CN105002282A - 核酸检测试纸条及其制备方法和检测核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线，其特征在于，所述连接垫上结合有碱性磷酸酶，所述检测线上结合有能与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，所述控制线上结合有通用探针，并且所述通用探针被生物素标记与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。本发明还涉及包括所述试纸条的试剂盒、所述试纸条的制备方法，以及一种检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种试纸条、尤其涉及一种检测试纸条。本发明还涉及包括所述试纸条的试剂盒、所述试纸条的制备方法，以及一种检测方法。
背景技术
以免疫反应为基础的胶体金(试纸条)检测技术是一种目前十分成熟的蛋白质快速检测技术，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原-抗体-有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成有色沉淀线。
目前市面的核酸试纸条检测技术主要是利用蛋白胶体金原理，主要是在PCR上下游引物的5’端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素；核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素及抗荧光素抗体。在扩增产物与扩展液混合后点在试纸条上时，当有扩增产物时，产物上修饰的生物素与金标上修饰的异硫氰酸荧光素的胶体金结合，到达检测线时，线上的抗荧光素抗体将标有荧光素的产物捕获，从而显色；多余的胶体金向质控线时与生物素结合而显色。此方法的不足是易产生引物二聚体，会有假阳性出现，特异性不够好。因此，本领域亟需一种特异性更好的用核酸检测试纸条来检测核酸的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种使用探针标记及特异性杂交的核酸试纸条技术进行核酸检测的技术，具有操作简单，灵敏度较好的特点。
本发明利用核酸试纸条上连接垫处的碱性磷酸酶处理和检测线和控制线处特异性探针设计以及针对整个试纸条的温育处理，通过探针的特异性杂交并利用底物显色而达到检测效果。
本发明提供了一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线，其特征在于，所述连接垫上结合有碱性磷酸酶，所述检测线上结合有能与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，所述控制线上结合有通用探针，并且所述通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。在本发明的一个优选的实施方式中，所述杂交指所述特异性探针与所述待检测的目的核酸或其片段互补。
其中，本发明用碱性磷酸酶代替传统的胶体金，与标有生物素的扩增产物进行结合。
在检测线处结合与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，当经过碱性磷酸酶处理的扩增产物经过检测线时，如有目的产物则其会与目的产物特异性结合，最终会显色而达到检测目的；如没有目的产物，则由于探针没有特异性杂交而不会出现颜色。
控制线处的通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补，只要有扩增产物和/或引物经过即会在显色底物作用下显色，达到质检的目的。
本发明的另一个目的在于，提供一种核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的核酸检测试纸条，以及显色底物。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述显色底物为3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。
本发明的再一个目的在于，提供一种制备上述的核酸检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线的试纸条；
2)在连接垫处用碱性磷酸酶处理；
3)在检测线处用与待检测的目的核酸杂交的特异性探针处理；
4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理。
本发明的又一个目的在于，提供一种用核酸试纸条来检测核酸的方法，包括如下步骤：
1)根据待检测的目的核酸制备与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，并由此制备上述的核酸检测试纸条或者上述的核酸检测试剂盒；
2)提取并用被生物素标记的上游引物和/或下游引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对试纸条在20-60摄氏度、优选38-42摄氏度下进行提前温育10分钟以上，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤1)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在40摄氏度下温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察结果，或者
向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，在向步骤1)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物的同时在38-42摄氏度下温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选10-15分钟，观察结果。
在本发明所限定的温度下进行温育，尤其是在本发明所优选的温度下进行温育，能保证杂交结果的稳定性。
对于实验结果：当控制线和检测线都显色时，检测结果为阳性；当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
在本发明的一个优选地实施方式中，在步骤1)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补，
并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。
在本发明的另一个优选地实施方式中，在步骤1)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
本发明的有益效果在于：将蛋白质快速检测技术的原理用于核酸诊断，将能把核酸诊断的高度敏感性和特异性与蛋白质检测技术的成熟性和快速性相结合，创造出一种新型的快速核酸诊断试剂，操作简单，灵敏度较好；利用核酸试纸条上探针的特异性杂交，保证了检测结果的特异性，较传统核酸试纸条检测，虽然多了一个温育杂交的过程，但是带来了更多的方便：本发明利用探针杂交显色，背景色对实验结果的判读几乎不会产生影响；同时其避免了因引物二聚体而产生的假阳性对检测结果的影响。
附图说明
图1为核酸试纸条的结构示意图。其中1为样品垫，2为连接垫(此处用碱性磷酸酶处理)，3为纤维膜，4为吸附垫，5为检测线(使用特异性探针处理)，6为控制线(使用通用探针处理)。
图2为试纸条检测结果显示示意图。其中，当检测线和控制线处均有条带时为阳性(如图2的左图)，当只有控制线有色时为阴性(如图2的右图)。
具体实施方式
以下结合非限制性的具体实施例来对本发明进行进一步的说明。
实施例中的核酸探针及引物均购于上海生工生物。
实施例1：人乳头瘤病毒(HPV)核酸的检测
1.HPV通用引物及探针的设计采购。均购于上海生工生物。
2.核酸试纸条的制备:如图1所示，在连接垫处使用碱性磷酸酶处理，然后在检测线处使用与目的产物能特异性杂交的探针进行处理；在控制线处使用通用探针，该通用探针被设计为与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补。
3.HPV核酸样本的提取：所述HPV核酸样本是从江苏省某医院HPV患者的宫颈脱落细胞标本提取的。用核酸提取试剂盒进行提取，主要利用煮沸裂解法进行核算的提取。
4.PCR扩增：根据步骤2和3中的试剂及核酸样本进行PCR体系配制，共20ul体系，包括19ul的PCR反应液和1ul的模板。其中，上游引物上标记有生物素。按照如下程序进行PCR扩增：
50℃ 2min,94℃ 4min；
94℃ 30sec,60℃ 45sec,72℃ 20sec,35 cycles；
4℃ hold.
扩增完成后保存待用。
5.提前对步骤2中的核酸试纸条进行恒温处理，温度为40摄氏度。
6.向步骤4中的扩增产物加入扩展液及显示底物，混匀后向试纸条样品垫上滴加10ul，反应15分钟后观察结果。
7.根据试纸条上检测线，控制线的显色情况，具体显色情况如图2：当控制线和检测线都显色时，检测结果为阳性；当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (7)
1.一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线，其特征在于，所述连接垫上结合有碱性磷酸酶，所述检测线上结合有能与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，所述控制线上结合有通用探针，并且所述通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。
2.一种核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的核酸检测试纸条，以及显色底物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3-氨基-9-乙基咔唑。
4.一种制备根据权利要求1所述的核酸检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线的试纸条；
2)在连接垫处用碱性磷酸酶处理；
3)在检测线处用与待检测的目的核酸杂交的特异性探针处理；
4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理。
5.一种用核酸试纸条来检测核酸的方法，包括如下步骤：
1)根据待检测的目的核酸制备与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，并由此制备根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒；
2)提取并用被生物素标记的上游引物和/或下游引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对试纸条在20-60摄氏度、优选38-42摄氏度下进行提前温育10分钟以上，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤1)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在40摄氏度下温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察结果，或者
向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，在向步骤1)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物的同时在38-42摄氏度下温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选10-15分钟，观察结果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补，
并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151028 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |