CN102618637A - 一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，采用了纳米钯标记生物分子(如DNA、亲和素等)，然后通过标记后的纳米钯对钴、铜、镍等金属的化学镀过程具有催化沉积作用进行显色，从而克服了以往“金标银染”过程中出现的系列缺点，达到显色过程可控、显色过程的非特异性沉积较少的目的。对于显色后的结果可以通过肉眼定性分析，亦可利用凝胶成像系统中的光学扫描仪进行灰度扫描，并结合相关软件对结果进行灰度值分析等定量研究，从而区别出探针与靶序列间的完全正配、错配一个碱基、错配两个碱基与完全错配。

Description

一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法

技术领域

本发明涉及一种基因芯片检测技术，尤其涉及一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，属于纳米技术领域。

背景技术

基因芯片(或称DNA微阵列)技术在生物检测、疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义，是目前发展较快的一种高通量筛选技术。它把大量已知序列的寡核苷酸探针集成在同一个基片上(如玻璃、尼龙膜等载体)，然后将标记好(同位素、酶或荧光等)的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交，接着利用各种成像技术，将标记杂交后的信号读出，最后对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析的一套检测系统。

目前，基因芯片杂交结果的检测技术主要有以下几种：同位素标记检测法、荧光标记检测法等。

其中，同位素标记检测法，尽管其灵敏度高，但空间分辨率低。同时，放射性标记检测体系需要特殊培训的技术人员，且还会面临放射性污染及标记活性受半衰期限制的问题。因此，除一些特定实验环境下还在使用外，一般实验室都不采用该技术。

而荧光标记检测法是目前应用最为广泛的一种技术，被国际上Affymetrix公司等重要生物芯片制备公司所采用。它在DNA靶序列上标记荧光染料如Cy3、Cy5，与DNA探针杂交后，荧光杂交信号可通过荧光扫描仪或激光扫描共焦显微镜获取。此法成熟稳定，但所用的扫描仪器较为昂贵，成本较高，而且荧光在空气中易被淬灭。因此，如何结合不同生物分子标记方法的探索，对大量的信息进行简单、价格便宜地解读，仍是科学家的梦想，是目前的一个艰巨的技术问题。

近二十年来，随着纳米材料技术的蓬勃发展，通过对DNA分子进行纳米颗粒标记，然后发展一种分析过程简单、不需要特殊仪器设备的显色法或目测法成为大家的一个努力方向。比如，2002年，美国西北大学Mirkin教授报道了纳米金标记银染的检测方法。与荧光检测方法相比，它的选择性可高出3倍，而灵敏度则可提高100倍之多。其基本原理是将靶DNA末端标记上纳米金颗粒，杂交后，利用化学镀使银离子在金颗粒表面还原沉积，而还原后的单质银呈现出黑色的银染信号。这种信号用肉眼就可观察到，如果用普通的扫描仪扫描后再用相关软件分析信号的灰度，即可得到准确的灰度值。国内的一些研究人员也将该技术引入基因芯片的检测过程中，并纷纷提出各种专利保护如：一种基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法(CN200610135832)、一种基因芯片的纳米金标记银染检测法(CN02113147)、纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用(CN1415759)、可目视化生物芯片的制备方法(CN1955307)等。

尽管如此，作为一种显色法或目测法，金标银染法目前还未见商品化的基因芯片检测中，仍处于实验室的低密度芯片分析试验中。究其原因有多方面，但其中关键一点是检测过程中不易控制银的沉积过程。理论上，作为一个化学镀过程，只有在纳米金存在的地方，才会出现因金的催化作用而沉积银的现象。但实际过程中，由于银的氧化还原电极电势较大，很容易就被还原。随着银染的进行，经常出现纳米金标记处刚出现黑色银斑点的同时，整个镀液也变成黑色，还原后的银在载玻片表面四处非特异性的沉积，从而给整个芯片的后期分析带来影响。为此，寻求一个新的基因芯片显色法对发展可目视化的芯片检测技术将有着重要意义。

纳米钯颗粒近年来一直吸引了众多研究者的目光，2007年因为其在Suzuki和Heck反应上出色的催化性能，而促使两位科学家获得化学Nobel奖。与纳米金相比，钯的催化范围更广。从化学镀角度看，钯不仅可以催化银的沉积，而且还可以催化钴、镍、铁、铜等金属的还原。同时，从钴、镍、铁、铜等金属的催化还原过程看，由于它们的氧化还原电位没有银离子的高，化学镀过程中，这些金属沉积过程的特异性非常强，只有出现纳米钯标记的地方才会出现金属沉积。从而可以有效地解决以上基于纳米金标记银染的基因芯片目视化技术的所有缺点。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于针对目前基因芯片目测法或显色法中(特别是金标银染的检测方法)存在的反应过程不易控制、特异性差等缺点，基于纳米钯标记与对应的显色方法，提供一种全新的基因芯片显色方法。

技术方案：本发明所述的基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，将纳米钯取代纳米金进行样品生物分子标记，然后将纳米钯标记后的样品DNA与芯片进行杂交。或者先将样品生物分子与芯片杂交，然后再进行纳米钯标记。在完成芯片上纳米钯的标记后，再将芯片浸入含有钴、铜、镍或其他金属离子的镀液中进行化学镀，沉积金属，从而完成可视化过程。最后，利用普通的光学扫描仪对其扫描，进行信号的定量分析。

本发明方法具体包括如下步骤：

(1)待测样品的基因提取、纯化、扩增与标记：基因提取、纯化的具体方法参照《分子克隆实验指南》，科学出版社，J.萨姆布鲁克；基因的扩增采用聚合酶链反应(PCR)或反转录扩增聚合酶链反应；样品DNA的标记是在上述PCR扩增过程中，通过特定的生物素修饰引物或一个含共用DNA序列的引物完成；

(2)生物分子的纳米钯标记，根据后面检测过程的不同，分为两种生物分子的纳米钯标记：

(2-1)共用序列DNA-纳米钯的制备：将一段5，(3，)端含巯基(-SH)的共用DNA序列与纳米钯水溶液孵育12-48小时，然后，离心清洗去除多余DNA。或者将一段5，(3，)端含胺基(-NH2)的共用DNA序列与醛基(或羧基)修饰纳米钯反应，利用共价键将DNA连到纳米钯表面；

(2-2)亲和素(或链亲和素)-纳米钯的制备，在EDC\NHS的帮助下，将亲和素(或链亲和素)连接到羧基修饰的纳米钯表面；

(3)芯片的制备：可采用商品化的基因芯片，如Affymetrix公司提供，亦可以根据实验需要自己设计制备，其过程参照一般芯片的制备过程，即先对玻璃载玻片表面进行清洗、去除污染物。接着，利用氨基硅烷化试剂在玻片表面修饰上氨基。随后，再通过戊二醛分子在玻片表面修饰醛基功能团。最后，根据检测样品的特点，利用点样仪将所设计的DNA探针点样到玻片表面进行固定；

(4)芯片的杂交：先将步骤(1)获得的目标DNA分散在TE缓冲液中，然后按2∶1的关系将其与杂交母液混合，配成杂交液；接着，在杂交舱或盖玻片的帮助下，将杂交液覆盖在芯片表面进行生物分子反应0.5-1.5小时，具体杂交温度取决于实验中待测样品中的G-C含量与碱基个数；杂交完成后，利用清洗液，洗去多余的、非特异性吸附的DNA片段；

(5)芯片表面的纳米钯标记，根据样品DNA标记方法的不同，采用两种不同标记纳米钯方法：

(5-1)样品DNA标记是利用共用DNA序列标记，则将以上得到的芯片再与共用DNA序列标记纳米钯进行二次杂交，杂交温度取决于共用DNA序列中的G-C含量与碱基个数；杂交后，清洗去除游离的共用DNA序列标记纳米钯。该过程在本专利中也称为“三明治”式的夹心法，特指检测时将待测样品DNA的一段设计成公共碱基设别区，与标记物上连的DNA片段完全互补，而另一段为探针的识别区，即待测样品的DNA检测区。由于检测过程中，样品DNA夹在探针与标记物之间，形象地将其称为“三明治”式的夹心法；(5-2)样品DNA标记是利用生物素标记，则纳米钯标记的过程采用生物素-亲和素系统(所谓的生物素-亲和素系统，特指利用生物素与亲和素之间的特异性相互作用，进行分子连接的一种过程)，直接将亲和素修饰纳米钯溶液与上面得到的芯片在35-38℃下，孵育反应0.5-1.5小时；反应结束后，利用PBS缓冲液洗去多余的、未结合亲和素-纳米钯颗粒；

(6)显色反应：利用化学镀技术，将以上得到的芯片浸入含钴、铜、镍或其他金属离子的镀液中，进行化学镀反应。反应后，以上列举的金属离子将围绕已修饰的钯颗粒周围进行沉积。由于沉积的金属为黑颜色，所以，清洗后，直接通过肉眼就可以观察到最终的检测情况。只有样品序列与探针完全互补的点样处才出现黑点，其他错配一个碱基或两个碱基的点样处，颜色将较完全互补的点样处颜色浅一些，而完全错配的点样处将无任何黑色金属沉积；

(7)芯片的定量分析：利用凝胶成像系统对以上显色后的芯片进行灰度扫描，然后利用photoshop等图片处理软件对扫描出的图片进行灰度值分析，从而进一步从量化的角度分析正错比例。

有益效果：本发明方法与现有的一些基于金标银染的基因芯片显色技术如CN200610135832、CN02113147、CN1415759、CN1955307等相对比，最大的不同点是本发明方法采用了纳米钯标记、显色方法是通过钯对钴、铜、镍等金属的催化沉积实现的，从而克服了以往金标银染过程中出现的系列缺点，如银染通常要在暗室进行，银自动沉积的速度很快，给信号分辨工作带来困难等。在纳米钯为催化剂的化学镀过程中，上述金属离子只有在遇到具有催化活性的钯颗粒时才会迅速在其表面沉积，从而达到显色过程可控、显色过程的非特异性沉积较少目的。同时，如能控制好杂交条件与化学镀温度，还可以大大提高碱基的正错配信号比。如图1所示，其中，(A)为本发明提出的基于纳米钯标记与钴化学镀显色后的结果，(B)为传统“金标银染”的检测结果。对比可以看出，(A)中只有完全正配的位点处出现黑色，而其它错配1-2个碱基的位点处无任何黑色沉淀。但((B))中在错配1-2个碱基的位点处仍有银沉积。所以说本发明方法提出的技术路线在碱基的正错配识别信号比上也要好于传统“金标银染”显示法。

附图说明

图1为本发明提出的基于纳米钯标记的显色法与传统“金标银染”显色的结果比较。

图2为基于生物素-亲和素系统的纳米钯标记过程。其中，(a)代表了固定有不同探针的基因芯片，(b)为基因芯片与生物素标记样品DNA杂交后的结果，(c)通过生物素与亲和素之间的特异性相互作用，在以上标记有生物素的芯片位点处进一步修饰上纳米钯，(d)通过化学镀过程，在纳米钯的催化作用下，显色沉积上钴等金属单质。

图3为纳米钯标钴显色的基因芯片检测结果(a)与灰度分析(b)。

图4为基于“三明治”夹心法的纳米钯标记过程。其中，(a)代表了固定有不同探针的基因芯片，(b)为基因芯片与共用序列DNA标记的样品DNA杂交后的结果，(c)通过共用序列DNA与纳米钯表面连接的互补共用序列DNA之间的碱基之间相互作用，进一步修饰上纳米钯，(d)通过化学镀过程，在纳米钯的催化作用下，显色沉积上钴等金属单质。

具体实施方式

应该特别指出的是，在以下实施例中，芯片上的探针阵列与探针序列是任意选择的，分别与靶DNA完全互补、错配一个碱基、错配两个碱基与完全错配序列。这样做的目的纯粹只是为了简单明了地说明原理。实际过程中，阵列密度与探针序列并不受此限制，探针密度可以根据芯片的制备方法有所不同，而DNA序列也将根据实际过程进行设计。

实施例1：基于生物素-亲和素系统的纳米钯标记与芯片的显色检测，示意图如图2。

在该实施例中，我们随机选择了实验室中正在进行的转基因大豆的外源基因检测为例。选择CaMV35S启动子、NOS终止子设计特异性引物及探针，经过在PCR体系中掺入生物素修饰的dUTP扩增得到带有生物素的核酸片段，与芯片上的特异探针进行杂交结合，然后加入链亲和素修饰的纳米钯与生物素结合，再通过催化钴染或其他金属离子沉积，进行显色及放大信号。最后，经过扫描仪扫描其灰度值测量结果。

(a)生物素标记35S DNA片段(biotin-35S)的扩增

根据E.coli BL21菌株的基因组DNA序列，用Primer Premier V5.0软件设计CAT的PCR引物，由该对引物扩增出的产物为283bp。

在20μL PCR混合反应体系中含有1×Taq酶缓冲液，1.5mM MgCl₂，250μMdATPs，dGTPs，dCTPs，210μM dTTPs，40μM biotin-11-dUTP(biotin-11-dUTP的掺入量参考New England Biolabs(NEB)公司“生物素标记dNTP混合物”(产品货号N7550S)中biotin-dATP的量确定)，和5U Taq DNA聚合酶。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸7min。扩增产物及基因组DNA用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。扩增产物作为后续实验的阴性对照。

(b)亲和素-纳米钯的制备

将所得1ml Pd-S-(CH2)11-COOH溶液，在13000rpm下，离心30min。除去上清液后，将底层的黑色沉淀用MES缓冲液稀释至1ml，并加入0.4mg EDC(约2mM)和0.6mgNHS室温反应15分钟。然后，在4℃，13000rpm下，离心10min，去除上清液，加入1ml含1mM的亲和素PBS缓冲液。接着，将以上混合溶液在4℃下，反应24小时。反应结束后，离心清洗去除掉多余的亲和素。再加入0.1mol/L的乙醇胺PBS缓冲液，封闭掉剩余的、未反应的活化羧基基团，并再次清洗。最后，得到了亲和素修饰纳米钯颗粒，贮存于4℃备用。

(c)DNA芯片的制作

1.玻片的清洗以及硅烷化：

a)首先将玻片置于甲醇与盐酸1∶1的混合溶液中，浸泡30min；

b)双蒸水清洗后再将玻片置于浓硫酸中浸泡30min。先用双蒸水，再用95％的乙醇充分冲洗玻片，洗净表面残余的酸液，然后氮气吹干液体；

c)将95％的乙醇和硅烷以49∶1配制成硅烷化试剂，浸泡玻片10min；

d)硅烷化后的玻片，用双蒸水充分清洗，氮气吹干；

e)将玻片置于干燥箱内，110℃，烘30min。玻片的硅烷化就完成了。

2.手臂分子的联接：

(1)硅烷化后的玻片首先用95％乙醇浸泡清洗5min，双蒸水充分清洗吹干；

(2)用0.01M的PB液将25％戊二醛稀释成5％的溶液，浸泡玻片2h；

(3)用0.01M的PB清洗玻片，除去残余的戊二醛；

(4)用双蒸水冲洗玻片，吹干，待用。

3.探针的点样及固定：

(1)用碳酸缓冲液将探针稀释至80pmol/μL；

(2)将0.15μL探针溶液每个点，手工点样点在修饰好的玻片上；

(3)将放有玻片的表面皿封闭，室温下放置过夜(时间长点效果更佳)；

(4)37℃下水浴1个小时；

(5)取出玻片，用0.1％的SDS溶液冲洗5min；

(6)再用双蒸水清洗4-5遍，吹干；

(7)用硼氢化钠还原试剂浸泡玻片30min；

(8)用双蒸水洗净后吹干放置待用。

(d)芯片的杂交

将待测PCR产物95℃变性10min，置于冰上3min后，用杂交液以1∶3稀释PCR产物，分别取0.15μL待测PCR产物与芯片上的探针于44℃杂交1h，分别用2×SSC/0.1％SDS和0.1×SSC/0.1％SDS溶液各清洗2min，再用2×PBN(0.3MNaNO₃，10mMPB，pH 7)液清洗2min。

(e)芯片表面的钯标记

杂交后的芯片浸入链亲和素修饰胶体钯(颗粒浓度调节为10nM)中10min，再分别用2×SSC/0.1％SDS和0.1×SSC/0.1％SDS溶液各清洗2min，再用2×PBN(0.3MNaNO₃，10mMPB，pH 7)液清洗2min。

(f)显色反应

接着，将以上所得芯片浸入含钴的镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液成分由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液为还原液，胺基硼烷(DMAB)0.39g/L。另外，还原剂还可以为NaBH₄、KBH₄等碱金属硼氢化物、三甲胺基硼烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及肼等，以DMAB为佳。B溶液中为CoSO₄ 8-14g/L、NaH₂ PO₂ 20g/L、C₆H₅O₇Na₃ 64g/L、络合剂0.020g/L、稳定剂0.003g/L、表面活性剂0.5g/L。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液混合，并将其pH值调至8～8.5。然后将以上获得微阵列浸入进行反应，30～40℃下反应10min，水洗吹干。

或者浸入镍染镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液成分由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液为还原液，胺基硼烷(DMAB)0.39g/L。另外，还原剂还可以为NaBH₄、KBH₄等碱金属硼氢化物、三甲胺基硼烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及肼等，以DMAB为佳。B溶液中为NiSO₄(以Ni²⁺计)/g·L^-14～7、NaH₂PO₂·H₂O/g·L^-120～40苹果酸/g·L^-110～30琥珀酸/g·L^-15～15。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液混合，并将其pH值调至4～5。然后将以上获得微阵列浸入进行反应，70～93℃下反应10min，水洗吹干。

或者浸入铜染镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液成分由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液3g CuSO₄、4g NaOH、14g酒石酸钠钾、100ml水，B溶液37.2％的福尔马林溶液。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液混合，然后将以上获得微阵列浸入进行反应。室温下反应10min，水洗吹干。

(g)芯片的定量分析

用水冲洗后，再用氮气吹干芯片，然后将其置于凝胶成像扫描仪中，对以上显色后的芯片进行灰度扫描，最后利用photoshop等软件对扫描出的图片进行灰度值分析。

图3代表性地给出了钴显色后的扫描图与灰度值。从图3(a)中可以看出，经过钴化学镀后，通过肉眼就可以直接观察到芯片杂交后的结果。完全正配的探针位点处，颜色非常黑。错配1个碱基处，颜色较浅。错配2个碱基处，颜色更浅。而完全错配的位点处没有任何黑色的钴沉积。特别需要指出的是，在整个显色过程中，除以上位点显示的黑色斑点外，镀液及玻璃载体的其他地方均没有出现颜色的变化，这说明基于纳米钯标记及随后的镀钴显色表现出良好的可控性，特异性很强。从检测灵敏度看，以上样品的最低检测极限亦达到pM级，与金标银染相当。图3(b)进一步给出图3(a)所对应的平均灰度值，从中可以看出，正配∶错配1个碱基∶错配2个碱基∶完全错配之间的灰度值比为1∶0.6∶0.2∶0，从而达到基因芯片检测中对碱基正错配的要求。

实施例2：基于“三明治”式的夹心法系统进行纳米钯标记与芯片的显色检测，示意图如图4。

在该实施例中，我们参照文献Taton et al，Science 2000，289，1757，直接设计了样品DNA(1)、共用DNA序列(6)与芯片表面的四种探针(2-5)，如下例所示：

5’-GGA TTA TTG TTA---AAT ATT GAT AAG GAT-3’所设计的待测样品DNA(1)

5’-CCT AAT AAC AAT-3’完全互补探针    (2)

5’-CCT ATT AAC AAT-3’错配1个碱基探针    (3)

5’-CCT ATG AAC AAT-3’错配2个碱基探针    (4)

5’-AAAAGT GTGAGA-3’完全错配探针    (5)

Pd-5’-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’    (6)

这样做的目的是简化问题，更简洁的将整个原理讲清。因此，在该实施例中，就省去了目标样品DNA的提取、扩增、纯化与标记等步骤，直接由上海博亚生物工程技术服务有限公司代为合成。

(a)共用序列-纳米钯的制备

将2ml所制备的柠檬酸修饰Pd胶体溶液(平均粒径在10纳米)与1OD巯基-共用序列DNA(5’-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’，其最终浓度大约在3.51μM)混合，室温下孵育16h。加入3ml磷酸缓冲液(10mM PB，0.1M NaCl，pH 7)，继续孵育48h。然后在14000rpm下离心25min，以分离未标记的DNA。离心后除去上层清液，底层的黑色沉淀重新用5ml磷酸缓冲液(10mM PB，0.1M NaCl，pH 7)稀释，再次在14000rpm下离心25min，除去上清液，下层黑色沉淀加入1ml 2×PBS液(10mM PB，0.3M NaCl，pH 7)，母液贮存于4℃备用。

或者将所得1ml Pd-S-(CH₂)₁₁-COOH溶液，在14000rpm下，离心30min，除去上清液，然后将底层的黑色沉淀用MES缓冲液稀释至1ml，加入0.4mgEDC(约2mM)和0.6mgNHS室温反应15分钟。然后，将1OD的H₂N-ATC CTTATC AAT ATT-3’溶液加入上述溶液中，继续孵育24h。反应后，将以上混合溶液在14000rpm下离心30min。去除上清液后，将下层黑色沉淀加入1ml 2×PBS液(10mM PB，0.3M NaCl，pH 7)，母液贮存于4℃备用。

经过以上过程制备了纳米Pd修饰的DNA靶序列。

(b)DNA芯片的制作

芯片的制作过程与实施例1(c)中的步骤基本相似，唯一不同的是固定在玻片表面的探针换成以上系列(2-5)。

(c)芯片的杂交

将以上人工合成的样品DNA(5’-GGA TTA TTG TTA---AAT ATT GAT AAGGAT-3’)与步骤(b)中获得的芯片进行杂交，杂交液为MicroHyb，杂交条件与荧光法相同。即，将200μl含样品DNA的杂交液点在玻片表面，盖上盖玻片，40℃下杂交1小时。最后，分别用2×SSC/0.1％SDS和0.1×SSC/0.1％SDS溶液各清洗10min，除去非特异性吸附在芯片表面的样品DNA。

(d)芯片表面的钯标记

将以上杂交后的芯片再次与含Pd-5’-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’的杂交液进行杂交，杂交条件与步骤(c)一样，唯一不同的是杂交过程在杂交舱中进行的。

(e)显色反应

与实施例1中步骤(f)相同。

(f)芯片的定量分析

与实施例1中步骤(g)相同。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (4)

1.一种基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)待测样品的基因提取、纯化、扩增与标记；

(2)生物分子的纳米钯标记，根据后面检测过程的不同，分为两种生物分子的纳米钯标记：

(2-1)共用序列DNA-纳米钯的制备：将一段5，(3，)端含巯基(-SH)的共用DNA序列与纳米钯水溶液孵育12-48小时，然后，离心清洗去除多余DNA；或者将一段5，(3，)端含胺基(-NH2)的共用DNA序列与醛基或羧基修饰纳米钯反应，利用共价键将DNA连到纳米钯表面；

(2-2)亲和素或链亲和素-纳米钯的制备：在EDC\NHS的帮助下，将亲和素或链亲和素连接到羧基修饰的纳米钯表面；

(3)芯片的制备：先对玻璃载玻片表面进行清洗、去除污染物；接着，利用氨基硅烷化试剂在玻片表面修饰上氨基；随后，再通过戊二醛分子在玻片表面修饰醛基功能团；最后，根据检测样品的特点，利用点样仪将所设计的DNA探针点样到玻片表面进行固定；

(4)芯片的杂交：先将步骤(1)获得的目标DNA分散在TE缓冲液中，然后按2∶1的关系将其与杂交母液混合，配成杂交液；接着，在杂交舱或盖玻片的帮助下，将杂交液覆盖在芯片表面进行生物分子反应0.5-1.5小时，具体杂交温度取决于实验中待测样品中的G-C含量与碱基个数；杂交完成后，利用清洗液，洗去多余的、非特异性吸附的DNA片段；

(5)芯片表面的纳米钯标记，根据样品DNA标记方法的不同，采用两种不同标记纳米钯方法：

(5-1)样品DNA标记是利用共用DNA序列标记，则将以上得到的芯片再与共用DNA序列标记纳米钯进行二次杂交，杂交温度取决于共用DNA序列中的G-C含量与碱基个数；杂交后，清洗去除游离的共用DNA序列标记纳米钯；

(5-2)样品DNA标记是利用生物素标记，则纳米钯标记的过程采用生物素-亲和素系统，直接将亲和素修饰纳米钯溶液与上面得到的芯片在35-38℃下，孵育反应0.5-1.5小时，反应结束后，利用PBS缓冲液洗去多余的、未结合亲和素-纳米钯颗粒；

(6)显色反应：利用化学镀技术，将以上得到的芯片浸入含钴、铜、镍或其他金属离子的镀液中，进行化学镀反应；反应后，金属离子将围绕已修饰的钯颗粒周围进行沉积，由于沉积的金属为黑颜色，所以，清洗后，直接通过肉眼就可以观察到最终的检测情况。

2.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，其特征在于：

步骤(6)显色反应后，还包括：

(7)芯片的定量分析：利用凝胶成像系统对以上显色后的芯片进行灰度扫描，然后利用图片处理软件对扫描出的图片进行灰度值分析，从而进一步从量化的角度分析正错比例。

3.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，其特征在于：

步骤(1)中，基因的扩增采用聚合酶链反应或反转录扩增聚合酶链反应。

4.根据权利要求3所述的基于纳米钯标记的基因芯片显色方法，其特征在于：

步骤(1)中，基因的标记是在所述聚合酶链反应扩增过程中，通过特定的生物素修饰引物或一个含共用DNA序列的引物完成。

Images