CN1926244B - 具有参比范围的分析芯片、试剂盒和分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了至少一种分析物的分析芯片，所述芯片包含用于识别和特异固定所述分析物的至少一个分析点；和参比范围(G)，其包含一些参比点，每个参比点以确定的方式并且相互独立地在所述芯片 上排列，该范围的每个参比点包含固定在其表面并且以确定的比例P—P对于每个点相对于所述范围的其他参比点不同——包含的：探针参比分子(PRM)，其允许和特异固定确定的靶标参比分子(TRM)，和/或惰性分子(IM)，其不能识别和与所述靶标参比分子杂交，这些分子都不能固定一种或多种所述分析物。本发明的方法包括使用所述芯片与其参比范围用于分析所述至少一种分析物。
Description
技术领域
本发明涉及包含参比范围的分析芯片，涉及用所述芯片分析样品的方法，还涉及含有所述芯片的诊断或者分析试剂盒。
本发明适于定性特别是定量分析样品中存在的任意分析物。
因此本发明显然属于化学或者生物芯片领域，例如，DNA芯片、蛋白质芯片、抗体芯片、抗原芯片、细胞芯片、受体芯片或者用于本领域技术人员已知的其他配体并且能够特异捕获和固定一种或多种分析物的芯片。
通常，使用DNA芯片的应用分成两大类：基因表达(i)和基因型分型(ii)。(i)基因表达包括使用一种或多种DNA芯片根据某些生物或者生理的参数：生物发育期间细胞的发展、组织的癌变等等来研究细胞的转录组的全部或者部分的变化。越来越明显的是，此类表达概况可以作用多因子疾病，特别是癌学中多因子疾病的诊断标记。(ii)在基因型分型类型的应用中，从DNA芯片要求的反应通常是定性的是/否类型。实际上，我们希望知道样品中是否存在一种或多种特定序列。当非常需要特异性，例如，在突变检测的情况中，将相差仅1或2个碱基的一些寡核苷酸置于芯片上，并且通常对对应于例如，最强的荧光信号的序列的存在作出结论。
本发明适于这两大类应用并且有利地解决了现有技术中上述许多问题，尤其在实施此类研究和概况中的问题。
本发明的芯片由于它的参比范围，使得可以将来自芯片，例如，来自生物芯片的检测和/或分析信号转化成绝对的、可重现的、稳定的单位，其可以与来自相同转化得到的其他测量结果相比较。
现有技术
为了定量基因表达中的变化，生物学家几乎总是使用在DNA芯片上同时杂交的两个样品：参考样品，其含有用第一种荧光染料，例如荧光素(以绿色读出)标记的一定质量的RNA或者cDNA；和目的样品，必须对其进行测量，目的样品含有用第二种荧光染料，例如，Cy3或者Cy5(以橙色或者红色阅读)标记的相同质量的RNA或者cDNA。杂交后，在两种波长下阅读DNA芯片，所发出信号的两个强度之间的比作为信号。
因此在每个实验中使用内部参比进行相对测量存在问题。该方法工作良好，但是使用中相当费劲，并且存在某些陷阱，如根据系列标记中的偏倚，或者读数的偏差，其取决于波长而变。
另一种定量技术用于Affymetrix公司开发的基因表达芯片。在该方法中，置于芯片上的每个序列由一组寡核苷酸代表，每个寡核苷酸为两种寡核苷酸的形式，第一种与所需的序列完全互补，另一种有点突变(“错配”)。然后目的样品在芯片上杂交，使用单独的一种颜色。然后互补-错配差异用作最初信号，这些信号在代表一种基因的那组寡核苷酸之间平均。而且，通过相同技术在芯片上排列“参比基因”；该参比基因来自所谓的生物持家基因，被认为不管细胞的生理条件如何都保持恒定表达。然后将每种基因的“最初信号”除以参比基因的信号，例如，以避免由于环境造成的荧光亮度的差异。这样不同实验可以相互比较。
该技术具有单色的优点，并且因此没有上述使用两种标记物的缺点。然而，必须使用短寡核苷酸(20到25个碱基)，并且因此存在其他陷阱，因为某些基因以多种形式(可变剪接)发生。因此该方法比现有技术的其他方法需要DNA芯片上存在更多点并且需要关于芯片上代表的基因的RNA的多种形式的更多知识。此外，结果取决于参比基因的选择而变，甚至当非常小心地选择参比基因时也是如此。因此，结果不是总能比较。
如果使用某些对照和实验重复，前述方法可以相对可靠并且因此提供了生物学家可以使用的研究工具。然而，必须指出测量是相对的，因为信号是从具有相对任意的单位(荧光的任意单位)的两种测量之间的比得到的无量纲的数字。因此，不可能比较用不同参比样品，例如，没有额外测试的参比样品进行的实验。此外，由于测量是任意单位，相当难以知道导致了低强度的问题：难以知道它是仪器问题、与芯片自身有关的问题、与样品有关、与操作步骤有关，还是与实验结果有关的问题。
在基因型分型类型的应用中，从DNA芯片要求的反应通常是定性的是/否型，如上文解释。此外，使用现有技术的芯片，结果是相对的，因为在一个并且相同的芯片上比较所研究的不同寡核苷酸的强度。
然而，对于某些应用，如一些序列混合物的检测，有利的是能够比较几个实验之间的信号，这用当前可利用的芯片是不可能的；总是必须重复一次或多次实验来得到相对测量，然后从这些测量得到结论，这费时并且费钱。
此外，在常规诊断中，用校准曲线可以解决结果定量的问题。用合适的稀释剂将参比样品以预定方式稀释到多种浓度，并且不用芯片对每种稀释液进行生物学测试。这提供了参考曲线。当进行实际的生物学测试时，在参考曲线上标绘任意单位表示的结果，并从这推导出样品中分析物的浓度。然而，重要的是用与用于构造参考曲线完全相同的要素进行试验。此外，在用酶促显影进行读数的试验，例如，ELISA、ELOSA等等试验中，对于试验的每个生产批也需要参考曲线。而且，必须为每名用户进行用于重调参考曲线的额外的校准点用以校正从一台机器到另一台机器、从一个温度到另一个温度、从一个实验室到另一实验室的差异，试剂可能的老化等等。必须由用户定期地，例如每周重复这些额外的校准试验。
该定量方法，尽管是常规的，但是因此是复杂且昂贵的。此外，它不容易应用于DNA芯片；实际上，将需要对参比范围的每个点使用一个DNA芯片，并且保持重复该实验(在标记物批的每次改变时，或者以常规时间检测，例如每个月，来检查仪器操作的可能的偏移)，这对于实验室来说太昂贵了。
因此，实际需要这样的芯片和分析方法，其能够解决现有技术的许多前述问题，并且特别是可靠的、准确的，并且可再现的；可以应用于多种已知的和将来的DNA芯片；使得可能比较几个实验之间的信号；使得可能避免为参比范围的每个点使用DNA芯片；并且使得可能避免不断重复校准试验(在标记物批的每次改变时，或者以常规时间检测，例如每个月，来检查仪器操作的可能的偏移)，从而为实验室、在工业和研究中减小芯片(例如，生物芯片)上分析的复杂性和成本。
在下面的描述中，方括号[ ]中的参考文献指下面描述的本发明申请的实施例后给出的参考文献列表。
发明描述
本发明精确地满足这些需要并且解决了现有技术的许多前述问题和其他问题，特别是因为它提供了分析芯片，以及使用该芯片的分析方法，如下文定义。
本发明的分析芯片是用于液体样品中存在的至少一种分析物的分析芯片，所述芯片包含：
a)所述至少一种分析物的至少一个分析点，所述分析点在芯片上排列以允许该分析物的识别和特异固定；和
b)参比范围(G)，所述参比范围由一些参比点组成，每个参比点在所述芯片上以确定的方式并且相互独立地排列，该范围的每个参比点包含固定在其表面并且以确定的比例P(P对于每个点相对于所述范围的其他参比点不同)包含的：(i)至少一种探针参比分子(PRM)，其允许识别和特异结合确定的靶标参比分子(TRM)，和/或(ii)至少一种惰性分子(IM)，其不能识别和结合所述靶标参比分子，所述探针参比分子和惰性分子都不能识别和固定所述分析物；
并且0≤P≤1，RPM数与IM数之和在一个参比点与另一参比点之间是恒定的。
本发明的分析方法是体外分析可能存在于液体样品中的至少一种分析物的方法，其包括下面的步骤：
(α)任选地，在分析物上固定第一种检测手段；
(β)向包含任选标记的分析物的待分析样品加入靶标参比分子(TRM)，该靶标参比分子上已经任选固定与第一种检测手段相同或不同的第二种检测手段，所述TRM能够识别并特异结合根据本发明的分析芯片的探针参比分子(PRM)，所述TRM以足够量加入所述样品以饱和所述芯片的参比范围(G)的PRM，从而产生参比范围，其是对于每个参比点不同的确定比例P的函数；
(γ)将包含TRM的待分析的样品与包含所述至少一种分析物的至少一个分析点的所述分析芯片在物理化学条件下接触，从而：一方面，待分析的分析物如果存在，将结合到芯片上它的分析点；另一方面，TRM特异识别PRM并且结合芯片的参比范围的多个参比点上的PRM；
(δ)确定参比范围的每个参比点发出的参比信号(如果由于第二种检测手段而可适用)，所述信号是固定在参比点上的靶标参比分子的量的函数；和
(ε)确定所述至少一个分析点发出的分析信号(如果由于第一种检测手段而可适用)，所述分析信号是该分析点固定的分析物的量的函数，并与步骤(δ)中确定的信号比较以将该分析信号表达为P的函数。
术语“分析物”指我们希望分析，即检测和/或定量的颗粒或者分子的全部或者部分，例如，微生物、细菌、真菌、病毒、真核细胞、如肿瘤细胞的细胞、化合物或者分子，诸如肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、多糖、脂质、糖脂、脂多糖、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、激素、抗原、抗体、生长因子、半抗原等等的分子。
样品可以是溶液、细胞提取物，或者从动物或者植物生物得到的样品。若需要的话，该样品可以被稀释以用于本发明。本领域技术人员将熟悉此类样品的处理和它们的溶解和/或它们的稀释、它们的纯化和/或它们的浓缩，用于在分析芯片，例如，生物或者化学芯片上分析。这些相同操作用于实施本发明。
本发明的芯片包含一方面待分析的至少一种分析物的至少一个分析点，另一方面参比范围的组合，所述分析点和参比范围都在根据本发明的一个并且相同的芯片的表面上排列。
本发明的芯片与现有技术的分析芯片以相同方式构造，只是它还包含本发明意义上的参比范围。因此产生参比范围的步骤加入如生产芯片的步骤。可以用于实施本发明的DNA芯片和它们的生产方法描述于例如参考文献的文件[1]。可以用于实施本发明的蛋白质芯片和它们的生产方法描述于例如参考文献的文件[2]和[3]。
因此，本发明的芯片可以在非常宽的范围内用作分析工具。从而，“分析”是指样品的“定性分析”，即检测样品中存在的分析物和/或“定量分析”，即定量测定样品中存在的分析物。在下面给出一些实例。
根据本发明，“点”包含唯一并且特异识别并固定“分析物”的手段(分析点)或者特异识别并固定“靶标参比分子”的手段(参比范围点)。
对于“分析点”，这些手段包含对所述分析物特异的探针分子。特异探针分子可以是例如允许识别和通过杂交固定互补分析物(DNA或者RNA)的DNA或者RNA分子；通过抗原/抗体型相互作用识别和固定分析物的抗原或者抗体分子；通过蛋白质/蛋白质型相互作用识别和固定分析物的蛋白质分子；通过酶/底物型相互作用识别和固定分析物的酶或者底物分子；等等。
例如，当分析物是核酸时，所述至少一种分析点是通过与所述核酸互补的核酸官能化的点。例如，当分析物是抗体或者抗原时，所述至少一种分析点是分别通过抗原或抗体官能化的点。
产生这些分析点和它们的官能化的方法是本领域技术人员已知的并且公开在例如前述文件中。芯片的分析点的官能化可以通过例如用于分配官能化溶液的液滴的机器人，例如，通过Packard Instrument或GeSim(注册商标)型的机器人来实现。
与当前用于实验室的分析芯片一样，本发明的芯片可以包含一些相同或不同的分析点。
本发明的参比范围由参比点组成，它们也是用于识别和固定靶标的点，但是这些参比点的特征是它们不能识别和固定待分析的一种或多种分析物，而是仅仅确定的靶标参比分子。该参比范围的参比点如本发明方法的第(i)和(ii)点中在上面定义。
根据本发明，探针参比分子、靶标参比分子和惰性分子一起选择并且作为本发明的芯片将分析的分析物的函数，使得它们与分析物有最小可能的相互作用。
根据本发明，优选地，靶标参比分子与分析物性质相同。它也可以具有不同性质。关键点是靶标参比分析应该既不被所述至少一种分析点识别又不被该分析点固定。
根据本发明，选择探针参比分子用以特异识别和固定所述靶标参比分子。优选地，该探针参比分子与对分析物特异的探针分子性质相同。它也可以具有不同性质。关键点是探针参比分子既不识别又不固定所述分析物。
例如，根据本发明，靶标参比分子和探针参比分子可以是例如互补的寡核苷酸(DNA或者RNA)，用以在包含探针分子的参比范围的点上通过杂交识别和固定靶标参比分子；例如，抗原和它的特异抗体允许在包含探针分子的参比范围的点上通过抗原/抗体型相互作用，识别和固定靶标参比分子。例如，蛋白质允许在包含探针分子的参比范围的点上通过蛋白质/蛋白质型相互作用识别和固定参比靶标；等等。
根据本发明，所述至少一种分析物和靶标参比分子优选为寡核苷酸或者抗体。使用探针和/或惰性寡核苷酸或者抗体或抗原在根据本发明的芯片上多个点的官能化(分析和参比范围)可以使用芯片领域技术人员非常熟悉的芯片领域中的官能化技术用寡核苷酸或者抗体或抗原来进行。可以使用的技术例如在前述的文件中描述。
根据本发明，以这种方式选择参比范围的惰性分子(也称作“非特异”分子)使得既不识别也不固定靶标参比分子和一种或多种分析物。优选地，根据本发明，惰性分子与探针参比分子性质相同。实际上，这意味着使用本发明的芯片时，不必考虑例如惰性分子一方面与一种或多种分析物和另一方面与靶标参比分子之间的可能干扰分析的非特异相互作用，并且得到可靠的参比范围。在前面实例中，参比范围的惰性分子因此可以分别为DNA或者RNA、抗原或者抗体、蛋白质、酶或者底物。根据本领域技术人员已知的芯片官能化技术，例如，前述文件中描述的技术，将参比惰性分子也固定在参比范围的点上。
根据本发明，探针参比分子、靶标参比分子和惰性分子优选为寡核苷酸。满足本发明的惰性分子和探针和靶标参比分子定义的寡核苷酸序列，例如，人工寡核苷酸序列的产生，和使用这些探针和惰性寡核苷酸官能化芯片上的点以产生参比范围实际上是容易的并且使用寡核苷酸芯片领域技术人员非常熟悉的技术。
原位系统：生产DNA芯片的某些方法使用寡核苷酸原位合成(例如，Affymetrix(注册商标)公司的GeneChip芯片或者Agilent公司的芯片的生产方法)。在这些方法中，在芯片上原位合成每个寡核苷酸。待偶联的单体的三维寻址在寡核苷酸的常规合成循环中去保护(Affymetrix的光去保护)水平上实现；或者在单体的偶联(Agilent的“点样”)水平上实现。这种原位合成技术使得可能产生本发明的芯片的分析点，并且，通过加入与参比范围中点数相同的合成循环，并且在这些合成循环中，通过在形成芯片的基质上的适当位置直接偶联探针参比寡核苷酸/惰性(非特异的)寡核苷酸的混合物(代替仅偶联一种单体)，产生了根据本发明的参比范围。
根据本发明，由在所述芯片上以确定方式并且相互独立地排列的一些参比点构成了参比范围。实际上，对于将使用的参比范围，必须每个参比点与其它参比点不同，从而当使用芯片时，该范围内的多个点提供独立的并且可以用于分析的信号。
参比范围的每个点与该范围内的其他点通过如上定义的它们的确定的比例P来区别：因此对于每个参比点，探针参比分子相对于惰性分子的量是已知的。通过用具有确定浓度的探针参比分子和/或惰性分子的溶液独立地官能化每个点，在每个参比点上得到了该确定的比例P。根据本发明，该比例P可以为0(当参比点仅含有惰性分子时)到1(当参比点仅含有探针参比分子时)。主要事情是为了参比范围是准确的，探针参比分子和惰性分子的总量(RPM+IM)应该在一个点与另一点之间相等。
优选地，在其中参比探针和惰性分子是寡核苷酸的实例中，以这种方式选择它们使得在芯片的制造期间它们附着到参比范围的点有效性相等。从而，附着后，参比寡核苷酸的比例与最初稀释的比例相等。这使得在用本发明的芯片分析过程中，可能有利地从“稀释％”单位到达“附着的参比寡核苷酸的％”的单位。
在根据本发明的寡核苷酸芯片的实例中，与cDNA芯片或者PCR产物芯片相比，优选地，总量“参比探针寡核苷酸+非特异惰性寡核苷酸”等于用于芯片制造的每个分析点的探针寡核苷酸的量。还优选使用具有相同长度的寡核苷酸。从而，由于附着效率几乎不独立于序列，所以对于每个点，可以以“杂交点的百分数”表达信号，其100％对应于表面的饱和度。
优选地，参比范围的点在芯片上线性排列并且相对于每个点的比例P排列，例如，从具有最高浓度探针参比分子的点到具有最低浓度探针参比分子的点。实际上，这得到了校准尺度，当使用芯片时，可以更容易地使用所述校准尺度。在这种范围内比例P从一个参比点增加到接近它的另一个参比点的增加可以是线性的，例如，以连续不同的点上探针参比分子的百分数表示，为0％；20％；40％；60％；80％和100％，或者非线性的，例如，0％，5％，10％，20％，50％，100％或甚至0％；0.1％；1％；10％和100％。除了对从参比范围的点提供的信号能够清楚地分配确定比例的探针参比分子外，对本发明的应用没有其他限制。
将参比范围的参比点的数目确定为使用芯片时分析所需的准确度和试验的动态范围的函数。例如，具有连续的0％、50％和100％的探针参比分子的三个参比点仅提供了三个校准结果作为分析分析物的结果的基础，而例如，具有连续的0％、20％、40％、60％、80％和100％的探针参比分子的五个参比点提供了6个校准结果，给出了分析结果的更准确的读数。例如，参比范围可以包含1到50个参比点，例如，2到20个参比点。本领域技术人员将根据分析所需的准确度和浓度的动态范围，容易地确定所需的不同参比点的数目和它们在芯片上的排列或布置。
附图1概略地以横截面显示了根据本发明的芯片(P)上的参比范围(G)。该图显示了多个参比点(1a、1b、1c和1d)，参比点上固定探针参比分子(PRM)(显示为粗线)和惰性分子(IM)(显示为细线)。没有显示分析点。最左边的点仅含有PRM(100％)，最右边的点仅含有IM(0％PRM)。中间点含有中等比例的PRM。在点与点之间PRM+IM之和是恒定的。
根据本发明，可以相同和不同的一些参比范围可以在一个且相同的芯片上排列。一些参比范围的使用尽管不是必须的，但是在一些情况中提高了所进行的分析的准确度。例如，当样品含有将通过寡核苷酸和抗体在芯片上同时分析的几种分析物时，这可以提高准确度。本领域技术人员将根据芯片将进行的分析，容易地确定最合适的实现方法。
当具有该参比范围的芯片用于分析包含或者可能包含待分析的一种或多种分析物时，特别在本发明的方法中，本发明的显著重要性变得明显。
在本发明方法中，分析物和靶标参比分子优选具有相同性质，但是不局限于该实施方案。还优选地，分析物和靶标参比分子是寡核苷酸或者抗体，但是不限于该实施方案。在本发明的尤其有利的实施方案中，出于与上面相同的原因，探针参比分子、靶标参比分子和惰性分子是寡核苷酸。
类似地，并且出于与上面相同的原因，所述至少一种分析物有利地为核酸，并且芯片上所述分析物的分析点是通过与该核酸互补的核酸官能化的点。分析物还可以是抗原或者抗体，并且芯片上所述分析物的分析点可以分别通过识别并固定所述抗原或抗体的抗体或抗原官能化。
本发明方法的步骤(α)是任选的。在该步骤中，第一种检测手段可以固定在分析物上。它可以是本领域技术人员已知的可以用于检测固定在芯片上的特异探针分子上固定的分析物(探针/分析物组合)的任何手段。该手段可以包括例如，第一种标记物，其可以固定在特异探针分子上，或者分析物上。该工具还可以是用于间接标记的另一种分子，例如，生物素，这取决于所用的标记技术。可以用于实施本发明的标记物和标记技术为，但不限于，分析芯片，例如生物芯片，例如，DNA或者RNA芯片、抗体/抗原芯片或者使用酶/底物相互作用的芯片领域中技术人员已知的那些技术。
可以使用的标记物可以例如选自荧光标记、放射性标记、标准、有色或者荧光乳胶颗粒、光子晶体(也称作“量子点”)、胶体金，和酶标记。在荧光标记中，我们可以提及荧光素、Cy3、Cy5和罗丹明。在放射性标记中，我们可以提及例如P32、P33、S35、I125、H3。在酶标记中，我们可以提及碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HPR)、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶。对于这些酶，有有色、荧光或者发光标记物。在该情况中，它们是用酶转化的分子，所述分子转化后变成有色的(或者吸收波长改变)、荧光、发光的或者产生氧化还原反应。也可以使用通常用于诊断免疫分析的酶标记。可以用于本发明的这些荧光或者酶标记和其他标记例如可以从Sigma/Aldrich、MolecularProbes、Amersham Pharmacia Biotech.、Stratagene等公司的目录得到。参考文献的文件[4]和[5]描述了可以用于实施本发明的这些标记的使用方法。可以用于本发明的颗粒形式的标记可以从一些供应商，例如，Molecular Probe、Miltenyi、Estapor/Merck、Polymer Solutions等得到。参考文献的文件[6]描述了可以用于实施本发明的乳胶或者胶体颗粒形式的这些标记的使用方法。对于光子晶体的使用，将可能使用例如参考文献的文件[7]中描述的方法。
对于某些标记，特别是酶标记，可检测的产物可以通过分子扩散从产生该产物的点移动一定距离，并污染相邻的点。这可以在使用参比范围和点发出的信号进行一种或多种分析物的识别中导致干扰。这是为什么本发明人优选发光标记的原因，因为发光标记的扩散有限：一旦酶产物发出了光子，它就不能发出更多光子。为了避免扩散现象，还可以使用所称作的沉淀性酶底物：酶产物是不溶的，并且在原位，即在点上沉淀。例如，四甲基联苯胺(TMB)可以用于HPR酶，氮蓝四唑与磷酸5-溴-4-氯-吲哚酯(NBT+BCIP)的组合用于碱性磷酸酶。
根据本发明，为了避免这些可以干扰使用某些标记时芯片读数的扩散现象，而且通常为了避免相邻点之间的任何扩散现象，本发明人推荐使用这样的芯片，在芯片上为所述点(用于识别和固定分析物和/或参比范围)提供手段以确保步骤(β)中得到的样品的小滴仅在每个点上形成，并且这些小滴不能在它们之间扩散。这些手段可以例如是围绕每个点的边界，例如树脂的形式。这些手段还可以是每个点周围的环的形式并且其对样品比对芯片表面的剩余部分显示出更大的润湿性，从而样品的小滴仅由每个点上的每个环保持。该环可以是例如通过二氧化硅表面上微型照像凹版得到的黑色硅环或者通过电润湿捕获样品小滴的电极。不管用于形成小滴的手段，芯片表面优选对于样品是非润湿性的。本发明的芯片因此有利地提供这些手段以便增加所得测量值的质量或者可靠性。
在步骤(β)，将靶标参比分子加入如上定义的样品，在所述靶标参比分子上任选固定与第一种检测手段相同或者不同的第二种检测手段。该第二种检测手段可以包括例如另一种标记物，其可以固定在靶标参比分子或者探针参比分子上。它还可以包括不同于标记物但是用于间接标记的方法中的分子(例如，生物素)。该标记物可以选自例如上面提到的那些标记物。第二种检测手段优选地但不是必须地，与第一种检测工具相同。主要事情是通过可检测的信号可以检测到芯片上靶标参比分子在参比范围的探针参比分子上的固定。
根据本发明，可以仅标记分析物，或者仅标记靶标参比分子，或者两者，或者两者都不标记。实际上，一些检测方法能够不用标记物检测分子相互作用(芯片上的探针/靶标固定化)。下面给出一些实例。
将任选固定第二种检测手段的靶标参比分子以足够量加入样品从而在用于将样品与芯片接触(步骤(γ))的实验条件下，参比范围的点的最大数目的探针分子识别并结合靶分子。可以优选通过与样品均匀混合进行样品的加入。
在步骤(γ)中，在上面定义的物理化学条件下，将来自步骤(β)的混合物与本发明的芯片接触。这些条件是分析芯片，例如生物芯片，例如，DNA芯片、RNA芯片、抗体/抗原芯片、蛋白质芯片等领域中技术人员已知的。例如，对于前述芯片，这些条件是pH、温度和离子强度的条件，其允许在它们的一个或多个识别点上识别并固定一种或多种分析物(DNA、RNA、抗体、抗原、蛋白质等等)，和在包含靶标参比分子的参比范围的点上识别并固定靶标参比分子(DNA、RNA、抗体、抗原、蛋白质等等)。本发明的优点是通过所述至少一个分析点识别和固定分析物和通过在参比点上固定探针参比分子形成参比范围可以同时地并且在相同的操作条件下实现。效果是明显的：在与用于固定分析物相同的操作条件下得到了参比范围发出的信号。因此，分析结果比通过现有技术的方法所得结果更可靠。
通常，通过分析芯片技术中将样品在功能化区上分布的常用方法可以将分析点和参比范围的点与样品接触。
芯片包含将样品的小滴形成限制在芯片的点上的手段，可以非常简单地进行所述接触，即用样品覆盖所述点，然后撤离样品从而仅仅留下分析点和芯片的参比范围的点上这些手段捕获的样品小滴。
附图2概略地以横截面显示了接触阶段后图1的参比范围(G)。该图显示了固定在探针参比分子(PRM)上的靶标参比分子(TRM)。通过标记物(Mq)标记TRM。显然最左边的点(100％PRM)将给出来自标记物的最强信号，最右边的点(0％PRM)将不给出信号。在中间的点上将出现中等强度的信号。
关于本领域技术人员已知的分析芯片的使用，该步骤(γ)可以接着是在物理化学条件下洗涤和冲洗步骤，其不破坏它的分析点上分析物的固定，以及探针参比分子上靶标参比分子的固定。这些洗涤和冲洗步骤是本领域技术人员已知的并且可以在前面的文件中找到。它们使得可以除去不在芯片上固定的过量试剂和分子。
在本发明方法的步骤(δ)中，测定参比范围的每个点发出的信号，其反映了参比范围的每个点上固定的靶标参比分子的量。在本发明方法的步骤(ε)中，特别测定每个分析点发出的信号，其反映了每个分析点上固定的分析物的量。
取决于在本发明的方法中是否使用标记物，可以以多种方法进行这些测定。主要事情是能够分配代表参比范围的每个点上固定的靶标的量的明确信号，和代表每个分析点上固定的分析物的量的明确信号。
当使用标记物时，使用适于检测这些标记物的技术手段。在所用的第一种和第二种检测手段中，检测手段将对于多个分析点和参比范围的多个点相同。这些信号读数技术是本领域技术人员已知的。在前述标记物实例中，它们使得可以检测例如荧光的量、放射性的量、酶反应产物的量、发光、等等。前述涉及标记物的文件给出了用于测定可以实现本发明方法的这些信号的技术。
根据本发明，还可以测定参比范围的每个点和/或每个分析点的信号，特别如果不使用标记时，可以通过选自通过表面等离子体共振检测的方法、光热检测方法、椭圆光度法、光度检测方法和声学检测方法的方法进行测定。这些方法是本领域技术人员已知的。参考文献的文件[8]和[9]公开了光热检测方法，其可以用于实施本发明的方法不用标记物来检测信号。
根据本发明，对于分析点和参比范围，可以用或者不用标记物，使用信号测定的不同方法。从而，本发明的方法使得可以比较用不进行标记(分析点或者参比范围)得到的结果与在相同芯片上用标记(分析点或者参比范围)，例如，通过荧光标记得到的结果。主要事情是应该在相同芯片上并且在相同操作条件下同时实现分析物在分析点上固定和靶标参比分子在参比范围内固定的操作条件。
在步骤(ε)，每个分析点发出的信号与参比范围发出的多种信号比较以将分析点的所述信号表达为上面定义的比例P的函数。实际上，将各分析点发出的信号的强度与参比范围的多种信号比较以从相对于参比范围的相等信号的信号值推导相对于比例P的信号值。考虑参比范围的其他标准的其他比较也是可能的(IM数、PRM数、IM/PRM比例、PRM/IM比例、等等)。
有利地，如果分析物和参比探针的性质相同，那么可以通过简单的读数直接、可靠且可再现地确定每个分析点上分析物的比例。实际上，基于本发明，通过从相同样品，并且因此在对于分析物相同的操作条件下同时进行的参比范围进行该测定。
如果分析物的性质与探针参比分子的不同，那么可以确定相对值，其具有稳定、可再现，并且将分析的操作条件与允许在同一芯片上同时形成来自同一样品的参比范围的那些条件整合在一起的优点。因此，该相对值比通过现有技术的方法得到的值更可靠。
在本发明申请的具体实例中，当分析物、对分析物特异的探针分子、探针参比分子、参比靶标和惰性靶标是寡核苷酸时，步骤(γ)的接触是为了在芯片上分析物与探针参比分子的杂交，和靶标参比分子与探针参比分子的杂交。对于该杂交，向含有分析物的样品加入靶标参比寡核苷酸，其含有与参比范围的探针参比寡核苷酸互补的序列，并且优选但不是必须地，以与分析物相同的方式标记。该寡核苷酸稍微过量使用，使得包含100％参比寡核苷酸的参比范围的点的所有探针参比分子都在所用的杂交的实验条件下杂交。从而，对于参比范围的每个点，所有可以杂交的点都将杂交。然后可以将来自DNA芯片的每个分析点的信号以“参比稀释的％”表达。通过在不同分析中使用相同的寡核苷酸和非特异性寡核苷酸(即，不识别并且不固定分析物)，该单位独立于样品、独立于标记化学方法、独立于所用的标记物(绿色、红色或蓝色、荧光的或者光子的，等等)、独立于杂交条件(如果参比寡核苷酸的杂交完全)、独立于芯片批次、独立于附着效率，等等，使得实验可以直接相互比较，不用如在现有技术的方法中必须的额外实验。
一般说来，可以进行直接读数，或者从参比范围绘制参考曲线，例如(测定的信号)＝f(P)，其可以用于分析所述芯片的分析点。
因此，本发明的芯片和方法是可靠的、准确的，并且结果是可再现的。本发明应用于多种已知的和将来的DNA芯片；它使得可能比较几个实验之间的信号，避免对参比范围的每个点使用一个DNA芯片，并且避免了如现有技术方法必须的不断重复校准实验。
有利地，对于用酶标记，例如，发光进行检测的方法，本发明使得可以在生产商和用户方都避免校准每个批次酶的活性。这因此代表“度量链”的极大简化。
因此本发明为实验室、在工业和研究中在芯片分析，例如，生物芯片上减小了分析的复杂性和成本。
因为本发明可以应用于现有技术中使用点进行分析物的识别和固定的所有分析芯片，所以本领域技术人员将容易理解本发明可以应用于可以使用该类型芯片的所有领域。
从而，本发明还涉及包含根据本发明的芯片的诊断试剂盒。在该情况中，本发明芯片的分析点包含对于识别所需的分析物特异的探针分子，用于获得结果，所述结果将可以解释从而确立诊断。例如，它可以是选自寡核苷酸、cDNA、抗体、凝集素、适体的探针分子的问题。
本发明还涉及包含根据本发明的芯片的分析试剂盒。在该情况中，本发明芯片的分析点包含对于所需的分析物的识别特异的探针分子从而进行所述分析。它可以是用于定性或定量分析的试剂盒。例如，它可以是选自寡核苷酸、cDNA、抗体、凝集素、适体的探针分子的问题。
本发明还涉及根据本发明的芯片在监视体外组织细胞中基因表达的差异的用途。例如，文件[1]描述了可以用于本发明的芯片上监视基因表达中这些差异的方案。
本发明还涉及根据本发明的芯片在体外基因型分型的方法中的用途。例如，文件[1]描述了可以用于本发明的芯片上进行基因型分析方法的方案。
例如，关于根据本发明基因表达芯片的有用性和用途，可以参考文件[10]中的描述，其描述了可以在这些应用中实施本发明方法的方案。
例如，关于本发明在基因型分型，例如，用于诊断目的中的用途，可以参考文件[11]和[12]，每个文件都描述了可以用于在该应用中实施本发明方法的方案。
当阅读了下面的实施例，参考附图后，其他特征和优点将变得明显，所述实施例用于阐明目的。
附图简述
- 图1是根据本发明的芯片上参比范围的图示。
- 图2是当靶标参比分子固定在探针参比分子上时，根据本发明的芯片上参比范围的图示。还显示了标记物。
- 图3显示了曝光560ms时，根据本发明的芯片上参比范围图像的两个底片，得到0(左)或者16(右)。
- 图4是曲线图，显示了对于四个独立实验(C1、C5、C6和C7)，作为捕获点上参比寡核苷酸比例的函数的信号曲线。
这些曲线组成了从根据本发明的参比范围得到的参比曲线。
- 图5是曲线图，其总结了对于根据本发明的参比范围的各点，用荧光颗粒标记，确定的信号结果。
- 图6是本发明人为了制造根据本发明的芯片使用的装置。
- 图7是用乳胶颗粒间接标记在本发明的芯片上参比探针分子上固定靶标参比分子的生化机制的图示。
- 图8是用于制造根据本发明的芯片的芯片基质的照片。
- 图9是根据本发明的分析芯片用于检测造成患者中细支气管炎的病毒RSV A和RSV B(RSV：呼吸道合胞病毒)的存在和造成患者中流行感冒的病毒Inf A(流感病毒A)和Inf B(流感病毒B)的存在的图示。
实施例
实施例1：根据本发明的芯片
1.1 芯片基质
用于制造根据本发明的芯片的基质是″VV5501 VGA MonochromeImage Sensor″型的单色图像仪(ST Microelectronics的注册商标)，它的主要技术特征在下表中显示：
| 图像格式 | 640×480像素(VGA) |
| 像素大小 | 5.6μm×5.6μm |
图8的照片中显示了该基质的顶视图。它在中央有硅表面。下面描述的图6是该芯片的示意性横截面，其在顶部也粘合塑料管(见下面)。
该基质实际上用于生产具有放大和曝光控制功能的低成本数字式照相机并且理论上具有56dB的信噪比。此外，它仅需要非常少的外部元件来运行并且提供工具包(软件或者硬件)来处理相机的内部参数。
1.2制造芯片的的第一阶段
修饰如前面段落1.1中描述的芯片基质以官能化硅表面(见图1)。为了可以使用光检测器(在基质的中心)的硅表面，除去玻璃盖并将结合连接(bonding connections)埋藏在globtop树脂(一般术语，表示用于保护结合连接的任意树脂)下。将光检测器中心的钝化层(氮化硅)官能化(硅烷化+附着点捕获探针)。
对于硅表面官能化的随后实验，将塑料管粘合(UV粘合)在芯片上以确定活性表面上的反应腔，在其中进行杂交、洗涤，和显影。图6是所用装置的图示：它包含用于保护芯片的连接的树脂(R)、硅表面(P)、陶瓷支架(Cc)、粘合的塑料管(Tp)和点(se＝参比点，sa＝分析点)，点上固定探针分子和/或惰性标准或者对分析物特异的探针分子。该示意图显示提供了管用以容纳与硅表面接触的反应液体(Lr)。
在管粘合和树脂沉积前，在图8照片中的顶视图中显示了(S)和(Cc)。
1.3通过寡核苷酸探针和寡核苷酸惰性分子官能化硅表面
1.3.1显露硅烷醇
(i)硅烷醇首先在氮化硅芯片表面上显露：在溶液：NaOH 1g/水3ml/乙醇99％4ml中室温下搅拌2小时。用水充分洗涤。在0.2N HCl中搅拌1小时，然后用水充分冲洗。在炉中80℃干燥。
ii)硅烷化：氩气、室温下，将板浸入3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷在乙醇中的10％(体积/体积)溶液中24小时。然后干燥。然后用99％乙醇洗涤，用99％乙醇+超声再次洗涤。每次洗涤几分钟。干燥。在110℃下干燥中退火3小时。
iii)预活化：将板浸入KOH溶液(20ml水中1.5g KOH)。室温、搅拌下孵育5到10分钟。然后用纯水冲洗。
iv)活化：将板浸入戊二醛溶液(4ml戊二醛溶于16ml水)中。室温孵育1小时30分钟。用纯水冲洗，干燥。
1.3.2 寡核苷酸的固定
通过戊二醛活化这些NH2基团后，可以用来自Karl Züss公司的装备来自Mikrodrop公司的移液器的机器人将胺化的寡核苷酸(下文ODN)沉积在芯片表面的多个点上进行粘附。点的直径估计为约140μm。
制备待沉积的寡核苷酸的溶液：所用的溶液每种都包含将在芯片的参比范围的每个点上沉积的共10μM ODN(探针+惰性的)。它们可以含有参比探针ODN和惰性(非特异性)ODN的混合物，它们的比例为100％参比、10％参比、1％参比、0.1％参比和100％非特异的，即用5个点产生的参比范围。用来自Karl Züss公司的装备来自Mikrodrop公司的压电移液器的机器人在点的5条线上沉积这5种溶液。所沉积的点相距200μm。线之间的距离为约400μm。点直径为约140μm。
该实验中的所有寡核苷酸都具有22个碱基的长度。所用的序列如下：
- 探针寡核苷酸的序列(SEQ ID No.：1)：
5’(H2N-)ATGAACAAGTAGATAAATTAGT 3’
- 惰性寡核苷酸的序列(SEQ ID No.：2)：
5’(H2N-)CTAAAGGAATAGTGTAAATAAT 3’
-NH2基团用于粘附在该实施例中使用的戊二醛的醛上。(参比靶标寡核苷酸的序列在实施例3中描述)。
1.4杂交和标记
这些芯片与15nM HRP缀合物溶液在37℃杂交30分钟，洗涤，然后在Pierce底物混合物(″Super ELISA Femto Maximum SensitivityKit″)(注册商标)存在下成像。HRP缀合物是与探针寡核苷酸互补的寡核苷酸，其偶联HRP酶(HPR：辣根过氧化物酶)。
在湿室中37℃下TE 1X，NaCl 1M，Triton X-100 0.05％中进行所有杂交30分钟。杂交的体积为200μl(即，约3mm厚的液体层)。不搅拌。杂交后用TE 1X，NaCl 1M，Triton X-100 0.05％洗涤3次，每次400μl，然后用TE 1X，NaCl 1M洗涤一次。TE 1X表示：Tris 10mM，EDTA 1mM，pH8。
杂交和洗涤后，将芯片安装在阅读卡上。
1.5测定参比范围的信号和读数
除去冲洗介质，然后加入200μl底物混合物SuperSignal ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce，#37075(注册商标))。
图像采集：50张图像(具有增益(gain)15除数(divisor)15)(1.8张图像/s)，50张图像(具有增益0除数15)(1.8张图像/s)。第一个图像系列使得可以显现弱信号。第二个系列允许显现强信号，其饱和上面条件下的传感器。将50张发光图像按像素平均，并将50张黑色图像按像素平均。然后将黑色图像的平均值从发光图像的平均值扣除。在所得图像上，得到每个点的平均强度，并从它减去点周围的本底噪音的平均值。所得的值代表点的发光信号。
实际上，传感器的动态范围(理论上估计为320)不足以覆盖生物样品产生的信号的动态范围。因此必须对放大或曝光用两种不同的设置进行两次采集。所选条件(增益0/曝光560ms，和增益16/曝光560ms)使得可以对强信号得到不饱和图像和得到弱信号图像：图3中的照片，左边增益0，右边增益16。在右边的图像中，甚至在处理图像前，我们就可以清楚地区分点的四条水平线，从顶部到底部为：100％，10％，1％，0.1％参比，接着是不含有任何探针参比分子，但是仅含有惰性(非特异性)分子的点线，其不可见。
将处理的图像上点的灰度水平(GL)定量，然后归一化，并在图4中显示了所得值。在图4中，C1、C5、C6和C7(C代表芯片)代表根据本发明的四个不同芯片上的4次独立的实验。在纵轴上显示校正的信号(Sc)(以GL表示)，并在横轴上显示了捕获的探针分子的百分数(％SCS)。
从该图可以看出通过参比靶标进行的酶偶联的杂交使得可以在1000的使用范围内(从0.1％到100％)区分参比范围的每个点的表面浓度(这里，对参比靶标特异的捕获参比探针)。
该系统模拟所捕获的参比靶标的点的表面浓度的差异。因此，可以检测浓度范围，即动态检测范围为1000的靶标。
在为了阐明进行的该实例中，芯片与直接偶联HPR酶的寡核苷酸杂交。在实际应用中，在芯片上当然会有其他点，而不仅仅是参比点。因此，芯片将例如与以前用半抗原，如生物素标记的样品杂交。杂交期间，将向样品加入与参比寡核苷酸互补并且用生物素标记的寡核苷酸。杂交后，将孵育链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物，其将自身附着到芯片上存在的生物素。如上述，将进行发光显影。该“两次”方法用于下面的实施例中，但是用颗粒而不是酶作为标记物。
实施例2：用荧光颗粒直接标记靶标参比分子
在该实施例中，将在芯片(C)上杂交的靶标参比分子(TRM)用半抗原生物素(B)标记，在该情况中通过检测ODN(ODNd)。然后，发生“染色”阶段，将芯片表面与用链霉抗生物素蛋白(St)官能化的荧光颗粒(Pf)孵育，链霉抗生物素蛋白因此将固定在生物素(b)上。在下面给出序列。图7示意性显示了该方法中使用的生物化学机制，在芯片的表面(S)上：捕获ODN固定在形成芯片的基质上并起本发明的探针参比寡核苷酸(PRM)的作用；组合靶标+检测ODN起互补(靶标)寡核苷酸(TRM)的作用。捕获ODN(探针)由70个核苷酸组成。靶标由513个寡核苷酸组成。检测ODN由16个核苷酸组成。序列如下：
- 探针寡核苷酸的序列(SEQ ID No.：3)：
5′TCACTATTAT CTTGTATTAC TACTGCCCCT TCACCTTTCC AGAGGAGC
TT TGCTGGTCCT TTCCAAAGTG 3′
- 惰性寡核苷酸的序列(SEQ ID No.：4)：
5′ACTGTTACTG ACCTACCATT TGTTACCTAT GCTAAGCTCA TTGCACCT
CT GATTGCCGAG GCCTTTCTTT 3′
- 靶标寡核苷酸的序列(SEQ ID No.：5)：
5′ACAGCAGTAC AAATGGCAGT ATTCATCCAC AATTTTAAAA GAAAAGGG
GG GATTGGGGGG TACAGTGCAG GGGAAAGAAT AGTAGACATA ATAGCAAC
AG ACATACAAAC TAAAGAATTA CAAAAACCCT TACAAAAATT CAAAATTT
TC GGGTTTATTA CAGGGACAGC AGAAATCCAC TTTGGAAAGG ACCAGCAA
AG CTCCTCTGGA AAGGTGAAGG GGCAGTAGTA ATACAAGATA ATAGTGAC
AT AAAAGTAGTG CCAAGAAGAA AAGCAAAGAT CATTAGGGAT TATGGAAA
AC AGATGGCAGG TGATGATTGT GTGGCAAGTA GACAGGATGA GATTAGAA
CA TGGAAAAGTT TAGTAAAACA CCATATGTAT GTTTCAGGGA AAGCTAGG
GG TAGGTTTTAT AGACATCACT ATGAAAGCCC TCATCCAAGA ATAAGTTC
AG AAGTAAATCG AATTCCCGCG GCCATGGCGG CCGGGAGCAT GCGACGTC
GG GCCCAATTCG CCC 3′
检测寡核苷酸的序列(ODNd)(SEQ ID No.：6)：
5′TTCTGAACTTATTCTT 3′
该染色阶段的效率仍然难以理解，并且取决于实验条件、用于生产DNA芯片的表面化学、所用的荧光颗粒等等而变。从而，尽管可以分别计数颗粒，但是在现有技术的方法中仍然必须校准测量值以便能够相互比较实验。
所以，对于该类型的标记，本发明的益处使得可以有利地免除了该校准。
该实施例中形成芯片的基质是载玻片，25×75mm。对于所有操作，将载玻片浸入含有所需溶液的小烧杯中。操作如下：
上面实施例1的段落1.3.1的步骤(i)到(iv)应用于该基质。然后：
(1)固定前述探针和惰性寡核苷酸：通过微量加液器将10μM胺化的寡核苷酸作为3μl小滴手工沉积。点的大小为约3mm。在湿室中室温下过夜孵育。
制备待沉积的寡核苷酸溶液：沉积的捕获ODN的10μM混合物含有参比和非特异ODN的混合物，它们的比例为100％参比、1％参比、0.2％参比、0.1％参比、0.033％参比和100％惰性(非特异)分子(即，用6个点产生的参比范围)。手工沉积这6种溶液。
(2)固定后处理。醛的还原仍然存在：水30ml/NaBH4 105mg；室温孵育1h，不搅拌。用水冲洗5分钟，然后用5％十二烷基硫酸钠冲洗5分钟，然后再次用纯水冲洗5分钟。干燥。
(3)芯片的杂交和检测：将芯片与100nM的513个碱基的前述靶标分子(SEQ ID No.：5)在室温下TE NaCl 1M Triton 0.05％中杂交30分钟。然后这些芯片与检测寡核苷酸的200nM溶液在室温杂交1小时，然后洗涤。将该寡核苷酸用生物素标记。接着，将载玻片与100nm直径的neutravidin荧光颗粒孵育(Molecular Probes，T8861)。
杂交：所有杂交都在室温下TE 1X，NaCl 1M，Triton X-1000.05％中进行。不搅拌。杂交后用TE 1X，NaCl 1M，Triton X-1000.05％洗涤3次，然后用TE 1X，NaCl 1M洗涤1次。TE 1X指：Tris 10mM，EDTA 1mM，pH8。
(4)显影和读数：将荧光颗粒在TE NaCl 1M中以106个颗粒/μl在室温下孵育3小时。颗粒的直径为100纳米。
(5)数字结果的提取：每个点用荧光显微镜成像(荧光素管)。然后，手工或者通过matlab程序(注册商标)计数每个点上的颗粒密度。结果在这两种方法之间是一致的。
当然得到可用的参比范围。它在图5中显示为曲线图，纵轴上显示每10000μm2的颗粒数，横轴上为P(％PRM/(IM+PRM))。
当使用来自Quantum Dot Corp.公司的Quantum Dot(注册商标)荧光颗粒代替上面提到的标记物时，我们可以预期得到比这里用荧光乳胶得到的好得多的标记效率。
实施例3：样品的分析
作为实例，我们提出了一种简单的芯片，其用于患有上呼吸道感染的患者的初步筛选。该芯片预期更精确地检测造成细支气管炎的病毒RSV A和RSV B的存在，和造成流感的流感病毒A(Inf A)和流感病毒B(Inf B)的存在。
在所有情况中，它们是非常多形的RNA病毒；症状相对类似，并且这些病毒通常在婴儿、老年人和所有免疫抑制患者中是危险的。
所用的芯片将使用与实施例1中完全相同的技术，官能化化学方法与实施例2中的相同。
点(分析的以及参比范围点)有约160μm的直径，以300μm的间隔排列。根据本发明的芯片在图9中图示。所示的点为圆形。
对于RSV A、RSV B、Inf A和Inf B，以及对于“染色”对照和显影(T&R)，相同的点重复5次。
“染色”对照和显影(T&R)的点上的分子是与TRM分子相同的寡核苷酸，其在寡核苷酸生产期间已经用生物素标记。
在本发明含义中，阳性对照(C+)是参比范围，比例为100％、10％、1％、0.1％、0％(从左到右)。
将以下面的方式使用芯片：
a)生物学家根据现有技术的方法纯化样品的RNA。
b)将生物样品与生产期间用生物素标记的靶标参比分子混合。
c)根据LDC方法的变通方案之一用生物素标记样品，该方法是BioMérieux申请的专利申请的主题，所述专利申请对应于参考文献中[13]、[14]、[15]或[16]的家族中。
d)将芯片上的组件孵育(杂交阶段)，然后如实施例1中洗涤。
e)如实施例1，加入链霉抗生物素蛋白/HPR酶缀合物。在该阶段，缀合物自身附着到分析点上的分析物，以及附着到参比范围的点上存在的TRM分子，以及附着到“染色”对照和显影点的分子。
f)如实施例1通过发光显影。
TRM、惰性和PRM寡核苷酸的序列与实施例1的相同。
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Claims (19)
1.液体样品中存在的至少一种分析物的分析芯片，所述芯片包含：
a)所述至少一种分析物的至少一个分析点，所述分析点在芯片上如此排列使得允许识别和特异固定所述分析物；和
b)参比范围，也即G，所述参比范围包含一些参比点，每个参比点以确定的方式并且相互独立地在所述芯片上排列，该范围的每个参比点包含固定在其表面并且以确定的比例P--P对于每个点相对于所述范围的其他参比点不同--包含的：(i)至少一种探针参比分子，也即PRM，其识别和特异固定确定的靶标参比分子，也即TRM，和(ii)至少一种惰性分子，也即IM，其不能识别和结合所述靶标参比分子，所述探针参比分子和惰性分子都不能识别和固定一种或多种所述分析物；
并且0≤P≤1，RPM数与IM数之和在一个参比点与另一参比点之间是恒定的。
2.根据权利要求1的芯片，其中所述分析物和所述靶标参比分子性质相同。
3.根据权利要求2的芯片，其中所述分析物和所述靶标参比分子是寡核苷酸或抗体。
4.根据权利要求1的芯片，其中所述探针参比分子、所述靶标参比分子和惰性分子是寡核苷酸。
5.根据权利要求1或4的芯片，其中所述至少一种分析物是核酸，并且其中所述至少一个分析点是通过与所述核酸互补的核酸官能化的点。
6.根据权利要求1的芯片，其中所述参比范围的点在芯片上线性排列并且作为每个点的比例P的函数排列。
7.包含根据权利要求1的芯片的诊断试剂盒。
8.包含根据权利要求1的芯片的分析试剂盒。
9.根据权利要求1的芯片的用途，用于体外监视细胞或者组织中基因表达的差异。
10.根据权利要求1的芯片的用途，用于体外基因型分型的方法中。
11.体外分析可能存在于液体样品中的至少一种分析物的方法，其包括下面的步骤：
(α)任选地，在分析物上固定第一种检测手段；
(β)向包含任选标记的分析物的待分析样品加入靶标参比分子也即TRM，该靶标参比分子上已经任选固定与第一种检测手段相同或不同的第二种检测手段，所述TRM能够识别并特异结合根据权利要求1的分析芯片的探针参比分子也即PRM，所述TRM以足够量加入所述样品以饱和所述芯片的参比范围也即G的PRM，从而产生参比范围，其是对于每个参比点不同的确定比例P的函数；
(γ)将包含分析物和TRM的任选标记的待分析的样品与包含所述至少一种分析物的至少一个分析点的根据权利要求1的所述分析芯片在物理化学条件下接触，从而：一方面，待分析的分析物如果存在，将结合到芯片上它的分析点；另一方面，TRM特异识别PRM并且结合芯片的参比范围的多个参比点上的PRM；
(δ)确定参比范围的每个参比点发出的参比信号，如果由于第二种检测手段而可适用，所述信号是固定在参比点上的靶标参比分子的量的函数；和
(ε)确定所述至少一个分析点发出的分析信号，如果由于第一种检测手段而可适用，所述分析信号是该分析点固定的分析物的量的函数，并与步骤(δ)中确定的信号比较以将该分析信号表达为P的函数。
12.根据权利要求11的方法，其中所述分析物和靶标参比分子性质相同。
13.根据权利要求12的方法，其中所述分析物和所述靶标参比分子是寡核苷酸或抗体。
14.根据权利要求11的方法，其中所述探针参比分子、所述靶标参比分子和惰性分子是寡核苷酸。
15.根据权利要求11或14的方法，其中所述至少一种分析物是核酸，并且其中所述至少一个分析点是通过与该核酸互补的核酸官能化的点。
16.根据权利要求11或15的方法，其中所述第一种和第二种检测手段分别包括第一种标记物和第二种标记物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述第一种和第二种标记物独立地选自荧光标记、放射性标记、酶标记、乳胶颗粒、光子晶体，和胶体金。
18.根据权利要求11的方法，其中测定参比范围的每个点和/或每个分析点的信号是通过选自通过表面等离子体共振检测的方法、光热检测方法、椭圆光度法、光度检测方法的方法进行的。
19.根据权利要求11的方法，其中所述分析是检测或者定量分析。
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