CN108220123A - 一种基于实时荧光定量pcr的快速便携式分子检测设备 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，属于分子生物学以及医疗检测仪器领域，包括：微型实时荧光定量PCR反应系统，用于放置PCR反应管；荧光信号传感系统，将PCR反应过程中的实时荧光信号转换为电信号发送给中央处理控制系统；中央处理控制系统，控制各模块有序工作；数据通信系统，将实时荧光信号发送给上位机或手持终端，上位机或手持终端实时观测荧光定量PCR反应的状态，同时对PCR检测结果进行分析和判断；本发明采用了微型实时荧光定量PCR反应系统及相应的传感、控制和通信系统，保证了仪器的便携性，采用上位机或手持终端进行实时数据分析，避免了不必要的资源和时间浪费，有效降低设备及实验成本。

Description

一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备
技术领域
本发明属于分子生物学与医疗检测仪器技术领域，特别涉及一种基于实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)的快速便携式分子检测设备。
背景技术
生物信息是调节和控制生命活动的信号，是构成生物体的三大要素(物质、能量、信息)之一，对生物体生存、繁殖及代谢等都起着重要作用。生物信息包含的范围很广，通常狭义上是指包含遗传信息的DNA、RNA等。这些带有遗传信息的序列因人而异，也有可能受物理、化学、生物等因素的影响而发生突变，或在自我复制过程中发生错误，而有的复制、转录错误或突变会造成人体的各种疾病，如癌症，因而对生物信息进行分析、找出突变信息对预测和诊断疾病有着重要意义。分析处理生物信息往往要求有一定量的样本才能进行基因测序等工作，然而从人体直接提取所得的一些致病基因序列尤其是早期癌症筛查所需的基因序列的量往往是很小的，故需要对其进行体外扩增以达到可以观察和分析的量级。当前，遗传信息序列的体外扩增主要是通过在基因扩增仪(PCR仪)中进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)得到。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径，而聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可被看作是体外特殊的DNA半保留复制。继1983年美国生物化学家K.B.Mullis提出设想并在1985年发明了聚合酶链式反应，即简易DNA扩增法之后，该技术已持续发展到第三代，有了耐热、稳定的DNA聚合酶——Taq酶。PCR反应先利用DNA在体外95℃左右的高温下变性的性质使之解旋成单链，再降温至60℃左右，使两个引物分别和上一步解旋得到的两条单链按碱基互补配对的原则结合，最后再调节温度至72℃左右(DNA聚合酶最适反应温度)，使DNA聚合酶能以引物为起始点沿着5’端到3’端的方向用游离的碱基A、T、G、C合成互补链。每完成一个这样的循环，DNA序列的数量就增长一倍，多个循环后目标序列就能被扩增至可观量级，以作为下一步生物信息分析的样本。
随着生命科学和生物信息学研究的不断发展，聚合酶链式反应技术及仪器也得到了更多关注和发展，逐渐成为生命科学研究和实验中不可或缺的部分。PCR仪一般分为普通PCR仪、梯度PCR仪、原位PCR仪以及实时荧光定量PCR仪四类。普通PCR仪一次扩增反应只能设定一个特定温度，一般用于对特定的目标基因进行扩增，而梯度PCR仪则能设定一系列不同的温度(温度梯度)，在一次扩增中找到最适宜的反应温度，更有效的进行扩增；原位PCR仪利用完整的细胞作为一个反应体系来扩增细胞内的目的序列片段，并在不破坏细胞的前提下用一些特定检测手段检测细胞内的扩增产物，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列；实时荧光定量PCR仪是带有荧光信号采集系统和计算机分析处理系统的普通PCR仪，其进行PCR扩增时所用的引物是用同位素、荧光素等标记过的，扩增结果可通过荧光信号采集系统实时采集并传输到计算机分析处理系统中处理以得到实时的量化结果输出，因此与其他类型的PCR仪器相比，实时荧光定量PCR仪在应用中具有不可替代的优势。
现有实时荧光定量PCR仪，多是面向实验室及大中型医疗机构的，体积较大、笨重不便携带，操作复杂，需专业实验人员操作，且测试时间平均在2小时以上，因此不具备快速分析、小型化、便携等现场实时检测和诊断的需求。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，由微型实时荧光定量PCR反应系统、荧光信号传感系统、中央处理控制系统、数据通信系统组成。在PCR反应过程中，中央处理控制系统基于PID调节来实时调控荧光定量PCR反应系统，配合数据通信系统实现和上位机或手持终端之间的数据实时传输。上位机或手持终端可对PCR反应过程进行实时监测，并在PCR反应结束后通过对熔解曲线进行分析，分析PCR扩增产物的特异性进而对检测结果进行判断。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，包括：
微型实时荧光定量PCR反应系统1，用于放置PCR反应管；
荧光信号传感系统2，将PCR反应过程中的实时荧光信号转换为电信号发送给中央处理控制系统3；
中央处理控制系统3，控制各模块有序工作；
数据通信系统4，将实时荧光信号发送给上位机或手持终端，上位机或手持终端实时观测荧光定量PCR反应的状态，同时对PCR检测结果进行分析和判断。
所述微型实时荧光定量PCR反应系统1包括PCR反应台101、温度控制系统及温度传感装置105，其中：
所述PCR反应台101由良导热性的金属制成，包含一个或多个用于放置PCR反应管的反应槽1011；
所述温度控制系统包括升温系统和降温系统两部分，升温系统包括但不限于蛇形电热片102、电热丝等，降温系统的实现方式包括但不限于小型风扇103、水冷系统、物理被动散热片等。其中蛇形电热片102位于PCR反应台101和反应台下盖104之间，当电流通过时，蛇形电热片102发热使PCR反应台101温度升高，小型风扇103位于PCR反应台101下方，当通电时使热量散去温度降低；
所述温度传感装置105是一个温度传感器，位于PCR反应台101与反应台下盖104之间，将PCR反应台101温度实时采集并反馈给中央处理控制系统3。其实现方式包括但不限于热敏电阻、传感器芯片等。
所述反应槽1011布置在PCR反应台101中心，为纵向槽，其物理设计保证PCR管均匀受热。
在实际PCR反应过程中，中央处理控制系统3接收温度传感装置105发回的温度信号，通过PID算法算法处理，自动控制蛇形电热片102和小型风扇103的工作状态，实现对PCR反应台101温度的准确控制。
具体来说，所述中央处理控制系统3采用PID控制原理对反应温度进行精准控制，当温度传感装置105采集的被测温度偏离所希望的给定值时，PID控制根据反馈回的测量信号与给定值的偏差进行比例(P)、积分(I)、微分(D)运算，从而输出某个适当的控制信号给蛇形电热片102和小型风扇103，促使测量值恢复到给定值，达到自动控制的效果。
在本发明中，荧光信号的采集使用了荧光信号传感系统2，荧光信号传感系统2由摄像头模块或光传感器组成，设置在PCR反应台101的上方，在PCR反应过程中，随着扩增的进行，荧光的强度将发生变化。荧光信号传感系统2获取PCR反应管内PCR反应过程中的实时荧光信号，并转换为电信号。
在反应开始之前，PCR反应的参数通过上位机或手持终端设置，并通过数据通信系统4传递给中央处理控制系统3以对PCR反应过程进行控制，所述参数包括温度、时间和循环次数等。
在PCR反应整体结束之后，中央处理控制系统3控制PCR反应台101温度上升，使得DNA双螺旋结构降解；这使得荧光的强度发生变化，其强度变化的曲线被称为熔解曲线，熔解曲线的重要参数是熔解温度，而不同的PCR扩增产物将产生不同的熔解曲线和熔解温度。在DNA受热降解的过程中，荧光信号传感系统2采集荧光信号，并通过数据通信系统4将信号发送给上位机或手持设备；上位机或手持终端通过分析熔解曲线和熔解温度，完成对PCR反应产物的特异性分析，进而得到检测结果。
与现有技术相比，本发明对实时荧光定量PCR进行了多项优化，是一种体积小、轻便易携、操作简单迅速的低成本、有数据管理及分析判断功能的实时荧光定量PCR仪，满足了现场实时检测和诊断的需求。
附图说明
图1为本发明系统架构图。
图2为本发明的一种整体结构的剖面示意图。
图3为本发明的PCR仪运行流程图。
图4为本发明电子电路部分的原理示意图。
图5为本发明采用的PID温控调节原理示意图。
图6为本发明采用的一种升温装置驱动电路示意图。
图7为图6中升温装置主体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
如图1所示，一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，包括：
微型实时荧光定量PCR反应系统1，用于放置PCR反应管；
荧光信号传感系统2，将PCR反应过程中的实时荧光信号转换为电信号发送给中央处理控制系统3；
中央处理控制系统3，控制各模块有序工作；
数据通信系统4，将实时荧光信号发送给上位机或手持终端，上位机或手持终端实时观测荧光定量PCR反应的状态，同时对PCR检测结果进行分析和判断。
附图2提供了本发明的剖面示意图，整个微型实时荧光定量PCR反应系统1在结构上主要分由外机壳、PCR反应台101、反应台下盖104、小型风扇103、PCB电路板等组成。其中，PCR反应台101由良导热金属制成，含有一个或多个放置PCR管的PCR槽1011，该纵向槽在设计上保证PCR管均匀受热。在PCR反应台101的下方是反应台下盖104。反应台下盖104也由良导热金属制成。在反应台下盖104和PCR反应台101之间，包含有两个重要元件，即温度传感装置105和蛇形电热片102。在PCR反应进行过程中，反应台下盖104和PCR反应台101紧紧压住他们中间的温度传感装置105和蛇形电热片102。蛇形电热片发出的热量传导给PCR反应台101，使得反应台温度升高。温度传感装置105实时采集PCR反应台101的温度信号并反馈给中央处理控制系统3。在PCR反应台101下方是小型风扇103，当中央处理控制系统3控制其工作时，PCR反应台101温度下降。在小型风扇103下方是PCB电路板。该PCB电路板是中央处理控制系统3和数据通信系统4的物理承载。中央处理控制系统3主要由微处理器、电源模块等构成，数据通信系统4主要由天线、通信芯片等组成，这些元器件都放置在PCB电路板上。此外，荧光信号传感系统2的摄像头放置于PCR仪器外壳上方，出于散热需求，PCR仪器外壳设计有散热口6。当用户使用该实时荧光定量PCR仪时，首先打开PCR仪上方外壳，将PCR管放入PCR反应台的PCR槽1011中，盖好外壳，设置初始条件后，即可开始整个PCR过程。
附图3提供了本发明基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备应用时的运行流程，当反应液制备完毕、放入PCR反应管并置放于反应平台的反应槽中后，接着，盖上上方外壳，通电启动PCR仪；接着，用户在上位机或手持终端设置PCR反应的各个参数，包括各阶段反应温度值、持续时间和反应轮数等，这些设置通过数据通信系统4传递给中央处理控制系统3以控制后续PCR反应过程；中央处理控制系统3中的微处理器(MCU)根据程序设定的各阶段反应温度值调动升温装置(蛇形电热片102)或降温装置(小型风扇103)对PCR反应台101进行加热或降温，温度传感器实时测定反应温度，该温度值反馈给MCU，MCU根据测量温度值与设定温度值的差值，应用比例(P)调节或比例积分(PI)调节或比例积分微分(PID)调节，控制加热或降温过程以达到设定温度；当温度传感器测量的温度值与设定温度值一致时，MCU根据程序设定的持续时间值，控制加热或降温装置使反应平台维持该温度相应时间；判断当前反应阶段为变性、退火还是复性，若最后一个反应阶段已完成，则认为该轮反应结束，否则继续下一阶段反应，直到本轮反应结束；每一轮反应结束对反应轮次进行计数，并与设定轮次进行比对，若未达到设定轮次则维持或更新各阶段反应时间及温度(初始时各阶段设定温度为固定值则维持，为温度梯度则更新)，继续进行下一轮反应，若达到则反应停止，至此，整体PCR反应流程结束；接下来，系统将启动PCR扩增产物的特异性分析，在此过程中，MCU控制PCR反应台101升温，使得DNA双链降解，使得荧光信号强度发生变化，据此上位机或手持终端得到了熔解曲线和熔解温度，并据此分析PCR扩增产物的特异性，得到准确的检测和诊断结果；在整个反应过程中，荧光信号传感2系统持续采集荧光信号，并通过数据通信系统4发送给上位机或手持终端。
附图4为本发明PCB电子电路板上的电路结构示意图，该PCB电路由电源管理模块、微处理器(MCU)、温度传感器接口电路、摄像头驱动电路、升温装置驱动电路、降温装置驱动电路和无线通信电路模块组成。其中，电源管理模块为其他各电路模块供电并进行电源管理，而MCU是整个电路的核心所在，MCU接收温度传感信号进而控制升温和降温装置，并控制摄像头采集荧光信号并通过无线通信电路将信号发送给上位机或手持终端。
附图5提供了本发明采用的PID温控调节的原理图，PID控制系统是一种闭环反馈控制系统，系统初始输入为一个或几个相对合适的温度设定值(温度梯度)以及对应温度的维持时间，Kp、Ki、Kd分别表示比例(P)、积分(I)、微分(D)作用的系数，三者共同作用得到滤波器传递函数H(s)。滤波器的输出在中央处理控制系统中产生升温装置及降温装置的控制信号，并最终通过升温装置和降温装置作用于反应平台。反应平台的实时温度测量值反馈给控制系统后，PID控制器根据温度设定值与测量值的差值重新计算并调动执行机构对温度进行调节，直到反应平台温度与设定输入温度差值为零。本发明中微处理器(MCU)承担了PID控制器的工作，升温装置和降温装置作为控制系统的执行机构在PID控制器控制下给反应平台进行加热或降温，温度传感器作为反馈机构承担了将反应平台实时温度传送回MCU的工作，而无线通信模块则可以实时地将温度、荧光信号强度等数据发送给上位机或手持终端以实现实时监控。
附图6提供了本发明采用的一种升温装置驱动电路。该驱动电路主要包含一支达林顿管、滤波电容以及蛇形电热片，其电源输入来自电源管理模块。达林顿管是一种功率管电路，当其通电控制信号使能时，将有电流通过蛇形电热片，使温度上升；滤波电容的功能是使电路工作更加稳定可靠；
附图7提供了本发明采用的一种升温装置示意图，即蛇形电热片。该蛇形电热片主体为均匀盘绕的折叠发热电阻带，其均匀分布在PCR反应台及其下盖之间；在PCR反应过程中，蛇形电热片与PCR反应台及其下盖物理紧密接触。

Claims (8)

1.一种基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，包括：
微型实时荧光定量PCR反应系统(1)，用于放置PCR反应管；
荧光信号传感系统(2)，将PCR反应过程中的实时荧光信号转换为电信号发送给中央处理控制系统(3)；
中央处理控制系统(3)，控制各模块有序工作；
数据通信系统(4)，将实时荧光信号发送给上位机或手持终端，上位机或手持终端实时观测荧光定量PCR反应的状态，同时对PCR检测结果进行分析和判断。
2.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，所述微型实时荧光定量PCR反应系统(1)包括PCR反应台(101)、温度控制系统及温度传感装置(105)，其中：
所述PCR反应台(101)由良导热性的金属制成，包含一个或多个用于放置PCR反应管的反应槽(1011)；
所述温度控制系统包括蛇形电热片(102)和小型风扇(103)，其中蛇形电热片(102)位于PCR反应台(101)和反应台下盖(104)之间，当电流通过时，蛇形电热片(102)发热使PCR反应台(101)温度升高，小型风扇(103)位于PCR反应台(101)下方，当通电时使热量散去温度降低；
所述温度传感装置(105)是一个温度传感器，位于PCR反应台(101)与反应台下盖(104)之间，将PCR反应台(101)温度实时采集并反馈给中央处理控制系统(3)。
3.根据权利要求2所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，所述反应槽(1011)布置在PCR反应台(101)中心，为纵向槽；所述温度传感器为热敏电阻或传感器芯片。
4.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，所述荧光信号传感系统(2)由摄像头模块或光传感器组成，设置在PCR反应台(101)的上方，获取PCR反应管内PCR反应过程中的实时荧光信号，并转换为电信号。
5.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，在反应开始之前，PCR反应的参数通过上位机或手持终端设置，并通过数据通信系统(4)传递给中央处理控制系统(3)以对PCR反应过程进行控制，所述参数包括温度、时间和循环次数。
6.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，在反应过程中，所述中央处理控制系统(3)接收温度传感装置(105)发回的温度信号，通过算法处理，自动控制蛇形电热片(102)和小型风扇(103)的工作状态，实现对PCR反应台(101)温度的准确控制。
7.根据权利要求6所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，所述中央处理控制系统(3)采用PID控制原理对反应温度进行精准控制，当温度传感装置(105)采集的被测温度偏离所希望的给定值时，PID控制根据反馈回的测量信号与给定值的偏差进行比例(P)、积分(I)、微分(D)运算，从而输出某个适当的控制信号给蛇形电热片(102)和小型风扇(103)，促使测量值恢复到给定值，达到自动控制的效果。
8.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR的快速便携式分子检测设备，其特征在于，在PCR反应整体结束之后，中央处理控制系统(3)控制PCR反应台(101)温度上升，使得DNA双螺旋结构降解；在此过程中，荧光信号传感系统(2)采集荧光信号，并通过数据通信系统(4)将信号发送给上位机或手持设备；上位机或手持终端通过分析熔解曲线和熔解温度，完成对PCR反应产物的特异性分析，进而得到检测结果。
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