WO2019069372A1

WO2019069372A1 - 検出対象の測定方法、捕捉プローブ固定化担体、検出キット、及び流体デバイス

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Publication number: WO2019069372A1
Application number: PCT/JP2017/036003
Authority: WO
Inventors: 久皇鈴木; 太郎上野
Original assignee: 株式会社ニコン
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2017-10-03
Publication date: 2019-04-11

Abstract

検体中の複数の検出対象を効率的に測定する、検出対象の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質、該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意し、前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検体中に含まれる検出対象毎に、前記固相担体と前記検出対象とからなる第１複合体を生成させ、前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体上において、該捕捉プローブ固定化担体と前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させ、前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記第３複合体の標識化物質の標識を検出することを特徴とする。

Description

検出対象の測定方法、捕捉プローブ固定化担体、検出キット、及び流体デバイス

　本発明は、検出対象の測定方法、捕捉プローブ固定化担体、検出キット及び流体デバイスに関する。

　臨床診断においては、全血、血清、血漿、尿等の生体試料を用いて、生体試料中の検出対象の測定が行われている。生体試料中の検出対象の測定において、生体試料中に複数の検出対象が含まれている場合、各々の検出対象に応じた測定を行わなければならない。

　例えば、磁性粒子を用いた生体試料中の検出対象の測定の場合、磁性粒子に固定化された検出対象に特異的に結合する抗体に、生体試料中の検出対象を結合させ、磁性粒子上に捕捉された検出対象を、酵素等を用いて測定することができるが、この場合、検出対象が結合した磁性粒子を、磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行わなければならない。このとき、生体試料中に複数の検出対象がある場合は、それぞれの検出対象に特異的に結合する抗体を固定化した磁性粒子に、各検出対象を結合させたとしても、各々の検出対象が結合した磁性粒子は、全て磁石に引き寄せられるため、各々の検出対象を測定するには、予め各々の検出対象を分離した後に、各々の測定系を用いて測定しなければならず、複数の検出対象を同時に測定することはできない。

　このように、臨床診断においては、生体試料中に測定すべき検出対象が複数含まれる場合に、別々の測定系を用いて測定を行わなければならず、時間とコストがかかるという問題がある。生体試料中に検出対象が複数含まれている場合に、複数の検出対象を効率よく測定する方法が求められている。

特許文献１には、試料中に存在する二種以上の免疫反応体を、磁性粒子に固定された二種以上の相補的免疫反応体と容器内で液体媒体中において反応させ、免疫反応体毎に異なる標識を用いて順次各免疫反応体を検定する多項目検定方法が開示されている。しかしながら、この方法では、免疫反応体毎に異なる標識を用いなければならず、測定できる検出対象項目に限界がある。
非特許文献１には、試料中に存在するＤＮＡとハイブリダイズするプローブを複数固定化した磁性粒子を用いて、１個の磁性粒子に複数のＤＮＡを結合させる方法が開示されているが、この方法でも、複数のＤＮＡ毎に異なる標識を用いて測定しなければならず、測定できる検出対象項目に限界がある。

特開２０００－３４６８４３号公報

Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　２２（２００７）２０１０－２０１７

　本発明者らは、検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意し、前記検体と前記固相担体とを接触させて、前記検体中に含まれる検出対象毎に、前記固相担体と前記検出対象とを含む第1複合体を生成させ、前記タグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体と、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を接触させ、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第1複合体と前記標識化物質とを含む複合体を生成させ、前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記標識化物質の標識を検出することにより、検体中に含まれる複数の検出対象を同時に測定できることを見出し、本発明を完成させた。本発明の一実施態様は、下記（１）～（４）を提供するものである。

（１）本発明の一実施態様における検出対象の測定方法は、
（ａ）検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意する工程と、
（ｂ）前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検体中に含まれる測検出対象成分毎に、前記固相担体と前記検出対象とを含む第１複合体を、生成させる工程と、
（ｃ）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体と、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を接触させ、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を、生成させる工程と、
（ｄ）前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記第３複合体の標識化物質の標識を検出することにより検出対象を測定する工程と、
を含む。

（２）本発明の一実施態様における捕捉プローブ固定化担体は、
上記（１）の測定方法に用いる、２種以上の捕捉プローブが異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体である。

（３）本発明の一実施態様における検体中の検出対象の測定用キットは、
２種類以上の、検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質と検出対象毎に異なるタグとが結合した固相担体と、２種類以上の、前記固相担体上のタグに特異的に結合する捕捉プローブが、種類毎に異なる位置に配置されている、捕捉プローブ固定化担体と、２種類以上の、検体中の検出対象と特異的に結合する標識化物質と、を含む。

（４）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
検出対象を含む検体を導入する検体導入部と、
前記検出対象と特異的に結合する検出対象物質及び該検出対象毎に異なるタグが固定化された固相担体を導入する固相担体導入部と、
前記検体導入部及び前記固相担体導入部が接続する反応部と、
前記検出対象に特異的に結合する標識化物質を導入する標識化物質導入部と、
前記固相担体に固定化されたタグに特異的に結合する捕捉プローブが検出対象毎に異なる位置に固定化された検出部と、
を備える。

本実施形態の第1実施形態における、検出対象の測定方法の模式図である。本実施形態の第２実施形態における、検出対象の測定方法の模式図である。本実施形態における、検出対象の測定方法に用いる、固相担体と捕捉プローブ固定化担体の模式図である。本実施形態の第1実施形態における、流体デバイスの模式図である。本実施形態の第２実施形態における、流体デバイスの模式図である。実施例における、タグＤＮＡと抗体を固定化した固相担体に、抗体を介して結合した検出対象を標識化抗体で標識して検出した結果である。実施例における、異なる捕捉プローブＤＮＡ固定化担体を用い、タグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体が固定化されている固相担体を用いて、標識である蛍光強度を測定した結果である。実施例における、異なる捕捉プローブＤＮＡ固定化担体を用い、タグＤＮＡ１５０３と抗トロポニン抗体とが固定化されている固相担体を用いて、標識であるＡＬＰ活性を測定した結果である。実施例における、捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化担体を用い、タグＤＮＡ１５０３と抗トロポニン抗体とが固定化されている固相担体を用いて、標識であるＡＬＰ活性を測定した結果である。実施例における、捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化担体を用い、タグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体とが固定化されている固相担体を用いて、標識であるＡＬＰ活性を測定した結果である。

≪検出対象の測定方法≫
［第１実施形態］
　本発明の一実施態様における検出対象の測定方法は、
（ａ）検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意する工程と、
（ｂ）前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検体中に含まれる測検出対象成分毎に、前記固相担体と前記検出対象とを含む第１複合体を、生成させる工程と、
（ｃ）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体と、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を接触させ、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を、生成させる工程と、
（ｄ）前記捕捉プローブ固定化担体に結合している第３複合体の前記標識化物質の標識を検出することにより検出対象を測定する工程と、
を含む。

　本実施形態において、前記工程（ｃ）は、
（ｃ１）前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させ、前記固相担体と前記検出対象と前記標識化物質とを含む第２複合体を、前記検出対象毎に生成させる工程と、
（ｃ２）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第２複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに、特異的に結合させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を、生成させる工程と、
を含む。

即ち、本実施形態の検出対象の測定方法は、
（ａ）検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象と特異的に結合する標識化物質を用意する工程と、
（ｂ）前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検体中に含まれる検出対象毎に、前記固相担体と前記検出対象とを含む第１複合体を、生成させる工程と、
（ｃ１）前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させ、前記固相担体と前記検出対象と前記標識化物質とを含む第２複合体を、前記検出対象毎に生成させる工程と、
（ｃ２）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第２複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに特異的に結合させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させる工程と、
（ｄ）前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記第３複合体の標識化物質の標識を検出することにより検出対象を測定する工程と、
を含む。

工程（ａ）は、検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質、該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意する工程である。
検出対象とは、本発明の方法で検出および／または測定の対象とする成分（物質）である。検体としては、全血（血液）、血球、血清、血漿、髄液、尿、組織、培養細胞等が挙げられる。
　検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質としては、検出対象が各種疾患マーカータンパク質やホルモン、インターロイキン類等のポリペプチドである場合は、抗体、アプタマー等が挙げられる。
　検出対象であるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、該ポリペプチドをマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ダチョウ等の動物に免疫することにより、公知の抗体の製造方法に従って得ることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体断片等が例示される。抗体断片としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)₂、ペプシン処理－還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が例示される。
検出対象であるポリペプチドに特異的に結合するアプタマーは、公知のアプタマーの製造方法に従って製造することができる。

　検出対象が細菌やウイルスである場合は、検出対象結合物質としては、細菌表面やウイルス表面に存在する抗原に特異的に結合する抗体やアプタマー等が挙げられる。細菌表面やウイルス表面に存在する抗原に特異的に結合する抗体は、細菌表面やウイルス表面に存在する抗原をマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ダチョウ等の動物に免疫することにより、公知の抗体の製造方法に従って得ることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体断片等が例示される。抗体断片としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)₂、ペプシン処理－還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が例示される。
細菌表面やウイルス表面に存在する抗原に特異的に結合するアプタマーは、公知のアプタマーの製造方法に従って製造することができる。

　検出対象が細胞外小胞体である場合は、検出対象結合物質としては、細胞外小胞体の膜表面に存在する抗原に特異的に結合する抗体やアプタマー等が挙げられる。細胞外小胞体の膜表面に存在する抗原に特異的に結合する抗体は、細胞外小胞体の膜表面に存在する抗原をマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ダチョウ等の動物に免疫することにより、公知の抗体の製造方法に従って得ることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体断片等が例示される。抗体断片としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)₂、ペプシン処理－還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が例示される。
細胞外小胞体の膜表面に存在する抗原に特異的に結合するアプタマーは、公知のアプタマーの製造方法に従って製造することができる。

検出対象がｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ、ＲＮＡ断片等のＲＮＡである場合は、検出対象結合物質としては、該ＲＮＡの配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有する合成ＤＮＡプローブ、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ等の核酸プローブ等が挙げられる。ＲＮＡの配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有する核酸プローブは、公知の核酸の合成方法に従って製造することができる。

検出対象がｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅＤＮＡ、ＤＮＡ断片等のＤＮＡである場合は、検出対象結合物質としては、該ＤＮＡの配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有する合成ＤＮＡプローブ、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ等の核酸プローブ等が挙げられる。ＤＮＡの配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有する核酸プローブは、公知の核酸の合成方法に従って製造することができる。

　本実施形態に用いる固相担体としては、ポリペプチド、脂質二重膜、セルロース粒子等の有機化合物、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等が例示される。

　固相担体に固定化するタグとしては、該タグに特異的に結合する捕捉プローブがあれば、いかなるものでもよい。このようなタグと捕捉プローブの組み合わせとしては、例えば、タグとしてのポリペプチドと、捕捉プローブとしての該ポリペプチドに特異的に結合する抗体及びアプタマーの組み合わせや、タグとしてのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ等の核酸と、捕捉プローブとしての当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、タグとしての核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブの組み合わせ等が挙げられる。また、上記タグと捕捉プローブの組み合わせを逆にしたものであってもよく、例えば、タグとしてポリペプチドに特異的に結合する抗体又はアプタマーを用い、捕捉プローブとして該抗体又はアプタマーに特異的に結合するポリペプチドを用いることもできる。また、タグとして、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブを用い、捕捉プローブとして、これらのプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、タグとしてのＤＮＡプローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ等の核酸を用いることができる。

検出対象結合物質及びタグの固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法又はこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電学的方法、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば、共有結合、配位結合等が挙げられる。固相担体がスチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等で、その表面に官能基を保持している場合は、その官能基と検出対象結合物質及びタグの官能基とを共有結合により結合させることができる。このような官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、トシル基、シラノール基等が挙げられる。

　また、固相担体に検出対象結合分子及びタグを間接的に固定化してもよい。間接的に固定化する方法としては、例えば、アビジンとビオチンとの特異的結合を利用した固定化方法等が挙げられる。或いは、リンカーを介して、検出対象結合物質及びタグを固相担体に固定化してもよい。このようなリンカーとしては、検出対象結合物質又はタグと固相担体表面に保持している官能基の両者に共有結合できる分子等が挙げられる。

標識化物質は、検出対象と特異的に結合する物質が標識物質により標識化された物質である。該標識化物質における検出対象と特異的に結合する物質としては、検出対象に特異的に結合する抗体等、前記工程（ａ）で用いられる検出対象結合物質が挙げられるが、該標識化物質は、前記工程（ａ）で用いられる検出対象結合物質と異なる部位で検出対象と結合することが好ましい。

　前記標識物質としては、酵素、蛍光物質、金属錯体、コロイド状粒子ドット等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＰＥ（Phycoerythrin）、ＡＰＣ（Allophycocyanin）等の蛍光蛋白質、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、Ｃｙ３（cyanine 3）、Ｃｙ５（cyanine 5），ＴＭＲ（tetramethylrhodamine）等のフルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類蛍光色素分子等が挙げられる。金属錯体としては、フェロセン、ルテニウム等が挙げられる。

　前記標識物質と前記検出対象結合物質との結合は、前記検出対象結合物質と前記標識物質の官能基との間で、リンカーを介するか、又はリンカーを介さずに共有結合を生じる反応によって行うことができる。

以下、図１を参照しながら、検出対象が、測定対象成分A、測定対象成分B、測定対象成分C及び検出対象Dであって、検体中に検出対象Aと検出対象Bが含まれている場合の第１実施形態（以下、実施形態１－１と称する）について説明する。

工程（ａ）では、検体中に含まれる成分毎に、検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質、検出対象毎に異なるタグが固定化された固相担体、及び該検出対象と特異的に結合する標識化物質を用意する。検出対象が、検出対象A、検出対象B、検出対象C及び検出対象Dである場合は、工程（ａ）では、検出対象A結合物質とタグAとが固定化された固相担体A、検出対象B結合物質とタグBとが固定化された固相担体B、検出対象C結合物質とタグCとが固定化された固相担体C及び検出対象D結合物質とタグDとが固定化された固相担体Dをそれぞれ用意する。この場合、タグA、タグB、タグC及びタグDはそれぞれ異なるものを使用する［図１（ａ）］。

　工程（ｂ）は、前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検出中に含まれる検出対象毎に、前記固相担体と検出対象とを含む第１複合体を、生成させる工程である。前記固相担体は、タグ及び検出対象結合物質が固定化されているため、第１複合体は、タグ－固相担体－検出対象結合物質－検出対象の複合体である。
前記検体と前記固相担体とを接触させる方法としては、例えば、前記固相担体を溶媒中に懸濁させ、該溶媒中で前記検体と接触させる方法等が挙げられる。
前記溶媒は、水性溶媒であっても有機溶媒であってもよい。水性溶媒としては、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が例示される。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１～１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。有機溶媒としては、ホルムアルデヒド等が挙げられる。有機溶媒の濃度としては、前記固相担体を懸濁できれば特に限定はされない。１～１００％、好ましくは５０％～７０％である。

実施形態１－１においては、工程（ｂ）において、検体と固相担体A、固相担体B、固相担体C、及び固相担体Dを含む溶媒とを接触させる。この場合、検体には検出対象Aと検出対象Bのみ含まれているため、検出対象Aは固相担体Aに、検出対象Bは、固相担体Bにそれぞれ結合し、固相担体Aと検出対象Aとを含む第１複合体、固相担体Bと検出対象Bの第１複合体が生成する。検体には検出対象Cと検出対象Dは含まれていないため、検出対象Cと検出対象Dについては、第１複合体を生成せず、固相担体Cと固相担体Dは検出対象と結合しない状態で溶媒中に存在する［図１（ｂ）］。

　工程（ｃ）は、前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体と、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を接触させ、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させる工程である。
　前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体としては、例えば、検出対象毎に異なるタグが核酸である場合は、当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを固相担体に固定化したもの等が挙げられる。

該捕捉プローブ固定化担体に用いられる固相担体としては、ポリペプチド、脂質二重膜、セルロース粒子等の有機化合物、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等が例示される。捕捉プローブの固相担体への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法又はこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電学的方法、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば、共有結合、配位結合等が挙げられる。固相担体がスチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等で、その表面に官能基を保持している場合は、その官能基と捕捉プローブの官能基とを共有結合により結合させることができる。このような官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、トシル基、シラノール基等が挙げられる。

　前記捕捉プローブ固定化担体は、上記捕捉プローブ固定化担体に用いる固相担体の素材を基板状にしてもよく、例えば、基板表面にエポキシ基を保持するガラス基板、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材を表面にコートした基板等が挙げられる。

　工程（ｃ）において、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を含む第３複合体が生成する。第３複合体は、前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させて、固相担体と検出対象と標識化物質とを含む第２複合体を生成させた後に、前記捕捉プローブ固定担体と接触させることにより生成させても、前記第1複合体と前記捕捉プローブ固定化担体とを接触させて、前記捕捉プローブに第1複合体を結合させた後、標識化物質と接触させることにより生成させてもよい。

　本実施形態においては、前記工程（ｃ）は、
（ｃ１）前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させ、固相担体と検出対象と標識化物質とを含む第２複合体を、前記検出対象毎に生成させる工程と、
（ｃ２）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第２複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに、特異的に結合させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と標識化物質とを含む第３複合体を、生成させる工程と、
を含む。

　工程（ｃ１）において、前記第1複合体と前記標識化物質とを接触させると、前記第1複合体は、検出対象を含んでいるため、該検出対象に特異的に結合する標識化物質は、検出対象毎に、前記第1複合体に結合し、固相担体と検出対象物と標識化物質とを含む第２複合体が生成される。
　検体中に検出対象が含まれていないために、固相担体に結合できない標識化物質は、溶媒中にそのまま存在する。当該固相担体に結合していない標識化物質は、工程（ｃ２）の後に、除去することが好ましい。当該固相担体に結合していない標識化物質を除去する方法としては、公知のＢ／Ｆ分離の方法が挙げられる。例えば、固相担体が磁性粒子の場合は、磁力によって磁性粒子を集め、当該固相担体に結合していない標識化物質を洗浄により除去する方法等が挙げられる。その後、磁石を離すなどにより磁力の影響を低減し、標識化物質が結合した磁性粒子を液相中に解放することができる。

　実施形態１－１においては、工程（ｃ１）において、検出対象A、検出対象B、検出対象C、検出対象Dにそれぞれ特異的に結合する標識化物質A、標識化物質B、標識化物質C、標識化物質Dを接触させる。標識化物質Aは、検出対象Aと結合した第１複合体に結合し、固相担体Aと検出対象Aと標識化物質Aとを含む第２第２複合体を生成する。標識化物質Bは、検出対象Bと結合した第１複合体に結合し、固相担体Bと検出対象Bと標識化物質Bとを含む第２複合体を生成する。検出対象C及び検出対象Dは検体中に含まれないため、標識化物質Cと標識化物質Dは、固相担体に結合せずにそのまま溶媒中に存在する［図１（ｃ）］。

前記工程（ｃ２）は、前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第２複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに、特異的に結合させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と標識化物質とからなる第３複合体を、生成させる工程である。
　工程（ｃ２）において、前記捕捉プローブは、前記検出対象毎に異なるタグに対応しているため、各タグに対応する捕捉プローブは、検出対象毎に異なる。また、各捕捉プローブは、捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に固定化されているため、前記第1複合体と標識化物質とを含む第２複合体は、検出対象毎に、該捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に特異的に結合し、検出対象毎に、捕捉プローブと第１複合体と標識化物質とを含む第３複合体が、捕捉プローブ固定化担体上の異なる位置に生成する。

　工程（ｃ２）において、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第２複合体の接触は、前記第２複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液してもよい。前記第２複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に送液する場合は、前記第２複合体が、前記捕捉プローブ固体化担体に結合した後に、送液を停止する。

　工程（ｃ２）において、第２複合体は検出対象毎に捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に結合するため、捕捉プローブ固定化担体のどの位置から標識が測定できるかで、検出対象の種類を同定することができる。捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブの捕捉プローブ固定化担体上の固定化領域は、他の捕捉プローブの固定化領域と区切られていても、区切られてなくてもよいが、標識が酵素の場合は、後述の工程（ｄ）において、標識物質の検出の際に生成する基質が他の領域に入らないようにするため、捕捉プローブが結合している領域は、他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られていることが好ましい。捕捉プローブが固定化している領域を他の捕捉プローブが固定化している領域と区切る方法としては、各領域にバルブを設けて、各領域を他の領域と区切ることが例示される。

例えば、工程（ｃ２）において、固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている、各タグに対応する捕捉プローブと特異的に結合させた後に、捕捉プローブが固定化された領域間に設けられたバルブを閉めることにより、他の前記捕捉プローブが固定化された領域と区切ることができる。これにより、後述の工程（ｄ）において、標識物質が酵素の場合であっても、検出対象に対応する捕捉プローブ固定化領域にのみ標識化物質を添加して、基質から生ずる生成物を測定することができ、当該検出対象の有無や、その存在量を測定することができる。後述の工程（ｄ）において、標識が標識化物質から遊離しない場合は、工程（ｃ２）において、検出対象に対応する捕捉プローブ固定化領域を他の捕捉プローブ固定化領域と区切らなくてもよい。

実施形態１－１においては、前記タグAに特異的に結合する捕捉プローブAと、前記タグBに特異的に結合する捕捉プローブBと、がそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、固相担体A－検出対象A－標識化物質Aからなる第２複合体Aと、固相担体B－検出対象B－標識化物質Bからなる第２複合体Bを接触させ、第２複合体Aを捕捉プローブAに結合させ、第２複合体Bを捕捉プローブBに結合させる。この結果、第２複合体Aと第２複合体Bが、捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に特異的に結合する。すなわち捕捉プローブAとタグA－固相担体A－検出対象A結合物質－検出対象A－標識化物質Aからなる第３複合体A、および、捕捉プローブB―タグB－固相担体B－検出対象B結合物質－検出対象B－標識化物質Bからなる第３複合体Bが、捕捉プローブ固定化担体上に形成される。
　なお、捕捉プローブ固定化担体は、前記タグCに特異的に結合する捕捉プローブCと、前記タグDに特異的に結合する捕捉プローブDと、が、さらに、それぞれ異なる位置に固定化されていてもよい。この場合、検出対象C及び検出対象Dは検体中に含まれないため、捕捉プロ―ブCおよび捕捉プローブDにはそれぞれ標識化されていない固相担体Cおよび捕捉プローブDが結合する。［図１（ｄ）］

　工程（ｄ）は、前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記第３複合体の標識化物質の標識を検出する工程である。この工程により、検出対象の存在および量を検出することができる。
　標識化物質の標識の測定は、各標識化物質の標識の測定に応じて適切な方法を選択することができる。標識物質が発色物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いて標識を測定することができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることにより測定することができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて測定することができる。

標識物質が酵素である場合、標識は、酵素活性を測定することにより測定することができる。具体的には、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質の吸光度等を測定することにより、標識を測定することができる。

　標識物質が酵素である場合は、工程（ｄ）において、酵素反応の際に生成する基質が他の領域に入らないようにするため、前記工程（ｃ２）において、捕捉プローブが固定化している領域は、他の捕捉プローブが結合している領域と区切られていることが好ましい。例えば、前記工程（ｃ２）において、固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている、各タグに対応する捕捉プローブと特異的に結合させた後に、捕捉プローブが固定化された領域間に設けられたバルブを閉めることにより、他の前記捕捉プローブが固定化された領域と区切った後、工程（ｄ）において、検出対象に対応する捕捉プローブ固定化領域に酵素の基質を添加し、基質から生ずる生成物を測定することにより、当該検出対象の有無や、その存在量を測定することができる。標識が標識化物質から遊離しない場合は、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブ固定化領域を他の領域と区切ることなく標識を測定することができる。

　実施形態１－１においては、捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に特異的に結合した第３複合体Aと第３複合体Bを、各標識に応じた標識の測定方法により標識を測定する。第３複合体Aのみを検出したい場合は、第３複合体Aが結合した領域を、他の領域と前記バルブ等により区切り、第３複合体Aの標識に応じた標識測定方法を実施することにより、第３複合体Aの有無や量を測定することができる。
なお、この場合、標識化物質Cについて、捕捉プローブCが存在する領域において、標識に応じた標識の測定方法によっても、標識が検出されないことにより、測定対象物質Cが検体中に不存在であることが確認できる。測定対象物質Dについても、同様に、検体中に不存在であることが確認できる。

［第２実施形態］
　本実施形態の検出対象の測定方法は、前記工程（ｃ）が、
（ｃ３）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第１複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに、特異的に結合させる工程と、
（ｃ４）前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置にそれぞれ結合した第１複合体と、各検出対象に対応する標識化物質と、を接触させ、前記捕捉プローブ固定化担体上に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と標識化物質とを含む第３複合体をそれぞれ結合させる工程と、
を含む。

　工程（ｃ３）において、前記捕捉プローブは、前記検出対象毎に異なるタグに対応しているため、各タグに対応する捕捉プローブは、検出対象毎に異なる。また、各捕捉プローブは、捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に固定化されているため、前記第１複合体は、検出対象毎に、該捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に特異的に結合する。

　工程（ｃ３）において、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第１複合体の接触は、前記第１複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液してもよい。前記第１複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に送液する場合は、前記第１複合体が、前記捕捉プローブ固体化担体に結合した後に、送液を停止する。

　本実施形態において、工程（ｃ３）の後に、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分をＢ／Ｆ分離により除去する工程を含んでいてもよい。Ｂ／Ｆ分離としては、公知のＢ／Ｆ分離の方法が挙げられる。例えば、固相担体が磁性粒子の場合は、磁力によって磁性粒子を集め、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分を除去する方法等が挙げられる。

　工程（ｃ４）は、前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置にそれぞれ結合した、第１複合体と、各検出対象に対応する標識化物質と、を接触させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブ固定化担体上に、前記捕捉プローブと前記第1複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させる工程である。
　工程（ｃ４）において、各検出対象に対応する標識化物質は、各検出対象と特異的に結合するため、検出対象毎に、前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置にそれぞれ結合している前記第１複合体中の検出対象と特異的に結合する。前記捕捉プローブ固定化担体に結合している第１複合体は、前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に結合しているため、前記標識化物質は、検出対象毎に、前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に特異的に結合し、検出対象毎に、捕捉プローブと第１複合体とを含む第３複合体が、捕捉プローブ固定化担体上の異なる位置に形成される。標識化物質は、検出対象毎に異なっているため、測定対象とする検出対象に応じた標識化物質を前記捕捉プローブ固定化担体に接触させることにより、目的とする検出対象のみを検出、或いはその量を測定することができる。

前記工程（ｃ４）において、標識化物質は、検出対象毎に捕捉プローブ固定化担体の異なる位置に結合した第１複合体に結合するため、前記工程（ｄ）において、捕捉プローブ固定化担体のどの位置から標識が測定できるかで、検出対象の種類を同定することができる。捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブの捕捉プローブ固定化担体上の固定化領域は、他の捕捉プローブの固定化領域と区切られていても、区切られてなくてもよいが、標識が酵素の場合は、前記工程（ｄ）において、標識物質の検出の際に生成する基質が他の領域に入らないようにするため、捕捉プローブが結合している領域は、他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られていることが好ましい。捕捉プローブが固定化している領域を他の捕捉プローブが固定化している領域と区切る方法としては、各領域にバルブを設けて、各領域を他の領域と区切ることが例示される。
例えば、工程（ｃ４）において、前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置にそれぞれ結合した第1複合体と、各検出対象に結合する標識化物質とを接触させた後に、捕捉プローブが固定化された領域間に設けられたバルブを閉めることにより、他の前記捕捉プローブが固定化された領域と区切ることができる。これにより、前記工程（ｄ）において、標識物質が酵素の場合であっても、検出対象に対応する捕捉プローブ固定化領域にのみ標識化物質を添加して、基質から生ずる生成物を測定することができ、当該検出対象の有無や、その存在量を測定することができる。前記工程（ｄ）において、標識が標識化物質から遊離しない場合は、工程（ｃ４）において、検出対象に対応する捕捉プローブ固定化領域を他の捕捉プローブ固定化領域と区切らなくてもよい。

　本実施形態において、検体中に検出対象が含まれていないために、固相担体に結合できない標識化物質は、溶媒中に存在する。当該固相担体に結合していない標識化物質は、除去することが好ましい。固相担体に結合していない標識化物質を除去する方法としては、公知のＢ／Ｆ分離の方法が挙げられる。例えば、固相担体が磁性粒子の場合は、磁力によって磁性粒子を集め、固相担体に結合していない標識化物質を洗浄により除去する方法等が挙げられる。その後、磁石を離すなどにより磁力の影響を低減し、標識化物質が結合した磁性粒子を液相中に解放する。

以下、図２を参照しながら、検出対象が、検出対象A、検出対象B、検出対象C、検出対象D及び検出対象Eであって、検体中に検出対象Cが含まれている場合の第２実施形態（以下、実施形態２－１と称する）について説明する。

実施形態２－１の場合、工程（ｃ３）において、捕捉プローブ固定化担体上にタグAが特異的に結合する捕捉プローブA、タグBが特異的に結合する捕捉プローブB、タグCが特異的に結合する捕捉プローブC、タグDが特異的に結合する捕捉プローブD、タグEが特異的に結合する捕捉プローブEがそれぞれ異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体に、工程（ｂ）で得られた固相担体Aと検出対象Aとを含む第１複合体A、固相担体Bと検出対象Bとを含む第１複合体B、固相担体Cと検出対象Cとを含む第１複合体C、固相担体Dと検出対象Dとを含む第１複合体D、固相担体Eと検出対象Eとを含む第１複合体Eを接触させる。検体には検出対象A、検出対象B、検出対象D及び検出対象Eは含まれていないため、固相担体A、固相担体B、固相担体Dと固相担体Eは検出対象と結合しない状態で捕捉プローブ固定化担体に結合する［図２（ａ）］。

固相担体Aに固定化されているタグAは、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブAが結合している位置に結合し、固相担体Bに固定化されているタグBは、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブBが結合している位置に結合し、固相担体Cに固定化されているタグCは、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブCが結合している位置に結合し、固相担体Dに固定化されているタグDは、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブDが結合している位置に結合し、固相担体Eに固定化されているタグEは、捕捉プローブ固定化担体上の捕捉プローブEが結合している位置に結合する［図２（ｂ）］。

　第１複合体A、第１複合体B、第１複合体C、第１複合体D及び第１複合体Eが、捕捉プローブ固定化担体上のそれぞれ異なる位置に結合している捕捉プローブ固定化担体に、各測定対象に対応する標識化物質を添加する。第１複合体A、第１複合体B、第１複合体C、第１複合体D及び第１複合体Eのうち、第1複合体Cのみに、検出対象Cが結合しているため、検出対象Cに特異的に結合する標識化物質Cのみが、第1複合体Cに結合する。標識化物質が酵素であって、酵素反応の結果、基質が遊離する場合は、標識化物質を接触させた後に、各捕捉プローブ固定化担体の領域を、他の捕捉プローブ固定化担体の領域と区切ることが好ましい［図３（ｃ）］。

　次に、各標識物質の標識に応じた検出方法により、標識物質の検出を行う。実施形態２－１においては、標識化物質Cのみが、捕捉プローブCが固定化されている捕捉プローブ固定化担体上の第1複合体Cに結合するため、捕捉プローブCが固定化されている領域のみに標識が検出される［図３（ｄ）］。

≪捕捉プローブ固定化担体≫
　本実施形態の捕捉プローブ固定化担体１００は、上述の検体中の検出対象の測定方法に用いる、２種類以上の捕捉プローブが異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体である。
　以下、図４を参照しながら、本実施形態の捕捉プローブ固定化担体について具体的に説明する。

本実施形態の２種類以上の捕捉プローブ６が異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体１００としては、検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体である。例えば、検出対象毎に異なるタグが核酸である場合は、当該核酸と相補的配列を有する核酸プローブを固相担体に固定化する。該捕捉プローブ固定化担体に用いる固相担体７としては、ポリペプチド、脂質二重膜、セルロース粒子等の有機化合物、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等が例示される。検出対象結合物質及びタグの固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法又はこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電学的方法、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば、共有結合、配位結合等が挙げられる。固相担体がスチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材、ガラス、金属薄膜、磁性粒子、金コロイド、ラテックス粒子等で、その表面に官能基を保持している場合は、その官能基と捕捉プローブの官能基とを共有結合により結合させることができる。このような官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、トシル基、シラノール基等が挙げられる。
　前記捕捉プローブ固定化担体に用いる固相担体７は、上記捕捉プローブ固定化担体に用いる固相担体７の素材を基板状にしてもよく、例えば、基板表面にエポキシ基を保持するガラス基板、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等の高分子素材を表面にコートした基板等が挙げられる。

　捕捉プローブ６は、該捕捉プローブ６が特異的に結合するタグ３が固定化されている固相担体２と結合する。固相担体２には、検出対象結合物質１が固定化されているため、検出対象４は該検出対象結合物質１に結合し、標識化物質５は検出対象４に結合する。捕捉プローブ６が結合する固相担体２に固定化されているタグ３は、検出対象毎に異なっているため、捕捉プローブ固定化担体１００上の目的の検出対象の捕捉プローブ６が固定化されている位置の標識化物質５の標識を測定することにより、目的の検出対象のみを測定することが可能となる。

　本実施形態の捕捉プローブ固定化担体１００において、標識化物質の標識を測定する際に、標識化物質に用いる標識として酵素を用いる場合は、酵素反応の際に生成する基質が、捕捉プローブ固定化担体１００上の他の領域に入らないようにするため、捕捉プローブ固定化担体１００上の捕捉プローブが結合している領域が、他の捕捉プローブが結合している領域と区切られていること好ましい。捕捉プローブが結合している領域を他の捕捉プローブが結合している領域と区切る方法としては、各領域にバルブを設けて、各領域を他の領域と区切ることが例示される。例えば、測定したい検出対象に対応する捕捉プローブ固定化担体１００の捕捉プローブ固定化領域と他の領域との間にバルブを設け、測定したい検出対象の領域において、酵素反応の結果生ずる生成物を、バルブを閉めることにより、他の領域と遮断して測定したい領域のみの標識を測定し、目的とする検出対象の有無や、その存在量を測定することができる。

≪捕捉プローブ固定化担体の製造方法≫
　本実施形態の捕捉プローブ固定化担体１００は、前記捕捉プローブ６を前記捕捉プローブ固定化担体１００に用いる固相担体７に固定化することにより製造することができる。前記捕捉プローブ６を捕捉プローブ固定化担体１００用固相担体７に固定化するには、アビジン－ビオチン結合を利用する方法の他、前記捕捉プローブをアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、捕捉プローブ固定化担体１００用固相担体７をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができる。

　捕捉プローブ固定化担体１００に用いる固相担体７に捕捉プローブ６を固定化した後は、捕捉プローブが固定化されていない捕捉プローブ固定化担体１００の官能基は、エタノールアミン等の1級アミンブロッキング剤を用いてブロッキングすることが好ましい。例えば、前記固相担体７として、エポキシ基修飾ガラス基板を用いる場合は、捕捉プローブ６を含む溶液をエポキシ基修飾ガラス基板に滴下した後に乾燥し、捕捉プローブ６をエポキシ基修飾ガラス基板に固定化する。その後、洗浄液を用いて前記固相担体７に固定化されなかった捕捉プローブを除去した後に、エタノールアミン等のブロッキング剤を添加して捕捉プローブ６が固定化されていないエポキシ基をブロッキングすることにより、捕捉プローブ６が固定化された捕捉プローブ固定化担体１００を得ることができる。

≪検体中の検出対象の測定用キット≫
　本実施形態の検出キットは、２種類以上の、検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質と検出対象毎に異なるタグとが結合した固相担体と、２種類以上の、前記固相担体上のタグに特異的に結合する捕捉プローブが、種類毎に異なる位置に配置されている、捕捉プローブ固定化担体と、２種類以上の、検体中の検出対象と特異的に結合する標識化物質と、を含む。

　本実施形態の検出キットにおいて、検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質と、検出対象毎に異なるタグとが結合した固相担体は、上述した≪検出対象の測定方法≫の第１実施形態の工程（ａ）で述べた、検出対象結合物質と固相担体を用いることができる。

本実施形態の検出キットは、上述した≪検出対象の測定方法≫の第１実施形態の工程（ｃ２）及び第２実施形態の工程（ｃ４）と、上述した≪捕捉プローブ固定化担体≫とで述べた標識化物質含む。
　本実施形態の検体中の検出対象の測定用キットは、上述した≪検出対象の測定方法≫の第１実施形態及び第２実施形態に用いることができる。

本実施形態の検出キットに含まれる、前記捕捉プローブ固定化担体において、標識化物質の標識を測定する際に、標識化物質に用いる標識として酵素を用いる場合は、酵素反応の際に生成する基質が、捕捉プローブ固定化担体上の他の領域に入らないようにするため、前記捕捉プローブ固定化担体上において、１種類の前記捕捉プローブが配置されている各領域は、他の種類の捕捉プローブが配置されている領域と区切られていること好ましい。１種類の捕捉プローブが配置されている領域を他の種類の捕捉プローブが配置されている領域と区切る方法としては、各領域にバルブを設けて、各領域を他の領域と区切ることが例示される。例えば、測定したい検出対象に対応する捕捉プローブが配置されている領域と他の種類の捕捉プローブが配置されている領域との間にバルブを設け、測定したい検出対象の領域において、酵素反応の結果生ずる生成物を、バルブを閉めることにより、他の領域と遮断して測定したい領域のみの標識を測定し、目的とする検出対象の有無や、その存在量を測定することができる。

≪検体中の検出対象測定用デバイス≫
　本実施形態の流体デバイスは、
検出対象を含む検体を導入する検体導入部１０、
前記検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質及び該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体を導入する固相担体導入部１１と、
前記検体導入部及び前記固相担体導入部が接続する反応部１２と、
前記検出対象に特異的に結合する標識化物質を導入する標識化物質導入部１３と、
前記固相担体に固定化されたタグに特異的に結合する捕捉プローブが検出対象毎に異なる位置に固定化された検出部１４と、
を備える。
［第１実施形態］
第1実施形態の流体デバイスは、上述した≪検出対象の測定方法≫の第１実施形態を実施するためのデバイスである。
以下、図４を参照して、本第１実施形態の流体デバイスを説明する。
　本実施形態の流体デバイス１０００は、検出対象を含む検体を導入する検体導入部１０、固相担体導入部１１、反応部１２、標識化物質導入部１３及び検出部１４を備える。また、本実施形態の流体デバイスは、前記標識化物質を除去するＢ／Ｆ分離部１８を備えていてもよい。

　検体導入部１０は、前記検出対象が含まれる検体を導入する部分である。検体導入部１０は前記反応部１２と接続されており、検体導入部１０と反応部１２とは、バルブ１５を閉めることにより遮断することができる。検体導入部１０に導入された検体は、バルブ１５を開くことにより、反応部１２に移動する。
　固相担体導入部１１は、前記検出対象結合物質と前記検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体を導入する部分である。固相担体導入部１１は反応部１２と接続されており、固相担体導入部１１と反応部１２とは、バルブ１６を閉めることにより遮断することができる。固相担体導入部１１に導入された前記固相担体は、バルブ１６を開くことにより、反応部１２に移動する。
上述した≪検体中の検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、検出対象Aと検出対象Bを含む検体を検体導入部１０に導入する。

反応部１２では、検出対象導入部１０から導入された検出対象と、固相担体導入部１１から導入された、前記検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と前記検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体とが反応し、前記固相担体と前記検出対象とを含む第１複合体が、検出対象毎に生成する。

上述した≪検体中の検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、固相担体導入部１１から反応部１２に、検出対象A結合物質とタグAとが固定化された固相担体A、検出対象B結合物質と第２タグとが固定化された固相担体B、検出対象C結合物質とタグCとが固定化された固相担体C及び検出対象D結合物質とタグDとが固定化された固相担体Dを導入する。反応部１２では、検体導入部１０から導入された検出対象Aは、固相担体Aに結合し、固相担体Aと検出対象Aとを含む第１複合体Aを生成し、検出対象Bは、固相担体Bに結合し、固相担体Bと検出対象Bとを含む第１複合体Bを生成する。検体中には検出対象Cと検出対象Dは存在しないため、固相担体Cと固相担体Dは、第1複合体を生成せずに、反応部１２にそのまま存在する。

　本第1実施形態の流体デバイスにおいては、標識化物質導入部１３は、反応部１２に接続されており、標識化物質導入部１３と反応部１２とは、バルブ１７を閉めることにより遮断することができる。標識化物質導入部１３に導入された標識化物質は、バルブ１７を開くことにより、反応部１２に移動する。
反応部１２に導入された標識化物質は、前記第1複合体と特異的に結合し、固相担体と検出対象と標識化物質とを含む第２複合体が、検出対象毎に生成する。
　上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、反応部１１に検出対象Aに対応する標識化物質A、検出対象Bに対応する標識化物質B、検出対象Cに対応する標識化物質C、検出対象Dに対応する標識化物質Dを導入し、固相担体Aと検出対象Aと標識化物質Aとを含む第２複合体Aと、固相担体Bと検出対象Bと標識化物質Bとを含む第２複合体Bが生成する。検体中には検出対象Cと検出対象Dは存在しないため、標識化物質Cと標識化物質Dは、標識化物質と結合しないまま、反応部１２にそのまま存在する。

　本反応部１２は、検出部１４と直接接続されていてもよいが、本実施形態の流体デバイスが、固相担体に結合していない前記標識化物質を除去するＢ／Ｆ分離部１８を備える場合は、本反応部１２は、Ｂ／Ｆ分離部１８と接続されている。反応部１２がＢ／Ｆ分離部１８と接続されている場合は、反応部１２とＢ／Ｆ分離部１８とはバルブ１９を閉めることにより遮断することができる。反応部１２で生成した第２複合体はバルブ１９を開くことにより、Ｂ／Ｆ分離部１８に移動する。
　Ｂ／Ｆ分離部１８は、固相担体に結合していない標識化物質をＢ／Ｆ分離により除去する部分である。該固相担体に結合していない標識化物質のＢ／Ｆ分離は、Ｂ／Ｆ分離が可能であればいかなる手段であってもよいが、例えば、固相担体が磁性粒子の場合は、Ｂ／Ｆ分離部１８に磁石を備えることにより、磁石の磁力により固相担体を収集し、固相担体に結合していない標識化物質を、洗浄液を流すこと等により除去することができる。

上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、Ｂ／Ｆ分離部１８で、固相担体に結合していない標識化物質Cと標識化物質Dを除去する。
Ｂ／Ｆ分離部１８は、Ｂ／Ｆ分離により生じた廃液を保管する廃液保管部２０と接続されていてもよい。Ｂ／Ｆ分離部１８と廃液保管部２０とはバルブ２１を閉めることにより遮断されおり、Ｂ／Ｆ分離部１８で除去された標識化物質や当該部位で使用された洗浄液等の廃液は、バルブ２１を開くことにより、廃液保管部２０に移動し、保管される。上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、標識化物質と結合していない標識化物質Cと標識化物質Dは、Ｂ／Ｆ分離部１８でＢ／Ｆ分離され、廃液保管部２０に移動する。

反応部１２は、検出部１４と接続されており、反応部１２と検出部１４との間にはバルブが設けられ、バルブを閉めることにより、反応部１２と検出部１４を遮断することができる。バルブを開くことにより、反応部１２で生成した第２複合体は、検出部１４に移動する。Ｂ／Ｆ分離部１９を介して、反応部１２と検出部１４が接続されている場合は、Ｂ／Ｆ分離部１９と検出部１４はバルブ２２を閉めることにより遮断することができる。Ｂ／Ｆ分離部１８で固相担体と結合しない標識化物質と分離された第２複合体は、バルブ２２を開くことにより検出部１４に移動する。

　検出部１４は、検出対象に特異的に結合する捕捉プローブが、検出対象毎に異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体を備える。該検出対象に特異的に結合する捕捉プローブが検出対象毎に異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体は、前記≪検体中の検出対象の測定方法≫の工程（ｃ２）及び工程（ｃ３）で述べた捕捉プローブ固定化担体を用いることができる。
検出部１４に移動した前記第２複合体は、それぞれの固相担体のタグに特異的に結合する捕捉プローブに結合し、該捕捉プローブ固定化担体１００上の異なる位置に結合する。

検出部１４において、捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブの捕捉プローブ固定化担体上の固定化領域は、他の捕捉プローブの固定化領域と区切られていても、区切られてなくてもよいが、標識が酵素の場合は、標識物質の検出の際に生成する基質が他の領域に入らないようにするため、捕捉プローブが結合している各領域は、他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られていることが好ましい。捕捉プローブが固定化している各領域が他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られている流体デバイス１０００としては、前記捕捉プローブが固定化された領域間が、バルブ３０により区切られている流体デバイスが例示される。

　検出部１４は、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第２複合体を接触させるため、前記第２複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液する往復送液手段を有するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液する循環送液手段を有していてもよい。前記第２複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に送液する場合は、前記第２複合体が、前記捕捉プローブ固体化担体に結合した後に、送液手段を停止させて、送液を停止する。検出部１４が、前記送液手段を有する場合は、前記検出部１４は、前記第２複合体を含む溶液が循環する循環流路上に位置することが好ましい。

上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、検出部１４は、固相担体Aに固定化されているタグAに特異的に結合する第１捕捉プローブAと、固相担体Bに固定化されているタグBに特異的に結合する捕捉プローブBと、固相担体Cに固定化されているタグCに特異的に結合する第１捕捉プローブCと、固相担体Dに固定化されているタグDに特異的に結合する第１捕捉プローブDとがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体１００を備える。反応部１２またはＢ／Ｆ分離部１８から移動した第２複合体Aは捕捉プローブ固定化担体１００上の捕捉プローブAに結合し、第２複合体Bは捕捉プローブ固定化担体１００上の捕捉プローブBに結合する。固相担体Cと固相担体Dは検体中に検出対象Cと検出対象Dが存在しないため、固相担体Cと固相担体Dは、検出対象と第２複合体を生成せずに、それぞれ捕捉プローブ固定化担体１００上の、捕捉プローブCと捕捉プローブDに結合する。

本実施形態において、検出部１４では、各標識化物質に応じて標識を生成させる物質を添加し、前記捕捉プローブ固定化担体１００に結合している標識化物質からシグナルを発生させる。
標識化物質から発生したシグナルを、検査装置２３により読み取ることにより、前記捕捉プローブ固定化担体１００に結合している検出対象の有無や、その量を測定することができる。

検査装置２３は、各標識化物質の標識の測定に応じて適切な装置を選択することができる。標識物質が発色物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。

上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態１－１の場合は、検出対象Aを測定する際には、標識化物質Aに対応した標識を発生させる物質を検出部１４に添加してシグナルを発生させ、該シグナルを、検査装置２３を用いて測定する。また、検出対象Bを測定する際には、標識化物質Bに対応する物質を添加してシグナルを発生させ、該シグナルを、検査装置２３を用いて測定する。標識化物質Aの標識物質が酵素である場合は、標識化物質Aに対応した標識を発生させる物質を検査部１４に添加する前に、捕捉プローブAが固定化されている領域のバルブ３０を閉めて、他の領域と区別しておくことが好ましい。同様に、標識化物質Bの標識物質が酵素の場合は、標識化物質Bに対応した標識を発生させる物質を検査部１４に添加する前に、捕捉プローブBが固定化されている領域のバルブ３０を閉めて、他の領域と区別しておくことが好ましい。

　検出部１４には、固相担体に結合していない標識化物質や洗浄液等を保管する廃液保管部２４と接続されていてもよい。検出部１４と廃液保管部２４とはバルブ２５を閉めることにより遮断されおり、検出部１４で、固相担体に結合しなかった標識化物質や洗浄液等は、バルブ２５を開くことにより、廃液保管部２４に移動し、保管される。実施形態１－１の場合は、固相担体と結合していない標識化物質D及び標識化物質Eは、廃液保管部２０に移動して、保管される。

［第２実施形態］
第２実施形態の流体デバイスは、上述した≪検出対象の測定方法≫の第２実施形態を実施するためのデバイスである。
以下、図５を参照して、本第２実施形態の検体中の流体デバイスを説明する。

　検体導入部１０は、前記検出対象が含まれる検体を導入する部分である。検体導入部１０は反応部１２と通じており、検体導入部１０と反応部１２とはバルブ１５を閉めることにより遮断することができる。検体導入部１０に導入された検体は、バルブ１５を開くことにより、反応部１２に移動する。
　固相担体導入部１１は、前記検出対象結合物質と前記検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体を導入する部分である。固相担体導入部１１は反応部１２と接続されており、固相担体導入部１１と反応部１２とは、バルブ１６を閉めることにより遮断することができる。固相担体導入部１１に導入された前記固相担体は、バルブ１６を開くことにより、反応部１２に移動する。
上述した≪検体中の検出対象の測定方法≫の実施形態２－１の場合は、検出対象Cを含む検体を検体導入部１０に導入する。

反応部１２では、検出対象導入部１０から導入された検出対象と、固相担体導入部１１から導入された前記検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と前記検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体とが反応し、前記固相担体と検出対象とを含む第１複合体が、検出対象毎に生成する。

上述した≪検体中の検出対象の測定方法≫の実施形態２－１の場合は、固相担体導入部１１から反応部１２に、検出対象A結合物質とタグAとが固定化された固相担体A、検出対象B結合物質と第２タグとが固定化された固相担体B、検出対象C結合物質とタグCとが固定化された固相担体C及び検出対象D結合物質とタグDとが固定化された固相担体Dを導入する。反応部１２では、検体導入部１０から移動した検体中の検出対象Cは、固相担体Cに結合し、固相担体Cと検出対象Cとを含む第１複合体Cを生成する。検体中には検出対象A、検出対象B、検出対象D及び検出対象Eは存在しないため、固相担体A、固相担体B、固相担体D及び固相担体Eは、第1複合体を生成せずに、反応部１２にそのまま存在する。

　本第２実施形態の流体デバイスにおいては、反応部１２は、検出部１４と直接接続するか、Ｂ／Ｆ分離部１８を介して検出部１４と接続している。Ｂ／Ｆ分離部１８を介して検出部１４と接続している場合は、反応部１２とＢ／Ｆ分離部１８とはバルブ１９を閉めることにより遮断することができる。反応部１２で生成した第１複合体はバルブ１９を開くことにより、Ｂ／Ｆ分離部１８に移動する。
　Ｂ／Ｆ分離部１８は、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分をＢ／Ｆ分離により除去する部分である。Ｂ／Ｆ分離としては、Ｂ／Ｆ分離が可能であればいかなる手段であってもよいが、例えば、固相担体が磁性粒子の場合は、Ｂ／Ｆ分離部１８は磁石を備えており、磁石の磁力によって磁性粒子を集め、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分を除去することができる。

Ｂ／Ｆ分離部１８は、Ｂ／Ｆ分離により生じた廃液を保管する廃液保管部２０と接続されていてもよい。Ｂ／Ｆ分離部１８と廃液保管部２０はバルブ２１を閉めることにより遮断されおり、Ｂ／Ｆ分離部１８で分離された、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分等の廃液は、バルブ２１を開くことにより、廃液保管部２０に移動し、保管される。
Ｂ／Ｆ分離部１８は、検出部１４と接続されており、Ｂ／Ｆ分離部１９と検出部１４とはバルブ２２により遮断することができる。Ｂ／Ｆ分離部１９で、検体中の夾雑物や検出対象以外の成分が除去された第１複合体を含む溶液は、バルブ２２を開くことにより検出部１４に移動する。

　検出部１４は、検出対象に特異的に結合する捕捉プローブが、検出対象毎に異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体１００を備える。該検出対象に特異的に結合する捕捉プローブが検出対象毎に異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体１００は、前記≪検体中の検出対象の測定方法≫の工程（ｃ２）及び工程（ｃ３）で述べた捕捉プローブ固定化担体１００を用いることができる。
検出部１４に移動した前記第１複合体は、それぞれの固相担体のタグに特異的に結合する捕捉プローブに結合し、該捕捉プローブ固定化担体１００上の異なる位置に結合する。

検出部１４において、捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブの捕捉プローブ固定化担体上の固定化領域は、他の捕捉プローブの固定化領域と区切られていても、区切られてなくてもよいが、標識が酵素の場合は、標識物質の検出の際に生成する基質が他の領域に入らないようにするため、捕捉プローブが結合している領域は、他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られていることが好ましい。捕捉プローブが固定化している領域を他の捕捉プローブが固定化している領域と区切られている流体デバイス１０００としては、前記捕捉プローブが固定化された領域間が、バルブ３０により区切られている流体デバイスが例示される。

　検出部１４は、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第１複合体を接触させるため、前記第１複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液する往復送液手段を有するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液する循環送液手段を有していてもよい。前記第１複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に送液する場合は、前記第１複合体が、前記捕捉プローブ固体化担体に結合した後に、送液手段を停止させて、送液を停止する。検出部１４が、前記送液手段を有する場合は、前記検出部１４は、前記第１複合体を含む溶液が循環する循環流路上に位置することが好ましい。

上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態２－１の場合は、検出部１４は、固相担体Aに固定化されているタグAに特異的に結合する捕捉プローブAと、固相担体Bに固定化されているタグBに特異的に結合する捕捉プローブBと、固相担体Cに固定化されているタグCに特異的に結合する捕捉プローブCと、固相担体Dに固定化されているタグDに特異的に結合する捕捉プローブDと、固相担体Eに固定化されているタグEに特異的に結合する捕捉プローブEとがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体１００を備える。該捕捉プローブ固定化担体１００に、反応部１２で得られた固相担体と検出対象とを含む第１複合体を接触させる。検体には検出対象Cは含まれているが、検出対象A、検出対象B、検出対象D及び検出対象Eは含まれていないため、前記捕捉プローブ固定化担体１００上で、固相担体Cと検出対象Cとを含む第1複合体Cが、捕捉プローブCと結合するが、固相担体A、固相担体B、固相担体D及び固相担体Eは検出対象と結合しない状態で捕捉プローブ固定化担体１００上の捕捉プローブA、捕捉プローブB、捕捉プローブD及び捕捉プローブEにそれぞれ結合する。

第２実施形態においては、標識化物質導入部１３は、検出部１４と接続されており、標識化物質導入部１３と検出部１４は、バルブ１７を閉めることにより遮断することができる。標識化物質導入部１３に導入された標識化物質は、バルブ１７を開くことにより、検出部１４に移動する。
検出部１４に導入された標識化物質は、前記捕捉プローブ固定化担体１００の異なる位置にそれぞれ結合した第1複合体と特異的に結合し、検出対象毎に、前記捕捉プローブ固定化担体１００上に、前記捕捉プローブと前記第1複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体が生成する。
本実施形態において、検出部１４では、各標識化物質に応じて標識を生じる物質を添加し、捕捉プローブ固定化担体１００に結合している標識化物質からシグナルを発生させる。
標識化物質から発生したシグナルを、検査装置２３により読み取ることにより、捕捉プローブ固定化担体１００に結合している検出対象の有無や、その量を測定することができる。

　上述した≪検出対象の測定方法≫の実施形態２－１の場合は、捕捉プローブ固定化担体１００に、標識化物質A、標識化物質B、標識化物質C、標識化物質D、標識化物質Eを接触させる。捕捉プローブ固定化担体１００上の、捕捉プローブA、捕捉プローブB、捕捉プローブC、捕捉プローブD及び捕捉プローブEのうち、捕捉プローブCのみに検出対象Cを含む第1複合体Cが結合しているが、捕捉プローブA、捕捉プローブB、捕捉プローブD及び捕捉プローブEにそれぞれ結合している、固相担体A、固相担体B、固相担体D及び固相担体Eには、検出対象が結合していないため、標識化物質Cのみが、第1複合体Cに結合する。
　次に、各標識物質の標識に応じた検出方法により、標識物質の検出を行う。実施形態２－１においては、標識化物質Cのみが、捕捉プローブCが固定化されている捕捉プローブ固定化担体１００上の第1複合体Cに結合しているため、捕捉プローブCが固定化されている領域のみに標識が検出される。該シグナルを、検査装置２３を用いて測定する。標識化物質の標識物質が酵素である場合は、標識化物質に対応した標識を発生させる物質を検査部１４に添加する前に、捕捉プローブA固定化領域、捕捉プローブB固定化領域、捕捉プローブC固定化領域、捕捉プローブD固定化領域及び捕捉プローブE固定化領域のそれぞれの領域間のバルブ３０を閉めて、各領域を区別しておくことが好ましい。

　検出部１４には、固相担体に結合していない標識化物質を保管する廃液保管部２４と接続されていてもよい。検出部１４と廃液保管部２４とはバルブ２５を閉めることにより遮断されおり、検出部１４で、固相担体に結合しなかった標識化物質等は、バルブ２５を開くことにより、廃液保管部２４に移動し、保管される。実施形態２－１の場合は、固相担体と結合していない標識化物質A、標識化物質B、標識化物質D及び標識化物質Eは、廃液保管部２０に移動して、保管される。

本実施形態の検体中の検出対象の測定方法、捕捉プローブ固定化担体１００、検出キット、及び流体デバイスにより、検体中の検出対象を同時に測定することができるため、迅速に目的の検出対象を測定することが可能となる。また、本実施形態の検出対象の流体デバイスによれば、検体の導入から検出まで１つのデバイス中で行うことが可能となる。検体の導入から検出まで１つのデバイス中で行うことが可能であるため、外部からの影響を受けにくいという効果を有する。

　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（１）捕捉プローブＤＮＡ固定化担体１５０３の作製
　エポキシ基修飾ガラス基板（ＳＨＯＴＴＯ社製）に撥水性マーカーペンで内径３ｍｍのスポット枠を１８か所作成し、配列番号３で表される塩基配列からなる１０μＭの捕捉プローブＤＮＡ１５０３を３μｌ／スポットで滴下した。このガラス基板を室温、湿度７５％で３０分間放置した後、さらに湿度４０～５０％で１２時間放置し、捕捉プローブＤＮＡをガラス基板に固定化した。その後、ガラス基板を洗浄液（０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００，１ｍＭ　ＨＣｌ，　１００ｍＭ　ＫＣｌ）で洗浄後、捕捉プローブＤＮＡが固定されていないエポキシ基を５０ｍＭエタノールアミンでブロッキングし、捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板を作製した。

（２）捕捉プローブＤＮＡ固定化担体１５０５の作製
　配列番号３で表される塩基配列からなる捕捉プローブＤＮＡ１５０３の代わりに、配列番号４で表される捕捉プローブＤＮＡ１５０５を用いる以外は（１）と同様にして、捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化ガラス基板を作製した。

（３）固相担体の作製
　配列番号２で表される塩基配列からなる5’アミノ基標識3’FITC標識タグＤＮＡ１５０５を合成した。このＦＩＴＣ標識タグＤＮＡ１５０５をトシル基修飾磁性粒子（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と３７℃で１６時間インキュベートし、ＦＩＴＣ標識タグＤＮＡ１５０５固定化磁性粒子を作製した。
（１）及び（２）で作製したＤＮＡ捕捉プローブ固定化ガラス基板のそれぞれに、（３）で作製したＦＩＴＣ標識タグＤＮＡ１５０５固定化磁性粒子を滴下し、２５℃で１０分間インキュベートした。その後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中に２５℃で１０分間、さらに、０．２×ＳＳＣ中で２５℃に１０分間浸すことにより洗浄した。
　次に、上記捕捉プローブＤＮＡ固定化ガラス基板を裏面から倒立顕微鏡を用いて蛍光顕微観察を行った。蛍光輝度は、画像ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ；　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Hｅａｌｔｈ開発のオープンソースソフトウェア）を用いてスポット領域をＲＯＩ設定し、平均輝度を算出した。その結果、タグＤＮＡ１５０５と相補的配列を有する捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化ガラス基板を用いた場合の平均輝度は３８３９であったのに対し、タグＤＮＡ１５０５と相補的配列を有さないＤＮＡ捕捉プローブ１５０３固定化ガラス基板を用いた場合の平均輝度は２５と小さかった。このことから、タグＤＮＡ１５０５とハイブリダイズする捕捉プローブＤＮＡ１５０５にタグＤＮＡ１５０５固定化磁性粒子が結合することを蛍光強度により観察できることが確認された。

［実施例２］
（１）抗体とＤＮＡタグが固定化された固相担体の作成
　配列番号２で表される塩基配列からなるタグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製）とを含む抗体溶液に磁性粒子（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、３７℃で１６時間インキュベートし、抗トロポニン抗体とタグＤＮＡ１５０５とを磁性粒子に固定化し、タグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を得た。

（２）ＤＮＡタグ抗トロポニン抗体固定化磁性粒子を用いたトロポニン検出
上記のタグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体とが固定された磁性粒子に、トロポニンを添加し、３７℃で１５分間反応させた後に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した抗トロポニン抗体を含む抗体溶液を添加し、ＡＬＰ標識抗トロポニン抗体とタグＤＮＡ１５０５とが固定化された磁性粒子を調製し、反応チューブにｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を滴下し、生成するｐ－ニトロフェノールの吸光度を吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。また、対象として、タグＤＮＡ１５０５と抗トロポニン抗体とが固定化された固定化磁性粒子の代わりに、抗トロポニン抗体のみが固定化された磁性粒子、及び何も固定していない磁性粒子を用いて、上記と同様に、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を滴下し、生成するｐ－ニトロフェノールの吸光度を測定した。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、抗トロポニン抗体とタグＤＮＡ１５０５とが固定化された磁性粒子は、抗トロポニン抗体が固定化された磁性粒子と同様のＡＬＰ活性値を示したことから、トロポニンをサンドイッチイムノアッセイにて検出可能であることが確認された。

［実施例３］
［抗トロポニン抗体とＤＮＡタグが固定化された固相担体を用いたトロポニンの検出（１）］
実施例１（１）の捕捉プローブＤＮＡ１５０３の代わりに、配列番号５で表される塩基配列からなる捕捉プローブＤＮＡ１５０８を用いる以外は、実施例１（１）と同様にして、捕捉プローブＤＮＡ１５０８固定化ガラス基板を得た。
上記で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０８固定化ガラス基板と、実施例１（１）で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板と、実施例１（２）で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化ガラス基板とに、それぞれ実施例２（２）で得られた、タグＤＮＡ１５０５とＦＩＴＣ標識抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子に、トロポニンが結合した状態の磁性粒子（ＭＤＴ１５０５）を滴下し、２５℃で１０分間インキュベートした。各捕捉プローブＤＮＡ固定化ガラス基板は、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中に２５℃で１０分間、さらに、０．２×ＳＳＣ中で２５℃に１０分間浸すことにより洗浄後、生成する蛍光強度を測定した。また、対象として、上記タグＤＮＡ１５０５とＦＩＴＣ標識抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子の代わりに、ＦＩＴＣ標識抗トロポニン抗体のみを固定化した磁性粒子（ＭＴ１５０５）を用いる以外は同様に行い、生成する蛍光強度を測定した。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化ガラス基板に、磁性粒子ＭＤＴ１５０５（黒棒）を滴下したときの蛍光強度が４０３に対して、磁性粒子ＭＴ１５０５（白棒）を滴下したときの蛍光強度は１２であった。
捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板に、磁性粒子ＭＤＴ１５０５（黒棒）を滴下したときの蛍光強度が８対して、磁性粒子ＭＴ１５０５（白棒）を滴下したときの蛍光強度は３であった。
捕捉プローブＤＮＡ１５０８固定化ガラス基板に、磁性粒子ＭＤＴ１５０５（黒棒）を滴下したときの蛍光強度が６に対して、磁性粒子ＭＴ１５０５（白棒）を滴下したときの蛍光強度は４であった。
このことから、タグＤＮＡ１５０５とトロポニンが結合した状態の抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子は、捕捉プローブＤＮＡ１５０５固定化ガラス基板に特異的に結合することが確認された。

［実施例４］
［抗トロポニン抗体とＤＮＡタグが固定化された固相担体を用いたトロポニンの検出（２）］
配列番号１で表される塩基配列からなるタグＤＮＡ１５０３と抗トロポニン抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製）を含む抗体溶液に磁性粒子（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、３７℃で１６時間インキュベートし、抗トロポニン抗体とタグＤＮＡ１５０３とを磁性粒子に固定化し、タグＤＮＡ１５０３と抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を得た。このタグＤＮＡ１５０３と抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子に、トロポニンを添加し、３７℃で１時間反応させた後に、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した抗トロポニン抗体を含む抗体溶液を添加し、タグＤＮＡ１５０３とＡＬＰ標識抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を調製した。
次に、捕捉プローブＤＮＡ１５０３の代わりに、配列番号６で表される塩基配列からなる捕捉プローブＤＮＡ１５１２を用いる以外は実施例１（１）と同様にして、捕捉プローブＤＮＡ１５１２固定化ガラス基板を得た。また、捕捉プローブＤＮＡ１５０３の代わりに、配列番号７で表される塩基配列からなる捕捉プローブＤＮＡ１５１９を用いる以外は実施例１（１）と同様にして、捕捉プローブＤＮＡ１５１９固定化ガラス基板を得た。

上記で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５１２固定化ガラス基板と捕捉プローブＤＮＡ１５１９固定化ガラス基板、及び実施例１（１）で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板、実施例３で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０８固定化ガラス基板のそれぞれに、実施例２（２）と同様の方法で得られた、タグＤＮＡ１５０３とトロポニンが結合した状態のＡＬＰ標識抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を滴下し、２５℃で１０分間インキュベートした。各捕捉プローブＤＮＡ固定化ガラス基板は、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中に２５℃で１０分間、さらに、０．２×ＳＳＣ中で２５℃に１０分間浸すことにより洗浄後、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を各ガラス基板に滴下し、生成するｐ－ニトロフェノールの吸光度を測定した。その結果を図８に示す。図８から明らかなように、捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板では、ＡＬＰ活性が測定されたが、捕捉プローブＤＮＡ１５０８固定化ガラス基板、捕捉プローブ１５１２ＤＮＡ固定化ガラス基板、及び捕捉プローブＤＮＡ１５１９固定化ガラス基板では、ＡＬＰ活性が測定されなかった。このことから、タグＤＮＡ１５０３とトロポニンが結合した状態の抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子のみが、タグＤＮＡとハイブリダイズする捕捉プローブＤＮＡ１５０３が固定化されたガラス基板に結合し、トロポニンを検出できることが確認された。

［実施例５］
［抗トロポニン抗体とＤＮＡタグが固定化された固相担体を用いたトロポニンの検出（３）］
実施例１（１）で得られた捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板に、実施例２（２）と同様の方法で得られたタグＤＮＡ１５０３とトロポニンを結合した状態の抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を滴下し、２５℃で１５分間インキュベートした。その後、捕捉プローブＤＮＡ１５０３固定化ガラス基板を、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中に２５℃で１０分間、さらに、０．２×ＳＳＣ中で２５℃に１０分間浸すことにより洗浄した。その後、ＰＮＰＰをガラス基板に滴下し、ＡＬＰ活性を測定した。対照として、実施例２（２）の方法でトロポニンを含まない抗原溶液を用いる以外は同様にして磁性粒子を作製し、同様にＡＬＰ活性を測定した。その結果を図９に示す。図９から明らかなように、タグＤＮＡ１５０３とトロポニンを結合した状態の抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を滴下した場合のみ、ＡＬＰ活性が測定された。このことから、トロポニンは、捕捉プローブＤＮＡ固定化ガラス基板と、該捕捉プローブＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡタグと抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子と、により検出可能であることが明らかとなった。

［実施例６］
［抗トロポニン抗体とＤＮＡタグが固定化された固相担体を用いたトロポニンの検出（４）］
捕捉プローブＤＮＡ１５０３の代わりに、配列番号４で表される捕捉プローブＤＮＡ１５０５を用い、タグＤＮＡ１５０３の代わりに配列番号２で示されるタグＤＮＡ１５０５を用いる以外は実施例５と同様にして、ＡＬＰ活性を測定した。その結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、タグＤＮＡ１５０５とトロポニンを結合した状態の抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子を滴下した場合のみ、ＡＬＰ活性が測定された。このことから、トロポニンは、捕捉プローブＤＮＡ固定化ガラス基板と、該捕捉プローブＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡタグと抗トロポニン抗体とが固定化された磁性粒子と、により検出可能であることが明らかとなった。

１…検出対象結合物質、２…固相担体、３…タグ、４…検出対象、５…標識化物質、６…捕捉プローブ、７…捕捉プローブ固定化用固相担体、１０…検体導入部、１１…固相担体導入部、１２…反応部、１３…標識化物質導入部、１４…検出部、１５…バルブ、１６…バルブ、１７…バルブ、１８…Ｂ／Ｆ分離部、１９…バルブ、２０…廃液保管部、２１…バルブ、２２…バルブ、２３…検査装置、２４…廃液保管部、２５…バルブ、１００…捕捉プローブ固定化担体、１０００…流体デバイス

Claims

（ａ）検体中に含まれる検出対象毎に、該検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質と該検出対象毎に異なるタグとが固定化された固相担体、及び該検出対象に特異的に結合する標識化物質を用意する工程と、
（ｂ）前記検体と前記固相担体とを接触させ、前記検体中に含まれる検出対象毎に、前記固相担体と前記検出対象とを含む第１複合体を生成させる工程と、
（ｃ）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体と、前記第１複合体と、前記標識化物質と、を接触させ、前記検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させる工程と、
（ｄ）前記捕捉プローブ固定化担体に結合している前記第３複合体の標識化物質の標識を検出することにより検出対象を測定する工程と、
を含む検出対象の測定方法。
　前記工程（ｃ）は、
（ｃ１）前記第１複合体と前記標識化物質とを接触させ、前記固相担体と前記検出対象と前記標識化物質とを含む第２複合体を、前記検出対象毎に生成させる工程と、
（ｃ２）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第２複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに特異的に結合させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を、生成させる工程と、
　を含む、請求項１に記載の方法。
　前記工程（ｃ）は、
（ｃ３）前記検出対象毎に異なるタグに特異的に結合する捕捉プローブがそれぞれ異なる位置に固定化された捕捉プローブ固定化担体に、前記第１複合体を接触させ、前記固相担体上のタグを前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている捕捉プローブに、特異的に結合させる工程と、
（ｃ４）前記捕捉プローブ固定化担体の異なる位置にそれぞれ結合した第１複合体と、各検出対象に対応する標識化物質と、を接触させ、検出対象毎に、前記捕捉プローブ固定化担体上に、前記捕捉プローブと前記第１複合体と前記標識化物質とを含む第３複合体を生成させる工程と、
　を含む、請求項１に記載の方法。
　前記工程（ｃ２）において、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第２複合体の接触が、前記第２複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液する、請求項２に記載の方法。
　前記工程（ｃ３）において、前記捕捉プローブ固定化担体と前記第１複合体の接触が、前記第１複合体を含む溶液を前記捕捉プローブ固定化担体に往復して送液するか、及び／又は、当該溶液を循環して送液する、請求項３に記載の方法。
　前記工程（ｃ２）または前記工程（ｃ４）において、前記固相担体上のタグを、前記捕捉プローブ固定化担体に固定化されている、各タグに対応する捕捉プローブと特異的に結合させた後に、前記捕捉プローブが固定化された領域間に設けられたバルブを閉めることにより、他の前記捕捉プローブが固定化された領域と区切る、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記工程（ｃ２）または前記工程（ｃ４）の後に、固相担体に結合していない標識化物質を除去する工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記検出対象結合物質が、該検出対象に特異的に結合する抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記捕捉プローブが核酸である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記捕捉プローブに特異的に結合するタグが、該該捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする核酸である、請求項９に記載の方法。
　前記標識化物質が、該検出対象と特異的に結合する標識化された抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記固相担体が、磁性粒子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に用いる、２種類以上の捕捉プローブが異なる位置に固定化されている捕捉プローブ固定化担体。
　２種類以上の、検出対象に特異的に結合する検出対象結合物質と検出対象毎に異なるタグとが結合した固相担体と、
２種類以上の、前記固相担体上のタグに特異的に結合する捕捉プローブが、種類毎に異なる位置に配置されている、捕捉プローブ固定化担体と、
２種類以上の、検体中の検出対象と特異的に結合する標識化物質と、
を含む、検出キット。
　前記捕捉プローブ固定化担体上において、１種類の前記捕捉プローブが配置されている領域は、他の種類の前記捕捉プローブが配置されている領域と、バルブにより区切られている、請求項１４記載の、検出キット。
　検出対象を含む検体を導入する検体導入部と、
　前記検出対象と特異的に結合する検出対象結合物質及び該検出対象毎に異なるタグが固定化された固相担体を導入する固相担体導入部と、
　前記検体導入部及び前記固相担体導入部が接続する反応部と、
前記検出対象に特異的に結合する標識化物質を導入する標識化物質導入部と、
前記固相担体に固定化されたタグに特異的に結合する捕捉プローブが検出対象毎に異なる位置に固定化された検出部と、
を備えた流体デバイス。
固相担体に結合していない前記標識化物質を除去するＢ／Ｆ分離部を備えた、請求項１６に記載の流体デバイス。
前記標識化物質導入部は、前記反応部に接続する、請求項１６または１７に記載の流体デバイス。
前記標識化物質導入部は前記検出部に接続する、請求項１６または１７に記載の流体デバイス。
　前記検出部は、前記捕捉プローブが固定化された領域間が、バルブにより区切られている、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の流体デバイス。
　前記検出部は、往復送液手段を有する、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の流体デバイス。
　前記検出部は、循環流路上に位置し、前記循環流路は送液手段を有する請求項１６～２１のいずれか一項に記載の流体デバイス。