CN103642924A

CN103642924A - 基于非对称pcr结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103642924A
Application number: CN201310669762.6A
Authority: CN
Inventors: 邢达; 周小明; 刘芳
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103642924B

Abstract

本发明公开了一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明的方法主要步骤包括：（1）食品致病菌亚型DNA的提取，（2）扩增引物及核酸探针序列设计，（3）基于非对称PCR的扩增反应，（4）纳米金探针的制备，（5）胶体金核酸试纸条的制备，（6）样品的检测。本发明可以快速、特异、灵敏、定性和定量检测食品样本中的食品致病菌及确定致病菌的特定亚型，其探针设计简单，操作步骤简短，产物为单链，易于检测，方便推广。

Description

基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒。

背景技术

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，会对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。近20年间，食源性致病菌所引起的食品安全问题一直在增长。因此，开展LM（Listeria monocytogenes）流行性分型研究对预防食源性李斯特菌病的流行具有十分重要的意义。快速、高特异性、高灵敏度的检测食品致病菌的致病亚型不仅可以快速诊断致病的原因，在现实生活中还能预防肠道传染病和食物中毒的发生。

目前食源性致病菌亚型的检测方法主要依靠脉冲电场凝胶电泳、低频限制性切割位点聚合酶链式反应、随意扩增多态性、扩增片段长度多态性、多位点酶电泳和多位点测序分型等6种用于细菌分型的分子生物学技术。但这些方法均存在检验周期长，需要昂贵的仪器等缺点。在重大疫情发生时，不能及时的判定致病菌的亚型，从而做出准确快速有效的治疗方案。所以食源性李斯特菌致病菌亚型的快速检测成为一个亟待解决的问题。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法。该方法基于非对称PCR结合胶体金核酸试纸条进行简便、灵敏度高、探针设计简单、操作步骤简短及特异性高的检测食品中食源性致病菌的方法，及时快速的获知食品中食品中食源性致病菌的污染情况。

本发明的另一目的在于提供一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的方法。

本发明的再一目的在于提供一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，具体包括如下步骤：

（1）食品致病菌亚型基因组DNA的提取

提取食品致病菌亚型的基因组DNA；

（2）扩增引物及核酸探针序列设计

根据步骤（1）得到的食品致病菌亚型的基因组的保守序列设计两对对称PCR的引物，包括用来标识T线的基因的前引物1和后引物2，及用来标识IACL线的基因的前引物3和后引物4；

设计一条与基因组序列不能完全互补配对的一段共用序列；

胶体金标记探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列互补配对的标记在胶体金上且3’添加有一段多聚T尾的探针序列；

控制线（CCT线）捕捉探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列相同且3’添加有一段多聚T尾的CCT线捕捉探针序列；

内部放大控制线（IACL线）捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的内部控制线捕捉探针；

测试线（T线）捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的T线捕捉探针；

（3）非对称PCR扩增反应

扩增反应：反应体系包括步骤（1）提取的基因组DNA、步骤（2）中所述的前引物1和后引物2、前引物3和后引物4、共用序列、dNTP、聚合酶及聚合酶缓冲液和双蒸水；

（4）纳米金探针的制备

纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸（HAuCl₄）为原料制备纳米金；

纳米金探针的制备：将步骤（2）中所述的胶体金标记探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；

（5）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、NC膜和吸水板按图3所示结构组装：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；

所述的金垫包埋有步骤（4）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线（T线）、含链霉亲和素的内部控制线（IACL线）和含链霉亲和素的控制线（CCT线）；

（6）样品的检测

将由步骤（3）得到的退火杂交产物与SSC缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加SSC缓冲液，读取结果，检测线、内部控制线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌亚型；仅有控制线变成红色，表明完全没有所检测的食品致病菌亚型；控制线和内部控制线变成红色表明检测菌种为所检测的食品致病菌但不是待检测的亚型。为了定量检测，可用读条机读取检测线和控制线上的信号。

步骤（2）中所述的食品致病菌的基因组的保守序列优选为食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段，如李斯特菌的prs基因（Phosphoribosyl pyrophosphatesynthetase）或单增李斯特菌4b型亚型特有的ORF2819基因片段（open readingframe2819，GenBank:GE305625.1）等；

步骤（2）中所述的胶体金标记探针的功能基团优选为巯基；

步骤（2）中所述的CCT线捕捉探针的功能基团优选为生物素；

步骤（2）中所述的共用序列优选为20～25个核苷酸构成的序列；所述的共用序列不能和基因组互补配对，就不会发生非特异性扩增；

步骤（2）中所述的IACL捕捉探针的功能基团优选为生物素；

步骤（2）中所述的T线捕捉探针的功能基团为生物素，多聚T尾中T的数量优选为8～12个。

当食品致病菌亚型为单增李斯特菌4b型亚型时，一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的方法如下：

步骤（2）中用来标识T线的基因为ORF2819基因片段（open reading frame2819，GenBank:GE305625.1），其PCR引物序列为：前引物1：

5’-AGCAAAATGCCAAAACTCGT-3’，

后引物2：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCATTG-3’；

用来标识IACL线的基因为PRS（Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase）基因，其PCR引物序列为：前引物3：5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’，后引物4：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’

步骤（2）中所述的共用序列5为5’-CCCCCATATATATATAT\CCCCCC-3’

步骤（2）中所述胶体金标记探针序列为：

5’-GGGGGGATATATATATATGGGGGTTTTTTTTTTTT-SH-3’（SH表示巯基）；

步骤（2）中所述CCT线捕捉探针序列为：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT-Bio-3’（Bio表示生物素）；

步骤（2）中所述IACL线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC-3’；

步骤（2）中所述的T线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT-3’；

步骤（3）中所述的聚合酶及聚合酶缓冲液优选为Taq DNA聚合酶及其相配的商品化的缓冲液；

步骤（3）中所述的扩增反应的条件优选为：95℃反应5min；接着95℃反应30s，54℃反应30s，72℃反应30s，共反应45个循环；72℃反应5min；

步骤（4）中所述的纳米金探针的制备方法为：将20μL200μM的3’端修饰有巯基的多聚T探针、0.66μL500μM的醋酸缓冲液（pH5.2）和1μL10μM的TCEP（磷酸三氯乙酯）混匀，室温、避光孵育1小时；在不断的摇动下，加入1mL10nM的纳米金胶体溶液，密封，室温避光用振荡器600rpm反应16小时；缓慢震荡下逐滴加入20μL500mM的Tris醋酸缓冲液（pH8.2），再逐滴加入200μL1M NaCl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，收集沉淀即得到纳米金探针；

步骤（4）中所述的包埋缓冲液为：Na₃PO₄20mM，BSA（牛血清白蛋白）质量百分比5%，Tween-20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比8%；

步骤（5）中所述的底板的材料优选为PVC塑料；

步骤（5）中所述的样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为：pH8.0，体积百分比0.25%的Triton-20，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl；

步骤（5）中所述的金垫的材料优选为玻璃纤维，其的处理方法为：用50μL步骤（4）中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存；

步骤（5）中所述的硝酸纤维素膜的处理方法优选为：用喷膜仪将6μL链霉亲和素溶液及T线捕捉探针喷到检测线（T线）的位置，将6μL链霉亲和素溶液和IACL捕捉探针混合液喷到内部放大控制线（IACL线）的位置，将6μL链霉亲和素溶液和CCT线捕捉探针混合液喷到控制线（CCT线）的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1.67mg/mL，所述的捕捉探针的浓度为1mM；所述的检测线宽1mm与金垫相隔6mm，所述的内部控制线控制线宽1mm与金垫相隔11mm，所述的控制线控制线宽1mm与金垫相隔16mm；

步骤（5）中所述的吸水板的材料优选为吸水纤维。

步骤（5）中所述的组装优选为：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于NC膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与NC膜重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的条；

步骤（6）中所述的样品的检测的过程优选为：将30μL由步骤（3）扩增反应得到的产物与120μL4×SSC缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，10min后，再滴加50μL4×SSC缓冲液，15min之内读取结果。

实现上述基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒，包含A、B两分试剂盒；

A分试剂盒包含引物、dNTP、DNA聚合酶及其相配的商品化的酶缓冲液和胶体金核酸试剂条；

所述的引物包括

前引物1：5’-AGCAAAATGCCAAAACTCGT-3’，

后引物2：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCATTG-3’；

前引物3：5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’，

后引物4：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’；

共用序列5‘-CCCCCATATATATATAT\CCCCCC-3’；

所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板（材料为PVC塑料）上且依次紧密相连的样品板（材料为玻璃纤维）、金垫（材料为玻璃纤维）、硝酸纤维素膜和吸水板（材料为吸水纤维）；所述的紧密连接的方式优选为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于硝酸纤维素膜上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2mm；金垫包埋有连接多聚T探针的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的T线捕捉探针的T线，一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的IACL线捕捉探针的IACL线以及一条含有链霉亲和素和CCT线捕捉探针的控制线；检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板；所述的检测线宽1mm与金垫相隔6mm，所述的内部控制线控制线宽1mm与金垫相隔11mm，所述的控制线控制线宽1mm与金垫相隔16mm。

B分试剂盒包含所需的探针：

胶体金标记探针序列为：5’-Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-SH-3’（SH表示巯基）；

CCT线捕捉探针序列为：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT-Bio-3’（Bio表示生物素）；

IACL线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC-3’；

T线捕捉探针序列为：

5’-BioTTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT-3’。

上述基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒用于检测食品中的单增李斯特菌4b型亚型的存在。

本发明的基本原理如图1所示：

当存在检测的目的基因片段时，在PCR扩增体系里进行对称PCR，当引物耗尽后消耗共用序列进行单引物扩增，直接产生单链产物。当将含有该产物的样品滴加到样品板上时，通过层析作用，与结合垫处已经包埋的胶体金探针再次杂交，形成”三明治”结构，当其到达已包埋有与引物的功能基团互补的基团或物质的检测线（T线或IACL线）处时就会形成一条或两条红色的线，过量的胶体金探针继续层析，到达已包埋有捕获探针的控制线（CCT线）处时形成第三条红色的线；

而不含目的片段时，检测线（T线或IACL线）处因不能形成“三明治”结构的杂交产物，而没有红色的线出现，只有过量的纳米金探针继续层析，到达已包埋有捕捉探针的控制线（CCT线）处时形成一条红色的线；

若检测线（T线）、内部控制放大线（IACL线）和控制线（CCT线）处都无红色的线出现，或者检测线和控制线出现红色的线，但是内部放大控制线无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）此扩增降低非特异性扩增几率，不易出现假阳性；

（2）产物为单链，无需对产物进行处理从而可以直接进行试纸条实验；

（3）可以实现定性或者定量检测，结果稳定；

（4）检测速度快，特异性好，灵敏度高；

（5）探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。

附图说明

图1是本发明原理图，A：基于非对称PCR的扩增原理，B：试纸条各部位包埋情况，C：试纸条阳性检测原理。

图2是13nm胶体金的吸收光谱图，在520mm处有最大吸收峰。

图3是试纸条的组装结构及各部分的尺寸图。

图4是基于非对称PCR的扩增产物的聚丙烯酰胺琼脂糖电泳检测结果图及基于非对称PCR扩增核酸试纸条检测单增李斯特菌4b型亚型结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂均购自New England生物技术公司，试纸条材料及设备均购自上海金标生物有限公司。

实施例1

1.单核增生李斯特菌的DNA的提取

采用TIANamp Bacteria DNA kit抽提单增李斯特菌（菌株号为CMCC54007，购自广州微生物研究所）基因组DNA。

2.引物及探针设计

根据PRS基因和ORF2819基因片段设计两对引物，在每对引物的5’端添加一段共用序列。根据扩增产物设计试纸条上的探针。各序列的碱基序列及标记如表1：

表1 扩增产物设计试纸条上的探针的碱基序列及标记如下

3.纳米金的制备

采用柠檬酸盐还原法制备纳米金，将100mL1mM的HAuCl₄加热沸腾，快速搅拌下迅速加入10mL38.8mM的柠檬酸钠溶液，2min内溶液颜色由金黄色→灰色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌20min，冷却至室温得到纳米金胶体溶液，用紫外吸收光谱仪测得其吸收峰在520nm左右处（图2所示），即得到13nm的纳米金胶体溶液。

4.探针与纳米金的连接（TCEP法标记纳米金探针）

向PCR管中加入20μL200μM的3’端修饰有巯基的探针，接着向PCR管中加入0.66μL500μM的醋酸缓冲液（pH5.2）和1μL10μM TCEP（磷酸三氯乙酯）以活化巯基，室温、避光孵育1小时；取洁净的离心管，加入1mL10nM的纳米金胶体溶液，然后在不断的摇动下，加入TCEP处理过的探针溶液，盖上管盖，室温避光放置至少16小时，用振荡器600rpm加速反应；缓慢震荡下向管中逐滴加入20μL500mM的Tris醋酸缓冲液（pH8.2），Tris醋酸缓冲液的终浓度为5mM；再向管中逐滴加入200μL1M NaCl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，取出离心管，纳米粒子沉积在管底，轻轻吸掉上清，用1mL包埋缓冲液（20mM Na₃PO₄，质量百分比5%BSA，体积百分比0.25%Tween X-100，质量百分比8%sucrose）重悬，用于试纸条金垫处的包埋。

5.基于非对称PCR的扩增

25μL扩增反应体系如表2：

表2 基于非对称PCR的扩增25μL扩增反应体系如下

反应条件：95℃反应5min；接着95℃反应30s，54℃反应30s，72℃反应30s，共反应45个循环；72℃反应5min。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果如图4所示（M：low loader，从左往右依次是对照，PRS基因与ORF2819基因片段多元扩增，PRS基因扩增，ORF2819基因片段扩增）。

6.胶体金核酸试纸条的组装与准备

（1）样品板：用样品板处理缓冲液（pH8.0、体积百分比0.25%的TritonX-100，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl）浸润，置于干燥器中室温保存；

（2）金垫：将60μL标记好的纳米金-探针溶液喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存；

（3）NC膜：用喷膜仪将6μL1.67mg/mL的链霉亲和素溶液和探针的混合物分别喷到检测线（T线）和内部放大控制线（IACL线）的位置，将6μL1.67mg/mL的链霉亲和素溶液和1mM3’端修饰有生物素的捕捉探针混合液喷到控制线（CCT线）的位置，CCT线和T线处划线宽度为1mm，两两线间相隔5mm，包埋好探针的NC膜置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；

（4）组装：按图3所示结构安装，每部分之间重叠2mm，最后切成4mm宽的条。

7.样品准备与检测

将30μL由步骤（4）得到的退火杂交产物与120μL4×SSC缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，等待10min后，再滴加50μL4×SSC缓冲液，15min之内读取结果。检测结果如图4所示

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）食品致病菌亚型基因组DNA的提取

提取食品致病菌亚型的基因组DNA；

（2）扩增引物及核酸探针序列设计

设计一条与基因组序列不能完全互补配对的一段共用序列；

CCT线捕捉探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列相同且3’添加有一段多聚T尾的CCT线捕捉探针序列；

IACL线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的内部控制线捕捉探针；

T线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的T线捕捉探针；

（3）非对称PCR扩增反应

（4）纳米金探针的制备

纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸为原料制备纳米金；

（5）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、NC膜和吸水板进行组装：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；

所述的金垫包埋有步骤（4）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线、含链霉亲和素的内部控制线和含链霉亲和素的控制线；

（6）样品的检测

将由步骤（3）得到的退火杂交产物与柠檬酸钠缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线、内部控制线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌亚型；仅有控制线变成红色，表明完全没有所检测的食品致病菌亚型；控制线和内部控制线变成红色表明检测菌种为所检测的食品致病菌但不是待检测的亚型。

2.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的食品致病菌亚型的基因组的保守序列为食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段。

3.根据权利要求2所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于：所述的食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段为李斯特菌的prs基因或单增李斯特菌4b型亚型特有的GenBank:GE305625.1的ORF2819基因片段。

4.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的胶体金标记探针的功能基团为巯基；

步骤（2）中所述的CCT线捕捉探针的功能基团为生物素；

步骤（2）中所述的IACL捕捉探针的功能基团为生物素；

步骤（2）中所述的T线捕捉探针的功能基团为生物素，多聚T尾中T的数量为8～12个。

5.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的共用序列为20～25个核苷酸构成的序列；所述的共用序列不能和基因组互补配对，就不会发生非特异性扩增。

6.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于：所述的食品致病菌亚型为单增李斯特菌4b型亚型；一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的方法如下：

步骤（2）中用来标识T线的基因为GenBank:GE305625.1的ORF2819基因片段，其PCR引物序列为：前引物1：5’-AGCAAAATGCCAAAACTCGT-3’；

后引物2：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCATTG-3’；用来标识IACL线的基因为PRS基因，其PCR引物序列为：前引物3：

5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’；后引物4：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’；

步骤（2）中所述的共用序列5为5’-CCCCCATATATATATAT\CCCCCC-3’；

步骤（2）中所述胶体金标记探针序列为：

5’-GGGGGGATATATATATATGGGGGTTTTTTTTTTTT-SH-3’；

步骤（2）中所述CCT线捕捉探针序列为：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT-Bio-3’；

步骤（2）中所述IACL线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC-3’；

步骤（2）中所述的T线捕捉探针序列为：

5’-BioTTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT-3’；

步骤（3）中所述的聚合酶及聚合酶缓冲液为Taq DNA聚合酶及其相配的商品化的缓冲液；

步骤（3）中所述的扩增反应的条件为：95℃反应5min；接着95℃反应30s，54℃反应30s，72℃反应30s，共反应45个循环；72℃反应5min；

步骤（4）中所述的纳米金探针的制备方法为：将20μL200μM的3’端修饰有巯基的多聚T探针、0.66μL500μM的pH5.2的醋酸缓冲液和1μL10μM的磷酸三氯乙酯混匀，室温、避光孵育1小时；在不断的摇动下，加入1mL10nM的纳米金胶体溶液，密封，室温避光用振荡器600rpm反应16小时；缓慢震荡下逐滴加入20μL500mM的pH8.2的Tris醋酸缓冲液，再逐滴加入200μL1M NaCl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，收集沉淀即得到纳米金探针；

步骤（4）中所述的包埋缓冲液为：Na₃PO₄20mM，BSA质量百分比5%，Tween-20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比8%；

步骤（5）中所述的底板的材料为PVC塑料；

步骤（5）中所述的样品板的材料为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为：pH8.0，体积百分比0.25%的Triton-20，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl；

步骤（5）中所述的金垫的材料为玻璃纤维，其的处理方法为：用50μL步骤（4）中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存；

步骤（5）中所述的硝酸纤维素膜的处理方法为：用喷膜仪将6μL链霉亲和素溶液及T线捕捉探针喷到T线检测线的位置，将6μL链霉亲和素溶液和IACL捕捉探针混合液喷到内部放大控制线IACL线的位置，将6μL链霉亲和素溶液和CCT线捕捉探针混合液喷到CCT线控制线的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1.67mg/mL，所述的捕捉探针的浓度为1mM；所述的检测线宽1mm与金垫相隔6mm，所述的内部控制线控制线宽1mm与金垫相隔11mm，所述的控制线控制线宽1mm与金垫相隔16mm；

步骤（5）中所述的吸水板的材料为吸水纤维；

步骤（5）中所述的组装为：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于NC膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与NC膜重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的条；

步骤（6）中所述的样品的检测的过程为：将30μL由步骤（3）扩增反应得到的产物与120μL4×SSC缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，10min后，再滴加50μL4×SSC缓冲液，15min之内读取结果。

7.一种实现权利要求6所述的方法的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒，其特征在于：试剂盒包含A、B两分试剂盒；

所述的A分试剂盒包含引物、dNTP、DNA聚合酶及其相配的商品化的酶缓冲液和胶体金核酸试剂条；

所述的A分试剂盒包含引物为：

前引物1：5’-AGCAAAATGCCAAAACTCGT-3’，

后引物2：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCATTG-3’；

前引物3：5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’，

后引物4：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’；

共用序列5‘-CCCCCATATATATATATCCCCCC-3’；

所述的B分试剂盒包含所需的探针：

胶体金标记探针序列为：

5’-Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-SH-3’；

C线捕捉探针序列为：

5’-CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT-Bio-3’；

IACL线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC-3’；

T线捕捉探针序列为：

5’-Bio-TTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT-3’。

8.根据权利要求7所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒，其特征在于：所述的胶体金核酸试剂条为包含附着于底板上且依次紧密相连的样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板；所述的紧密连接的方式为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于硝酸纤维素膜上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2mm；金垫包埋有连接多聚T探针的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的T线捕捉探针的T线，一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的IACL线捕捉探针的IACL线以及一条含有链霉亲和素和CCT线捕捉探针的控制线；检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板；所述的检测线宽1mm与金垫相隔6mm，所述的内部控制线控制线宽1mm与金垫相隔11mm，所述的控制线控制线宽1mm与金垫相隔16mm。

9.根据权利要求8所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒，其特征在于：所述的底板的材料为PVC塑料；

所述的样品板的材料为玻璃纤维；

所述的金垫的材料为玻璃纤维；

所述的硝酸纤维素膜和吸水板的材料为吸水纤维。

10.权利要求7～9任一项所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的试剂盒用于检测食品中的单增李斯特菌4b型亚型的存在。