EA025219B1

EA025219B1 - Микролуночный чип для скрининга целевых клеток и его применение

Info

Publication number: EA025219B1
Application number: EA201070220A
Authority: EA
Inventors: Айшунь Цзинь; Хироюки Киси; Ацуси Мурагути; Цутому Обата
Original assignee: Тояма Префекчер; Вальнева
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2016-12-30
Also published as: US20170023562A1; US9494575B2; KR101371840B1; ES2570633T3; AU2008283301B2; US9977017B2; EP2184345A1; JP4148367B1; AU2008283301A1; HK1140789A1; WO2009017226A1; EA201691174A1; EP2184345B1; US20110294678A1; EP2184345A4; CN101861383B; EA201070220A1; KR20100106294A; CN101861383A; JP2009034047A

Abstract

Изобретение относится к микролуночному чипу для скрининга целевых клеток, содержащему множество лунок на одной из основных поверхностей опорного элемента, где лунки имеют размер, который позволяет помещать в каждую лунку только одну клетку, причем лунки расположены в равноудаленных друг от друга рядах и колонках, отличающееся тем, что на указанную основную поверхность по крайней мере вокруг части лунок нанесен слой вещества, способного связываться с веществом, продуцируемым указанными целевыми клетками, где часть основной поверхности, которая не покрыта указанным слоем вещества, способным связываться с веществом, продуцируемым указанными целевыми клетками, покрыта блокирующим агентом. Кроме того, изобретение относится к способу скрининга целевой клетки, включающему помещение образцов клеток по меньшей мере в часть лунок чипа по п.1; нанесение клеточной культуральной среды на чип, покрывая слой вещества, способного связываться с веществом, продуцируемым целевыми клетками, покрытие и лунки, обеспечивая диффузию веществ, продуцируемых клетками в культуральную среду из лунок в указанный слой; и культивирование клеток после удаления культуральной среды, нанесение на указанный слой меченого вещества, которое специфично связывается с веществом, продуцируемым целевой клеткой; и идентификацию целевой клетки путем детектирования вещества, продуцируемого целевой клеткой посредством меченого вещества, с определением указанной целевой клетки.

Description

Изобретение относится к способу скрининга клеток и к микролуночному чипу, применяемому в указанном способе. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу скрининга иммуноцитов, таких как специфичные иммуноглобулин-продуцирующие клетки и специфичные цитокинпродуцирующие клетки, а также к микролуночному чипу, применяемому в указанном способе.

Уровень техники

Традиционно гибридомы, продуцирующие антигенспецифичные антитела, создавали с целью получения моноклональных антител. В обычном способе получения гибридом получают гибридомы, после чего скринируют клоны гибридом, продуцирующие антигенспецифичные антитела. Однако получение гибридом неэффективно. А именно, не все В-лимфоциты становятся гибридомами, лишь некоторые из Влимфоцитов, подвергнутых слиянию с клетками миеломы, становятся гибридомами. Даже когда гибридому получают из клетки селезенки, стимулированной антигеном, образуются не только одни гибридомы, которые продуцируют антигенспецифичные антитела, - большинство полученных гибридом либо продуцируют посторонние антитела, либо вообще не продуцируют антитела.

Например, при поиске гибридомы, продуцирующей целевое антитело, обычным способом клетки селезенки, взятые у иммунизированной мыши, подвергают слиянию с раковыми клетками миеломы и высевают в примерно десять 96-луночных планшетов. Можно посеять больше, если использовать все клетки, однако существуют временные рамки, когда один человек выполняет скрининг, поэтому оставшиеся клетки замораживают или сохраняют как-либо еще. Обычно гибридомы выращивают приблизительно в 500 лунках, используя данный способ.

Не все гибридомы в указанных 500 лунках пролиферируют с одинаковой скоростью, некоторые растут быстро, а другие растут медленно. Поэтому невозможно проверить рост всех 500 одновременно. Сначала с помощью микроскопа необходимо выполнить проверку, в каких лунках происходит рост клеток и увеличилось ли число клеток достаточно, чтобы можно было проводить проверку на предмет антител. Затем из подходящих лунок отбирают клеточный супернатант и проводят проверку на предмет продукции антигенспецифичных антител. Необходимо выполнить проверку клеток и клеточного супернатанта чрезвычайно быстро. Это обусловлено тем, что гибридомы растут непрерывно и пролиферируют в чрезмерной степени, если остаются без контроля, истощая питательные вещества в среде и погибая. Таким образом, скрининг необходимо закончить до того, как нужные гибридомы погибнут.

Кроме того, в обнаруженной лунке, в которой растет целевая гибридома, часто могут присутствовать гибридомы, продуцирующие другие антитела и растущие в лунке в дополнение к гибридоме, продуцирующей целевое антитело. К тому же, поскольку гибридомы теряют собственные хромосомы в процессе роста, существуют также случаи, когда гибридома, продуцировавшая антитело, вырождается, теряя хромосому с антителом, и становится неспособной к выработке антитела. Рост таких клеток часто идет с более высокой скоростью по сравнению с гибридомами, которые продуцируют антитело, и большинство клеток, культивируемых без контроля, вырождаются, становясь клетками, не продуцирующими антитела. Соответственно, при обнаружении лунки, в которой растет нужная гибридома, клетки из указанной лунки немедленно пересевают в 96-луночный планшет, по одной клетке в каждую лунку (метод критического разведения), а затем опять проводят скрининг на предмет желаемых антителопродуцирующих гибридом (вторичный скрининг). При обнаружении целевой гибридомы необходимо быстро провести вторичный скрининг, пока не ухудшилось состояние клеток.

Как указано выше, поскольку скрининг иногда проводят лишь с некоторыми из полученных гибридом, а не со всеми, становится сложно получить редко встречаемые гибридомы, продуцирующие антигенспецифичные антитела.

Более конкретно, в случае антигенспецифичных человеческих антител существует способ скрининга клеток, продуцирующих антигенспецифичные антитела в линиях, полученных путем трансформации периферических В-лимфоцитов вирусом ЭБ (непатентный документ 1). В данном способе, поскольку частота получения стабильных клеточных линий лимфоцитов является низкой, вероятность получения клеточной линии В-лимфоцитов, продуцирующих антигенспецифичные антитела, чрезвычайно мала. Кроме того, требуется приблизительно месяц, чтобы получить стабильную клеточную линию. К тому же линии В-лимфоцитов, которые являются стабильными, продуцируют лишь малые количества антитела. Хотя гибридомы могут быть получены на мышах, на людях системы получения гибридом с хорошей эффективностью разработано не было.

Гибридомы могут быть получены на мышах. Обычно для получения гибридомы мышь иммунизируют антигеном, забирают селезенку или лимфатические узлы мыши, получают лимфоциты, затем проводят слияние клеток приблизительно 10⁸ лимфоцитов и приблизительно 10⁷ клеток миеломы, используя полиэтиленгликоль или воздействие напряжения, после чего их культивируют в селективной среде, такой как НАТ, гибридомы, которые растут, скринируют с помощью ЕЬТЗА, поточной цитометрии и т.п., чтобы определить, действительно ли они продуцируют антигенспецифичное антитело, отбирая в резуль- 1 025219 тате гибридомы, продуцирующие антигенспецифичные антитела (непатентные документы 2 и 3). При использовании данного способа гибридомы растут в 300-400 лунках. Из них только в нескольких процентах лунок растут гибридомы, продуцирующие антигенспецифичные антитела. Указанное количество зависит от используемого антигена, однако сложно получить гибридомы указанным способом, когда частота В-лимфоцитов, продуцирующих антигенспецифичные антитела, является низкой.

Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали способы удобного отбора лимфоцитов, специфично реагирующих с заданными антигенами в форме как антигенспецифичных лимфоцитов относительно высокой частоты, так и антигенспецифичных лимфоцитов низкой частоты, и получения гибридом, продуцирующих антигенспецифичные антитела, из антигенспецифичных В-лимфоцитов, которые были отобраны. Затем авторы изобрели способ получения гибридом, продуцирующих антигенспецифичные антитела, посредством культивирования отобранных антигенспецифичных В-лимфоцитов с последующим слиянием антигенспецифичных В-лимфоцитов, выращенных в ходе культивирования, с клетками миеломы, для получения гибридом, и подавали заявку на патент (патентный документ 1).

Также предпринимались попытки характеризовать и отбирать индивидуальные клетки и применять клетки, которые были отобраны. Например, было исследовано раздельное обнаружение специфичности к индивидуальному антигену, выделение единичного детектированного антигенспецифичного лимфоцита и применение единичного антигенспецифичного лимфоцита, выделенного с целью получения антитела (патентные документы 2 и 3).

[Патентный документ 1] νΟ 2004/087911.

[Патентный документ 2] Опубликованная неакцептованная заявка на патент Японии 2004-173681.

[Патентный документ 3] Опубликованная неакцептованная заявка на патент Японии 2004-187676.

[Непатентный документ 1] Мейюйк οί ИеШсйпд ЬутрЬосу1е Рипсйопк (Уеткюп 5), Лийс1й ΥΑΝΟ, МюЫо РИЛνΑΚΑ, ейк., СНида1 1дакикНа (1994), ике οί ЕВ \агик йапкГотт В се118 ίοτ ртератайоп οί Нитап топос1опа1 апйЪойу, Ритю ΜΙΖυΝΟ, ТокЫго ΟΗδΑΤΟ, рр.381-391.

[Непатентный документ 2] Ме!Нойк оГ Пе!есйп§ ЬутрНосуЫ Рипсйопк (Уеткюп 5), ЛпйсЫ ΥΑΝΟ, МюЫо ΡυίίνΑΚΑ, ейк., СНидаь 1дакикНа (1994), Ртератайоп оГ топос1опа1 апйЪойу νίΠι В се11 НуЬпйотак, НЫео ΝΑΚίυϋΗΙ, рр.574-576.

[Непатентный документ 3] Мопос1опа1 апйЪой1ек ш ЛпиЪоШек: Α ЬаЪота!огу Мапиа1 Ъу Ей Наг1о\у апй Иау1й Ьапе, Со1й 8ртшд НагЪог ЬаЪота1огу, Со1й 8ртшд НагЪог, ΝΥ, рр.139-244, 1988.

[Непатентный документ 4] 1п уйто, апйЪойу ртойисйоп. 1п СпггеШ Рго(осо1к ш 1ттипо1о§у. Еййей Ъу ТЕ. Сойдап е! а1., 1оНп \УПеу & §опк (№ν Уогк), р.3.8.1-3.8.16, 1991.

[Непатентный документ 5] ВаЪсоок !§., Ьекйе К.В., Ο1кеη Ο.Α., §а1топ Κ.Α., ЗсНтайет IV. Α поуе1 к1га1еду Гог депегайпд топос1опа1 апйЪой1ек Ггот ктд1е, йокИей 1утрНосу!ек ргойисшд апйЪой1ек оГ йейпей кресгйсЫек. Ргос. №И. Αсай. 8сь υδΑ, 93: 7843-7848, 1996.

[Непатентный документ 6] МеакигетеШ оГ ро1ус1опа1 пптипоДоЬиНп куШЬекЫ икт§ Не ЕЕ-ΙδΡΟΤ аккау. 1п СпггеШ Рго!осо1к ш 1ттипо1оду. Еййей Ъу ТЕ. Сойдап е! а1., 1оНп \УПеу & δοηк (Νον Уогк), р.7.14.1-7.14.7, 1991.

[Непатентный документ 7] Αккаук Гог апйЪойу ртойисйоп. 1п СштеШ Рго!осо1к ш 1ттипо1о§у. Еййей Ъу ТЕ. Сойдап е! а1., 1оНп \УПеу & δοηк (№ν Уогк), р.2.1.1-2.1.22, 1991.

[Непатентный документ 8] ТС. Ьоуе, ТЬ. Копап, С.М. Сго!епЪгед, Α.Ο. уап йег Уееп, Н.Ь. Р1оедй, Α тюгоепдгаушд те!Ной Гог тарШ ке1есйоп оГ ктд1е се11к ртойисшд апйдеп-кресгйс апйЪоЫек. №ш.1ге Вю!есйпо1оду, 24: 703-707, 2006.

Все содержание патентных документов 1-3 и непатентных документов 1-8 настоящим включено путем отсылки.

В вышеописанных обычных способах раздельное обнаружение антигенной специфичности индивидуальных лимфоцитов и выделение обнаруженных антигенспецифичных лимфоцитов проводят вручную. В патентных документах 2 и 3 указано, что были подтверждены характерные свойства клеток на клеточном уровне и что также можно выделить указанные клетки. Однако фактическое обнаружение лимфоцитов, которые специфичном реагировали с антигеном, из многочисленных лимфоцитов, является сложным.

В качестве примера способа обнаружения применяется тот факт, что концентрация ионов кальция в лимфоцитах, которые прореагировали с антигеном, повышается, и указанное изменение концентрации ионов кальция детектируют с помощью флуоресценции, определяя, таким образом, антигенспецифичные лимфоциты. Однако в зависимости от типа клетки (лимфоцита) способ генерации флуоресценции, ее интенсивность и т.п. могут различаться. Существуют лимфоциты, в которых концентрация ионов кальция повышается непосредственно при антигенной стимуляции, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Однако также существуют клетки, в которых концентрация ионов кальция повышается только по прошествии определенного времени после антигенной стимуляции, приводя к повышению интенсивности флуоресценции. Кроме того, необходимо почти одновременно и за один цикл измерить интенсивность флуоресценции приблизительно 10000-200000 лимфоцитов, удерживаемых на поверхности пробирки площадью несколько квадратных сантиметров. К тому же, поскольку данная флуоресценция возникает в индивидуальных клетках, интенсивность флуоресценции является низкой, что

- 2 025219 требует высокочувствительной детекции флуоресценции.

На сегодняшний день не существует ни способа, ни устройства, позволяющих одновременно измерять интенсивность многочисленных источников слабой флуоресценции, сосредоточенных в высокой концентрации на поверхности пробирки.

Одним обычным устройством является лазерный сканирующий цитометр. С помощью лазерного сканирующего цитометра можно измерять концентрацию кальция в нескольких сотнях тысяч индивидуальных клеток. Однако продолжительность получения одного скана составляет 10 мин или больше, что исключает возможность детектирования лимфоцитрв в реальном времени, интенсивность флуоресценции которых изменяется через несколько минут после антигенной стимуляции.

Флуоресцентный микроскоп с проектором состоит из обычного флуоресцентного микроскопа, объединенного с проекционным устройством. Флуоресцентный микроскоп с проектором не предоставляет никаких проблем касательно скорости. Однако, как у обычного микроскопа, область проекции является узкой, что позволяет одновременно детектировать флуоресценцию только приблизительно в 1000 клеток. Невозможно одновременно детектировать флуоресценцию в нескольких десятках тысяч-нескольких сотнях тысяч клеток.

Клеточный чип-детектор на основе сканера ДНК-микрочипов представляет собой устройство, которое было разработано для детектирования флуоресценции в клетках, расположенных на клеточных чипах, и может детектировать флуоресценцию внутри или снаружи клеток. Однако это система, в которой с помощью лазера возбуждают флуоресцентный краситель, а затем детектируют флуоресценцию возбуждения. Таким образом, в системах детектирования, которые отслеживают изменения с течением времени, скорость линейного сканирования лазером является низкой, что исключает возможность одновременной детекции областей, включающих множество клеток.

В способах, описанных в вышеуказанных патентных документах 2 и 3, система детектирования реакции для обнаружения клеток, специфично реагирующих с антигеном, должна обладать способностью отслеживать в режиме реального времени изменения уровня кальция во времени, в индивидуальных клетках, а также способностью обнаруживать индивидуальные клетки, которые присутствуют в очень малом количестве (реагируют очень слабо) среди большого количества клеток, что требует наличия способности раздельно и одновременно анализировать большое количество клеток параллельно.

Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ, который позволяет одновременно оценивать свойства большого количества клеток, превышающего 10000, а желательно превышающего 100000, закрепленных на чипе, такие как реакционные свойства антигенстимулированных лимфоцитов, а также раздельно определять свойства индивидуальных клеток.

В-лимфоциты экспрессируют одно антитело на поверхности клетки. Когда болезнетворный микроорганизм (антиген) или нечто подобное проникает в организм, антиген связывается антителом на поверхности клетки, активируя клетку и вызывая ее пролиферацию и дифференцировку. Наконец, клетка дифференцируется в антителосекретирующую клетку. Существует уже целый ряд способов определения антителосекретирующих клеток. Типичными способами определения клеток, секретирующих одно антитело, являются метод бляшкообразования или локального гемолиза и метод иммуноферментного спотанализа (ЕЫ8РОТ).

Метод локального гемолиза является способом определения клеток, секретирующих антигенспецифичное антитело, в котором в качестве индикатора служит гемолиз, вызванный связыванием антител с эритроцитами, меченными антигенами, которые окружают антителосекретирующие клетки (непатентный документ 4). Уже был разработан способ, который позволяет детектировать клетки, секретирующие антигенспецифичные антитела, с помощью метода локального гемолиза, и выделять ген, кодирующий антитело (непатентный документ 5).

Метод ЕЫ8РОТ является способом, в котором клетки вносят в планшет, покрытый антигеном, вызывая связывание антитела, секретируемого антителрсекретирующими клетками, с антигеном вблизи клеток, после чего антитело детектируют с помощью меченного ферментом анти-1д антитела или подобным образом (непатентный документ 6). В методе ЕЫ8РОТ в ходе детектирования связывания антигенспецифичного антитела вблизи клеток с помощью меченного ферментом анти-1д антитела, сами клетки смывают, исключая возможность выделения клеток, секретирующих антигенспецифичное антитело.

Гибридомы представляют собой антителосекретирующие клетки. В любом случае в ходе скрининга гибридом обычно используют твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ§Л) (непатентный документ 7). Недавно указанный метод был дополнительно усовершенствован: сообщили о способе, с помощью которого индивидуальные гибридомы культивируют в маленьких лунках, а антитело, которое секретируется в каждой лунке, детектируют с помощью меченного флуоресцентной меткой антигена или чего-либо подобного, обнаруживая, таким образом, клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело (непатентный документ 8).

Для достижения вышеуказанной цели настоящего изобретения авторы настоящего изобретения привели обширное исследование с целью разработки способа детектирования иммуноцитов, таких как новые клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело, который полностью отличается от способов, описанных в непатентных документах 4-8. Изобретение было разработано на данном основании.

- 3 025219

Предпочтительные варианты осуществления изобретения [микролуночный чип].

Микролуночный чип настоящего изобретения представляет собой микролуночный чип, на одной из основных поверхностей основного элемента которого расположено множество лунок, имеющих такой размер, что в них может проходить только одна клетка. Микролуночный чип, имеющий такую структуру, может применяться в форме, описанной, например, в патентных документах 1-3.

Множество микролунок расположено в равноудаленных друг от друга рядах и колонках на микролуночном чипе.

Ни форма, ни размер микролунок конкретно не ограничены. Впрочем, например, форма микролунки может являться цилиндрической. Также микролунка может являться нецилиндрической, например многогранником, состоящим из множества граней (например, параллелепипедом, шестиугольной призмой или восьмиугольной призмой), перевернутым конусом, перевернутой пирамидой (перевернутой треугольной пирамидой, перевернутой квадратной пирамидой, перевернутой пятиугольной пирамидой, перевернутой шестиугольной пирамидой или перевернутой многоугольной пирамидой с семью или более углами), или иметь форму, объединяющую две или более из перечисленных форм. Например, она может являться частично цилиндрической, а остальная часть может иметь форму перевернутого конуса. В случае перевернутой конической или перевернутой пирамидальной формы отверстие микролунки находится на основании. Впрочем, форма может быть такой, при которой часть вершины перевернутого конуса или перевернутой пирамиды отсечена (когда дно микролунки является плоским). В случае конической формы и параллелепипеда дно микролунки обычно плоское, но при этом также возможны изогнутые поверхности (выпуклые или вогнутые). Причина, по которой дно микролунки сделано изогнутым, та же, что и в случае форм, состоящих из перевернутого конуса или инвертированной пирамиды с усеченной вершиной.

Что касается микролунки, имеющей цилиндрическую форму, ее размеры, например диаметр, могут составлять 3-100 мкм. Когда биологическая клетка является В-лимфоцитом, диаметр предпочтительно равен 4-15 мкм. Кроме того, глубина может составлять от 3 до 100 мкм, а в случае, когда биологическая клетка является В-лимфоцитом, глубина предпочтительно составляет 4-40 мкм. Впрочем размеры микролунки, как изложено выше, могут быть соответствующим образом установлены с учетом необходимого соотношения диаметра биологической клетки, помещаемой в микролунку, и размеров микролунки.

Форму и размер микролунки соответствующим образом устанавливают с учетом типа биологической клетки (формы, размера и т.п. биологической клетки), помещаемой в микролунку, при этом в микролунке может содержаться только одна биологическая клетка.

Для уверенности в том, что в микролунке будет содержаться одна биологическая клетка, например диаметр наибольшей окружности, которая может быть вписана в проекцию микролунки, соответственно находится в пределах 0,5-2, желательно 0,8-1,9 и предпочтительно 0,8-1,8 диаметра биологической клетки, которая содержится в микролунке.

Кроме того, глубина микролунки соответственно находится в пределах 0,5-4, желательно 0,8-1,9 и предпочтительно 0,8-1,8 диаметра биологической клетки, которая содержится в микролунке.

Количество микролунок, присутствующих в одном микролуночном чипе, конкретно не ограничено. Однако в случае, когда биологическая клетка является лимфоцитом, а частота данного антигенспецифичного лимфоцита на 10⁵ клеток составляет от 1 до приблизительно 500 в верхнем пределе, число микролунок может изменяться в пределах от приблизительно 2000 до 1000000 на см², например.

Микролуночный чип настоящего изобретения дополнительно включает по меньшей мере на части своей основной поверхности вокруг лунок слой покрытия вещества, обладающего способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, выработанного по меньшей мере частью клеток, содержащихся в лунках. Это является отличительным признаком микролуночного чипа настоящего изобретения.

В микролуночном чипе настоящего изобретения основной элемент может представлять собой пластину (однако какого-либо намерения ограничить его пластиной нет), а слой покрытия расположен по меньшей мере на части основной поверхности вокруг множества лунок, расположенных на основной поверхности основного элемента. Микролуночный чип настоящего изобретения применяется для детектирования присутствия или отсутствия связывания между веществом, выработанным по меньшей мере частью клеток, содержащихся в лунках, и веществом в слое покрытия.

Клетки, содержащиеся в лунках (образцы клеток), могут являться, например, группой клеток, включающей иммуноглобулин-продуцирующие клетки или цитокин-продуцирующие клетки. Кроме того, иммуноглобулин-продуцирующие клетки и цитокин-продуцирующие клетки могут являться природными клетками, гибридомами или линиями клеток. Природные клетки могут являться клетками млекопитающих, например клетками, полученными от людей, мышей и т.п. Гибридомы могут быть созданы обычными способами, описанными в уровне техники. Линии клеток могут являться линиями, в которые была, генетически введена экспрессионная библиотека кДНК или что-либо подобное.

В случае, когда клетки, содержащиеся в лунках, являются образцами клеток, включающими иммуноглобулин-продуцирующие клетки, то в качестве вещества, обладающего способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, вырабатываемого клетками, может применяться антиген или антитело против иммуноглобулина, способное к реакции с иммуноглобулином в форме вещества, вырабатываемо- 4 025219 го иммуноглобулин-продуцирующими клетками. Присутствие или отсутствие связывания детектируют с использованием антигена или антитела к вырабатываемому иммуноглобулину.

В случае, когда клетки, содержащиеся в лунках, являются образцами клеток, включающими цитокин-продуцирующие клетки, то в качестве вещества, обладающего способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, вырабатываемого клетками, может применяться антитело против цитокина, способное к реакции с цитокином, который является веществом, вырабатываемым цитокинпродуцирующими клетками, или рецепторы. Присутствие или отсутствие связывания детектируют с использованием антитела к цитокину или рецептора цитокина.

Или же, когда клетки, содержащиеся в лунках, являются образцами клеток, включающими иммуноглобулин-продуцирующие клетки, веществом, обладающим способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, вырабатываемого клетками, может являться рецептор или рецептор цитокина, способный к реакции с иммуноглобулином, который выработан иммуноглобулин-продуцирующими клетками. В данном случае присутствие или отсутствие связывания детектируют с использованием лиганда или цитокина, способного к реакции с рецептором цитокина или рецептором. Когда выработанный иммуноглобулин связывается с рецептором или рецептором цитокина, связывание с лигандом или цитокином, используемым для детектирования присутствия или отсутствия связывания, блокируется, что позволяет детектировать присутствие или отсутствие связывания.

Примеры:

(1) веществ, обладающих способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, выработанного клетками (связывающее вещество);

(2) клеток, содержащихся в лунках (образцов клеток);

(3) веществ, вырабатываемых клетками (вырабатываемых веществ); и (4) меченых веществ (меченых веществ), предназначенных для идентификации вырабатываемых веществ, приведены в таблице ниже.

Вещество, используемое для мечения вещества, предназначенного для идентификации вырабатываемого вещества, может являться, например, флуоресцентным веществом. Впрочем, оно не ограничено флуоресцентными веществами, и в качестве метки могут применяться другие вещества. Мечение флуоресцентным веществом, например, антигена или антитела, служащего в качестве меченого вещества, может быть выполнено обычными способами. Существуют случаи, когда меченое вещество специфично связывается с вырабатываемым веществом, и случаи, когда оно специфично связывается со связывающим веществом.

- 5 025219

Связывающее вещество	Клетка	Вырабатываемое вещество	Меченое вещество
Анти- иммуноглобулин	В-лимфоцит	Иммуноглобулин (антитело)	Антиген
Антитело		Все антитела, такие как 1дС, 1дМ, 1дА, 1дЕ
Анти- иммуно гл обулин	В-лимфоцит	Иммуноглобулин (антитело)	Антитело против имму н о глобулин а
Антитело		Все антитела, такие как Где, 1дм, 1дА, 1дЕ
Антитело против 1дС	В-лимфоцит	ГдС	Антиген
Антитело против Где	В-лимфоцит	1дС	Антитело против ГдС
Антитело против ГдМ	В-лимфоцит	1дМ	Антиген
Антитело против 1дМ	В-лимфоцит	ХдМ	Антитело против 1дМ
Антитело против 1дА	В-лимфоцит	ХдА	Антиген
Антитело против 1дА	В-лимфоцит	ХдА	Антитело против 1дА
Антитело против ГдЕ	В-лимфоцит	1дЕ	Антиген
Антитело против 1дЕ	В-лимфоцит	ХдЕ	Антитело против 1дЕ
Антитело против цитокина	т- лимфоцит, другие	Цитокин	Антитело против цитокина
Антитело против цитокина	Т- лимфоцит, другие	Цитокин	(Растворимый) рецептор цитокина
(Растворимый} рецептор цитокина	Т- лимфоцит, другие	Цитокин	Антитело против цитокина

Антиген	В-лимфоцит	ГдС	Антитело против 1дС
Антиген	В-лимфоцит	1дМ	Антитело против 1дМ
Антиген	В-лимфоцит	1дА	Антитело против 1дА
Антиген	В-лимфоцит	1дЕ	Антитело против 1дЕ
(Растворимый) рецептор цитокина	В-лимфоцит	Антитело	Цитокин*
(Растворимый) рецептор	В-лимфоцит	Антитело	Лиганд**

* Детектирование блокирования антителом связывания цитокина.

** Детектирование блокирования антителом связывания лиганда.

При формировании слоя покрытия связывающего вещества основную поверхность опорной пластины, на которой предстоит формировать слой покрытия, обрабатывают, например, силановым аппретом, чтобы гарантировать связывание связывающего вещества и основной поверхности. Затем раствор, содержащий связывающее вещество, может быть нанесен на поверхность, обработанную силановым аппретом, с формированием слоя покрытия. Количество наносимого связывающего вещества в слое покрытия может быть соответственно определено в зависимости от типа связывающего вещества, типа клетки и вырабатываемого вещества, а также типа меченого вещества. Обработка поверхности для обеспечения

- 6 025219 связывания связывающего вещества с основной поверхностью не ограничивается обработкой с применением силанового аппрета - для использования может быть соответственно выбрано любое вещество, повышающее связывание связывающего вещества, состоящего из белка или чего-либо подобного, с поверхностью подложки, состоящей из неорганического материала (например, кремниевого материала) или органического материала (например, полимерного материала).

На поверхности, которая покрыта связывающим веществом, могут иметь место случаи, когда связывающее вещество может быть нанесено неплотно, и на поверхности остаются открытые участки в зависимости от количества покрытия. В таких случаях, особенно когда поверхность обработали силановым аппретом, как изложено выше, имеются случаи, когда вещество, выработанное клетками, неспецифично свяжется с поверхностью подложки. Такое неспецифичное связывание приводит к уменьшению точности чувствительности обнаружения. Таким образом, в настоящем изобретении по меньшей мере часть основной поверхности, на которую не нанесен слой покрытия вещества, обладающего способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, вырабатываемого клетками, которые содержатся в лунках, предпочтительно покрыта блокирующим агентом. Примером блокирующего агента является водорастворимый полимер ЫрМиге (зарегистрированная торговая марка), имеющий структурное звено в форме 2метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина (МРС), обладающее такой же структурой, как и полярное основание фосфатидилхолин, входящее в состав клеточной мембраны.

Способ скрининга.

В способе скрининга настоящего изобретения для отбора целевой клетки из группы клеток, содержащих образцы клеток, применяется микролуночный чип настоящего изобретения; при этом способ включает следующие стадии:

(1) помещение образцов клеток и клеточной культуральной среды по меньшей мере в часть лунок микролуночного чипа;

(2) погружение слоя, покрытия и лунок в культуральную среду и культивирование клеток в течение некоторого промежутка времени в состоянии, которое допускает диффузию веществ, содержащихся в культуральной среде, из клеток в слой покрытия;

(3) после удаления культуральной среды добавление меченого вещества, которое специфично связывается с веществом, вырабатываемым целевыми клетками, присутствующими среди образцов клеток, в слой покрытия; и (4) детектирование вещества, которое было выработано или секретировано целевой клеткой и связано с веществом в слое покрытия посредством меченого вещества с определением целевой клетки.

(1) Вещество, обладающее способностью связываться по меньшей мере с частью вещества, вырабатываемого клеткой (связывающее вещество); (2) клетки, содержащиеся в лунках (образцы клеток); (3) вещество, вырабатываемое клетками (вырабатываемое вещество); и (4) вещество, которое было помечено, идентифицирующее вырабатываемое вещество (идентифицирующее меченое вещество), применяемые в способе скрининга настоящего изобретения, идентичны соответствующим веществам, описанным для микролуночного чипа настоящего изобретения, а элементы, приведенные в таблице, являются их примерами.

Стадия (1).

Клетки (группа клеток), включающие образцы клеток, вводят вместе с клеточной культуральной средой по меньшей мере в часть лунок микролуночного чипа. Перед введением клеток лунки микролуночного чипа и область вокруг них очищают с применением среды; надлежащее удаление примесей, налипших на поверхности в ходе формирования слоя покрытия связывающего вещества, желательно для точного детектирования. Затем клетки вводят вместе с культуральной средой в лунки. Образцы клеток, которые содержатся в лунках, могут состоять из группы клеток, содержащей иммуноглобулинпродуцирующие клетки или цитокин-продуцирующие клетки. Кроме того, иммуноглобулинпродуцирующие клетки и цитокин-продуцирующие клетки могут являться природными клетками или гибридомами. Указанные группы клеток могут быть получены известными способами.

Клетки, которые содержатся в лунках, могут являться клетками, которые стимулировали требуемым антигеном заранее, чтобы вызвать состояние, обеспечивающее выработку вещества. Например, в случае иммуноглобулин-продуцирующих клеток они предпочтительно являются клетками, которые стимулировали требуемым антигеном заранее, чтобы вызвать состояние, обеспечивающее выработку иммуноглобулина. Точно так же в случае цитокин-продуцирующих клеток они предпочтительно являются клетками, которые стимулировали требуемым антигеном заранее, чтобы вызвать состояние, обеспечивающее выработку цитокина. Требуемый антиген конкретно не ограничен; соответственно могут быть выбраны различные требуемые элементы группы, состоящей из белков, сахаров, липидов, нуклеиновых кислот, органических соединений, неорганических соединений, а также их комбинаций (включая клетки). Культуральная среда может быть соответственно определена в зависимости от типа вводимых и детектируемых клеток.

Стадия (2).

Слой покрытия и лунки погружают в культуральную среду и культивируют клетки в состоянии, которое допускает диффузию веществ, содержащихся в культуральной среде, из лунок в слой покрытия.

- 7 025219

Культивируемые клетки вырабатывают вещества, которые поступают в культуральную среду, диффундируя из лунок в слой покрытия вокруг лунок. Выработанные вещества, которые диффундируют и достигают слоя покрытия, связываются связывающими веществами, входящими в состав слоя покрытия. Условия культивирования могут быть соответственно определены в зависимости от типа клеток. Период культивирования может быть соответственно определен, чтобы обеспечивать выработку детектируемого количества выработанного вещества, связываемого связывающим веществом, входящим в состав слоя покрытия. В слое покрытия вокруг лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают вещество, связывание между выработанным веществом и связывающим веществом не происходит. Чрезмерно длительный период культивирования приводит к чрезмерно широкой диффузии выработанного вещества, что иногда мешает определять те лунки, в которых содержатся клетки, продуцирующие вырабатываемое вещество. Период культивирования предпочтительно соответственно определен в пределах диапазона, позволяющего быстрое определение лунок, содержащих клетки, продуцирующие вырабатываемое вещество.

Стадия (3).

При завершении культивирования после необязательного удаления культуральной среды меченое вещество, специфично связывающееся с веществом, выработанным целевыми клетками, присутствующими среди образцов клеток, добавляют в слой покрытия. Вещество, выработанное целевыми клетками, диффундирует в процессе культивирования, связываясь со связывающим веществом, входящим в состав слоя покрытия. При добавлении меченого вещества на данном этапе меченое вещество связывается с выработанным веществом, которое связалось со слоем покрытия или связывается со слоем покрытия, который не был блокирован выработанным веществом, связавшимся со слоем покрытия. В первом случае меченое вещество иногда связывается с выработанным веществом. В последнем случае меченое вещество связывается не с выработанным веществом, а со связывающим веществом, формирующим слой покрытия. Данный пункт более подробно описан ниже.

Перед добавлением меченого вещества желательно удалить культуральную среду. Когда клетки, содержащиеся в лунках, являются, например, иммуноглобулин-продуцирующими клетками, в культуральную среду секртируются большие количества антитела. Например, при добавлении антитела к иммуноглобулину оно связывается с антителом в культуральной среде до того, как оно успевает связаться с антителом на поверхности чипа и может устранить возможность обнаружения антитела, связанного на поверхности чипа. Впрочем, имеют место случаи, когда детектирование может быть выполнено, без проблем при объединении клеток и связывающих веществ, даже когда меченое вещество добавляют в слой покрытия без удаления культуральной среды.

Стадия (4).

Вещество, выработанное целевой клеткой, которое было связано с веществом в слое покрытия, детектируют посредством меченого вещества, определяя при этом целевую клетку. Меченое вещество связывается с выработанным веществом, которое связано со слоем покрытия. Таким образом, можно определить клетку (целевую клетку), продуцирующую вырабатываемое вещество, связывающееся со слоем покрытия, посредством детектирования меченым веществом.

В случае, когда меченое вещество является веществом, специфично связывающимся с вырабатываемым веществом, меченое вещество связывается с вырабатываемым веществом, которое диффундировало из лунок в слой покрытия вокруг лунок, достигло слоя покрытия и связалось со связывающим веществом, формирующим слой покрытия. Затем данное связанное меченое вещество детектируют. Кроме того, связывания выработанного вещества и связывающего вещества в слое покрытия вокруг лунок, в которых не вырабатывалось вещество, не происходит. Таким образом, не происходит связывания меченого вещества, в результате чего меченое вещество не детектируют.

В случае, когда меченое вещество является веществом, специфично связывающимся со связывающим веществом, выработанное вещество, которое диффундировало из лунок в слой покрытия вокруг лунок, достигая слоя покрытия и связываясь со связывающим веществом, формирующим слой покрытия, блокирует связывание меченого вещества и связывающего вещества. Кроме того, связывания выработанного вещества и связывающего вещества в слое покрытия вокруг лунок, в которых не вырабатывалось вырабатываемое вещество, не происходит. Таким образом, связывание меченого вещества и связывающего вещества не блокируется, и меченое вещество связывается. В данном случае меченое вещество не детектируют в лунках, в которых продуцировалось вырабатываемое вещество, отличая их от лунок, в которых детектировали меченое вещество.

В случае, когда меченое вещество является, например, флуоресцентной меткой, целевые клетки могут быть определены с помощью флуоресцентного микроскопа, флуоресцентного сканера изображений, устройства для считывания изображений и т.п.

В вариантах осуществления, описанных ниже, преимущественно применяются чипы с лунками правильной шестиугольной формы (внизу слева на фиг. 1). В данном случае сигнал распространяется почти по концентрической окружности (вверху слева на фиг. 1). Однако, как показано внизу справа на фиг. 1, когда в лунке правильной шестиугольной формы сформирован диагональный разрез, вырабатываемое антитело или что-либо также распространяется в направлении разреза, приводя к форме сигнала

- 8 025219 наподобие системы Млечного пути, как показано вверху справа на фиг. 1. Таким путем сигнал от меченого вещества, полученный при взаимодействии с продуктом, изменяется в форме в зависимости от формы лунки.

В случае, когда меченое вещество является веществом, специфично связывающимся с выработанным веществом (1).

Когда образцы клеток, содержащиеся в лунках, включают иммуноглобулин-продуцирующие клетки, культивирование клеток приводит к выработке иммуноглобулина. При использовании слоя покрытия с антителом к иммуноглобулину или антигеном в качестве связывающего вещества вырабатываемый иммуноглобулин связывается со слоем покрытия, и в результате выработанный иммуноглобулин, связанный в слое покрытия, может быть детектирован с использованием антитела к иммуноглобулину или антигена. Вокруг лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают иммуноглобулин, т.е. вокруг лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают иммуноглобулин при стимулировании антигеном, который был добавлен, иммуноглобулин, который диффундирует из лунок, отсутствует. Указанные лунки можно отличить от лунок, содержащих клетки, которые вырабатывают иммуноглобулин. Таким путем можно определить целевые клетки в форме клеток, продуцирующих антигенспецифичный иммуноглобулин.

Ниже приведено более подробное описание с использованием фиг. 2.

(A) Антителосекретирующие клетки добавляют в отдельные лунки микролуночного чипа, изготовленного из кремния, на поверхности которого было связано антитело к иммуноглобулину (1д).

(B) Клетки культивируют, обеспечивая секрецию клетками антитела. Антитело, секретированное клетками, связывается с анти-1д антителом вокруг лунок.

(C) При добавлении антигена, меченного флуоресцентной меткой, антиген связывается с антигенспецифичным антителом, которое было уловлено вокруг лунок.

(Ό) Наблюдение с помощью флуоресцентной микроскопии, сканирования и т.п. показывает, что антигенспецифичное антитело распространилось вокруг лунок в форме кольца.

В случае, когда меченое вещество является веществом, специфично связывающимся с выработанным веществом (2).

Когда образцы клеток, содержащиеся в лунках, включают цитокин-продуцирующие клетки, культивирование клеток приводит к выработке цитокина. При использовании слоя покрытия с антителом против цитокина или рецептором цитокина в качестве связывающего вещества, вырабатываемый цитокин связывается со слоем покрытия, и в результате выработанный цитокин, связанный в слое покрытия, может быть детектирован с использованием антитела к цитокину или рецептора цитокина. Вокруг лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают цитокин, т. е. лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают цитокин при стимулировании антигеном, который был добавлен, цитокин из лунок не диффундирует. Указанные лунки можно отличить от лунок, содержащих клетки, которые вырабатывают цитокин. Таким путем можно определить целевые клетки в форме цитокин-продуцирующих клеток.

В случае, когда меченое вещество является веществом, специфично связывающимся со связывающим веществом.

Когда образцы клеток, содержащиеся в лунках, включают иммуноглобулин-продуцирующие клетки, культивирование клеток приводит к выработке иммуноглобулина. При использовании слоя покрытия с рецептором цитокина или рецептором в качестве связывающего вещества часть выработанного иммуноглобулина связывается со слоем покрытия, при этом указанная часть выработанного иммуноглобулина, которая связалась со слоем покрытия, блокирует связыванием рецептора цитокина или рецептора с меченым веществом в форме цитокина или лиганда. Меченое вещество не связывается вокруг лунок, содержащих иммуноглобулин-продуцирующие клетки. Вокруг лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают иммуноглобулин, т.е. лунок, содержащих клетки, которые не вырабатывают иммуноглобулин при стимулировании антигеном, который был добавлен, иммуноглобулин из лунок не распространяется и, таким образом, связывание рецептора цитокина или рецептора с цитокином или лигандом не блокировано. Вокруг лунок, содержащих клетки, которые вырабатывают иммуноглобулин, который не связывается с рецептором цитокина или рецептором, и вокруг лунок, содержащих клетки, вырабатывающие иммуноглобулин, который связывается с рецептором цитокина или рецептором, но при этом связывание между рецептором цитокина или рецептором и цитокином или лигандом не блокировано, иммуноглобулин, диффундирующий из лунок, связывается, но при этом связывание рецептора цитокина или рецептора с цитокином или лигандом не блокировано. Такие лунки можно отличить от лунок, содержащих клетки, вырабатывающие иммуноглобулин. Целевые клетки в форме клеток, вырабатывающих антигенспецифичный иммуноглобулин, таким образом, могут быть определены.

Далее вышеуказанный способ описан на основе фиг. 3.

(A) Рецептор нанесен на поверхность чипа.

(B) Антителосекретирующие клетки добавляют в микролунки и культивируют. Секретируемое антитело диффундирует. Рецепторспецифичное антитело связывается с рецептором вокруг лунок.

(C) Когда антитело, которое связалось с рецептором, связывается с лиганд-связывающим сайтом, то лиганд, меченный флуоресцентной меткой, не может связаться с рецептором.

- 9 025219 (Ό) Когда антитело, которое связалось с рецептором, связывается не с лиганд-связывающим сайтом, а с чем-либо иным, меченный флуоресцентной меткой лиганд может связаться с рецептором.

Способ получения целевых клеток.

Настоящее изобретение включает способ получения целевых клеток, включающий выделение из лунок целевых клеток, которые были определены с помощью вышеописанного способа скрининга настоящего изобретения. Целевые клетки могут являться клетками, продуцирующими специфичный иммуноглобулин, или клетками, продуцирующими специфичный цитокин.

Настоящее изобретение обеспечивает получение белка антигенспецифичного антитела посредством выделения гена антигенспецифичного иммуноглобулина из выделенной целевой клетки с последующей экспрессией кДНК антитела и получения белка антигенспецифичного антитела. Кроме того, может быть выделена мРНК гена рецептора Т-клеток, экспрессируемого клеткой, которая вырабатывала цитокин, после чего кДНК рецептора Т-клетки может быть выделена и введена в другую клетку с целью экспрессии белка рецептора Т-клетки.

Варианты осуществления.

Настоящее изобретение более подробно описано ниже на основе вариантов осуществления.

Далее описан пример изготовления микролуночного чипа.

Пример изготовления 1.

Далее описан пример изготовления, в котором применяется кремниевая подложка. Фиг. 4-1 является примером микролуночного чипа на основе примера изготовления 1. Примеры стадий изготовления показаны на фиг. 4-2.

(1) Оксидную пленку 1-а формировали на кремниевой подложке 1-Ь.

(2) Фоторезист 1-с, такой как ОРРК-800 (Токуо Окка Кодуо), наносили на подложку, а для переноса шаблона использовали экспонирующее устройство.

(3) Оксидную пленку 1-а, облученную через слой фоторезиста 1-с, подвергали травлению буферизованной фтороводородной кислотой.

(4) Микролунки 1-ά глубиной 10-20 мкм формировали путем сухого травления или жидкостного травления. Фоторезист 1-с удаляли подходящим путем в зависимости от способа травления.

(5) Поверхность предварительно обрабатывали адгезионным материалом, чтобы антитела связывались однородно. Например, силилирование использовали для формирования силильных групп 1-е на поверхности и на внутренних, стенках лунок. Существуют различные материалы и способы, которые могут использоваться в данной обработке, и они не ограничиваются обработкой, используемой в настоящем примере изготовления.

(6) Детектирование антителосекретирующих клеток проводили согласно настоящему изобретению.

Пример изготовления 2.

Чтобы более четко наблюдать антитела, секретируемые клетками, вокруг лунок можно сформировать ячейки. На фиг. 5-1 показан внешний вид такой ячейки, а на фиг. 5-2 показан пример изготовления.

(1) Оксидную пленку 2-а формировали на кремниевой подложке 2-Ь.

(2) Фоторезист 2-с, такой как ОРРК-800 (Токуо Окка Кодуо), наносили на подложку, а для переноса шаблона использовали экспонирующее устройство.

(3) Оксидную пленку 2-а, облученную через слой фоторезиста 2-с, подвергали травлению буферизованной фтороводородной кислотой.

(4) Фоторезист 2-с удаляли и посредством травления формировали углубления 2-ά глубиной 1-5 мкм.

(5) Фоторезист 2-е, такой как ОРРК-800 (Токуо Окка Кодуо), снова наносили на подложку, и экспонирующее устройство использовали для переноса шаблона. Когда углубления являются глубокими, может использоваться негативный фоторезист, такой как ОМК-85 (Токуо Окка Кодуо).

(6) Лунки 2-Г глубиной 10-20 мкм формировали путем сухого травления.

(7) Поверхность предварительно обрабатывали адгезионным материалом, чтобы антитела связывались однородно. Например, силилирование использовали для формирования силильных групп 2-д на поверхности и на внутренних стенках лунок. Существуют различные материалы и способы, которые могут использоваться в данной обработке, и они не ограничиваются обработкой, используемой в настоящем примере изготовления.

(8) Детектирование антителосекретирующих клеток проводили согласно настоящему изобретению. В настоящем примере, поскольку вокруг лунок сформированы стенки, предотвращающие диффузию антител, это препятствует размыванию в результате диффузии антител, облегчая идентификацию изображения.

На фиг. 5-3 показан результат тестирования настоящего примера изготовления.

Пример изготовления 3.

Путем увеличения площади поверхности вокруг лунок можно более точно наблюдать секретируемые антитела. Площадь поверхности может быть увеличена путем формирования пористой кремниевой структуры или, например, неровной структуры. В неакцептованной заявке на патент Японии (опубликованной) Хэйсэй 6-21509 (1994), например, описан способ изготовления пористого кремния. Неровная

- 10 025219 структура может быть изготовлена путем травления, вакуумного осаждения и т.п. На фиг. 6-1 показан внешний вид данной структуры, а на фиг. 6-2 показан пример ее изготовления.

(1) Оксидную пленку 3-а формировали на кремниевой подложке 3-Ь.

(2) Фоторезист 3-с такой как ОРРК-800 (Токуо ОЬка Кодуо), наносили на подложку, а для переноса шаблона использовали экспонирующее устройство.

(3) Оксидную пленку 3-а, облученную через слой фоторезиста 3-с, подвергали травлению буферизованной фтороводородной кислотой.

(4) Для увеличения площади поверхности отверстий, в облучаемых частях, может быть изготовлена, например, пористая структура 3-й. Пористую структуру формируют путем химической анодной конверсионной обработки или т. п. Также на поверхности, с использованием смеси фтороводородной и азотной кислот, может быть сформирована наноструктура.

(5) Фоторезист 3-е, такой как ОРРК-800 (Токуо ОЬка Кодуо), снова наносили на подложку, и использовали экспонирующее устройство для переноса шаблона. Для формирования лунок 3-Р глубиной 10-20 мкм использовали сухое травление.

(6) Поверхность предварительно обрабатывали адгезионным материалом, чтобы антитела связывались однородно. Например, силилирование использовали для формирования силильных групп 3-д на поверхности и на внутренних стенках лунок. Существуют различные материалы и способы, которые могут использоваться в данной обработке, и они не ограничиваются обработкой, используемой в настоящем примере изготовления.

(7) Детектирование антителосекретирующих клеток проводили согласно настоящему изобретению. В настоящем примере, поскольку площадь поверхности вокруг лунок увеличена и поскольку увеличена плотность флуоресцентно меченных связей, идентификация флуоресцентного изображения облегчается.

Пример изготовления 4.

При локальном связывании антитела только вокруг лунок можно наблюдать секрецию антитела более четко. В настоящем способе вещество, посредством которого антитело связывается только вокруг лунок, может быть нанесено с помощью конечной обработки при использовании шаблона или т. п. Внешний вид данной структуры показан на фиг. 7-1, и пример изготовления - на фиг. 7-2. Оксидную пленку 4-а формировали на кремниевой подложке 4-Ь.

(1) Фоторезист 4-с, такой как ОРРК-800 (Токуо ОЬка Кодуо), наносили на подложку, и использовали экспонирующее устройство для переноса шаблона.

(2) Оксидную пленку 4-а, облученную через слой фоторезиста 4-с, подвергали травлению буферизованной фтороводородной кислотой.

(3) Поверхность предварительно обрабатывали адгезионным материалом, чтобы антитела связывались однородно. Например, поверхность обрабатывали силановым аппретом в форме гексаметилдисилазана или т.п. Существуют различные материалы и способы, которые могут использоваться в данной обработке, и они не ограничиваются обработкой, используемой в настоящем примере изготовления.

(4) Фоторезист 4-е, такой как ОРРК-800 (Токуо ОЬка Кодуо), наносили поверх предыдущих слоев.

(5) Контур поверхности, связывающей антитело, формировали на фоторезисте 4-е с помощью экспонирующего устройства. Размеры поверхности, связывающей антитело, которые превышают размеры лунки, составляют от 1 мкм до 1/2 расстояния между смежными лунками.

(6) Фоторезист 4-е подвергали облучению, формируя контуры лунок с помощью экспонирующего устройства.

(7) Сухое травление использовали для формирования лунок 4-Р глубиной 10-20 мкм в контуре лунок. В ходе формирования лунок вещество 4-й одновременно удаляли, связывающее антитело, которое не было защищено слоем фоторезиста 4-е. Оно может быть также удалено с помощью кислородной плазмы или т. п.

(8) Фоторезист 4-е удаляли с помощью органического растворителя, такого как ацетон. Поскольку связывание вещества с антителами имеет место только вокруг лунок, зона связывания антитела может быть ограничена.

(9) Вышеуказанные стадии могут быть упрощены путем применения фоточувствительного силанового аппрета. В частности, после проведения обработки согласно примеру изготовления 1, наносили фоточувствительный силановый аппрет и формировали требуемый контур посредством засвечивания, достигая тех же результатов, как и в настоящем примере изготовления.

Флуоресцентно меченое антитело вносили в микролуночный чип, изготовленный согласно настоящему примеру изготовления. Наблюдаемое состояние связывания показано на фиг. 7-3. Связывание антитела наблюдали только на участках вокруг лунок. Кроме того, настоящий пример изготовления отличается тем, что поверхность, связывающая антитело, сформировали только вокруг лунок, при этом существуют различные способы достижения этого. Также можно использовать группу полимеров йРХ или т.п., производимых компанией КЫитоЮ 8аидуо. Они формируют аминогруппы на поверхности поли-пксилиленовой смолы. Такая же связывающая поверхность может быть получена, как в настоящем примере изготовления. Тот же самый эффект может быть также достигнут путем формирования пленки, обладающей обратным эффектом по сравнению с эффектом первичного покрытия для связывания антитела

- 11 025219 на частях, отличных от антителосвязывающей поверхности, при необходимости. Примером является Βίозигйие, производимый компанией Тоуо Созе/

Способ обработки поверхности (фиг. 8).

Обработку поверхности проводили с применением следующего способа, чтобы обеспечить однородное связывание анти-1д антитела.

1. С поверхности подложки 5-а удаляли загрязнение, такое как масло. Загрязнение удаляли, например, с помощью органического растворителя, кислоты и щелочи или путем химической очистки с помощью кислородной плазмы или т.п. Материал подложки может быть соответственно выбран в зависимости от загрязнения.

2. Чтобы увеличить поверхностную плотность связывающего адгезионного материала, связывающего подложку и антитело, например, также на поверхности подложки можно сформировать гидроксильные группы 5-Ь, заменяющие адгезионный материал. С целью формирования гидроксильных групп на поверхности подложки, а также удаления микрочастиц с поверхности, проводят промывку приблизительно 1%-ной аммиачной водой. Затем выполняют тщательную промывку водой. В случае кремния достаточно заменить это очисткой §С-1, в очистке КСЛ. Однако стадия 2 может быть пропущена, если формирование поверхности, подходящей для достаточного связывания адгезионного материала, может быть достигнуто в стадии 1.

3. На поверхность наносили адгезионный материал 5-с. Ее погружали в силановый аппрет или т.п., и соответственно замещали гидроксильными группами на поверхности. Адгезионным материалом является, например, гексаметилдисилазан, который делает поверхность гидрофобной. Существуют различные адгезионные материалы и способы, которые могут использоваться в данной обработке, и они не ограничиваются агентом для обработки поверхности, применяемым в настоящем примере изготовления.

Адгезионный материал в первую очередь характеризуется тем, что он является силановым аппретом или силилирующим агентом, и связывает органический материал с неорганическим материалом. Он применяется в качестве модификатора поверхности и дает гидрофобную поверхность. В полупроводниках, прежде всего, используются материалы, характерным примером которых является гексаметилдисилазан. Адгезионный материал необходимо соответственно подбирать в зависимости от материала подложки. Примерами являются силановые аппреты и силилирующие агенты, поставляемые компанией δΙιίη-Είβιι §Шсоие.

Адгезионный материал может быть нанесен различными способами. Может применяться погружение, покрытие с помощью центрифугирования, диффузия из газовой фазы, барботирование Ν₂ и т.п. Необходимо выбрать способ, более всего подходящий для материала. Например, в случае диффузии из газовой фазы нанесение можно выполнить путем обработки средой адгезионного материала в паровой фазе в герметичной камере в течение 5-10 мин.

Микролуночный чип настоящего примера изготовления не ограничивается кремнием и может быть сформирован из смолы, металла, стекла и т. п. Он не должен непременно находиться в форме однокомпонентного материала и может находиться в форме пленки, сформированной на подложке.

Примерами смол являются акриловая смола, полипропилен, полиэтилен, поливинилхлорид, АБС, полиуретан, эпоксидная смола, термореактивные смолы, фотоотверждаемые смолы и фоторастворимые смолы. Указанные смолы могут формоваться путем литьевого формования, компрессионного прессования, термоотверждения, фотоотверждения, сухого травления и т.п. Формование может быть также выполнено путем нанесения полимерной пленки на стеклянную, кремниевую или металлическую подложку. Поверхность смолы, формованной в форме микролунок, можно обработать адгезионным материалом тем же способом, как и кремний, чтобы обеспечить связывание антитела. Например, это можно выполнить посредством способа обработки поверхности, описанного в настоящем изобретении. При использовании фоточувствительного адгезионного материала можно сформировать антителосвязывающую поверхность так же, как и на кремнии. В данном случае подбирают подходящий адгезионный материал, учитывая также его способность адгезии к полимерным материалам. Если смола сама по себе предназначена для связывания антитела на своей поверхности и способна связывать антитело, то может быть достигнуто еще большее снижение стоимости.

Примерами металлов являются алюминий, алюминиевые сплавы, медные сплавы, золото и нержавеющая сталь. Указанные металлы могут формоваться путем отливки в металлических формах, травления и т.п. Формование можно также выполнить путем нанесения металлической пленки на стеклянную, кремниевую или металлическую подложку. Поверхность металла, формованную в форме микролунок, можно обработать адгезионным материалом тем же способом, как и кремний, чтобы обеспечить связывание антитела. Например, это можно выполнить посредством способа обработки поверхности, описанного в настоящем изобретении. В данном случае подбирают подходящий адгезионный материал, учитывая также его способность адгезии к металлическим материалам.

Микролунки могут быть сформированы в стекле путем травления. Кроме того, пленка из смолы, кремния или металла может быть сформирована на поверхности для формирования микролунок. Поверхность металла, формованную в форме микролунок, можно обработать адгезионным материалом тем же способом, как и кремний, чтобы обеспечить связывание антитела. Например, это можно выполнить

- 12 025219 посредством способа обработки поверхности, описанного в настоящем изобретении. В данном случае подбирают подходящий адгезионный материал, учитывая также его способность адгезии к стеклу и поверхностным пленкообразующим материалам.

В нижеследующих вариантах осуществления применяли кремниевые микролуночные чипы, изготовленные согласно примеру изготовления 1. При этом форма поверхности лунок чипов, применяемых в вариантах осуществления, была шестиугольной (круглая в примере изготовления 1).

Вариант осуществления 1.

Экспериментальный способ (методика I).

1. Нанесение покрытия на чип с антителом против 1дС человека.

Антитело против 1дС человека в количестве 80 мкл, разведенное в РВ8 до концентрации 10 мкг/мл, добавляли в кремниевый микролуночный чип, обработанный силановым аппретом, затем чип помещали во влагосохраняющую камеру (фиг. 9), чтобы поддерживать влажность чипа на таком уровне, чтобы раствор на чипе не высыхал, после чего чип выдерживали в течение одного часа при комнатной температуре (15-25°С), чтобы антитело анти-1дО связалось с поверхностью кремниевого чипа. В данном случае в отличие от стадии 2 ниже дегазацию при пониженном давлении не проводили. Антитело не вносили в лунки, а распределяли вокруг лунок. (В дальнейшем, при инкубировании чип постоянно держали во влагосохраняющей камере, чтобы препятствовать его высыханию).

2. Блокирование.

Раствор антитела удаляли с чипа, 100 мкл РВ8 добавляли к чипу, а затем удаляли в операции очистки, которую повторяли три раза. Затем 100 мкл РВ8, содержащего 0,2% (об./об.) ЫрМиге (ΝΘΡ Согрогаίίοη, ВЬ-В03 ЫрШиге (5 вес.%)) добавляли к чипу и использовали вакуумный насос для создания вакуума, чтобы полностью удалить пузырьки в микролунках, покрывая, таким образом, поверхность чипа и заполняя лунки раствором ЫрМиге. Чип оставляли при комнатной температуре на 15 мин (15-25°С), чтобы провести блокирование.

3. Добавление клеток.

Чип три раза промывали 100 мкл среды РРМ1-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РС8). Клетки Х63/116 (секретирующие 1дС человека в ответ на поверхностный антиген вируса гепатита В (НВк-антиген) ) или клетки НуНЕЬ10 110ТС (секретирующие химерное антитело мыши/человека в ответ на лизоцим куриного яйца (НЕЬ)), которые дважды промывали средой КРМ1-1640, содержащей 10% РС8, добавляли к чипу и оставляли чип при комнатной температуре в течение приблизительно 10 мин, чтобы клетки попали в лунки.

4. Культивирование клеток.

Клетки, не попавшие в лунки, удаляли с помощью промывки несколько раз средой КРМ1-1640, содержащей 10% РС8 (пока не были удалены все лишние клетки). Среду КРМ1-1640 в количестве 80 мкл, содержащую 10% РС8, добавляли на чип, чип помещали в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и культивировали клетки на чипе в течение 2-3 ч.

5. Связывание биотинилированного антигена.

С осторожностью, чтобы предотвратить выход клеток из лунок, буфер удаляли с поверхности чипа, приблизительно 100 мкл РВ8 добавляли на поверхность чипа, а затем удаляли, при этом данную операцию повторяли несколько раз, чтобы очистить чип. Затем меченный биотином НЕЬ или меченный биотином НВ8-антиген, в количестве 80 мл (1 мг/мл), добавляли в чип, после чего чип оставляли при комнатной температуре на 30 мин.

6. После промывки чипа РВ8 таким же способом, как и в стадии 5, к чипу добавляли 80 мкл СуЗмеченного стрептавидина (81дша, 8-6402), представлявшего собой 1000-кратное разведение исходного раствора, после чего чип так же оставляли на 30 мин при комнатной температуре.

7. После промывки чипа РВ8 таким же способом, как и в стадии 5, к чипу добавляли РВ8 и регистрировали флуоресценцию Су3 с помощью флуоресцентной микроскопии, при этом на основе распространения флуоресценции Су3 в форме колец вокруг лунок определяли положение лунок, содержащих клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело (фиг. 10).

8. Краситель Огедоп дгееп в количестве 80 мкл (1 мкг/мл) добавляли к чипу, после чего чип оставляли на 3 мин при комнатной температуре, чтобы пометить клетки красителем. После промывки чипа РВ8 таким же способом, как и в стадии 5, к чипу добавляли свежий РВ8. Наблюдая клетки, испускающие флуоресценцию Огедоп дгееп, служившего в качестве индикатора, целевые клетки, секретирующие йнтигенспецифичное антитело, забирали с помощью микроманипулятора.

Идентификация клеток, секретирующих антигенспецифичное антитело на микролуночном чипе, с применением способа настоящего изобретения (способ РЬ18РОТ).

Клетки НуНЕЬ10 110ТС, клетки Х63/116 и клетки 110ТС (отрицательный контроль, не секретируют антитело) культивировали на кремниевом микролуночном чипе, покрытом антителом анти-1дО. Секрецию антигенспецифичного антитела детектировали с помощью меченного биотином НЕЬ или меченного биотином НВ8-антигена и СуЗ-меченного стрептавидина (фиг. 11 А). Как показано на фиг. 11 А, секретируемое антитело детектировали в форме колец вокруг лунок. На чипе, в который добавляли клетки

- 13 025219

110ТС, не секретирующие антитело, сигнала не регистрировали. Затем для окрашивания клеток использовали краситель Огедоп дгееп и подтверждали наличие клеток (фиг. 11В).

Окрашивание являлось антигенспецифичным. На чипе, в который добавляли клетки НуНЕЬ10 110ТС, сигнал регистрировали с помощью биотинилированного НЕЬ, а при добавлении биотинилированного НВз-антигена сигнала не регистрировали. Наоборот, на чипе, в который добавляли клетки Х63/116, при добавлении биотинилированного НЕЬ сигнала не регистрировали, а при добавлении биотинилированного НВз-антигена - регистрировали (данные не приведены).

Идентификация гибридом, секретирующих антигенспецифичное антитело, с помощью способа РЫ8РОТ (с применением методики I).

Клетки селезенки получали из мышей ВЛЬВ/е, которых иммунизировали белком НЕЬ. Полученные клетки подвергали слиянию обычным способом с использованием полиэтиленгликоля с клетками миеломы Х63.Ад8.653, получив гибридомы. Гибридомы отбирали на селективной среде НАТ, а затем переносили в микролуночный чип, покрытый антителом против 1дО мыши. Клетки, которые не попали в лунки, удаляли с помощью промывки, после которой клетки культивировали на чипе в течение 1 ч 30 мин. Гибридомы, секретирующие антитело к НЕЕ детектировали с использованием меченного биотином НЕЬ и меченного фикоэритрином стрептавидина (фиг. 11А). Затем с целью определения положения клеток добавляли Огедоп дгееп (фиг. 11В). Фиг. 11С - комбинация А и В.

Вариант осуществления 2.

Экспериментальный способ (методика II).

Получение СЭ138-положительных клеток мыши (антитело-секретирующих клеток).

1. Получали клетки селезенки мыши.

2. Антитело против мышиного СЭ138 добавляли к 100 мкл суспензии клеток в количестве <1 мкг на 10⁶ клеток, после чего клетки инкубировали в течение 15 мин при 4°С.

3. Клетки дважды промывали 10 мл РВ8, после чего суспендировали в 100 мкл РВ8. Затем к суспензии клеток добавляли антитело против к (каппа)-цепи крысы на микрогранулах в количестве <1 мкг на 10⁶ клеток и инкубировали клетки в течение 15 мин при 4°С.

4. Клетки дважды промывали 10 мл РВ8, а затем суспендировали в 1000 мкл РВ8. СЭ138положительные клетки отбирали с помощью Аи1оМАС8.

Получение СЭ138-положительных клеток человека.

1. Лимфоциты выделяли из периферической крови человека стандартным методом (метод разделения по удельной плотности с помощью центрифугирования с использованием фиколла).

2. Реагент, блокирующий Ре-рецептор (МШепу1 Вю1ес), добавляли в количестве 20 мкл на 10⁷ клеток с последующим добавлением анти-СЭ138 антитела на микрогранулах в количестве <1 мкг на 10⁶клеток и инкубировали клетки в течение 15 мин при 4°С.

3. Клетки дважды промывали 10 мл РВ8 и суспендировали в 1000 мкл РВ8, а затем СЭ138положительные клетки отбирали с помощью Аи1оМАС8.

Экспериментальный способ (методика II, продолжение).

1. В нижеследующих тестах для предотвращения высыхания в ходе инкубирования были предприняты те же меры, как и в методике I.

2. К кремниевому микролуночному чипу, обработанному силановым аппретом, добавляли 80 мкл раствора антитела осла против ЦС козы в РВ8 (10 мкг/мл). Чип помещали во влагосохраняющую камеру (фиг. 1), чтобы раствор на чипе не высыхал, и оставляли на 1 ч при комнатной температуре (15-25°С), чтобы антитело осла против ЦС козы связалось с поверхностью кремниевого чипа.

3. Раствор антитела удаляли с чипа, чип три раза промывали 100 мкл РВ8, после чего к чипу добавляли 100 мкл РВ8, содержащего 0,2% (об./об.) ЫрШиге (ΝΟΡ Согрогайоп, ВЬ-В03 ЫрШиге (5 вес.%)), и создавали вакуум, чтобы удалить пузырьки в микролунках, покрывая, таким образом, поверхность чипа и заполняя лунки раствором ПрЦиге. Чип оставляли на 15 мин при комнатной температуре, чтобы провести блокирование.

4. Чип трижды промывали 100 мкл среды КРМР1640, содержащей 10% РС8. СЭ138положительные антителосекретирующие клетки (1-2х10⁶ клеток, суспендированных в 30 мкл РВ8), промытые один раз 10 мл РВ8, добавляли к чипу, после чего чип оставляли приблизительно на 10 мин при комнатной температуре, чтобы клетки могли попасть в лунки.

5. Клетки, не попавшие в лунки, удаляли путем промывки средой КРМР1640, содержащей 10% РС8. Затем к чипу в количестве 80 мкл (10 мкг/мл) добавляли антитело козы против ЦС человека (или мыши) и оставляли чип на 30 мин при комнатной температуре, чтобы антитело связалось с антителом осла против ЦС козы на поверхности чипа.

6. Чип промывали средой КРМЫ640, содержащей 10% РС8, с осторожностью, чтобы клетки не выходили из лунок. Затем к чипу добавляли среду КРМЫ640, содержащую 10% РС8, после чего клетки культивировали в течение 3 ч в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂).

7. Затем проводили последующие стадии в форме стадии 5 и далее из методики I.

Детектирование клеток, секретирующих НЕЬ-специфичное антитело, среди НЕР- 14 025219 иммунизированных клеток селезенки мыши, посредством способа изобретения (способ РЫЗРОТ).

СЭ138-положительные клетки получали из клеток селезенки мышей ВЛЬВ/с, иммунизированных лизоцимом куриного яйца (НЕЬ). Клетки переносили в кремниевый микролуночный чип, с поверхностью которого согласно методике II было связано антитело осла против 1§О козы. Затем антитело козы против 1§О мыши связывали с чипом согласно методике и в течение приблизительно 3 ч культивировали клетки. После этого добавляли меченный биотином НЕЬ и Су3-меченный стрептавидин и клетки, секретирующие НЕЬ-специфичное 1дО антитело, детектировали с помощью флуоресцентной микроскопии (фиг. 12). Затем клетки отбирали с помощью микроманипулятора и амплифицировали ген, кодирующий антитело. Из семи полученных 1§О шесть связывались с НЕЬ (данные не приведены).

Детектирование клеток, секретирующих НВ8-специфичное антитело, среди лимфоцитов периферической крови человека с применением способа настоящего изобретения (способ РЫЗРОТ).

ί'Ό138-положительные клетки получали в соответствии с методикой II из периферической крови здоровых людей, которых стимулировали вакциной на основе НВ8-антигена. СЭ 138-положительные клетки добавляли в кремниевый микролуночный чип, на котором связывали антитело осла против козы в соответствии с методикой II. Затем согласно методике на чипе связывали антитело козы против ^О человека, и культивировали клетки в течение приблизительно 3 ч. Затем добавляли меченный биотином НВ8-антиген и Су3-меченный стрептавидин, после чего клетки, секретирующие НВ8антигенспецифичное ^О антитело, детектировали с помощью флуоресцентной микроскопии (фиг. 13).

Добровольцам, от которых было получено согласие на основе полной информации, вводили НВ8 вакцину, на день 7 забирали 100 мл крови, ί'Ό13 8-положительные клетки отбирали из лимфоцитов периферической крови, полученных из забранной крови, после чего указанные клетки переносили в планшет, покрытый антителом против ^О человека. Клетки культивировали, после чего клетки, секретирующие НВ 8-специфичное антитело, детектировали с использованием меченного биотином НВ8антигена и Су3-меченного стрептавидина. Клетки выделяли в общей сложности из 24 лунок. Аналогичным путем клетки, секретирующие НВ8-специфичное антитело, детектировали среди лимфоцитов периферической крови, полученных в результате забора 100 мл крови на 8 день после вакцинации НВ8, при этом клетки, выделяли из 57 лунок. Из полученных клеток получили кДНК 53 пар Н-цепей и Ь-цепей антитела. Указанную кДНК встраивали в экспрессионный вектор, пары Н-цепи и Ь-цепи вводили в геном клеток 293Т (линию клеток, полученных из эмбриональной ткани почки человека), а затем получали культуральный супернатант. С помощью ЕЫЗА анализировали, связывалось ли с НВ8-антигеном антитело, секретируемое в супернатант, или нет. В результате получили 41 антитело (белок), из которых 36 обладали специфичностью к НВ8-антигену.

Вариант осуществления 3.

Экспериментальный способ (методика III).

1. Антиген (НЕЬ белок), разведенный в РВЗ до концентрации 10 мкг/мм, в количестве 80 мкл добавляли в кремниевый микролуночный чип, обработанный силановым аппретом. Чип помещали во влагосохраняющую камеру (фиг. 9), чтобы раствор на чипе не высыхал. Чип оставляли на 1 ч при комнатной температуре (15-25°С), чтобы НЕЬ белок связался с поверхностью кремниевого чипа. (При каждом последующем инкубировании чип помещали в указанную камеру, чтобы предотвратить высыхание.)

2. Раствор антигена удаляли с чипа, после чего чип промывали три раза 100 мкл РВЗ. Затем в чип добавляли РВЗ в количестве 100 мкл, содержащий 0,2% (об./об.) ЫрШиге (ΝΟΡ Согрогайои, ВЬ-В03 Ηϊρΐбиге (5 вес.%)), и создавали вакуум, чтобы удалить пузырьки в микролунках, покрывая, таким образом, поверхность чипа и заполняя лунки раствором Ырхбиге. Чип оставляли на 15 мин при комнатной температуре, чтобы провести блокирование.

3. СЭ138-дположительные клетки получали согласно методике 11 из клеток селезенки мышей, котррым вводили НЕЬ.

4. Чип промывали средой КРМЕ1640, содержащей 10% РСЗ, после чего СЭ13 8-положительные клетки (1-2х10⁶ клеток, суспендированных в 30 мкл РВЗ), промытые один раз в 10 мл РВЗ, добавляли в чип. Затем чип оставляли приблизительно на 10 мин, чтобы клетки попали в лунки.

5. Клетки, не попавшие в лунки, удаляли путем промывки средой КРМЕ1640, содержащей 10% РСЗ, после чего в чип добавляли 80 мкл среды КРМЕ1640, содержащей 10% РСЗ. Затем чип помещали в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и культивировали клетки в течение 3 ч на чипе.

6. С осторожностью, чтобы клетки не вышли из лунок, с поверхности чипа удаляли буфер, после чего на поверхность чипа добавляли 100 мкл РВЗ, и повторами данную операцию несколько раз, чтобы очистить чип. Затем в чип добавляли 80 мкл 1 мкг/мл Су3-меченного антитела против !§О мыши, после чего чип оставляли на 30 мин при комнатной температуре.

7. Чип, идентичный чипу в стадии 6, промывали РВЗ, добавляли в чип свежий РВЗ, а затем с помощью флуоресцентной микроскопии регистрировали флуоресценцию Су3, определяя положения лунок, содержащих клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело, используя распространение флуоресценции Су3 в форме колец вокруг лунок в качестве индикатора (фиг. 14).

8. Краситель Огедоп дгееп в количестве 80 мкл добавляли в чип и оставляли чип при комнатной

- 15 025219 температуре в течение 3 мин, чтобы пометить клетки Огедои дгееи. Чип, идентичный чипу в стадии 6 выше, промывали РВ8, добавляли в чип свежий РВ8, а затем, наблюдая клетки с флуоресценцией Огедои дгееи в качестве индикатора, целевые клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело, отбирали с помощью микроманипулятора.

Вариант осуществления 4.

Экспериментальный способ (применение методики IV).

Применение меченого ферментом антигена или меченого ферментом антитела вместо флуоресцентно меченого антигена или флуоресцентно меченого антитела.

Различия.

1. После использования действия меченного ферментом антигена или меченного ферментом антитела буфер, к которому добавили субстрат фермента, добавляли в чип, после чего инкубирование проводили при комнатной температуре.

2. Продукт, образующийся в результате конверсии субстрата ферментом, осаждается в форме кольца вокруг лунки. Это наблюдали с помощью оптической микроскопии, позволяющей детектировать антителосекретирующие клетки.

Фермент: щелочная фосфатаза; субстрат: ΒΟΙΡ/ΝΒΤ.

Детектирование также возможно при использовании антигена или антитела, с которым вместо флуоресцентного пигмента связана квантовая точка.

Детектирование цитокин-продуцирующих клеток.

1. Вместо связывания с чипом антитела против 1дС, с чипом связывали антитело против цитокина, после чего Т-клетки или т.п., секретирующие цитокин, переносили в чип и индуцировали выработку цитокина.

2. Секретируемый цитокин связывался с антителом против цитокина вокруг лунок.

3. Затем при добавлении меченного флуоресцентной или ферментной меткой антитела против цитокина могут быть детектированы кольца цитокина, связанного вокруг лунок, позволяя детектировать, таким образом, цитокинсекретирующие Т-клетки или т. п.

Спот-иммуноанализ на чипе (Ι8ΆΆΚ).

Детектирование цитокинсекретирующих клеток.

Методика.

1. Лимфоциты выделяли из периферической крови человека и стимулировали в течение ночи в СО₂инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в присутствии 10 нг/мл форболмиристатацетата (РМА) и 1 мкМ иономицина.

2. Лимфоциты собирали и промывали, после чего клетки вносили в микролуночный чип, покрытый антителом против ΙΡΝγ (интерферон-гамма) человека. Чип помещали во влагосохраняющую камеру (фиг. 9), чтобы предотвратить высыхание, после чего клетки культивировали в течение 5 ч в СО₂инкубаторе (37°С, 5% СО2).

3. Чип промывали РВ8-Тетееи20, к чипу добавляли меченное биотином антитело против ΙΡΝγ человека, и инкубировали чип в течение 30 мин при комнатной температуре во влагосохраняющей камере.

4. Чип промывали РВ8-Тетееи20, добавляли Су3-меченный стрептавидин и инкубировали чип в течение 30 мин при комнатной температуре во влагосохраняющей камере.

5. Чип промывали РВ8-Тетееи20 и с помощью флуоресцентной микроскопии регистрировали сигнал секретируемого цитокина (время освещения 2 с).

Результаты приведены на фиг. 15.

Вариант осуществления 5 (получение блокирующего антитела).

1. В следующих тестах с целью предотвращения высыхания при инкубировании чипов были предприняты те же меры, как и в методике Ι.

2. ТКА1Ь-К1/Рс, разведенный в РВ8 до концентрации 10 мкг/мл, в количестве 80 мкл добавляли в кремниевый микролуночный чип, обработанный силановым аппретом, после чего чип помещали во влагосохраняющую камеру (фиг. 9), чтобы раствор на чипе не высыхал. Чип оставляли на 1 ч при комнатной температуре (15-25°С) для связывания ТКА1Ь-К1/Рс с поверхностью кремниевого чипа.

3. Раствор антитела удаляли с чипа и промывали чип три раза 100 мкл РВ8. Затем к чипу в количестве 100 мкл добавляли РВ8, содержащий 0,2% (об./об.) ЫрШите (ΝΟΡ СотротаРои, ВЬ-ВОЗ ЫрШите (5 вес.%)), и создавали вакуум, чтобы удалить пузырьки в микролунках, покрывая, таким образом, поверхность чипа и заполняя лунки раствором ЫрМите. Чип оставляли на 15 мин при комнатной температуре, чтобы провести блокирование.

4. Чип промывали три раза 100 мкл среды КРМ1-1640, содержащей 10% РС8. Затем к чипу добавляли СО138-положительные антителосекретирующие клетки, промытые один раз в 10 мл и дважды в 1000 мкл среды РРМ1-1640, содержащей 10% РС8 (1-2х10⁶ клеток, суспендированных в 30 мкл среды КРМ11640, содержащей 10% РС8), после чего чип оставляли приблизительно на 10 мин при комнатной температуре, чтобы клетки могли попасть в лунки.

5. С осторожностью, чтобы клетки не вышли из лунок, чип промывали средой КРМ1-1640, содержащей 10% РС8, после чего в чип добавляли еще 80 мкл среды РРМ1-1640, содержащей 10% РС8. Затем

- 16 025219 клетки культивировали в течение 3 ч в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂).

6. С осторожностью, чтобы клетки не вышли из лунок, с поверхности чипа удаляли буфер, операцию добавления приблизительно 100 мкл (РВ8 на поверхность чипа и удаления РВ8 повторяли несколько раз, чтобы очистить чип, а затем в чип добавляли 80 мкл (1 мкг/мл) меченного биотином ТКА1Ь и оставляли чип на 30 мин при комнатной температуре.

7. После промывки чипа РВ8, как в стадии 6, в чип добавляли 80 мкл СуЗ-меченного стрептавидина (81дта, 8-6402), представляющего собой 1000-кратное разведение исходного раствора, после чего чип точно так же оставляли на 30 мин при комнатной температуре.

8. После промывки чипа РВ8, как в стадии 6, в чип добавляли РВ8 и с помощью флуоресцентной микроскопии регистрировали флуоресценцию Су3. Положения лунок, содержащих клетки, секретирующие антитело, блокированное между ТКА1Ь-К1/Рс и его лигандом, ТКА1Ь, определяли с использованием индикатора в форме черных колец, в которых флуоресцентная метка Су3 не была связана вокруг лунок на поверхности чипа, который имел ярко красную окраску в результате флуоресценции Су3.

9. Краситель Огедоп дгееп в количестве 80 мкл (1 мкг/мл) добавляли в чип, после чего чип оставляли при комнатной температуре в течение 3 мин, чтобы пометить клетки Огедоп дгееп. После промывки чипа РВ8, как в стадии 6, в чип добавляли свежий РВ8. Наблюдая клетки с помощью флуоресценции Огедоп дгееп в качестве индикатора, целевые клетки, секретирующие антигенспецифичное антитело, отбирали с помощью микроманипулятора.

Вариант осуществления 6 (применение функционального антитела для скрининга).

Белок-рецептор наносили на поверхность чипа и вносили в чип клетки ί'Ό138. выделенные из клеток селезенки мышей, иммунизированных белком-рецептором. Клетки культивировали, после чего добавляли меченный биотином лиганд и Су3-меченный стрептавидин. Меченный биотином лиганд и Су3меченный стрептавидин связывался почти по всей поверхности чипа. Однако связывание меченного биотином лиганда и Су3-меченного стрептавидина было блокировано вокруг лунок, в которых находились клетки, вырабатывающие функциональное антитело, которое блокировало связывание лиганда с рецептором, вследствие чего указанные области оставались темными. Результаты показаны на фиг. 16. Слева: результаты детектирования для меченного биотином лиганда/Су3-меченного стрептавидина. В центре: клетки пометили Огедоп дгееп и визуализировали. Справа: наложение фигур слева на фигуры в центре.

Промышленная применимость.

Изобретение может применяться в областях техники, связанных со способами скрининга иммуноцитов, например клеток, вырабатывающих специфичный иммуноглобулин, и клеток, вырабатывающих специфичный цитокин. Соответствующими примерами являются области диагностики и иммунологических лекарственных препаратов, включая лекарственные препараты на основе антител.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - схема, на которой показана взаимосвязь между формой сигнала от меченого вещества и формы лунки;

фиг. 2 - схема способа настоящего изобретения в примере, в котором применяют антителосекретирующие клетки;

фиг. 3 - схема способа настоящего изобретения в случае (1), в котором меченое вещество специфично связывается с вырабатываемым веществом;

фиг. 4-1 - схема примера изготовления 1; фиг. 4-2 - схема примера изготовления 1; фиг. 5-1 - схема примера изготовления 2; фиг. 5-2 - схема примера изготовления 2; фиг. 5-3 - схема примера изготовления 2; фиг. 6-1 - схема примера изготовления 3; фиг. 6-2 - схема примера изготовления 3; фиг. 7-1 - схема примера изготовления 4; фиг. 7-2 - схема примера изготовления 4; фиг. 7-3 - схема примера изготовления 4; фиг. 8 - схема способа обработки поверхности;

фиг. 9 - схема влагосохраняющей коробки, которая сохраняет влажность чипа;

на фиг. 10 показаны результаты определения положений лунок, содержащих клетки, секретирующие антигенспецифичные антитела, в варианте осуществления 1;

на фиг. 11 - результаты идентификации на микролуночном чипе, применяемом в способе (РЬРЗРОТ) настоящего изобретения в варианте осуществления 1, клеток, секретирующих антигенспецифичное антитело;

на фиг. 12 - результаты обнаружения клеток, секретирующих НЕЬ-специфичное антитело, среди клеток селезенки мышей, иммунизированных НЕЬ, посредством способа (РЫ8РОТ) настоящего изобретения в варианте осуществления 2;

на фиг. 13 - результаты обнаружения клеток, секретирующих НВк-антигенспецифичное антитело, среди лимфоцитов периферической крови человека посредством способа (РЫ8РОТ) настоящего изобре- 17 025219 тения в варианте осуществления 2;

на фиг. 14 - результаты варианта осуществления 3;

на фиг. 15 - результаты варианта осуществления 4 (обнаружение цитокин-продуцирующих клеток); на фиг. 16 - результаты варианта осуществления 6 (применение функционального антитела для скрининга).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Микролуночный чип для скрининга целевых клеток, содержащий множество лунок на одной из основных поверхностей опорного элемента, где лунки имеют размер, который позволяет помещать в каждую лунку только одну клетку, причем лунки расположены в равноудаленных друг от друга рядах и колонках, отличающийся тем, что на указанную основную поверхность по крайней мере вокруг части лунок нанесен слой вещества, способного связываться с веществом, продуцируемым указанными целевыми клетками, где часть основной поверхности, которая не покрыта указанным слоем вещества, способным связываться с веществом, продуцируемым указанными целевыми клетками, покрыта блокирующим агентом.
2. Чип по п.1, который содержит клетки в части лунок и где культуральная среда, нанесенная на чип, покрывает указанный выше слой вещества и лунки для обеспечения диффузии веществ, продуцируемых клетками в культуральную среду, из лунок в слой вещества, способный связываться с веществом, продуцируемым целевыми клетками.
3. Чип по п.2, где по меньшей мере часть клеток, содержащихся в лунках, является иммуноглобулин-продуцирующими клетками или цитокин-продуцирующими клетками.
4. Чип по п.2, где по меньшей мере часть клеток, содержащихся в лунках, является иммуноглобулин-продуцирующими клетками, а указанное вещество, обладающее способностью связываться с веществом, которое продуцируется указанными иммуноглобулин-продуцирующими клетками, является антителом против иммуноглобулина или специфическим антигеном, с которым связывается иммуноглобулин.
5. Чип по п.2, где по меньшей мере часть клеток, содержащихся в лунках, является цитокинпродуцирующими клетками, а указанное вещество, обладающее способностью связываться с веществом, которое продуцируется указанными цитокин-продуцирующими клетками, является антителом против цитокина или рецептором цитокина.
6. Чип по любому из пп.3-5, где иммуноглобулин-продуцирующие клетки и цитокинпродуцирующие клетки являются природными клетками или гибридомами.
7. Чип по любому из пп.1-6, где опорный элемент имеет форму пластины.
8. Способ скрининга целевой клетки, включающий помещение образцов клеток по меньшей мере в часть лунок чипа по п.1;

нанесение клеточной культуральной среды на чип, покрывая слой вещества, способного связываться с веществом, продуцируемым целевыми клетками, и лунки, обеспечивая диффузию веществ, продуцируемых клетками в культуральную среду из лунок в указанный слой; и культивирование клеток после удаления культуральной среды, нанесение на указанный слой меченого вещества, которое специфично связывается с веществом, продуцируемым целевой клеткой, присутствующей в образце клеток; и идентификацию целевой клетки путем детектирования вещества, продуцируемого целевой клеткой посредством меченого вещества, с определением указанной целевой клетки.
9. Способ скрининга по п.8, где образцы клеток включают иммуноглобулин-продуцирующие клетки или цитокин-продуцирующие клетки.
10. Способ скрининга по п.8 или 9, где образцы клеток включают иммуноглобулинпродуцирующие клетки и где вещество, обладающее способностью связываться с веществом, продуцированным целевой клеткой, является антителом против иммуноглобулина или специфическим антигеном, к которому присоединен иммуноглобулин, а целевая клетка является клеткой, продуцирующей антиген-специфический иммуноглобулин.
11. Способ скрининга по п.8 или 9, где образцы клеток включают цитокин-продуцирующие клетки, вещество, обладающее способностью связываться с веществом, продуцируемым целевой клеткой, является антителом против цитокина или рецептором цитокина, и целевая клетка является клеткой, продуцирующей антигенспецифический цитокин.
12. Способ скрининга по любому из пп.8-11, где иммуноглобулин-продуцирующие клетки и цитокин-продуцирующие клетки являются природными клетками или гибридомами.
13. Способ получения целевой клетки, включающий выделение из лунки целевой клетки, идентифицированной с помощью способа скрининга по любому из пп.9-12.
14. Способ по п.13, где целевая клетка является клеткой, продуцирующей специфический иммуноглобулин, или клеткой, продуцирующей специфический цитокин.