CN102559488A

CN102559488A - 集成电化学检测技术的定量pcr微流控芯片一体化装置

Info

Publication number: CN102559488A
Application number: CN2012100133235A
Authority: CN
Inventors: 刘爱林; 陈伟; 林新华
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开一种集成电化学检测技术的定量 PCR 微流控芯片一体化装置，包括固定底座、恒温器，一个PCR微流控芯片和电化学检测器，其特点为在固定底座上制作有三个独立的恒温器，三个独立的恒温器分别为低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器是依序并排设置的，PCR微流控芯片中的PCR反应能在低温退火区、适温延伸区和高温变性区中完成；在适温延伸区的DNA扩增反应管中设置有PCR反应物的定量检测用的电化学检测器。所述的定量PCR微流控芯片装置适用于各种基因诊断检测和实验室使用。本装置平台将温控、PCR反应、检测三部分集成为一体，微型化程度高。

Description

集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置

技术领域

本发明属于一种集成电化学检测的定量PCR微流控芯片一体化装置，具体地说，是将电化学检测技术与PCR技术集成在微流控芯片系统中，发挥一体化、多功能的优势，该微流控芯片适用于各种基因诊断检测和实验室使用，属于生物检测技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 PCR由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸三个基本反应步骤组成一个周期，进行多次循环。每完成一个循环仅需几分钟左右，约2-4小时就能将待扩目的基因得以迅速扩增放大约为10⁹个拷贝，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于遗传疾病、肿瘤等重大疾病的诊断。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

微流控芯片技术是目前分析科学的研究前沿热点之一。微流控芯片技术是将实验室整个分析过程如样品处理、样品过滤、样品分离以至样品检测等集成在一小块芯片上进行，可以实现整个分析过程的自动化和微型化。

微流控芯片领域中一个重要的热点就是研究微流控芯片中PCR集成技术。目前，集成PCR微流控芯片技术一般是仅仅设计PCR技术在微流控芯片中完成，PCR微流控芯片为现有技术，但它缺少实时定量检测技术，限制了集成PCR微流控芯片的应用范围。因此，实现定量检测技术与PCR微流控芯片的集成，可进一步拓宽PCR微流控芯片的应用研究领域，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程，所以更为快捷、简便和灵敏。

发明内容

本发明目的是提供一种集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置。

本发明的目的在于还提供一种操作简便、实时定量或定量的集成电化学检测技术PCR微流控芯片一体化装置的PCR反应物检测方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，包括固定底座、三个独立的恒温器，一个PCR微流控芯片和电化学检测器，其特征是在固定底座上制作有三个独立的恒温器，三个独立的恒温器分别为低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器是依序并排设置的，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器上分别形成有可精确控制温度的低温退火区、适温延伸区和高温变性区的三个温度区，在低温退火区、适温延伸区和高温变性区分别具有三个基本PCR反应步骤所需的温度，在上述三个独立的恒温器的上方放置有PCR微流控芯片，在PCR微流控芯片内分布有扩增反应管，扩增反应管有PCR反应进液口、PCR反应扩增后出液口和DNA扩增反应管，PCR反应进液口位于高温变性区内且与微型注射泵连接，扩增反应管依次穿过高温变性区、适温延伸区和低温退火区，扩增反应管作为PCR微流控芯片中的PCR扩增反应区，在适温延伸区的DNA扩增反应管中设置有电化学检测器，PCR微流控芯片中的PCR反应能在低温退火区、适温延伸区和高温变性区中实现；PCR微流控芯片中各PCR反应的高温变性区、适温延伸区和低温退火区相应与控制解链、延伸和退火的三个恒温器位置相对应；所述适温延伸区的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，实现PCR反应扩增物的定量检测。微流控芯片中集成的电化学检测电极，用于目的基因扩增数目的检测。

所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特点为所述的三个独立的恒温器是由铜、铝或不锈钢材料制成的微型长方形的恒温器。

所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特点为DNA扩增管的管道设置长度和管道内流体所设置的流速能控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次。

所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特点为所述的电化学检测器包括工作电极、对电极和参比电极。

本发明所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置的PCR反应物检测方法，包括如下步骤：调节所需实验温度以确保PCR微流控芯片中各PCR反应在低温退火区、适温延伸区和高温变性区的三个温度区的温度恒定；利用微型注射泵将PCR反应液在PCR反应进液口处进入DNA扩增反应管，PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次是通过DNA扩增反应管的管道长度和管道内的流体流速来调节控制；最后利用DNA扩增反应管内的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，实现PCR反应物的定量检测。

本发明的装置可通过恒温器这一独立温度加热装置，精确控制解链、退火和延伸温度的温度，通过微流控芯片中微管道长度和流体流速来控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次数，实现目的基因扩增，在各周期退火步骤处利用电化学检测技术定量检测目的基因扩增数目，比普通PCR和荧光PCR更为快捷、简便、灵敏，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程。

本发明的特点：本发明是集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置。三个独立的微型恒温器，可精确控制高温变性、低温退火（复性）及适温延伸三个基本反应步骤的温度，实现微流控芯片中的PCR反应。微流控芯片中的PCR退火区域集成电化学检测电极，可对目的基因扩增数目定量检测，大大提高了实验的检测时间、成本、染料污染，避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程，拓宽了PCR集成微流控芯片的研究范围。本装置平台将温控、PCR扩增、检测三部分集成为一体，快捷、简便，集成化程度高。

附图说明

图1为本发明的集成电化学检测的定量PCR微流控芯片一体化装置俯视示意图。

图1-1为图1的A部分局部放大图。

图2为本发明的集成电化学检测的定量PCR微流控芯片一体化装置截面示意图。

图3为信号指示剂在本装置上发生PCR反应后的检测结果图。

图中：1，低温退火区；2，适温延伸区；3，高温变性区；4，PCR反应进液口；5， DNA扩增反应区；6，PCR微流控芯片；7，固定底座；8，电化学检测器；9，PCR反应扩增后出液口；10，工作电极；11，对电极；12，参比电极；13，PCR反应扩展前时检测信号曲线；14，PCR反应扩展后检测信号曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明：

如图1、图1-1和2所示，本发明所提供的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，包括固定底座7、三个独立的恒温器，一个PCR微流控芯片和电化学检测器，所述的恒温器、PCR微流控芯片和电化学检测器为现有技术，其特征是在固定底座7上制作有三个独立的恒温器，三个独立的恒温器分别为低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器是依序并排设置的，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器上分别形成有可精确控制温度的低温退火区1、适温延伸区2和高温变性区3的三个温度区，在低温退火区1、适温延伸区2和高温变性区3分别具有三个基本PCR反应步骤所需的温度，在上述三个独立的恒温器的上方放置有PCR微流控芯片6，在PCR微流控芯片内分布有扩增反应管，扩增反应管有PCR反应进液口4、PCR反应扩增后出液口9和DNA扩增反应管，PCR反应进液口4位于高温变性区3内且与微型注射泵连接，扩增反应管依次穿过高温变性区3、适温延伸区2和低温退火区1，扩增反应管作为PCR微流控芯片中的PCR扩增反应区5，在适温延伸区2的DNA扩增反应管中设置有电化学检测器8，PCR微流控芯片6中的PCR反应能在低温退火区1、适温延伸区2和高温变性区3的各区中实现；PCR微流控芯片6中各PCR反应的高温变性区3、适温延伸区2和低温退火区1与控制解链、延伸和退火的三个精确恒温器上下对应；DNA扩增管的管道设置长度和管道内流体所设置的流速以控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次；所述适温延伸区2的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，而实现PCR反应扩增物的定量检测。

所述的电化学检测器包括工作电极10、对电极11和参比电极12，工作电极10、对电极11和参比电极12分别引导线与检测电路连接。

本发明装置的制作包括以下3个步骤：（1）首先再在固定底座上制作低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器拥有PCR扩增的三个基本反应步骤的温度控制（1，低温退火区；2，适温延伸区；3，高温变性区）；（2）再制作PCR微流控芯片，微流控芯片中微管道长度和流体流速来控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次数（5，微流控芯片中的PCR扩展反应区；6，微流控芯片）；芯片中各PCR反应区域与精确控制解链、退火和延伸的恒温器上下对应；（3）微流控芯片中集成电化学检测器的制作，在微流控芯片PCR扩增的适温延伸区微管道处制作集成电化学检测器（10，工作电极；11，对电极孔；12，参比电极孔）。

三个基本PCR扩增反应步骤的温度控制的恒温器采用铜（或铝）质金属材料，微型恒温器为长方形，PCR微流控芯片是在三个独立的恒温器上方，PCR微流控芯片中各PCR反应温度区域与控制解链、退火和延伸的精确恒温器上下对应。金属恒温器上部设有电加热器，下部设有散热器，可以通过PID等方式对恒温器的温控工质进行精确控温。

实验过程：先将集成电化学检测的定量PCR微流控芯片一体化装置按上述步骤组装；再开通三个恒温器的恒温控温系统，调节所需实验温度（循环变性95oC—退火60oC—延伸72oC），确保PCR微流控芯片中各PCR反应区域温度恒定；然后利用微型注射泵将100 μl PCR反应液[含有10μl的10×扩增缓冲液（Mg²⁺），8 μl 的 2.5 mmol/L 4种dNTP混合物, 2 μl 的 10 pmol/μl 上游引物（5’-CGG GAG CAG CAG AAG AAG TGT-3’）和 10 pmol/μl下游引物（5’-AAA GGT TGG GGT CAT TTT CAC-3’），10 μ1的模板cDNA, 1 μ1 of Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl)，0.8 μg μL^-1BSA，20 μmol/L DNA电化学杂交指示剂（异鼠李素）和69 μl双或三蒸水]在PCR反应进液口4处进入DNA扩增反应管，PCR反应液在各个温度区[首先95℃解链（60 s），然后进行30循环变性95oC（30 s）—退火60oC（30 s）—延伸72oC（45 s），最后72oC延伸（60 s）]的时间和周期循环次可通过微管道长度和流体流速来控制；最后利用电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂异鼠李素的变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，如附图3（13，PCR反应扩展前时检测信号曲线；14，PCR反应扩展后检测信号曲线），从而实现PCR反应物的定量检测。

制作集成电化学检测的定量PCR微流控芯片一体化装置可按如下步骤进行：首先制作恒温平台；再在恒温平台放置PCR微流控芯片，并利用微管道长度和流体流速来控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次；最后利用DNA扩增反应管内集成的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，而实现PCR反应扩增物的定量检测。

Claims

1.一种集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，包括固定底座（7）、三个独立的恒温器，一个PCR微流控芯片和电化学检测器，其特征是在固定底座（7）上制作有三个独立的恒温器，三个独立的恒温器分别为低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器是依序并排设置的，所述的低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器上分别形成有可精确控制温度的低温退火区（1）、适温延伸区（2）和高温变性区（3）的三个温度区，在低温退火区（1）、适温延伸区（2）和高温变性区（3）分别具有三个基本PCR反应步骤所需的温度，在上述三个独立的恒温器的上方放置有PCR微流控芯片（6），在PCR微流控芯片内分布有扩增反应管，扩增反应管有PCR反应进液口（4）、PCR反应扩增后出液口（9）和DNA扩增反应管，PCR反应进液口（4）位于高温变性区（3）内且与微型注射泵连接，扩增反应管依次穿过高温变性区（3）、适温延伸区（2）和低温退火区（1），扩增反应管作为PCR微流控芯片中的PCR扩增反应区（5），在适温延伸区（2）的DNA扩增反应管中设置有电化学检测器（8），PCR微流控芯片（6）中的PCR反应能在低温退火区（1）、适温延伸区（2）和高温变性区中实现；PCR微流控芯片（6）中各PCR反应的高温变性区（3）、适温延伸区（2）和低温退火区（1）相应与控制解链、延伸和退火的三个恒温器位置相对应；所述适温延伸区（2）的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，实现PCR反应扩增物的定量检测。

2.根据权利要求1所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特征是所述的三个独立的恒温器是由铜、铝或不锈钢材料制成的微型长方形的恒温器。

3.根据权利要求1或2所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特征是DNA扩增管的管道设置长度和管道内流体所设置的流速能控制PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次。

4.根据权利要求1或2所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置，其特征是所述的电化学检测器包括工作电极（10）、对电极（11）和参比电极（12）。

5.权利要求1-4之任一所述的集成电化学检测技术的定量PCR微流控芯片一体化装置的PCR反应物检测方法，包括如下步骤：调节所需实验温度以确保PCR微流控芯片中各PCR反应在低温退火区（1）、适温延伸区（2）和高温变性区（3）的三个温度区的温度恒定；利用微型注射泵将PCR反应液在PCR反应进液口（4）处进入DNA扩增反应管，PCR反应液在各个温度区的时间和周期循环次是通过DNA扩增反应管的管道长度和管道内的流体流速来调节控制；最后利用DNA扩增反应管内的电化学检测器检测PCR反应扩增过程中DNA电化学杂交指示剂变化量，间接反应PCR反应后扩增产物的量，实现PCR反应物的定量检测。