CN107099598B - 一种细菌微流控集成检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌微流控集成检测的方法，增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。该方法可彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，能够实现细菌样本的自动化检测。

Description

一种细菌微流控集成检测的方法
技术领域
本发明涉及一种细菌微流控集成检测的方法，用于细菌检测的领域。
背景技术
细菌性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病，仅细菌性食源性致病菌每年约导致美国360万人患病，3.6万人住院，861人死亡。中国每年细菌性食源性疾病发病人数约9411.7万人次，其中2475.3万患者就诊，335.7万患者因病住院，8530例患者死亡。
致病菌的检测是细菌性疾病预防控制和相关研究的基石，主要检测对象为临床样本和非临床样本(环境、食品和媒介生物体等样本)。分离培养技术是早期出现的致病菌检测技术，以分离和鉴定两个基本步骤为基础，增加增菌步骤，有利于恢复受损菌体和低载量目标菌，同时可抑制竞争性杂菌生长，从而提高检测敏感性。
分离培养技术作为标准方法已被广泛应用于各层级实验室，但其增菌、分离及鉴定的前处理步骤大多需要人工操作，程序较复杂，即使目前有自动化的接种仪器和飞行质谱鉴定设备以及上述两种设备的联用系统等可代替部分人力，但总体上因分离培养技术自身程序的复杂性和昂贵的自动化设备普及性受限，分离培养技术仍需占用大量人力，耗时较长。
为了克服上述不足，在增菌方面，本申请人首次创新性研制了毛细管色谱式增菌法，利用半固体凝胶的分子吸附原理将选择性增菌剂固定于毛细管中作为固定相，以此预制毛细管为“色谱柱”，以样本增菌液混合液为进样源，利用带鞭毛目标菌自身的动力，在毛细管中由进样端向远端高效地将目标菌从混合菌群中色谱式增菌，且同时可实现预增菌与增菌两步合并进行，可节约大量的人力和时间，已获相关授权专利5项。
在分离鉴定方面，致病菌分离培养技术的部分步骤可以被分子生物学检测技术替代，以便于节约人力、加快检测速度。增菌步骤无法由两种技术替代，因两种技术的灵敏性仍有一定局限性(检出限较高)，分子生物学检测技术对不同菌属(种)的检出限为101-103CFU/mL。
分子生物学检测技术的核心部分是聚合酶链式反应(PCR)技术，主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR和以及其他基于PCR的技术。目前已有DuPont公司的
Figure BDA0001303350230000011
系列产品、Bio-Rad公司的iQ-
Figure BDA0001303350230000012
系列产品和Thermo Fisher Scientific公司的SureTectTM系列产品和Cepheid公司的Gene
Figure BDA0001303350230000013
系列产品等实现了一定程度的自动化。但是上述产品均未包括增菌过程，仍需要进行一定的人工辅助操作。
综上所述，对于致病菌检测，毛细管色谱式增菌法一定程度简化了增菌的过程，但仍需配以后续繁杂的分离鉴定步骤。PCR技术在节约人力和降低检测成本方面表现出一定优势，但是仍需要辅以增菌过程，需几步人工辅助。目前细菌的检测仍然过程较为复杂，时间和人力成本占用较多。
发明内容
为了彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，本发明旨在提供一种细菌微流控集成检测的方法，能够实现细菌样本的自动化检测。
本发明的技术方案如下所述：
一种细菌微流控集成检测的方法，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；
所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；
所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；
所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；
将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。
为了更好地应用该方法，在该方法中使用自动细菌微流控集成检测装置，该装置包括：微型管道集成系统、微流控系统和控制系统；
其中，所述微型管道集成系统包括取菌针环、增菌细管、DNA提取管和PCR反应管；沿增菌细管长度方向上且在增菌细管的上部设置第一连接管，在增菌细管的下部、与第一连接管相对的位置处设置第二连接管，所述第二连接管通过DNA提取管与PCR反应管相连接；所述取菌针环位于第一连接管内且位于增菌细管上方；
所述微流控系统包括传动装置和注射泵；
所述控制系统用于控制传动装置以驱动取菌针环穿过增菌细管取菌液后达到DNA提取管，所述控制系统还用于控制注射泵以将DNA提取管中的设定量的液体转移到PCR反应管中。
优选的，所述第一连接管的顶端采用密封膜密封。
优选的，第一连接管与增菌细管的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使第一连接管与增菌细管成为两个独立的封闭空间。
优选的，所述增菌细管与第二连接管的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使增菌细管与第二连接管成为两个相对独立的封闭空间；当然，为了使得结构更加简单，该密封膜结构可省略。
优选的，第二连接管与DNA提取管的连接处采用密封膜密封，使第二连接管与DNA提取管成为两个独立的封闭空间。
优选的，所述取菌针环是由柄基、接种环和针状部件依次相连构成的。
进一步优选的，所述针状部件为针。
进一步优选的，所述取菌针环的柄基顶端与传动装置相连。
优选的，所述增菌细管，包括细管以及用于装填细管中的含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶；或者，所述增菌细管，包括细管以及用于装填细管中的吸附有选择性性增菌剂的大分子吸附材料、营养液。
优选的，所述第一连接管、增菌细管和第二连接管的集成为一体形成，或者，各个部分是可拆卸的。
进一步优选的，当各个部分是可拆卸时，第一连接管和第二连接管通过四通接头与增菌细管相连接，其中接头将增菌细管分成两段细管。
优选的，所述第二连接管上设有气压平衡孔，以微孔滤膜封孔。
优选的，所述DNA提取管，包括细管、用于装填细管中的DNA提取液和用于密封细管两端的密封膜；或者，所述DNA提取管，是由两根细管连接而成，其中一根细管装填溶菌酶，另一根细管中装填DNA提取液。
优选的，所述PCR反应管，包括细管、用于装填细管中的PCR反应试剂；或者，进一步包括装填细管中的荧光检测相关试剂。
优选的，所述PCR反应管末端内部设有微孔滤芯。
优选的，所述PCR反应管通过二通阀与注射泵相连。
优选的，所述DNA提取管与PCR反应管之间设有三通阀。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
本发明可以代替原有细菌检测过程中仍需要人工增菌的繁杂的操作过程，将增菌过程、DNA提取过程和PCR反应过程进行集成一体化，可节约时间和人力成本，此外自动化操作可降低人工操作中的失误几率，进一步提高检测的准确性。结合PCR反应的快速检测能力，能够为临床诊断或细菌传染源的快速锁定提供快速的技术支持，有利于及早地循证诊疗，提高治疗的有效性；或者及早地发现传染源，避免疫情的进一步扩大，降低更多的高危人群的感染风险。
附图说明
图1和图2是本发明自动细菌微流控集成检测的装置的结构示意图。
图3是接通状态下的三通阀的剖视侧视图。
图4是未接通状态下的三通阀的剖视侧视图。
图5是三通阀的俯视图。
图6是接通状态下的二通阀的剖视侧视图。
图7是未接通状态下的二通阀的剖视侧视图。
图8是二通阀的俯视图。
其中，1、取菌针环，1-1、柄基，1-2、接种环，1-3、针，2、增菌细管，3、DNA提取管，4、PCR反应管，5、第一连接管，6、接头，7、第二连接管，8、冻干溶菌酶，9、精密传动装置，10、精密注射泵，11、三通阀，11-1、第一定子，11-2、第一转子，11-3、第一转轴，11-4、第二孔道，11-5、第二孔道，11-6、板扣，12、二通阀，12-1、第二定子，12-2、第二转子，12-3、第二转轴，12-4、第三孔道，12-5、凹槽。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤和/或它们的组合。
正如背景技术中所介绍的，现有技术中细菌的检测过程仍然较为复杂，时间和人力成本占用较多，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种细菌微流控集成检测的方法，该方法包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；
所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；
所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；
所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；
将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。
在本发明优选的技术方案中，所述增菌基质为含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶，或者是，所述增菌基质为大孔吸附材料和含有选择性增菌剂的培养基。
在本发明优选的技术方案中，所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将溶菌酶和DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端。
在本发明优选的技术方案中，所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂和荧光检测试剂填装入细管中。具体的技术方案是：将PCR反应试剂或PCR反应试剂和荧光检测试剂溶解后，冷冻干燥包被于细管内的表面上。
在本发明优选的技术方案中，还包括使用增菌培养控温系统实现原位增菌培养。
在本发明优选的技术方案中，还包括使用DNA提取控温系统实现原位DNA提取。
在本发明优选的技术方案中，还包括使用PCR反应控温系统实现原位PCR反应。
本发明还提供上述方法使用的细菌微流控集成检测装置，如图1和图2所示，该装置包括：微型管道集成系统、微流控系统和控制系统。
其中，所述微型管道集成系统包括取菌针环1、增菌细管2、DNA提取管3、PCR反应管4、第一连接管5和第二连接管7；沿增菌细管2长度方向上且在增菌细管2的上部设置第一连接管5，在增菌细管2的下部、与第一连接管5相对的位置处设置第二连接管7，所述第二连接管7通过DNA提取管3与PCR反应管4相连接；所述取菌针环1位于第一连接管5内且位于增菌细管2上方。第一连接管5的中心线和第二连接管7的中心线所属一条直线，保证取菌针环1能够顺利从第一连接管5中通过第二连接管7进入DNA提取管，否则，无法实现这一过程。
其中，所述微流控系统包括精密传动装置9和精密注射泵10。
在本发明的优选的技术方案中，所述精密传动装置9可选择为直线式驱动马达，该设备为现有技术。
其中，所述控制系统用于控制精密传动装置9以驱动取菌针环1穿过增菌细管2取菌液，所述控制系统还用于控制所述精密注射泵10以将DNA提取管3中的设定量的液体转移到PCR反应管4中，所述精密注射泵10与PCR反应管的末端相连接，以将DNA提取管中的液体吸入到PCR反应管中。本发明采用的精密注射泵为现有技术中常规的实验仪器，特点是：电机驱动螺杆(导向螺杆)慢慢旋转，将注射器的活塞推入，并且将注射液推出；当电机反向旋转可以回吸液体。
在本发明中，为了防止杂菌污染，部件的顶端或末端，各个部件的连接处需要进行密封。如下所述：
在本发明优选的技术方案中，所述第一连接管5的顶端采用密封膜密封，防止外界的杂菌进入第一连接管5中污染取菌针环1。
在本发明优选的技术方案中，所述第一连接管5与增菌细管2的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使第一连接管5与增菌细管5成为两个独立的封闭空间，以防止增菌细管2中的待检测菌污染取菌针环1。或者，直接在取菌针环1下部处采用密封膜密封，从而使第一连接管5中的取菌针环1与增菌细管2隔开。
在本发明优选的技术方案中，所述增菌细管2与第二连接管7的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使增菌细管2与第二连接管7成为两个相对独立的封闭空间；当然，为了使得结构更加简单，该密封膜结构也可省略。
在本发明优选的技术方案中，第二连接管7与DNA提取管3的连接处采用密封膜密封，使第二连接管7与DNA提取管3成为两个独立的封闭空间。
在本发明中，所述取菌针环1是由柄基1-1、接种环1-2和针状部件依次相连构成的，该针状部件可为带有针状结构的部件，但是并没有特别的限定，只要是能穿破第一连接管5与增菌细管2的连接处达到DNA提取管3即可，针状部件优选为针1-3。所述取菌针环1的柄基1-1顶端与精密传动装置9相连，其柄基1-1可露出第一连接管5外与精密传动装置9相连，或者，柄基1-1完全在第一连接管5内与精密传动装置9相连；两种连接方式均可。根据使用需要不同，可以有多种取量(1～10μL)的取菌针环。该取菌针环1能够通过四通接头6穿过增菌细管2到达DNA提取管3。为了防止杂菌污染将取菌针环1设置于第一连接管5中。所述第一连接管5的顶端(是指精密传动装置9的那一端)采用密封膜密封，与外界隔离。
在本发明中，所述增菌细管2，包括细管以及用于装填细管中的含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶；或者，所述增菌细管2，包括细管以及用于装填细管中的大孔吸附材料和含有选择性增菌剂的培养基。
在本发明中，所述增菌细管2与第一连接管5和第二连接管7两者的中心线所在直线的角度α为0＜α≤90°，优选45°≤α≤90°，如图1和2所示的角度。角度的选择主要是考虑外置的温度控制系统的结构形状。
在本发明中，所述第一连接管5、增菌细管2和第二连接管7的集成为一体形成，或者，各个部分是可拆卸的。当各个部分是可拆卸时，第一连接管5和第二连接管7通过接头6(该接头为四通接头)与增菌细管2相连接，其中接头6将增菌细管2分成两段细管。
在本发明优选的技术方案中，增菌细管2与DNA提取管3的第二连接管7上设有气压平衡孔，以微孔滤膜封孔，便于精密注射泵10吸液时压力平衡。
在本发明中，所述DNA提取管3，包括细管、用于装填细管中的DNA提取液和用于密封细管两端的密封膜；或者，所述DNA提取管3，是由两根细管连接而成，其中一根细管装填溶菌酶，另一根细管中装填DNA提取液，DNA提取管3的两端以及两根细管的连接处均采用密封膜密封，如图2所示。
在本发明中，所述PCR反应管4，包括细管、用于装填细管中的PCR反应试剂；或者，进一步包括装填细管中的荧光检测相关试剂。
在本发明中，所述的细管的内径均为1～8mm。在本发明优选的技术方案中，所述细管的内径为3～5mm。
在本发明优选的技术方案中，所述DNA提取管3与PCR反应管4之间设有三通阀11，三通阀11将两管连通，在不使用该装置时，三通阀11两端的管道是不相连通的，只用使用时通过该三通阀11来连通。该三通阀11可采用电磁阀，通过控制系统来控制其关与闭，实现全自动检测的目的。三通阀顾名思义一共有三个口，其中两个口与DNA提取管3与PCR反应管相连接，剩余一个口与外界空气连通，目的是平衡精密注射泵10在吸液后的气压。该三通阀11可采用现有技术中常规的三通电磁阀改进而来，本领域的技术人员可常规改进，只需将现有技术中的常规的三通电磁阀改进成为超小型三通电磁阀即可，三通电磁阀由控制系统控制开与闭；或者由现有技术中高效液相色谱中使用的六通阀进样器改进而来，所述三通阀11是通过中间的第一转轴11-3将圆柱状的第一定子11-1和圆柱状的第一转子11-2连接，第一转子11-2可通过第一转轴11-3转动；第一定子11-1和第一转子11-2均设有沿长度方向的第一孔道11-4，第一转子11-2还设有连通外界大气的第二孔道11-5。当第一定子11-1和第一转子11-2的两第一孔道11-4在同一位置时，则连通，状态结构如图3所示，两孔道错开时则关闭，状态结构如图4所示。第一转子12-2的柱体上设置凸起的板扣11-6用来旋转第一转子11-2，以发生相对移动，如图5所示。
在本发明优选的技术方案中，所述PCR反应管4末端内部设有微孔滤芯，以缓冲外界气体与内部试剂的接触。PCR反应管4的末端通过二通阀12与精密注射泵10的吸液针相连接，不吸液时处于关闭状态，吸液时开通。其中所述二通阀12可采用现有技术中常规的二通电磁阀改进而来，本领域的技术人员可常规改进，只需将现有技术中的常规的二通电磁阀改进成为超小型二通电磁阀即可，二通电磁阀由控制系统控制开与闭；或者由现有技术中高效液相色谱中使用的六通阀进样器改进而来，所述二通阀12是通过中间的第二转轴12-3将圆柱状的第二定子12-1和圆柱状的第二转子12-2连接，第二转子12-2可通过第二转轴12-3转动；第二定子12-1和第二转子12-2均设有沿长度方向的第三孔道12-4，当第二定子12-1和第二转子12-2的两第三孔道12-4在同一位置时，则连通，状态结构如图6所示，两孔道错开时则关闭，状态结构如图7所示。第二转子12-2的柱体上设置凹槽12-5用来旋转第二转子12-2，以发生相对移动，如图8所示。二通阀12外径与PCR反应管等径，在未与精密注射泵10相连接时，PCR反应管4的末端口进行无菌膜密封。
进一步的，在本发明优选的技术方案中，所述自动细菌微流控集成检测的装置还包括精密温度控制系统。所述精密温度控制系统可为微型管道集成系统中的各个管道提供相应的温度，本领域的技术人员通过现有技术常规设置和实现，在此不再赘述。
进一步的，在本发明优选的技术方案中，所述自动细菌微流控集成检测的装置还包括荧光检测器，所述荧光检测器对PCR反应管中的反应液进行荧光实时监测。
本发明中的自动细菌微流控集成检测的装置的使用方法是：
使用时，使微型管道集成系统相应的管道区域可匹配相应的温度，将增菌细管2的一端插入到样本增菌液中，设定一定增菌时间，增菌时间达到预设时间后，精密传动装置9驱动取菌针环1穿过增菌细管2取一定量菌液后(取菌针环1容易穿透各个密封膜)，到达DNA提取管3，DNA提取管3可在设定温度和时间条件下提取一定时间后，精密注射泵10将DNA提取管3中的液体转移一定量到PCR反应管4中反应，反应后荧光实时监测或通过电泳检测目标产物。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的应用实施例详细说明本发明的以上技术方案。
实施例1细菌微流控集成检测沙门氏菌
1、增菌过程管道化：选取内径3mm、长度10cm玻璃细管，填装改良半固体四硫磺酸钠煌绿培养基，所述改良半固体四硫磺酸钠煌绿培养基是通过以下方法制备得到：取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠3.0g、碳酸钙45.0g、琼脂粉2.7g和蒸馏水1000mL加热溶解后取900mL，加入100mL50％(质量分数，下同)硫代硫酸钠溶液、20.0mL20％碘溶液(含25％碘化钾)、2.0mL0.5％煌绿水溶液、50.0mL10％牛胆盐溶液，混匀灭菌)。
2、DNA提取过程管道化：选取内径5mm的聚丙烯管，填装200μLDNA提取液(DNA提取液配方：10mmol/L Tri-HCL pH7.6，5mmol/L EDTA，0.5％SDS)，两端用聚乙烯膜密封。
3、PCR反应过程管道化：选取与DNA提取液兼容的50μL反应体系的引物、DNA聚合酶、脱氧核苷酸单体溶解后，冷冻干燥包被于3mm内径透明聚丙烯细管内的表面上。
4、增菌过程、DNA提取过程和PCR反应过程的管道集成一体化：将5μL微型取菌针环1通过四通接头6和第一连接管5与增菌细管2连接，取菌针环1孔的起始位置位于增菌细管2上部，环的上侧能与四通接头6的开孔尺寸匹配，下侧使用聚乙烯密封膜密封，取菌针环1的柄基1-1部用聚乙烯膜与第一连接管5顶部密封。将增菌细管2通过第二连接管7与DNA提取管3连接，增菌细管2与DNA提取管3的第二连接管7上留一个气压平衡孔，以微孔滤膜封孔，便于精密注射泵10吸液时压力平衡。将DNA提取管3通过三通阀11与PCR反应管4通连接过，PCR反应管4末端用微孔滤芯和一个凹槽式控制二通阀12，阀门外径与PCR反应管4等径，末端口进行无菌膜密封。
5、管道集成中自动移液：直线式驱动马达(误差≤0.5mm)驱动取菌针环1穿过增菌细管2取5μL菌液后，到DNA达提取管3。由精密注射泵10(移液误差≤1μL)移取将DNA提取管3中50μL的液体转移PCR反应管4中反应。
6、增菌过程、DNA提取过程和PCR反应的原位执行：集成管道的增菌细管2一头插入到缓冲蛋白胨水增菌液中，使用培养控温系统供温36℃，24h对增菌管道实现原位增菌培养。使用DNA提取控温系统实现原位DNA提取，95℃裂解30min后，降温至4℃。使用PCR反应控温系统实现原位PCR反应，反应后电泳检测目标产物。
实施例2细菌微流控集成检测金黄色葡萄球菌
1、增菌过程管道化：选取内径3mm、长度10cm玻璃细管，依次填装大孔吸附树脂和7.5％氯化钠肉汤(取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠75g和蒸馏水1000mL加热溶解后灭菌)。
2、DNA提取过程管道化：5mg溶菌酶于冷冻干燥包被于2.5mm外径的弹头式转运架(即是子弹头式的一个塑料支架，溶菌酶包被于其表面)表面，然后装入3mm内径聚丙烯管，两端用聚乙烯膜密封，选取内径5mm的聚丙烯管，填装200μLDNA提取液(DNA配方：10mmol/LTri-HCL pH7.6，5mmol/L EDTA，0.5％SDS)，两端用聚乙烯膜密封，并将两个细管进行焊接。
3、PCR反应过程管道化：选取与DNA提取液兼容的50μL反应体系的引物、DNA聚合酶、脱氧核苷酸单体和荧光检测试剂溶解后，冷冻干燥包被于3mm内径透明聚丙烯细管内的表面上。
4、增菌过程、DNA提取过程和PCR反应的管道集成一体化：将5μL微型取菌针环1通过四通接头6和第一连接管5与增菌细管2连接，取菌针环1孔的起始位置位于增菌细管2上部，环的上侧能与四通接头6的开孔尺寸匹配，下侧使用聚乙烯密封膜密封，取菌针环1的柄基1-1部用聚乙烯膜与第一连接管5顶部密封。将增菌细管2通过第二连接管7与DNA提取管3连接，增菌细管2与DNA提取管3的第二连接管7上留一个气压平衡孔，以微孔滤膜封孔，便于精密注射泵10吸液时压力平衡。将DNA提取管3通过三通阀与PCR反应管4通连接过，PCR管末端用微孔滤芯和一个凹槽式控制二通阀12，阀门外径与PCR反应管4等径，末端口进行无菌膜密封。
5、管道集成中自动移液：直线式驱动马达(误差≤0.5mm)驱动取菌针环1穿过增菌细管2取5μL菌液后，到DNA达提取管3(同时携带溶菌酶转运架进入DNA提取液)。由精密注射泵10(移液误差≤1μL)移取将DNA提取管3中50μL的液体转移PCR反应管4中反应。
6、增菌过程、DNA提取过程和PCR反应的原位执行：集成管道的增菌管一头插入到7.5％氯化钠肉汤增菌液中，使用培养控温系统供温36℃，18h对增菌管道实现原位增菌培养。使用DNA提取控温系统实现原位DNA提取，37℃提取30min后，95℃灭活10min，降温至4℃。使用PCR反应控温系统实现原位PCR反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种非疾病的诊断目的的细菌微流控集成检测的方法，其特征是，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；
所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；
所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；
所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；
将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述增菌基质为含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶，或者是，所述增菌基质为大孔吸附材料和含有选择性增菌剂的培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将溶菌酶和DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂和荧光检测试剂填装入细管中。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：还包括使用增菌培养控温系统实现原位增菌培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：还包括使用DNA提取控温系统实现原位DNA提取。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：还包括使用PCR反应控温系统实现原位PCR反应。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述方法使用的细菌微流控集成检测的装置包括：微型管道集成系统、微流控系统和控制系统；
其中，所述微型管道集成系统包括取菌针环、增菌细管、DNA提取管和PCR反应管；
沿增菌细管长度方向上且在增菌细管的上部设置第一连接管，在增菌细管的下部、与第一连接管相对的位置处设置第二连接管，所述第二连接管通过DNA提取管与PCR反应管相连接；所述取菌针环位于第一连接管内且位于增菌细管上方；
所述微流控系统包括传动装置和注射泵；
所述控制系统用于控制传动装置以驱动取菌针环穿过增菌细管取菌液后达到DNA提取管，所述控制系统还用于控制注射泵以将DNA提取管中的设定量的液体转移到PCR反应管中。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是：所述第一连接管的顶端采用密封膜密封。
10.如权利要求8所述的方法，其特征是：第一连接管与增菌细管的接触部位采用密封膜密封。
11.如权利要求8所述的方法，其特征是：所述增菌细管与第二连接管的接触部位采用密封膜密封。
12.如权利要求8所述的方法，其特征是：第二连接管与DNA提取管的连接处采用密封膜密封。
13.如权利要求8所述的方法，其特征是：所述第二连接管上设有气压平衡孔，以微孔滤膜封孔。
14.如权利要求8所述的方法，其特征是：所述取菌针环是由柄基、接种环和针状部件依次相连构成的。
15.如权利要求14所述的方法，其特征是：所述针状部件为针。
16.如权利要求14所述的方法，其特征是：所述取菌针环的柄基顶端与传动装置相连。
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KR101216828B1 (ko) * 2002-12-30 2013-01-04 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 병원균 검출과 분석을 위한 방법과 기구
KR100790880B1 (ko) * 2006-07-05 2008-01-02 삼성전자주식회사 자성 비드가 결합되어 있는 소수성 다공성 중합체가 벽면에결합되어 있는 마이크로채널 또는 마이크로챔버를포함하는 미세유동장치 및 그를 이용하는 방법
CN102296103A (zh) * 2010-06-28 2011-12-28 唐锋 固相倾注增菌法及配套用装置
CN102154261B (zh) * 2010-12-23 2012-05-23 厦门大学 一种在微流控芯片内进行核酸扩增的装置
CN102517198B (zh) * 2012-01-10 2014-07-30 济南市疾病预防控制中心 一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置
CN104293659A (zh) * 2013-07-19 2015-01-21 厦门万泰沧海生物技术有限公司 一种全封闭一体式核酸扩增与检测管
CN203807475U (zh) * 2013-12-31 2014-09-03 倪一 一种基于微流控芯片的细菌快速检测装置
CN105277725B (zh) * 2014-07-01 2017-03-29 清华大学 一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统

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