CN102046809A - 筛选产生生物活性剂的单细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。

Description

筛选产生生物活性剂的单细胞的方法
发明领域
本发明一般涉及用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。
引言
通常期望筛选产生一种或多种生物活性剂的单细胞或细胞小群体。这样的信息可用于确定细胞暴露于生物活性剂后的状态或活性以确定这些生物活性剂对细胞的作用，所述生物活性剂例如候选药物诸如小分子、蛋白或siRNA。这样的信息还可用于鉴定表达生物活性剂的特定变体例如SNP或抗体的细胞。这样的信息还可用于鉴定编码感兴趣的生物活性剂例如抗体的核酸序列，以利用核苷酸序列在多个细胞中的频率来预测或建模其产生的蛋白的行为或所得的表型。本文的方法、装置和试剂盒是涉及这些和类似的功用。
发明概要
用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。
在实践本发明的方法时，将产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的细胞分离到单独孔中。允许细胞在孔中产生一种或多种生物活性剂，然后将孔中的一种或多种生物活性剂与结合到固体表面的一种或多种结合剂接触。结合剂特异性地结合孔中的一种或多种感兴趣的生物活性剂，然后基于一种或多种感兴趣的生物活性剂与结合剂或与靶结合蛋白的结合确定关于孔中细胞的信息，例如，关于孔中细胞的信号转导途径是活性还是失活的信息。然后将此信息与固体表面的特定寻址区关联从而鉴定特别感兴趣的孔。在本发明一些方面中，向孔提供生物活性剂，从而影响孔中细胞的状态和/或活性。
在本发明一些方面中，该方法还包括获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列，并将关于感兴趣的生物活性剂的结合性质的信息与编码感兴趣的生物活性剂核苷酸序列关联，所述生物活性剂例如构成感兴趣的蛋白的一种或多种多肽。
在本发明一些方面中，仅获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。在这些方面，将产生至少一种感兴趣的生物活性剂的细胞分离到单独孔中，并获得编码一种或多种生物活性剂的核苷酸序列。然后这种数据可用于获得关于感兴趣的生物活性剂的元数据，例如生物活性剂的结合性质、或感兴趣的生物活性剂在被筛选的细胞群中的出现(represented)频率。
因此，本发明提供单独地分析大量细胞的有效方法，而不是分析细胞群体并报告群体的平均测量值。将细胞分离到小微孔中并在其中加工，其中阻滞或封闭了分子在各微孔之间扩散。另外，由于其小的尺寸，每个微孔促进快速反应速率，诸如mRNA杂交或捕获蛋白。而且，捕获到固体基质上的蛋白形成基质上的阵列，其中可一同分析蛋白对固体基质接触的动力学性质，或蛋白与所有捕获的蛋白或复合体共同的标记的亲和配体接触时的动力学性质。
在阅读如下更详细描述的本发明方法和实施方案的细节后，本发明的这些和其它目标、优点和特征对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
结合附图阅读时，最佳地从以下详述理解本发明。重点是，根据一般实践，附图的各个特征不是按比例的。相反，为了清楚，各特征的尺寸是任意放大或缩小的。附图中包括以下图示：
图1是微孔中捕获的B细胞或浆细胞的示意图。
图2是可连同本发明的多孔系统使用的方法的流程图。
图3是mRNA捕获和随后转化为标签cDNA的示意图。
图4描绘用于从抗体-产生细胞捕获mRNA的2种寡核苷酸探针的特征，一种探针是针对小鼠重链(上图)(SEQ ID NO：1)，一种探针是针对小鼠轻链(下图)(SEQ ID NO：2)。401和406是用于被核酸内切酶XhoI从微阵列裂解下合成的cDNA的识别位点。402和406是将用于PCR扩增的引物序列。403和408是增强PCR引物与包含由多个N表示的纠错汉明码的独特14-核苷酸标签(404和409)之间的区分的界标二核苷酸。405是与包括同种型1、2a和2b的小鼠重链mRNA恒定区互补的寡核苷酸(oligo)。此外，410是与小鼠κ轻链mRNA互补的寡核苷酸。为了更好的捕获效率，有间隔子和6个脱氧腺苷残基使得捕获寡核苷酸远离微阵列表面。
图5是可与本发明系统一起使用的多孔托盘部件(1)的一种实施方案的图解视图。孔包括沿着行的索引或地址1-12(2)和沿着列的索引或地址A-H(3)，形成常规96孔托盘。
图6是可与本发明一起使用的多孔托盘盖(top)部件的图解视图。盖4包括基本框架5，并包括盖上的多个区域6。如同图5的多孔托盘1，每个区域6标以索引。如同图5的托盘，各区域沿着行编号为1-12，沿着列编号为A-H。切去部分14-17以提供与例如图7中盖部件的准确对齐。
图7是可与图6的盖部件一起使用的多孔托盘部件的第二实施方案的图解视图。托盘包括框架8，框架8包括多个孔9。托盘包括在每个拐角处向上延伸的槽口10、11、12和13。槽口10-13与图6所示盖的切去部分14、15、16和17配合。以这种方式，盖与托盘可以准确地彼此对齐。
图8是显示在图6的盖的第二实施方案的图解视图，其中盖在每个区域上包含一个突起。托盘盖20包含框架21和在对应图5的孔3的每个区域上包含突起22。在该图所示的实施方案中，每个区域包含单个突起。然而，该区域可包含2、3、4或任何更大数目的突起。
图9是本发明系统的分解图解视图，显示用于将托盘与托盘盖对齐的具体部件。
图10是具有不同设计和结构的微孔601-608的图解视图，当视野不包括所有微孔时其可提供局部可寻址性。
定义
本文所用的生物活性剂是在生物系统中具备活性的任何剂。生物活性剂的实例包括小分子化合物；多肽，如蛋白；siRNA；和寡核苷酸。多种这样的生物活性剂将包括，例如，2种或更多种这样的剂；在一些情况，3种或更多种剂；5种或更多种剂；10种或更多种剂；20种或更多种剂；50种或更多种剂；100种或更多种剂；500种或更多种剂；1000种或更多种剂；5000种或更多种剂；10,000种或更多种剂；30,000种或更多种剂；100,000种或更多种剂；或1,000,000种或更多种这样的剂。
本文所用的术语“标签”是指标明其来源的物理位置的部分。在一些实施方案中，标签可以是寡核苷酸标签，其中寡核苷酸的序列作为标签来标明其来源的物理位置。
本文所用的术语“寡核苷酸”包括具有天然或修饰的单体或键合的线性寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构形式、肽核酸(PNA)和类似物，所述寡核苷酸能够经由单体间相互作用的规则模式特异性地结合靶多核苷酸，所述单体间相互作用诸如Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen型碱基配对、或类似相互作用。通常单体以磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小从数个单体单位如3-4到数十个单体单位如40-60变化的寡核苷酸。无论何时寡核苷酸以字母序列诸如“ATGCCTG”表示时，应理解的是，除非另外指明，否则核苷酸是从左到右以5′.-.3′顺序，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，且“T”表示胸苷。通常本发明的寡核苷酸包括四种天然核苷酸；然而，还可包括非天然核苷酸类似物。对于本领域技术人员清楚的是，当可能采用具有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸，如当需要被酶加工时，通常需要由天然核苷酸组成的寡核苷酸。
提及双链体时的“完全匹配”是指构成双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此形成双链结构以使每条链中的每一个核苷酸与另一条链中的核苷酸进行Watson-Crick碱基配对。该术语还包括可能采用的核苷类似物诸如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷和类似物的配对。提及三链体时，该术语是指三链体由完全匹配的双链体和第三链构成，第三链中的每一个核苷酸与完全匹配的双链体的碱基对进行Hoogsteen或反向Hoogsteen缔合。相反，双链体中标签与寡核苷酸“错配”是指双链体或三链体中的一对核苷酸或三联体不能进行Watson-Crick和/或Hoogsteen和/或反向Hoogsteen成键。
本文所用的“核苷”包括天然核苷，包括2’-脱氧和2’-羟基形式，如由Kornberg和Baker，DNA Replication(DNA复制)，第2版(Freeman，SanFrancisco，1992)所述。提及核苷时的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成的核苷，如由Scheit，Nucleotide Analogs(核苷酸类似物)(John Wiley，New York，1980)；Uhlman和Peyman，ChemicalReviews 90：543-584(1990)或类似文献所述，唯一的前提是其能够特异性杂交。这样的类似物包括设计为增强结合性质、减少复杂性、增加特异性等等的合成的核苷。
术语“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文可互换使用，描述多核苷酸例如多肽的基因的序列。类似地，术语“序列确定”、“确定核苷酸序列”和“确定核酸序列”可互换使用，描述构成多核苷酸的核酸或核苷酸的序列的确定，包括确定多核苷酸的部分以及完整序列信息。即，该术语包括序列比较、指纹分析、和关于靶多核苷酸的类似水平的信息，以及靶多核苷酸中核苷、通常是每种核苷的明确鉴定和顺序。该术语还包括确定靶多核苷酸中四种核苷酸的一种、两种或三种的鉴定、顺序和位置。
本文所用的“表位”是被免疫系统识别，尤其是被抗体、B细胞或T细胞识别的大分子部分。尽管通常认为表位来源于非自身蛋白，来源于宿主的可被识别的序列也分类为表位。被抗体或B细胞识别的大多数表位可认为是抗原分子的三维表面特征；这些特征与抗体精确地配合，因此结合抗体。
本文所用的“杂交”是指其中细胞RNA或单链DNA与具有大致序列互补性的寡核苷酸相互作用的过程，其中在具有序列互补性的所述区域形成双链体。
本文所用的“微孔”是指亚毫米结构，容积在1皮升和500纳升之间。微孔通常构造为允许在平面基质上紧密堆积的形状，即：形状是三角形、矩形或六边形。微孔可通过移去通常在盖上的一个表面而打开，或通过将所述盖放置在接触其它表面而关闭。微孔可以是均质的，或由相异的材料构造，所述材料包括但不限于玻璃、光刻胶或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
本文所用的“互补位”是指抗体识别抗原表位的部分。
本文所用的“phOX”是指4-{[(Z)-(5-氧-2-苯基-1，3-亚噁唑-4(5H)-基)甲基]氨基}丁酸，以化学式C14H12N2O4表示。
本文所用的“旋转异构体”是指低能侧链构象。利用旋转异构体的建成库允许任何人确定或建模结构以尝试最可能的侧链构象，省时并产生最可能正确的结构。即，当然，仅当旋转异构体真正地是正确的低能构象的情况。库以多种方式解决这一质量问题：仅使用非常高分辨率的结构(1.8
Figure BPA00001259378000061
或更好)，利用多个滤器去除其位置可能存疑的侧链，利用观察到的构象的模式而不是平均值(这具有许多益处)，并努力去除系统地不吻合的构象。
本文所用的“突变”是生物体遗传物质的核苷酸序列的改变。突变可由以下导致：遗传物质在细胞分裂期间的复制错误，暴露于紫外线或电离辐射、化学诱变剂或病毒，或可在诸如高突变等过程期间在细胞控制下故意地发生。在多细胞生物体中，突变可细分为种系突变和本文所用的“体细胞突变”，种系突变可传递给后代，体细胞突变不能传递给动物后代。B细胞在亲和性成熟过程中经历体细胞突变。
为了能够进行其生物功能，蛋白折叠为一种或多种具体空间构象，这是由多种非共价相互作用诸如氢键、离子相互作用、范德华力和疏水堆积驱动的。本文所用的“结构”是指蛋白结构的四种不同方面：a)一级结构是肽链的氨基酸序列，b)二级结构是高度规则的亚结构(α螺旋和β折叠链)，这是局部界定的，表示在单个蛋白分子中可存在许多不同二级基序，c)三级结构是单个蛋白分子的三维结构；二级结构的空间排列，和d)四级结构是多种在本文通常称为蛋白亚基的蛋白分子或多肽链的复合体，蛋白亚基的功能是作为更大的装配体或蛋白复合体的部分。
本文所用的蛋白是氨基酸以线性链排列而构成的有机化合物，并由相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起。蛋白可包括氨基酸的单个多肽链或氨基酸的多个多肽链，例如，由二硫键结合在一起的多个多肽，如抗体。本文所用的“蛋白复合体”是由蛋白-蛋白相互作用形成的一组两个或多个缔合的蛋白。蛋白复合体是一种形式的四级结构。随着时间稳定的蛋白复合体在本文称为“顺式蛋白复合体”。瞬时的蛋白复合体在本文称为“反式蛋白复合体”。本发明涉及顺式和反式蛋白复合体二者。
本文所用的“动力学特征”是指在顺式和/或反式蛋白复合体之间的反应速率koff、kon和其比例KD。对于双元蛋白复合体，解离常数KD与Gibbs自由能单调相关，Gibbs自由能描述从等温、等压过程、与活系统紧密接近的条件可获得的结果。
本文所用的“靶结合蛋白”或“靶蛋白”是感兴趣的生物活性剂结合的蛋白。靶结合蛋白可以是通常结合感兴趣的生物活性剂的蛋白；例如细胞因子，其中感兴趣的生物活性剂是受体；或抗原，其中感兴趣的生物活性剂是抗体。可选地，靶结合蛋白可以是通常不结合感兴趣的生物活性剂的蛋白；例如，对照细胞因子。
本文所用的“结合剂”或“捕获剂”是用于固定生物活性剂的分子。捕获剂可以是寡核苷酸、DNA、RNA、蛋白、小分子、肽、适体等等，其对各自的天然或人工配体具有亲和性。
本文所用的固体表面或固体表面是任何种类的表面或支持物。其可以由玻璃、塑料、硝化纤维素、聚偏氟乙烯或其它高度非反应性材料制成。可能附加结合/捕获剂，在这种情况下，结合/捕获剂可以包被固体表面，或结合/捕获剂可被包含在固体表面上离散位置，例如布为点，或局限在垫中，或成形为线。
术语“单克隆抗体”是指选自不同抗体混合物的抗体。相同特异性的所有单克隆抗体是相同的，除了其天然突变体。本文所用的术语“抗体”理解为表示免疫球蛋白的完整分子以及其片段(Fab、F(ab’)、Fv、scFv)。
本文所用的“配体”是能够结合生物分子并与其形成复合体以起到生物目的的物质。
本文所用的术语“B细胞”是指在骨髓中发育并高度特异化以产生免疫球蛋白和抗体的免疫细胞。B细胞是来源于骨髓的淋巴细胞，并提供体液免疫。B细胞识别溶液中的抗原分子并成熟为浆细胞。因此，当本文使用术语“B细胞”时，意为包括从B细胞发育的细胞诸如浆细胞。
术语“浆细胞”意为指反应于特定抗原从B淋巴细胞发育来的细胞。浆细胞见于骨髓和血液中。浆细胞还可称为浆B细胞或浆细胞(plasmocyte)，是免疫系统中分泌大量抗体的细胞。在被CD4+淋巴细胞刺激时从B细胞分化浆细胞。浆细胞是一种类型的白血细胞，其产生抗体并来源于抗原特异性B细胞。在本申请中，术语“B细胞”意为涵盖“浆细胞”且反之亦然。总之这两者都意为涵盖是指产生感兴趣的抗体的细胞的术语。
生物活性剂的特征为其对指定靶生物活性剂例如蛋白的“结合亲和性”。例如，抗体的特征为其对结合位点或表位的亲和性。每一种抗体包含特定3维结构的氨基酸，其结合称为表位或抗原的另一结构。
抗体对其抗原的结合是简单的双分子、可逆反应。如果抗体以Ab表示，抗原以Ag表示，可由标准动力学理论分析反应。假设单个结合位点，反应以以下等式I表示：
Figure BPA00001259378000081
其中Ag-Ab是结合的复合体。正向和反向结合反应分别以速率常数k1和k2表示。抗体与抗原的“结合亲和性”由平衡时复合的反应物与自由反应物的比例来测量。平衡时反应物浓度越低，抗体对抗原的结合亲和性越高。在免疫学领域，结合亲和性以“亲和性常数”表示，其由符号“K”代表，或有时称为“Ka”。“K”由以下等式II定义：
II . K = [ Ag - Ab ] [ Ag ] [ Ab ] = k 1 k 2
其中括号表示以摩尔/升或升/摩尔计的浓度。
还称为“K”的结合亲和性Ka的典型值是“亲和性常数”，对于典型抗体在从约105到约1011升/摩尔的范围中。Ka是填充在抗原溶液中存在的抗体的一半结合位点所需的自由抗原浓度。如果以升/摩尔测量，更高的Ka(如1011)或更高的亲和性常数表示大体积的溶剂、非常稀浓度的自由抗原，如此表示抗体具有对表位的高结合亲和性。
如果Ka以摩尔/升测量，低Ka(如10-11)表示占据一半抗体结合位点所需的自由抗原的较低浓度溶液，如此表示高结合亲和性。
为了测量Ka达到平衡。更具体地，当结合到抗原的抗体浓度[Ag-Ab]等于抗体浓度[Ab]时测量Ka。因此，[Ag-Ab]除以[Ab]等于1。如此，以上等式II可分解为以下等式III：
III . K = 1 [ Ag ]
等式III中，K的单位是升/摩尔。以升/摩尔计的典型值在从约105到约1011升/摩尔的范围中。
以上等式的倒数是K＝[Ag]，其中K的单位是摩尔/升，典型值在10-11到10-5摩尔/升的范围中。
以上显示，典型结合亲和性可变化六个数量级。因此，可能被认为是有用抗体的抗体可具有与可能被认为是不同抗体的抗体相比大100,000倍的结合亲和性，而不同抗体也被认为是有用的。
基于上述，应理解的是，抗体对抗原的结合特征可利用免疫学领域充分定义的术语和方法来定义。可以精确地确定抗体的结合亲和性或“K”。
本领域技术人员应理解，高程度的结合亲和性不必然转化成高度有效的药物。因此，当获得候选药物时，可检验显示宽范围结合亲和性的候选药物以确定其是否获得期望的生物化学/生理学响应。尽管结合亲和性是重要的，一些具有高结合亲和性的候选药物不是有效药物，而一些具有低结合亲和性的候选药物是有效药物。
术语“元数据”用来描述“关于其它数据的数据”。一项元数据可能描述单独数据、或内容项目、或包括多个内容项目和分级水平的数据集合，例如数据库概要。本文所用的元数据是定义性数据，提供关于或记载利用本发明的过程中获得的其它数据的信息。例如，元数据记载关于数据元素或属性(名称、大小、数据类型等等)的数据、和关于记录或数据结构(长度、字段、数组等等)的数据、和关于数据(位于何处、如何关联、所有权等等)的数据。元数据可包括关于环境、质量和条件的描述性信息、或数据特征。例如，元数据可以是关于具体抗体在细胞群体中的出现频率的数据，如通过获得关于群体中被多个单独细胞表达的抗体序列的数据来确定的。
发明详述
提供了用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。
进一步描述本发明之前，应理解的是本发明不限于描述的具体方法和装置，因为这些当然都是可以变化的。还应理解的是，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不意为限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求书限制。
当提供值的范围时，应理解的是，还具体地公开了上限值与下限值之间的每个中间值，除非上下文另外清楚地指明，否则到下限值单位的十分之一。在指定范围中任何指定值或中间值与在该指定范围中任何其它指定值或中间值之间的每个较小范围也被本发明涵盖。这些较小范围的上限值和下限值可能独立地被该范围包括或排除，且其中两个限值的任一、无一或二者被较小范围包括的每个范围也被本发明涵盖，受限于指定范围中任何具体地排除的限值。当指定范围包括限值之一或二者时，排除包括的限值的任一或二者的范围也被本发明包括。
除非另外指明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料可用于实践或检验本发明，现在描述一些可能和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与出版物一起提及的方法和/或材料。本申请涉及2009年4月3日与其一起提交的两个其它申请，这两个申请的代理人案号是SCTI-0001和SCTI-0002，这两个相关申请通过引用全文并入本文。应理解的是，当本公开与并入的出版物的任何公开冲突时，以本公开为准。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用的，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括多数指代物。因此，例如提及“一个细胞或序列”可包括多个这样的细胞或序列，提及“该孔或地址”可包括提及一种或多种孔或地址和本领域技术人员已知的其等价物，等等。
本文讨论的出版物仅因为其在本申请提交日之前公开而提供。本文的任何内容不解释为承认本发明不够资格借助在先发明而先于这样的出版物。而且，提供的出版物的日期可能不同于实际的出版物日期，实际的出版物日期可能需要独立地证实。
如以上概述的，提供了用于筛选产生感兴趣的生物活性剂的单细胞，和任选地用于获得编码这些生物活性剂的核苷酸序列的方法、装置和试剂盒。进一步描述本发明时，首先描述所述方法，然后是用于实践所述方法的装置和试剂盒的综述。
抗体实施方案
本发明方法的一个实施方案包括从多个分离细胞获得信息的方法。通过将大量细胞放置在单独孔中，可从大量细胞同时获得信息。试图在单个孔中包含一个单细胞。然而，当进行牵涉数百、数千或甚至数万细胞和孔的方法时，可能一些孔不包含细胞而其它孔包含多于一个细胞。
本发明的方法可开始于免疫动物并从该动物提取产生抗体的细胞。然而，该方法可开始于已被提取的细胞，并将细胞放置在孔托盘的孔中。本领域技术人员将认识到，本发明的方法可以多种不同方式进行。在一个实施方案中，使用包括微孔的孔托盘。微孔具有足以容纳单细胞和足以在细胞产生抗体的有限时间段期间支持细胞的液体营养的容积。本领域技术人员将认识到，期望将单细胞放置在每个微孔中。然而，当实际进行此方法时，一些孔将不包含细胞而一些孔包含两个或更多个细胞。尽管这可限制本发明的效果，但当仅有小百分比的微孔包含单细胞时可进行本发明，如仅1％、5％、10％、50％或更多细胞包含单细胞而其余孔不包含细胞或包含多个细胞，即2个或更多个细胞。期望的是非常高百分比，70％或更多、80％或更多、90％或更多、或95％或更多的孔包含单细胞并仅包含一个单细胞。这使得利用所有孔并特异性地将孔中产生的抗体与一个单细胞关联成为可能。本领域技术人员还将认识到，虽然期望所有细胞产生抗体，一些细胞可能不产生抗体或可能产生的抗体量不足以被检测。当相对少量的细胞实际上产生抗体时可进行本发明。例如，可能孔中只有1％、5％、10％或50％的细胞实际上以可检测的量产生抗体(或其它生物活性分子)，虽然期望获得高百分比的产生抗体的细胞，如放置在孔中的70％或更多、80％或更多、90％或更多、或95％或更多的细胞产生抗体(或其它生物活性分子)。包含产生抗体的单细胞的孔越多，本发明方法的效力越大。
期望表面的每个区或区域具有在该区结合至其表面的结合剂诸如抗体结合剂，诸如蛋白A。然而，当相对小百分比的这些区域具有结合至其表面的蛋白结合剂时可进行本发明。例如，可以表面上仅1％、5％、10％、50％或更多的区域具有与其结合的结合剂操作本发明。期望高百分比，70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或优选地100％的区域在对应孔或微孔的区域具有结合的结合剂。以类似方式，微孔可具有结合至其表面的多核苷酸序列，诸如特异性地结合编码感兴趣的抗体或其它蛋白的部分的多核苷酸序列的序列。期望所有微孔具有结合至表面的多核苷酸。然而，当仅少量孔，如1％、5％、10％或更多微孔具有结合至其表面的多核苷酸时可操作本发明。优选地，当利用本发明的此实施方案时，高百分比的微孔，如70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、或更优选地100％的微孔具有结合至其表面的多核苷酸序列。
细胞是诸如B细胞或浆细胞等产生抗体的细胞，在孔中产生的抗体与诸如蛋白A等结合剂接触，结合剂结合至可为膜的表面。该表面可具有多个可寻址区或将包括可特异性地与单独孔关联的区。孔可以在孔托盘中，孔托盘具有100或更多孔/cm2或1,000或更多孔/cm2的孔密度，孔可包括可检测标志物，使得可能确定特定孔相对其它孔的位置，标志物可以是标志物细胞或一组标志物，可包括染料、核苷酸序列、放射性标记或量子点。
将孔中抗体接触结合剂后，进行一个过程以确定关于结合至表面的抗体与优选地为特定已知抗原的抗原的结合的结合信息，以确定诸如抗体与该抗原的结合亲和性等信息。然后将关于表面上特定区域的结合信息与其中获得抗体的特定孔关联。因此，可能同时从大量不同孔获得关于大量不同抗体的信息，并将抗体与从其获得抗体的孔关联。
确定感兴趣的表面的区域上的具体抗体并将这些与感兴趣的孔关联后，可能从具体孔获得特定多核苷酸信息，该信息通常是关于从具体感兴趣的孔获得的信使RNA的序列信息。可将孔中的信使RNA与选择性地结合编码抗体的序列诸如编码抗体轻链和重链等序列的序列结合来获得信使RNA。
可将获得的信使RNA转化为cDNA。cDNA可包含对特别感兴趣的孔特异性的标签。标签可用于将关于特别感兴趣的抗体的结合信息与来自特别感兴趣的孔的信使RNA关联。以下参考附图进一步详细描述本发明。
一般实施方案
实践本发明方法时，将产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的细胞分离到单独孔中。在一些实施方案中，每个孔中的细胞大体上相同，例如，来自培养细胞系的细胞、来自原代细胞制品的细胞、或工程化细胞。在其它实施方案中，每个孔中的细胞不同，即，它们可以是不同来源或具有使得它们彼此不同的遗传差异，如浆细胞，或来自相同人类受治疗者的不同细胞种类，或来自不同人类受治疗者的相同细胞种类。在一些实施方案中，每孔放置仅一个细胞。在其它实施方案中，每孔放置多个细胞。通常，包含2个或更多细胞的微孔数目除以包含单细胞的微孔数目的比例小于20％。
允许细胞在孔中产生一种或多种生物活性剂，然后将孔中的一种或多种生物活性剂与附加到固体表面的一种或多种结合剂接触。在一些实施方案中，附加到固体表面的结合剂对所有孔相同。在一些实施方案中，附加到固体的结合剂对不同孔不同。结合剂的实例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、抗IgG Fcγ亚类特异性抗体、和所述细胞产生的所述至少一种生物活性剂的靶蛋白。这些结合剂附加到的固体表面可由玻璃、塑料、硝化纤维素、聚偏氟乙烯或其它高度非反应性材料制成，并包括可寻址区，以使每个地址与包含产生感兴趣的生物活性剂的细胞的单独孔之一特异性地相关。
固体表面上的结合剂特异性地结合孔中细胞产生的一种或多种感兴趣的生物活性剂，从而“捕获”感兴趣的生物活性剂。然后可基于一种或多种感兴趣的生物活性剂对结合剂本身的结合确定关于细胞的信息。例如，孔中存在或不存在生物活性剂可通过存在或不存在对固体表面上结合剂的结合来确定，其中生物活性剂的存在/不存在表示孔的细胞中信号转导途径是否已被活化/失活。可选地，关于细胞的信息可基于捕获的一种或多种感兴趣的生物活性剂对随后提供的靶结合蛋白的结合来确定。例如，捕获的生物活性剂对靶蛋白的结合亲和性可通过利用固体表面上处于其被捕获状态的生物活性剂的亲和性研究来确定，其中捕获的生物活性剂对靶蛋白的特定亲和性表示产生生物活性剂的细胞是感兴趣的细胞。然后将该信息与固体表面的特定寻址区关联从而鉴定特别感兴趣的孔。
为了寻址固体表面上的区以使其与包含感兴趣的细胞的孔对准，并为了提供其对结合剂的结合是已知的且可与其比较实验样品的生物活性剂，可能期望将带有已知标记的生物活性复合体的标志物细胞包括到所研究的细胞群中。标志物细胞将是任选地能够表达抗体的细胞，例如杂交瘤。这样的细胞系被保藏并描述在文献中，容易获得。以带有不同荧光团的抗原染色这些细胞以使其在微孔中可被鉴定，或遗传改造这些细胞来表达可被追踪的荧光标签。同样地，可将抗体捕获到固体表面上并用带有不同染料的适当抗原染色来鉴定其在固体表面上的位置。如此，标志物细胞在微阵列载玻片上的位置可用作界标以寻址固体表面上的区。然后可基于其相对于标志物细胞的位置和其产生的抗体，匹配捕获在固体表面上的其它细胞的生物活性剂。
在一些实施方案中，向孔中细胞提供生物活性剂，例如小分子化合物、iRNA、蛋白或寡核苷酸。在一些实施方案中，在每个孔中提供的生物活性剂相同。因此，可检验提供的一种生物活性剂对多种细胞类型或对多个信号转导途径的影响。在其它实施方案中，在每个孔中提供的生物活性剂不同。因此，可检验提供的多个生物活性剂对单个细胞类型或对单个信号转导途径的影响。
在本发明一些方面中，方法还包括获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列，所述生物活性剂例如多肽或多种多肽，如果感兴趣的生物活性剂是多肽复合体，并将关于感兴趣的生物活性剂的结合性质的信息与编码感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列关联。例如，核苷酸序列可通过从细胞获得mRNA，从mRNA合成cDNA和对cDNA测序来获得。
在一些实施方案中，获得编码所选孔中感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。在其它实施方案中，同时确定所有孔中的所有细胞产生的感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。在这些实施方案中，向孔提供孔特异性标签如寡核苷酸标签，并且获得编码至少一种生物活性剂的核苷酸序列包括在合成cDNA时将孔特异性标签掺入其中，汇集所有cDNA，并由超高通量DNA测序技术将汇集的cDNA测序以确定每个来源细胞中至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。寡核苷酸可在将细胞放置在孔中之前提供于孔。可选地，寡核苷酸可在将细胞放置在孔中同时或之后提供于孔。通常，寡核苷酸在将细胞放置在孔中之前附加到微孔的内部表面。寡核苷酸可为长至少约10个核苷酸，长至少约15个核苷酸；长至少约20个核苷酸；长至少约25个核苷酸；长至少约30个核苷酸；长至少约40个核苷酸；长至少约50个核苷酸；长至少约60个核苷酸；长至少约70个核苷酸；长至少约80个核苷酸；长至少约90个核苷酸；通常，具有与编码生物活性剂的mRNA互补的少于100个核苷酸。寡核苷酸可包含同一微孔中所有相同寡核苷酸共同的一个或多个独特标签。
在测序过程期间，将标出微孔的标签转化为DNA序列形式的数字标签，然后其可用于将核苷酸序列与特定孔关联(并互相关联，如果多于一种感兴趣的生物活性剂被从孔测序，如蛋白复合体、如抗体的重链和轻链)，并因此与膜的特定寻址区关联。因此，可将关于感兴趣的生物活性剂的结合性质的信息与编码感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列关联。
如上所述，为了寻址固体表面上的区以使其与包含感兴趣的细胞的孔对准，并为了提供其对结合剂的结合是已知的且可与其比较实验样品的生物活性剂，可能期望将带有已知标记的生物活性剂的标志物细胞包括到所研究的细胞群中，例如，任选地能够表达重链和轻链二者的序列信息已知的抗体的杂交瘤细胞系。可以用被不同荧光团标记的抗原染色这些细胞，或遗传这些改造细胞来表达荧光标志物以使其在微孔中可被鉴定。同样，阵列上捕获的抗体可以带有不同染料的适当抗原染色以鉴定其在固体表面上的位置。最后，对标志物细胞的mRNA进行加工和测序以使DNA序列加上数字标签将阳性地鉴定标志物细胞在捕获微阵列载玻片上的位置。如此，标志物细胞在微阵列载玻片上的位置可与固体表面上的匹配。阵列中其它细胞的mRNA和蛋白可基于其相对于标志物细胞、其mRNA和抗体的位置匹配。这些标志物细胞还可用于提供决定性结合亲和性，可与其比较多种生物活性剂的结合亲和性。
在本发明一些方面中，仅获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。在这些方面，采用该数据以获得关于感兴趣的生物活性剂的元数据。例如，基于核苷酸序列，然后可获得关于生物活性剂的结合性质的元数据，并预测理想的生物活性剂。类似地，可获得关于感兴趣的生物活性剂被群体中细胞表达的频率的元数据，其可用于预测生物体对该生物活性剂的偏好。
在本发明一些方面中，可测量可被细胞产生感兴趣的生物活性剂或提供的生物活性剂的存在影响的其它细胞特征。这样的细胞特征可包括，例如，细胞形态学、膜电位、表面标志物表达、分泌或胞内标志物表达。可如下测量这样的特征：通过捕获孔中沉积的细胞的计算机图像并分析这些图像的各种参数，例如，形状、颜色、不透明和大小。然后利用每个孔的位置，将这些参数与细胞产生的生物活性剂的结合亲和性和/或编码这些生物活性剂的核苷酸序列关联。
本发明提供单独地分析大量细胞的有效方法，而不是分析细胞群体并报告群体的平均测量值。该方法可用于同时筛选数百、数千、数万、数十万、数百万或更多细胞。该方法可用于a)将感兴趣的生物活性剂按照亲和性分级，b)过滤DNA序列数据从而去除污染或无关细胞不考虑，c)基于产生生物活性剂的量将细胞类型分类，或d)测量产生类似感兴趣的生物活性剂的细胞的频率。
本发明可用在药物筛选领域。在这样的情况，将待筛选的用于调节细胞信号转导途径的多种生物活性剂如小分子化合物、抗体或siRNA提供于多孔装置中的多个微孔，其中每个微孔包括不同生物活性剂。大体上向每个孔提供类似细胞并允许产生感兴趣的生物活性剂如蛋白，其表达将预测被筛选的生物活性剂的效力。将孔中细胞产生的感兴趣的生物活性剂与已知与生物活性剂结合的结合剂如蛋白接触，该结合剂反过来附加到固体表面，如多孔装置的盖(lid)。如果细胞产生感兴趣的生物活性剂，其被结合剂在寻址的位置捕获。然后由ELISA或其它这样的结合测定检验固体表面是否存在生物活性剂。然后将关于生物活性剂存在/不存在的信息与固体表面上特定寻址区关联，反过来将特定寻址区与多孔板中的孔关联。如此，可筛选多种生物活性剂以确定其调节细胞信号转导途径的效力。
本发明还可用在网络药理学领域。在这样的情况，筛选一种或多种生物活性剂，如小分子化合物、抗体或siRNA以确定其对多个细胞信号转导途径的作用。例如，向多孔装置中的多个微孔提供单个生物活性剂。大体上向每个孔提供类似细胞并允许产生感兴趣的生物活性剂如蛋白，其产生将预测生物活性剂对多个信号转导途径的影响。将孔中细胞产生的感兴趣的生物活性剂与已知与生物活性剂结合的多种结合剂如蛋白接触，该结合剂反过来布点到固体表面，如多孔装置的盖，其中每种结合剂布点在固体表面上与孔关联的区域。如果细胞产生感兴趣的生物活性剂，感兴趣的生物活性剂被结合剂在寻址的位置捕获。然后例如通过利用微阵列扫描仪上的多谱荧光检测检验固体表面上细胞产生的生物活性剂的存在/不存在以鉴定不同结合剂(如每个以不同着色的荧光团标记)，并对在每个结合剂捕获的生物活性剂的量定量。然后关于生物活性剂存在/不存在的信息可用于确定细胞状态和细胞信号转导途径的活性水平。如此，可筛选单种生物活性剂以确定其调节多个细胞信号转导途径的效力。注意，还可以这种方式筛选生物活性剂组合对途径网络的作用。在这样的情况，在每个孔中可提供多于一种生物活性剂，或可单独地向每个孔和组合地向单个孔提供生物活性剂。
本发明还可用于鉴定感兴趣的蛋白变体。例如，在生物标志物发现领域，鉴定可预测对疾病增加/减少的易感性，或对治疗增加/减少的敏感性的新型单核苷酸多态性(SNP)。在这样的情况，生物活性剂如蛋白、和其突变体通常已与对疾病增加/减少的易感性或对治疗增加/减少的敏感性相关。在这样的情况，将来自不同人类受治疗者的细胞放置在多个孔中，其中来自不同受治疗者的细胞在不同孔中，允许细胞产生感兴趣的蛋白。将孔中感兴趣的蛋白与已知与感兴趣的蛋白结合的结合剂如蛋白接触，该结合剂反过来结合至固体表面，如多孔装置的盖。感兴趣的蛋白被结合剂在寻址位置捕获，除非感兴趣的蛋白包括突变如SNP，这将影响感兴趣的蛋白对结合剂结合的效力。然后由ELISA或其它这样的结合测定检验固体表面的感兴趣的蛋白，以确定感兴趣的蛋白对固体表面上结合剂结合的效力。然后将关于感兴趣的蛋白的结合效力的信息与固体表面上特定寻址区关联，反过来将特定寻址区与多孔板中的孔关联。
同时，如下确定每个孔中感兴趣的蛋白的核苷酸序列：通过从孔中细胞制备mRNA，合成cDNA并对cDNA测序。如下对cDNA一同测序：通过向每个孔提供独特寡核苷酸，在合成时将独特寡核苷酸掺入cDNA，之后汇集cDNA，并由超高通量DNA测序技术测序以确定每个来源细胞中至少一种感兴趣的蛋白的核苷酸序列。在测序过程期间，将标出微孔的标签转化为DNA序列形式的数字标签，然后其可用于将核苷酸序列与特定孔关联(并互相关联，如果多于一种感兴趣的蛋白被从孔测序，或蛋白包括多种多肽，例如参见以下)，并因此与固体表面的特定寻址区关联。因此，可同时筛选感兴趣的蛋白的多种变体，可将关于这些变体的结合性质的信息与编码这些天然产生的变体的核苷酸序列关联。这一信息与关于受治疗者对疾病的易感性和/或对治疗的敏感性的数据的关联可用于鉴定新型预测性和预后的生物标志物。
应注意的是，在一些情况，感兴趣的蛋白变体可包括单个多肽。在其它情况，感兴趣的蛋白变体是从同一确切细胞产生的多肽的复合体，即，顺式复合体，其中多肽的复合对蛋白如抗体赋予结合性质。在又其它情况，感兴趣的蛋白变体可为蛋白复合体，即，反式复合体，其中蛋白的复合对复合体的一种蛋白或甚至复合体整体赋予结合性质。例如，负责信号转导的许多细胞表面受体具备经由非共价键与其它受体形成复合体的能力。本发明还可用于基于逐个细胞的基础检查这些蛋白复合体的结合性质，从而鉴定影响这些复合体形成的定性变化诸如剪接变体。例如，可进行正常细胞与癌细胞之间逐个细胞的比较。如果捕获了相关蛋白，可以受体的标记的配体进行类似分析以基于每个细胞的基础理解这些复合体的结合特征，以及基于每个细胞的基础定量受体和鉴定不同组合。可将所有这些信息片与观察到的细胞的上述特征关联，包括细胞产生的生物活性剂的结合特征和生物活性剂编码的核苷酸序列。可进行细胞和其信号转导机制的高容量分析。
其中感兴趣的生物活性剂是多肽复合体的领域的一个实例是抗体发现领域。例如，本发明可用于筛选细胞以鉴定产生对抗原具有更高亲和性或亲和力的抗体的细胞和确定编码这些抗体的结合结构域的核苷酸序列。在这样的情况，将B细胞如浆细胞放置在多个孔中，其中每个浆细胞放置在不同孔中，允许细胞产生抗体。将孔中细胞产生的抗体与结合剂如蛋白G、蛋白A、蛋白L、蛋白A/G接触，该结合剂结合至固体表面如多孔装置的盖，以使抗体被普遍和特异性地结合。然后由多种已知结合测定如ELISA的任一种检验捕获的抗体以确定其对靶蛋白即抗原的亲和性和/或亲和力。然后将关于抗体结合效力的信息与固体表面的特定寻址区关联，特定寻址区反过来与多孔板中的孔关联。
同时，如下确定抗体重链和轻链的核苷酸序列：通过从孔中细胞制备RNA，合成cDNA并对cDNA测序。对于一同测序，向孔提供每个孔独特的寡核苷酸，在合成时将寡核苷酸掺入cDNA，之后汇集cDNA，并由超高通量DNA测序技术测序以确定每个浆细胞产生的抗体的核苷酸序列。在测序过程期间，将标出微孔的标签转化为DNA序列形式的数字标签，其用于将重链和轻链的核苷酸序列与特定孔关联以及互相关联，并因此与膜的特定寻址区关联。因此，可将关于特定孔中特定细胞产生的抗体的结合性质的信息与编码这些抗体的核苷酸序列关联。这样的信息可用于工程化具有对抗原的更好亲和性/亲和力的抗体。
可选地，本发明可用于独立于利用固体表面元件来检验抗体结合亲和性而获得重链和轻链的核苷酸序列，和由于免疫应答期间克隆选择的现象，给定抗体序列的出现频率用于估计抗体的KD。可将这一估计的KD与从捕获的抗体获得的测量值关联。这一方向的分析可帮助理解体内亲和性成熟过程，并最终指导体外增加抗体的亲和性的集中和更有效的工作。
由于给定抗体重链和轻链组合有可获得的大量序列，利用突变位置和测量的平衡常数以推断抗体上互补位的关键氨基酸残基变得可能。本发明还可用于这些研究，因为其提供了获得大的群体中单细胞编码的蛋白的核苷酸序列。
随着鉴定了关键氨基酸残基，推断表位和抗原上推断表位周围的结构也变得可能。本发明估计了抗体的自由结合能和推断的蛋白折叠。随着对每个抗体鉴定了可能的表位，这提供了将对靶抗原获得的抗体分类的另一原则。快速鉴定各针对抗原上不同表位的抗体组的能力是本发明的一个益处。由于回收了大量不同抗体，这减少了所需的验证试验的数目。当鉴定的表位密度变得足够高时，解密抗原上鉴定的表位局部的结构可导致充分地理解抗原的总体结构。这个结果也是空前的。这些都因为这样的事实：可利用本发明快速回收大量抗体。
尽管获得具有最高KD和最低Koff的抗体的目标与药物开发一致，本发明可用于通过从免疫后任一天获取产生抗体的细胞诸如浆细胞和/或抗原特异性B细胞来跟踪免疫应答。此外，本发明可用于监测免疫系统的状态，这是通过对B细胞群绘制图谱而不从小鼠脾中选择或甚至对人类受治疗者循环中的那些B细胞绘制图谱。这在研究自体免疫疾病和发现生物标志物或可能的药物靶中可以特别有用。无疑，可以类似方式分析具有类似抗体的结构的T细胞受体以研究免疫功能。因此，本发明具有很多可能的用途，但主要应用可能是分析细胞群体中多态性的基因组合，诸如Ig或T细胞受体或分泌的抗体的重排基因。
类似于噬菌体展示技术，本发明可用于在许多展示技术诸如酵母展示、细菌展示和哺乳动物展示中筛选构建体。候选的展示克隆可通过类似以流式细胞术选择抗原特异性B细胞的方式从文库富集。富集后，这些展示克隆可如同抗原特异性B细胞那样分离到微孔中，并以非常类似的方式加工。必须进行捕获顺序的改变以适于所用的展示技术。然而，不同于这些展示技术中的许多技术，如果展示克隆表达的蛋白如以下实施方案1或实施方案2所述地捕获，可更快地加工候选物并可一同表征其结合性质。
还应注意的是，本发明还可用于检查可被细胞产生的蛋白变体影响的其它细胞特征，例如，细胞形态、膜电位、表面标志物表达、分泌或胞内标志物表达。因此，人们可基于每个细胞的基础记录这些细胞特征，然后将这些特征与细胞产生的生物活性剂的结合特征和/或编码生物活性剂的核苷酸序列关联。举一个例子，单独细胞的形态可用作细胞的肿瘤发生能力的量值，将这些结果与核酸测序关联以评价蛋白变体或基因拷贝数从而证实诊断并减少假阳性。当采用细胞或表面结合抗体的荧光测量值时，微阵列读数器产生其中各像素的强度与特定孔中细胞表面标志物或表面结合抗体的浓度必须关联的图像。为了确保证实的细胞、捕获的mRNA、和任选地捕获的蛋白之间的适当对准，可再次期望将具有已知顺式蛋白复合体的标志物细胞包括到所研究的细胞群中。
进一步描述本发明的各方面时，以下描述集中在筛选表达以期望亲和性结合特定抗原的抗体的单细胞，和/或获得编码这些抗体重链和轻链的核苷酸序列。然而，本发明方法和其装置还可用于对单细胞进行可用于获取关于这些细胞的状态和活性的信息的其它生物活性剂的筛选。
例如，将浆细胞102悬浮在微孔101的充满整个微孔的缓冲溶液中。微孔101可具有50微米×50微米×50微米的尺寸。尺寸105测量为从微孔101的底部到盖0至50微米。从一侧到对侧的尺寸范围为从-25微米至25微米。DNA寡核苷酸附加在微孔101下表面的连续区域，称为垫。垫103包含与浆细胞102编码抗体重链的mRNA中的不变序列互补的寡核苷酸。垫104包含与浆细胞102编码抗体轻链的mRNA中不变序列互补的寡核苷酸。选择所述不变序列以使当互补mRNA从浆细胞102释放并扩散到可以是微孔101中细胞培养溶液的溶液中时，所述不变序列强烈和实际上捕获所述mRNA。尽管微孔101将以任何方向正确地起作用，为了示意，图1中垫103和垫104显示为附加到微孔101的底部。
在以下具体实施方案中，细胞产生的感兴趣的生物活性剂是宿主中细胞作为对抗原免疫应答而产生的抗体。在实施方案1和实施方案2中，确定编码每个浆细胞产生的每个抗体重链和轻链的核苷酸序列，捕获每个浆细胞产生的抗体以形成与微孔对准的寻址阵列，在微孔中各自限制原始浆细胞。以不同浓度使用荧光标记的抗原制品以询问在每个点捕获的抗体，以使测量解离常数(koff)和平衡常数(KD)二者。缔合常数来源于koff和KD二者。这样的动力学结合性质对于将利用本发明获得的抗体分级尤其有价值，因为回收了大量抗体，期望将其分类的手段。此外，如果利用流式细胞术不足够富集抗原特异性B细胞，这些测量值用于过滤出来源于污染性非B细胞或非抗原特异性B细胞的数据。
在实施方案3和实施方案4中，这一生物系统用于示意本发明如何可用于确定编码顺式蛋白复合体的两种组成大分子的核苷酸序列，其中每种组成(重链和轻链)的两个拷贝由多个共价键保持在一起。在这种情况，在免疫应答期间产生的每个浆细胞中每个抗体重链和轻链有多态性差异。通过实践本发明，可对分析的每个浆细胞确定抗体重链和轻链的一级结构的组合。由于这样的组合确保抗体的细致特异性，知道一级结构即，氨基酸序列时，允许人们通过以下遗传改造抗体：通过基于抗体重链和轻链组合的一级结构的知识合成适当构建体，并通过将这样的构建体输入到适当表达系统中以无限供应抗体，这在包括研究、诊断和治疗的多种领域中有广泛应用。
尽管讨论集中在小鼠抗体上，很明显本发明可应用于具有产生体液免疫应答能力的动物产生的抗体。在本发明的一方面，实践本发明的一个先决条件是已知给定同种型抗体重链和轻链mRNA的恒定区序列。因为本发明从产生抗体的细胞诸如B细胞直接获得mRNA和蛋白，清楚地排除了融合细胞来产生杂交瘤细胞的需要。
尽管在所示意的实施例中仅小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b同种型重链保守序列和κ轻链序列用于捕获小鼠抗体mRNA，这代表一个实施方案而不是限制本发明。利用布点的微阵列完全在本发明范围内，其中可附加包含适当序列的寡核苷酸探针混合物并用于捕获所有同种型。
在实施方案之一中，所研究的蛋白复合体可以是抗体的重链和轻链。在这种情况，整合结构信息与动力学特征提供了对抗体上互补位以及抗原上表位的洞察。为了示意本发明的这一效用，以针对半抗原2-苯基-5-唑酮(phOX)的抗体进行模拟。
实施方案1
可通过将高50微米(±25％)的壁附加到扁平支持物上并在孔内结合寡核苷酸垫而产生微孔。将细胞在这些微孔之间分配，其方式允许单细胞安置在一个微孔中。将包被有适于附加感兴趣的蛋白的材料的盖子放置在所述微孔上。例如，为了在上方盖子上固定抗体，将盖子包被抗体特异性捕获剂诸如蛋白A或蛋白L(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
实施方案2
在实施方案2中，将适于附加感兴趣的蛋白的材料包被在商业微孔阵列如：包含50微米六边形孔的空白PicoTiterPlate装置(454 Life Sciences，Branford，Connecticut)上。将细胞在所述六边形孔之间分配，其方式允许单细胞安置在一个孔中。例如，为了在孔表面上固定抗体，人们将表面包被抗体特异性化合物诸如蛋白A。将定制寡核苷酸阵列(NimbleGenSystems，Inc.，Madison，Wisconsin)放置在所述PicoTiterPlate上以捕获和标签mRNA。
实施方案3
在实施方案3中，我们通过将大约50微米的壁附加到扁平支持物上来制造微孔。将细胞在所述微孔之间分配，其方式允许单细胞安置在一个微孔中。将定制寡核苷酸阵列(NimbleGen Systems，Inc.，Madison，Wisconsin)放置在所述制造的微孔上以捕获和标签mRNA。未捕获蛋白。
实施方案4
在实施方案4中，商业微孔阵列如：包含50微米六边形孔的空白PicoTiterPlate装置(454Life Sciences，Branford，Connecticut)用于包含分配的细胞。将定制寡核苷酸阵列(NimbleGen Systems，Inc.，Madison，Wisconsin)放置在所述商业微孔阵列上以捕获和标签mRNA。未捕获蛋白。
实施方案5
在实施方案5中，两个平面表面被多孔结构间隔小的距离(如：50微米)。平面表面之一或二者是微阵列。多孔结构包含足够大以包含生物细胞的孔(如：50微米)。多孔结构临时附加于一个平面表面，从而构建开放微孔的阵列。以以下两种方法之一将生物细胞分配到所述微孔顶部：a)随机分离，其中选择所述细胞的浓度以使当细胞在所述微孔上方随机分配时通常仅一个单细胞占据单个微孔；和b)确定性分离，其中使得单独细胞移到预确定的微孔。一段时间后(如：3分钟)，允许微孔上方的细胞由于其密度增加而进入所述微孔。将所有微孔共同的试剂引入所述微孔上方的区域，在每个微孔中发生反应。允许小分子在短时间(如：10秒)扩散出所述微孔。然后将第二平面表面放置在所述微孔上，密封其并允许微孔中的反应经长时间发生。所述反应导致微阵列被限制于所述微孔的化学物修改。认为所述微阵列被修改后，分离平面阵列并去除多孔结构。分析期间使用制造到所述修改的微阵列的编码来将微孔与测量的结果关联。所述编码可以是在微阵列上的物理位置、或导致被包埋在所分析的数据中的标签。例如，在寡核苷酸阵列的情况，所述包埋的标签可以是独特的DNA序列。
多孔装置
本发明方法关键的是将单细胞限制在单独的微孔中。因此，本发明的一方面是包括微孔的多孔装置。微孔起到两种目的：首先，抑制反应物和产物在单独细胞之间扩散；其次，加速过程诸如核酸杂交或蛋白相互作用的速率。因此，本发明的多孔装置的微孔以大于100微孔/cm2的密度互连，且每个微孔具有1皮升和500纳升之间的容积。托盘可包括任何数目的孔，优选地包括96或更多个孔，100、1,000、10,000、100,000、1,000,000个孔或更多个。通常，微孔占据大于100孔/cm2的密度。设计孔以使其能够容纳单细胞，设计托盘表面以使当细胞被放置在托盘表面上并在托盘表面上移动时，单细胞移到每个孔中。另外，可设计托盘以使微孔间歇地可及外部试剂。
本发明方法一些实施方案的另外关键是筛选细胞的感兴趣的生物活性剂。因此，本发明的多孔装置可还包括向其附加结合感兴趣的生物活性剂的剂如结合剂的固体表面。这种固体表面可以是膜、细丝、珠、或聚苯乙烯或聚丙烯片，如包括多个区域的托盘盖，其中每个区域独特地对应托盘上的每个孔。区域可为平面或向外凸起以提供更多表面积。托盘盖上的区域(和任选的突起)包被有抗体结合剂，如蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、山羊抗小鼠IgG抗体、或细胞产生的至少一种感兴趣的生物活性剂的靶结合蛋白。包被可包括有效和选择性地结合孔中细胞产生的生物活性剂的任何剂。
在一些实施方案中，生物活性剂可以提供于微孔。例如，小分子化合物、蛋白、siRNA或寡核苷酸可布点在微孔中。每个孔还可或可选地具有包被于其上的多核苷酸，如寡核苷酸。多核苷酸可作为引物以在孔中在裂解细胞后复制核苷酸，例如在测序反应中。
装置可以在包括根据本文所述的任何方法使用装置的说明书的试剂盒中。进一步，装置可与包括PCR试剂的试剂一起出售。
实施例
提出以下实施例从而对本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并不意为限制发明人视为发明的范围，也不意为代表以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保使用的数字(如量、温度等等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则部分是重量部分，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度，压力是以大气或接近大气。
实施例1：获得小鼠抗HEL抗体的重链和轻链序列
免疫小鼠
参考图2，对一组BALB/c小鼠201用完全弗氏佐剂(Sigma)中的50μg鸡蛋溶菌酶(HEL，Sigma，St.Louis，MO)腹膜内免疫。首次免疫六周后，用相同剂量HEL静脉内免疫小鼠。第二次接种两天后，从小鼠尾静脉取血并由ELISA检验确定血清中针对HEL的多克隆抗体的存在。如果由所述ELISA检验确定的滴度是令人满意的，则第二天处死小鼠并收集其脾。
分离抗原特异性B细胞
通过机械破坏脾来获得脾细胞的细胞悬液，将红细胞在pH 7.4的0.16M氯化铵溶液中裂解。将所得的单细胞悬液用以FITC(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)标记的HEL和以PE-Cy5(Prozyme，San Leandro，CA)标记的HEL的组合以最佳稀释度染色。染色在4℃以2个步骤进行。首先，用FITC标记的HEL染色细胞一小时，利用经验确定的最佳亚饱和浓度。然后用FACS缓冲液洗涤细胞三次。然后，用PE-Cy5标记的HEL染色细胞。染色后，用带5％FCS的PBS洗涤细胞两次。
利用修改过的双波长激光器
Figure BPA00001259378000261
(Becton Dickinson)分析细胞。利用CELLQuest软件获取文件。在步骤202中，利用附加于
Figure BPA00001259378000262
和Clone-Cyt软件(Becton Dickinson)的自动细胞-分配单元分选具有适当表面表型的单个B细胞用于谱系(repertoire)分析。将细胞分选到补充有1U/μL浓度RNA酶抑制剂SUPERase-In的适当容积的PBS中。可选地，可利用磁辅助细胞分选(MACS)，利用鉴定适当细胞表面标志物的试剂分离抗原特异性B细胞。此外，可通过琼脂糖凝胶微滴，利用CellSys 101微滴制备器(One Cell Systems，Inc.，Cambridge，MA，USA)或油包水乳液产生的微滴分离抗原特异性B细胞。可选地，上述方法的组合可用于分离抗原特异性B细胞。
利用PicoTiterPlate分离细胞(步骤203)
准备PicoTiterPlate(PTP)装置(454Life Sciences，Branford，CT)，用0.1M醋酸钠中的蛋白L(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)包被表面过夜。用PBS中3％BSA封闭表面1小时。去除PBS中3％BSA后，用PBS中0.1％Tween-20洗涤表面4次。然后用补充SUPERase-In的PBS填充PTP装置。在PTP装置在Bead Deposition装置(454Life Sciences，Branford，CT)中后，通过离心逐出孔中可能保持的气泡。利用2-mL移液管，将细胞轻柔地放置在PTP装置盖上并静置10分钟以允许单独细胞落入孔中。以盖玻片将不进入孔的细胞移出PTP装置。用包含离液剂诸如异硫氰酸胍或去垢剂诸如NP-40的惯例的裂解溶液裂解细胞(步骤204)。如果期望捕获感兴趣的蛋白，将使用去垢剂NP-40。包被有捕获剂诸如蛋白A或蛋白L的固体表面用于覆盖微孔以限制从裂解的单细胞释放的大分子的扩散并同时捕获所述感兴趣的蛋白诸如抗体在固体表面，形成蛋白阵列(步骤211)。
制造带图案的(patterned)光刻胶结构和膜。
利用标准光刻技术和刚性铬掩模在硅晶片上制造光刻胶的圆柱形柱(post)的阵列。利用透明片作为光掩模，制造测量为50μm×50μm×50μm，各件之间间距50μm的正方形件阵列。
制造弹性PDMS膜。
将PDMS预聚合物(以10∶1比例与交联催化剂混合)以3,000rpm旋转包被在上述带图案的光刻胶件的浮雕上60秒，以产生厚约45μm的膜。如此，所得的PDMS膜具备由光刻胶件尺寸界定的正方形孔。在60℃熟化PDMS膜2h。以逐滴的方式将更厚的PDMS预聚合物层加到膜边缘。在60℃保持膜过夜。利用镊子将膜从其支持物去除，并沿着支持物边缘切为期望的尺寸。
以BSA包被带孔的膜以使蛋白的非特异性结合最小化
将PDMS膜放置在带有数滴乙醇的载玻片表面。将数滴BSA的缓冲溶液(1％w/v，PBS中)放置在膜上以覆盖孔。因此流体不快速地填充疏水的孔，施加真空(约500mTorr)30秒并释放两次以提取出孔中截留的空气，允许BSA吸附到表面15min。然后用PBS洗涤载玻片上的PDMS膜三次。在PBS存在下从载玻片剥去膜并转移到覆盖有PBS的蛋白阵列载玻片(Full Moon BioSystems，Sunnyvale，CA)以帮助将膜密封在载玻片上。
用蛋白L包被载玻片以支持带孔的PDMS膜。
用蛋白L(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)包被SuperEpoxy 2载玻片(TeleChem International，Inc.，Sunnyvale，CA)。将制备的带孔的PDMS膜放置在载玻片盖上，加压使得与表面均匀接触。再次在BSA缓冲溶液中封闭整套装备。再次，施加短暂的真空以去除孔中截留的空气。封闭进行1小时，然后用PBS洗涤三次。包被有蛋白L、支持带孔的PDMS膜的载玻片现在易于从B细胞捕获抗体，PDMS膜上的孔代表微孔。除了蛋白L以外，可能使用蛋白G、蛋白A/G、山羊抗小鼠IgG抗体等等。
NimbleGen HD-2微阵列芯片上探针的一般特征
NimbleGen HD-2微阵列芯片在单个载玻片上具有210万个探针，阵列尺寸是62mm×14mm。如此，有具备210万个独特标签的可能。为了便于捕获、加标签和随后的DNA操作，利用重链和轻链二者的探针的一般特征，其中重链捕获探针的所述一般特征的一个实例是：Xho I裂解、454LifeSciences的引物B、鉴定孔标识符标签的起始2-碱基的间隔子(通常是不变的)、14mer孔标识符、小鼠γ重链CH1 IgG1、IgG2a和IgG2b同种型重链保守序列捕获探针。此外，轻链捕获探针的所述一般特征的一个实例是XhoI裂解位点、454Life Sciences 407的引物A、鉴定孔标识符标签的起始的2-碱基的间隔子(通常是不变的)、14mer孔标识符标签和小鼠κ轻链恒定区捕获探针。注意微孔标识符标签的长度是14-mer，这具有超过26800万的可能序列组合，远超过210万个探针所需的。这种缓冲允许消除不期望的序列诸如相同碱基的连续三倍体和完美自身互补性或微孔标识符与重链探针序列、轻链探针序列、454引物A或454引物之间的互补性。此外，期望保持G+C含量在40-60％之间。如果需要，为了纠错目的，可将诸如汉明码中使用的奇偶检验码包埋在孔标识符中。用于免疫球蛋白重链(SEQ ID NO：1)和轻链(SEQ ID NO：2)多肽的探针实例可见于图4。
从裂解的细胞捕获释放的mRNA并转化为带标签的ds cDNA的过程在图3示意。mRNA 301的靶分子与寡核苷酸探针203杂交，寡核苷酸探针203附加于如在典型微阵列载玻片中的固体表面306，所述载玻片包含非DNA接头305、454Life Sciences 304的PCR/测序引物B、孔标识符标签303、与来自重链或轻链基因的靶mRNA中区域互补的捕获寡核苷酸302。反转录307利用反转录酶(Stratagene，La Jolla，CA)通过延伸捕获寡核苷酸203作为引物来合成第一链cDNA 308，并拷贝靶mRNA模板的适当区，从而掺入5’-甲基dCTP 309。第二链cDNA反应310以RNA酶H与大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的组合作用来代替靶mRNA，留下原始mRNA模板的小区段在5’端。利用T4DNA聚合酶的反应313使得ds cDNA314的5’端变钝。在连接反应315中，附加包含454Life Sciences的PCR/测序引物A、带有3’突出端以确保方向特异性连接的衔接物(adapter)分子316。在过程318中，去除过量衔接物分子，在过程319中，用核酸内切酶XhoI(New England Biolabs，Ipswich，MA)从固体表面切除附加的dscDNA，释放带有侧翼是454Life Sciences的PCR/测序引物A和B的孔标识符标签的ds cDNA分子320，所述引物容易被塞到454测序工作流程中。
mRNA和抗体捕获(步骤205)
从PTP装置一侧吸出等体积的1％NP-40以使最终NP-40浓度为0.5％。培养PTP装置10秒。然后用NimbleGen HD-2微阵列芯片覆盖PTP装置上部，利用适当装置牢固地钳制。在37℃培养30分钟。然后将整套装置浸入保持在托盘中的无RNA酶的PBS中以从PTP装置分离微阵列。用PBS彻底洗涤PTP装置3次。现在带有从单个B细胞捕获的抗体的PTP装置可在4℃储存。在60℃将微阵列浸入保持在托盘中的PBS 10分钟以去除非特异性杂交的RNA物类，然后用PBS彻底洗涤3次。微阵列现在可用于下游操作。
cDNA合成和衔接物附加(图2中的步骤206)
将微阵列简短地在一片kimwipe上吸干，立即加入30μL包含SuperScriptIII RTase(Invitrogen，Carlsbad，CA)、适当缓冲液成分和除了5’-甲基dCTP以外的dNTP的反转录酶(RTase)反应溶液。加入盖片，在潮湿环境中在50℃放置微阵列1小时。通过浸入DNA聚合酶缓冲液中来去除盖片并洗涤3次。再次将芯片在一片kimwipe上吸干。加入30μL包含大肠杆菌DNA聚合酶和RNA酶H的适当缓冲液，在16℃培养样品2小时。洗涤芯片，在37℃以T4DNA聚合酶完善合成的双链(ds)cDNA 30分钟。加入带有生物素化末端的预退火衔接物并在室温、在适当缓冲液中由T4DNA连接酶连接于芯片上平端cDNA 1小时。然后通过在10mMTris-HCl(pH 7.5)、0.1mM EDTA中彻底洗涤去除过量衔接物。附加有cDNA的载玻片可在4℃储存。
标志物细胞用于在微阵列载玻片上的DNA垫与蛋白阵列上的蛋白点 之间对准
杂交瘤细胞系TIB-228(美国典型培养物中心，Manassas，VA)产生针对人类CD14的抗体，同种型是IgG2b。已确定其重链和轻链的DNA序列(重链可变区和轻链可变区的GenBank登录号分别是AY669065和AY669066)。重组人类CD14可购买获得(Abnova，Taipei，Taiwan)。实践本发明时，可将范围为10至50的适当数目细胞与富集的抗原特异性B混合，随后将其分离到微孔中。CD14可用PE-Cy5标记以与抗HEL抗体区别开，后者可以用FITC标记的HEL染色。
由454Life Sciences的技术进行DNA测序
通过在37℃与XhoI核酸内切酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)一起培养15分钟，裂解下附加于NimbleGen芯片的双链(ds)cDNA(步骤207)。释放的ds cDNA可任选地被链霉亲和素珠(MyOne beads，Invitrogen，Carlsbad，CA)捕获并储存。这样的策略减少了储存期间DNA的损失。随后，可从珠上熔解下互补链，利用实时PCR定量，该实时PCR通过454引物A和轻链引物、以位于轻链区的适当探针进行。可为重链dscDNA设计用于实时PCR的类似试剂。
对ds cDNA定量后，收回适当量并与适当量的珠混合用于随后的步骤208中的乳滴PCR。根据卖主的建议加工珠并测序(步骤209)。包括间隔子、标签、恒定区和完整可变区，重链和轻链二者要求约415碱基的序列，这在454测序技术的限值内。一个方向的测序读数足以获得清楚的序列信息以重构抗体重链和轻链。这是因为原型可变序列的基因组序列是已知的。此外，基于其它报道的序列，可能FR1是在免疫应答期间抗体序列中最未突变的。最后，每抗体序列读数的冗余性高。因此，基于卖主的说明书，每次允许100万个读数，减去数个标志物细胞，人们可能能够分析达200,000B细胞，对每个B细胞为5倍覆盖范围。可选地，通过在PCR引物的3-端掺入标签特异性序列，可直接扩增来源于通过结合动力学测量鉴定的特定孔的cDNA。
在测序运行后，进行以下步骤以分析序列(步骤210和213)：
a)从454运行获得一系列序列；
b)以计算方式评价序列并鉴定每个序列的标签、间隔子和恒定区，从而确定每个序列是H还是L链序列。此外，对朝向重链恒定区5’端的碱基测序且其中的微小变化用于确定捕获的抗体的同种型；
c)掩蔽恒定区序列和间隔子；
d)鉴定标志物细胞H和L链序列；
e)鉴定对应于标志物细胞H和L链序列的标签并检查以确定它们在微阵列上是否紧密接近(即：小于微孔宽度)。如果是肯定的，则这些标签标明了微孔。包含标志物细胞的多个微孔的位置将确立各自可能包含B细胞的其它微孔的物理布局；
f)基于所述布局，产生每个预期微孔的标签组；
g)鉴定具有相同H链或L链的序列；
h)以计算方式评价相同H链或L链序列的相应标签。如果标签相同，那么证实了H链或L链的来源；
i)利用来自证实的H链和证实的L链的标签，回顾H标签和L标签对以观察其是否匹配预期的标签组。如果是肯定的，则证实了组合；
j)在证实的组合中比对多个H链序列或L链序列以获得共有序列。共有序列将与适当免疫球蛋白v基因的原型基因组序列匹配；
k)鉴定配对的H链和L链序列上的所有CDR和FR。此外，鉴定与原型相比突变的残基；
l)聚类证实的组合并对相同组合的频率计分以确定其是否代表克隆选择事件的结果；和
m)将DNA序列翻译为氨基酸序列。
实施例2：制造环氧孔
构造大约50微米的化学上惰性的结构对本领域技术人员而言是普通的知识。其用在本发明的以上实施方案1和实施方案3中。简要地说，在丙酮、异丙醇、甲醇、去离子(18Mohm)水中洗涤34mm盖玻片(FisherScientific，Pittsburgh，PA)，在氮气流下干燥。通过暴露于120瓦特氧等离子体10分钟而进一步清洁，基础压是80mTorr，氧压是120mTorr(Technics500II Asher)。
将清洁的盖玻片小心地居中在旋转涂敷器的真空盘上(LaurellTechnologies，North Wales，PA)，将SU-850(Microchem，Newton，MA)负性光刻胶静态地分配到中心。盖玻片在500rpm旋转10秒并经后面30秒提升到2,000rpm。在95℃轻柔地烘烤盖玻片20分钟并在室温冷却10分钟。
利用Adobe Photoshop设计乳胶掩模，并在Linotronic-Hercules 3300dpi打印机上印刷(7.4微米点大小)。放置掩模使其接触SU-8膜，用石英载玻片覆盖以使其变重，并在365nm和以大约200mJ/cm2的强度曝光于Kasper 2001 Contact Mask Aligner 1分钟。在水平烤盘中在95℃烘烤曝光后的光刻胶2小时，浸入乙酸PM 30分钟，然后在200℃固化1小时。
将包被后的盖玻片浸入无菌蒸馏水过夜，UV杀菌灯下在DI中70％乙醇灭菌1小时。利用无菌水漂洗盖片三次，湿储存至少4小时备用。4小时的储存时间确保孔中没有保持的气泡。
选择50微米的尺寸以使微孔宽裕地包含单个10-15微米的浆细胞。因为雷诺氏数是以米/秒计的流速的56倍，孔内没有湍流。因此，孔填充流体后没有气泡进入。
实施例3：利用异硫氰酸胍(GT)从B细胞释放mRNA
本实施例是指以上实施方案3和实施方案4。我们从计算异硫氰酸胍(GT)扩散进入微孔并再次退出的分子模拟计算结果。模拟的GT分子朝向B细胞的细胞膜扩散并最终溶解B细胞的细胞膜。我们计算典型微孔的20个图像，每个在不同时间计算。前10个图像之间间隔0.1秒；后11个图像之间间隔1.0秒。
时间t＝0秒时，快速地将2000个GT分子引入直接紧邻每个微孔之上的等体积。这代表非常低的GT浓度(26pM)，比裂解细胞所需的GT浓度(1M)低得多。因为仅2000个分子是直观的并用于测量扩散，我们猜想仅一小部分的1M GT被报告分子标记，仅这些报告分子用在我们的计算中。随着时间推移，400个GT分子扩散到微孔中直到t＝1.0秒。然后微孔上方的GT分子数目快速减少并保持在零。微孔内的所述分子向微孔外扩散，再过10秒后浓度降低到13个分子。
我们的模拟中，在0.5和0.8秒之间浆细胞的细胞膜大体上溶解，高尔基体周围的膜也同样。因为所述mRNA大体上比GT大，其扩散的更慢。
此模拟中使用的GT分子数可缩放到任何方便浓度。如果标准化为上样到物理微孔上的浓度，21％将在1.0秒内扩散到微孔中，冲洗微孔上方浓度10秒后，孔内浓度将降低到0.65％。时间等于11秒时，所有mRNA仍然完全保持在孔中。这种低浓度的GT不干扰RNA与DNA杂交、或DNA与DNA杂交。11秒后密封微孔以使所有mRNA继续保持在微孔内。
从Stokes-Einstein关系式计算扩散率：
D = k B T 6 πηr
其中D是扩散率，kB是波耳兹曼常数(1.38×10-23J/K)，T是室温，η是缓冲液粘度(8.94×10-4Pa/sec)，且r分别是GT(5.0埃)或mRNA(60埃)的回转半径。每Δt＝3毫秒重算轨迹，加入以从球的482棋盘花纹选择的随机方向的长度矢量
Figure BPA00001259378000332
实施例4：绘制抗体互补位图谱(步骤214)
当顺式和/或反式蛋白复合体是抗体时，本发明提供关于比以前可获得的数量大得多的抗体的信息。通过将测序的标签与最初微孔关联，我们鉴定B细胞产生的mRNA群体以及其各自的重链和轻链序列。所述序列可推断每个B细胞内的体细胞突变。
我们从21个轻链和重链抗体的公开序列模拟B细胞群体。根据Web抗体建模的建议比对序列。每个序列储存为带着由Milstein测量的解离常数。我们还计算了拷贝数，这代表序列中包含特定mRNA的细胞数。
我们检查了独立地沿着轻链和重链的氨基酸变异。在每一个氨基酸位置，我们计算了氨基酸不同于最常见氨基酸的概率。如果在位置i我们计算f为n个中最常见氨基酸，则概率计算为：
Figure BPA00001259378000341
最可变的轻链和重链氨基酸是互补位的最可能位置。因为我们可以比对序列群体，所以可推断互补位。
本发明还可测量抗原结合至互补位的KD，我们可绘制出KD与氨基酸突变概率之间的关系。本发明中，我们解释KD-突变图中的簇为显著的免疫学活性的迹象。当免疫系统已经发现了稳定的重或轻链抗体结构时，小的单碱基突变表示可通过突变单个氨基酸显著地改进特异性。相反，具有低KD的单簇表示发现成功的体细胞突变。我们强有力地将成功的体细胞突变迹象与互补位关联。
实施例5：抗原结构预测(步骤215)
尽管计算化学家已经取得了巨大的进展，以计算方式利用仅关于氨基酸序列和溶剂的知识推断蛋白三级结构的现有方法仍是挑战性、耗时和易错的。然而，如果在推定折叠期间掺入现有信息或约束，计算时间和准确性的显著改进是可获得的。Web抗体建模(http://antibody.bath.ac.uk/)已经建立了具有高成功度的抗体模型。本发明利用我们发现的抗体的计算结构、和在以上实施例4鉴定的互补位，来对推定蛋白折叠指派实际概率。
最初的死路消除(DEE)算法鉴定了数千推定的蛋白折叠。最近的改进加速了这一算法，提供了结构和统计滤器，显著减少这一数目到大约1,000。运行时间是大约5.5小时。
本发明可以计算方式估计抗体与推定的蛋白折叠的自由结合能。为了计算这一能量估计值，我们以计算方式将抗体与推定蛋白对接。有利用形状、电子密度或统计频率进行此的许多方法。大的计算簇显著地改进计算时间。大型计算机上典型的运行时间每次对接运行大约8秒。
本发明比较了自由结合能的计算估计值与测量的KD，并选择最紧密匹配的蛋白和表位。本发明的结果是：a)通过获得其H和L链的DNA序列，针对特定抗原的数字上永生的抗体群体；b)每个抗体与抗原之间相互作用的动力学度量学；c)计算绘制每个抗体互补位的图谱；d)计算绘制抗原上表位的图谱；和e)通过组合来自a)、b)、c)和d)的信息帮助建模抗原结构。
实施例6：从序列频率和FACS荧光推断KD
这一实施例是指实施方案3和实施方案4。每个B细胞表面包含数千个相同的膜结合B细胞受体(BCR)，在较小程度上浆细胞也如此。可通过将细胞接触将结合一部分BCR的已知浓度的荧光标记的抗原来特异性地标记细胞，所述部分f由表达式紧密地近似：
f = [ a ] K D + [ a ]
其中KD是解离常数，[a]是抗原浓度。
部分f可由荧光信号估计。然而，因为细胞大小变化，引入了大的偏差。通过将所述荧光测量值以细胞大小标准化来大大改进f的估计值，细胞大小是与来自适当细胞分选仪器，诸如BD Biosciences，San Jose，CA的仪器的正向散射F1信号充分关联的尺寸。逆转上式，因为我们知道用于标记细胞的抗原浓度[a]，KD可从标准化的荧光信号f估计为：
K D = [ a ] ( 1 - f ) f
本发明将细胞分配到微孔中并将与mRNA互补的DNA捕获到带独特标签的寡核苷酸上。通常难以将由FACS荧光推断的KD与带标签的寡核苷酸关联，因为细胞在所述分配之间被汇集。本发明解决这一关连的一种方式是通过利用KD与表达特定抗体的B细胞的丰度(或频率)之间的关系：表达相同抗体分子的B细胞数n是KD的函数：
Figure BPA00001259378000362
其中c是任意常数。
这一关系不仅适用于从所述分配的微孔读取的大量序列，还适用于在FACS中测量的抗原阳性细胞。因此，如下确定常数c：
a)确定对每个序列取样的次数；
b)利用随意值c计算与每个序列关联的拷贝数；
c)根据所述拷贝数分选序列；
d)以正向散射FACS F1信号标准化侧面散射FACS信号F2以计算和估计结合的BCR表面密度；
e)由所述结合的BCR密度估计值分选FACS信号；
f)调整参数c以确保序列总数等于FACS信号总数；
g)以所述结合的BCR密度估计值比对所述序列；
h)为每个所述结合的BCR密度估计值计算KD；
i)将每个序列与以所述序列比对的所述结合的BCR密度估计值的平均KD关联。
我们从FACS分选浆细胞的正向散射的F1信号模拟数据。我们展示荧光振幅和以特定荧光振幅计算的细胞数。
从模拟的F1和F2信号开始，我们进行以上标为步骤a)至i)的方案。比较以我们的方法推断的KD和文献报告的KD结果相当好。测量的与预测的KD的合理地接近的匹配证明这一方法的价值。
实施例7.优化分配的细胞数目
本发明在分布微孔的表面上分配一定数目的细胞。短时间如：3分钟后，所述细胞安置入微孔中。具有尽可能多的微孔，因此尽可能多的细胞，与使微孔足够大之间有竞争，以使a)带标签的寡核苷酸捕获足够的mRNA，和b)来自细胞内部的物质大体上不干扰mRNA-DNA杂交。我们预期，对于直径10-15微米的细胞诸如B细胞，50微米的孔大小是合理的妥协。显然，对于其它细胞或不同化学物，孔大小可变化。
固定微孔大小后，必须确定微孔的数目。全部阵列的方便尺寸是显微镜盖片的大小34×34mm，其中仅使用24×24mm以允许机械支持物的空间。这留下了在50微米中心上放置23万个微孔的空间。
在微孔上分配细胞时，想要一个细胞安置入每个微孔中。然而，如果在微孔上铺展过多细胞时，可能有高概率使得两个或更多细胞可安置入同一孔中。如果在微孔上铺展太少细胞，将留下许多微孔没有单细胞。统计优化这一问题是本领域技术人员公知的。简要地说，考虑单细胞进入紧邻微孔之上的体积。微孔包含所述单细胞的概率p为
Figure BPA00001259378000371
根据二项式定理，两个微孔各包含一个细胞的概率prob是prob＝2p(1-p)，因为希望两个细胞之一在孔中而另一个细胞在别处。对于n个细胞，prob＝np(1-p)n-1。单细胞微孔(单峰)的数目等于prob的23万倍。利用相同形式，未被占据的微孔的数目等于230K(1-p)n。
为了优化分配的细胞的数目，计算多峰概率m，m＝1-(1-p)n-np(1-p)n-1；即：微孔将容纳2个或更多细胞的概率是细胞数目的函数。惯例的平衡和本文所用的多峰概率与细胞数目之间的平衡是5％，当n＝82,000细胞时发生。
计算了占据单个微孔的单细胞的数目与分配到微孔上方的细胞数目之间的关系。例如，当分配的细胞数目等于82,000时，单细胞孔的数目是57,400。
实施例8：优化序列数目
每个微孔包含两条带标签的寡核苷酸来捕获Ab mRNA：一条是对重链，一条对轻链。为了数字地关联这两条序列，必须对包含细胞的每个孔的至少一种分子测序。因为释放和汇集cDNA序列，必须过量取样序列以确保对每个细胞的重链和轻链的至少一种序列测序。
序列群体是细胞数目的两倍。选择特定重链序列的概率p等于选择轻链序列的概率q：
Figure BPA00001259378000381
不选择特定序列的概率是r＝1-p-q。两条链测序至少一次的孔的数目利用多项式分布计算：prob＝164，000(1-rn-nprn-1-npqn-1)。两条链测序的孔的数目计算为测序样品总数目的函数。确保良好覆盖的惯例的过量测序率是5X。利用5×82,000，这一数目的序列为来自160,000微孔的双倍序列提供97.6％的双倍取样百分比。
实施例9：利用荧光减少测量koff和kon(步骤212)
杂交瘤细胞系(NQ2-12.4)测量的KD为2.8×10-7摩尔-1。测量的抗体Kon值趋向于在105sec-1摩尔-1周围簇集，获得2.8×10-2sec-1的koff。大于10-7摩尔-1的KD在研究、诊断或治疗上兴趣较小，因为其非常弱地结合各自的抗原，快速从其抗原解离，大体上降低获得期望结果的概率。通常具有小于10-8的KD的紧密结合的抗体更有用。本发明利用以下事实：紧密结合的KD通常具有＜2.8×10-2sec-1的koff值，因此容易地允许利用荧光来测量在24×24mm抗体阵列中的KD和koff。kon从
Figure BPA00001259378000382
计算。在本实施例中，显示本发明对2.8×10-2sec-1的极其弱情况起作用，因此也将对其它商业上有意义的抗体起作用。
在本实施方案中，显微镜盖玻片包被有蛋白A。将细胞在微孔上分配，裂解，将所述盖玻片放置在微孔上。在本实施方案中，寡核苷酸固定于微孔内表面。如果在微孔中裂解的细胞包含大量抗体，这些抗体将在孔中扩散，扩散到蛋白A周围并紧密结合，如本领域技术人员公知的。在与kon和抗体浓度的预期范围相称的培养时间后，去除盖玻片，洗涤，并接触荧光标记的抗原溶液。
我们利用平衡表达式：
Figure BPA00001259378000391
进行了NQ2-12.4与phOX结合的详细分子模拟。我们集中在未结合的抗体Ab暴露于两种最初浓度的荧光标记的抗原后前3分钟：[Ant0]＝100nM和[Ant0]＝200nM。未结合的抗体Ab、结合的抗体Ab.Ant和自由抗原Ant的演变由以下公知关系概括：
d [ Ab . Ant ] dt = - k off [ Ab . Ant ] + k on [ Ab ] [ Ant ] = - d [ Ab ] dt = - d [ Ant ] dt
容易测量荧光标记的抗原，并紧密地近似未标记的抗原的结合。如果从未结合的抗原开始，在将抗体浸入抗原超过3分钟后，带有结合的抗原的抗体位点部分f除以抗体位点总数目渐近地达到以下平衡：
f = [ Ab . Ant ] [ Ab . Amt ] + [ Ab ] = [ Ab . Ant ] [ Ab 0 ] = [ Ant ] K D + [ Ant ]
如果知道抗体的总数，可直接测量相对占位f：可以小心地以充分控制的光束激发荧光团，计数散射到检测器中的光子数目。基于荧光断面和已知的光漂白概率，可以相当接近地估计荧光团的数目。这一方法的困难在于，不知道抗体的总数目，因此不能形成测量的荧光团与总荧光团的比例来计算比例f。
本发明通过测量两种或更多荧光振幅解决了这一问题。来自荧光微阵列读数器的信号依赖于荧光团浓度。通常这一关系是近似线性的。如果从固定的抗体沉积测量相同的总信号，对于已知光漂白效应适当地校正，则相对占位.f也与测量的荧光线性相关：对于与一些特定抗原浓度[Ant1]相关的一些相对占位f1，meas1＝α.f1。对于抗体的相同沉积，这对于具有相同α的meas2、f2和[Ant2]是同等地正确的。利用上述关于f的关系，求解KD为meas1、[Ant1]、meas2和[Ant2]的函数：
K D = meas 2 - meas 1 meas 1 [ Ant 1 ] - meas 2 [ Ant 2 ]
尽管这一等式书写为与两种抗原浓度关联的两种荧光测量值的函数，应理解的是，非线性参数估计领域的技术人员可容易地利用与多种抗原浓度关联的多种荧光测量值。
确定KD后，利用
Figure BPA00001259378000401
求解α。知道α对本发明尤其有用，因为然后可将测量的信号转化为相对占位。因为从荧光读数器的校准知道测量的荧光团的数目，相对占位提供结合的和未结合的抗体的总数目。这一数目高度地与细胞身份关联，即，是浆细胞还是B细胞。浆细胞通常包含来自其B细胞祖先的另外的体细胞突变。因为浆细胞表面上的B细胞受体在体细胞突变之前产生，抗体可能不同。鉴定B细胞，以及鉴定高频率B细胞，允许更好地估计紧密结合的抗体。
以上描述要求准确测量抗原和荧光信号。利用抗原初始浓度[Ant0]作为[Ant]的估计值。当[Ant0]大体上大于总Ab浓度时，这通常是足够的。[Ab]的估计值利用50微米2面积、125皮升容积、浓度4.4nM，22fmol cm-2的抗体密度。100和200nM的初始浓度[Ant0]大体上大于此。
测量荧光必须在溶液中以[Ant0]＝0进行以使背景噪音最小化。测量荧光振幅作为测量koff的参数。随着抗体结合的抗原接触无抗原溶液，荧光降低。总之，难以在时间＝0时利用盖玻片测量[Ab.Ant]，因为花费有限量的时间来将被无抗原溶液覆盖的盖玻片上样到适当读数器上，同时保持盖玻片上的无抗原溶液的流。本发明中，通过以大约一分钟的间隔测量结合至抗体的荧光标记的抗原的荧光，取样结合的抗体浓度。现代微阵列读数器(如：ArrayIt InnoScan 700，TeleChem International，Inc.，Sunnyvale，California)以10微米分辨率在一分钟扫描25×24mm面积，这对于50微米的抗体沉积是相当足够的。
例如，结合至NQ2-12.4的phOX抗原相当快地降低，代表本发明预期测量的最差抗体之一，因为其荧光衰减时间是预期取样的最快的。更紧密的抗体将具有更大数量级的衰减时间。微阵列读数器将在大约一分钟对大约230,000个抗体点成像，因此对于不断地或立即地对所有点成像不可行。本发明取样的信号降低三次。典型荧光测量值的数字是：在.39秒是736，在1.39秒是137，在2.39秒是26。
在我们的模拟中，将测量的数据meas与公知的指数衰减式：
Figure BPA00001259378000411
拟合。利用以上数据和Mathematica(Wolfram Research Inc.，Champaign，IL)的非线性参数估计特征，计算A为1427，koff为0.028sec-1。
实施例10.对齐NimbleGen寡核苷酸垫与454六边形孔
这一实施例适用于以上实施方案2和实施方案4。NimbleGen寡核苷酸阵列包含大小为13微米×13微米的交错的寡核苷酸垫。交错是指交替，例如国际象棋棋盘，其中黑色正方形是交错的。当将NimbleGen阵列与PicoTiterPlate(PTP)六边形孔配对时，将有一些寡核苷酸垫完全地暴露于微孔，另一些埋在微孔壁下或暴露于多个微孔。为了使本发明对NimbleGen寡核苷酸阵列和PTP六边形孔起作用，必须确保大多数孔包含至少两个垫，并暴露其区域的大部分。
进行模拟，其中在50微米中心以44微米直径，即，相对壁之间的距离，构造100×100六边形孔。将一微米中心上的点的网格放置在每个六边形孔上，仅选择落在每个六边形内的点。对于选择的每个六边形孔，在含有点的唯一垫中点的数目(通过将其位置除以每个垫的大小来计算)是增加的。在加工每个点后，具有对每个孔列出其包含的垫和每个垫中点的数目的数据库。因为已知垫中点的最大数目，计算每个孔中每个垫的部分。
每个孔包含至少六个垫。对于每个孔，选择具有最大部分的六个垫，产生10,000×6阵列。将这看作是六个数字的10,000个样品，6个部分的平均值和其标准偏差是：第一个平均值是1，标准偏差为0；第二个平均值是0.99，标准偏差为0.02；第三个平均值是0.93，标准偏差为0.07；第四个平均值是0.81，标准偏差为0.11；第五个平均值是0.51，标准偏差为0.15；第六个平均值是0.4，标准偏差为0.15。
每个孔包含至少一个完整的垫。99％包含至少2个交错的垫。因此，利用NimbleGen寡核苷酸阵列和PTP六边形孔的实施方案允许99％分配的细胞的重链和轻链利用DNA标签数字地匹配。
实施例11.以低熔点琼脂糖包被载玻片。
当利用机器人微阵列布点器(如：SpotBot 2，TeleChem，International，Sunnyvale，CA)时，这一方法是可用的。将1％低熔点琼脂糖(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)溶液溶解在纯水中，在70℃倒在载玻片表面上(每载玻片2.0ml)。在琼脂糖胶凝后，在空气中干燥载玻片。将干燥的载玻片放置在微阵列布点设备中，将温水(如：70℃)分配在琼脂糖上。琼脂糖熔解，通过另一次施加温水而被洗去。制造孔图案，其中所述孔如同微阵列布点器的公差(对于SpotBot 2是大约10％)一样可重复。形成所述孔并清洁后，可利用相同微阵列布点器将其它分子布点到孔中。如果存在对齐误差，琼脂糖提供对微阵列针头的低阻力。最终结果是大小被温水注射过程控制的孔，和均匀包被附加于玻璃的检测分子。包被在玻璃上的分子可以是，例如，寡核苷酸、蛋白、抗体或捕获分子、或2种或更多寡核苷酸、蛋白、抗体或捕获分子的混合物。
产生独特的寡核苷酸标签并将其掺入包含与mRNA和PCR引物互补的区域的寡核苷酸。
制造与mRNA互补的寡核苷酸阵列的一种方法利用合成的寡核苷酸。当考虑具有，如，40,000个或更多个各带有独特标签的寡核苷酸的阵列时，这是困难的。产生带有独特标签的40,000个寡核苷酸的有效方法包括：
a)合成不带有末端磷酸基的200个独特寡核苷酸；
b)合成带有末端磷酸基的另200个独特寡核苷酸；
c)连接步骤(a)的寡核苷酸与步骤(b)的寡核苷酸。注意因为缺少磷酸基，步骤(a)的寡核苷酸不能彼此连接。类似地，因为多余的磷酸基，步骤(b)的寡核苷酸不能彼此连接。
d)连接步骤(c)的寡核苷酸与PCR引物。
e)连接步骤(d)的寡核苷酸和与mRNA互补的区域。
40,000个垫的数值仅是示例，不意为对微阵列大小的另外限制。这一实施例联合包被有低熔点琼脂糖的载玻片使用，提供实施方案5的低成本实施例。
实施例12：DNA芯片与预制造孔之间对齐
根据制造商的建议，将SU-8光刻胶(MicroChem Corporation，Newton，MA)旋转包被在10cm硅晶片上。根据制造商的建议，将50微米立方微孔图案利用来自掩模对准器(SUSS MicroTec AG，Schleiβheimer Str.90，D85748 Garching b.München)的紫外光曝光，并利用SU-8显色剂(MicroChem)显色。根据制造商的建议，混合聚二甲基硅氧烷(PDMS)(SylGard Elastomer，Ellsworth Adhesives，Germantown，WI)，固化并去除。如下形成底部托盘(图5)：通过利用刀片切下205×154微孔(31，570微孔)的阵列并小心地放置在清洁和干燥的显微镜载玻片上，在这里其与载玻片形成疏水键。微孔的尺寸和位置准确地匹配DNA芯片(385K CGH阵列，Roche/Nimblegen，Madison，WI)上寡核苷酸垫的位置和大小。DNA芯片形成微孔的上部(图6)，被放置在微孔上方以使大多数孔直接在DNA之下且大多数孔壁接触裸露的玻璃。当利用如此小的微孔时，PDMS孔上方DNA载玻片的定位、对齐、和随后的密封足够脆弱以致通常需要机械辅助，诸如掩模对准器或定制仪器。
可获得的掩模对准器的一个实例是来自SUSS MicroTec AG(Schleiβheimer Str.90，D 85748 Garching b.München)的MJB4四英寸手工掩模对准器。用聚酯磁带将载玻片粘贴到4”方形石英板上，并插入到对准器的掩模真空吸盘中。将PDMS粘贴到类似板上，并插入到晶片吸盘中。利用光学和对准器上可获得的定位控制将两个表面对齐。对齐后，去除PDMS并继续加工直到DNA载玻片与孔对齐。此时，将PDMS重新插入对准器，将两个表面(DNA和PDMS)放置为接触，将整个部件静置数分钟，同时从抗体mRNA构建cDNA。
尽管可进行这一方案，其具有多个缺点：1)待对齐的部件必须被推入防UV区域，这阻止了人和设备容易地接近；2)用于来自孔上部上沉积的必然湿的细胞悬液的过量液体的空间很少；和3)对准器上有不需要的昂贵的功能。
可以如下设计的定制的对准器更有效地使用该系统：包含少量液体，提供实验者和设备容易接近，同时以减少的成本提供减少的功能组。定制的对准器500的一个实例显示在图9。四个竖柱502拧入铝基板501和支持铝台503。铝台503上放置底部压板504。第一塑料插片505和第二塑料插片506夹在底部压板504和上部压板507之间。
真空孔508提供底部压板504与塑料插片505之间、以及上部压板507与塑料插片506之间的紧密接触。包括微孔511的底部托盘放置在玻璃显微镜载玻片510上，由另外的真空孔509将托盘牢固地保持在塑料插片505的上侧。类似地，由另外的真空孔513将具有与显微镜载玻片510相同尺寸的DNA芯片512牢固地保持在塑料插片506的下侧。
当释放底部真空时，通过将其相对塑料插片509滑动，底部微孔511和载玻片510可小心地以两个轴移动。在最佳地对齐孔511后，向真空孔509施加真空以保持载玻片510不移动。将小的计算机界面的显微镜(未显示)放在铝台503之下，以利用进入仪器500上部的平面场光对孔中细胞成像。
实现对齐后，可将掩膜放置在塑料插片509上以记录载玻片510的位置。可选地，将物体挨着载玻片510放置以记录载玻片510的位置。然后可移动微孔511和载玻片510，加工并返回对齐仪器500，位置准确度为10微米。发现10微米的准确度足以将微孔511与DNA芯片512正确地对齐，以使芯片512上的特定寻址可与微孔511的特定寻址正确地匹配。
实施例13：在微孔设计中包埋数字代码
在对齐和加工期间，在中等效力的显微镜(如：100×)下检查微孔或微孔中的细胞通常是可用的。显微镜的视野很少能涵盖所有微孔。因此，通过实时或在捕获图像后检查单个显微镜图像难以确切地知道哪个孔被观察。可能期望确切地知道哪个孔被观察而不必从边缘或角落计数孔。
为此目的，编码的形状诸如特定形状(图10)可包埋到孔中。形状是三个约束之间的权衡：1)各形状应足够地不同以使环氧包被的晶片可容易地再生其，且反过来，可从环氧包被的晶片获取的PDMS压迹中观察到它们；2)孔容积不应在孔之间大体上不同以使细胞将经历大约相同的微环境；和3)壁厚度不以将削弱PDMS结构的方式减少。八边形段(Octagonfragment)提供了这些约束之间有用的平衡。八边形段分为对称或不对称段，以图10所示形状使用。
这一实施例中，选择孔的4×4模块，因为在我们的实验室显微镜下可以容易地在视野中放入16个孔。参考图10，16孔的模块600是利用八边形段来在孔形状中包埋三个数字的实例：1)行数；2)列数；和3)图案号。这一实例中，最多有64个行和列，每个标为0至63。因为在每个模块的每行和每列有4个孔，这个实例解决了在图案的所有行或列最多有256个孔。二进制表示法用于编码行数和列数。如计算机文献中公知的，需要六个二进制位来编码0至63的数值。对称的孔用于表示行1和列0。例如，图10中，孔605是1而孔607是零。
在模块拐角处使用不对称孔。孔601提供起始点和起始方向。此外，其它拐角(602、603和604)提供手性，即，形状与从上方或下方观察的左手和右手显微镜图像的镜像图像不相同。因此，需要方法来确定哪个孔与哪个模块相配而不预先假定特定的观察方向。不是起始孔的模块三个拐角具有指向模块中心的独特方向。因为有两种这样的方向(如：孔602和603)，两种方向可用于代表二进制1(孔602)和二进制0(孔603)以编码另外的信息。在这一实例中，有不同的孔图案，各具有略微不同的尺寸从而适应不同固化温度造成的PDMS收缩差异。三个拐角编码8个不同值，0至7。
图10显示编码三个值的模块：列3、行4和图案5。通过发现设计为具有棒球中本垒形状的不对称孔601，首先在显微镜视野中定位模块。在孔601方向四个孔后，孔602界定了模块的手性，这一情况下是向左。孔603和604证实了这一手性。此外，从高位开始，孔604、603和602编码二进制数101，其以十进制表示为孔图案5。
列编码以高位606开始，结束于低位605：000011、或列3。行编码以高位608开始，结束于低位607：000100、或行4。
这仅是示例性实施例。可容易地改变形状以适应不同设计和材料、以及每个模块孔的数目、大小和相对排列。
在以上说明书和附图公开了不在以下权利要求书范围内的任何另外的主题的情况下，本发明不专用于公众，保留提交一个或多个申请来要求保护另外的发明的权利。
以上仅为了阐述本发明的主旨。应理解的是，本领域技术人员将能够设计各种排列，所述排列尽管在本文没有明确地描述或显示，但体现本发明的原理，而被本发明的主旨和范围所包括。此外，本文列举的所有实例和有条件的措辞大体上意为辅助读者理解本发明的主旨和发明人为促进本领域而提供的概念，应解释为不限于这样的具体列举的实例和条件。而且，本文列举本发明的主旨、各方面、和实施方案以及其具体实施例的所有陈述意为涵盖其结构和功能等价物。另外，意为这样的等价物包括目前已知的等价物和未来开发的等价物，即，进行相同功能的开发的任何元件，而不论其结构。因此，本发明的范围不意为被本文展示和描述的示例性实施方案所限制。而是，本发明的范围和主旨由所附的权利要求书体现。

Claims (20)

1.一种从感兴趣的分离细胞获得信息的方法，包括以下步骤：
将多个单独细胞放置在多个单独孔中，其中每个细胞产生至少一种感兴趣的生物活性剂；
将所述孔中的所述至少一种感兴趣的生物活性剂与附加至少一种结合剂的固体表面接触，其中所述至少一种结合剂选择性地结合所述至少一种感兴趣的生物活性剂，且所述固体表面包含可与所述单独孔关联的可寻址区；
确定关于所述一种或多种感兴趣的生物活性剂与靶结合蛋白结合的结合信息；并
将所述结合信息与所述固体表面的特定寻址区关联，从而鉴定特别感兴趣的孔。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为在所述多个单独孔的每个单独孔中大体上相同的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞选自以下组成的组：原代细胞、来自细胞系的细胞和工程化细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为在所述多个单独孔的每个单独孔中不同的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞选自以下组成的组：浆细胞、来自同一人类受治疗者的不同细胞类型、和来自不同人类受治疗者的相同细胞种类。
6.根据权利要求1所述的方法，其中结合到固体表面的所述至少一种结合剂选自以下组成的组：蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、抗IgG Fcγ亚类特异性抗体、和由所述细胞产生的所述至少一种生物活性剂的靶结合蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括：
向所述孔中的所述细胞加入生物活性剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中向所述细胞加入不同生物活性剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中向所述细胞加入相同生物活性剂。
10.根据权利要求7所述的方法，其中加入所述细胞的所述生物活性剂选自以下组成的组：小分子化合物、siRNA、蛋白和寡核苷酸。
11.根据权利要求7所述的方法，还包括：
获得编码来自所述特别感兴趣的孔的细胞产生的至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列；并
将关于细胞产生的所述感兴趣的生物活性剂的结合性质的信息与编码所述感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列关联。
12.根据权利要求11所述的方法，其中获得所述核苷酸序列的步骤包括：
从所述细胞获得mRNA；
从所述mRNA合成cDNA并在所述cDNA中掺入独特的孔特异性标签；并
将所述cDNA测序。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括：
汇集包含所述标签的所述cDNA序列并同时将所述汇集的cDNA序列测序。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将10,000或更多单独细胞放置在相应数目的单独孔中，且所述固体表面中有相应数目的寻址区；且
其中所述孔是以大于100微孔/cm2的密度互连的微孔，并且其中所述孔是微孔且每个微孔具有1皮升和500纳升之间的容积。
15.一种方法，包括以下步骤：
将来自细胞群的多个单独细胞放置在多个单独孔中，其中所述细胞产生至少一种感兴趣的生物活性剂；
分离感兴趣的生物活性剂；并
从特别感兴趣的孔获得编码所述感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列；并
将感兴趣的所述序列与感兴趣的所述剂关联，其中将5,000或更多细胞放置在包括5,000或更多孔的孔托盘的孔中，并且其中筛选所述孔中剂的感兴趣的特征。
16.根据权利要求15所述的方法，其中细胞产生的所述感兴趣的生物活性剂是抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中获得所述核苷酸序列包括获得所述抗体的重链和轻链的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括：
采用所述核苷酸序列来产生关于所述感兴趣的生物活性剂的元数据。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述元数据包括基于所述核苷酸序列，所述感兴趣的生物活性剂的结合性质。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述元数据包括基于所述细胞群中所述核苷酸序列的出现频率，所述细胞群中所述感兴趣的生物活性剂的出现频率。
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