EA006425B1 - Система для определения одной или нескольких мишеней в образце и способы ее применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается композиций, устройства и способов, применимых для одновременного осуществления множественных высокопроизводительных биологических или химических тестов с использованием повторяющихся наборов зондов. Сочетание по настоящему изобретению включает поверхность, которая несёт множество тест-участков, по крайней мере два из которых, а в предпочтительном варианте по крайней мере двадцать из которых существенно идентичны друг другу, причем каждый из этих тест-участков включает набор родственных якорных молекул. Эти якори связаны с бифункциональными линкерными молекулами, каждая из которых включает часть, специфичную в отношении по крайней мере одного из якорей, и часть в виде зонда, специфичного в отношении представляющей интерес мишени. Полученный в результате набор зондов используют для анализа присутствия или тестирования активности одной или большего числа молекул-мишеней, которые специфическим образом взаимодействуют с данными зондами. В одном из вариантов настоящего изобретения тест-участки (которые могут быть лунками) дополнительно подразделены на более мелкие суб-участки (углубления или «ямки»). В одном из вариантов настоящего изобретения осуществляют картирование маркёров EST. В другом варианте присутствие нуклеиновой кислоты-мишени детектируют путём защиты этой мишени от действия нуклеаз с помощью защитного фрагмента с последующим анализом защищённого полинуклеотида с применением масс-спектрометрии.

Description

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение касается, например, композиций, устройства и способов, применимых для одновременного проведения множественных биологических или химических тестов с использованием повторяющихся наборов зондов. Каждый из множества участков содержит набор родственных «якорных» молекул. Эти якори находятся в связи с бифункциональными линкерными молекулами, каждая из которых включает участок, специфичный в отношении по крайней мере одного из якорей, и участок, являющийся зондом, специфичным для интересующей мишени. Полученный в результате набор зондов используют для анализа присутствия одной или большего числа молекул-мишеней, которые специфическим образом взаимодействуют с данными зондами. Настоящее изобретение касается ряда областей знаний, что определяется природой молекулярных взаимодействий, включая, но тем самым не ограничиваясь, разработку новых лекарственных средств, молекулярную биологию, биохимию, фармакологию и методологию медицинской диагностики.

Множественные молекулярные зонды, расположенные на поверхностях или «чипах», используются в различных биологических и химических тестах. Тесты осуществляют с целью определения того, взаимодействуют ли интересующие молекулы с этими зондами. После контакта зондов с молекуламимишенями в выбранных условиях проводимого теста с помощью детекционных устройств определяют, произошло ли взаимодействие между мишенью и данным зондом.

Такие системы применимы в различных поисковых процедурах с целью получения информации как о самих зондах, так и о молекулах-мишенях. Например, они используются для скрининга пептидов или потенциальных лекарственных средств, которые, помимо прочего, связываются на интересующем рецепторе; для скрининга образцов на присутствие в них, например, генетических мутаций, аллельных вариантов в популяции или для скрининга конкретного патогена или патогенного штамма, помимо многих других путей применения; для изучения экспрессии генов, например, для идентификации видов мРНК, экспрессия которых коррелирует с конкретным физиологическим параметром, стадией онтогенеза или заболеванием, и т. п.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет композиции, устройство и способы одновременного проведения множественных биологических или химических тестов, обеспечивающих высокопроизводительный анализ множественных образцов, например, образцов от группы пациентов, которые необходимо подвергнуть скринингу в диагностическом тесте, или группы потенциальных лекарств или терапевтических средств, предназначенных для тестирования в способе разработки лекарств. Представляется сочетание, применимое для детекции одной или большего числа мишеней в одном образце. Это сочетание включает поверхность, несущую множество пространственно разобщённых участков, которые могут быть определены как «тест-участки» и которые могут быть планшетными лунками, при том, что по крайней мере два из них существенно идентичны. На каждой такой поверхности находится по крайней мере два, предпочтительно по крайней мере двадцать или более, например, по крайней мере примерно 25, 50, 96, 864 или 1536 и т.п. таких существенно идентичных участков. Каждый «тест-участок» представляет собой пространство для внесения образца, содержащего (или предположительно содержащего) одну или несколько мишеней, при том, что в этом пространстве находится биологический или химический набор. (Такие выражения, как «образец, содержащий мишень» или «детекция мишени в образце», не призваны исключить образцы или определения, т.е. попытки детекции, в которых выявляется отсутствие мишени. В общем смысле, настоящее изобретение включает наборы, предназначенные для поиска мишени в образце вне зависимости от того, имеется она в нём или нет). Данный набор состоит из родственных «якорей», каждый из которых связан с бифункциональной линкерной молекулой, первая часть которой специфична в отношении данного якоря, а вторая её часть включает зонд, специфичный в отношении по крайней мере одной из мишеней. Сочетанию по настоящему изобретению обеспечивают контакт с образцом, содержащим одну или большее число мишеней, которое необязательно реагирует с детекторной(ыми) молекулой(ами), после чего оно тестируется детекторным устройством, которое определяет реакции, произошедшие между молекулами и зондами в данных тест-участках, тем самым определяя результаты данного теста.

Настоящее изобретение представляет способы и композиции, в частности, применимые для высокопроизводительных биологических тестов. В наиболее предпочтительных вариантах настоящее изобретение может быть использовано для высокопроизводительного скрининга, необходимого в разработке новых лекарств. Например, высокопроизводительный тест может быть осуществлён в большом числе (например, в сотне) 96-луночных микропланшетов одновременно. Каждая лунка планшета может, например, соответствовать 36 различным тестам за счёт использования набора из примерно 36 пар якорей и линкеров. Это значит, что 100 планшетов о 96 лунках каждый при 36 тестах в каждой лунке могут позволить провести 345 тысяч тестов: например, 9600 предполагаемых лекарственных средств могут быть одновременно протестированы по 36 различным параметрам или тестам. Высокопроизводительные тесты

- 1 006425 представляют намного больше информации для каждого предполагаемого лекарства по сравнению с тестами, в которых в данный момент времени тестируется единственный параметр. Например, возможным является в одном одновременно проводимом высокопроизводительном тесте определить, является ли предполагаемое лекарство избирательным, специфичным и (или) нетоксичным. В случае применения невысокопроизводительных способов необходимым окажется экстенсивное тестирование таких параметров в отношении каждого из представляющих интерес лекарств. Некоторые варианты высокопроизводительных скрининг-тестов описаны, например, в примерах 15-17. Возможность одновременного осуществления широкого круга биологических тестов и возможность выполнять одновременно множество тестов (т.е. очень высокая производительность или «пропускная способность») являются двумя важнейшими преимуществами настоящего изобретения.

В одном из вариантов, например, при использовании 96-луночных планшетов ΌΝΆ Βίηά (Согшпд Сош81аг), выполненных из полистирола с поверхностью, дериватизованной для прикрепления первичных аминов, таких как аминокислоты или модифицированные олигонуклеотиды, набор из 36 различных олигонуклеотидов, выполняющих роль якорей, может быть нанесён на поверхность каждой лунки каждого планшета. Эти якори могут быть ковалентно присоединены к дериватизованному полистиролу и те же 36 якорей могут быть использованы при проведении скрининг-тестов. Для любого конкретного теста данный набор линкеров может быть использован для «программирования» поверхности каждого планшета таким образом, чтобы он был специфичен в отношении 36 различных мишеней или типов тестов, а различные тестируемые образцы могут быть применены в отношении каждой из 96 лунок каждого планшета. Такой же набор якорей может быть использован многократно для перепрограммирования поверхности лунок для других мишеней или тестов или же он может быть неоднократно вновь использован с тем же самым набором линкеров. Такая пластичность и неоднократная применимость представляют следующие преимущества настоящего изобретения.

Одним из вариантов настоящего изобретения является сочетание, применимое для детекции одного или большего числа мишеней в образце, которое до момента добавления упомянутого образца включает (a) поверхность, несущую множественные пространственно разобщённые участки, при том, что по крайней мере два из них существенно идентичны, а каждый участок включает (b) по крайней мере восемь различных олигонуклеотидных якорей, каждый из которых связан с (c) бифункциональным линкером, включающим первую часть, специфичную в отношении олигонуклеотидного якоря, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении упомянутой(ых) мишени(ней).

Другим вариантом настоящего изобретения является сочетание, применимое для детекции одной или большего числа мишеней в образце, которое перед добавлением упомянутого образца включает:

(а) поверхность, несущую множественные пространственно разобщённые участки, при том, что по крайней мере два из них существенно идентичны, а каждый участок включает (в) по крайней мере восемь различный якорей, каждый из которых связан с (с) бифункциональным линкером, включающим первую часть, специфичную в отношении олигонуклеотидного якоря, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении упомянутой(ых) мишени(ней).

Ещё один вариант настоящего изобретения представляет способ детекции по крайней мере одной мишени, который включает контактирование образца, который может содержать мишень (мишени), с упомянутым выше сочетанием в условиях, обеспечивающих эффективное связывание упомянутой(ых) мишени(ней) с упомянутым сочетанием. Другой вариант представляет способ определения параметров экспрессии РНК, который включает инкубацию образца, содержащего являющиеся мишенями по крайней мере две молекулы РНК, с сочетанием, описанным выше, при том, что по крайней мере один зонд в составе данного сочетания является нуклеиновой кислотой (например, олигонуклеотидом), которая специфична (т.е. селективна) в отношении по крайней мере одной из РНК-мишеней, в условиях, которые обеспечивают эффективную гибридизацию РНК-мишени (РНК-мишеней) с зондом (зондами). В другом варианте представляется способ идентификации агента (или условий), который модулирует параметры экспрессии РНК, дополнительно включающий сравнение параметров экспрессии РНК, проявленных в присутствие упомянутого агента (или условий), с параметрами экспрессии РНК, проявленными при другом комплексе условий.

В качестве примера фиг. 1 и 2 иллюстрируют сочетание по настоящему изобретению и способ его применения для детекции мРНК-мишени. На поверхности в соответствии с настоящим изобретением, показанной на фиг. 2, сформированы 1 5 идентичных тест-участков: в наиболее предпочтительном варианте настоящего изобретения каждый из этих тест-участков является лункой микротитровального планшета. В каждом из тест-участков имеется шесть различных якорей, которые в данном случае пронумерованы от 1 до 6. На фиг. 1 схематически показан один из таких якорей - якорь 1 , который в соответствии с одним из конкретных предпочтительных вариантов изобретения является олигонуклеотидом. К якорю 1 присоединена линкерная молекула линкер 1, которая включает две части. Первая её часть, специфичная в отношении данного якоря, на данной фигуре является олигонуклеотидом, который может гибридизовать с якорем. Вторая её часть, которая является зондом, специфичным в отношении интересующей ми

- 2 006425 шени (здесь это мРНК-мишень 1), на данной фигуре является олигонуклеотидом, который способен гибридизовать с данной мишенью. Хотя это на данной фигуре и не показано, каждый из остальных пяти якорей может гибридизовать со своим линкером через специфичную в отношении якоря часть; каждый линкер может включать в качестве своей части зонд, специфичный в отношении, например, мРНК, отличной от мРНК 1 (или совпадающей с ней). Описанное иллюстрирует сочетание, которое может быть использовано для тестирования по меньшей мере 15 различных образцов одновременно на присутствие мРНК 1 (или одновременно на мРНК-мишени, которые специфичны, будучи запрограммированными, для пяти других зондов данного набора). Для проведения такого теста каждый образец, который в данном примере может представлять собой экстракт РНК, скажем, из 1 5 независимых клеточных линий, добавляют в небольшом количестве к одному из тест-участков (или лунке) и инкубируют в условиях, эффективных с точки зрения гибридизации зонда и мишени. С целью определения присутствия мРНК 1 в образце используют детекционное устройство, которое способно распознавать соответствующие параметры и (или) может определять конкретные положения в каждом из участков в связи с присутствием сигнала. Если клеточные линии инкубируют в условиях, в которых их мРНК помечены ίη νίνο, и если мРНК 1 присутствует в образце, то детектор должен обнаружить сигнал, создаваемый помеченной мРНК в том месте, которое определяется комплексом «якорь/зонд» 1. С другой стороны мРНК может быть напрямую помечена ίη νίίτο - до или после её добавления к участкам (лункам). С другой стороны, как показано на фиг. 1 , мРНК может быть помечена косвенно - до или после того, как она гибридизует с зондом, например, путём инкубации этой РНК с помеченным «детекторным» олигонуклеотидом (специфичный в отношении мишени репортерный олигонуклеотид), который комплементарен последовательности, отличной от той последовательности, которая распознаётся данным зондом. В иллюстрируемом примере 15 образцов могут быть проанализировано одновременно. Поскольку по крайней мере 20 или больше, например по меньшей мере 1536 или больше, образцов может быть протестировано одновременно в соответствии с настоящим изобретением, то данная система является высокопроизводительной.

По использованию в данном тексте термин «мишень» обозначает субстанцию, присутствие, активность и (или) количество которой желательно установить и которая характеризуется аффинностью в отношении данного зонда. Мишенями могут быть «самодельные» или естественно встречающиеся субстанции. Также они могут быть прикреплены (ковалентно или нековалентно) к связывающему компоненту как напрямую, так и опосредованно через специфический связывающий компонент. Примерами мишеней, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, тем самым не исчерпываясь, рецепторы (находящиеся на везикулах, липидах, клеточных мембранах или являющиеся различными иными рецепторами); лиганды, являющиеся агонистами или антагонистами, связывающимися с конкретными рецепторами; поликлональные антитела, моноклональные антитела и антисыворотки, реактивные в отношении специфичных антигенных детерминант (таких как вирусы, клетки или другие материалы); лекарственные средства; нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды (включая мРНК, тРНК, рРНК, олигонуклеотиды, ДНК, вирусные РНК или ДНК, последовательности Е8Т, кДНК, ПЦРамплифицированные продукты, производные от РНК или ДНК, а также их мутации, варианты или модификации); белки (включая ферменты, такие как ферменты, вовлечённые в процессинг предшественников нейротрансмиттеров, протеазы, киназы и подобное); субстраты для ферментов; пептиды; кофакторы; лектины; углеводы; полисахариды; клетки; клеточные мембраны; клеточные органеллы и т.д., равно как и другие молекулы или другие субстанции, которые могут существовать в комплексной ковалентно связанной перекрёстными сшивками, форме и в других формах. В данном тексте термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид», «полинуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» взаимозаменяемы. Мишени также могут обозначаться как «антизонды».

По использованию в данном тексте термин «зонд» обозначает субстанцию, например молекулу, которая может специфическим образом распознавать конкретную мишень. Примерами возможных партнёров по связыванию «зонд/мишень» или «мишень/зонд» являются пары «рецептор/лиганд»; «лиганд/антилиганд»; взаимодействия нуклеиновых кислот (полинуклеотидов), включая ДНК/ДНК, ДНК/РНК, «РНП (нуклеопротеин)/нуклеиновая кислота»; ферменты или другие катализаторы, или иные субстанции и их субстраты, небольшие молекулы или эффекторные молекулы и т. д.

Примерами зондов, которые представляются настоящим изобретением, являются, тем самым не ограничиваясь, органические и неорганические материалы или полимеры, включая металлы, хелатирующие агенты или другие соединения, которые взаимодействуют с металлами специфическим образом, пластмассы, агонисты и антагонисты рецепторов клеточных мембран, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны (например, опиоидные пептиды, стероиды и т.п.), рецепторы гормонов, липиды (включая фосфолипиды), пептиды, ферменты (такие как протеазы или киназы), субстраты ферментов, кофакторы, лекарственные средства, лектины, углеводы, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды, ДНК, РНК, РНП или модифицированные или замещённые нуклеиновые кислоты), олигосахариды, белки, ферменты, поликлональные и моноклональные антитела, одноцепочечные иммуноглобулины или их фрагменты. Полимерные зонды могут быть как линейными, так и циклическими. Зонды могут различать фосфорилированные и нефосфорилированные белки за счёт как их различной активности, так и по их дифференцированному связыванию. Такие зонды, как лектины, могут распознавать гликозилированные белки. По

- 3 006425 использованию в данном тексте термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид», «полинуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» используются вперемежку. Любая из субстанций, описанных выше в качестве «зонда», может являться и «мишенью», и наоборот.

В соответствии с настоящим изобретением может быть использована любая совместимая поверхность. Такой поверхностью (обычно твёрдой) может являться любой из органических или неорганических материалов или их комбинаций, включая, что приводится исключительно в качестве примера, пластики, такие как полипропилен или полистирол; керамику; силикон; кремнезём, кварц или стекло, которые могут иметь толщину как предметного, так и покровного стекла; бумагу, например фильтровальную бумагу; диазотизированную целлюлозу; нитроцеллюлозные фильтры; нейлоновую мембрану или подушечку полиакриламидного геля. Прозрачные для видимого света субстраты используют тогда, когда в детекционном способе применяется оптическая детекция. В предпочтительном варианте такой поверхностью является поверхность многолуночного планшета, например планшета для тканевых культур, например, 24-, 96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночного планшета (например, модифицированного планшета, такого как - Согшпд Сок1аг ΌΝΆ-Βίηά). Якори могут быть связаны, например соединены, напрямую с поверхностью или могут быть связаны с одним типом поверхности, например стеклом, которая, в свою очередь, находится в контакте с другой поверхностью, например с пластиковой «лункой», в микротитровальной кювете. Форма данной поверхности несущественна. Она может быть, например, плоской поверхностью, такой как квадрат, прямоугольник или круг; искривлённой поверхностью или трёхмерной поверхностью, такой как шарик, частица, цепочка, преципитат, пробирка, сфера и т.п.

На данной поверхности находятся участки, которые пространственно разобщены и при этом «адресны» или идентифицируемы. В каждом таком участке имеется набор якорей. То, как эти участки разграничены, их физические параметры и их ориентация относительно друг друга не являются существенными параметрами. В одном из вариантов эти участки могут быть отделены друг от друга физическими преградами, которые непреодолимы для жидкостей. Например, в предпочтительном варианте эти участки могут быть лунками многолуночной кюветы (например, предназначенной для тканевых культур), например 24-, 96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночного планшета. С другой стороны, такая поверхность, как поверхность стекла, может быть вытравлена таким образом, чтобы на ней образовались, например, 864 или 1536 небольших дискретных лунок. С другой стороны, поверхность может включать участки без разделителей или лунок, например она может быть плоской поверхностью, например, куском пластика, стекла или бумаги, на которой отдельные участки могут определяться перекрыванием структуры (например, куска пластика или стекла), которая определяет отдельные участки на ней. Необязательно на поверхности уже могут находится один или большее число наборов якорей или якорей, связанных с линкерами, перед тем, как будут размечены отдельные её участки. В другом варианте наборы якорей на каждом из участков могут быть отделены один от другого пустым пространством на данной поверхности, на котором якори отсутствуют, или химическими разделителями, такими как воск или силикон, что предотвратит растекание капель. Ещё в одном варианте эти участки могут быть определены в виде трубок или канальцев, например, предназначенных для тестов по контролю протекающих жидкостей, описанных, например, у ВеаШе с1 а1., 1995, С1ш. СЬет.. 4, 700-706. Участки на поверхности также могут быть размечены путём модифицирования самой поверхности. Например, пластмассовая поверхность может нести участки, изготовленные из модифицированного или изменённого пластика, которые могут служить, например, в качестве сайтов для добавления конкретных типов полимеров (например, полиэтиленгликоль может быть нанесён на полистироловую поверхность и затем дериватизован карбоксильными или аминогруппами, двойными связями, альдегидами и подобным). С другой стороны, пластиковая поверхность может нести формованные участки по типу выступов или выпуклостей, которые могут служить «платформами» для размещения якорей. Относительная ориентация тест-участков может принимать любую форму, включая, но тем самым не ограничиваясь, параллельные или перпендикулярные ряды на квадратной или прямоугольной поверхности, радиально расположенные ряды на круглой или иной формы поверхности или линейные ряды и т. п.

Пространственно разобщённые участки в соответствии с настоящим изобретением присутствуют во множественных копиях. Т. е. имеется по крайней мере два, предпочтительно по крайней мере двадцать или по крайней мере 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025 или больше и т.д., существенно идентичных пространственно разобщённых (дискретных) участков. Увеличение числа повторяющихся участков может позволить проводить более высокопроизводительные тесты. По использованию в данном тексте выражение «по сути (существенно) идентичные участки» определяет участки, которые включают идентичные или существенно идентичные наборы якорей и (или) комплексов «якорь/линкер». Термин «существенно идентичные» по использованию в данном тексте обозначает, что набор или участок призван выполнять существенно такие же функции, что и другой набор или участок, в контексте проведения анализа мишени в соответствии с настоящим изобретением. Различия, которые в существенной степени не обусловливают изменения функций, т.е. выявляемости мишеней, представлены небольшими нуклеотидными дефектами (замены, вставки, делеции) или дефектами олигонуклеотидов (ухудшенное связывание на поверхности) и т.п., которые в объёме точности проводимого теста не приводят к существенному искажению результатов выявления мишени.

- 4 006425

Конечно, специалисту в данной области техники будет ясно, что не все участки поверхности должны быть существенно идентичными друг другу. Например, если два разных набора рядов предназначены для параллельного тестирования, то предпочтительным будет размещение обоих наборов на одной и той же поверхности. Например, два разных набора рядов могут быть сформированы в виде перемежающихся полос, что облегчит проведение сравнений между ними. В другом варианте у практика может возникнуть желание включить один или несколько участков, которые бы могли быть обособлены с помощью отличающегося способа от других участков на данной поверхности, тем самым используясь в качестве «регистрационных участков». Например, регистрационный участок может нести олигонуклеотиды или пептиды, которые характеризуются отличающимися свойствами флуоресцирующих молекул, которые могут быть выявлены путём сканирования в качестве «стартовых участков» для сопоставления параметров локализации остальных участков на этой поверхности.

Размер и физическое распределение тест-участков ничем не ограничено. Типичные участки представляют собой область площадью примерно 1-700 мм², предпочтительно примерно 1-40 мм², которые расположены примерно в 0,5-5 мм друг от друга, а эти величины выбираются стандартным образом в зависимости от используемой площади. В предпочтительном варианте участки удалены друг от друга на 5 мм. Например, каждый участок может нести прямоугольный грид («сеточку») а, например, с 8 рядами и 6 столбцами с приблизительно округлой формы пятнами якорей диаметром примерно 100 мкм, удалёнными друг от друга на 500 мкм, такой участок в целом будет покрывать площадь примерно в 20 мм². Включаются и большие, и меньшие значения площади и участка и дистанций между ними.

Такие участки также могут быть дополнительно подразделены таким образом, чтобы некоторые или все якори в пределах одного участка были физически разобщены с соседними якорями за счёт, например, углубления или ямки. Например, число подразделений («суб-участков») в участке может варьироваться от примерно 10 до примерно 100 или больше, или меньше этого. В одном из вариантов участок, являющийся лункой 1536-луночного планшета, может быть дополнительно подразделён на меньшие лунки, например примерно на 4-900, а предпочтительно на примерно 16-36 лунок, тем самым образуя структуру «лунки-в-лунке» (см. фиг. 4). Такая выемчатая поверхность снижает допуски, необходимые для физического размещения отдельного якоря (или группы якорей) в каждый определённый сайт («локус»), и к тому же размер зон, несущих якори, становится более однообразным, что облегчает детекцию мишеней, связывающихся с данным зондом.

Термин «якорь» по использованию в данном тексте обозначает любую составляющую или субстанцию, например молекулу (или «группу» существенно идентичных подобных субстанций, см., например, фиг. 7), которые связаны с поверхностью (например, иммобилизованы на неё или присоединены к ней ковалентным или нековалентным образом) или которые являются частью такой поверхности (например, производной частью пластмассовой поверхности) и которые могут участвовать в специфическом взаимодействии или ассоциировании с линкером или иной субстанцией в соответствии с описанным в данном тексте. По использованию в данном тексте термин «комплекс якорь/линкер» обозначает тот случай, когда якорь и линкер объединены молекулярными связями по специфическому типу. Такое взаимодействие с линкером может быть как необратимым, например, в результате образования нескольких ковалентных связей, так и обратимым, например, в процессе гибридизации нуклеиновых кислот. В предпочтительном варианте якорем является нуклеиновая кислота, длина которой (например, он является олигонуклеотидом) и тип которой (например, ДНК, РНК, РНП или ПЦР-продукт молекулы РНК или ДНК) могут быть любыми. Нуклеиновая кислота может быть модифицирована или замещена (например, путём включения ненативных нуклеотидов, таких как, например, инозин; скомпонована с использованием различных известных видов связей, таких как сульфаматная, сульфамидная, фосфотионатная, метилфосфонатная, карбаматная и т.п.; или может быть полусинтетической молекулой, такой как ДНК-стрептавидиновый комплекс и т.п.). Предпочтительными являются одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Также якорь может быть белком или пептидом. Например, он может являться поликлональным или моноклональным антителом, или его фрагментом, или одноцепочечным иммуноглобулином или его фрагментом, который специфическим образом связывается с той частью линкера, которая является антигеном или анти-антителом; надо отметить, что якорь может быть пептидом, а та часть линкера, которая с ним связывается, может являться антителом или подобным. В другом варианте якорь может быть лектином (таким как конканавалин-А или агглютинины таких организмов, как слизень Ыти1и5. арахис, фасольмаш, фасоль рода Рйа8ео1и8, зародыши пшеницы и т.п.), которые специфичны в отношении конкретного углевода. В другом варианте якорь может быть органической молекулой, такой как модифицированная или производная полимерная пластмасса, которая может служить, например, в качестве этапа в конкретном твёрдофазном химическом синтезе олигонуклеотида. В этом случае производный пластик может быть распределён в виде ряда производных разобщённых сайтов, которые вместе друг с другом формируют поверхность пластика как части сочетания непосредственно при её производстве. В другом варианте якорь может обеспечивать преимущества специфичного или предпочтительного связывания между ионами металла, например никеля, цинка, кадмия, марганца и т.п., и конкретными белками или хелатирующими агентами. Например, якорь может являться полигистидином, а специфичной в отношении якоря частью линкера может быть никель, который через никель-хелатирующий агент прикрепляется к спе

- 5 006425 цифичному в отношении такой мишени зонду. С другой стороны, хелатирующий агент может быть якорем, а полигистидин - соответствующим ему участком зонда. С другой стороны, якорь может быть неорганическим соединением. Например, он может быть металлом, таким как кальций или магний, а специфичной для якоря частью линкера может быть предпочитаемый хелатирующий агент, такой как ΕΌΤΆ или ЕСТА, соответственно, который присоединяется к специфичному в отношении мишени зонду. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что широкий круг других молекул также может выполнять роль якорей, таких как те основные их типы, которые также рассматриваются в связи с обсуждением типов зондов и мишеней.

Количество якорей в тест-участке может составлять по крайней мере два, предпочтительно примерно 8-900 (большие и меньшие значения также включаются), более предпочтительно примерно 8-300 и наиболее предпочтительно примерно 30-100 (например, примерно 64). В некоторых предпочтительных вариантах на поверхности с 96 тест-участками (например, лунками) имеется примерно 16, 36, 4 5 или 100 якорей в расчёте на один тест-участок или на поверхности с 384 тест-участками (например, лунками) имеется примерно 9, 16 или 25 якорей в расчёте на один тест-участок. В наиболее предпочтительном варианте каждый якорь в тест-участке характеризуется отличающейся специфичностью по сравнению с каждым из других якорей в данном наборе. Однако два или большее число якорей могут проявлять одинаковую специфичность или же все якори набора могут быть идентичными. В одном варианте, в котором сочетание по настоящему изобретению включает очень большое число тест-участков (например, примерно 864, 1536 или больше), т.е. одновременно может быть обработано большое количество тестируемых образцов, может быть интересным протестировать эти образцы только по ограниченному числу (например, примерно 2, 4, 6 или 9) параметров. Другими словами, для сочетаний, включающих очень большое число участков, предпочтительным является наличие лишь примерно 2-9 якорей на одном участке.

Физическое распределение и относительная ориентация якорей в тест-участке (или на нём) ничем не ограничиваются. Обычно расстояние между якорями составляет примерно 0,003-5 мм или меньше, а предпочтительно примерно 0,03-1 мм. Также включаются большие и меньшие расстояния между якорями (и зонами). Якори могут быть размещены в любой ориентации по отношению друг к другу и по отношению к границам участка. Например, они могут быть размещены в двумерном распределении, таком как квадрат, прямоугольник, шестиугольник и подобная форма или в круговой форме, в которой якори располагаются радиально от центра или концентрическими кругами. Также якори могут быть размещены в одномерной форме, т.е. линейно. Например, олигонуклеотиды могут быть гибридизованы с конкретными положениями вдоль последовательности ДНК или РНК с образованием надмолекулярного ряда. С другой стороны, якори могут быть размещены в формате линии кодирования («штрих-кода») (см. фиг. 6). Например, якори могут быть размещены в виде длинных линий, параллельных друг другу. Расстояние между линиями или ширина этих линий могут варьироваться регулярным образом с получением простой распознаваемой схемы, напоминающей штрих-код: например, первая и третья линии могут быть вдвое толще остальных, эти линии можно пропускать и т. п. Дополнительная пустая линия может быть помещена после последней линии с целью ограничения тест-участка, и затем набор штрих-кода может быть повторён на последующих тест-участках.

Расположение якорей необязательно должно находиться в жёстком соответствии с положениями разграниченных тест-лунок (тест-участков) или отдельных тестируемых капель. Термин «тестположение» будет использоваться для обозначения положения на тест-поверхности, на которое будут наноситься тестируемые образцы. (Например, это может определяться положением отдельных капель тестируемого образца или положением лунок или сепараторов, определяющих лунки конкретного теста на многолуночном планшете). Само по себе распределение якорей (например, схема типа штрих-кода в приложении к олигонуклеотидным якорям) используется для того, чтобы определить точное расположение каждого отдельного якоря в данной схеме, т.е. как каждая линия штрих-кода распознаётся по её положению относительно остальных линий. Следовательно, первый якорь должен находиться на одном краю или в одном углу каждого тест-положения. Положение первого якоря должно определяться общей схемой в большей степени, нежели расположением по отношению к тест-положению. Поскольку площадь, используемая каждым тест-положением (например, площадь капли или площадь лунки), достаточно велика для того, чтобы содержать по крайней мере одну полную единицу повторяющегося набора якорей, то каждая тест-точка будет обеспечивать тестирование образца по данному тест-положению по всем тем мишеням, которые маркируются данной схемой (данным штрих-кодом) независимо от расположения этой площади в пределах тест-положения.

Отсутствует необходимость в строго постоянном или даже фиксированном расположении якорей в пределах каждого тест-участка. Например, каждый якорь может быть присоединён к частице, шарику или подобному, в результате чего достигается случайное расположение в пределах тест-участка. Локализация каждого якоря может быть определена с использованием, например, выявляемой метки. Например, линкерная молекула, специфичная в отношении каждого типа якоря, может быть помечена с помощью различных флуоресцентных, люминесцентных и т. п. меток, а положение частицы, несущей конкретную пару «линкер/якорь», может быть идентифицировано исходя из природы сигнала, считываемого с линкера, например, по возбуждаемому или эмитируемому спектру. Специалист в данной области техники мо

- 6 006425 жет сформировать набор линкеров с различными присоединёнными метками, каждая из которых имеет отличающийся спектр. С другой стороны, якори могут быть помечены напрямую. Например, каждый тип якоря может быть помечен маркёром, который флуоресцирует со спектром, отличным от таковых у меток, находящихся на других типах якорей. С другой стороны частицы, шарики или подобное могут быть дифференцированы друг от друга по размеру или по форме. Могут быть использованы любые из описанных в данном тексте методов мечения и детекции. Например, флуоресценция может быть замерена в системе измерений ССЭ с помощью флуоресцентного микроскопа или с помощью клеточного сортера с активируемой флуоресценцией (ЕАС8).

Якорь может взаимодействовать или связываться специфическим образом с одной частью (специфичной в отношении якоря частью) линкерной молекулы. Термины «взаимодействует» или «связывается» обозначают здесь то, что две субстанции или два соединения (например, якорь и якорь-специфичная часть линкера, зонд и соответствующая ему мишень или мишень и мишень-специфичный репортер) соединяются друг с другом (например, присоединяются, связываются, гибридизуют, отжигаются, связываются ковалентными связями или ассоциируются какими-либо иными путями) настолько существенно, чтобы мог быть проведён заявленный тест. Термины «специфичный» или «специфичным образом» обозначают здесь то, что два компонента (например, якорь и якорь-специфичный участок линкера, зонд и соответствующая ему мишень или мишень и мишень-специфичный репортер) избирательно связываются друг с другом, а без применения любого из методов защиты не связываются в принципе с другими компонентами, непредназначенными для связывания с данными компонентами. Параметры, необходимые для достижения специфичных взаимодействий, могут быть определены стандартными способами, например с помощью стандартных известных в науке методов.

Для нуклеиновых кислот, например, специалист в данной области техники сможет определить экспериментальным путём свойства (такие как длина, состав нуклеотидов и степень комплементарности), которые обеспечат нуклеиновой кислоте (например, олигонуклеотидному якорю) способность гибридизовать с другой нуклеиновой кислотой (например, якорь-специфичной частью линкера) в условиях избирательной жёсткости с минимизацией неспецифической гибридизации с другими веществами или молекулами (например, другими олигонуклеотидными линкерами). Обычно ДНК или последовательность другой нуклеиновой кислоты в составе якоря, часть линкера или детекторный олигонуклеотид должны характеризоваться существенным уровнем комплементарности по отношению к партнёру по связыванию с целью обеспечения гибридизации в условиях избирательной жёсткости, а величина Т_т должна превышать примерно на 10-20°С комнатную температуру (например, примерно 37°С). В целом, олигонуклеотидный якорь может иметь в длину от примерно 8 до примерно 50 нуклеотидов, а предпочтительно состоять из примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. По использованию в данном тексте выражение «высокий уровень жёсткости условий гибридизации» обозначает любые условия, при которых гибридизация будет иметь место в случае, если уровень комплементарности (идентичности) нуклеиновых кислот составляет по крайней мере 95%, предпочтительно примерно 97-100%. Однако в зависимости от ставящихся задач условия гибридизации могут выбираться так, чтобы требовался меньший уровень комплементарности, например, примерно 90, 85, 75, 50% и т.п. Среди параметров реакции гибридизации, которые могут варьироваться, концентрация солей, параметры буфера, величина рН, температура, продолжительность инкубации, количество и тип денатурирующего агента, такого как формамид, и др. (см., например, 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 26 еб. , Уо1. 1-3, Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк, ΝΥ; Натек е! а1., 1985, ШсШс Ас1б НуЬпб|/а1юп. 1Ь Ргекк; Ωηνίκ е! а1., 1986, Вайс Ме1йобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Е1кеу1ег 8ск РиЬ1. 1пс., ΝΥ). Например, нуклеиновая кислота (например, линкерные олигонуклеотиды) может быть добавлена на тест-участок (например, лунку многолуночного планшета - в предпочтительном варианте 96- или 384-лучного планшета или планшета с большим количеством лунок) в объёме, варьирующемся от примерно 0,1 до примерно 100 мкл или более (в предпочтительном варианте примерно 1-50 мкл, а наиболее предпочтительно - 40 мкл), в диапазоне концентрации от примерно 0,01 до примерно 5 мкМ (в предпочтительном варианте примерно 0,1 мкМ) в буфере, таком как, например, буфер 6х88РЕ-Т (0,9 М №С1, 60 мМ №Η₂ΡΟ.·|. 6 мМ и 0,05% Тритон Х-100) с осуществлением гибридизации с партнёром (например, олигонуклеотидным якорем на данной поверхности) в течение от примерно 10 мин до примерно по крайней мере 3 ч (в предпочтительном варианте - по крайней мере в течение примерно 15 мин) при температуре от примерно 4°С до примерно 37°С (в предпочтительном варианте - при примерно комнатной температуре). Условия могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить высокую производительность. В одном варианте настоящего изобретения условия реакции могут быть приближены к физиологическим параметрам.

Конструирование других типов субстанций или молекул (например, полипептидов, лектинов и т.п.), которые могут служить, например, якорями или быть частями линкеров, а также условия реакций, необходимые для обеспечения специфичности взаимодействий с их партнёрами по связыванию, являются стандартными и известными в науке (см. описанное у Метеуег е! а1., 1994, №с1. Ас1бк Век., 22, 55305539; Еобог е! а1., 1996, патент США 5510270; Рптипд е! а1., 1992, патент США 5143854). Среди параметров инкубации - тип буфера, концентрация солей, величина рН, температура, время инкубации, присутствие носителя и (или) агентов или наличие условий, призванных подавлять неспецифические взаимо

- 7 006425 действия и др. Например, на тест-участок (например, лунку многолуночного планшета - в предпочтительном варианте 96- или 384-лучного планшета или планшета с большим количеством лунок), который содержит антитела, выполняющие роль якорей, могут быть добавлены антитела к антителам (например, антигены или специфичные по отношению к этим антителам вторичные антитела) в объёме в пределах от примерно 0,1 до примерно 100 мкл и более (в предпочтительном варианте примерно 1-50 мкл, а наиболее предпочтительно - 40 мкл), в диапазоне концентрации от примерно 10 пкМ до примерно 10 нМ (в предпочтительном варианте примерно 1 нМ) в буфере, таком как, например, буфер 6х88РЕ-Т, фосфатносолевой буфер или физиологический раствор, с последующей инкубацией с якорями, размещёнными на данной поверхности, в течение от примерно 1 0 мин до примерно по крайней мере 3 ч (в предпочтительном варианте по крайней мере в течение примерно 15 мин) при температуре от примерно 4°С до примерно 45°С (в предпочтительном варианте при примерно 4°С). Для случая пептидных якорей предпочтительной является длина от примерно 5 до примерно 20 аминокислот.

В некоторых вариантах настоящего изобретения каждый якорь в наборе при выбранных условиях реакции может взаимодействовать с якорь-специфичной частью соответствующего ему линкера с по сути такой же степенью, что и с другими якорями этого набора. Это может обеспечивать то, что якори составляют по сути однотипный набор линкеров и, следовательно, зондов.

Якори на тест-участке могут образовывать «родственный набор», т.е. каждый из якорей такого набора может взаимодействовать с одним или несколькими разными линкерами, в составе каждого из которых имеется часть, специфичная в отношении такого якоря, но при этом разные «зондовые» части: следовательно, отдельный ряд родственных якорей может быть использован для программирования или определения вариабельного набора зондов. Гибкая природа такого родственного набора якорей может быть проиллюстрирована обращением к фиг. 1 и 2.

На фиг. 2 показана поверхность, включающая 15 тест-участков, на каждом из которых находится набор из 6 различных якорей, которые в качестве примера могут являться олигонуклеотидами. На фиг. 1 схематически показан один из таких (олигонуклеотидных) якорей - якорь 1 , который находится в контакте с линкером 1 , в составе которого имеется первая часть, специфичная в отношении якоря 1 , и вторая часть, специфичная в отношении мРНК-мишени 1. С другой стороны, можно провести замену, например, на линкер 2, в составе которого имеется, как и в линкере 1 , часть, специфичная в отношении линкера 1 , но при этом вторая его часть специфична в отношении мРНК-мишени 2 вместо специфичности по отношению к мРНК-мишени 1. Таким образом, якорь 1 может быть использован для обозначения (или для программирования, или для определения, или для детерминации) зондов либо для двух, либо для большего числа различных мРНК-мишеней. Процесс формирования и сборки высокоразрешающего ряда (схемы) олигонуклеотидов или пептидов мог бы быть затратным, длительным и (или) физически трудным. Возможность использования преформированного набора якорей с целью программирования широкого круга различных наборов зондов является одним из преимуществ настоящего изобретения.

Хотя родственные якори, показанные на фиг. 2, определяют схему олигонуклеотидных зондов, набор идентичных якорей также может быть использован для программирования набора других зондов, например белков-рецепторов (см., например, фиг. 3). Ясно, что возможным является внесение множественных пермутаций, обеспечивающих широкий круг типов взаимодействий «якорь/линкер», например, даже более сложных слоёв зондов, таких как «сэндвич-слои», известные во взаимодействиях «белок/антитело». Следовательно, поверхность якорей в соответствии с настоящим изобретением сама по себе представляет новые преимущества.

В одном из вариантов настоящего изобретения якори могут взаимодействовать с линкерами обратимым образом: следовательно, родственный набор якорей может быть перепрограммирован в отношении различных наборов зондов. Например, олигонуклеотидный якорь может быть отделён от олигонуклеотидной части линкера, например, путём нагревания, что обусловливает диссоциацию двух олигонуклеотидов с последующей возможностью нового связывания со вторым линкером. Возможность «перенабора» ряда якорей, которое могло бы быть затратным, длительным и (или) физически затруднительным, представляет ещё одно преимущество настоящего изобретения.

Взаимодействие якоря с линкером не является обязательным. Например, якорь может быть соединён (напрямую или опосредованно) с детекторной молекулой, такой как флуорохром, и тем самым может служить маркёром для выявления пятна на сеточке, например, для целей разграничения тестповерхности и детектора. С другой стороны, якорь может быть помечен известным количеством детекторной молекулы так, чтобы служить в качестве внутреннего количественного эталона, например, для целей проведения калибровки.

По использованию в данном тексте термин «линкер» обозначает бифункциональную субстанцию, которая включает первую часть (или составляющую, или сегмент), специфичную в отношении выбранного (подобранного) якоря или набора якорей («якорь-специфичная часть»), и вторую часть, являющуюся зондом, специфичным в отношении интересующей мишени («мишень-специфичная часть»). Эти две части линкера могут быть соединены друг с другом с помощью ковалентных или нековалентных связей и могут быть соединены друг с другом напрямую или через промежуточное звено.

Химическая природа якорь-специфичной части линкера, понятно, зависит от типа якоря или якорей,

- 8 006425 с которыми она должна взаимодействовать. Например, если якорь является олигонуклеотидом, то часть линкера, которая с ним взаимодействует, может быть, например, пептидом, который связывается по специфическому типу с этим олигонуклеотидом, или нуклеиновой кислотой, которая может эффективно и специфически гибридизовать с якорем при соблюдении заданных условий жёсткости гибридизации. Нуклеиновая кислота может быть, например, олигонуклеотидом, ДНК, РНК, РНП, ПЦР-продуктом или замещённой или модифицированной нуклеиновой кислотой (например, путём включения ненативных нуклеотидов, таких как, например, инозин; путём сборки с использованием таких известных связей, как сульфаматная, сульфамидная, фосфотиоатная, метилфосфонатная, карбаматная; или может являться полусинтетической молекулой, такой как ДНК-стрептавидиновый комплекс и т.п.). Предпочтительными являются одноцепочечные составляющие. Длина линкера, специфичного в отношении олигонуклеотидного якоря, может варьироваться от примерно 8 до примерно 50 нуклеотидов, а предпочтительно состоять примерно из 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. Если якорь является антителом, то часть линкера, которая с ним взаимодействует, может быть, например, антиантителом, антигеном или меньшим фрагментом одной из таких молекул, которая может специфическим образом взаимодействовать с этим якорем. Субстанции или молекулы, которые специфически взаимодействуют с другими типами якорей, описанными выше, и которые могут являться якорь-специфичными частями линкера, хорошо известны в науке и могут быть сформированы с применением стандартных процедур (см., например, выше).

Химическая природа мишень-специфичной части линкера, понятно, зависит от той мишени, с которой зонд должен взаимодействовать. Например, если мишень является конкретным видом мРНК, то мишень-специфичная часть линкера может быть, например, олигонуклеотидом, который связывается специфически с мишенью, но не с какими-либо иными РНК или ДНК, при соблюдении выбранных условий гибридизации. Специалист в данной области техники с использованием соответствующих методов сможет экспериментальным путём определить свойства олигонуклеотида, который будет оптимально гибридизовать с данной мишенью при минимальном уровне неспецифической гибридизации с посторонними ДНК или РНК (например, см. выше). В целом, длина олигонуклеотидного зонда, используемого для выявления мРНК-мишени, присутствующего «на фоне» большого избытка посторонних РНК, может варьироваться в пределах примерно 8-50 нуклеотидов, а предпочтительно состоит из 18, 20, 22 или 25 нуклеотидов. Олигонуклеотидный зонд, предназначенный для использования в биохимическом тесте, в котором отсутствует значительный «фоновый груз», может быть короче. С применением известных научных методов (например, компьютерной программы ВЬЛ8Т) последовательности олигонуклеотидных зондов могут быть отобраны таким образом, чтобы они были взаимно несовпадающими и отличались от предположительно посторонних последовательностей в соответствии с известными генетическими базами данных. Выбор условий гибридизации, которые будут обеспечивать специфичную гибридизацию олигонуклеотидного зонда с РНК, могут быть определены стандартными путями с использованием известных процедур (например, см. выше). Например, РНК-мишень [например, тотальный пул РНК или мРНК, экстрагированный из тканей или клеток, выращенных (и необязательно обработанных интересующим агентом) в любой ёмкости, такой как лунка многолуночного микротитровального планшета (например, планшета с 96 или 384, или с большим числом лунок)] может быть добавлена в тест-участок, несущий набор олигонуклеотидных зондов (см. выше) в таком буфере, как 6х88РЕ-Т или другие буферы, необязательно содержащем агент, обеспечивающий подавление неспецифического связывания (например, примерно 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы сельди или лосося или дрожжевой РНК), с последующей инкубацией при эмпирически определённой температуре в течение от примерно 1 0 мин до по крайней мере 18 ч (в предпочтительном варианте в течение примерно 3 ч). Жёсткость гибридизации может быть такой же (или ниже её), как жёсткость, применяемая для связывания якорей с якорь-специфичными частями линкеров. Конструирование и применение других типов зондов также является рутинным в данной области техники, что, например, обсуждалось выше.

Якорь-специфичные и мишень-специфичные части линкера могут быть соединены друг с другом (связаны, присоединены) с помощью любых связей ковалентного или нековалентного типа, природа которых с точки зрения настоящего изобретения несущественна. Эти две части могут быть соединены напрямую или через промежуточную молекулу. В одном варианте, в котором обе части линкера являются олигонуклеотидами, они могут быть соединены друг с другом ковалентным образом, например, с помощью фосфодиэфирных связей с образованием единой колинеарной молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте, в котором якорь-специфическая часть является олигонуклеотидом, а мишеньспецифичная часть - рецептором, например рецепторным белком, две эти части могут быть соединены друг с другом за счёт взаимодействия молекул биотина и стрептавидина; такой пример показан на фиг. 3. Известны многочисленные вариации таких связей (см., например, Мстсусг с1 а1. , 1994, М1с1. Лабк Век., 22, 5530-5539). С другой стороны, эти две части могут быть соединены друг с другом напрямую: например, олигонуклеотид может быть амидирован и затем присоединён напрямую (например, путём перекрёстной сшивки) к пептиду или белку через амидную связь или присоединён к мембранному компоненту с помощью амидной связи или липидного соединения. Методы формирования таких ковалентных и нековалентных связей являются стандартными и легко могут быть оптимизованы специалистом в данной об

- 9 006425 ласти техники.

После того как две субстанции оказываются связанными (например, в результате инкубации двух нуклеиновых кислот, двух белков, белка и нуклеиновой кислоты, или другой комбинации) с образованием комплекса (такого как, например, комплекса «якорь/линкер»), полученный в результате комплекс необязательно может быть обработан (например, путём промывки) с целью удаления несвязанных компонентов (например, линкерных) с использованием условий, которые определяют эмпирическим путём так, чтобы сохранить интактными специфические взаимодействия, но удалить материал, связанный по неспецифическому типу. Например, реакционные смеси могут быть промыты примерно от одного до десяти раз или более в тех же или несколько более жёстких условиях по сравнению с теми условиями, которые использовались при формировании данного комплекса (например, комплекса «якорь/линкер»).

Сочетания по настоящему изобретению могут быть сформированы стандартными способами с использованием традиционных технологий.

Некоторые из поверхностей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, легко доступны на коммерческих условиях. В предпочтительном варианте такой поверхностью является микротитровальный планшет о 96, 384 или 1536 лунках, например модифицированные планшеты фирмы «Костар». С другой стороны, поверхность, несущая лунки, которые, в свою очередь, имеют углубления или «ямки», может быть образована микроманипуляциями с такой субстанцией, как алюминиевый или стальной порошок, от которого образовываются царапины, которые затем заливают пластиком или сходным материалом, в результате чего получают структуру, проиллюстрированную на фиг. 4. С другой стороны, такая структура, как показанная на фиг. 4, состоящая из стекла, пластмассы, керамики или подобного материала, может быть создана, например, из трёх сегментов, например, как показано на фиг. 5: первый сегмент, называемый сепаратором лунок (фиг. 5а), будет обеспечивать границы между лунками для образцов, второй сегмент, называемый субразделителем (фиг. 5Ь), будет образовывать подразделения или углубления в пределах каждой из тест-лунок, а третий сегмент, называемый основанием (фиг. 5с), будет образовывать основание планшета и нижнюю поверхность тест-лунок. Сепаратор может быть, напимер, куском материала, например силикона, со сквозными отверстиями, расположенными таким образом, чтобы каждое такое отверстие образовывало стенки тест-лунки тогда, когда все эти три сегмента объединяются. Субразделитель может быть, например, тонкой пластинкой такого материала, как силикон, имеющей форму экранной сетки или тонкоячеистой пластины. Основание может быть плоским куском такого материала, как стекло, имеющим форму, например, днища обычного микротитровального планшета, применяемого в стандартных биохимических тестах. Верхняя поверхность основания может быть плоской в соответствии с изображённым на фиг. 5с или может быть образована выпуклостями, которые будут совпадать с формой подразделительного сегмента, что обеспечит полную подразделённость зон или лунок в пределах каждой из тест-лунок. Эти три сегмента могут объединены с помощью стандартных процедур, например таких приёмов, которые применяются при сборке силиконовых облаток.

Олигонуклеотидные якори, линкерные составляющие или детекторы могут быть синтезированы с помощью стандартных методов, например с использованием промышленного синтезатора олигонуклеотидов и (или) путём лигирования друг на друга субфрагментов, которые были перед этим синтезированы. В одном из вариантов настоящего изобретения заранее сформированные нуклеотидные якори, такие как олигонуклеотидные якори, могут быть размещены на поверхности тест-участка с помощью любой из стандартных процедур, включая фотолитографию или химическое прикрепление к шелковой ткани, размещение с помощью технологии распыления в виде капиллярного, сетчатого или жидкого чипа, электрохимического размещения с использованием наборов электродов, контактирования с иглой или птичьим пером или денатурации с последующим обжигом или облучением ультрафиолетом на фильтрах (см., например, Вауа е! а1., 1996, патент США 5545531; Робог е! а1., 1996, патент США 5510270; 2апхисс1п е! а1., 1997, патент США 5643738; Вгеппап, 1995, патент США 5474796; международные патентные заявки \УО 92/10092 и \УО 90/15070). Якори могут быть размещены на верхней поверхности тест-участка или могут быть, например, в случае использования подушечки полиакриламидного геля, погружены в эту поверхность таким образом, чтобы некоторые из якорей пронизывали эту поверхность и были доступными для взаимодействия с линкером. В предпочтительном варианте преформированные олигонуклеотидные якори дериватизуют по 5'-концу с использованием свободной аминогруппы: растворяют в концентрации, которую определяют обычно эмпирическим путём (например, около 1 мкМ) в буфере, таком как 50 мМ фосфатный буфер, рН=8,5 и 1 мМ ΕΌΤΑ с последующим распределением в капли с использованием разбрызгивателя Р1хи8 (Сайеыап Тес1то1още5). работающего в нанолитровом диапазоне, при размере капель примерно 10,4 нл, помещая их в конкретные участки тест-лунки, верхняя поверхность которой находится на чистом сухом планшете ΌΝΑ-Втб (Согшпд Сойаг). В зависимости от относительной скорости присоединения и упаривания олигонуклеотидов необходимым может оказаться контроль влажности в лунках в ходе подготовки. В другом варианте олигонуклеотидные якори могут быть синтезированы непосредственно на поверхности тест-участка с использованием таких стандартных методов, как, например, активируемое светом освобождение от защиты нарастающих олигонуклеотидных цепочек (например, в сочетании с использованием сайт-маркирующей «маски»), или путём распределения нанолитровых капель дезактивированного соединения с использованием соответствующего ультрамикрораспылителя.

- 10 006425

Освобождение от защиты всех растущих нуклеотидных последовательностей, которые должны получать по одному нуклеотиду, может быть осуществлена, например, с тем, чтобы этот нуклеотид был добавлен затем уже на данной поверхности.

Пептиды, белки, лектины, хелатирующие элементы, пластмассы и другие типы якорей или линкерных составляющих также могут быть сформированы стандартными путями, и такие якори могут быть размещены на поверхности или в её толще с использованием имеющихся методологий (см., например, Еобог е! а1., 1996, патент США 5510270; Ргггипд е! а1., 1992, патент США 5143854; ΖαηζαοοΗί е! а1., 1997, патент США 5643738; Ьотее е! а1., 1985, патент США 4562157; Ыгетеуег е! а1., 1994, Ыис1. Асгбк Век., 22, 5530-5539).

В некоторых вариантах настоящего изобретения заявляемые сочетания используются в ряду различных скрининговых процедур и (или) для получения информации об уровне, активности или структуре зондов или молекул-мишеней. Такие тесты определяются как методы или тесты МАР 8 (Ми1б Аггау Р1а!е 8сгееп - скрининг на многорядных или «многонаборных» планшетах): соответственно, поверхности, несущие ряды (наборы) якорей или якорей/зондов для таких тестов, определяются как «МАР8-ряды» или «МАР 8 -планшеты».

Компоненты реакционной смеси, процедуры тестирования или скрининга могут быть выстроены в любом порядке. Например, якори, линкеры и мишени могут быть собраны последовательно или же мишени и линкеры (в присутствие или в отсутствие репортеров) могут быть собраны в растворе и затем проконтактированы с якорями.

Один из вариантов настоящего изобретения касается способа детекции по крайней мере одной мишени, включающего (а) контактирование образца, который может включать упомянутую(ые) мишень(и), с бифункциональным линкером, первая часть которого специфична в отношении олигонуклеотидного якоря, а вторая часть включает зонд, который специфичен в отношении упомянутой(ых) мишени(ей), в условиях, эффективных в отношении получения первого гибридизационного продукта, образуемого упомянутой(ыми) мишенью(ями) и упомянутым линкером;

(б) контактирование упомянутого первого гибридизационного продукта с сочетанием в условиях, эффективных по получению второго гибридизационного продукта, образуемого упомянутым первым гибридизационным продуктом и упомянутым сочетанием, при том, что упомянутое сочетание включает (до добавления упомянутого первого гибридизационного продукта) (1 ) поверхность, несущую множественные, пространственно разобщённые участки, по крайней мере два из которых по сути являются идентичными, при том, что каждый такой участок включает (2) по крайней мере 8 различных олигонуклеотидных якорей;

(с) контактирование упомянутого первого гибридизационного продукта или упомянутого второго гибридизационного продукта с помеченным детекторным зондом и (д) детекция упомянутого детекторного зонда.

Каждый из тестов или каждая из процедур, описанных далее, могут быть осуществлены в высокопроизводительном варианте, в котором большое количество образцов (например, по меньшей мере 864, 1036, 1536, 2025 или больше, что зависит от числа тест-участков в составе сочетания) быстро и одновременно тестируют на каждом планшете или поверхности. Далее, в одно и то же время может быть обработано много планшетов или поверхностей. Например, в методах разработки лекарственных средств большое число образцов, каждый из которых содержит предполагаемое лекарство (например, элемент комбинаторной химической библиотеки, такой как варианты небольших молекул, пептиды, олигонуклеотиды или другие субстанции), может быть нанесено на отдельные участки сочетания в соответствии с описанным или может быть добавлено к биологическим или биохимическим образцам, которые затем наносят на отдельные тест-участки сочетания, с последующей инкубацией с наборами зондов, расположенными в этих участках; и тесты могут быть осуществлены в отношении каждого из образцов. С учётом недавних выполненных и продолжающихся разработок высокоинформативных микропланшетов, приёмов раскапывания проб ДНК и таких способов, как лазерные технологии, предназначенных для получения информации с даже ещё более плотных микропланшетов, а также робототехники, улучшенных распылителей, высокоточных детекционных систем и программ для обработки данных, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для скрининга или анализа тысяч или десятков тысяч, или ещё большего количества соединений в день.

Например, варианты, в которых зондами являются олигонуклеотиды, тест может представлять собой диагностический скрининг нуклеиновой кислоты или полинуклеотида (например, в тесте на связывание или ином тесте) в большом числе образцов на присутствие генетических вариантов или дефектов (например, полиморфных вариантов или отдельных мутаций, ассоциированных с заболеваниями, такими как муковисцидоз: см., например, Шга е! а1., 1992, Мо1. Се11. РгоЬек, 6, 505-512); патогенных организмов (таких как бактерии, вирусы или простейшие, организмами-хозяевами которых являются животные, включая человека, или растения); или параметры транскрипции мРНК, которые являются диагностическими признаками для конкретных физиологических состояний или заболеваний. Наборы нуклеотидных зондов, включающих фрагменты Е8Т (включая их полноразмерные копии), могут быть использованы

- 11 006425 для оценки параметров транскрипции, проявляемых теми клетками, от которых являются производными эти маркёры Е8Т (или других). Нуклеотидные зонды также могут выявлять пептиды, белки или белковые домены, которые специфическим образом связываются с конкретными нуклеотидными последовательностями (и наоборот).

В другом варианте сочетания по настоящему изобретению могут использоваться для контроля за биохимическими реакциями, такими как, например, взаимодействия белков, нуклеиновых кислот, небольших молекул или подобного, например, эффективности или специфичности взаимодействий между антигенами и антителами; или между рецепторами (такими как очищенные рецепторы или рецепторы, связанные на клеточных мембранах) и их лигандами, являющимися агонистами или антагонистами; или между ферментами (такими как протеазы или киназы) и их субстратами, или в связи с увеличением или уменьшением количества субстрата, конвертируемого соответствующим ферментом в продукт; а также во многих других комбинациях. Такие биохимические тесты могут быть использованы для охарактеризования свойств зонда или мишени или служить основой для проведения скрининг-теста. Например, для целей скрининга образцов на присутствие конкретных протеаз (например, протеаз, вовлечённых в свёртывание крови, таких как факторы Ха и УНа) образцы могут быть протестированы в сочетаниях, в которых зондами являются флуоресцирующие субстраты, специфичные в отношении каждой из представляющих интерес протеаз. Если являющаяся мишенью протеаза связывается с субстратом и расщепляет его, то тогда этот субстрат будет флуоресцировать, что обычно является следствием, например, расщепления и разделения двух пар переноса энергии, в результате чего может быть детектирован такой сигнал. В другом примере для целей скрининга образцов на присутствие конкретных киназ (например, киназа 8гс, тирозинкиназа или киназа ΖΑΡ70) образцы, содержащие одну или несколько представляющих интерес киназ, могут быть протестированы с использованием сочетаний, в которых зондами являются пептиды, которые могут быть избирательно фосфорилированы под контролем одной из интересующих киназ. С использованием известных в науке стандартным образом определяемых условий образцы могут быть проинкубированы с набором субстратов в подходящем буфере и в присутствие необходимых кофакторов в течение периода времени, определяемого эмпирическим путём. (В некоторых тестах, например, при биохимическом изучении факторов, регулирующих активность интересующих киназ, концентрация каждой из киназ может быть доведена таким образом, чтобы каждый субстрат фосфорилировался с одинаковой скоростью). После обработки (например, промывки) каждой реакции с целью удаления киназ и нежелательных компонентов реакции (что необязательно) в условиях, определяемых эмпирически, полученные фосфорилированные субстраты могут быть выявлены, например, путём их инкубации с детекторными реагентами, такими как, например, помеченные флуоресцеином антифосфотирозиновые или антифосфосериновые антитела (например, в концентрации примерно 10 нМ или больше, или меньше), а полученный сигнал может быть детектирован. В другом примере могут быть проведены тесты на связывание. Например, домены 8Н2, такие как 8Н2-домены киназ СВВ2 или ΖΑΡ70, могут быть протестированы с использованием набора зондов в виде подходящих фосфорилированных пептидов; или же сыворотка крови может быть подвергнута скринингу с набором зондов в виде конкретных рецепторов на существование иммунодефицита. Также связанные с ферментами тесты могут быть осуществлены в таком формате набора зондов. Сочетания по настоящему изобретению также могут быть использованы для выявления мутантных ферментов, которые характеризуются либо более высокой, либо более низкой активностью по сравнению с их вариантами дикого типа, или для скрининга разнообразных агентов, таких как гербициды или пестициды.

Понятно, что ΜΑΡδ-тесты могут быть использованы для количественной оценки (измерения) содержания активной мишени в образце, для чего зонд не должен быть полностью «занят», т.е. не более чем 90% доступных зондовых сайтов находится в связи с мишенью (или прореагировало или гибридизовало с ней). При таких условиях мишень может быть оценена количественно на основании того, что чем больше имеется такой мишени, тем большее количество зонда находится в связанном состоянии. С другой стороны, в условиях, когда более 90% доступных зондовых сайтов связаны, увеличение количества мишени не будет обусловливать существенного повышения связывания мишени с зондом. Таким образом количественному анализу могут быть подвергнуты мишени любого из упоминавшихся выше типов. Например, в примере 6 описывается количественный анализ олигонуклеотидных мишеней. Более того, в нём показано, что даже если мишень присутствует с большим избытком (например, если она присутствует в столь большом количестве, что обеспечивает насыщение количества доступного зонда в ΜΑΡ8тесте), то путём добавления известного количества непомеченной мишени к связывающейся смеси можно обеспечить «сдвиг чувствительности» данной реакции с целью обеспечения количественного определения даже ещё большего количества мишени.

В другом варианте сочетания по настоящему изобретению могут быть использованы для скрининга агентов, которые модулируют взаимодействие мишени и данного зонда. Агент может модулировать взаимодействие в паре «мишень/зонд» путём прямого или опосредованного взаимодействия либо с этим зондом, либо с этой мишенью, либо с комплексом, образуемым этими мишенью и зондом. Такая модуляция может происходить в различных формах, что, тем самым не ограничиваясь, включает повышение или снижение аффинности по связыванию мишени с зондом, увеличение или уменьшение скорости, с

- 12 006425 которой происходит связывание этой мишени и этого зонда, конкурентное или неконкурентное подавление связывания этого зонда с этой мишенью или повышение или снижение активности этого зонда или этой мишени, что может, по крайней мере в ряде случаев, приводить к усилению или ослаблению взаимодействия «зонд/мишень». Такие агенты могут быть искусственными или естественно встречающимися субстанциями. Также такие агенты могут быть использованы в своём первозданном виде или в виде смесей с другими компонентами; они могут быть ковалентно или нековалентно присоединены к связывающему компоненту как напрямую, так и опосредованно через специфичную связывающую составляющую. Например, для идентификации потенциальных «средств разжижения крови» или агентов, которые взаимодействуют с одним из элементов протеазного каскада в процессе свёртывания крови, смесь представляющих интерес протеаз может быть протестирована со множеством потенциальных агентов с последующим тестированием на их активность в соответствии с описанным выше. Другие примеры агентов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением, весьма многообразны и включают пестициды и гербициды. В примерах 1 6 и 1 7 описаны высокопроизводительные тесты для агентов, которые избирательно подавляют конкретные киназы или являются селективными ингибиторами взаимодействия между доменами 8Н2 и фосфорилированными пептидами.

В другом варианте сочетания по настоящему изобретению могут быть использованы для скрининга агентов, которые модулируют параметры экспрессии генов. Наборы олигонуклеотидов могут быть использованы, например, для идентификации видов мРНК, параметры экспрессии которых коррелируют с конкретным физиологическим статусом, или стадией онтогенеза, или с заболеванием (т.н. «коррелятивные» гены, РНК или параметры экспрессии). Под терминами «коррелирует» или «коррелятивные» подразумевается, что параметры синтеза РНК ассоциированы с физиологическим статусом клетки, но при этом не является обязательным то, что экспрессия данной РНК является следствием или причиной конкретного физиологического статуса. Например, небольшой набор мРНК может быть идентифицирован в связи с их экспрессией, позитивной и (или) негативной регуляцией в клетках, которые являются моделью для конкретного заболевания; такой изменённый характер экспрессии по сравнению с нормальной клеткой, у которой не выявляется патофенотип, может являться индикатором заболевания («индикаторные» гены, РНК или параметры экспрессии). Термины «коррелятивный» и «индикаторный» могут быть использованы вперемежку. Например, клетки, обработанные опухолеродным фактором, таким как форболмиристат, будут проявлять параметры экспрессии генов, имитирующие таковые, известные на ранних этапах роста опухоли. В другой модели раковой опухоли инсулиномные клетки мыши (например, клеточная линия ТСР61) в случае их инфицирования аденовирусом проявляют усиление экспрессии, например, генов с-)ип и М1Р-2, в то время как экспрессия генов «домашнего хозяйства», таких как гены ΟΛΡΌΗ и Ь32, остаётся по сути неизменной.

Агенты, которые после контакта с клеткой, являющейся моделью заболевания, либо напрямую, либо опосредованно, также либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο (например, в культуре ткани), обеспечивают модуляцию индикаторных параметров экспрессии, могут действовать как терапевтические средства или лекарственные средства для организмов (например, человека или других животных-пациентов, или же растений), страдающих от этого заболевания. Агенты также могут модулировать параметры экспрессии вследствие контакта с нуклеиновой кислотой напрямую, например, в экспрессионной системе ίη νίίτο (в тест-пробирке). По использованию в данном тесте термин «модулирует» обозначает обусловливание увеличения или уменьшения количества и (или) уровня активности молекулы или подобного, которые вовлечены в измеримые реакции. Сочетания по настоящему изобретению могут быть использованы для осуществления скрининга таких агентов. Например, серия клеток (например, производных от модели заболевания) может быть проконтактирована с серией агентов (например, в течение периода времени от примерно 10 мин до примерно 48 ч или более), после чего с применением стандартных, известных в науке методов (например, основывающихся на наборах реактивов, доступных на коммерческой основе) могут быть приготовлены экстракты тотальных пулов РНК или мРНК. Если желательным является амплифицирование определённого количества РНК, то могут быть использованы стандартные процедуры, такие как ПЦР с ревертированием (см., например, Ιηηίδ с1 а1.. 1996, РСК РгоЮеоК: А Сшбе ίο Ме11юб5 ίη ΛιηρΙίΓίοαΙίοη. Асаб. Рге§8, ΝΥ). Полученные экстракты (или амплифицированные на их основе продукты) могут быть проконтактированы (например, проинкубированы) со множеством по сути идентичных наборов, включающих зонды для подходящих индикаторных РНК, а те агенты, которые ассоциированы с изменением индикаторных параметров экспрессии, могут быть идентифицированы. В примере 1 5 описан высокопроизводительный тест, предназначенный для скрининга соединений, которые могут изменять экспрессию генов, являющихся индикаторными для заболевания.

Сходным образом могут быть идентифицированы агенты, которые способны модулировать те параметры экспрессии, которые ассоциированы с конкретными физиологическими состояниями или стадиями онтогенеза. Такие агенты могут быть искусственными или естественно встречающимися веществами, включая факторы внешней среды, такие как субстанции, вовлечённые в развитие эмбрионов или в регуляцию физиологических процессов, или субстанции, важные для сельскохозяйственного производства, например, пестициды или гербициды. Также такие агенты могут быть использованы в их первозданном виде или в виде смесей с другими факторами; и они могут быть ковалентно или нековалентно

- 13 006425 присоединены к связывающему компоненту как напрямую, так и опосредованного через специфичную связывающую составляющую.

В другом варианте настоящего изобретения представляется набор, применимый для детекции по крайней мере одной мишени в образце, который включает (а) поверхность, несущую множественные пространственно разобщённые участки, по крайней мере два из которых существенно идентичны, при том, что каждый такой участок включает по крайней мере восемь различных якорей (олигонуклеотидных или якорей иного типа, описанных в данном тексте), и (б) ёмкость, включающую по крайней мере одну бифункциональную линкерную молекулу, которая включает первую часть, специфичную в отношении по крайней мере одного из упомянутых якорей, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении по крайней мере одной из упомянутых мишеней.

В одном из вариантов представляется такая же, как в пункте (а) выше, поверхность и набор инструкций по присоединению по крайней мере к одному из упомянутых якорей бифункциональной линкерной молекулы, которая включает первую часть, специфичную в отношении по крайней мере одного из упомянутых якорей, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении по крайней мере одной мишени. Инструкция может содержать, например (тем самым не ограничиваясь), описание каждого из якорей, размещённых на данной поверхности, указание на общее количество якорей и на их точное расположение, а также пропись для специфического прикрепления (ассоциирования, связывания и т. п.) линкеров к этим якорям. Например, если якори являются олигонуклеотидами, то в инструкции может содержатся описание нуклеотидной последовательности каждого якоря, на основании которых на практике может быть осуществлено конструирование комплементарных, специфичных для этих якорей линкерных составляющих, специфически взаимодействующих с этими якорями (например, гибридизующими с ними); если якори являются пептидами, то в инструкцию может быть включена информация, например, об антителах, которые специфически взаимодействуют с этими пептидами. Инструкция также может содержать пропись для объединения якорей и линкеров, например, описание условий и реагентов для гибридизации (или связывания другого типа), такие как температура и время инкубации, условий и реагентов для удаления непроассоциировавших молекул (например, промывки) и подобное. Более того, инструкция может содержать информацию о конструкции и использовании любого из типов обсуждаемых здесь контрольных линкеров, а также методов, например, количественного анализа, калибровки, стандартизации или «точной настройки» тестов, которые предполагается осуществлять с помощью данных сочетаний. Инструкции могут представлять любые параметры, условия или варианты, включённые в данную заявку, при том, что все они могут быть осуществлены специалистом в данной области техники стандартным образом с помощью стандартных процедур.

Как обсуждается в настоящем изобретении, на практике к поверхности по настоящему изобретению, несущей данный набор (или наборы) якорей, можно присоединить широкий круг типов линкеров, тем самым программируя разнообразные типы наборов зондов. Более того, на практике можно удалить данный набор линкеров с поверхности по настоящему изобретению и добавить на неё другой набор линкеров (как тот же самый, так и отличающийся от предыдущего набора), тем самым обеспечивая возможность повторного многократного использования этой поверхности. Такая гибкость и возможность повторного использования представляет дополнительные преимущества настоящего изобретения.

В другом варианте сочетания по настоящему изобретению могут быть использованы для картирования маркёров Е8Т (Ехргеккюп 8сс.|испес Тад - маркёрные, или неидентифицированные, экспрессируемые последовательности). В этом случае МЛР8-тесты могут быть использованы для определения того, какие (если таковые есть) из группы Е8Т-маркёров происходили от отличающихся (или частично перекрывающихся) участков одного(их) гена(ов), а какие из них (если таковые есть) являются уникальными. На фиг. 18, 19, 20 и 21 проиллюстрирован такой тест: в этом примере тест нацелен на определение того, какие (если таковые есть) из 16 Е8Т-маркёров связаны с общим геном. На первом этапе теста (см. фиг. 18) необходимо сконструировать наборы, в которых каждый из Е8Т, картирование которых осуществляется, представлен по крайней мере одним олигонуклеотидным зондом, ему соответствующим. Серию наборов, равную по числу (или превышающую) числу картируемых Е8Т, распределяют по отдельным участкам (например, лункам) поверхности; в иллюстрируемом примере на поверхности данного сочетания находится 16 лунок, в каждой из которых находится по 16 различных Е8Т-специфичных олигонуклеотидов, пронумерованных от 1 до 16. Олигонуклеотид «соответствует Е8Т» (т.е. является «Е8Тспецифичным») тогда, когда он в существенной степени комплементарен Е8Т, что определяет гибридизуемость этого олигонуклеотида при жёстких условиях гибридизации именно с данным Е8Т, но не с другими Е8Т. Е8Т-соответствующий олигонуклеотид такого типа может специфическим образом связываться (при оптимальных условиях) с кодирующей или транскрибируемой цепью кДНК, синтезированной на матрице гена, от которого данный Е8Т-маркёр происходил, или с мРНК, синтезированной на матрице гена, от которого происходил данный Е8Т-маркёр. Факторы, которые должны быть приняты во внимание при конструировании олигонуклеотидов и выборе параметров гибридизации, необходимых для оптимизации с целью достижения специфической гибридизации, обсуждаются по ходу данной заявки. С целью конструирования наборов линкерные молекулы приготавливают таким образом, чтобы каждая из них включала составляющую, специфичную для одного из якорей родственного набора, и составляющую

- 14 006425 в виде олигонуклеотидного зонда, соответствующего одному из маркёров Е8Т, которые предполагается картировать; и эти линкеры присоединяют к данным якорям в соответствии с описанным в данной заявке. На следующем этапе аликвоту образца, включающего смесь нуклеиновых кислот (например, мРНК или одноцепочечных или денатурированных ДНК), которая может включать последовательности, комплементарные одному или большему числу олигонуклеотидных зондов, добавляют на каждый участок (лунку), в которых находится набор зондов; смесь затем инкубируют при стандартным образом установленных оптимальных условиях, тем самым обеспечивая связывание нуклеиновой кислоты с комплементарными зондами. Если некоторые из Е8Т-специфичных зондов комплементарны различным частям одной нуклеиновой кислоты, то такая нуклеиновая кислота будет связываться на каждом сайте набора, на котором находится один из соответствующих зондов.

На следующем этапе дифференцированные детекторные олигонуклеотиды (в иллюстрируемом примере детекторы от 1 до 16) добавляют к каждому участку (лунке) (см. фиг. 19). Детекторный олигонуклеотид создают для каждого из картируемых Е8Т-маркёров. Каждый Е8Т-специфичный детектор соответствует отличающейся части (по крайней мере, частично неперекрывающейся) такого Е8Т по сравнению с соответствующим зондом: в результате эти олигонуклеотиды (зонда и детектора) не перекрывают друг друга. См., например, Е8Т, показанный на фиг. 21, который соответствует Е8Т 1, 2 и 6 с фиг. 18-20. На фиг. 21 показаны Е8Т 1 и 2: оба они происходят от гена «X» (т.е. они «сцеплены»), в то время как Е8Т 6 происходит от другого, неродственного гена. Если аликвоты образца, содержащего смесь мРНК, включая происходящую от гена «X», инкубируют с набором зондов, показанных на фиг. 1820, то мРНК гена «X» при оптимальных условиях будет гибридизовать по сайтам зондов 1 и 2, но не по сайту зонда 6. (Понятно, что каждая мРНК должна добавляться с молярным избытком по отношению к суммарному количеству зондов, с которыми она может гибридизовать). Если детекторный олигонуклеотид 1 добавляют к участку (лунке) 1, то он должен гибридизовать с мРНК гена «X», которая связана на сайтах 1 и 2 набора зондов, но не сайте 6. Сходным образом при добавлении детекторного олигонуклеотида 2 в другую лунку, скажем лунку 2, он также должен гибридизовать по сайтам 1 и 2, но не по сайту 6. В этом случае быстро можно определить, какие из Е8Т сцеплены, т.е. кодируют разные участки одного и того же гена, а какие Е8Т являются уникальными. В случае гипотетического примера, показанного на фиг. 20, первые три Е8Т-маркёра составляют части общего гена, последние пять Е8Т представляют фрагменты другого гена, а остальные Е8Т ни с ними, ни друг с другом не сцеплены. Условия гибридизации, необязательные этапы промывки, способы детекции и подобное обсуждаются по ходу данной заявки в связи с описанием МЛР8-тестов. С целью подтверждения данных о сцеплении, полученных в МЛР8-тесте, можно провести ПЦР с использованием пар Е8Т-специфичных олигонуклеотидных зондов, берущихся в качестве смысловой и несмысловой затравок. Каждая пара сцепленных Е8Т будет обеспечивать получение ПЦР-продукта. Надо заметить, что такой «попарный ПЦР-тест» может быть проведён с целью установления сцепления напрямую без использования МЛР8-теста на сцепление, однако, для этого потребуется проведение множества реакций, а каждая из Е8Т-затравок должна быть синтезирована по обеим цепям - смысловой и антисмысловой. В связи с проиллюстрированным примером потребовалось бы провести 180 таких ПЦР.

В одном из аспектов настоящее изобретение касается способа установления того, какие из множества Е8Т-маркёров комплементарны данной нуклеиновой кислоте, включающего (а) инкубацию иммобилизованного набора олигонуклеотидных зондов, по крайней мере один из которых соответствует каждому из упомянутых Е8Т, с тестируемым образцом, который может содержать упомянутую заданную нуклеиновую кислоту, с целью выявления продукта гибридизации, образуемого упомянутыми олигонуклеотидными зондами и упомянутой нуклеиновой кислотой;

(б) инкубацию упомянутого продукта гибридизации с детекторным олигонуклеотидом, который соответствует Е8Т, которому соответствует один из упомянутых олигонуклеотидных зондов, но который специфичен в отношении отличающегося участка этого Е8Т по сравнению с упомянутым олигонуклеотидным зондом; и (с) детекцию тех олигонуклеотидных зондов из состава упомянутого набора, которые оказались помечены упомянутым детекторным олигонуклеотидом;

при том, что упомянутый набор олигонуклеотидных зондов иммобилизован в участке сочетания, при том, что упомянутое сочетание включает (1 ) поверхность, несущую серию пространственно разобщённых существенно идентичных участков, число которых равно числу анализируемых Е8Т, при том, что каждый участок включает (2) серию различных якорей, число которых равно числу анализируемых Е8Т, при том, что каждый якорь связан с (3) бифункциональным линкером, включающим первую часть, специфичную в отношении данного якоря, и вторую часть в виде олигонуклеотидного зонда, специфичную в отношении по крайней мере одного из упомянутых Е8Т-маркёров.

В другом аспекте настоящего изобретения представляется соответствующий вышеописанному способ, при том, что один или несколько упомянутых Е8Т могут быть комплементарны упомянутой нуклеиновой кислоте, и при том, что каждый из упомянутых Е8Т включает по две различающиеся олиго

- 15 006425 нуклеотидные последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий упомянутому Е8Т, а вторая из которых определяет детекторный олигонуклеотид, соответствующий упомянутому Е8Т, включающий (а) контактирование образца, содержащего молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты, по крайней мере с одним участком сочетания, при том, что упомянутый участок включает набор олигонуклеотидных зондов, по крайней мере один из которых соответствует каждому из упомянутых Е8Т;

(б) инкубацию упомянутого образца на упомянутом участке, тем самым обеспечивая связывание молекул упомянутой нуклеиновой кислоты с упомянутыми Е8Т-соответствующими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны участкам упомянутой нуклеиновой кислоты;

(с) инкубацию упомянутого участка, включающего молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты, связанные с одним или несколькими упомянутыми Е8Т-соответствующими олигонуклеотидными зондами, с детекторным олигонуклеотидом, который соответствует тому Е8Т, которому соответствует тот данный олигонуклеотидный зонд из упомянутого набора, в результате чего детекторные олигонуклеотиды связываются с молекулами нуклеиновой кислоты, которые были связаны с упомянутым олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, комплементарными упомянутой нуклеиновой кислоте;

(б) детекцию присутствия упомянутых детекторных олигонуклеотидов, а тем самым идентификацию тех Е8Т-соответствующих олигонуклеотидных зондов из состава упомянутого набора, которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с упомянутым данным Е8Тсоответствующим зондом, тем самым определяя идентификацию Е8Т, которые комплементарны упомянутой данной нуклеиновой кислоте, при том, что упомянутый набор олигонуклеотидных зондов иммобилизован в участке сочетания, при том, что упомянутое сочетание включает (1) поверхность, несущую серию пространственно разобщённых существенно идентичных участков, число которых равно числу анализируемых Е8Т, при том, что каждый участок включает (2) серию различных якорей, число которых равно числу анализируемых Е8Т, при том, что каждый якорь связан с (3) бифункциональным линкером, включающим первую часть, специфичную в отношении данного якоря, и вторую часть в виде олигонуклеотидного зонда, специфичную в отношении по крайней мере одного из упомянутых Е8Т-маркёров.

Компоненты теста на картирование Е8Т-маркёров могут быть собраны следующим образом. Например, якори, линкеры и Е8Т могут быть собраны последовательно или линкеры и Е8Т в присутствии или отсутствии репортеров могут быть собраны в растворе и затем добавлены к якорям.

В другом аспекте настоящее изобретение касается способа установления тех из множества Е8Тмаркёров, которые комплементарны данной нуклеиновой кислоте, включающего (а) инкубацию коллекции бифункциональных олигонуклеотидных линкерных молекул, каждая из которых включает первую часть в виде зонда, соответствующего по крайней мере одному из упомянутых Е8Т, и вторую часть, специфичную с отношении олигонуклеотида якоря, при том, что тестируемый образец может содержать упомянутую данную нуклеиновую кислоту с целью получения первого продукта гибридизации, образуемого упомянутыми олигонуклеотидными зондами и упомянутой нуклеиновой кислотой;

(б) инкубацию упомянутого первого продукта гибридизации с иммобилизованным набором якорных олигонуклеотидов, при том, что каждый якорный олигонуклеотид соответствует якорь-специфичной части по крайней мере одной из упомянутых линкерных молекул, с образованием второго продукта гибридизации, включающего упомянутые якори, упомянутые олигонуклеотидные зонды и упомянутую нуклеиновую кислоту; и (с) инкубацию либо первого, либо второго продукта гибридизации с детекторным олигонуклеотидом, который соответствует Е8Т, которому соответствует один из упомянутых олигонуклеотидных зондов, но который специфичен в отношении отличающейся части Е8Т по сравнению с упомянутым олигонуклеотидным зондом; и (б) детекцию тех олигонуклеотидных зондов упомянутого набора, которые помечены упомянутым детекторным олигонуклеотидом, при том, что упомянутый набор олигонуклеотидных зондов иммобилизован в участке сочетания, при том, что упомянутое сочетание включает (1 ) поверхность, несущую серию пространственно разобщённых существенно идентичных участков, число которых равно числу анализируемых Е8Т, при том, что каждый участок включает:

(2) серию различных якорей, число которых равно числу изучаемых Е8Т.

Понятно, что описанные выше способы картирования, Е8Т-маркёров могут быть использованы для картирования тест-последовательностей (например, полинуклеотидов) на любой интересующей нуклеиновой кислоте. Например, можно установить, картируются ли в общей геномной ДНК два или большее число клонированных фрагментов ДНК или молекул кДНК. Целью такой процедуры может быть, например, расшифровка структуры крупных, сложно устроенных генов. Сходным образом можно установить, картируются в общей геномной ДНК одна или большее число сплайсированных последовательностей или кодирующих последовательностей. Такой подход может быть применён, например, в диагно

- 16 006425 стике при разграничении нормального состояния и заболевания, которые могут различаться по параметрам сплайсинга. Многие другие пути применения способа картирования будут ясны специалисту в данной области техники.

В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ установления того, какие из множества полинуклеотидов комплементарны данной нуклеиновой кислоте, при том, что один или несколько упомянутых полинуклеотидов могут быть комплементарны упомянутой нуклеиновой кислоте, и при том, что каждый из упомянутых полинуклеотидов включает по две дифференцированные олигонуклеотидные последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий упомянутому полинуклеотиду, а вторая из которых определяет детекторный олигонуклеотид, соответствующий упомянутому полинуклеотиду, включающий (а) контактирование образца, содержащего молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты, по крайней мере с одним участком сочетания, при том, что упомянутый участок включает набор олигонуклеотидных зондов, по крайней мере один из которых соответствует каждому из упомянутых полинуклеотидов;

(в) инкубацию упомянутого образца на упомянутом участке, тем самым обеспечивая связывание молекул упомянутой нуклеиновой кислоты с упомянутыми полинуклеотид-соответствующими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны участкам упомянутой нуклеиновой кислоты;

(с) инкубацию упомянутого участка, включающего молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты, связанные с одним или несколькими упомянутыми полинуклеотид-соответствующими олигонуклеотидными зондами, с детекторным олигонуклеотидом, который соответствует тому полинуклеотиду, которому соответствует тот данный олигонуклеотидный зонд из упомянутого набора, в результате чего детекторные олигонуклеотиды связываются с молекулами нуклеиновой кислоты, которые были связаны с упомянутым олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, комплементарными упомянутой нуклеиновой кислоте;

(б) детекцию присутствия упомянутых детекторных олигонуклеотидов, а тем самым идентификацию тех полинуклеотид-соответствующих олигонуклеотидных зондов из состава упомянутого набора, которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с упомянутым данным полинуклеотид-соответствующим зондом, тем самым определяя идентификацию полинуклеотидов, которые комплементарны упомянутой данной нуклеиновой кислоте, при том, что упомянутый набор олигонуклеотидных зондов иммобилизован в участке сочетания, при том, что упомянутое сочетание включает:

(1) поверхность, несущую серию пространственно разобщённых существенно идентичных участков, число которых равно числу изучаемых полинуклеотидов, при том, что каждый участок включает (2) серию различных якорей, число которых равно числу изучаемых полинуклеотидов, при том, что каждый якорь связан с (3) бифункциональным линкером, включающим первую часть, специфичную в отношении данного якоря, и вторую часть в виде олигонуклеотидного зонда, специфичную в отношении по крайней мере одного из упомянутых полинуклеотидов.

В другом аспекте настоящего изобретения описанные выше способы картирования Е8Т-маркёров или иных полинуклеотидов дополнительно включают удаление несвязанных фрагментов образца, производимое в один или несколько этапов.

В другом варианте настоящего изобретения одна или большее число представляющих интерес РНК-мишеней (например, мРНК или других типов РНК) конвертируют в кДНК с использованием обратной транскриптазы и полученные кДНК затем гибридизуют с набором зондов. Этот вариант теста схематически проиллюстрирован на фиг. 8. Экстракты РНК (или пул очищенных мРНК) приготавливают на материале клеток или тканей в соответствии с описанным в данном тексте. Затем обратную транскриптазу и олигонуклеотидные затравки, специфичные в отношении интересующих РНК, добавляют к образцу РНК и с использованием стандартных условий и процедур, которые могут быть стандартным образом подобраны и оптимизованы, синтезируют первую цепь кДНК. Термин «специфичная затравка» указывает на затравку, которая в существенной степени комплементарна интересующей мРНК так, чтобы связываться с ней при выбранных условиях гибридизации и быть распознаваемой обратной транскриптазой, но которая не связывается с нежелательной нуклеиновой кислотой (см. выше обсуждение подходящих условий реакции с целью достижения специфичности гибридизации). Остающиеся РНК (мРНК, которые не были распознаны специфическими затравками, и/или иные типы загрязняющих РНК в составе РНКэктракта, такие как тРНК или рРНК) могут быть удалены с помощью любой рибонуклеазы или с помощью химических методов, таких как обработка щёлочью, после чего остаётся лишь одноцепочечная кДНК, которую после этого помещают для контактирования с набором зондов в МЛР8-тесте. Использование в данном способе обратной транскриптазы минимизует необходимую «ручную работу» с РНК, которая может быть весьма чувствительна к разрушению нуклеазами, тем самым затрудняя проведение анализа. Более того, дополнительная специфичность, задаваемая использованием специфичных обратнотранскрипционных затравок, выводит данный тест на новый уровень специфичности.

Необязательно кДНК, описанные выше, могут быть амплифицированы перед проведением гибри

- 17 006425 дизации с набором зондов с целью повышения интенсивности сигнала. Обратнотранскрипционные олигонуклеотидные затравки, описанные выше, могут включать по их 5'-концам последовательности (длина которых может быть примерно 22-27), специфичные в отношении сайтов инициирования, распознаваемые РНК-полимеразой (например, полимеразами Т7, Т3 или 8Р2 и подобными). В примере, проиллюстрированном на фиг. 8, Т7-промоторная последовательность была добавлена к обратнотранскрипционной затравке. В результате сайт разпознавания РНК-полимеразой оказывается включённым в состав кДНК и может служить в качестве распознавательного сайта, необходимого для серии циклов транскрипции, обеспечиваемых подходящей РНК-полимеразой (при транскрипции ίη νίίτο). Необязательно сформированные таким образом мРНК могут быть дополнительно амплифицированы с применением ПЦР и с подходящими затравками, или же сама кДНК может быть амплифицирована таким образом. Процедуры проведения транскрипции и ПЦР стандартны и хорошо известны в науке.

Описанный выше способ, в котором мРНК-мишени конвертируются в кДНК с помощью обратной транскриптазы перед проведением тестирования на МАР8-планшетах, может быть применён вместо стандартного МАР8-теста для любых описанных выше тестов, нацеленных на РНК.

В другом варианте настоящего изобретения одна или большее число представляющих интерес нуклеиновых кислот-мишеней гибридизуют со специфическими полинуклеотид-защитными фрагментами и подвергают процедуре метода защиты от действия нуклеаз, а те защитные фрагменты, которые гибридизовали с интересующей(ими) мишенью(ями), тестируют на МАР8-планшетах. Если представляющей интерес мишенью является РНК, а защитный фрагмент - это ДНК, то комплексный тест «защита от нуклеазы + МАР8» (№А-МАР8) обусловит снижение уровня «ручной работы» с РНК, которая может быть чувствительна к разрушению загрязняющими нуклеазами, тем самым существенно затрудняя проведение анализа. В таком тесте ПРА-МАР8 зонды в составе их набора являются олигонуклеотидами с таким же количеством цепей, что и представляющие интерес нуклеиновые кислоты-мишени, помимо того, что они им комплементарны, как это имеет место в стандартном МАР8-тесте. Один из примеров теста ΝΓΛМАР8 схематически показан на фиг. 9.

В тесте №А-МАР8 интересующая мишень может являться любой нуклеиновой кислотой, например геномной ДНК, кДНК, вирусной ДНК или РНК, рРНК, тРНК, мРНК, олигонуклеотидами, нуклеотидными фрагментами, модифицированными нуклеиновыми кислотами, синтетическими нуклеиновыми кислотами или подобным. В предпочтительном варианте настоящего изобретения данная процедура применяется для тестирования одной или нескольких мРНК-мишеней, которые содержатся в тканевом или клеточном экстракте РНК. Образец, который содержит интересующую(ие) мишень(и), вначале гибридизуют в выбранных условиях гибридизации (см. выше обсуждение подходящих условий реакции, необходимых для достижения специфичности гибридизации) с одним или несколькими специфичными защитными фрагментами. Защитный фрагмент - это полинуклеотид, который может являться, например, РНК, ДНК (включая ПЦР-продукт), РНП или модифицированной или замещённой нуклеиновой кислотой, специфичной в отношении части интересующей нуклеиновой кислоты-мишени. Под «специфичным защитным фрагментом» подразумевается полинуклеотид, который в существенной степени комплементарен своему предполагаемому партнёру по связыванию в выбранных условиях жёсткости, но который не связывается с другими, «непреднамеренными» нуклеиновыми кислотами. Длина защитного фрагмента составляет по крайней мере 10 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до примерно 100 нуклеотидов, или примерно в соответствии с полным размером кДНК. В предпочтительном варианте защитные фрагменты являются одноцепочечными ДНК-олигонуклеотидами. Защитные фрагменты, специфичные в отношении 1 00 или более мишеней, могут быть включены в одну реакцию гибридизации. После гибридизации образец обрабатывают одной или смесью нескольких нуклеаз с целью разрушения по сути всех нуклеиновых кислот за исключением защитного(ых) фрагмента(ов), которые гибридизовали с интересующей(ими) нуклеиновой(ыми) кислотой(ами) и, что необязательно, с частью(ями) нуклеиновой кислоты-мишени, которая гибридизовала и была тем самым защищена от действия нуклеаз в методе защиты от нуклеаз (находясь в составе двухцепочечного гибрида). Например, если образец является клеточным экстрактом, то нежелательные нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, тРНК, рРНК и мРНК, помимо тех, которые представляют интерес, могут быть на данном этапе в существенной степени разрушены. Может быть использована любая нуклеаза, включая, например, нуклеазу 81, панкреатическую РНКазу, нуклеазу фасолимаш, РНКазу-А, рибонуклеазу Т1, экзонуклеазу III или подобное, что зависит от природы образовавшихся гибридных комплексов и природы нежелательных нуклеиновых кислот, содержащихся в данном образце. В частности, РНКаза-Н может быть использована с целью расщепления остаточной РНК, связанной с ДНК-защитным фрагментом. Условия реакции для этих ферментов хорошо известны в данной области техники и могут быть оптимизованы эмпирическим путём. Также могут быть применены химические методы, например щелочной гидролиз ДНК. По необходимости образцы могут быть дополнительно обработаны с помощью известных методов с целью удаления непрогибридизовавшего материала и (или) инактивации или удаления оставшихся ферментов (например, экстракция фенолом, преципитация, гель-фильтрация и т.п.). Процесс гибридизации, после которой проводится обработка нуклеазой и (необязательно) химическое расщепление, называют «методом защиты от действия нуклеаз»; ранее был описан целый ряд вариантов этого метода (см., например, Ьее с1 а1., 1987, Мс111. Епху

- 18 006425 то1., 152, 633-648; Ζίηη с1 а1., 1983, Се11, 34, 865-879). Образцы, обработанные в методе защиты от нуклеаз с последующей (необязательной) процедурой инактивации этих нуклеаз, помещают в контакте с набором зондов МЛР8-теста и осуществляют обычные этапы этого теста. Связанные защитные фрагменты могут быть выявлены с помощью гибридизации с помеченными мишень-специфичными репортерами в соответствии с описанным в данной заявке для стандартных МЛР8-тестов или же сами по себе защитные фрагменты могут быть помечены путём ковалентного или нековалентного связывания с маркерной молекулой.

В предпочтительном варианте защитный фрагмент помечают напрямую, например, предпочтительнее путём гибридизации с мишень-специфическим репортером. Например, такой репортер связывают с защитным фрагментом по типу взаимодействия в паре «лиганд/антилиганд», например, стрептавидиновый комплекс присоединяют к биотинилированному олигонуклеотиду. В другом примере защитный фрагмент модифицируют химическими методами (например, путём прямого присоединения пероксидазы хрена или флуоресцентного вещества) и с последующим выявлением такой химической модификации как в связи с нуклеотидным сегментом данного защитного фрагмента, так и без него (например, после расщепления данного модифицированного варианта, например, каталитическим или химическим путём). В любом из описанных выше способов защитный фрагмент может быть помечен перед тем или после того, как он гибридизует с соответствующей линкерной молекулой.

С целью контроля за точностью процесса защиты от действия нуклеаз, т.е. за тем, чтобы, как это желаемо, непрогибридизовавшие нуклеиновые кислоты были расщеплены, можно сконструировать один или несколько защитных фрагментов так, чтобы они включали выступающие (негибридизующие) сегменты, которые бы отщеплялись нуклеазами в случае, если процедура была правильной. Присутствие или отсутствие выступающих сегментов может быть установлено путём гибридизации с комплементарным помеченным детекторным зондом, или же сам по себе «выступ» данного защитного фрагмента может быть помечен путём ковалентного или нековалентного присоединения молекулы-детектора. Такой контроль может быть осуществлён перед тем, как образец будет помещён в контакте с набором зондов, или может сам являться одним из этапов МЛР8-теста. Пример теста с таким контролем описан в примере 1 5. Понятно, что ввиду возможного использования различных меток, которые могут быть легко различимыми (например, они могут флуоресцировать с различными спектрами поглощения), в один и тот же тест могут быть включены несколько по-разному помеченных олигонуклеотидов. Кроме того, стандартный тест на защиту от действия нуклеаз с анализом методом гель-электрофореза может быть использован в ходе проверки результатов теста на точность процессирования защитных фрагментов.

Тесты ХРЛ-МЛР8 могут быть использованы для количественного определения содержания мишени в образце. Если защитный фрагмент добавляется со значительным молярным избытком, что необходимо для обеспечения завершения реакции гибридизации, то количество защитного фрагмента, остающееся после этапа защиты от действия нуклеазы будет отражать то, сколько мишеней присутствовало в данном образце. Один из примеров такой количественной реакции описан в примерах 12 и 13.

Тесты ХРЛ-МЛР8 могут быть использованы при реализации любого из описанных здесь способов, базирующихся на стандартных МЛР8-тестах.

В предпочтительном варианте полинуклеотидные защитные фрагменты количественно определяют с помощью масс-спектрометра, предпочтительно не на МЛР8-планшетах. В наиболее предпочтительном варианте никакой из полинуклеотидов не связан (не присоединён) с твёрдой поверхностью в процессе гибридизации или защиты от действия от нуклеаз. После гибридизации гибридизовавшая мишень может быть разрушена, например, путём обработки нуклеазой или химическими методами, ставя тем самым количество защитного фрагмента в прямую зависимость от того, сколько его гибридизовало с мишенью. С другой стороны, данный образец может быть обработан таким образом, чтобы сохранить гибридизовавшую часть (одноцепочечную) мишени или дуплекс, образованный гибридизовавшей мишенью и защитным фрагментом, которые должны быть проанализированы дополнительно.

Предназначенные для анализа образцы отделяют от остальной гибридизационной и нуклеазной смеси (например, путём этанольной преципитации, или адсорбциорнного отбора, или аффинной хроматографии и т.п.), элюируют или солюбилизуют и впрыскивают в масс-спектрометр с помощью петлевого впрыска. В предпочтительном варианте предназначенные для анализа образцы (например, защитные фрагменты) адсорбируют на поверхности и тестируют с помощью лазерной десорбции на основе применения хорошо известных в данной области техники методов. Для достижения наибольшей чувствительности может быть использована масс-спектрометрия с фурье-преобразованием (ЕТМ8) (или другие сходные современные методы), с помощью которой могут быть выявлены фемтомолярные или меньшие количества каждого из защитных фрагментов.

Защитные фрагменты, которые должны быть выявлены в составе одного (или большего числа) образа, могут быть сформированы таким образом, чтобы давать уникальный сигнал в применяемой массспектроскопии. В одном из вариантов каждый из защитных фрагментов характеризуется уникальной молекулярной массой после гибридизации и обработки нуклеазой, т.е. их молекулярных масс и характеристик ионизации и фрагментации должно быть достаточно для определения их концентрации. Для достижения более высокой чувствительности или для облегчения анализа сложных по составу смесей за

- 19 006425 щитные фрагменты могут быть модифицированы (например, с получением их производных) химическими составляющими, конструкция которых обеспечит получение отчётливого уникального сигнала. Например, каждый защитный фрагмент может быть дериватизован с помощью отличающейся нативной или ненативной аминокислоты, присоединённой с помощью амидной связи к цепочке олигонуклеотида по одному или нескольким сайтам на гибридизующем участке этой цепи. При использовании массспектрометра с подходящим уровнем энергии фрагментация будет происходить именно по этим амидным связям, высвобождая тем самым характерную долю аминокислот. Такой тип анализа, в котором используются химические составляющие среднего размера (грубо - с молекулярной массой 80-200), применяется тогда, когда желательным является наличие масс-спектрометрических меток, потому что молекулы такого размера обычно легко выявляемы. В другом примере химической модификацией является органическая молекула с определённым масс-спектрометрическим сигналом, такая как тетраалкиламмонийная группа, с помощью которой можно, например, дериватизовать другую молекулу, такую как, например, молекулу аминокислоты. В другом примере сигналы положительных или отрицательных ионов усиливаются за счёт реакций с любым агентом. Например, для усиления выявляемости положительных ионов можно осуществить реакцию пирилиевой соли (такой как, например, 2,4-дитенил-6-этилпирилийтетрафторборат или многие другие) с амином с образованием пиридиниевой соли; любой из других усиливающих агентов также может быть использован с целью образования других положительно заряженных функциональных групп (см., например, Ошгке е! а1., 1994, Апа1. Сйет., 66, 1302-1315). Сходным образом можно прореагировать любой из известных в науке агентов с образованием вариантов, усиливающих отрицательно заряженные ионы. Химическая модификация может быть выявлена, понятно, либо после её отщепления от нуклеиновой кислоты, или же непосредственно в связи с этой нуклеиновой кислотой. За счёт обеспечения возможности идентификации каждого защитного фрагмента отдельным способом становится возможным тестировать (например, в форме скрининга) большое число различных мишеней (например, 2, 6, 10, 16 или больше различных мишеней) в ходе одного теста. Многие такие тесты могут быть осуществлены легко и быстро. Такой тест или ряд тестов могут быть проведены, следовательно, высокопроизводительным образом, что и определяется настоящей заявкой.

Независимо от использования прямого мечения олигонуклеотидов по их молекулярным массам или использования меток с уникальной молекулярной массой, сигналы для каждой из молекул, которые должны быть выявлены, могут быть в полном объёме охарактеризованы с помощью чистых препаратов в известной концентрации. Это позволяет количественно оценивать сигнал (измерять) с высокой точностью. Для любой молекулы, выявляемой методом масс-спектрометрии, интенсивность и профиль не могут быть точно предсказаны. Слишком сложны для предсказывания такие признаки, как способность молекулы ионизироваться, чувствительность всех имеющихся в молекуле химических связей к фрагментации и степень, с которой каждый из фрагментов приобретает множественный или единичный заряд. Однако для данного прибора с известной энергией ионизации и известными характеристиками обработки образца величины интенсивности и профиля сигнала характеризуются существенной повторяемостью. Следовательно, для каждого зонда сигнал может быть охарактеризован с помощью чистых стандартов с последующей точной количественной интерпретацией сигналов, получаемых в эксперименте.

В одном из аспектов настоящее изобретение представляет способ детекции одной или большего числа представляющих интерес нуклеиновых кислот, включающий обработку образца, содержащего интересующую(ие) нуклеиновую(ые) кислоту(ы), методом защиты от действия нуклеаз с использованием одного или нескольких защитных фрагментов и детекцию гибридных дуплексов, или защищённой нуклеиновой кислоты, или защитного фрагмента с помощью масс-спектрометрии.

Методы анализа нуклеиновых кислот с помощью масс-спектроскопии хорошо известны в данной области техники: см., например, А1рег е! а1., 1998, 8с1епсе, 279, 2044-2045 и Кок!ег, патент США 5605798.

В дополнение к различным высокопроизводительным тестам, описанным выше, для специалиста в данной области техники будут очевидны и многие другие тесты.

Преимуществом использования многозондовых тестов является возможность включать в состав каждого набора зондов группу «контрольных зондов», которые являются объектом тех же условий реакции, что и реальные экспериментальные зонды. Например, каждый участок в таком наборе может включать позитивные и (или) негативные контроли. По использованию в данном тексте термин «позитивный зонд-контроль» обозначает контрольный зонд, для которого известно, например, существенное взаимодействие с данной мишенью или его взаимодействие по известным количественным или качественным характеристикам, т. е. тем самым он действует в качестве (внутреннего) стандарта для оценки взаимодействия в паре «зонд/-мишень». Такой зонд может использоваться, например, для контроля эффективности гибридизации. По использованию в данном тексте термин «негативный зонд-контроль» обозначает контрольный зонд, для которого известно отсутствие существенного взаимодействия с данной мишенью. Такой зонд может использоваться для контроля, например, специфичности гибридизации. В качестве примера типов контроля, которые могут быть использованы, приводится тест, в котором набор олигонуклеотидных зондов используется для скрининга агентов, которые модулируют экспрессию ряда коррелятивных генов в связи с заболеванием. В качестве внутреннего стандартизующего контроля, необходимого для оценки таких переменных, как число лизированных в каждом образце клеток, количества выде

- 20 006425 ленной мРНК или эффективность гибридизации, набор зондов может включать зонды, специфичные для одного или большего числа генов, экспрессирующихся на базовом уровне или конститутивно по типу генов «домашнего хозяйства», таких как структурные гены (например, гены актина, тубулина или другие) или гены ДНК-связывающихся белков (например, гены транскрипционных факторов или другие), экспрессия которых не должна модулироваться тестируемыми агентами. Более того, для установления того, не приводят ли тестируемые агенты к проявлению нежелательных побочных эффектов, таких как гибель клеток или токсичность, набор зондов может включать зонды, специфичные в отношении генов, для которых известна индуцибельность в процессе апоптоза (запрограммированной гибели клеток) или которые индуцируются в условиях повреждения клетки (например, гены белков теплового шока - или стрессовых генов) или при цитотоксичности (например, гены цитохромов Р450).

Другие контрольные зонды могут быть включены в набор с целью «точной настройки» чувствительности теста. Примером является тест, предназначенный для агента, который модулирует выработку мРНК, ассоциированных с конкретным заболеванием. Если в предыдущих анализах было показано, что одна из коррелятивных мРНК (скажем, мРНК-А) в данном наборе вырабатывается в таких высоких количествах по сравнению с другими, что соответствующий сигнал закрывает другие мРНК, то линкеры могут быть подвергнуты «точной настройке» таким образом, чтобы обеспечить уравновешенные по силе сигналы. Для этой цели «заблокированные линкеры», включающие якорь-специфичную олигонуклеотидную последовательность, сконструированную в отношении мишени мРНК-А, но не включающие зонд-специфичную последовательность, могут быть добавлены с целью разбавления пула мишеньспецифичных линкеров, что тем самым приведёт к снижению чувствительности данного теста с данной мРНК. Подходящее соотношение заблокированных и незаблокированных линкеров может быть определено стандартными путями, понятными для специалиста в данной области техники.

Предназначенные для анализа в тестах по настоящему изобретению образцы могут содержать любые из описанных выше мишеней или какие-либо иные мишени. Жидкие образцы, предназначенные для тестирования, могут характеризоваться любым объёмом, подходящим для размера тест-участка, варьируясь от примерно 100 нанолитров до примерно 100 мкл. В предпочтительном варианте жидкие капли объёмом примерно 1 мкл наносятся в каждую лунку 1536-луночного микротитровального планшета. Образцы могут помечены в контакте с наборами зондов с помощью любого из различных методов, пригодных для высокопроизводительного анализа, например с помощью пипетки, путём распыления через красковые сопла или с помощью использования игольного устройства. Образцы инкубируют в условиях (например, концентрация солей, величина рН, температура, продолжительность инкубации и т. д. см. выше), эффективных с точки зрения достижения связывания или стабильного взаимодействия иного типа между данным зондом и данной мишенью. Эти условия определяемы с помощью стандартных подходов. После инкубации образцы необязательно могут быть обработаны (например, промыты) с целью удаления несвязанной мишени, для чего применяют определяемые эмпирическим путём условия, обеспечивающие сохранение интактным специфичное взаимодействие, но удаление неспецифически связанного материала. Например, образцы могут быть промыты от одного до десяти раз или больше при одинаковых или в некоторой степени более жёстких условиях, чем те, которые использовались для достижения связывания в паре «зонд/мишень».

Образцы, содержащие РНК-мишень, например мРНК, рРНК, тРНК, вирусную РНК или тотальную РНК, могут быть приготовлены с помощью любой из различных процедур. Например, клеточные культуры ίη νίίτο, из которых будут экстрагированы мРНК, могут быть высеяны на участках поверхности, таких как отдельные лунки микротитровального планшета. Необязательно эти клетки после достижения желаемой плотности клеток могут быть обработаны интересующим агентом, таким как стимулирующий агент или потенциальный терапевтический агент, который может быть добавлен к клеткам с помощью любого из способов, например, с помощью многоигольного устройства (такого как 96- или 384-игольный бекмановский распределитель проб), путём раскапывания пипеткой или нанесения с помощью диспергирования красковыми соплами, с последующей инкубацией этих клеток в течение любого подходящего периода времени, например от примерно 15 мин до примерно 48 ч, что зависит от типа конкретного теста. Экстракты тотальной РНК, мРНК и т.п. из тканей или клеток из источников ίη νίίτο или ίη νΐνο могут быть приготовлены с использованием стандартных, известных в науке методов (например, с использованием наборов реактивов, доступных на коммерческой основе).

Необязательно нуклеиновая кислота, которая должна конкурировать с представляющей интерес РНК за гибридизацию со специфичным зондом (т.е. геномная ДНК, рРНК, тРНК или мРНК, которые характеризуются, по крайней мере, частичной гомологией с интересующей РНК), может быть, по крайней мере, частично удалена из образца РНК путём предобработки этого образца в методе защиты от действия нуклеаз перед тем, как провести саму гибридизацию. Нуклеиновая кислота («защитный фрагмент», который может быть, например, РНК, ДНК или РНП), комплементарная по крайней мере части интересующей РНК и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, частично или полностью перекрывающейся с последовательностью зонда, специфичного в отношении этой интересующей РНК, вносится в избытке в данный образец и инкубируется с ним при выбранных условиях жёсткости, которые обеспечивают специфичную гибридизацию с данной интересующей РНК (см. выше обсуждение подходящих

- 21 006425 условий реакции). На этом этапе защитные фрагменты, специфичные в отношении любых или всех интересующих РНК в составе образца, могут быть добавлены (например, в числе 100 или более). После гибридизации образец обрабатывают одной или смесью нескольких нуклеаз таким образом, чтобы разрушить в существенной степени все нуклеиновые кислоты, за исключением частей каждой из интересующих РНК, комплементарных защитному(ым) фрагменту(ам) или за исключением дуплексов, образованных защитным(ми) фрагментом(ами) и защищённой РНК. На следующем этапе защитный(ые) фрагменты) могут быть удалены из состава этих дуплексов путём денатурирования этих дуплексов и расщепления подходящим ферментом, который обеспечит разрушение защитного(ых) фрагмента(ов), оставляя защищённую РНК в существенной степени интактной. Любая из широкого круга нуклеаз может быть использована для осуществления обсуждавшихся выше этапов расщепления, включая, например, панкреатическую РНКазу, нуклеазу фасоли-маш, РНКазу-Н, нуклеазу 81 (в условиях расщепления при высокой или низкой солевой концентрации) , РНКазу-А, рибонуклеазу Т1, экзонуклеазу III, экзонуклеазу VII, РНКазу СЬ3, РНКазу РйуМ, РНКазу И2 и подобное, что зависит от природы гибридизовавших комплексов и природы нежелательных нуклеиновых кислот, содержащихся в данном образце. Условия реакций для этих ферментов хорошо известны в данной области техники и могут быть оптимизованы эмпирическим путём. По необходимости образцы могут быть обработаны с помощью хорошо известных процедур с целью удаления непрогибридизовавшего материала и (или) с целью инактивации или удаления оставшихся ферментов (например, с помощью экстракции фенолом, преципитации, гель-фильтрации и т.п.). Обработанные образцы затем помещают в контакте с набором зондов. С целью контроля за специфичностью гибридизации и точностью последующего процесса защиты от действия нуклеазы, т. е. за тем, чтобы, как это желаемо, непрогибридизовавшие нуклеиновые кислоты были расщеплены, можно сконструировать один или несколько защитных фрагментов так, чтобы они включали выступающие (негибридизующие) сегменты, которые бы отщеплялись нуклеазами в случае, если процедура была правильной. Присутствие или отсутствие выступающих сегментов может быть установлено путём гибридизации с комплементарным помеченным детекторным зондом, или же сам по себе «выступ» данного защитного фрагмента может быть помечен с помощью молекулы-детектора.

В связи с любым из способов в соответствии с настоящим изобретением мишени могут быть помечены (маркированы) с помощью любой из процедур, известных в науке и (или) описанных в данном тексте (например, для целей детекции фрагментов при защите от действия нуклеазы). Например, молекулымишени могут быть соединены напрямую или опосредованно с химическими группами, которые дают детекционный сигнал, такие как хемолюминесцентные молекулы или ферменты, которые катализируют выработку хемолюминесцентных молекул, или флуоресцирующие молекулы, такие как флуоресцеин или Су5, или зависящие от времени флуоресцентные молекулы, такие как один из хелатирующих металловлантанидов, или радиоактивное соединение. С другой стороны, мишени могут быть помечены после того, как они прореагировали с зондом, с помощью одного или нескольких мишень-специфичных репортеров (например, антител, олигонуклеотидов в соответствии с показанным на фиг. 1 или любых основных типов молекул, обсуждавшихся выше в связи с описанием зондов и мишеней). Также может быть применён круг более сложных процедур «сэндвич»-типа. Например, мишень может быть прогибридизована с бифункциональной молекулой, включающей первую составляющую, специфичную в отношении данной мишени, и вторую составляющую, которая может быть распознана с помощью обычного (т.е. такого же) репортерного реагента, например помеченного полинуклеотида, антитела или подобного.

Бифункциональные молекулы могут быть сконструированы таким образом, чтобы любое желаемое число общих репортеров могло быть использовано в каждом тесте.

Методы, с применением которых мишени могут быть проинкубированы с мишень-специфичным(ми) репортером(ами) в условиях, эффективных с точки зрения достижения связывания или стабильного взаимодействия иного типа, определяются стандартным образом (см. выше). Например, флуоресцентные олигонуклеотидные репортеры (в концентрации от примерно 10 нМ до примерно 1 мкМ или больше, предпочтительно примерно 30 нМ, в буфере, таком как буфер 6х88РЕ-Т или другие) могут быть проинкубированы со связанными мишенями в течение от примерно 1 5 мин до примерно 2 ч или дольше (предпочтительно в течение примерно 30-60 мин) при температуре от примерно 15°С до примерно 45°С (предпочтительно примерно при комнатной температуре). После этой инкубации образцы необязательно могут быть обработаны (например, промыты) с целью удаления несвязанных мишень-специфичных репортеров, для чего применяются условия, которые определяют эмпирическим путём с целью сохранения интактными специфических взаимодействий, но с удалением неспецифически связанного материала. Например, образцы могут быть промыты от одного до десяти и более раз в таких же или несколько более жёстких условиях по сравнению с теми условиями, которые использовались при достижении связывания в паре «мишень/репортер».

Мечение мишень-специфичным(ми) репортером(ами) может придать дополнительный уровень специфичности исходной реакции гибридизации, например, в случае, когда мишень-специфичный олигонуклеотидный репортер маркируют отличающимся сегментом последовательности нуклеиновой кислоты-мишени по сравнению с олигонуклеотидным зондом или когда зондовое и репортерное антитела распознают отличающиеся эпитопы в составе антигена-мишени. Более того, мечение мишень

- 22 006425 специфичными репортерами может позволить «настроить» чувствительность данной реакции. Например, если мРНК-мишень, являющаяся частью коррелятивных параметров экспрессии, экспрессируется на очень низком уровне, то уровень сигнала может быть усилен («амплификация сигнала») путём гибридизации связанной мишени с несколькими (например, примерно с двумя-пятью или более) мишеньспецифичными олигонуклеотидными репортерами, каждый из которых гибридизует специфическим образом с отличающейся частью мРНК-мишени.

Способность выявлять два типа меток независимо обеспечивает дополнительный путь контроля в МАР8-тестах. Некоторые линкеры (например, от примерно 10% до примерно 100%), сконструированные в отношении конкретного якорного сайта (на фиг. 7 показаны 3 типичных якорных сайта, каждый из которых включает множество существенно идентичных якорей - А, В или С), могут включать метку (например, флуорохром), присоединённую к одному концу. Например, родамин или флуорохром Су5 могут быть присоединены по 5'-концу линкера. Такие модифицированные линкеры обозначаются как «контрольные линкеры». После того, как смесь линкеров и контрольных линкеров будет ассоциирована с якорями и образец, содержащий мишень, будет проинкубирован с полученным в результате набором зондов, может быть использован мишень-специфичный репортер, несущий отличающуюся флуоресцентную метку (например, флуоресцеин или иную выявляемую метку, такую как хемолюминесцентная метка) (или мишень может быть напрямую помечена флуорохромом или другой выявляемой меткой); после этого может быть определено соотношение двух сигналов. Присутствие контрольных линкеров позволяет калибровать число функциональных якорей (например, способных взаимодействовать с линкерами) в пределах и между тест-участками (т. е. определять способность каждого сайта в составе набора связывать мишень, что нужно для стандартизации наблюдаемых сигналов), служит основой для количественного определения содержания связанной мишени, позволяет определять локализацию якорного сайта и (или) представляет позитивный контроль, например, в случае, когда отсутствует экспериментальный сигнал ввиду отсутствия мишени в образце. В одном варианте настоящего изобретения две различные метки (например, флуорофоры) также могут быть использованы для детекции двух различных популяций молекул-мишеней; однако, способность распознавать присутствие мишеней по пространственному разделению сигналов позволяет использовать единственный тип метки для различных молекулмишеней.

В другом варианте настоящего изобретения «якори», специфичные в отношении интересующей(их) мишени(ей), не ассоциируются с линкерами, но напрямую связываются с мишенью(ями); в свою очередь, мишень(и) может (могут) необязательно взаимодействовать с мишень-специфичным(ми) репортером(ами).

Мишени, как помеченные, так и непомеченные, могут быть выявлены с помощью любого из широкого круга методов, которые являются стандартными для данной области техники (см., например, Робот е! а1., 1996, патент США 5510270; Ритипд е! а1., 1992, патент США 5143854; Кок!ег, 1997, патент США 5605798; НоШк е! а1., 1997, патент США 5653939; Не11ег, 1996, патент США 5565322; Еддегк е! а1., 1997, патент США 5670322; ЫрйиПх е! а1., 1995, ВюТес11пк.|иек. 19, 442-447; 8ои!йегп, 1996, Тгепбк Сепе!., 12, 110-115). Методы детекции включают ферментативную детекцию, колориметрические методы, 8РА, авторадиографию, масс-спектрометрию, электрические методы, измерение поглощения или люминесценции (включая хемолюминесценцию или электролюминесценцию) и детекцию рассеяния света, обусловливаемого, например, микроскопическими частицами, используемыми в качестве меток. Также флуоресцентные метки могут быть выявлены, например, путём представления на «паразарядном устройстве» (ССЭ), или с помощью флуоресцентного микроскопа (например, сканирующего или конфокального флуоресцентного микроскопа), или путём присоединения сканирующей установки к прибору ССЭ или фотоэлектронному умножителю, или с использованием пошаговой технологии детекции (например, может быть определён поверностный потенциал каждого 10-микронного шага тест-участка или поверхностный плазменный резонанс может быть применён в случае, если достаточной является его разрешающая способность). С другой стороны, в составе набора может находиться метка (например, элемент пары зондов с переносом энергии между ними, такие как флуоресцеин и родамин), которая может быть выявлена по переносу энергии (или его модуляции) на метку, находящуюся в составе линкера, мишени или репортера. Среди параметров, присущих основанным на флуоресценции детекционным системам, интенсивность флуоресценции, поляризация флуоресценции, флуоресценция в определённый момент времени, флуоресцентный резонанс переноса энергии и высвобождающаяся равномерно по времени флуоресценция. Анализ повторяющихся признаков по типу «штрих-кодов» может быть осуществлён путём распознавания параметров (нахождения подходящей точки или линии для каждой специфически помеченной мишени по её положению по отношению к другим точкам или линиям) с последующей количественной оценкой интенсивности этих меток. Устройства для считывания штрих-кодов и компьютерные программы для такого анализа в одно- или двумерном масштабах создаются обычным путём или доступны на коммерческой основе (см., например, Раса е! а1., 1996, патент США 5545531).

Методы формирования и использования наборов в соответствии с настоящим изобретением включая приготовление таких поверхностей или участков, которые описаны в данном тексте, синтеза или очистки и присоединения или сборки таких субстанций, как описанные здесь якори, линкеры, зонды и

- 23 006425 детекторные зонды, и детекции и анализа помеченных или маркированных субстанций в соответствии с описанным в данном тексте, хорошо известны и представлены стандартными методами. В дополнение к методам, описываемым материалами, цитируемыми в настоящей заявке, см., например, патенты, защищённые фирмами Айутах. Айуте!пх. №-тодеп. Рго!одепе. 8рес1гадеп. Мййроге и Весктап (от них доступны материалы, применимые в связи с настоящим изобретением), а также стандартные руководства по молекулярной биологии и изучению белков, включая цитировашиеся выше и СохеИе е! а1., 1991, патент США 5063081; 8ои1йег. 1996. Сигг. Оршюп Вю!есйпо1.. 7. 85-88; С1ее е! а1.. 1996. 8с1епсе. 274. 610-614; Робот е! а1.. 1993. 1993. УПиге. 364. 555-556.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана схема конструирования олигонуклеотидов, в составе которых линкер 1 включает часть, специфичную в отношении якоря 1, и другую часть (зонд), специфичную в отношении мРНКмишени 1 , и в составе которых помеченный детекторный зонд 1 специфичен в отношении последовательности мРНК-мишени 1, которая не совпадает с той последовательностью, в отношении которой специфична мишень-специфичная часть данного линкера.

На фиг. 2 показана поверхность, несущая 1 5 тест-участков, в каждом из которых находится набор из 6 олигонуклеотидов-якорей.

На фиг. 3 показана конструкция линкера, предназначенного для теста на рецепторное связывание, в котором якорь-специфичная часть линкера ассоциирована с зондовой частью (белком-рецептором) через молекулы биотина и стрептавидина и в котором специфичный в отношении данного рецептора лиганд помечен флуоресцентной молекулой-меткой. В - биотин. 8Α - стрептавидин. Вес - белок-рецептор. Лиганд - нативный или синтетический лиганд данного рецептора. * - флуоресцентная молекула-метка присоединена к лиганду.

На фиг. 4 показана поверхность, несущая 21 тест-участок, каждый из которых дополнительно разделён на 16 субучастков (углублений, ямок).

На фиг. 5а, 5Ь и 5с показаны три «слоя» (пластины), из которых может быть собрана поверхность, показанная на фиг. 4. На фиг. 5а изображён луночный разделитель; на фиг. 5Ь подразделитель; а на фиг. 5 с - основание.

На фиг. 6 показаны два тест-участка, в каждом из которых находится линейно расположенный набор зондов (или якорей), которые расположены по типу «штрих-кода».

На фиг. 7 схематически показан тест-участок, несущий 3 якоря (А, В и С), каждый из которых присутствует во множественных копиях («группа»). Расположение каждой группы якорей определяется термином «сайт».

На фиг. 8 показан набор, в котором на МАР8-планшетах осуществляется тестирование кДНК, полученных с использованием специфической обратной транскриптазы.

На фиг. 9 показан тест, основанный на использовании метода защиты от действия протеаз (ТЕСТ ΝΡΑ-ΜΑΡ8). Образец РНК получают из клеток или тканей: он показан в виде тонких волнистых линий. К образцу РНК добавляют группу полинуклеотидных защитных фрагментов, изображённых в виде толстых тёмных и светлых линий. Тёмные области защитных фрагментов соответствуют их сегментам, которые комплементарны специфичным РНК-мишеням и гибридизуют с этими мишенями. Светлые области соответствуют выступающим сегментам: последовательностям, продолжающимся комплементарной последовательностью, но не комплементарной мишени. Защитные фрагменты добавляют в избытке. После гибридизации всех доступных мишеней с защитными фрагментами образцы обрабатывают подходящей смесью нуклеаз и подвергают химической обработке с целью разрушения нежелательных непрогибридизовавшей РНК и непрогибридизовавшего полинуклеотида. Например, нуклеаза 81 способна разрушить любую присутствующую одноцепочечную ДНК. Следовательно, избыток защитного фрагмента гидролизуется, как и выступающий непрогибридизовавший сегмент связанного защитного фрагмента. РНК может быть гидролизована добавлением рибонуклеаз, включая РНКазу-Н, или путём нагревания образца в щёлочи. Остаётся лишь собрать отщеплённые защитные фрагменты, количество которых отражает то, сколько каждой РНК-мишени присутствовало в данном образце. Остающиеся защитные фрагменты измеряют путём проведения гибридизационного МАР8-теста.

Фиг. 10 иллюстрирует специфичность гибридизации в МАР8-тесте.

Фиг. 11 показывает кинетику связывания якоря и линкера.

Фиг. 12 иллюстрирует МАР8-тест с двумя олигонуклеотидными мишенями.

На фиг. 13 показан количественный анализ сдвига чувствительности.

На фиг. 1 4 проиллюстрировано определение температуры диссоциации для четырёх олигонуклеотидных пар «линкер/якорь».

Фиг. 15 показывает анализа мРНК в тесте №А-МАР8.

На фиг. 16 показана кривая разведения в тесте №А-МАР8.

Фиг. 17 иллюстрирует тест, предназначенный для детекции пептидов, включающих остатки фосфотирозина.

На фиг. 18 показан начальный этап теста по картированию маркёров Ε8Τ: сборку линкеров, соответствующих каждому из Ε8Τ, которые предполагается картировать, на наборах родственных якорей,

- 24 006425 находящихся на МАР8-планшете. К поверхности каждой из 16 лунок микропланшета присоединяют линкеры, включающие 16 различных олигонуклеотидных зондов, формируя матрицу 4x4. Первый сайт содержит олигомер 1, комплементарный участку первой нуклеотидной последовательности Е8Т, и так далее для всех 16 предназначенных к тестированию Е8Т.

Во все 1 6 лунок добавляют кДНК или мРНК, полученные на матрице тех генов, от которых происходят анализируемые Е8Т-маркёры с последующей гибридизацией в подходящих условиях. Следовательно, любая кДНК или мРНК, включающая одну из 16 Е8Т-последовательностей, будет прикреплена к сайту, в котором находился комплементарный ей зонд.

Фиг. 19 показывает следующий этап теста по картированию Е8Т: добавление детекторных олигонуклеотидов на МАР8-планшет. В каждую лунку данного планшета вносят детекторный олигонуклеотид, который соответствует одному из картируемых Е8Т-маркёров. Каждый детекторный олигонуклеотид - это олигонуклеотид, соединённый с молекулой, используемой для детекции, например с флуоресцеином, в случае, когда методом детекции является оценка параметров флуоресценции. Каждый детекторный олигионуклеотид комплементарен одному из Е8Т, но отличается от Е8Т-специфичного зонда таким образом, что комплементарные одному и тому же Е8Т зонд и детекторный олигонуклеотид могут с ним связываться одновременно.

После промывки отдельный детекторный олигонуклеотид добавляют в каждую лунку в соответствии с нумерацией на данной фигуре. Т.е. детекторный олигонуклеотид, последовательность которого комплементарна первому Е8Т, добавляют в первую лунку и так далее.

На фиг. 20а и 20Ь приведены результаты теста по картированию Е8Т в соответствии с изображённым на фиг. 18 и 19. После гибридизации с детекторными олигонуклеотидами и промывки в подходящих по уровню жёсткости условиях 1 6 лунок микропланшета оценивают, например, с помощью флуориметрического устройства ССЭ. На фиг. 20а результаты показаны схематически. Ожидается, что каждый Е8Т-специфичный детекторный олигонуклеотид должен пометить мРНК или кДНК, остающуюся в связи с соответствующим Е8Т-специфичным зондом. Например, зонд 5 присоединяет в данном сайте кДНК или мРНК, включающие последовательность Е8Т 5 т.е. детекторный олигонуклеотид 5 должен также гибридизовать с кДНК или мРНК в том же сайте. Этот принцип использован в показанных схематических данных, где каждый детекторный олигонуклеотид помечает соответствующий зонд. Кроме того, каждый из первых трёх детекторных олигонуклеотидов помечает кДНК или мРНК, удерживаемые первыми тремя зондами: это указывает на то, что данные последовательности находятся в пределах одного и того же гена. Сходным образом последние пять Е8Т, по-видимому, также сцеплены. Оценка сцепления, полученная в этих данных, графически изображена на фиг. 20Ь.

Фиг. 21 показывает соотношения зондов, детекторных олигонуклеотидов и Е8Т-маркёров № 1, 2 и 6, изображённых на фиг. 18-20.

На фиг. 22 проиллюстрирована схема высокопроизводительного теста.

Примеры

Пример 1. Специфичность при гибридизации (см. фиг. 10).

«Родственный» МАР8-планшет был сформирован с использованием распылителя для красок Р1хик (Сайеыаи Тесйио1од1ек 1пс., 1гуше, СА) с целью получения идентичной сетки ДНК в каждой лунке микротитровального планшета. Все олигонуклеотиды были приобретены у Вюкоигсе 1п!егпа!юпа1 (СатагШо, СА). На данном планшете семь разных олигонуклеотидных якорей были распределены по каждой лунке по схеме, показанной в виде «ключа» (см. слева на фигуре). Каждый олигонуклеотид вносили каплей объёмом 10 нл в две точки из раствора 2 мкМ, содержащего 500 мМ фосфата натрия (рН=8,5) и 1 мМ ЕЭТЛ. в лунки костаровского планшета для анализа ДНК (ΌΝΑ-Βίηά Согшпд Сойаг) и оставляли высыхать. После прикрепления лунки блокировали добавлением 50 мМ Трис (рН=8,0), и затем олигонуклеотиды, которые не прикрепились ковалентно к данной поверхности, смывали с использованием 0,1% 8Ό8 в буфере 5х88Р.

К промытому планшету добавляли флуоресцентно помеченные линкерные олигонуклеотиды и оставляли гибридизовать в буфере 6х88РЕ, содержащем 0,1% Тритон Х-100, при комнатной температуре на 30 мин. Эта пропись для прикрепления линкеров является предпочтительной. Эти линкерные олигонуклеотиды в процессе синтеза связывали с Су5, и они были комплементарны 25-нуклеотидным сегментам специфичных олигонуклеотидных якорей. Нуклеотидные последовательности данных семи якорей и линкеров были следующими (показаны в направлении 5' 3'):

- 25 006425

Якорь 1*:

ΞΕΟ Ιϋ ΝΟ 1

ТССАССТСАССАССССАСССССТСС

Линкер**:

3Εζ) Ιϋ ΝΟ 2

СТССТТТССАТСТТТССАСТСАТАССАТАСТСАбТееАСССССТССССТССТСАССТССА

РНК-имитатор (с-₃ип мыши):

ЗЕО Ю N0 3

СТАТ6АСТССААА6АТССАААССАССАТАСТСАСТТ0САССТААСАТТССАТСТСАТТСА

Детекторный олигонуклеотид***:

ЗЕО ΙΩ N0 4

ТСААТСАСАТССААТСТТАС6ТССА

Якорь 2*:

ЗЕО Ю N0 5

САСТАССССТ6АССАССТ6СССТСА

Линкер**:

5ЕГ> ιυ N0 б

СТАСССТСААСТСТСССТССАСТСТССАССССАССТССТСАССССТАССС

РНК-имитатор (ΜΙΡ-2 мыши):

ЗЕС Ιϋ N0 7

А6АСТССАСССАСАСТТСАСССТАССАТАСТСАСТСТСААСАААСССААСС6ТААСТСАС

Детекторный олигонуклеотид***:

СТСАСТТАСССТТСССТТТСТТСАС

Якорь 3*:

3ΕΩ Ιϋ N0 9

СТСАСТТАСССТТСССТТТСТТСАС

Линкер**:

ЗЕО Ιϋ N0 10

АССАТСТАСТТСАССТСААТБААССССССТСССАСААСССТССАСССССС

РНК-имитатор (САРИН мыши);

ЗЕО 1И N0 11

ССТТСАТТСАССТСААСТАСАТССТСАТАСТСАСТССАеАААССТСССААСТАТСАТеАС

Детекторный олигонуклеотид***:

ЗЕО 10 N0 12

СТСАТСАТАСТТСССАССТТТСТСС

Якорь 4*:

ЗЕО Ιϋ N0 13

СААССССТССССТСТТСТАСАСССА

Линкер**:

ЗЕО 10 N0 14

СТАСССАССАААСТССАААТСАААТТСССТСТАСААСАССССАССССТТС

РНК-имитатор (белок Д32 мыши):

ЗЕО Ю N0 15

АТТТСАТТТССАСТТТССТС66ТА6САТАСТ6А6Т6АСТСАССААТСССААССССАЗССТ

Детекторный олигонуклеотид***:

А6ССТССССТТСССАТТССТСАСТС

Якорь 5*:

СТССТТСССССТСССТСССТСССАС

Линкер**:

СТСССАСССАСССАСССССААССАС

Якорь б*:

СССТССССАТССТАССАСАСТСССС

Линкер**:

6СССАСТСТС6ТАССАТССССАСС6

Якорь 7*:

ССССССССССТТАТССАТСТСТТСС

Линкер**:

	ЗЕО Ю N0 16
ЗЕО	ю	N0	17
ЗЕО	ю	N0	18
ЗЕО	10	N0	19
ЗЕО	10	N0	20
ЗЕО	ю	N0	21
ЗЕО	10	N0	22

ССААСАСАТССАТААСССССССССС * - Якори были синтезированы со спейсером С12 и амидом с 5'-конца;

** - Линкеры были синтезированы с присоединённым по 5'-концу флуорохромом Су5;

*** - Детекторные олигонуклеотиды были синтезированы с присоединённым по 5'-концу биотином.

К каждой лунке добавляли либо один линкер, либо смесь линкеров (в соответствии с отмеченным на фигуре). (Смесь всех семи линкеров добавляли в лунку помеченную на фигуре как «все»). После инкубации и трёхкратной промывки в буфере 5х88Р картина флуоресценции, показанная на фигуре справа, была получена с помощью сканера Тиийга (1Ш. ЕИ.СаШсппсз. Оп1апо). Как можно видеть, линкеры претерпевали самосборку на данной поверхности в зависимости от специфичности связи с комплементарными им якорями.

Данный процесс был полностью воспроизведён, за исключением того, что восемь разных якорей были размещены в каждой лунке, и после этого отмечено предпочтительное ассоциирование линкеров с ними. Полный процесс был повторен для вариантов с 36, 64 и т.д. якорями, размещаемыми в каждой из лунок 24-, 96-, 384-, 864- или 1536-лучноных планшетов.

- 26 006425

Пример 2. Кинетика связывания (см. фиг. 11).

Темп гибридизации Су5-производного линкера 1 со своим комплементарным якорем показан для различных концентраций линкера. «Родственный» МАР8-планшет приготавливали в соответствии с изображённым на фиг. 1, за исключением того, что якорь 1 был нанесён в 4 точках каждой лунки. Инкубацию проводили при комнатной температуре в буфере 5х88Р с добавлением 0,1% Твин-20, лунки промывали трижды буфером 5х 88Р и измеряли связанную флуоресценцию. Картину флуоресценции планшета считывали с помощью Типбга. вычитали величину фона и интегральную интенсивность каждой точки в каждой лунке подсчитывали с помощью программы, прилагающейся к сканеру Типбга. На график наносили средние величины и стандартные отклонения для признака интегральной интенсивности для четырёх точек в пределах каждой из двух дупликатных лунок.

Пример 3. Флуоресцирующий линкер.

«Родственный» МАР8-планшет формировали путём раскапывания якорного олигонуклеотида в 1 точку в каждой лунке (верхние два ряда), в 4 точки в каждой лунке (следующие 4 ряда) или в 1 6 точек в каждой лунке (нижние два ряда) в соответствии с обсуждавшимися выше способами. К каждой лунке присоединяли комплементарный, флуоресцентно помеченный линкер с использованием предпочтительного протокола, описанного в примере 1 . После промывки картину флуоресценции данного планшета считывали с помощью сканера Типбга. Величина флуоресценции в каждой точке указывала на то, сколько функционального линкера способно гибридизовать с мишенью. Количественные параметры сигналов на одинаковых точках характеризовались высоким уровнем воспроизводимости.

Пример 4. Кривые связывания.

Различные концентрации олигонуклеотида-мишени добавляли к планшету, сформированному в соответствии с описанным в примере 3. Ассоциировавшийся линкер включает 25-нуклеотидную последовательность, комплементарную части данной мишени. Мишень добавляют в буфере 5х88С, содержащем 0,05% 8Ό8, при общем объёме либо 30, либо 100 мкл, планшет закрывали и инкубировали при 50°С в течение ночи. После гибридизации мишени с линкером эту мишень визуализовали, используя хемолюминесценцию в качестве предпочтительного протокола. Биотинилированный детекторный олигонуклеотид, включающий 25-нуклеотидную последовательность, комплементарную отличающейся части данной мишени (т.е. не той же самой части, которая комплементарна данному линкеру), добавляют в концентрации 30 нМ. Биотинилированный детектор может быть добавлен на 30 мин после смывания избытка неприсоединившейся мишени или он может быть добавлен вместе с мишенью в ходе ночного этапа гибридизации. После присоединения детектора данную поверхность дважды промывают буфером 5х88С, один раз буфером 1х88Р, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% полиэтиленгликоля (88РТР) и разведение 1/50000 250 мкг/мл пероксидазы хрена, соединённой со стрептавидином (Р1егсе, КοскΓο^ά. 1Ь), добавляют на 5 ч в буфере 88РТР при комнатной температуре. Лунки промывают 4 раза буфером 88РТР, промывают 1 раз и затем инкубируют с реагентом 8ирет 8ί§η;·ι1 и11га (Р1егсе). Через несколько минут картины люминесценции анализируют на сканере Тиифа, например, такая картина может быть получена с помощью установки ССИ в течение 5 мин. Низкие уровни мишени могут быть визуализованы в некоторых лунках при концентрации мишени вплоть до примерно 5-10^-13 М; количество сигнала в принципе становится насыщенным при концентрации мишени примерно 1 0^-10 М. Количество сигнала, выявляемого в одинаковых точках, характеризуется высоким уровнем воспроизводимости.

Пример 5. Тест для двух олигонуклеотидов (см. фиг. 12).

Показана кривая связывания, отражающая параметры гибридизационного МАР8-теста, использующего обсуждавшийся выше предпочтительный протокол в отношении двух разных олигонуклеотидов-мишеней. «Родственный» МАР8-планшет был сформирован с четырьмя разными якорными олигонуклеотидами, каждый из которых раскапывали по 4 раза в каждую лунку. Для второго и четвёртого якоря комплементарные линкерные олигонуклеотиды проявляли «самособираемость» на данной поверхности в соответствии с описанным. Две мишени добавляли в концентрациях 40 мкл к каждой лунке в соответствии с описанным и инкубировали при 50°С в течение ночи. Количество каждой присоединившейся мишени визуализовывали путём присоединения биотинилированного детекторного олигонуклеотида, специфичного в отношении каждой мишени с последующим выявлением с помощью пероксидазы хрена со стрептавидином и хемолюминесценции, как было выше описано. На нижней панели показана количественная оценка интенсивности изображения. Компьютерная программа входит в па-кет, прилагающийся к сканеру Типбга; он был использован для сканирования интенсивности изображений вдоль линий между рядами, показанными на верхней панели. При наименьшей концентрации мишени (1,1 пкМ) сканированные изображения демонстрируют отчётливые гауссовы пики для каждой точки, в то время как отсутствуют отчётливые фоновые пики, видимые в самом левом образце при концентрации мишени, равной 0.

Пример 6. Сдвиг чувствительности (см. фиг. 13).

Гибридизационный МАР8-тест может быть использован для определения концентрации набора нуклеотидов по параметрам их связывания на поверхности и их мечения. Этот тест эффективен в отношении тех олигонуклеотидов, которые находятся в относительно средней или низкой концентрации. Два образца можно различить в этом случае с учётом того, что чем больше один из образцов содержит оли- 27 006425 гонуклеотида, тем сильнее он будет связываться. С другой стороны, если концентрация олигонуклеотида-мишени является для данной поверхности насыщающей (т.е. если его достаточно для занятия всех сайтов связывания), т.е. концентрация превышает ту, которая может быть далее связана, то такое количество не может быть измерено. Однако кривая связывания мишени может быть сдвинута добавлением непомеченного конкурирующего лиганда.

Данные по связыванию получают для четырёх различных олигонуклеотидных мишеней - все они насыщают данную поверхность (т.е. обеспечивают максимальное связывание) при грубо оцениваемой концентрации 3 нМ. Путём добавления непомеченных конкурентных мишеней во все лунки уровень связывания помеченного олигонуклеотида сдвигается таким образом, что его связывается меньше при меньшей концентрации, а уровень, при котором происходит насыщение, сдвигается. Можно добавить конкурентные олигонуклеотиды, скажем, к мишеням № 1 и 3, но не к мишеням № 2 и 4. Этот «сдвиг чувствительности» теста произойдёт только для мишеней № 1 и 3. В этом случае олигонуклеотидные мишени могут быть протестированы в широком диапазоне концентраций в пределах одной тест-лунки, если ожидаемое относительное количество олигонуклеотида известно.

Данные могут быть оценены количественно в соответствии с приведёнными выше объяснениями для связывания олигонуклеотидных мишеней. На фиг. 13 показана количественная оценка того, что включение конкурентного олигонуклеотида в данном тесте сдвигает кривую связывания, используемую в этом тесте для данной мишени, находящейся в высоких концентрациях.

Пример 7. Температура диссоциации для четырёх зондов (см. фиг. 14).

Количество четырёх различных флуоресцентно помеченных линкерных олигонуклеотидов, специфически гибридизующих с якорными олигонуклеотидами в МЛР8-тесте, наносят на график в виде величины повышения температуры. Эти четыре олигонуклеотида впервые способны гибридизовать при 50°С в течение 1 ч в концентрации 300 нМ. После этого лунки промывали буфером 88С в отсутствие зондов и количество связанного материала измеряли в соответствии с описанным выше по уровню флуоресценции (точка 50°С). Затем эту поверхность инкубировали при 55°С в течение получаса и измеряли связанную флуоресценцию, и так далее для всех приведённых температур.

Пример 8. Методы детекции.

Два метода детекции могут быть подвергнуты прямому сравнению. На МЛР8-планшет с четырьмя присоединёнными якорными олигонуклеотидами (каждый из них в 4 точках в каждой лунке) добавляют по два олигонуклеотида в каждую лунку, при том, что оба они включают ковалентно присоединённую составляющую Су5 или оба они включают группу биотина. Измерение поверхностной флуоресценции осуществляют в соответствии с тем, что было описано в связи с визуализацией и измерением флуоресценции линкера. Измерение хемолюминесценции осуществляют в соответствии с описанным для МЛР8теста с использованием последовательного добавления пероксидазы хрена со стрептавидином и хемолюминесцирующей субстанции. Индуцированные сигналы по грубой оценке имеют одинаковый масштаб. Однако в связи с геометрией микропланшетов, имеющих стенки, разделяющие отдельные лунки, и с наличием случайных пузырьков жидкости или мениска на поверхности жидкости, обусловливающих отражение в поверхностных флуоресцентных изображениях, на интерпретацию получаемых данных может влиять интерференция.

Пример 9. Хемолюминесцирующие продукты.

Два продукта, пригодные в качестве хемолюминесцирующих субстратов для пероксидазы хрена, могут быть подвергнуты сравнению с точки зрения детекционных процедур, включаемых в МЛР8-тест. МЛР8-планшет формируют так, как это было описано в примере 8, и инкубируют с биотинилированными линкерными олигонуклеотидами. Затем добавляют либо соединённую со стрептавидином щелочную фосфатазу, либо пероксидазу хрена со стрептавидином с последующей промывкой и добавлением реактивов либо СЭР-Лаг (Тгор1х) к лункам с щелочной фосфатазой, либо ЕСЬ-Р1ик к лункам с пероксидазой хрена. Мечение стрептавидином производных ферментов и субстратов осуществляется в соответствии с рекомендациями производителя, данными в связи с их применением для мечения Вестерн-блотов. Эти два субстрата (равно как и другие доступные субстраты) могут быть использованы для оценки гибридизации олигонуклеотидов на МЛР8-планшетов.

Пример 10. Разрешение на уровне 0,6 мм.

Разрешающую способность используемой для МЛРЗ-теста системы исследовали путём формирования МЛР8-планшета с четырьмя разными олигонуклеотидными якорями в каждой лунке, при том, что каждый из них раскапывали в каждой лунке по 4 раза, при интервале, или шаге (расстояние от центра до центра) в 0,6 мм. Затем либо Су5-производные линкеры, либо биотинилированные линкеры гибридизовали, детектировали и сканировали так, как это было описано выше. При измерении поверхностной флуоресценции разрешающая способность была выше (и интервал может быть, по-видимому, снижен). При детекции с помощью хемолюминесценции соседние точки полностью не разделены, но даже при таком расстоянии отдельные пики могут быть недвусмысленно идентифицированы с помощью компьютерного представления.

Пример 11. Протокол теста на защиту от действия нуклеаз.

В тесте на определение оптимальных условий гибридизации и обработки нуклеазами для протокола

- 28 006425 метода защиты от нуклеаз используют набор для этого теста Ыис1еа8е РгсИесНоп Аккау кй фирмы АтЫоп (Аикйп. ΤX) с целью определения условий, буферов и ферментов. Восемь образцов приготавливают в одном из трёх буферов. НуЬ-ВиГГ 1 - 100%-ный гибридизационный буфер (АтЫоп); НуЬ-ВиГГ 2 - 75%ный гибридизационный буфер + 25%-ный гибридизационно-дилюционный буфер (АтЫоп); и НуЬ-ВиГГ 3 - по 50% каждого из них. Синтезировали 70-мерный олигонуклеотид, включающий 60 нуклеотидов, комплементарных тестируемой мРНК (Вюкоигсе ГпГетп.. СатагШо, СА): его помечали псораленфлуоресцеином (8сЫе1сйег & 8сйие11. Кеепе. ΝΗ) в соответствии с прописью, рекомендуемой фирмой АтЫоп для мечения псорален-биотином. Вкратце, защитный фрагмент разводят до 50 мкг/мл в 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЕИТА - рН=8), кипятят в течение 10 мин и быстро охлаждают на смеси воды и льда. Добавляют 4 мкл 130 мкг/мл псорален-флуоресцеина в ИМЕ и в течение 45 мин при 40°С образец облучают ручной длинноволновой ультрафиолетовой лампой. Несвязавшийся псораленфлуоресцеин удаляют путём экстрагирования насыщенным бутанолом. Используемая в тесте мРНК является антисмысловой мРНК гена САРИН, приготовленной из антисмысловой плазмиды (рТШ-САРИНМоике апйкепке Соп1го1 Тетр1а1е - АтЫоп) с использованием промотора Т7 и реактивов Мах18спрГ кй (АтЫоп). Короткий защитный фрагмент - это 60-нуклеотидный комплементарный сегмент, синтезированный отдельно и сходным образом помеченный. Нуклеотидные последовательности защитных фрагментов следующие:

Полноразмерный защитный фрагмент: 5Е<2 Ю ΝΟ 23

ССАСАААТАТСАСААСТСАСТСААСАТТСТАССААТССАТ ССТССАССАС СААСТСС

ТТССТТСТСТАА

Короткий защитный фрагмент: 3Εζ) Ю ΝΟ 24

ССАСАААТАТСАСААСТСАСТСААСАТТбТАССААТССАТССТССАССАССААСТССТТ

Гибридизацию осуществляют путём смешивания защитных фрагментов в концентрации 20 нМ и мРНК САРИН в концентрации 60 нМ при конечном объёме 10 мкл в течение 2 ч при 22°С или при 37°С. После гибридизации 200 мкл смеси нуклеаз добавляют в соответствии с инструкциями производителя (АтЫоп Шс1еаке РтоГесйоп кй: разведение смеси нуклеаз - 1:200) и инкубируют снова при тех же температурах в течение получаса. Гидролиз останавливали с помощью гибридизационно-ингибирующего буфера (АтЫоп) и олигонуклеотиды пеллетировали и промывали этанолом. Добавляли 10 мкл буфера 1х Се1 Ьоабшд (АтЫоп) и олигонуклеотиды разделяли в 15%-ном ТРЕ-мочевинном геле. Гель вращали в специальном буфере в течение 30 мин, помещали на пластиковый планшет и анализировали сканером Типбга с использованием фильтров для флуоресцеина, позволяющих разделять длины волн возбуждения и эмиссии. Изображение накапливали на устройстве ССИ в течение 2 мин. Наилучшими условиями были те, когда образцы инкубировали в буфере НуЬ-ВиГГ 2 при 37°С или в буфере НуЬ-ВиГГ 3 при 22°С. В этих образцах не выявлено сохранения полноразмерных защитных фрагментов, но выявляется существенное количество части полноразмерного защитного фрагмента, размер которого практически таков же, что и у короткого защитного фрагмента.

Пример 12. Тестирование мРНК с помощью ЖА-МАР8 (см. фиг. 15).

Был использован протокол полного теста №А-МАР8, условия гибридизации и обработка нуклеазами были сходными с таковыми, которые описаны в примере 11. Для проведения теста использовали десять образцов. Во всех них содержалось одинаковое количество 70-мерного олигонуклеотидного защитного фрагмента и различные количества мРНК САРИН. Гибридизационные образцы в объёме 10 мкл в 50%-ном гибридизационном буфере + 50%-ном дилюционном буфере, содержащих 0,08 мг/мл дрожжевой РНК (АтЫоп), нагревали до 90°С на 6 мин, быстро центрифугировали, нагревали до 70°С на 5 мин и оставляли охлаждаться до 19°С и инкубировали в течение 19 ч. Затем к каждому образцу добавляли 200 мкл смеси нуклеаз на 30 мин при 19°С. От каждого образца отбирали аликвоты по 60 мкл для проведения МАР8-теста. Добавляли 2 мкл 10 N №ЮН и 2 мкл 0,5 М ЕИТА и образец нагревали до 90°С на 15 мин, до 37°С на 15 мин и оставляли при комнатной температуре на 20 мин. Затем образцы нейтрализовали с использованием 2 мкл 10 М НС1 и 12 мкл буфера 20х88С, содержащего 2 М НЕРЕ8 (рН=7,5) и 200 нМ биотинилированного детекторного олигонуклеотида, специфичного в отношении данного защитного фрагмента, добавляли наряду с 1 мкл 10% 8И8. Образцы смешивали, нагревали до 80°С на 5 мин и две аликвоты по 35 мкл от каждого образца раскапывали в две лунки МАР8-планшета (каждый образец разделяли надвое и анализировали в двух повторностях на МАР8-планшете). Этот планшет формировали в соответствии со стандартным МАР8-протоколом, в котором проходит самосборка Су5-производного линкера, специфичного в отношении защитного фрагмента, который уже присоединён. МАР8-планшет закрывали и инкубировали при 50°С в течение ночи и проводили детекцию и люми-несценцию в соответствии с описанным. В последнем образце нуклеазы не добавляли в ходе теста: его использовали в качестве контрольного для визуализации того, как сам по себе защитный фрагмент будет выявляться в МАР8-тесте. В нижней части фигуры показан скан уровней интенсивности (результаты анализа на сканере) верхнего ряда лунок. Количество мРНК САРИН, содержащегося в образце (а, следовательно, и количество в каждой из дупликатных лунок после разделения на аликвоты с нанесением их на МАР8

- 29 006425 планшет), приведено на данной фигуре.

Олигонуклеотиды, использовавшиеся для МАР8-планшетов, были следующими:

Якорь*: ЗЕ<2 Ю N0 25

ССССССТССАСССТТСТССеДОСбС

Линкер**: 3Εζ2 Ю N0 26

СТТСАЕТеАбТТСТСАТАТТТСТСЕСАТАСТСАСТОССССТСССАСААСССТССАСССбСе Защитный фрагмент (комплементарный антисмысловой м₽НК

САРОН мыши) ЗЕО Ю N0 27

С&АСАААТАТСАСААСТСАСТСААЕАТТбТСАбСААТбСАТССТбСАССАССААСТС

СТТ6СТТСТСТАА

Детекторный олигонуклеотид***, помеченный по 5'-концу биотином ЗЕС 10 N0 28

ААССА6ТТС0ТС6Т6САС0АТ6САТ * - Якори были синтезированы со спейсером С12 и амидом с 5'-конца;

** - Линкеры были синтезированы с присоединённым по 5'-концу флуорохромом Су5;

*** - Детекторные олигонуклеотиды были синтезированы с присоединённым по 5'-концу биотином. Пример 13. Кривая разведения в тесте №А-МАР8 (см. фиг. 16).

Данные, обсуждавшиеся в примере 12 и показанные на фиг. 15, были подвергнуты количественному анализу и нанесены на кривую разведения. Для каждой концентрации мРНК были построены графики по средним величинам и стандартным отклонениям для всех восьми точек в лунках, соответствующих двум повторностям. Кривая связывания была проведена в форме:

[Связанная фракция] = [максимальное связывание] ·1 / (1 + ИК₅₀/л), где [максимальное связывание] соответствует максимальному уровню связывания при насыщении, [связанная фракция] - это количество, связанное при концентрации лиганда [л], а ИК₅₀ -это концентрация лиганда, при которой [связанная фракция] составляет 50% от [максимального связывания]. Кривая показана в виде чёрных точек на данной фигуре, составленной по величинам наилучшего соответствия ИК₅₀=4,2 фемтомолей в соответствии с помеченным на данной фигуре.

Пример 14. Тест №А-МАР8 мРНК САРЭН в общем экстракте РНК печени мыши.

Экстракт тотальной мышиной РНК тестируют на присутствие мРНК гена САРЭН в тесте №АМАР8 и выводят кривую разведения. Тотальную РНК мышиной печени приготавливают с помощью набора реактивов 01адеп. РНК осаждают в 70% этаноле, содержащем 0,5 М Мд-ацетата и ресуспендируют в буфере 5х88С, содержащем 0,05% 8Ό8 и 1,8 нМ защитного фрагмента. Защитный фрагмент добавляют в виде 70-мерного олигонуклеотида, при том, что 60 нуклеотидов комплементарны последовательности САРЭН мыши. Используют либо фрагмент, комплементарный мРНК САРЭН мыши («защитный фрагмент»), либо комплемент последовательности, являющийся негативным контролем («антисмысловой фрагмент»).

Образцы РНК с защитными фрагментами нагревают до 90°С на 5 мин и гибридизацию осуществляют путём перемещения образцов в 70°С и оставления медленно охлаждаться до комнатной температуры в течение ночи. Нуклеазу 81 (Рготеда) в разведении 1:10 добавляют в количестве 30 мкл в нуклеазном буфере 1x81 (Рготеда) на 30 мин при 19°С и реакцию останавливают добавлением 1,6 мкл 10 N №ЮН и 2,7 мкл 0,5 М ЕЭТА. Образцы нагревают до 90°С на 15 мин и затем до 37°С на 15 мин с целью денатурации и разрушения РНК, нейтрализуют 1,6 мкл 10 М НС1 и инкубируют на МАР8-планшетах в течение ночи в буфере 5х88С, содержащем 0,05% 8Ό8, с добавлением 200 мМ НЕРЕ8 (рН=7,5), к чему добавляют 30 нМ биотинилированного детекторного олигонуклеотида. Промывку и визуализацию с использованием пероксидазы хрена со стрептавидином осуществляют в соответствии с описанным. Количество сигнала снижается параллельно уменьшению количества мышиной РНК (образцы включают 500, 170, 50, 5 или 0,5 мкг тотальной мышиной РНК). Включают два контрольных образца, к которым нуклеазу 81 добавляют. Сигнал был визуализован только для комплементарного защитного фрагмента.

Использовавшиеся олигонуклеотиды:

Для антисмыслового контроля (те же олигонуклеотиды, что и в примере 1 2):

Якорь*: 5Е<2 Ю ΝΟ 25

ССССССТССАСССТТСТСССАСССС

Линкер**: ЗЕО Ю ΝΟ 26

СТТСАСТбАСТТСТСАТАТТТСТСббАТАСТбАбТССССТСССАСААСбСТССАСССбСб

- 30 006425

Защитный фрагмент (комплементарный мышиной антисмысловой мРНК гена САРОН) : ЗЕ£) Ю N0 27

ССАСАААТАТСАСААСТСАСТСААЗАТТСТСАССААТССАТССТССАССАССААСТС

СТТССТТ6ТСТАА

Детекторный олигонуклеотид***: ЗЕ<Э Ю N0 28

ААССАСТТЗСТС6ТССАССАТССАТ

Для образцов смысловой мРНК ΟΑΡϋΗ:

Якорь*: 3ΕΩ Ю N0 25

ССССССТССАСС6ТТ6Т66СА0ССС

Линкер**: 5Е<2 Ю N0 29

АТССАТССТССАССАССААСТССТТСАТАСТСАСТССССТСССАСААСССТССАССбССС Защитный фрагмент (комплементарный мышиной мРНК гена 6ΑΡΩΗ): 3ΕΏ Ю N0 30

ААССАСТТССТССТССАССАТССАТТбСТЗАСААТСТТСАСТеАСТТеТСАТАТТТС

ТССССТТСТСТАА

Детекторный олигонуклеотид***: 5Е2 Ю N0 31

С ЗАСАААТАТСАСААСТ САСТСАА6 * - Якори были синтезированы со спейсером С12 и амидом с 5'-конца;

** - Линкеры были синтезированы с присоединённым по 5'-концу флуорохромом Су5;

*** - Зонды были синтезированы с присоединённым по 5'-концу биотином.

Пример 15. МАР8-тест на защиту от нуклеаз с контролями.

Пулы мРНК экстрагируют из печени мышей и тест на защиту от действия нуклеаз проводят в существенном соответствии с описанным в примере 14, за исключением того, что специфичные в отношении САРЭН защитные фрагменты включают 60 нуклеотидов, комплементарные гену САРЭН мыши, и далее 15 «выступающих» нуклеотидов по 3'-концу этого фрагмента, которые некомплементарны данной мишени. После гибридизации и обработки нуклеазами остаток защитного фрагмента гибридизуют на МАР8-планшете в соответствии с описанным в примере 14, за исключением того, что два разных детекторных олигонуклеотидных фрагмента используются для детекции иммобилизованного защитного фрагмента. Один из детекторных фрагментов комплементарен САРЭН-специфичной части данного защитного фрагмента, а другой, являющийся контролем, комплементарен 15-нуклеотидному выступающему сегменту в составе данного защитного фрагмента. Каждый из детекторных фрагментов используется на разных повторных образцах (т.е. на разных лунках), поэтому оба детекторных фрагмента могут быть помечены с использованием одной и той же детекторной молекулы. В данном примере оба фрагмента помечали пероксидазой хрена. Без добавления нуклеазы выявлялись сигналы на обоих детекторных фрагментах; напротив, в случае когда обработка нуклеазой имела место, сигнал выявлялся только в варианте соответствия САРЭН. Количество САРЭН-специфичного сигнала снижается относительно того, что наблюдается в отсутствие обработки нуклеазой, потому что защитный фрагмент добавляют в избытке по отношению к количеству содержащейся мРНК гена САРЭН. Это позволяет ограничивать количество мРНК САРЭН в реакции гибридизации с защитным фрагментом, поскольку количество образующегося двухцепочечного гибрида (и, следовательно, количество защитного фрагмента, защищённого от действия нуклеазы) отражает количество данной мРНК. Когда в реакционной смеси мРНК отсутствует, при добавлении нуклеаз никакие сигналы не обнаруживаются. Приведённые выше данные показывают, что этапы гибридизации и обработки нуклеазой имеют место, когда это является желательным.

Когда защитные фрагменты, соответствующие различным мишеням, включаются в данный тест, то каждый из защитных фрагментов может включать тот же 15-нуклеотидный «выступающий» сегмент. Это позволяет использовать один и то же детекторный фрагмент для тестирования остающегося «выступа» во всех образцах.

Пример 16. Транскрипционный скрининг-тест для соединений, которые могут изменять экспрессию генов, являющихся коррелятивными для заболевания.

Используют клеточную линию, производную от опухоли человека. Установлена экспрессия 30 генов, проявлявшаяся на более высоком уровне, чем в нормальных клетках. (Следовательно, эти 30 генов более интенсивно используются этими клетками по сравнению с нормальными клетками в связи с синтезом мРНК и, соответственно, с выработкой белка, который кодируется этими генами. Транскрипционный тест призван измерить количество используемых таким образом генов путём измерения того, как много

- 31 006425 мРНК для каждого гена присутствует в образце). С использованием теста на защиту от действия нуклеаз на МАР8-планшетах (№А-МАР8) 8800 химических соединений тестируют с целью определения того, может ли при росте этих клеток в присутствие данных соединений снижаться экспрессия некоторых их этих 30 коррелятивных генов без подавления экспрессии шести «нормальных» генов («конститутивных генов», «генов домашнего хозяйства»). Любое из соединений, проявляющее искомый эффект, может быть использовано в будущем при разработке новых лекарственных средств, предназначенных для лечения данного типа опухоли.

Примерно от 10 до 100 тысяч клеток добавляют в каждую лунку ста 96-луночных полистироловых планшетах и клетки культивируюи в течение 2 дней до тех пор, пока они не покрывают поверхность каждой лунки. Для 8 лунок на каждом планшете клетки оставляли расти без каких-либо добавок. К остальным 88 лункам каждого планшета добавляли различные химические соединения таким образом, чтобы мог быть протестирован эффект одного отдельного соединения. При одновременном использовании 100 планшетов могут быть протестированы или подвергнуты скринингу 8800 соединений. Клетки культивируют в течение 24 ч в присутствие данных соединений и затем эти клетки собирают для проведения собственно теста. Клетки на каждом планшете обрабатывают в соответствии с инструкциями по приготовлению пулов РНК в образцах с 96-луночных планшетов (например, в соответствии с описанием к набору реактивов ВЫеаку 96 кй фирмы 01адеп). После приготовления пула РНК каждую из 36 мРНК определяют количественно с помощью теста №А-МАР8: они включают транскрипты 30 коррелятивных генов и 6 «нормальных» генов («домашнего хозяйства»). К каждой лунке добавляют 36 олигонуклеотидных защитных ДНК-фрагментов, каждый из которых соответствует одному или нескольким анализируемым генам, и оставляют гибридизоваться в выбранных условиях жёсткости с соответствующими им последовательностями мРНК-мишеней. Затем нуклеазу 81 добавляли с целью разрушения избытка непрогибридизовавшей ДНК и образцы обрабатывали химически с целью такого же разрушения РНК. Остаток является олигонуклеотидным защитным фрагментом для каждого из 36 генов, который пропорционален количеству мРНК, которое присутствует в обработанных клетках каждого образца.

Сотню 96-луночных планшетов, каждый из которых несёт набор из 36 различных якорных олигонуклеотидов в каждой лунке, готовили добавлением в каждую лунку 36 различных линкерных олигонуклеотидов. Эти линкеры «самособираются» на поверхности каждой лунки, конвертируя тем самым «родственные» планшеты в МАР8-планшеты, включающие зонды, специфичные в отношении каждого из 36 олигонуклеотидных защитных фрагментов. Каждый линкер включает часть, специфичную в отношении одного из 36 якорей, и часть, специфичную в отношении сегмента одного из 36 защитных олигонуклеотидов. Образец олигонуклеотидов из каждой лунки из 100 планшетов с образцами добавляют к соответствующей лунке 100 МАР8-планшетов. После гибридизации в выбранных условиях уровня жёсткости детекторный олигонуклеотид для каждой мишени с присоединённым хемолюминесцирующим ферментом добавляют таким образом, что каждая специфичная точка каждой лунки светится пропорционально тому, сколько мРНК присутствует в данном образце. Представляют интерес любые лунки, которые проявляют сниженные количества коррелятивных генов без отсутствия эффекта в отношении 6 генов «домашнего хозяйства». Соединения, которые были добавлены к клеткам данных образцов, являются вероятными начальными «точками» для разработки противоопухолевых лекарств.

Пример 17. Индуцибельная и конститутивная экспрессия генов.

РНК готовили по сути так же, как это описано в примере 1 4, на материале печени мышей, либо не инфицировавшихся («контроль»), либо через 1 ч после инъекции («инфицированные») аденовирусом. В каждом образце использовали по 60 мкг печёночной РНК и эти образцы готовили в двух повторностях. Каждая тест-лунка включала по три набора дуплицированных сайтов, соответствующих описанным выше трём генам. Каждый сайт включал якорь, связанный с линкером, включающим зонд, который был комплементарен защитному фрагменту, соответствующему одному из этих трёх генов. МАР8-тест с защитой от нуклеазы осуществляли существенно так же, как это показано на фиг. 1 2, и изображения получали и сканировали в соответствии с описанным. Показаны параметры необработанных изображений и данные сканирования интенсивности для дупликатных лунок для каждой из трёх мРНК-мишеней. Номера над линиями сканирования соответствуют интегральным значениям интенсивности и стандартным отклонениям для каждого условия (п=4). Как ожидается, изменения не затрагивают ген «домашнего хозяйства», коим является ген САРОН, для которого установлено 1,3-кратное увеличение в инфицированном образце, что не является статистически достоверным. Транскрипция генов М1Р-2 и с_)ип усиливалась в 4 и 6 раз, соответственно. Эти данные указывают на то, что эти два гена, а именно М1Р-2 и сщп, проявляют усиленную экспрессию в ответ на аденовирусную инфекцию по сравнению с контролем, которым является экспрессируемый по конститутивному типу ген САРЭН.

Пример 18. Ферментный скрининг-тест для соединений, которые избирательно подавляют тирозиновые или сериновые киназы (см. фиг. 17).

Киназами являются ферменты, которые катализируют присоединение фосфатных групп к белкам. Для многих киназ была установлена стимуляция нормального и опухолевого роста клеток. Следовательно, соединения, которые бы подавляли активность отдельных киназ (но не всех киназ), могут быть использованы для тестирования того, вовлечены ли киназы в патогенез, а если это так, то служить исход

- 32 006425 ным материалом для создания новых лекарственных средств. Например, пять тирозинкиназ, которые участвуют в стимуляции роста клеток или в регуляции воспалительного ответа, - это киназы 5гс, 1ск, Гуп, Ζαρ70 и уе§. Для каждой из киназ характерны субстраты, которые отчасти уже идентифицированы как короткие пептиды, включающие тирозин. Некоторые из специфичностей этих киназ перекрываются, поэтому разные киназы могут фосфорилировать некоторые пептиды в равной степени, но другие - предпочтительно. Для этих пяти киназ 36 пептидных субстратов были выбраны так, чтобы продемонстрировать полный спектр их специфичных и перекрывающихся специфичностей.

Использовали сотню 96-луночных планшетов; каждая лунка на них включает 36 родственных олигонуклеотидных якорей. Готовят 36 линкеров с целью конверсии набора родственных олигонуклеотидов (только с якорями) в наборы, включающие пептидные субстраты. Эти 36 пептидных субстратов синтезировали и каждый из них присоединяли ковалентно по амидной связи, например, к олигонуклеотиду, несущему на 5'-конце амид. Эти олигонуклеотиды включают последовательности, которые гибридизуют с данными якорями специфическим образом. Пептид-олигонуклеотидные линкеры проявляют «самосборку» на поверхности после их внесения во все лунки МАР8-планшетов.

Для проведения скрининга эти пять киназ в подходящих концентрациях (так, чтобы скорость фосфорилирования субстратов оказывалась максимально возможной) добавляют в каждую лунку вместе с одним из 8800 тестируемых соединений. Эти соединения тестируют по их способности напрямую подавлять выделенные ферменты. Уровень фосфорилирования каждого пептида из тест-набора определяли путём добавления помеченных антител, которые связываются только с пептидами, которые были фосфорилированы по остаткам тирозина. Интерес представляют любые лунки, в которых имеет место снижение в некоторых, но не во всех фосфотирозиновых точках. Соединения, которые были добавлены в эти лунки, могут быть дополнительно протестированы в качестве потенциальных селективных ингибиторов некоторых из тестированных киназ.

Схема данного теста показана на верхней части фиг. 17. Химерную линкерную молекулу приготавливали так, чтобы в её составе 25 нуклеотидов, комплементарных одному из якорей, перекрёстно сшивались с пептидным субстратом тирозин-фосфокиназы. Химерный олигонуклеотид/пептидный субстрат проявлял «самосборку» на наборе олигонуклеотидных якорей, а киназы использовали для обеспечения фосфорилирования пептидной части данной химеры; после катализируемой этим ферментом реакции уровень фосфорилирования данного пептида определяют с помощью антифосфотирозиновых или антифосфосериновых антител, к которым присоединён детекторный флуорохром или фермент.

Полученные в этом тесте результаты показаны на нижней части фигуры. Бифункциональный кросслинкер Ό88 (Р1егсе) был использован для присоединения 5'-аминогруппы олигонуклеотидного линкера к Ν-концу пептида, синтезированного так, чтобы включать фосфорилируемый тирозин. Последовательность этого пептида путём записи в однобуквенной кодировке такова: ΤδΕΓΟρΥΟΓΟΕΝΕ (8Е0. ΙΌ N0 32), где ρΥ представляет фосфо-тирозин. Данную химеру либо использовали напрямую, либо сначала помечали на 1 ч в среду с рН=14 с целью частичного гидролиза фосфатной группы от остатка тирозина. Фосфорилированные или частично дефосфорилированные химерные молекулы проявляли «самосборку» на комплементарных якорных молекулах на поверхности МАР8-планшета в концентрациях, показанных в течение 1 ч. После промывки и блокирования лунок обработкой 0,3% бычьим сывороточным альбумином в буфере 88РТР добавляли антифосфотирозиновые антитела, сшитые с пероксидазой хрена (антитело 4С10 - υρ5ίаίе Вю1ес11по1оду. Баке Р1ас1й, ΝΥ), в разведении 1:3000 в буфере 88РТР на 1 ч, после чего количество присоединённого антитела определяли с применением хемолюминесцентного субстрата 8ирег 81дпа1 В1ахе. Показанное изображение получено на устройстве ССЭ при экспозиции 1 мин. Как и ожидалось, различия были выявлены в количестве фосфатов, присоединённых к олигонуклеотид/пептиду. Это различие является основанием для измерения того, насколько активна серия киназ тогда, когда производится обработка различными потенциальными ингибиторами.

Пример 1 9. Тест на связывание, предназначенный для детекции селективных ингибиторов взаимодействия между доменами 8Н2 и фосфорилированными пептидами.

Домены 8Н2 служат в качестве «субъединиц-доков» («присоединяющих компонентов») в составе некоторых белков-регуляторов роста (факторов роста). Эти домены связываются с белками или пептидами, включающими фосфорилированный тирозин, при широкой специфичности. Следовательно, некоторые фосфорилированные по тирозину пептиды специфически связываются с одним или несколькими 8Н2-включающими белками, в то время как другие связываются со многими такими белками.

Для данного теста линкерами являются фосфорилированные пептиды, ковалентно присоединённые к олигонуклеотидам. Пептидные составляющие выбирают по их способности связываться с группой отобранных 8Н2-белков. Эти линкеры превращают «родственные» МАР8-планшеты в планшеты, несущие лиганды, которые специфичны в отношении группы 8Н2-белков. Формируют сотню 96-луночных МАР8-планшетов, несущих такие лиганды. Белки выделяют и помечают, например, с использованием флуоресцентной молекулы Су5.

С целью проведения скрининга ингибиторов взаимодействия между 8Н2-доменом и фосфорилированным пептидом группу помеченных 8Н2-белков добавляют в каждую лунку сотни 96-луночных МАР8-планшетов, а также в каждую из лунок добавляют отличающееся тестируемое соединение. Следо

- 33 006425 вательно, при этом оценивается влияние каждого соединения на взаимодействие белков 8Н2 с их фосфопротеиновыми лигандами по отдельности. В этом тесте должна измеряться флуоресценция связанного 8Н2-белка, ассоциированного с каждым из находящихся на тест-поверхности пептидным линкером. В случае любой лунки, в которой выявляется снижение флуоресценции в некоторых, но не во всех точках, добавленное в них соединение может быть дополнительно протестировано в качестве потенциального селективного ингибитора «присоединяющей» функции домена 8Н2.

Пример 20. Высокопроизводительный скрининг (см. фиг. 22).

Изображён высокопроизводительный МЛР8-планшет, приспособленный для детекции сигнала в 96 лунках в ходе единственного эксперимента. Гибридизацию с одним и тем же олигонуклеотидом измеряли в 16 повторностях в 80 лунках. Как показано, уровень воспроизводимости результатов 1280 гибридизационных тестов был очень высоким. Крайние правая и левая колонки являются контрольными и использованы для стандартизации сигнала для различных концентраций данного олигонуклеотида.

Сходным образом 1 6 различных олигонуклеотидов могут быть протестированы в каждой лунке, и этот тест повторяли в 80 различных лунках данного планшета. Понятно, что даже большее количество различных олигонуклеотидов или иных по типу зондов (например, 100 нуклеотидных зондов) могут быть протестированы в каждой лунке и при этом множество таких планшетов может быть протестировано одновременно (например, 100 планшетов, таких как 96-луночные микротитровальные планшеты). Большое число тестов, которые могут быть осуществлены в отношении каждого образца (например, в последнем случае, примерно 1 00 разных тестов), и большое количество образцов, которое может быть протестировано одновременно (например, в последнем случае, примерно 9600 различных образцов, т.е. 96x100), обеспечивают очень высокий уровень производительности тестов.

Исходя из предыдущего описания специалисту в данной области техники будут очевидны базовые характеристики настоящего изобретения, а без какого-либо отклонения от его духа и буквы могут быть выполнены изменения и модификации настоящего изобретения, призванные адаптировать его к различных путям его использования и для различных условий этого.

Без дополнительных разработок можно считать, что специалист в данной области техники сможет на основании вышеприведённого описания реализовать настоящее изобретение в его наиболее полном объёме. Предшествующие конкретные предпочтительные варианты, следовательно, призваны играть исключительно иллюстративную роль и при этом ни в чём не ограничивают настоящую заявку в какой бы то ни было её части.

Полное содержание всех заявок, патентов и научных публикаций, цитировавшихся выше и на фигурах, включено в данный текст для сведения в виде библиографии.

Claims (32)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Система, применяемая для определения одной или нескольких мишеней в образце, которая перед внесением указанного образца содержит (а) поверхность, имеющую множественные пространственно разобщённые участки, по меньшей мере два из которых существенно идентичны друг другу, а каждый такой участок содержит (б) по меньшей мере восемь различных локусов олигонуклеотидных якорей, причем каждый из якорей связан с (в) бифункциональным линкером, содержащим первую часть, специфичную в отношении данного олигонуклеотидного якоря, и вторую часть, специфичную в отношении указанной(ых) мишени(ней), причем части указанного линкера могут быть связаны сшивающей молекулой и вторая часть указанного линкера (зонд) связывается с указанной(ыми) мишенью(нями).
2. 2. Система по п.1, в которой каждый участок содержит по меньшей мере 64 различных олигонуклеотидных якоря.
3. 3. Система по п.1, содержащая по меньшей мере приблизительно 96-1536 существенно идентичных друг другу участков.
4. 4. Система по п. 1, в которой каждый из указанных участков содержит приблизительно 30-100 линкеров, где вторые части линкеров отличаются одна от другой.
5. 5. Система по п.1, содержащая приблизительно 96 существенно идентичных друг другу участков, причем каждый участок содержит приблизительно 16, 36, 46 или 100 различных олигонуклеотидных якорей.
6. 6. Система по п.1, содержащая приблизительно 384 существенно идентичных друг другу участка, причем каждый участок содержит приблизительно 9, 16 или 25 различных олигонуклеотидных якорей.
7. 7. Система по п.1, содержащая приблизительно 1536 существенно идентичных друг другу участков, причем каждый участок содержит приблизительно от 4 до 9 различных олигонуклеотидных якорей.
8. 8. Система по п. 1, в которой указанные участки дополнительно подразделены на меньшие субучастки.
9. 9. Система по п.1, в которой указанные участки дополнительно содержат контроли для оценки эффективности или специфичности связывания второй части линкеров и указанной(ых) мишени(ней).

   - 34 006425
10. 10. Система по п.1, в которой указанные участки дополнительно содержат контроли для оценки способности бифункционального линкера в пределах участка связывать мишень для нормализации сигнала.
11. 11. Система по п.1, в которой зонд представляет собой нуклеиновую кислоту.
12. 12. Система по п. 1, в которой зонд представляет собой молекулу пептида или белка.
13. 13. Система по п.12, в которой молекула пептида или белка соединена с первой частью линкерной молекулы с помощью сшивающей молекулы.
14. 14. Система по п.13, в которой указанной сшивающей молекулой является биотин или стрептавидин.
15. 15. Система по п.1, в которой указанным зондом является субстрат для фермента или лиганд для рецептора.
16. 1 6. Система, применяемая для определения одной или нескольких мишеней в образце, которая перед внесением указанного образца содержит (а) поверхность, имеющую множественные пространственно разобщённые участки, по меньшей мере два из которых существенно идентичны друг другу, а каждый такой участок содержит (б) по меньшей мере восемь различных локусов якорей, причем каждый из якорей связан с (в) бифункциональным линкером, содержащим первую часть, специфичную в отношении данного якоря, и вторую часть, специфичную в отношении указанной(ых) мишени(ней), причем части указанного линкера могут быть связаны сшивающей молекулой и вторая часть указанного линкера (зонд) связывается с указанной(ыми) мишенью(нями).
17. 17. Способ определения по меньшей мере одной мишени в образце, предусматривающий (а) обеспечение взаимодействия образца, в котором может (могут) содержаться указанная(ые) мишень(мишени), с системой по п. 1 в условиях, обеспечивающих связывание указанной мишени с указанной системой;

    (б) обеспечение дополнительного взаимодействия указанной системы и любой из связанных мишеней с меченым детекторным зондом и (в) выявление сигнала указанного детекторного зонда, причем наличие сигнала свидетельствует о содержании мишени в образце.
18. 18. Способ по п. 17, согласно которому меченый детекторный зонд вырабатывает хемилюминесцентный сигнал.
19. 19. Способ по п.17, предназначенный для количественного анализа мишени.
20. 20. Способ по п.17, согласно которому указанный образец защищают от действия нуклеаз до осуществления стадии а).
21. 21. Способ по п.17, согласно которому указанной мишенью является защитный фрагмент, представляющий собой полинуклеотид, специфичный по отношению к части определяемой нуклеиновой кислоты.
22. 22. Способ по п.17, согласно которому указанная система содержит по меньшей мере 96 существенно идентичных участков.
23. 23. Способ по п.17, дополнительно предусматривающий удаление бифункциональных линкеров, связанных с олигонуклеотидными якорями, и замену их новыми существенно идентичными или отличающимися бифункциональными линкерами, что служит для перепрограммирования указанных поверхностей с последующим повторением указанного способа определения мишени.
24. 24. Способ определения по меньшей мере одной мишени в образце, предусматривающий (а) инкубацию образца, в котором может(могут) содержаться указанная(ые) мишень(мишени), с одним или несколькими защитными фрагментами в условиях, обеспечивающих гибридизацию указанного(ых) защитного(ых) фрагмента(ов) с интересующей(ими) РНК-мишенями;

    (б) обработку указанного образца одной или несколькими нуклеазами, эффективно расщепляющими по существу все нуклеиновые кислоты помимо защитного(ых) фрагмента(ов), гибридизованного(ых) с интересующей(ими) РНК, и необязательно часть(и) указанной(ых) гибридизованной(ых) РНК;

    (в) удаление по существу всех нуклеиновых кислот помимо указанных защитных фрагментов, гибридизованных с указанной(ыми) интересующей(ими) РНК с целью получения образца, содержащего в качестве мишени(ней) защитный(ые) фрагмент(ы);

    (г) обеспечение взаимодействия образца, в котором может(могут) содержаться указанная(ые) мишень(и), с системой по п. 1 в условиях, обеспечивающих связывание указанной мишени с указанной системой;

    (д) обеспечение дополнительного взаимодействия указанной системы и любой из связанных мишеней с меченым детекторным зондом и (е) выявление сигнала указанного детекторного зонда, причем наличие сигнала свидетельствует о содержании мишени в образце.
25. 25. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий удаление бифункциональных линкеров, связанных с олигонуклеотидными якорями и замену их новыми существенно идентичными или отличающимися бифункциональными линкерами, что служит для перепрограммирования указанных поверх

    - 35 006425 ностей с последующим повторением указанного способа определения мишени.
26. 26. Способ определения параметров экспрессии РНК в образце, предусматривающий (а) обеспечение взаимодействия образца, в котором может (могут) содержаться указанная(ые) РНКмишень(и), с системой по п.1, причем указанными мишенями являются по меньшей мере две молекулы РНК и причем инкубацию указанного образца с указанной системой осуществляют в условиях, обеспечивающих специфичную гибридизацию указанных РНК-мишеней с зондами бифункциональных линкеров;

    (б) обеспечение дополнительного взаимодействия указанной системы и любой из связанных мишеней с меченым детекторным зондом, специфичным по отношению к указанным мишеням, причем каждый из зондов системы по п.1 является олигонуклеотидом, специфичным в отношении по меньшей мере одной из указанных РНК-мишеней;

    (в) выявление сигнала указанного детекторного зонда и (г) оценку параметров экспрессии РНК на основании результатов выявления сигнала детекторного зонда.
27. 27. Применение способа по п.26 для идентификации агента, модулирующего параметры экспрессии РНК, дополнительно предусматривающий сравнение параметров экспрессии РНК, проявляемых в присутствии указанного агента, с параметрами экспрессии РНК, проявляемыми в отличных условиях.
28. 28. Способ определения по меньшей мере одной РНК-мишени в образце, предусматривающий

    а) инкубирование образца РНК с одним или несколькими защитными фрагментами в условиях, обеспечивающих гибридизацию указанных защитных фрагментов с РНК;

    б) обработку указанного образца одной или несколькими нуклеазами, эффективно расщепляющими по существу все негибридизовавшиеся нуклеиновые кислоты, с получением образца, содержащего комплекс «РНК-защитный фрагмент»;

    в) обработку образца, полученного на стадии б), одной или несколькими РНК-нуклеазами, эффективно расщепляющими по существу все РНК, с получением образца, содержащего в качестве мишени защитный фрагмент;

    г) обеспечение взаимодействия указанного защитного фрагмента с системой по п.1 в условиях, обеспечивающих связывание указанного защитного фрагмента с указанной системой;

    д) обеспечение дополнительного взаимодействия указанной системы и любых связанных мишеней с меченым детекторным зондом, специфичным по отношению к указанным мишеням и

    е) выявление сигнала указанного детекторного зонда, причем наличие сигнала свидетельствует о содержании мишени в образце.
29. 29. Способ быстрого тестирования большого количества образцов, предусматривающий помещение каждого образца в отдельный участок системы по п. 1 и выявление представляющих интерес мишеней в образцах.
30. 30. Способ определения по меньшей мере одной мишени в образце, предусматривающий (а) обеспечение взаимодействия образца, который может содержать указанную(ые) мишень(и), с бифункциональным линкером, который содержит первую часть, специфичную в отношении олигонуклеотидного якоря, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении указанной(ых) мишени(ней), в условиях, обеспечивающих получение первого продукта гибридизации между указанной(ыми) мишенью(ями) и указанным линкером;

    (б) обеспечение взаимодействия указанного первого продукта гибридизации с системой по п. 1 в условиях, обеспечивающих получение второго продукта гибридизации между первым продуктом гибридизации и указанной системой;

    (в) обеспечение дополнительного взаимодействия второго продукта гибридизации с меченым детекторным зондом, специфичным по отношению к указанному второму продукту гибридизации; и (г) выявление сигнала указанного детекторного зонда, причем наличие сигнала свидетельствует о содержании мишени в образце.
31. 31. Способ определения по меньшей мере одной мишени в образце, предусматривающий (а) обеспечение взаимодействия образца, который может содержать указанную(ые) мишень(и), с бифункциональным линкером, который содержит первую часть, специфичную в отношении олигонуклеотидного якоря, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении указанной(ых) мишени (ней), в условиях, обеспечивающих получение первого продукта гибридизации между указанной(ыми) мишенью(ями) и указанным линкером;

    (б) обеспечение дополнительного взаимодействия указанного первого продукта гибридизации с меченым детекторным зондом, специфичным по отношению к указанной мишени, с получением второго продукта гибридизации указанного детекторного зонда и указанного первого продукта гибридизации; и (в) взаимодействие комплекса второго продукта гибридизации с системой по п. 1 в условиях, обеспечивающих получение третьего продукта гибридизации между указанным вторым гибридизационным комплексом и указанной системой посредством входящих в ее состав якорей;

    (г) выявление сигнала указанного детекторного зонда, причем наличие сигнала свидетельствует о содержании мишени в образце.

    - 36 006425
32. 32. Набор, применимый для детекции по меньшей мере одной мишени в образце, содержащий (а) поверхность, имеющую множественные пространственно разобщённые участки, по меньшей мере два из которых существенно идентичны друг другу, а каждый участок содержит по меньшей мере восемь различных локусов олигонуклеотидных якорей;

    (б) комплект инструкций, описывающих присоединение олигонуклеотидных якорей по меньшей мере в одном из указанных локусов к бифункциональной линкерной молекуле, которая содержит первую часть, специфичную в отношении по меньшей мере одного из указанных олигонуклеотидных якорей, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении по меньшей мере одной из указанных мишеней; и (в) контейнер, содержащий по меньшей мере одну бифункциональную линкерную молекулу, которая содержит первую часть, специфичную в отношении олигонуклеотидного(ых) якоря(ей) по меньшей мере в одном из указанных локусов, и вторую часть в виде зонда, специфичного в отношении по меньшей мере одной из указанных мишеней.