CN102154261B - 一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置 - Google Patents
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Abstract
一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，涉及一种核酸扩增装置。提供一种能够实现快速的温度循环，缩短扩增过程所需的时间，实现温度的精确控制，提高扩增效率，降低试剂和样品的消耗，减少干扰和交叉污染的在微流控芯片内进行核酸扩增的装置及其方法。装置设有微流控芯片、步进电机、转盘、温控器和均布在转盘同一半径圆周上的至少2个试管；转盘与步进电机输出轴连接，各试管固于转盘上，各试管内均设有加热件和温度探头，温控器设于试管外部，加热件和温度探头均与温控器连接，微流控芯片的微通道入口端插入试管中。可采用所述装置在微流控芯片内进行核酸扩增。
Description
技术领域
本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种核酸扩增装置，尤其是涉及一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置及其方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)在体外酶促合成特异DNA片段，是现代核酸分析的重要手段之一(Saiki RK，Scharf S，Faloona F，Mullis KB，Horn GT，Erlich HA，Arnheim N Science 1985，230：1350)。由高温变性、低温退火及适温延伸等步骤组成一个循环，在一个循环内能将目标核酸分子的数目增加近一倍，整个聚合酶链式反应所包含的20～40个循环能将有限的核酸分子扩增109倍。具有操作简便、灵敏度高、特异性强、产率高、重现性好、易于自动化等优势。一个循环过程主要由以下三个基本步骤构成：①模板DNA的变性：将反应溶液加热至93～98℃，溶液中的双链DNA模板在热作用下，氢键断裂而形成单链DNA；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55～70℃左右，引物与单链DNA的互补序列配对结合；③引物的延伸：在60～75℃下，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶等的作用下，以dNTP作为反应原料，靶序列作为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA单链互补的半保留复制链。在一个循环过程完成后，每个目标核酸分子由一条DNA双链扩增成为两条DNA双链。
在PCR扩增过程中，温度的控制至关重要。PCR扩增仪是目前广泛使用的扩增设备，通过微机控制温控模块的温度，从而实现试管中的PCR反应溶液的升温和降温。现有PCR扩增仪存在着如下缺点：温控模块热容量大、升温降温速度慢；采用导热性较差的塑料管作为反应容器，反应溶液的温度变化滞后于温控模块；设定温度或模块温度并不能代表反应溶液的实际温度，温度控制精度较差，扩增效率较低，通常一个循环需几分钟到十几分钟，完成全部的扩增过程需要数个小时的时间。
微流控芯片是利用各种微加工技术在芯片材料(如玻璃、PDMS或PMMA等其他材料)上加工出具有各种功能的微结构，实现反应、分离、检测等功能，最大限度地把实验室的功能集成到便携的芯片上。自20世纪90年代初Manz和Widmer等(ManzA，GraberN，Widemer H M.Sens.Acturators，B，1990，B1：244)首次提出以来，微流控芯片技术得到了快速发展，已经从单纯的化学分析扩展到各个领域，包括核酸分析、蛋白质分析和细胞分析等。微流控芯 片的通道及各种结构均在微米级别，具有比表面积大、导热快、传质迅速等优点，在微流控芯片上进行PCR扩增，能够有效降低热容量、缩短扩增所需时间、降低样品和试剂消耗(Zhang CS，Xing D.Nucleic Acids Res.2007，35：4223)。到目前为止，有关在微流控芯片上进行PCR扩增反应已有许多报道，主要采用以下两种方式：
1.在微流控芯片上加工一个PCR反应腔，将PCR反应溶液加入到反应腔内，通过在芯片底部集成加热部件或外置的加热装置进行温度控制，反应溶液在反应腔内实现静止式的三温区循环，完成扩增过程(Lagally E T，Medintz I，Mathies RA.Anal.Chem.2001，73：565；Ohashi T，Kuyama H，Hanafusa N，Togawa Y.Biomed.Microdevice，2007，9：695；路卡·布塞 张建平 中国专利 专利公开号：CN101680013A)。
2.利用三个集成或外置的加热装置，分别控制微流控芯片的不同区域处于三种不同的温度下，微流控芯片的微通道分别经过这三个不同的温度区域，这样PCR反应溶液在微通道内依次循环流经3个不同温区，在流动过程中完成扩增过程(Kopp M U，de Mello A J，Manz A.Science.1998，280：1046；Mohr S，Zhang YH，Macaskill A，Day PJR，Barber RW，Goddard NJ，Emerson DR，Fielden PR.Microfluid.Nanofluid，2007，3：611；中国实用新型专利公告号CN2767454)。但目前已报道的这两种方式仍有一定的不足，采用第1种方式仍需要反复进行升温和降温过程，需要一定的时间完成温度变化，而且温度的重现性较差，精确控温对温度控制系统有较高的要求；采用第2种方式反应溶液要流经完整的微通道，容易被吸附到微通道内壁上而导致干扰和交叉污染。
公告号为CN2767454的实用新型专利提供了一种应用于PCR扩增的微流控芯片应用封装结构，属于生物医学领域。从上至下包括：接口结构，公知的微流路单元和温控单元。常规PCR扩增仪，存在着热容大、加热速度和冷却速度慢、样品耗用高等缺点。通常完成一个扩增循环通常需要几到十几分钟，因此对于30个循环的扩增过程需要花费数个小时，而且对于反应物的需求量大。该实用新型实现了PCR系统中由时间向空间的转换，即维持系统不同地方的温度恒定，而是样品流经不同的温区。这种方式能够大大提高反应速度，仅需十几分钟实现快速PCR反应，此外也可通过注射泵改变流速也扩大了样品容量的选择范围。
发明内容
本发明的目的在于针对目前常规的PCR扩增仪所存在的不足，提供一种能够实现快速的温度循环，缩短扩增过程所需的时间，实现温度的精确控制，提高扩增效率，降低试剂和样品的消耗，减少干扰和交叉污染的在微流控芯片内进行核酸扩增的装置。
本发明的另一目的在于提供一种在微流控芯片内进行核酸扩增的方法。
本发明所述的在微流控芯片内进行核酸扩增的装置设有微流控芯片、步进电机、转盘、 温控器和均布在转盘同一半径圆周上的至少2个试管；转盘与步进电机输出轴连接，各试管固于转盘上，各试管内均设有加热件和温度探头，温控器设于试管外部，加热件和温度探头均与温控器连接，微流控芯片的微通道入口端可插入试管中。
所述各个试管最好为相同的试管。
所述微通道可为玻璃微通道、石英微通道、硅微通道或高聚物微通道等，所述高聚物可为聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等可用于制作微流控芯片的高聚物。
所述微通道可为经可逆或不可逆键合组成完整的微通道。
所述微通道的尺寸可为1nm～1cm。
所述温控器可为单片机或电脑。
本发明所述一种在微流控芯片内进行核酸扩增的方法，采用所述在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，包括以下步骤：
1)将微流控芯片的微通道预先充满与水不互溶的有机相，在各试管内加入传热液体，然后将PCR反应溶液以液滴的形式引入到微流控芯片的微通道入口端内，并在微通道入口处用有机相进行封闭；再将微流控芯片的微通道入口端插入到盛有传热液体的试管中，PCR反应溶液液滴所处位置浸在试管内的传热液体中；
2)根据不同PCR反应溶液对温区的要求，将相应数量的试管安装在与步进电机固连的转盘上，对各试管内的传热液体进行水浴加热，并分别控制各试管内的传热液体，使各试管内的传热液体分别恒定于PCR扩增所需要的不同温度；
3)控制步进电机转动，让微流控芯片的微通道入口端内的PCR反应溶液液滴依次浸没在不同温度的试管的传热液体中，并满足PCR反应各基本步骤对反应时间的要求，步进电机转动一圈即完成一次PCR循环，转动20～40圈就能完成一次完整的PCR扩增过程。
在步骤1)中，所述传热液体可为水，所述有机相为与水不互溶或部分互溶的有机溶液，可为醇、酯或矿物油等。所述醇可为丁醇或己醇等，所述酯可为乙酸乙酯或甘油三乙酸酯等。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过步进电机带动3个试管的快速切换与PCR反应溶液液滴的快速传热，能够实现快速的3种温度循环，缩短扩增过程所需的时间，3个试管内的温度可实现精确控制，这样可显著提高扩增效率、降低试剂和样品的消耗、减少干扰和交叉污染。
附图说明
图1是本发明实施例的结构及使用示意图。
图2是图1中3个试管的安置示意图。
图3为图1中的微流控芯片的入口端放大示意图。
具体实施方式
参见图1～3，3个试管2内装有水(也可为其他液体)，3个试管2按顺序均布安装在转盘11上，转盘11连接在步进电机1上，试管2内安装有加热件7和温度探头8用于将试管2内的液体恒定在一定温度，加热件7和温度探头8通过导线10与外部温控器9连接。温控器9对3个试管2中的水分别控制在PCR反应过程所需的3种不同温度(如93℃、52℃和72℃)。微流控芯片3的微通道4内预先充满与水不混溶的有机相，微流控芯片3的入口端5加工成尖针状，入口端5内有1滴PCR反应溶液6，而且入口处用有机相(采用丁醇，也可己醇或矿物油)进行封闭，将入口端5从试管2末端的开口(开槽)21中插入，并确保PCR反应液滴6所处位置浸没在试管2内的水中。本装置工作时，步进电机1旋转，3个试管2可依次对准微流控芯片3的入口端5，PCR反应液滴6依次在不同温度的3个试管2中浸没并保持所需的不同的时间，完成PCR反应所需的三个温区循环过程。步进电机1转动一圈即完成一次PCR循环，一般转动20～40圈就能完成一次完整的PCR扩增过程。
Claims (9)
1.一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于设有微流控芯片、步进电机、转盘、温控器和均布在转盘同一半径圆周上的至少2个试管；转盘与步进电机输出轴连接，各试管固于转盘上，各试管内均设有加热件和温度探头，温控器设于试管外部，加热件和温度探头均与温控器连接，微流控芯片的微通道入口端插入试管中。
2.如权利要求1所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于所述各试管为相同试管。
3.如权利要求1所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于所述微通道为玻璃微通道、石英微通道、硅微通道或高聚物微通道。
4.如权利要求3所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于所述高聚物为聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯聚合物。
5.如权利要求1或3或4所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于所述微通道的径向尺寸为1nm～1cm。
6.如权利要求1所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，其特征在于所述温控器为单片机或电脑。
7.一种在微流控芯片内进行核酸扩增的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置，所述方法包括以下步骤：
1)将微流控芯片的微通道预先充满与水不互溶的有机相，在各试管内加入传热液体，然后将PCR反应溶液以液滴的形式引入到微流控芯片的微通道入口端内，并在微通道入口处用有机相进行封闭；再将微流控芯片的微通道入口端插入到盛有传热液体的试管中，PCR反应溶液液滴所处位置浸在试管内的传热液体中；
2)根据不同PCR反应溶液对温区的要求，将相应数量的试管安装在与步进电机固连的转盘上，对各试管内的传热液体进行水浴加热，并分别控制各试管内的传热液体，使各试管内的传热液体分别恒定于PCR扩增所需要的不同温度；
3)控制步进电机转动，让微流控芯片的微通道入口端内的PCR反应溶液液滴依次浸没在不同温度的试管的传热液体中，满足PCR反应各基本步骤对反应时间的要求，步进电机转动一圈即完成一次PCR循环，转动20～40圈就能完成一次完整的PCR扩增过程。
8.如权利要求7所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的方法，其特征在于在步骤1)中，所述传热液体为水。
9.如权利要求7所述的一种在微流控芯片内进行核酸扩增的方法，其特征在于在步骤1)中，所述有机相为醇、酯或矿物油。
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