CN109338015A - 检测fhv-1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测FHV‑1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用。所述检测FHV‑1病毒的引物对包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。所述金标试纸条包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。所述试剂盒包括前述引物对和核酸捕获金标试纸条。本发明检测FHV‑1病毒的检测方法特异性高、灵敏度高、准确、快速，应用前景广阔。

Description

检测FHV-1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种PCR扩增结合核酸分子捕获技术，检测FHV-1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条，相应的试剂盒及其检测应用。

背景技术

猫疱疹病毒(FHV-1)是属于大型的病毒(100～130nm直径)，具有封套及双股的DNA，于细胞核内进行增殖，并形成核内包涵体。

猫病毒性鼻气管炎是由猫疱疹病毒引起的一种上呼吸道传染疾病，在猫与猫之间互相传播，死亡率极高，早期的临床症状包括：沉郁、打喷嚏和咳嗽，接着就出现畏光、结膜炎、和浆液性的眼和鼻分泌物，体温并且快速地提升，阵发性的打喷嚏、深部的气管咳嗽、舌头和上颔的溃疡等症状也常发生；如果再有细菌的继发性感染，那么眼和鼻的分泌物就会呈现脓状。慢性感染的病例可能会出现慢性鼻窦炎、溃疡性角膜炎和全眼炎，年轻的仔猫感染可能会造成严重的结膜炎，溃疡性的角膜炎最后可能导致全眼炎和失明。因此，建立FHV-1快速检测方法在猫病害筛查和控制上显得尤为重要。

目前检测FHV-1的常见方法有：酶联免疫法，但是该方法灵敏度低，假阳性高，易造成误检；荧光定量PCR法，该方法灵敏度较高，但仪器成本投入较大，对操作人员要求较高。此外，还有斑点杂交法、southern杂交法等，但这些方法假阳性高，操作繁琐，耗时较长。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种用于FHV-1 PCR扩增和核酸捕获的特异性引物，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一主要目的在于提供一种FHV-1核酸捕获金标试纸条。

本发明的另一目的还在于提供一种用于FHV-1 PCR扩增和核酸捕获的试剂盒。

本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒在制备检测FHV-1病毒的产品中的用途。

本发明的另一目的还在于提供一种包含前述的用于FHV-1 PCR扩增和核酸捕获的试剂盒的产品。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测FHV-1病毒的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

进一步地，所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记。

进一步地，所述上游引物标记的生物素为地高辛，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸。

本发明实施例还提供了一种检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条，包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。

本发明实施例还提供了一种检测FHV-1病毒的试剂盒，其包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为前述的检测FHV-1病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条。

本发明实施例还提供了前述的检测FHV-1病毒的试剂盒于制备检测FHV-1病毒的产品中的用途。

进一步地，应用所述产品检测FHV-1病毒的方法包括：

提供前述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒。

本发明实施例还提供了一种包含前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于FHV-1病毒的检测方法，所述检测方法包括：

提供前述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明以FHV-1的gC基因的保守区域设计生物素标记引物，用以FHV-1的定性检测，引物具有极高的扩增效率和特异性；

2)本发明的上下游引物两端采用不同生物素标记，分别与核酸捕获金标试纸条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，特异性好，灵敏度高，能快速、简便地检测FHV-1病毒；

3)本发明提供的核酸捕获金标试纸条的检测线包被上游引物标记生物素的抗体，金标结合垫上干燥有胶体金偶联下游引物标记生物素的抗体，由于本发明的试纸条采用了核酸捕获的方法，经PCR扩增后样本含量得到了几何级数的放大，因此大大提高了检测灵敏度；

4)本发明提供的核酸捕获金标试纸条对PCR产物进行一定量的稀释，再进行上样，可进一步提高胶体金试纸条的检测灵敏度。

综上所述，本发明利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对FHV-1重新设计、标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了核酸捕获金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为猫病毒性鼻气管炎的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。

附图说明

图1是实施例1中FHV-1病毒以FHV/gC244、FHV/gC250、FHV/gC294、FHV/gC210四对引物分别进行PCR扩增的电泳图。

图2是检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的检测原理示意图。

图3是检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图截面图。

图4是检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图俯视图。

图5是设有壳体的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图截面图。

图6是设有壳体的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图俯视图。

图7是检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条判读结果标准示意图。

图8是实施例5中FHV-1灵敏度实验PCR产物电泳示意图。

图9是实施例5中FHV-1PCR产物金标试纸条检测灵敏度实验结果图。

附图标记说明：1-衬板，2-样品垫，3-金标结合垫，4-包被膜，5-检测印迹线，6-对照印迹线，7-吸水垫，81-样品浸入端保护膜，82-手柄端保护膜，9-样品标记线，10-加样孔，11-观察窗，12-面板，13-定位槽，14-底座，15-凹槽，16-凸条。

具体实施方式

鉴于当前ELISA和免疫胶体金技术存在的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是采用PCR核酸扩增与免疫层析相结合的方法，以FHV-1的gC基因的保守区域设计生物素标记引物，PCR产物与金标试纸条结合并显色，根据显色结果，对猫疱疹病毒进行定性检测，具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于宠物疾病中猫病毒性鼻气管炎的快速检测。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。

在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：

采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。

本发明实施例的一个方面提供了一种检测FHV-1病毒的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

进一步地，所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记。

进一步地，所述上游引物标记的生物素为地高辛(Digoxigenin)，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸(FITC)。本发明的上下游引物两端采用不同生物素标记，分别与核酸捕获金标试纸条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，特异性好，灵敏度高，能快速、简便地检测FHV-1病毒。

本发明的引物根据FHV-1的gC基因的保守区域设计，用以FHV-1的定性检测。

进一步地，所述引物对的上游引物具有序列表中FHV-1-gC-F的核苷酸序列，下游引物具有序列表中FHV-1-gC-R的核苷酸序列。

进一步地，所述引物对所含引物序列如下表1：

本发明以FHV-1的gC基因的保守区域设计生物素标记引物，用以FHV-1的定性检测，引物具有极高的扩增效率和特异性。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条(检测原理可参见图2)，包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。

在一些实施例中，所述检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条还包括第一保护膜和第二保护膜，所述第一保护膜的至少局部区域覆设于所述样品垫和金标结合垫上，所述第二保护膜的至少局部区域覆设于所述吸水垫上。

进一步地，所述第一保护膜的上表面设置有样品标记线。

在一些实施例中，所述检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳包括相互配合连接的底座和面板，所述底座包括定位槽，所述衬板卡设于所述定位槽内，所述面板上开设有观察窗和加样孔，所述观察窗与所述包被膜的位置对应，所述加样孔与所述样品垫的位置对应。

进一步地，所述底座的上端面设置有凸条，所述面板与底座相配合的一面上开设有与所述凸条相配合的凹槽，所述凸条与凹槽能够插接相连，实现底座和面板的连接。

进一步地，所述包被膜上的隐性检测区和隐形对照区均为线条型，即可分别为检测印迹线和对照印迹线。

进一步地，所述衬板为硬质PVC塑胶条，但不限于此。

进一步地，所述样品垫为聚酯膜，但不限于此。

进一步地，所述包被膜为硝酸纤维素膜，但不限于此。

进一步地，所述吸水垫为滤纸或滤油纸，但不限于此。

在一些较为具体的实施案例中，所述检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条的结构参见图3-图4所示，其包括长条型衬板1，衬板1的上表面从一端到另一端依次粘贴有样品垫2、吸附有FITC金标抗体的金标结合垫3、包被膜4及吸水垫7，所述包被膜4上印制有地高辛抗体的隐形检测印迹(即检测印迹线5)和羊抗鼠二抗的隐形对照印迹(即对照印迹线6)，所述吸水垫7是滤纸或滤油纸。

所述金标试纸条的两端覆有保护膜，一端是样品浸入端保护膜81覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，该样品浸入端保护膜81上印制有样品标记线9；另一端的手柄端保护膜82覆盖在吸水垫7上。

参见图5和图6所示，所述核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳由底座14和面板12组成，所述底座14设有用于固定衬板1的定位槽13，所述面板12上设有观察窗11和加样孔10，所述底座14和面板12之间以凹槽15和凸条16插接相连。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测FHV-1病毒的试剂盒，其包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为前述的检测FHV-1病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条。

在一些实施例中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件。

进一步地，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液和DNA聚合酶。

更进一步地，30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的检测FHV-1病毒的试剂盒于制备检测FHV-1病毒的产品中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种应用所述产品检测FHV-1病毒的方法，其包括：

提供前述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒。

本发明提供了提供最适PCR扩增体系和条件，具有极高的扩增效率。

进一步地，所述30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。

进一步地，所述FHV-1病毒PCR扩增的条件为：

预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；

PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；

其后，在70～75℃延伸保温5～10min。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于FHV-1病毒的检测方法，所述检测方法包括：

提供前述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与前述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入前述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒。

本发明提供了提供最适PCR扩增体系和条件，具有极高的扩增效率。

进一步地，所述30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。

进一步地，所述FHV-1病毒PCR扩增的条件为：

预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；

PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；

其后，在70～75℃延伸保温5～10min。

以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例1用于对FHV-1进行PCR的引物设计

参照GenBank收录的FHV-1基因组序列，选择FHV-1的gC基因保守区域，采用ABIPrimerExpress 3.0PCR引物设计软件，设计合成引物。

其中的典型的引物对序列如下：

如图1所示，针对FHV-1病毒设计的四对引物对，进行PCR扩增实验，电泳结果则说明了FHV/gC210对引物扩增效率最高，因此本实验使用FHV/gC210-F和FHV/gC210-R作为FHV-1病毒的检测序列，其序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

其中图2中编号1的扩增片段条带为引物对FHV/gC244的PCR扩增产物；图2中编号2的扩增片段条带为引物对FHV/gC250的PCR扩增产物；图2中编号3的扩增片段条带为引物对FHV/gC294的PCR扩增产物；图2中编号4的扩增片段条带为引物对FHV/gC210的PCR扩增产物。

实施例2 PCR实验

一、磁珠法提取核酸

1.1样品处理

取宠物粪便或鼻腔分泌物样品于1mL生理盐水或1×PBS(0.01M，pH7.2)中，制备成匀浆。2000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管中。

1.2核酸制备

1.2.1无菌条件下将样本液体混合均匀后，取300μL样品于1.5mL洁净离心管中，加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K，56℃水浴30min。

1.2.2磁珠使用前须于37℃温育10min，用手轻轻摇匀使之呈现悬浮状态。

1.2.3经水浴裂解完毕的样品中，加入15μL已加热混匀的磁珠，再加入250μL的结合液，涡旋混匀。

1.2.4将离心管于混合仪旋转混合10min(转速0.83～0.85转/s)。

1.2.5混合完毕，于磁力架固定吸附，肉眼观察，磁珠完全被吸附至磁铁一侧即可(约需要10～15s)，用移液器吸去离心管内清液，加入500μL漂洗液漂洗磁珠，每次注入漂洗液后轻轻摇匀5s，再次固定于磁力架，10s后再次完全吸去清液，重复漂洗三次。

1.2.6将离心管从磁力架上取下，开盖放置5min使乙醇完全挥发。

1.2.7加入100μL洗脱液，超声分散附着在离心管壁的磁珠(超声时间大约45s，时间不宜过长以免DNA断裂)，期间不断取出摇匀肉眼观察分散情况。

1.2.8水浴65℃，10min，然后置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸取清液至新的洁净1.5mL离心管中，即得到DNA溶液。

二、生物素标记PCR引物

所述的引物修饰为：上游引物是地高辛(Digoxigenin)修饰，下游引物是FITC修饰。

2.1 FHV-1生物素标记引物

F：5’-Digoxigenin-GAAAAGTGTAGCCCCGGACG-3’20bp

R：5’-FITC-CACGGGTCCATCCGTTTCTG-3’20bp

三、PCR反应体系构建及反应条件确立

3.1 PCR反应体系

PCR	Total(30μl)
		预混液	15μl
上游引物(10μM)	1μl
		下游引物(10μM)	1μl
模板	1μl
		双蒸水	12μl

3.2PCR反应条件

3.2.1FHV-1PCR反应条件

94℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环后进入72℃，7min；4℃保存。

用上述引物跑完PCR电泳图如图8，电泳条带清晰可见。

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含FHV-1的样品作阳性对照，用已知不含FHV-1的样品作阴性对照，用等体积的DEPC水代替模板DNA作空白对照。

实施例3、胶体金标试纸条制作

3.1制金

3.1.1向装有磁力搅拌子的洁净锥形瓶，加入1ml氯金酸(5g/L)，超纯水稀释到50ml，用保鲜膜封口。

3.1.2将锥形瓶置于磁力搅拌器上，打开搅拌器，调整锥形瓶位置使搅拌子位于锥形瓶中间，同时缓慢增大搅拌速度，至转速1300±20r/min，保证磁力搅拌子在锥形瓶中央稳定搅拌后，关闭搅拌器，停止搅拌，将加热旋钮调至最大，开始加热。

3.1.3当瓶中液体开始暴沸，开启搅拌器，同时向瓶中快速加入1000μL柠檬酸三钠溶液(1％)。

3.1.4持续加热搅拌，待液体颜色由黑色逐渐变至酒红色稳定后，开始计时，继续加热搅拌5min后，停止加热搅拌。

3.1.5自然冷却至室温，封口膜封口，2-8℃保存，效期6个月。

3.2.金标结合垫制作

3.2.1取1000μL胶体金注入1.5ml锥形离心管，加入10μL碳酸钾溶液(0.1mol/L)，涡旋仪振荡6s混匀。

3.2.2加入6μl Anti-FITC(1mg/ml)，涡旋仪振荡6s。

3.2.3于旋转混合仪上振荡反应60min。

3.2.4加入80μL BSA溶液(10％)，涡旋仪振荡6s。

3.2.5于3D旋转混合仪振荡封闭30min。

3.2.6冷冻离心机上以r＝11000r/min、t＝4℃离心15min。(注意：离心前对称位置离心管重量需配平，相对质量误差≤20mg)

3.2.7配制重悬液：离心结束用移液枪快速吸取底部20μL酒红色沉淀物转移至200μL的PCR管中(注意：尽量避免吸取上清)，加入10μL蔗糖溶液(10％)和70μL BSA溶液(10％)，涡旋仪振荡8s。

3.2.8重悬液6μL/片滴加在金标结合垫(4*6mm/片)上，25℃干燥2h。

3.3NC膜固定抗体：喷金划膜仪将抗体划到NC膜，于烘箱37℃干燥2h。

检测线(T)：Anti-Digoxigenin抗体浓度：1mg/ml,划线量：0.8μL/cm。

质控线(C)：羊抗鼠二抗(H+L)抗体浓度：1mg/ml,划线量：0.8μL/cm。

3.4附件制作及切割

3.4.1附件制作

3.4.1.1样品垫制备：将玻璃纤维板裁切成17*300mm宽度长条，样品垫处理液浸泡120min后，放置在含有泡沫棉的纸盒中，37℃烘箱烘干，时间120min。

3.4.1.2吸水纸制备：将纸板裁切19*300mm宽度长条，待用。

3.5组装

组装详见图3-6。

3.5.1样品垫组装

样品垫贴合位置与PVC底板齐平。

将PVC底板19mm宽度一侧不干胶揭除，样品垫贴合位置与PVC底板齐平。

3.5.2吸水纸组装

将PVC底板17mm宽度一侧不干胶揭除，吸水纸贴合至相应位置，一侧于PVC底板边缘齐平，另一侧压覆于NC膜上(压覆尺寸2.0±0.3mm)。

3.5.3切条

将组装好的PVC板放置切条机进板口，调整限位板，空隙≤0.5mm。调整滚轮压入底板，设定切条宽度4mm，切条。

3.5.4金标结合垫安装

用镊子将样品垫掀起，再用另外一把镊子将铺金干燥好的金标结合垫填放在样品垫和NC膜中间，调整金标结合垫与NC膜压覆尺寸2.0±0.2mm。

实施例4、判读标准

4.1试纸条上样

取6μL PCR产物，加入54μL上样稀释液，混匀后垂直缓慢滴加于试条样品孔中，3-5分钟之间观察结果。

4.2结果判定

试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为阳性。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性，详见图7。

4.3表述

阳性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)变红色，检测结果为阳性，判定为检出FHV-1。

阴性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)不变色，检测结果为阴性，判定为未检出FHV-1。

4.4质量控制

以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

A)空白对照：质控线变红，检测线未变红。

B)阴性对照：质控线变红，检测线未变红。

C)阳性对照：质控线变红，检测线变红。

实施例5、FHV-1PCR产物试纸条检测灵敏度实验

为了验证该方法对FHV-1检测的灵敏度，将FHV-1的质粒DNA梯度稀释，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测(结果见图8)，当质粒DNA浓度为1fg时，FHV-1仍然有很清晰的条带。PCR-试纸条检测(结果见图9)，当质粒DNA浓度为1fg时，FHV-1试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带。

实施例6、FHV-1PCR扩增结合核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒

将用于对猫病毒性鼻气管炎(猫疱疹病毒FHV-1)核酸进行PCR检测的修饰引物FHV-1-gC-F(10μM)50μL，FHV-1-gC-R(10μM)50μL以及Premix Ex Taq 0.8mL、FHV-1质粒DNA(30ng/μL)20μL、超纯水1.5mL、上样样品稀释液5mL、成品试纸条48条共同包装，得到猫病毒性鼻气管炎(猫疱疹病毒FHV-1)PCR产物核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对FHV-1重新设计、标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了核酸捕获金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为猫病毒性鼻气管炎的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州蝌蚪生物技术有限公司

<120> 检测FHV-1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gaaaagtgta gccccggacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cacgggtcca tccgtttctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gtgtaccacg ggacgggata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ctgacgattt caggggacgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ctacgtcaca gccgttggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

catggcgtct aatcggtcgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

atactgtccg catttacata ga 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

cggaatagcc aacacagaa 19

Claims (10)

1.一种检测FHV-1病毒的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的检测FHV-1病毒的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记；优选的，所述上游引物标记的生物素为地高辛，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸。

3.一种检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条，包括衬板，其特征在于：所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。

4.根据权利要求3所述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条，其特征在于还包括第一保护膜和第二保护膜，所述第一保护膜的至少局部区域覆设于所述样品垫和金标结合垫上，所述第二保护膜的至少局部区域覆设于所述吸水垫上；优选的，所述第一保护膜的上表面设置有样品标记线；

和/或，所述检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳包括相互配合连接的底座和面板，所述底座包括定位槽，所述衬板卡设于所述定位槽内，所述面板上开设有观察窗和加样孔，所述观察窗与所述包被膜的位置对应，所述加样孔与所述样品垫的位置对应；优选的，所述底座的上端面设置有凸条，所述面板与底座相配合的一面上开设有与所述凸条相配合的凹槽，所述凸条与凹槽能够插接相连，实现底座和面板的连接。

5.根据权利要求3所述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条，其特征在于：所述包被膜上的隐性检测区和隐形对照区均为线条型；和/或，所述衬板包括硬质PVC塑胶条；和/或，所述样品垫包括聚酯膜；和/或，所述包被膜包括硝酸纤维素膜；和/或，所述吸水垫包括滤纸或滤油纸。

6.一种检测FHV-1病毒的试剂盒，其特征在于包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为权利要求1或2所述的检测FHV-1病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为权利要求3-5中任一项所述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增检测的常规组件；优选的，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液和DNA聚合酶。

8.权利要求6-7中任一项所述的检测FHV-1病毒的试剂盒于制备检测FHV-1病毒的产品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测FHV-1病毒的方法包括：

提供权利要求1或2所述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与权利要求6-7中任一项所述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入权利要求3-5中任一项所述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒；

优选的，所述FHV-1病毒PCR扩增的条件为：

预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；

PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；

其后，在70～75℃延伸保温5～10min。

10.一种包含权利要求6-7中任一项所述的检测FHV-1病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于FHV-1病毒的检测方法，所述检测方法包括：

提供权利要求1或2所述的检测FHV-1病毒的引物对和阳性样本；

使所述引物对与权利要求6-7中任一项所述的检测FHV-1病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；

之后对所述混合液进行PCR扩增；

将所获PCR扩增产物加入权利要求3-5中任一项所述的检测FHV-1病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含FHV-1病毒；

优选的，所述FHV-1病毒PCR扩增的条件为：

预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；

PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；

其后，在70～75℃延伸保温5～10min。