CN105039550A - 利用核酸试纸条进行分型检测方法及其应用 - Google Patents

利用核酸试纸条进行分型检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用核酸试纸条进行分型检测方法，包括如下步骤：1)制备用于分型检测的核酸试纸条；2)提取并用被生物素标记的引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸；3)对步骤1)获得的试纸条在30-50摄氏度下进行提前温育，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤1)制备得到的试纸条的样品垫上滴加1-100微升混匀后的混合物，再在30-50摄氏度下进一步温育，观察试纸条检测结果；4)制备标准板；5)将试纸条检测结果与标准板进行比对，获取具体的检测型别。本发明还涉及另一种检测方法，以及所述检测方法的应用。

Description

利用核酸试纸条进行分型检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其涉及一种核酸检测方法。本发明还涉及另一种检测方法，以及所述检测方法的应用。
背景技术
以免疫反应为基础的胶体金(试纸条)检测技术是一种目前十分成熟的蛋白质快速检测技术，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原-抗体-有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成有色沉淀线。将蛋白质快速检测技术的原理用于核酸诊断，将能把核酸诊断的高度敏感性和特异性与蛋白质检测技术的成熟性和快速性相结合，创造出一种新型的快速核酸诊断试剂。
目前市面的核酸试纸条检测技术主要是利用蛋白胶体金原理，核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素及抗荧光素抗体，通过与pcr扩增产物上的荧光素和生物素结合，来对目的产物进行捕获，但是受限于抗荧光素抗体及生物素种类的限制，只能进行单一的核酸检测；当涉及基因多态性检测或者一些进行分型检测时，不能实现在同一试纸条上的检测；并且容易出现因引物而具体的产生而出现的假阳性，影响检测结果的准确性。因此，本领域亟需一种能够利用核酸试纸条进行分型检测的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用核酸试纸条上的特异性探针与目的产物的特异性杂交而进行基因分型检测的技术，具有特异性好，分型效果好，分型通量高的特点。
在本发明的一个优选的实施方式中，在核酸试纸条上设置多条检测线，并在每条检测线处用特异性探针处理；通过特异性探针与对应的目的基因片段的杂交反应，再在显色底物的作用下完成核酸试纸条的分型检测。
本发明提供了一种利用核酸试纸条进行分型检测的方法，包括如下步骤：
1)制备用于分型检测的核酸试纸条：
1-1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有两条或两条以上的检测线和一条或多条控制线的试纸条(如图1所示)；
1-2)在连接垫处用碱性磷酸酶处理；
1-3)在两条或两条以上的检测线处分别用与待检测的目的分型型别对应的特异性探针处理；
1-4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理；
2)提取并用生物素标记的引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对步骤1)获得的试纸条在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进行提前温育，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤1)制备得到的试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进一步温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察试纸条检测结果；
4)制作标准板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置标示控制线；
5)将试纸条检测结果与标准板进行比对，获取待检测的目的核酸的分型结果。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-2)中在试纸条的连接垫处用碱性磷酸酶处理，是用于和扩增产物上的生物素结合，以便显色。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-3)中在检测线处分别用对应的特异性探针处理，当标记有生物素的扩增产物在连接垫处与碱性磷酸酶酶结合后，当经过各检测线时与对应的探针杂交，在显色底物作用下显色，若没有对应产物则不会发生杂交反应。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-3)中与待检测的目的分型型别对应的特异性探针是指与待检测的目的分型型别DNA或其片段互补的特异性探针。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-4)中在控制线处，控制线处的通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补，只要有扩增产物和/或引物经过即会在显色底物作用下显色，达到质检的目的。
在本发明的一个优选的实施方式中，步骤3)中所述的提前温育和/或进一步温育为恒温温育。
在本发明的一个优选的实施方式中，当扩增产物加入扩展液及显色底物后点在样品垫上后，经与连接垫处的碱性磷酸酶结合，在经过检测线时，目的产物即会与相对应的探针特异性杂交并在显色底物作用下显色，而其他检测线不会出现显色；控制线处通用探针上的生物素与碱性磷酸酶直接结合显色，达到质控的作用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述检测线的数目为两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十二条、十四条、十五条、十六条、十八条或二十条。在本发明的一个更加优选的实施方式中，所述检测线的数目为两条、三条、四条或五条。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
对于检测结果：当控制线和对应于某一型别的检测线都显色时，检测结果为该型别阳性当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
本发明的另一个目的在于，提供另一种利用核酸试纸条进行分型检测的方法，包括如下步骤：
1)制备用于分型检测的核酸试纸条：
1-1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有两条或两条以上的检测线和一条或多条控制线的试纸条；
1-2)在连接垫处用结合有异硫氰酸荧光素的胶体金处理；
1-3)在两条或两条以上的检测线处分别用与待检测的目的分型型别对应的特异性探针处理；
1-4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理；
2)提取并用生物素标记的引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对步骤1)获得的试纸条在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进行提前温育，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液并混匀，向步骤1)制备得到的试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进一步温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察试纸条检测结果；
4)制作标准板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置标示控制线；
5)将试纸条检测结果与标准板进行比对，获取待检测的目的核酸的分型结果。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-2)中在试纸条的连接垫处用经异硫氰酸荧光素结合的胶体金处理，用于和扩增产物结合，以便显色。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-3)中根据检测的需求设置多条检测线，并在检测线处分别用对应的特异性探针处理，当扩增产物在连接垫处与胶体金结合后，当经过各检测线时与对应的探针杂交，若没有对应产物则不会发生杂交反应。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-3)中与待检测的目的分型型别对应的特异性探针是指与待检测的目的分型型别DNA或其片段互补的特异性探针。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-4)在控制线处，用被与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理，只要有经异硫氰酸荧光素结合的胶体金经过即会显色，达到质检的目的。
在本发明的一个优选的实施方式中，步骤3)中所述的提前温育和/或进一步温育为恒温温育。
在本发明的一个优选的实施方式中，当扩增产物加入扩展液后点在样品垫上后，经与连接垫处的胶体金结合，在经过检测线时，目的产物即会与相对应的探针特异性杂交并显色，而其他检测线不会出现显色；控制线处通用探针经异硫氰酸荧光素结合的胶体金直接结合显色，达到质控的作用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述检测线的数目为两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十二条、十四条、十五条、十六条、十八条或二十条。在本发明的一个更加优选的实施方式中，所述检测线的数目为两条、三条、四条或五条。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
在本发明的另一个优选的实施方式中，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。
对于检测结果：当控制线和对应于某一型别的检测线都显色时，检测结果为该型别阳性当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
本发明的再一个目的在于，提供上述的方法在人乳头瘤病毒核酸分型检测、地中海贫血分型检测、SNP分型检测和HCV分型检测中的一种或多种中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明利用核酸试纸条上特异性探针与目的产物的特异性杂交而完成基因分型的目的，探针的特异性杂交即保证了检测结果的特异性，各检测线出的探针设计保证了多型别的同时检测；同时由于探针的特异性，避免了背景色及引物二聚体对本发明的检测结果影响；操作简单，分型通量高，分型效果好。
附图说明
图1为用于分型检测的核酸试纸条的示意图。其中，1为样品垫，2为连接垫，3为纤维膜，4为检测线a，5为检测线b，6为检测线c，7为控制线，8为吸附垫。
图2为用于分型检测的核酸试纸条的检测标准板及检测结果的示意图。其中，A为标准板：1.连接垫，2.型别a，3.型别b，4.型别c，5.控制线；B为型别a的检测结果；C为型别b的检测结果；D为型别c的检测结果。E为阴性检测结果。将实验检测结果通过与标准板比对来获取最终的分型结果。
具体实施方式
以下结合非限制性的具体实施例来对本发明进行进一步的说明。
实施例中的核酸探针及引物均购于上海生工生物。
实施例1：人乳头瘤病毒(HPV)核酸分型(16，18)检测
1.HPV通用引物及探针的设计采购。均购于上海生工生物。
2.核酸试纸条的制备：如图1所示制备试纸条(忽略检测线c)，在连接垫处使用碱性磷酸酶处理，然后在检测线a处使用16型别探针处理，检测线b处使用18型别探针处理；在控制线处使用通用探针，并且所述通用探针被设计为与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。
3.HPV核酸样本的提取：用核酸提取试剂盒进行提取，试剂盒为本公司自己生产，主要利用煮沸裂解法进行核酸的提取。
4.PCR扩增：根据步骤2，3中的试剂及核酸样本进行PCR体系配制，共20ul体系，包括19ul的PCR反应液和1ul的模板。引物被生物素标记。按照如下程序进行PCR扩增：
50℃2min,94℃4min；
94℃30sec,60℃45sec,72℃20sec,35cycles；
4℃hold.
扩增完成后保存待用。
5.提前对步骤2中的核酸试纸条进行恒温处理，温度为40摄氏度。
6.向步骤4中的扩增产物加入扩展液及显示底物，混匀后向试纸条样品垫上滴加10ul，40摄氏度下进一步反应15分钟后观察结果。
7.制作标准比对板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条一个与试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别各相同位置标识标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置控制线出标示标明控制线。
8.根据试纸条上检测线，控制线的显色情况，具体显色情况的分型结果如图2所示：当控制线和16型检测线都显色时，检测结果为16型阳性；当控制线和18型检测线都显色时，检测结果为18型阳性；当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
实施例2：人乳头瘤病毒(HPV)核酸分型(16，18，6，11)检测
1.HPV通用引物及各型别探针的设计采购。均购于上海生工生物。
2.核酸试纸条的制备：如图1所示制备试纸条(检测线d未显示)，在连接垫处用经异硫氰酸荧光素结合的胶体金处理，然后在检测线a处使用16型别探针处理，检测线b处使用18型别探针处理，检测线c处使用6型别探针处理，检测线d处使用11型别探针处理；在控制线处使用通用探针，并且所述探针被设计为与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。
3.HPV核酸样本的提取：用核酸提取试剂盒进行提取，试剂盒为本公司自己生产，主要利用煮沸裂解法进行核酸的提取。
4.PCR扩增：根据步骤2，3中的试剂及核酸样本进行PCR体系配制，共20ul体系，包括19ul的PCR反应液和1ul的模板。引物被生物素标记。按照如下程序进行PCR扩增：
50℃2min,94℃4min；
94℃30sec,60℃45sec,72℃20sec,35cycles；
4℃hold.
扩增完成后保存待用。
5.提前对步骤2中的核酸试纸条进行恒温处理，温度为40度。
6.向步骤4中的扩增产物加入扩展液及显示底物，混匀后向试纸条样品垫上滴加10ul，反应15分钟后观察结果。
7.制作标准板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置标示控制线。
8.根据试纸条上检测线，控制线的显色情况，具体显色情况的分型结果如示意图2：当控制线和16型检测线都显色时，检测结果为16型阳性；当控制线和18型检测线都显色时，检测结果为18型阳性；当控制线和6型检测线都显色时，检测结果为6型阳性；当控制线和11型检测线都显色时，检测结果为11型阳性；当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种利用核酸试纸条进行分型检测的方法，包括如下步骤：
1)制备用于分型检测的核酸试纸条：
1-1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有两条或两条以上的检测线和一条或多条控制线的试纸条；
1-2)在连接垫处用碱性磷酸酶处理；
1-3)在两条或两条以上的检测线处分别用与待检测的目的分型型别对应的特异性探针处理；
1-4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理；
2)提取并用被生物素标记的上游引物和/或下游引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对步骤1)获得的试纸条在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进行提前温育，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤1)制备得到的试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进一步温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察试纸条检测结果；
4)制作标准板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置标示控制线；
5)将试纸条检测结果与标准板进行比对，获取待检测的目的核酸的分型结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的提前温育和/或进一步温育为恒温温育。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述检测线的数目为两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十二条、十四条、十五条、十六条、十八条或二十条，优选为两条、三条、四条或五条。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
6.一种利用核酸试纸条进行分型检测的方法，包括如下步骤：
1)制备用于分型检测的核酸试纸条：
1-1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有两条或两条以上的检测线和一条或多条控制线的试纸条；
1-2)在连接垫处用结合有异硫氰酸荧光素的胶体金处理；
1-3)在两条或两条以上的检测线处分别用与待检测的目的分型型别对应的特异性探针处理；
1-4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理；
2)提取并用被生物素标记的引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物；
3)对步骤1)获得的试纸条在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进行提前温育，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液并混匀，向步骤1)制备得到的试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在30-50摄氏度下、优选38-42摄氏度下进一步温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察试纸条检测结果；
4)制作标准板：按照预先设定好的各检测线对应的型别制备用于分型检测的核酸试纸条大小相同的纸板，在与用于分型检测的核酸试纸条中各检测线对应的位置分别标示具体型别，在与用于分型检测的核酸试纸条中控制线对应的位置标示控制线；
5)将试纸条检测结果与标准板进行比对，获取待检测的目的核酸的分型结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的提前温育和/或进一步温育为恒温温育。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述检测线的数目为两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十二条、十四条、十五条、十六条、十八条或二十条，优选为两条、三条、四条或五条。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-4)中，在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补的通用探针处理，
并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法在人乳头瘤病毒核酸分型检测、地中海贫血分型检测、SNP分型检测和HCV分型检测中的一种或多种中的应用。
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