピラリーホルダー２に保持されたキャピラリーアレイシート１は、計測セル１７内に３〜５ｍｍ間隔で４段の階層状に重ねられ、キャピラリー先端と受光用石英窓６の間の間隔が約０．２ｍｍ〜０．３ｍｍとなるようにして固定される。計測セル１７の上部にはバッファー液入口４が設けられており、このバッファー液入口から注入されたバッファー液は線速度０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ／秒程度の流速でキャピラリーシートの先端部と受光用石英窓６の間の空間を図中上から下へ流れ、計測セルの下部に設けられたバッファー液出口５から流出する。バッファー液流路中には電極１４が設けられている。
【００１８】
多種蛍光体でそれぞれ修飾されたＤＮＡ試料は、９６穴のタイタープレート７の各試料ウエル１５に保持され、キャピラリーアレイの各キャピラリーに電界注入される。電界注入は、図２の円内に拡大して示すように、キャピラリーアレイの試料注入端をタイタープレート７の各ウエル１５に入れ、ウエル１５の底部に設けられた電極１３と計測セル１７に設けられた電極１４を介して、試料１６とキャピラリーの他端の間に８ｋＶの電圧を約５秒間加えることによって行う。試料側の電極１３は、試料ウエル１５の底部に固定せず、キャピラリーの試料注入端と共にタイタープレートの上方から試料ウエル１５中に挿入するようにしてもよい。
【００１９】
試料注入後は、キャピラリーの試料注入端をタイタープレートから取り出して図示しないバッファー液に浸し、そのバッファー液中に浸漬した電極と計測セル１７の電極１４の間に１００Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍの電界強度となるように５ｋＶ程度の電圧を印加する。ＤＮＡ試料はキャピラリー中を図の左から右へ泳動し、長さに応じて分離されたＤＮＡ断片はキャピラリー右端から計測セル１７のバッファー液中に溶出し、バッファー液流に乗って下方に移動する。
【００２０】
キャピラリーホルダー２と石英窓６の間のバッファー液流路には、図３に示すように、液流に対して直角方向（図２では、紙面と交差する方向）からレーザ光が照射されている。発光波長の異なる２個のレーザ光源２１，２２から出た光は、光反射部と光透過部を交互に有する回転チョッパー２３によって同一光路上に交互に通される。レーザ光は計測セル１７の側部に設けられた光透過窓２６，２７を透過し、金蒸着ミラーあるいはプリズム等の光路変更部材２４によって折り返されて各キャピラリーアレイ１の下流側０．５〜１ｍｍのところを通過し、最後は光トラップ２５によって吸収される。
【００２１】
各キャピラリーアレイ１の下流側を通過するレーザ光は、図２に×印で示す励起光照射位置１２において蛍光体で標識されたＤＮＡを励起し、蛍光を発生させる。標識蛍光体から発生した蛍光はレンズ８で集光され、励起光除去フィルター２９を通り、ダイクロイックミラー９で波長分離された後、レンズ１０ａ，１０ｂによって２次元検出器１１ａ，１１ｂ上に結像され、計測される。
【００２２】
キャピラリーアレイから溶出したＤＮＡ断片はバッファー液流にのって他のキャピラリーアレイの端部の前方を通過することになるが、隣接するキャピラリーアレイの位置に到達するまでにバッファー液中で拡散して十分に希釈されるため、隣接するキャピラリーアレイから溶出するＤＮＡ断片の検出を妨害することはない。キャピラリーホルダー２の面取り部に滞留しているバッファー液は、この溶出ＤＮＡ断片の拡散希釈を助ける作用をする。
【００２３】
ＤＮＡシーケンシングでは３’末端塩基種が、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）に応じて４種の異なる蛍光体でＤＮＡ断片を標識し、波長分離して計測する。波長選別検出法には種々あるが、ここでは波長４８８ｎｍのＡｒ＋ レーザと波長５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザの２本のレーザ光を交互に照射するのと、図４に示す透過波長特性を有するダイクロイックミラー９及び２個の２次元検出器１１ａ，１１ｂを用いる方法によった。標識蛍光体にはＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ 、発光波長約５２０ｎｍ）、ＪＯＥ（商品名、発光波長約５４５ｎｍ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（発光波長約６１５ｎｍ）及びＣｙ−５（商品名、発光波長約６６７ｎｍ）を用いた。以下、上記蛍光体を発光波長の短波長側からＦ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４と呼ぶことにする。
【００２４】
蛍光体Ｆ１及びＦ２はＡｒ＋ レーザで効率良く励起でき、蛍光体Ｆ３及びＦ４はＨｅ−Ｎｅレーザで励起される。一方、ダイクロイックミラー９はＦ２及びＦ３からの蛍光を透過し、Ｆ１及びＦ４からでる光を主として反射する。従って、Ａｒ＋ レーザ照射時には、検出器１１ｂにはＦ１からの光が、検出器１１ａにはＦ２からの光が入る。一方、Ｈｅ−Ｎｅレーザ照射時には、検出器１１ｂにはＦ４からの光が、検出器１１ａにはＦ３からの光が入る。受光光路上に配置された励起光除去フィルター２９は、波長４８８ｎｍの光線を除去して長波長側の光線を透過する色ガラスフィルターとＨｅ−Ｎｅレーザ光を遮断するノッチ型フィルターとすることができる。こうして、キャピラリーアレイの各キャピラリーから溶出するＤＮＡ断片を分離して検出することができる。
【００２５】
レーザ光源としては発光ダイオードアレイ、面発光型半導体レーザアレイ等を用いることもできる。この場合には、反射ミラー等で光路を折り曲げる必要がない。また、高強度レーザ光源を使用する場合には、レーザ光を複数個のビームスプリッタで順次分割して複数本の平行レーザ光として用いてもよい。
なお、励起光照射方法及び蛍光検出方法は、ここで説明した方法に限らず既知の任意の方法を採用できるのはもちろんである。
【００２６】
〔実施例２〕
キャピラリーアレイシートの他の例を図５及び図６に示す。本実施例のキャピラリーアレイシート３０は、図５に全体図を示すように、ステンレス製の厚さ２ｍｍの２枚のキャピラリーホルダー３１，３２の間に内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍｍのキャピラリーを０．４ｍｍピッチで４０本並べて保持したものである。また、図６に、その先端部を拡大して示すように、ホルダー３１，３２の端面は突出縁部３４，３５を有し、２つの突出縁部３４，３５に挟まれた溝状部分にキャピラリーアレイ３０の先端部分が露出している。上下のホルダー３１，３２には、バッファー液流路となる直径０．２ｍｍの孔３６，３７の列が前記溝状部分に開口するように設けられている。上部ホルダー３１に設けられた流路３６は全てホルダー内部でキャピラリーアレイの配列方向に形成された１本のバッファー液流入孔３８に連通しており、下部ホルダー３２に設けられた流路３７は同様にキャピラリーアレイの配列方向に形成された１本のバッファー液流出孔３９に連通している。
【００２７】
図７に示すように、本実施例のキャピラリーアレイシート３０は、端面の突出縁部３４，３５を石英製の光学窓６に密着させて計測セル中に複数枚積層して配置される。多種蛍光体でそれぞれ修飾されたＤＮＡ断片試料はキャピラリーアレイの試料注入端に電界注入され、そののち試料注入端を浸したバッファー液中に配置される電極とシースフロー用バッファー槽中に配置した電極との間に電圧を印加することによってキャピラリー中を泳動する。キャピラリーアレイ先端から溶出したＤＮＡ断片は、上部ホルダー３１に設けられたバッファー液流入孔３８から導入されてバッファー液流路３６から流れ出るバッファー液の流れにのって移動し、その途中で図３に示したのと同様の励起光照射光学系によってホルダー端部の溝状部分を走るレーザビームの照射を受けて蛍光を発する。発生された蛍光は、光学窓６から計測セル外に取り出され、前記実施例１と同様の蛍光検出光学系で計測される。蛍光測定後の試料は、下部ホルダー３２に設けられたバッファー液流路３７を通してバッファー液流出孔３９から計測セル外に排出される。
【００２８】
キャピラリーアレイシート３０中の各キャピラリー先端と、上部ホルダー３１に形成されるバッファー液流路３６及び下部ホルダー３２に形成されるバッファー液流路３７の位置関係は、図８に示すように、バッファー液流路３６の流出口を隣接する２本のキャピラリーの間に位置させ、バッファー液流路３７の流入口は各キャピラリーの位置と整列させて配置するのが有利である。この様な配置にすると、バッファー液は孔３６から広がるようにして流れ出るため、キャピラリーから溶出する試料はそのキャピラリーの両側から広がってくるバッファー液の流れに閉じこめられて拡散が抑制され、高濃度を保ったまま励起光照射位置に到達することができる。
【００２９】
ただし、図８のような配置とすることは有利ではあるが必ずしも必要ではなく、バッファー液流路３６，３７は、各キャピラリーの位置に整列させて配置してもよいし、各キャピラリーの位置と整列させることなくランダムに配置しても、あるいは上部ホルダー３１の全ての流路３６の流出口あるいは下部ホルダー３２の全ての流路３７の流入口を連絡させてスリット状の流入口あるいはスリット状の流出口とすることもできる。
【００３０】
また、キャピラリーアレイシート３０の端面の突出縁部３４，３５は、両方設けず一方のみを設けるようにしてもよい。
本実施例によると、１つのキャピラリーアレイシートから溶出する試料が他のキャピラリーアレイシートによる検出に影響を与える可能性を完全に排除して、複数枚のキャピラリーアレイシートから溶出するＤＮＡを同時に計測することができる。
【００３１】
〔実施例３〕
次に、試料溶出側のキャピラリー軸方向にバッファー液によるシースフローを形成させた実施例について説明する。図９は、本実施例による２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の概略断面図、図１０はキャピラリー右端付近の詳細図である。
【００３２】
外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍのキャピラリーを０．４ｍｍピッチで４０本並べて１ｍｍ厚のステンレス製キャピラリーホルダー４１上に保持したキャピラリーシート４０を計測用セル１７中に挿入する。本実施例では８枚のキャピラリーシートを０．５ｍｍ離して重ねて用いた。シートのピッチは１．５ｍｍとした。すなわち、１６ｍｍ×１２ｍｍの領域に３２０本のキャピラリーを収納している。シートピッチは０．５ｍｍにすることもでき、その場合には９６０本のキャピラリーを収納することとなる。
【００３３】
キャピラリー先端部はキャピラリーホルダー４１の端部から５ｍｍ突出させ、キャピラリーアレイカバーを載せて接着固定してある。シート状になったキャピラリーアレイは、ステンレス製の固定板４３に設けられたスリットに挿入される。スリットは幅０．２ｍｍ、長さ１６ｍｍで、キャピラリーアレイが挿入しやすいようにキャピラリーアレイ側の開口部は三角溝状に広げられている。
【００３４】
キャピラリー端から１ｍｍ離れた位置に厚さ０．３ｍｍの石英製の中板４４が設置されている。この中板４４にはキャピラリーの延長線との交点に直径０．２ｍｍの細孔あるいはスリット４５が設けられている。更に、この板の外側２ｍｍの位置に厚さ１ｍｍの石英製の光学窓６が設けられている。キャピラリーシートの厚さはキャピラリーアレイカバーを含めて約１．３ｍｍで、シート間の０．２ｍｍの間隔からシース液が流れる。バッファー液入口４から計測セル１７中に流入したバッファ液は、中板４４に設けられた細孔４５からバッファー液排出路４７に流出し、バッファ液出口５から計測セル外に排出される。中板４４は、各キャピラリーを軸にシースフローを形成する流路形成の役を果たす。
【００３５】
シースフローをスムーズにするため各シート４０間のキャピラリー端側にシートを区画する石英板４８を設けてある。シート区画用石英板４８には、各キャピラリーアレイシートに対応した位置にスリット４９が設けられている。このシート区画用石英板４８と前記固定板４３は、単一の石英板から一体化して作製してもよい。
【００３６】
励起光照射光源にはレーザを用い、計測セルの側方からシート区画用石英板４８に設けられたスリット４９内にレーザ光を通した。このとき、図３と同様の光学系によって、１つのキャピラリーシート照射毎にレーザを折り返し、図１０に黒丸で示す全てのキャピラリーアレイシート４０の溶出端前方０．５〜１ｍｍの位置１２を同時に照射した。図１１に示すように、光源には発光ダイオードアレイ５０や面発光型半導体レーザアレイなどを用いてもよい。
【００３７】
励起光照射によって２次元マトリックス状に配列した点状蛍光像が得られるが、前記実施例と同様に光学窓６を通して２個の２次元検出器で検出した。なお、キャピラリーアレイシートの間隔（本実施例では１．５ｍｍ）を大きくし、図１２に示したような像分割プリズム６０で結像位置のズレた２つの２次元点状蛍光像を形成して１個の２次元検出器で受光してもよい。光路上には適当な透過波長帯域を有するフィルター６１，６２を配置する。
計測セル１７は、全体を９０°回転させて、石英窓２０を下方に向けた配置としても良い。その場合には、計測セル１７からキャピラリーシートが出る部分のシールの負担を軽減することができる。
【００３８】
上記実施例では、キャピラリーアレイの先端をキャピラリーホルダーから突出させたが、図１３に示すように、キャピラリーアレイ７０の先端を２枚の面取りしたキャピラリーホルダー７１，７２で挟む構成とすることもできる。図１４に示すように、このキャピラリーアレイシートは固定板４３に設けた溝にホルダーの面取りした先端部分を挿入して固定する。このような構造とすると、キャピラリーアレイの先端部分が突出していないため、取扱中にキャピラリーが損傷する危険が少なく、装置組立も簡単になる。バッファー液は、ホルダー表面に設けた溝７３，７４を通り、固定板４３に設けられたスリット７６に流入する。なお、ホルダー７１，７２の表面に溝７３，７４を設ける代わりに固定板４３のホルダー先端挿入溝の表面に細かい溝を設け、その溝を通してバッファー液をスリット７６に流通させるようにしてもよい。
【００３９】
〔実施例４〕
本発明による２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置は、単に多数キャピラリーをアレイ化してスループットを上げるだけに留まらない。生体切片にｍ−ＲＮＡ等とハイブリダイズする蛍光標識ＤＮＡプローブを作用させ、相補配列を持つｍ−ＲＮＡの組織中での分布を見ることは重要である。この場合、従来はもっぱら蛍光顕微鏡が用いられているが、多数のＤＮＡプローブを同時に検出できない。精々蛍光体の色を変化させて数種を観測するだけである。ＤＮＡプローブの長さを変えてこれを識別できれば非常に多くのＤＮＡプローブを同時に計測できる。本発明はこのような用途にも有効に活用できる。
【００４０】
図１５はこの様子を示したものである。前例と異なりキャピラリーアレイ８０は垂直に保持されている。内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍのキャピラリーの上部は最も緻密に配置されている。キャピラリー下部は相似形に配置されているが、間隔は２倍となっている。これは各キャピラリーからの蛍光信号を区別して計測するためである。キャピラリー上部端面に接してＤＮＡプローブがハイブリダイズした組織切片８１をおき、昇温して遊離してくるＤＮＡプローブをキャピラリーアレイ８０に電界注入する。電界注入は、組織切片８１の上にバッファ液を含浸した濾紙を載せ、その上に電極を重ね、その電極とキャピラリー下端を浸したバッファー液中に設置した電極の間に電圧を印加することによって行う。
【００４１】
ＤＮＡプローブは組織内でハイブリダイズしていた位置に近いキャピラリー内に注入され、ゲル電気泳動により分離される。ＤＮＡプローブは種類に応じてその長さを変化させてあり、泳動時間からその種類を特定でき、二次元蛍光像の位置から組織内でハイブリダイズしていた場所が分かる。計測セル、励起光照射光学系及び蛍光検出光学系には前記実施例で説明したものをいずれも使用することができる。
本実施例によると、２次元的に分布した被計測対象についてその２次元分布情報を保持したまま計測できる。これは２次元状にプローブを配置したオリゴチップ上に捕獲されたＤＮＡの分布測定その他にも応用可能である。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、非常に多くのキャピラリーをアレイ化して電気泳動路を形成し、感度を損なうことなく多数の蛍光標識ＤＮＡ試料などの分析を行うことができる。すなわち、キャピラリーアレイの配列を２次元的にすることにより、非常に多くの点状蛍光像を像縮小などによる感度低下なく検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリーアレイシートの一例の斜視図。
【図２】２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の説明図。
【図３】蛍光励起光照射光学系の一例の説明図。
【図４】蛍光体及びダイクロイックミラーの発光強度及び透過率特性図。
【図５】キャピラリーアレイシートの他の例の斜視図。
【図６】図５に示したキャピラリーアレイシートの詳細説明図。
【図７】図５に示したキャピラリーアレイシートを用いた計測セルの部分拡大図。
【図８】バッファー液の流れを説明する図。
【図９】２次元キャピラリーアレイ電気泳動計測装置の他の実施例の説明図。
【図１０】図９の部分拡大図。
【図１１】発光ダイオードアレイを用いた蛍光励起光照射光学系の説明図。
【図１２】像分割プリズムを用いた蛍光検出光学系の説明図。
【図１３】キャピラリーアレイシートの他の例の説明図。
【図１４】図１３に示したキャピラリーアレイシートを用いた計測セルの部分拡大図。
【図１５】組織切片から直接ＤＮＡ等をキャピラリーに注入し計測する装置の説明図。
【符号の説明】
１…キャピラリーアレイシート、２…キャピラリーホルダー、３…キャピラリーアレイカバー、４…バッファ液入口、５…バッファ液出口、６…光学窓、７…タイタープレート、８…レンズ、９…ダイクロイックミラー、１０ａ，１０ｂ…レンズ、１１ａ，１１ｂ…２次元検出器、１２…レーザ照射位置、１３…電極、１４…電極、１５…ウェル、１６…ＤＮＡ試料、１７…計測セル、２１，２２…レーザ光源、２３…回転チョッパー、２４…光路変更部材、２５…光トラップ、２６，２７…光透過窓、２９…励起光除去フィルター、３０…キャピラリーアレイシート、３１，３２…ホルダー、３４，３５…突出縁部、３６，３７…バッファー液流路、３８…バッファー液流入孔、３９…バッファー液流出孔、４０…キャピラリーアレイシート、４３…固定板、４４…中板、４５…細孔、４７…バッファー液排出路、４８…シート区画用石英板、４９…スリット、５０…発光ダイオードアレイ、７０…キャピラリーアレイ、７３，７４…溝、７６…スリット、６０…像分割プリズム、６１，６２…光学フィルタ、８０…キャピラリーアレイ、８１…組織切片
Claims (13)
- 複数のキャピラリーの一方の端部が所定の間隔で支持体に固定された複数のキャピラリーアレイシートと、前記複数のキャピラリーアレイシートが重ねられ、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーの一方の端部の外部で試料に照射する励起光を発する光源と、前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、前記各キャピラリーの一方の端部は同一の平面にあり、前記励起光は前記平面に平行に照射され、前記試料は、前記各キャピラリーの一方の端部からバッファー液の流れに溶出し、前記励起光は前記バッファー液中で前記試料を照射し、前記２次元検出器は前記平面に垂直な方向から前記蛍光を検出することを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 複数のキャピラリーの一方の端部が所定の間隔で支持体に固定された複数のキャピラリーアレイシートと、前記複数のキャピラリーアレイシートが重ねられ、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーの一方の端部の外部で試料に照射する励起光を発する光源と、前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、前記試料は、前記各キャピラリーの一方の端部からバッファー液の流れに溶出し、前記励起光は前記バッファー液中で前記試料を照射するものであり、前記バッファー液の流れは、前記各キャピラリーの一方の端部が形成する平面と、前記平面に対向する平板との間に形成され、前記バッファー液は、前記各キャピラリーの一方の端部から前記平板に設けられた細孔又はスリットに流れ、前記試料は前記バッファー液に溶出することを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- バッファー液の入口、前記バッファー液の出口、及び前記バッファー液に接する光学窓を備えるセルと、複数のキャピラリーの一方の端部が所定の間隔で支持体に固定された複数のキャピラリーアレイシートとを具備し、前記複数のキャピラリーアレイシートは、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーの一方の端部が前記光学窓に対向するように重ねられ、前記バッファー液は、前記各キャピラリーの一方の端部と前記光学窓との間の空間を流れることを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- バッファー液を含み前記バッファー液に接する光学窓を備えるセルと、複数のキャピラリーの一方の端部が所定の間隔で上部ホルダと下部ホルダの間に固定された複数のキャピラリーアレイシートとを具備し、前記複数のキャピラリーアレイシートは、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーの一方の端部が前記光学窓に対向するように重ねられ、前記各キャピラリーアレイシートの前記上部ホルダ及び前記下部ホルダの少なくとも一方の端部は突出縁部を有し、前記上部ホルダと前記下部ホルダの間で前記各キャピラリーの一方の端部が露出し、前記上部ホルダ及び前記下部ホルダの端部に前記バッファー液が流れる開口を具備し、前記突出縁部は前記光学窓に密着することを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 請求項４に記載のキャピラリーアレイ電気泳動装置において、前記上部ホルダの端面に形成される前記開口は、隣接する前記キャピラリーの一方の端部の露出部の間に位置することを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- バッファー液の入口、前記バッファー液の出口、前記入口と前記出口の間に配置され複数の平行なスリットをもつ区画用板、及び前記区画用板に平行に配置され前記バッファー液に接する光学窓を備えるセルと、複数のキャピラリーの一方の端部が所定の間隔で支持体に固定された複数のキャピラリーアレイシートとを具備し、前記複数のキャピラリーアレイシートは前記区画用板により区画されて配置され、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーの一方の端部は前記区画用板の前記スリットに対応して位置し、前記バッファー液は、前記入口から前記セルに流入し、前記区画用板の前記スリットを通って前記出口から排出されることを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 請求項６に記載のキャピラリーアレイ電気泳動装置において、前記各キャピラリーの一方の端部は前記支持体から突出し、突出した端部が挿入される固定板を有することを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 請求項６に記載のキャピラリーアレイ電気泳動装置において、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーは、先端が面取りされ溝を備えた上部及び下部ホルダに挟んで固定され、スリットと、面取りされた前記先端が挿入されるホルダ先端挿入溝とが形成される固定板を有し、前記バッファー液は、前記入口から前記セルに流入し、前記上部及び下部ホルダの前記溝、前記固定板のスリット、及び前記区画用板の前記スリットを通って前記出口から排出されることを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 請求項６に記載のキャピラリーアレイ電気泳動装置において、前記各キャピラリーアレイシートの前記各キャピラリーは、先端が面取りされた上部及び下部ホルダに挟んで固定され、スリットと、面取りされた前記先端が挿入されるホルダ先端挿入溝とが形成される固定板を有し、前記バッファー液は、前記入口から前記セルに流入し、前記ホルダ先端挿入溝の表面に形成された溝、前記固定板のスリット、及び前記区画用板の前記スリットを通って前記出口から排出されることを特徴とするキャピラリーアレイ電気泳動装置。
- 試料が内部で流れ、一方の端部が２次元に配列された複数のキャピラリーと、
前記試料に照射する励起光を発するための光源と、
前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、
前記キャピラリーの一方の端部と前記２次元検出器との間に窓状部材が位置し、
前記複数のキャピラリーの前記一方の端部は一の２次元平面にあり、
前記キャピラリーの一方の端部と前記窓状部材との間にバッファー液流路を有し、前記バッファー液流路の中に電極を設置し、
前記２次元検出器は前記２次元平面に垂直な方向から前記蛍光を検出することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 試料が内部で流れる複数のキャピラリーと、
前記試料に照射する励起光を発するための光源と、
前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、
前記キャピラリーの一方の端部と前記２次元検出器との間に窓状部材が位置し、
前記キャピラリーの一方の端部と前記窓状部材との間にバッファー液流路を有し、前記バッファー液流路の中に電極を設置し、
前記２次元検出器はキャピラリーの延長軸方向から前記蛍光を検出することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 試料が内部で流れ、一方の端部が２次元に配列された複数のキャピラリーと、
前記試料に照射する励起光を発するための光源と、
前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、
前記複数のキャピラリーの前記一方の端部は一の２次元平面にあり、
前記キャピラリーの一方の端部が接するバッファー液を設置し、前記バッファー液は、前記励起光が照射される位置で、前記キャピラリーの延長軸方向に流動し、前記励起光は、前記キャピラリーから前記バッファー液へ溶出された前記試料に照射され、
前記２次元検出器は前記２次元平面に垂直な方向から前記蛍光を検出することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 試料が内部で流れる複数のキャピラリーと、
前記試料に照射する励起光を発するための光源と、
前記試料から発する蛍光を検出する２次元検出器とを有し、
前記キャピラリーの一方の端部が接するバッファー液を設置し、前記バッファー液は、前記励起光が照射される位置で、前記キャピラリーの延長軸方向に流動し、前記励起光は、前記キャピラリーから前記バッファー液へ溶出された前記試料に照射され、
前記２次元検出器はキャピラリーの延長軸方向から前記蛍光を検出するとを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
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