CN103194536A - 白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用，属于分子生物学和免疫学领域。本发明是将分子生物学的聚合酶链式反应技术和免疫层析技术进行结合，实现对白色念珠菌的快速检测。本发明试剂盒包括PCR扩增及试纸条检测共二部分。其中通过对引物进行特定修饰，并在试纸条制备中选择相应的包被物和标记物，反应过程中形成一个特异的复合物，实现分子生物学技术和免疫层析技术的结合，达到对白色念珠菌特异扩增产物的检测，与传统生化方法相比大大节省了检测时间，简化操作步骤，以达到快速、高效、准确的检测和筛选目的。在临床检测和筛选白色念珠菌的过程中发挥重要作用。

Description

白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及快速检测白色念珠菌的试剂盒及方法和应用。 

背景技术

白色念珠菌（candida albicans）是念珠菌属（假丝酵母属）中最为常见的种。也是临床上浅部/深部真菌病中发病率最高的念珠菌病的重要病原菌。由于该菌多侵犯已患有严重疾病机体免疫力低下的病人，以及接受器官移植，实施心脏、胃肠道手术需行插管、尿管、导管的外科病人，对生命威胁极大，为及早发现与诊断念珠菌感染，快速、简便、特异及准确达到临床分离和鉴定念珠菌的方法一直受到国内外的广泛关注。随着免疫受损或低下人群的不断扩大，机会性念珠菌病继续增多，迄今仍是医学真菌领域研究的热点。 

目前国内外白色念珠菌主要的检测方法有传统的微生物检测方法和分子生物学检测方法。微生物方法检测白色念珠菌主要用到科玛嘉显色培养基进行分离鉴别，要求检测人员有较丰富的经验，进口的培养基检测成本也高。分子生物学检测主要使用PCR及RT-PCR等方法，普通的PCR技术其扩增产物大多通过凝胶电泳判断扩增结果，该方法中的致癌物质不仅对环境和操作人员有很大的危害，而且要求检测人员具备熟练的操作技巧，点样时操作误差会使样品漂移造成结果不准确，不适合进行大量样本的检测分析工作；RT-PCR方法需要购买高端的仪器设备，并且试剂价格昂贵，这些都给检测带来了巨大的成本压力。 

发明内容

本发明解决的技术问题是提供白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用；发明主要目的在于克服传统的微生物检测方法存在检测时间长、步骤繁琐等缺陷，提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。 

本发明设计试剂盒即可以保证PCR技术的灵敏度和特异性，还保留了免疫层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点。 

所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液、样品稀释液、阴性对照、阳性对照和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成。所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；所述PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物 F为5’TTGGTGGTGGTAGACATAGA 3'，下游引物R为5'TCAGAACACTGAATCGAAAG 3'；所述上游引物F标记生物素，下游引物R标记地高辛。 

所述结合垫上包被的胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记8.4μg鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。 

所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。 

PCR反应液组成如下：23μL反应体系包括以下组分 

阴性对照：热带念珠菌； 

阴性对照制备方法：热带念珠菌培养过夜后，作为阴性对照品； 

阳性对照：白色念珠菌； 

阳性对照制备方法：白色念珠菌培养过夜后，作为阳性对照品； 

样品稀释液：PBS溶液(pH7.2)组成为 

氯化钠            8.5g 

氯化钾            2g 

十二水磷酸氢二钠  2.9g 

二水磷酸二氢钠    0.3g 

纯水              1000mL 

PCR反应液、阴性对照、阳性对照储存于－20℃。 

样品稀释液和试纸条常温储存于阴凉干燥处。 

所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处； 

应用本发明试剂盒检测样品中白色念珠菌的方法，包括以下步骤： 

1）取出含有PCR反应液的反应管，待溶化后2000转/分离心30秒； 

2）向反应液管中加入2μL样品DNA，混匀； 

3）将上述反应管置于普通PCR仪中，95℃变性3min后，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环，之后72℃延伸10min，完成PCR扩增； 

4）将上述10μL的扩增产物与90μL的样品稀释液进行混合； 

5）取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品孔中； 

6）反应10min后，根据试纸条层析情况判断检测结果，完成样本检测； 

所述步骤2）中获取样品DNA方法可以根据样品情况采取酚-氯仿抽提法、离心柱提取法、磁珠分离法、煮沸裂解法等，也可采用市售基因组提取试剂盒进行提取。 

结果判定： 

根据试纸条显色情况，直接读取检测结果。 

1）质控标准 

阴性对照仅出现一条红线（在质控线C）。 

阳性对照出现两条红线：一条位于检测线（T），另一条位于质控线（C）。 

每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。 

2）结果描述及判定（见图1） 

仅在质控线C出现一条红线，表示样品中无白色念珠菌或细菌拷贝数低于试剂盒最低检测限； 

出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在白色念珠菌。 

C线未显色，表明不正确的操作过程或检测条已失效。 

注意：在T线显色很深的情况下，可能出现C线显色很浅，属于正常情况。 

本发明试剂盒的技术原理如下： 

根据白色念珠菌的遗传背景信息，选择保守、特异序列进行引物筛选，并使用生物素、地高辛进行引物修饰，使得阳性核酸扩增产物带有双标记。同时胶体金试纸条上金标结合垫上包被鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜的检测线上包被能够与生物素进行特异结合的亲和素，质控线上包被羊抗鼠抗体。在层析过程中阳性扩增物的地高辛标记与金标结合垫上金标复合物-鼠抗地高辛抗体进行结合，之后所带的生物素标记物与硝酸纤维素膜上检测线的亲和素结合，形成“三明治”夹心结构复合物，从而被检测线捕获随之显色，多余的金标复合物继续层析，达到控制线时金标结合垫上金标复合物-鼠抗地高辛抗体与包被的羊抗鼠抗体结合，从而被控制线捕获随之显色。阴性样品则因为没有双标记物的存在在层析过程中不能够被检测线捕获从而不显色。 

有益效果： 

该试剂盒是将PCR扩增技术和免疫层析技术相结合实现对核酸产物的快速检测，PCR扩增后，产物不需要通过复杂的凝胶电泳实验，在10-20min内即可实现对白色念珠菌扩增产物的分 析，与荧光PCR及普通PCR方法相比具有以下特点： 

1.操作简单：只需将核酸产物与一定量样品稀释液混合后滴加在试纸条样品孔即可，无需其他操作； 

2.反应速度快：在10-20min内即可实现对白色念珠菌扩增产物的分析，缩短了检测时间； 

3.低成本：检测不需要复杂的仪器，普通PCR仪即可，也不需昂贵的特殊试剂，检测成本低； 

4.降低了对实验人员的要求：由于该技术不需要复杂的仪器，操作过程简单，检测结果肉眼判读，所以任何人经过自学或者简单的培训即可胜任。 

5.安全性：该技术不需要用到特殊试剂，避开凝胶电泳中EB等污染物，对操作者和试验环境都是安全无害的。 

本发明所研究的白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，使用试纸条直接检测PCR的扩增产物，该反应模式既可以保证灵敏度和特异性，还保留了层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点，使得对PCR扩增产物的分析时间只需要10-20min；实现一步操作，完全省去制胶、电泳、染色分析等一系列复杂操作及相关仪器设备，极大提高了扩增产物分析的效率和成功率、降低了检测成本；同时还实现了对操作人员无毒害、对环境无污染。核酸层析快速检测技术对临床迫切需要明确是否为白色念珠菌感染帮助很大，可协助临床选择最合适的抗真菌药物，此外还可用于连续采集的临床标本，以监视治疗效果及判断预后，缩短临床诊断时间，为疾病的治疗争取时间。同时该试剂盒可在食品、化妆品等检验检疫领域发挥快速筛选的作用，提高检测效率和准确率。 

附图说明

图1试剂盒结果判断； 

图2试剂盒检测特异性； 

图3试剂盒检测灵敏度； 

图4试剂盒结构示意图； 

图中1—吸水垫 2—胶体金结核垫 3—样品垫 4—NC膜 5—背衬 

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。 

实施例1试剂盒的检测特异性 

以葡萄牙假丝酵母ATCC34449（1）、乳酒假丝酵母ATCC66028（2）、克柔念珠菌ATCC14243（3）、热带念珠菌ATCC13803（4）、产朊假丝酵母ATCC9950（5）、近平滑假丝酵母ATCC22019 （6）、光滑假丝酵母ATCC15126（7）为念珠菌验证菌株，其它常见细菌致病菌大肠杆菌（8）、金黄色葡萄球菌（9）、肠炎沙门氏菌（10），提取上述基因组作为模板进行PCR扩增，以白色念珠菌ATCC26790作为阳性对照C⁺，检测结果见图2。 

从图上结果可以看出只在阳性对照（C⁺）白色念珠菌26790处显示阳性，其余为阴性，说明本发明的试剂盒检测特异性好，检测结果准确。 

实施例2试剂盒的灵敏度 

将过夜培养的白色念珠菌ATCC26790标准菌株，用无菌生理盐水将培养液梯度稀释，选择10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL三个浓度各取1mL，按照本发明方法进行检测，判定检测结果，同时做五个平行，以检测出阳性结果的最低浓度作为目标菌株的检测灵敏度，结果见图3。 

从结果可以看出在10³CFU/mL处显示为阳性，10²CFU/mL处检测线不显色结果为阴性，说明本发明试剂盒检测白色念珠菌灵敏度可达到10³CFU/mL。 

实施例3样品检测 

从医疗检测机构获得临床样品60份，使用本发明试剂盒进行检测，同时采用微生物培养检测法（科马嘉念珠菌显色培养基）进行对比验证，结果见表1，与微生物培养检测法结果比较没有显著差异，特异性达到97.1%，符合率为98.3%。 

表1样品检测试验 

χ²=0  P>0.05。 

Claims (8)

1.一种白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成；其特征在于试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5’TTGGTGGTGGTAGACATAGA3'，下游引物R为5'TCAGAACACTGAATCGAAAG3'；所述上游引物F5’端标记生物素，下游引物R5’端标记地高辛；所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线。

2.如权利要求1所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液组成如下：23μL反应体系包括以下组分

3.如权利要求1或2所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，所述PCR反应液中引物F5’端标记的生物素与硝酸纤维素膜上亲和素结合；引物R5’端标记的地高辛与结合垫上胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体结合。

4.如权利要求1或3所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述结合垫上包被胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记8.4μg鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。

5.如权利要求1所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。

6.如权利要求1-5所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处。

7.如权利要求1-6中任一权利要求所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1）取出含有PCR反应液的反应管，待溶化后2000转/分离心30秒；

2）向反应液管中加入2μL样品DNA，混匀；

3）将上述反应管置于普通PCR仪中，95℃变性3min后，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环，之后72℃延伸10min，完成PCR扩增；

4）将上述10μL的扩增产物与90μL的样品稀释液进行混合；

5）取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品孔中；

6）反应10min后，根据试纸条层析情况判断检测结果，完成样本检测；

结果判定：出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在白色念珠菌；仅出现一条红线（在质控线），则样品中不存在白色念珠菌。

8.一种白色念珠菌核酸层析检测试剂盒在检测样品中白色念珠菌中的应用。

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