JP2010046072A - ハイスループットアッセイシステム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも20の実質的に同一の試験領域を含む表面であり、各試験領域には包括的アンカー分子のアレイが含まれる。そのアンカーは、二官能性リンカー分子に結合し、それぞれに、少なくとも1つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分が含まれる。作成したプローブのアレイを用い、プローブと特異的に相互作用する1つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析するか、または活性を試験する。一つの実施態様では、ESTをマップする。他の実施態様では、標的核酸の存在が、ヌクレアーゼ消化に対し標的をポリヌクレオチドフラグメントで保護することにより、そしてマススペクトロメトリーで保護ポリヌクレオチドを分析することにより検出される。
【選択図】なし
Description
本発明は、例えば、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しアレイを用いる多種の生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。多数の領域には、それぞれ一般的アンカー分子のアレイが含まれる。アンカーは二官能性リンカー分子を伴い、それぞれ少なくとも1つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分を含む。生成したプローブのアレイを用い、プローブに特異的に相互作用する1つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析する。本発明は、分子相互作用の性質により識別し得る多種分野に関連し、それには医薬探索、分子生物学、生化学、薬理学および医学診断技術が含まれるが、これらに限らない。
本発明は、多種の生物学的または化学的アッセイを同時に行う組成物、装置および方法を提供し、多数のサンプルをハイスループット分析し得、そのサンプルには、例えば、診断アッセイにおいてスクリーニングされる多数の患者サンプル、または薬物探索の方法において試験される多数の可能性ある薬物もしくは治療薬がある。サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せを提供する。この組合せには、多数の空間的に分離された領域を含む表面が含まれ、その領域は試験領域と名付けられ、少なくとも2つの実質的に同一のウェルであり得る。各表面には、少なくとも、2つ、好ましくは20またはそれ以上、例えば、少なくとも約25、50、96、864または1536などの実質的に同一な領域が含まれる。各試験領域は、1つまたはそれ以上の標的を含む(または部分的に含む)サンプルを導入する空間であると定義され、生物学的または化学的アレイを含む。(“標的を含むサンプル”または“サンプル中の標的を検出する”という語句は、標的を含まないかまたは検出されないサンプルまたは測定(検出の試み)を除外することを意味するものではない。通常の意味において、本発明は、標的がサンプル中に含まれるかどうかを、それが検出されるかされないかにかかわらず測定するアレイを含む。)このアレイは、包括的アンカーを含み、それぞれが、アンカーに特異的な第1の部分および少なくとも1つの標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー分子に結合する。本発明の組合せは、1つまたはそれ以上の標的を含むサンプルとの接触にあり、所望により、ディテクター分子と反応し、次いで、試験領域中における標的分子とプローブとの間の反応を検出する検出装置により応答指令信号が送られ、それによりアッセイの結果を得る。
a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面
b)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー(これは上記領域それぞれに含まれる)
c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー(これは上記オリゴヌクレオチドアンカーそれぞれと結合する)、
を含む組合せである。
a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面
b)少なくとも8種のアンカー(これは上記の領域それぞれに含まれる)
c)アンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー(これは上記アンカーのそれぞれと結合する)、
を含む組合せである。
a)当該標的を含むサンプルを、当該標的と当該リンカーとの間の第1のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を含む二官能性リンカーと接触させること、
b)当該第1のハイブリダイゼーション産物と当該組合せ[当該組合せには、当該第1のハイブリダイゼーション産物の添加前に、
1)少なくとも2つは実質的に同一な多数の空間的に分離された領域を含む表面、それぞれの領域に含まれるのが、
2)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー
が含まれる]との間の第2のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、当該第1のハイブリダイゼーション産物を組合せと接触させること、
c)当該第1のハイブリダイゼーション産物または当該第2のハイブリダイゼーション産物を標識したディテクタープローブと接触させること、
d)当該検出プローブを検出すること
を含む。
a)多分離領域を含み、少なくともその二つが実質的に同一であり、各々の領域が少なくとも8個の異なるアンカー(オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の他のタイプ)を含むものである表面、そして
b)該アンカーの少なくとも一部に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2部分を有する、少なくとも一つの2官能性リンカー分子を含む容器
を含む、サンプル中の少なくとも一つの標的の検出に有用なキットである。
a)オリゴヌクレオチドプローブ(この少なくとも1つは該ESTの各々に対応する)の固定化アレイを、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベートし、該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸とのハイブリダイゼーション産物を得る、
b)該ハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの1つが対応するESTに対応するが、ESTの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、
c)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドにより標識されたかを検出する。
1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、
2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アンカーが、
3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ESTに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと結合している。
b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を、該核酸部分に相補的な該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合せしめ、
c)1以上の該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を含む該領域を、該アレイの所定の1つのオリゴヌクレオチドプローブが対応するESTに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定のオリゴヌクレオチドプローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチドプローブに結合している核酸分子に結合せしめ、
d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイのどのEST対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌクレオチドEST対応プローブに結合する核酸の部分に相補的であるかを検出し、それによってどのESTが該所定の核酸に相補的かを同定する。
1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、
2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アンカーが、
3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ESTに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと結合している。
a)2官能的オリゴヌクレオチドリンカー分子のコレクション(その各々が、少なくとも1つの該ESTに対応するプローブである第1部分、およびアンカーオリゴヌクレオチドに特異的な第2部分を含む)を、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベートして、該オリゴヌクレオチドと該核酸との第1ハイブリダイゼーション産物を得、
b)該第1ハイブリダイゼーション産物をアンカーオリゴヌクレオチド(各アンカーオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの該リンカー分子のアンカー特異的部分に対応している)の固定化アレイとインキュベートして、該アンカー、該オリゴヌクレオチドプローブおよび該核酸を含む第2ハイブリダイゼーション産物を形成し、
c)該第1または該第2のいずれかのハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの1つが対応するESTに対応するが、ESTの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、
d)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドにより標識されたかを検出する。
1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、
2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含む。
なお、1以上の該ポリヌクレオチドが該核酸に相補的であり得、かつ該ポリヌクレオチドの各々が2の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、その第1は該ポリヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブであり、その第2は該ポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドであり、下記事項を含む。
a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも1つの領域に接触せしめ、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも1つは該ポリヌクレオチドの各々に対応する)のアレイを含み、
b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を、該核酸部分に相補的な該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに結合せしめ、
c)1以上の該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を含む該領域を、該アレイの所定の1つのオリゴヌクレオチドプローブが対応するポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定のオリゴヌクレオチドプローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチドプローブに結合している核酸分子に結合せしめ、
d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイのどのポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌクレオチドポリヌクレオチド対応プローブに結合する核酸の部分に相補的であるかを検出し、それによってどのポリヌクレオチドが該所定の核酸に相補的かを同定する。
1)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、
2)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アンカーが、
3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ポリヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと結合している。
本発明の別の具体的態様において、目的の1以上のRNA標的(例えば、mRNAや他の型のRNA)を逆転写酵素によってcDNAに変え、このcDNAをプローブアレイにハイブリダイズする。この型のアッセイは図8に模式的に示した。RNA抽出物(または精製mRNA)を本明細書で述べるように細胞または組織から調製する。次いで、逆転写酵素および目的のRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをRNAサンプルに加え、技術分野で認識の条件および手法(日常的に決定および最適化できる)を用いて、cDNAの第1鎖をつくる。用語“特異的”プライマーは、目的のmRNAに十分相補的であって、それに選択したストリジェントなハイブリダイゼーション条件で結合し、逆転写酵素で認識されるが、望ましくない核酸と結合しないものを意味する(特異的ハイブリダイゼーションが達成される適当な反応条件については、上記の記述を参照)。残りのRNA-特異的プライマーにより認識されなかったmRNA、および/またはRNA抽出物中の他の型の汚染性RNA、例えばtRNAまたはrRNA-は、種々のリボヌクレアーゼのいずれかにより、またはアルカリ処理などの化学的方法により除去でき、1本鎖cDNAが残り、これをMAPSプローブアレイと接触せしめる。この方法で逆転写酵素を用いると、RNAを多量に取り扱う必要を最低にする。RNAはヌクレアーゼによる変性に感受性であり、したがって扱いが難しい。さらに、特異的逆転写酵素プライマーにより生じた追加の特異性がアッセイに対する追加層の特異性をもたらす。
NPA-MAPSアッセイを用いて、標準MAPSアッセイを利用する上記の方法のいずれも行い得る。
種々の上記のハイスループットアッセイに加えて、多くの他のものが当業者に明白である。
一般的MAPSプレートをインクジェットディスペンサーであるPixusシステム(Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA)を使用して製造し、マイクロタイタープレートの各ウェル内にDNAの同一グリッドを形成した。全てのオリゴヌクレオチドはBiosourse International (Camarillo, CA)から購入した。このプレートに、7個の異なるオリゴヌクレオチドアンカーを、キーとして示す(図の左側)各ウェル内に分配した。各オリゴヌクレオチドを、500mMリン酸ナトリウムpH8.5および1mM EDTAを含む2μM溶液から、DNA Bindプレート(Corning Corstar)に10ナノリットル滴から2個のスポットで分配し、乾燥させた。結合後、ウェルを50mM Tris pH8で遮断し、次いで、表面に共有結合しないオリゴヌクレオチドを5×SSP緩衝液中の0.1%SDSで洗い流した。
**リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。
***ディテクターオリゴヌクレオチドを5'末端に結合したビオチンで合成した。
この方法を8個の異なるアンカーおよびそれらと実質的に優先的に会合するリンカーを各ウェルに分配する以外、繰り返す。方法全部を、24、96、384、864または1536ウェルプレートの各ウェルで、36、64などの異なるアンカーで繰り返す。
Cy5誘導体化リンカー番号1のその相補的結合アンカーへのハイブリダイゼーションの速度を、異なる濃度のリンカーに関して示す。一般的MAPSプレートを、アンカー1がウェル当り4スポットで結合している以外、図1のように調製する。インキュベーションを、室温で0.1%Tween-20含有5×SSPと室温で行い、ウェルを3回5×SSPで洗浄し、結合蛍光を測定した。プレートの蛍光画像をTundraで撮り、背景を引いて各ウェル内の各スポットでの結合強度をTundraソフトウェアで計算した。プロットしたのは、二つのデュプリケートウェルの4点の結合強度の平均と標準分散である。
一般的MAPSプレートを、ウェルあたり1スポット(上の二つの列)、ウェル当り4スポット(次ぎの4列)またはウェル当り16スポット(下の2列)にスポットした一つの固定オリゴヌクレオチドを含むように、上記の方法に従って製造する。各ウェルに、相補的、蛍光標識リンカーを実施例1に記載の好ましいプロトコールで結合する。洗浄に続いて、プレートの蛍光画像をTundraで撮る。各スポットでの蛍光の量は、どの程度官能的リンカーが標的へのハイブリダイズに利用可能であるかを報告する。反復スポットで検出したシグナルの量は非常に再現性である。
実施例3のように調製したプレートに、異なる濃度の標的オリゴヌクレオチドを添加する。会合しているリンカーは標的の部分に相補的な25量体配列を含む。標的を、全量30または100マイクロリットルの0.05%SDS含有5×SSC中に添加し、プレートを覆い、50℃で一晩インキュベートする。標的の結合リンカーへのハイブリダイゼーションに続き、標的を化学ルミネッセンスを使用した好ましいプロトコールにより可視化する。標的の別々の部分に相補的な(リンカーに相補的な部分と同じではない)25量体配列を含むビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを30nMで添加する。ビオチニル化ディテクターは、過剰の非結合標的を洗い流した後30分添加できるか、または一晩のハイブリダイゼージョンの長さの標的と一緒に添加できる。ディテクターの添加に続いて、表面を2回5×SSC、1回0.1%Tween-20および1%PEG含有1×SSP(SSPTP)で洗浄し、250μg/mlのストレプトアビジンに接合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP:SA、Pierce, Rockford, IIlから)の1:50,000希釈を、SSPTP中5時間室温で添加する。ウェルを4回SSPTPで洗浄し、1回洗浄し、次いでSuper Signal Ultra試薬(Pierce)とインキュベートする。数分後、蛍光の画像をTundraイメージャーで集め、例えば、画像を5分CCDアレイ内に蓄積できる。低レベルの標的を、標的の濃度が〜5×10-13Mほど少なくてもあるウェルでは可視化できる;シグナルの量は、一般に〜10-10Mの濃度の標的で飽和される。反復スポットで検出されるシグナルの量は、非常に再現性である。
上記の好ましいプロトコールを使用した二つの異なる標的オリゴヌクレオチドのMAPSDアッセイを証明する結合曲線を示す。一般的MAPSプレートを、各々4回各ウェル内にスポットされた4つの異なる固定オリゴヌクレオチドで調製する。第2および第4のアンカーに関して、相補的リンカーオリゴヌクレオチドは、記載のように自己凝集した。二つの標的を40マイクロリットル中に示す濃度で、記載のように各ウェルに添加し、50℃で一晩インキュベートする。各標的の結合量は、記載のように、HRP:SAおよび化学ルミネッセンス結像後に、各標的に特異的なビオチニル化検出オリゴヌクレオチドの結合により可視化された。下部パネルにおいて、イメージの強度を定量する。Tundra Imagaerパッケージの一部であるソフトウェアを使用して上部パネルに示す矢印の間の線に沿って画像の強度をスキャンした。標的の最低濃度である1.1pMで、スキャンしたイメージは十分に定義されたガウスピークを各スポットで示し、一方、標的の0濃度では、最も左のサンプルで検出可能な背景ピークはなかった。
MAPSハイブリダイゼーションアッセイは、一連のオリゴヌクレオチドの濃度の測定に、それらを表面に結合させ、それらを標識することにより使用できる。これは、中程度のまたは低い濃度であるこれらのオリゴヌクレオチドで十分に働く。二つのサンプルを、一つのサンプルがよりオリゴヌクレオチドを含み、より結合する場合、区別できる。他方、標的オリゴヌクレオチドの濃度が表面を飽和している場合(即ち、全ての結合部位を占領するのに十分高い場合)、そして濃度が上がってもより結合できない場合、量は測定できない。しかし、標的の結合曲線は、非標識競合リガンドの添加により変化できる。
データは一つのオリゴヌクレオチド標的への結合に関して上記に例示のように定量できる。図13は、高い濃度のこの標的のアッセイに使用する結合曲線のアッセイシフトにおける競合オリゴヌクレオチドの包含を定量的に示す。
MAPSアッセイでアンカーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする4つの異なる蛍光標識リンカーオリゴヌクレオチドの量を、温度の上昇にしたがってプロットする。4つのオリゴヌクレオチドは最初に50℃で1時間、300nM中でハイブリダイズさせた。次いで、ウェルをプローブなしのSSCで洗浄し、結合した量を上記のように蛍光(50℃点)で測定する。次いで、表面を55℃で30分インキュベートし、結合した蛍光を測定するなど、全ての示した温度で行う。
二つの検出法を直接比較する。各々ウェル当り4スポットで、4つのオリゴヌクレオチドアンカーが結合したMAPSプレートに、二つのオリゴヌクレオチドを各ウェルに添加し、両方とも共有結合したcy5部分を含むか、両方ともビオチン基を含む。落射蛍光測定を、記載のように可視化および蛍光リンカーの測定に関して行う。化学ルミネッセンス測定をMASPアッセイに記載のように、HRP:SAの続く添加および化学ルミネッセンス基質を使用して行う。産生したシグナルは大まかに同じ強度である。しかし、各ウェルを離す壁があるマイクロプレートの外形、および液体の泡または流体のミニスカス(miniscus)のために、落射蛍光画像の反射がデータ解析に影響し得る。
ホースラディッシュペルオキシダーゼの化学ルミネッセンス基質として利用可能な二つの生産物を、MAPSアッセイの検出法で比較できる。MAPSプレートを実施例8のように調製し、ビオチニル化リンカーオリゴヌクレオチドとインキュベートする。次いで、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼ(AlkPhos:SA)またはHRP:SAのいずれかを添加し、続いて、洗浄し、AlkPhos:SAのプレートにはCDP-Star(Tropix)またはHRP:SAのウェルにはELC-Plusを添加する。SA誘導酵素および基質での標識は、ウェスタンブロットの標識における使用に関して製造者が指示する通りである。これらの二つ(および他の利用可能な基質)は、両方ともMAPSプレートへのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼージョンの評価に使用できる。
MAPSアッセイの現在のシステムの解析は、各々ウェルあたり4回、0.6mmのピッチ(中心から中心の空間)でスポットしたMAPSプレートをウェル当り4つの異なるオリゴヌクレオチドアンカーで調製して試験する。次いで、cy5誘導体化リンカーまたはビオチニル化リンカーをハイブリダイズし、検出し、上記のようにスキャンする。落射蛍光測定に関して、解析は高い(そしてピッチは減少できるようである)。化学ルミネッセンス検出法に関して、隣のスポットと完全に離れておらず、この空間で、まだ個々のピークはコンピューターデコンヴォルーションにより明白に解析し得る。
ヌクレアーゼ保護プロトコールのハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の最適条件の試験のアッセイにおいて、Ambion(Austin, Texas)のNuclease Protection Assay Kitを使用して条件、緩衝液および酵素を提供する。8個のサンプルを3つの緩衝液の一つに調製する。Hyb Buff 1は100%Hybridization Buffer(Ambion);Hyb Buff 2は75%Hybridization Bufferおよび25%Hybridization Dilution Buffer(Ambion)およびHyb Buff 3は各々50%である。試験mRNAに相補的な60残基を含む70量体オリゴヌクレオチドを合成し(Biosource International, Camarillo, CA)、Ambionによりソラレン-ビオチンの標識について示されるプロトコールにしたがって、ソラレン-フルオレッセイン(Schleicher and Schuell, Keene, NH)で標識する。簡単に、保護フラグメントを20μlのTE緩衝液(10mM Tris、1mM EDTA、pH8)中50μg/mlに希釈し、10分間沸騰させ、急速に氷水で冷やす。DMF中の4μlの130μg/mlソラレン-フルオレッセインを添加し、サンプルを45分、40℃で手に持てる波長のUV源で照射する。遊離ソラレンフルオレッセインを飽和ブタノールでの抽出により除去する。使用したmRNAは、アンチセンスプラスミド(AmbionのpTRI-GAPDF-MouseアンチセンスControl Template)から、T7プロモーターおよびMaxiScriptキット(Ambion)を使用して製造したGAPDHアンチセンスmRNAである。短保護フラグメントは、別々に合成し、同様に標識した60量体相補的部分である。保護フラグメントの配列は下記の通りである:
完全NPA-MAPSプロトコールを、実施例11に記載のものと同じハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の条件で使用した。10個のサンプルをアッセイで流した。全て、同じ量の70量体オリゴヌクレオチド保護フラグメントおよび異なる量のGAPDA mRNAを含んだ。0.08mg/ml Yeast RNA(Ambion)含有50%Hybridization Bufferおよび50%Dilution Bufferの10μlの中のハイブリダイゼーションサンプルを90℃で6分加熱し、70℃で5分加熱して短く遠心し、19℃に冷やして19時間インキュベーションした。200μlのヌクレアーゼ混合物を次いで各サンプルに30分、19℃で添加した。各サンプルを、MAPSアッセイのために60μlに等分した。2μlの10N NaOHおよび2μlの0.5M EDTAを添加し、サンプルを90℃に15分、37℃に15分加熱し、20分室温で放置した。次いで、サンプルを2μlの10M HClで中和し、2M HEPES pH7.5および200nMの保護フラグメントに特異的なビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを含む12μlの20×SSCを、1μlの10%SDSと共に添加した。サンプルを混合し、80℃で5分加熱し、各サンプルの2個の35μl量をMAPSプレートの二つのウェルにピペット輸送した(各サンプルを二つにわけ、MAPSプレートでデュプリケートで流す)。プレートは標準MAPSプロトコールのために調製されており、保護フラグメントに特異的な自己凝集CY5誘導体化リンカーが既に結合している。MAPSプレートを覆い、50℃で一晩インキュベートし、発光の検出を記載のように行った。最後のサンプルにおいて、保護フラグメント単独ではMAPSでどのように検出されるかの可視化のコントロールとして、ヌクレアーゼをアッセイ中に添加しない。図の下部において、ウェルの上の列の強度スキャン(イメージャーの分析として)を示す。サンプルに存在するGAPDH mRNAの量(即ち、MAPSプレートに等分した後の各デュプリケートにおける量)を図に列記する。
**リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。
***ディテクターオリゴヌクレオチドを5'末端に結合したビオチンで合成した。
実施例12に記載のおよび図15に示すデータを定量し、希釈曲線としてプロットした。二つのデュプリケートウェルの全8スポットの平均および標準分散をmRNAの各濃度に対してプロットした。結合曲線は、式:
フラクション結合=最大結合*1/(1+IC50/L)
〔式中、最大結合は飽和時の最大結合、フラクション結合はリガンド濃度Lで結合する量、およびIC50はフラクション結合が最大結合の半分であるリガンドの濃度〕
に入れた。曲線は図上に点で示し、図で標識するように、IC50=4.2フェムトモルの値で最も適合した。
全マウスRNA抽出物を、NPA-MAPSアッセイでGAPDH mRNAについてアッセイし、希釈曲線を作る。マウス肝臓由来の全RNAは、Quiagenキットを使用して調製する。RNAを0.5mM Mg-アセテート含有70%EtOHに沈殿させ、10μlの0.8nM保護フラグメント含有0.05%SDS含有5×SSC中に再懸濁した。添加した保護フラグメントはオリゴヌクレオチド70塩基長であり、その60塩基がマウスGAPDHに相補的である。マウスGAPDH mRNAに相補的なフラグメントを使用する(“保護フラグメント”)か、これらの配列の相補物をネガティブコントロールとして使用する(“アンチセンスフラグメント”)。
**リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。
***プローブを5'末端に結合したビオチンで合成した。
mRNAはマウス肝臓から抽出され、ヌクレアーゼ保護は、GADPH特異的保護フラグメントがマウスGAPDHに相補的な60ヌクレオチドを含み、標的に相補的ではないフラグメントの3'で15“オーバーハンギング”ヌクレオチドが続く以外、本質的に実施例14に記載のように行う。ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ消化後、残りの保護フラグメントを、二つの異なるオリゴヌクレオチド検出フラグメントを固定化保護フラグメントの検出に使用する以外、本質的に実施例14に示すようにMAPSプレートとハイブリダイズさせる。一つの検出フラグメントは保護フラグメントのGAPDH特異的部分に相補的であり、他方、コントロールは保護フラグメントの15塩基オーバーハング部分に相補的である。各検出フラグメントは異なる複製サンプル(即ち、異なるウェル)で使用し、両方の検出フラグメントが同じ検出分子で標識できるようにする。本実施例においては、両フラグメントをHRPで標識する。ヌクレアーゼの添加なしに、両方の検出フラグメントのからのシグナルが見られる;一方、ヌクレアーゼ消化が行われたときは、GAPDH配列に対応するシグナルのみが検出できる。GAPDH特異的シグナルの量は、保護フラグメントを存在するGAPDH mRNAの量に対し対して過剰に添加したため、ヌクレアーゼ消化の不存在下で見られるものに相対して減少する。これは、GAPDH mRNAの量が保護ハイブリダイゼーションを限定し、形成された二本鎖の量(したがって、ヌクレアーゼから保護された保護フラグメントの量)がmRNAを反映するするようにする。mRNAが反応混合物に含まれないとき、ヌクレアーゼを検出したときシグナルは検出できない。上記の発見は、アッセイのハイブリダイゼーションおよび消化段階が所望により起こっていることを証明する。
ヒト腫瘍由来の細胞系を使用する。正常細胞よりも高いレベルで30遺伝子が発現されることが判明している。(即ち、これらの30遺伝子は正常細胞でよりも使用されおり、mRNAを造り、続いて遺伝子が指示するタンパク質を製造する。転写アッセイは、各遺伝子のmRNAがどの程度存在するかにより、どの程度遺伝子が使用されているかを測定する。)MAPSプレートでのヌクレアーゼ保護アッセイ(NPA-MAPS)を使用して、8800個の化学化合物を試験して、化合物存在下での細胞の成長が、5個の正常(構造的、“ハウスキーピング”)遺伝子の発現に影響することなく30個の相関的遺伝子のいくつかの発現を減少できるかを見るために試験する。効果を有する化合物は、この種の腫瘍の処置の医薬の開発に将来的に有用であるかも知れない。
RNAを、本質的に実施例14に記載のように、アデノウイルスに感染していない(“コントロール”)または感染1時間後(“感染”)のマウスの肝臓から調製した。肝臓RNAの60μgを各サンプルに使用し、サンプルをデュプリケートで調製した。各アッセイウェルはデュプリケート位置を3組含み、上記の3つの遺伝子に対応する。各位置はアンカーを含み、3つの遺伝子の一つの対応する保護フラグメントに相補的なプローブを含むリンカーに結合する。ヌクレアーゼ保護MAPSアッセイを、本質的に図12に記載のように行い、記載のように画像を集めてスキャンした。3個のmRNA標的の各々に関してデュプリケートのウェルの回収した生データおよびスキャンした強度を示す。スキャン線上の数は、統合強度値および各条件の標準偏差(n=4)である。変化が予期されないハウスキーピング遺伝子、GAPDHは、統計的に有意ではない1.3倍の僅かな増加を感染サンプルで示した。MIP-2およびc-junの転写は各々4および6倍に増加した。これらの発見は、二つの遺伝子、MIP-2およびc-junが、コントロールの構造的発現遺伝子GAPDHと比較して、アデノウイルス感染に反応して促進された反応を示すことを証明する。
キナーゼはタンパク質にリン酸を結合させる酵素である。多くは正常および新生物形成的細胞生育を刺激することが示されている。これ故、特異的キナーゼ(しかし、全てのキナーゼではない)を阻害する化合物は、どのキナーゼが病因に関与するかの試験に使用でき、そしてもしそうなら医薬開発の出発点として働く。例えば、細胞生育の刺激または炎症性反応の調節に関与する5個のチロシンキナーゼはsrc、lck、fyn、Zap70およびyesである。各キナーゼは、チロシンを含む短いペプチドとして、基質が部分的に同定される。キナーゼ種のいくつかは重複し、異なるキナーゼがあるペプチドを、同等に、しかし、他のものが優性にリン酸化し得る。5個のキナーゼに関して、36個のペプチド基質は、特異的および重複特性を示すものを選択する。
SH2ドメインはある成長調節タンパク質で結合サブユニットとして働く。ドメインはリン酸化ホスホチロシン含有タンパク質またはペプチドに不完全な特異性で結合する。即ち、あるホスホチロシンペプチドは1個または数個のSH2タンパク質に特異的に結合するが、他方は多くのSH2タンパク質に広く結合する。
一つの実験における96ウェルからのシグナルの検出を証明するハイスループットMAPSプレートを示す。同じオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを80ウェルの16個の複製で測定した。示されるように、1280個のハイブリダイゼーションアッセイの再現性は非常に高かった。最も左および最も右のカラムは、異なる濃度のオリゴヌクレオチドのシグナルの標準化のためのコントロールとして働く。
更に努力することなく、当業者は、前記を使用して、本発明をその完全な範囲で利用できると考えられる。前記は好ましい具体的態様を記載し、したがって、単に説明的であり、如何なる方法でも明細書の残りの記載を限定しない。
上記および図面で引用した全ての出願、特許および刊行物は、本明細書に引用して包含させる。
Claims (1)
- サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、当該サンプルの添加前に、
a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、
b)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー(これは上記領域それぞれに含まれる)、
c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー(これは、上記オリゴヌクレオチドアンカーのそれぞれと結合する)、
を含む組合せ。
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