JP7045924B2 - 細胞捕捉用フィルター膜及びその使用 - Google Patents

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Description

一態様において、本発明は、フィルター膜及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、フィルター膜、フィルター膜の製造方法、構造体、粒子を捕捉する方法、及び細胞の選別方法に関する。
細胞等の粒子を捕捉して網羅的に解析する需要がある。例えば、特に創薬分野において、細胞を単一細胞レベルで選別して回収し、回収した細胞を用いる試みがなされている。細胞を選別する方法としては、例えば、細胞から分泌される分泌物を検出し、目的の分泌物を分泌した細胞を特定することが行われている。このような単一細胞解析においては、細胞を網羅的に捕捉し、一括して解析する技術が有用である。
細胞を網羅的に捕捉する方法として、例えば、特許文献１には、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するマイクロメッシュ上に、１細胞レベルで細胞を捕捉することができるデバイスが記載されている。
また、１つの細胞のみが入る大きさのウェルを有するマイクロチップを用いて多数の単一細胞を同時に解析する方法が知られている。例えば、特許文献２には、１つの細胞のみが入る大きさのウェルを有するマイクロウェルアレイと、該マイクロウェルアレイで細胞を培養し、ウェル中に格納された細胞から産生される物質を検出するスクリーニング方法が記載されている。
特許第５２７８９１３号公報 特許第４１４８３６７号公報
しかしながら、特許文献１に記載のデバイスにおいては、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞が、微細貫通孔の開口部に吸引力のみで固定されている。このため、捕捉した細胞が、操作中に捕捉位置から移動してしまう場合がある。また、特許文献２に記載の方法においては、ウェルに細胞が格納されるまでに時間を要する場合がある。そこで、本発明は、粒子を効率よく捕捉する技術を提供することを課題とする。
本発明は以下の態様を含む。
本発明の第一の態様は、貫通孔と、細胞１単位を収容可能な大きさを有する凹部とを有し、前記凹部は、前記細胞捕捉用フィルター膜の一方面に開口しており、前記一方面における前記貫通孔は、前記細胞１単位が通過できない形状又は大きさであり、前記貫通孔と前記凹部とが隣接して配置されており、前記凹部は、前記細胞捕捉用フィルター膜における前記貫通孔の形成されていない部分の表面に設けられている、細胞捕捉用フィルター膜である。
本発明の第二の態様は、支持体上に、溶解可能な下地膜を積層することと、前記下地膜上に第１の硬化性樹脂膜を積層することと、前記第１の硬化性樹脂膜をパターニングして、第１の貫通孔及び凹部の底部がパターニングされた第１の膜を得ることと、前記第１の膜上に第２の硬化性樹脂膜を積層することと、前記第２の硬化性樹脂膜をパターニングして、前記第１の貫通孔に連続する第２の貫通孔及び前記凹部の側部がパターニングされた第２の膜を得ることと、前記下地膜を溶解して、前記支持体から、前記細胞捕捉用フィルター膜となる前記第１の膜及び前記第２の膜の積層物を剥離することと、を含む、細胞捕捉用フィルター膜の製造方法である。
本発明の第三の態様は、前記細胞捕捉用フィルター膜と、前記細胞捕捉用フィルター膜の他方面に対向するように、前記細胞捕捉用フィルター膜から離間して配置された基板とを備える、構造体である。
本発明の第四の態様は、前記細胞捕捉用フィルター膜の前記凹部が開口している側の面に、細胞又は細胞塊の分散液を接触させることを含む、細胞又は細胞塊を捕捉する方法である。
本発明の第五の態様は、複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、前記構造体の前記細胞捕捉用フィルター膜の前記凹部が開口している側の面に前記細胞の分散液を接触させて、前記細胞を前記凹部１つあたり１単位ずつ捕捉することと、前記凹部に捕捉された前記細胞に前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を、前記基板の表面の、前記凹部に近接した領域に蓄積させることと、前記分泌物の蓄積により生じる変化を検出することと、前記変化を指標として目的の細胞を選別することとを含む、細胞の選別方法である。
本発明によれば、粒子を効率よく捕捉する技術を提供することができる。
（ａ）は、一実施形態に係るフィルター膜の上面図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。（ｃ）は、実施例において製造したフィルター膜の電子顕微鏡写真である。 （ａ）は、一実施形態に係るフィルター膜の上面図である。（ｂ）は、一実施形態に係るフィルター膜の上面図である。 （ａ）～（ｆ）はフィルター膜の製造方法を説明する模式図である。 （ａ）は、一実施形態に係る構造体の上面図である。（ｂ）は、（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 （ａ）～（ｃ）は、粒子を捕捉する方法を説明する模式図である。 （ａ）は、実験例１において撮影した、実施例１の構造体のフィルター膜の代表的な蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例１において撮影した、比較例１の構造体のフィルター膜の代表的な蛍光顕微鏡写真である。 実験例２において、構造体の基板側から撮影した代表的な蛍光顕微鏡写真である。
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［フィルター膜］
本実施形態のフィルター膜は、貫通孔と、粒子１個を捕捉可能な大きさを有する凹部とを有し、前記凹部は、前記フィルター膜の一方面に開口しており、前記一方面における前記貫通孔は、前記粒子１個が通過できない形状又は大きさであり、前記貫通孔と前記凹部とが近接して配置されている。フィルター膜の材質については後述する。
実施例において後述するように、本実施形態のフィルター膜によれば、粒子を効率よく捕捉することができる。本明細書において、粒子を効率よく捕捉するとは、例えば、フィルター膜に粒子の分散液を接触させた場合に、単位時間内に、フィルター膜に接触させた粒子を高い割合で凹部に収容することができることを意味する。
図１（ａ）は、本実施形態のフィルター膜の一例である、フィルター膜１００の上面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）に示すフィルター膜１００のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。図１（ｃ）は、後述する実施例において実際に製造した、図１（ａ）及び（ｂ）に示すフィルター膜１００の電子顕微鏡写真である。図１（ｃ）には、フィルター膜１００の断面及び上面が撮影されている。
フィルター膜１００は、貫通孔１１０と、凹部１２０を有する。凹部１２０は粒子１個を捕捉可能な大きさを有している。凹部１２０は、フィルター膜１００の一方面１３０に開口している。一方面１３０における貫通孔１１０は、粒子１個が通過できない大きさである。貫通孔１２０と凹部１３０とは近接して配置されている。
フィルター膜１００において、貫通孔１１０の形状又は大きさが、粒子１個が通過できないものであるとは、貫通孔１１０を前記粒子１個が通過できない限り特に限定されない。例えば、貫通孔１１０の面１３０における形状が、粒子１個が通過できない形状であってもよい。粒子１個が通過できない形状としては、例えば、櫛形形状が挙げられる。あるいは、貫通孔１１０の面１３０における大きさが、粒子１個が通過できない大きさであってもよい。貫通孔の大きさとは、例えば、貫通孔１１０の面１３０における断面（面１３０と平行な断面）の断面積であってもよい。
また、貫通孔１１０の形状は、特に限定されず、例えば、円筒形であってもよく、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）であってもよく、円錐台形であってもよく、角錐台形（三角錐台形、四角錐台形、五角錐台形、六角錐台形、七角以上の多角錐台形）等であってもよく、逆円錐台形であってもよく、逆角錐台形（逆三角錐台形、逆四角錐台形、逆五角錐台形、逆六角錐台形、七角以上の逆多角錐台形）等であってもよく、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。また、フィルター１００において、貫通孔１１０の形状は１種類のみであってもよいし、２種類以上の組み合わせであってもよい。
凹部１２０の形状も特に限定されず、上述した貫通孔１１０の形状と同様であってよい。また、フィルター膜１００において、凹部１２０の形状は１種類のみであってもよいし、２種類以上の組み合わせであってもよい。
また、貫通孔１１０の形状及び大きさは、フィルター膜１００の全体にわたって同一であってもよいし、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。同様に、凹部１２０の形状及び大きさは、フィルター膜１００の全体にわたって同一であってもよいし、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
フィルター膜１００において、貫通孔１１０と凹部１２０とが近接して配置されているとは、例えば、貫通孔１１０の面１３０における形状の重心と、凹部１２０の面１３０における形状の重心との間の距離が、粒子の投影面積と同じ面積の円の直径（以下、「投影面積相当径」という場合がある。）の０．５～１０倍であることを意味する。
フィルター膜１００において、貫通孔１２０と凹部１３０とは、近接していればその配置は特に限定されない。
図２（ａ）は、本実施形態のフィルター膜の一例であるフィルター膜１００ａの上面図である。フィルター膜１００ａは、貫通孔１１０ａと、凹部１２０ａとを有する。貫通孔１１０ａと凹部１２０ａとの配置は、例えば図２（ａ）に示すものであってもよく、これに限定されない。
図２（ｂ）は、本実施形態のフィルター膜の一例であるフィルター膜１００ｂの上面図である。フィルター膜１００ｂは、貫通孔１１０ｂと、凹部１２０ｂとを有する。貫通孔１１０ｂと凹部１２０ｂとの配置は、例えば図２（ｂ）に示すものであってもよく、これに限定されない。
本実施形態のフィルター膜１００は、複数の貫通孔１１０及び複数の凹部１２０を有し、貫通孔１１０の数と凹部１２０の数との比（貫通孔：凹部）が、１：５～１００：１であってもよい。
貫通孔１１０の数と凹部１２０の数との比は、１：５～１０：１であることが好ましく、１：４～４：１であることがより好ましい。
（粒子）
本明細書において、粒子としては特に制限されず、例えば、細胞、細胞塊、樹脂粒子、金属粒子、ガラス粒子、セラミック粒子等が挙げられる。本明細書において、粒子が凝集して凝集塊を形成している場合には、当該凝集塊を粒子１個という。粒子１個の投影面積相当径（粒子の投影面積と同じ面積の円の直径）は特に制限されず、例えば０．０１μｍ以上１ｍｍ以下であってもよく、例えば１～５００μｍであってもよく、例えば１～２００μｍであってもよく、例えば１～１００μｍであってもよく、例えば１～５０μｍであってもよい。
（フィルター膜の用途）
上述したように、粒子は細胞を含んでいてもよい。また、フィルター膜は細胞捕捉用であってもよい。すなわち、本実施形態のフィルター膜は、細胞捕捉用フィルター膜であってもよい。実施例において後述するように、本実施形態のフィルター膜は、細胞を効率よく捕捉することができる。
［フィルター膜の製造方法］
本実施形態のフィルター膜の製造方法は、支持体上に、溶解可能な下地膜を積層することと（以下、「工程１」という。）、前記下地膜上に第１の硬化性樹脂膜を積層することと（以下、「工程２」という。）、前記第１の硬化性樹脂膜をパターニングして、前記第１の貫通孔及び前記凹部の底部がパターニングされた第１の膜を得ることと（以下、「工程３」という。）、前記第１の膜上に第２の硬化性樹脂膜を積層することと（以下、「工程４」という。）、前記第２の硬化性樹脂膜をパターニングして、前記第１の貫通孔に連続する第２の貫通孔及び前記凹部の側部がパターニングされた第２の膜を得ることと（以下、「工程５」という。）、前記下地膜を溶解して、前記支持体から、前記フィルター膜となる前記第１の膜及び前記第２の膜の積層物を剥離することと（以下、「工程６」という。）、を含む。本実施形態の製造方法により、上述したフィルター膜を製造することができる。図３（ａ）～（ｆ）は、フィルター膜の製造方法を説明する模式図である。以下、図３（ａ）～（ｆ）を参照しながら本実施形態の製造方法を説明する。
（工程１）
図３（ａ）に示すように、本工程では、支持体３１０上に、溶解可能な下地膜３２０を積層する。支持体３１０としては、例えば、電子部品用の基板等を例示することができる。より具体的には、シリコンウェハ、銅、クロム、鉄、アルミニウム等の金属製の基板や、ガラス基板等が挙げられる。
下地膜３２０としては、例えば、ポリビニルアルコール樹脂、デキストリン、ゼラチン、にかわ、カゼイン、セラック、アラビアゴム、澱粉、蛋白質、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルメチルエーテル、スチレン系エラストマー、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体、酢酸ビニルとイタコン酸との共重合体、ポリビニルピロリドン、アセチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等を用いることができる。これらの材料は、同種の液体に可溶な複数の材料の組み合わせであってもよい。下地膜の強度や柔軟性の観点から、下地膜の材料は、例えば、マンナン、キサンタンガム等の多糖類を含んでいてもよく、グアーガム等のゴム成分を含んでいてもよい。
具体的には、支持体３１０上に下地膜形成用組成物を塗布することにより、支持体３１０上に下地膜３２０を積層することができる。
（工程２）
図３（ａ）に示すように、本工程では、下地膜３２０上に第１の硬化性樹脂膜３３０を積層する。具体的には、下地膜３２０上に硬化性樹脂組成物を塗布することにより、下地膜３２０上に硬化性樹脂膜３３０を積層することができる。
硬化性樹脂組成物としては、紫外線等の活性エネルギー線を照射することにより架橋して硬化する性質を有するものが挙げられ、例えば、ネガタイプのフォトレジスト等が挙げられる。
より具体的な硬化性樹脂組成物としては、例えば、エポキシ官能性ノボラック樹脂と、トリアリールスルホニウム塩等のカチオン系光重合開始剤と、エポキシ官能基と反応可能な希釈剤とを含み、完全に硬化して、剥離しにくい樹脂となる光硬化性組成物等が挙げられる。
硬化性樹脂組成物としては、例えば、（ａ）多官能エポキシ樹脂と、（ｂ）カチオン重合開始剤と、（ｃ）溶剤とを含む樹脂組成物を好適に用いることができる。
《（ａ）多官能エポキシ樹脂》
多官能エポキシ樹脂とは、１分子中に２個以上のエポキシ基を有する樹脂であり、硬化性樹脂組成物で形成された樹脂膜を硬化させるのに十分な数のエポキシ基を１分子中に含むエポキシ樹脂であれば、どのようなエポキシ樹脂であってもよい。多官能エポキシ樹脂としては、フェノールノボラック型エポキシ樹脂、オルトクレゾールノボラック型エポキシ樹脂、トリフェニル型ノボラック型エポキシ樹脂、ビスフェノールＡノボラック型エポキシ樹脂等が挙げられる。
多官能エポキシ樹脂の１分子中に含まれるエポキシ基の数である官能性は、２以上であることが好ましく、３～１２であることがより好ましい。多官能エポキシ樹脂の官能性が３以上であることにより、高いアスペクト比と解像性を有する樹脂パターンを形成することができるので好ましく、多官能エポキシ樹脂の官能性が１２以下であることにより、樹脂合成の制御が容易となり、また樹脂パターンの内部応力が過剰に大きくなることを抑制できるので好ましい。
多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量は、３００～５０００であることが好ましく、５００～４０００であることがより好ましい。多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量が３００以上であることにより、硬化性樹脂組成物が活性エネルギー線照射によって硬化する前に熱フローしてしまうことを抑制できる点で好ましく、多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量が５０００以下であることにより、パターニング現像時の適当な溶解速度を得ることができる点で好ましい。
硬化性樹脂組成物中の多官能エポキシ樹脂の含有量は、全固形分中、１～９９．９質量％であることが好ましく、５～７０質量％であることがより好ましい。これにより、基板上にコーティングした際に、高感度で適当な硬度の硬化性樹脂膜を得ることができる。
《（ｂ）カチオン重合開始剤》
カチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー光、Ｘ線、電子線等の活性エネルギー線の照射を受けてカチオンを発生し、そのカチオンが重合開始剤となり得る化合物である。
カチオン重合開始剤としては、例えば、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－メチルフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－（β－ヒドロキシエトキシ）フェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（３－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－フルオロ４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，３，５，６－テトラメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，６－ジクロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，６－ジメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，３－ジメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（３－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－フルオロ４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－メチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，３，５，６－テトラメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，６－ジクロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，６－ジメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２，３－ジメチル－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－アセチルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ドデカノイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－アセチルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ドデカノイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－アセチルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－（４－メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ドデカノイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムテトラフルオロボレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムパークロレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムトリフルオロメタンスルホネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムテトラフルオロボレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムパークロレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムｐ－トルエンスルホネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムカンファースルホネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムノナフルオロブタンスルホネート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムテトラフルオロボレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムパークロレート、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－クロロフェニル）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネート、ジフェニル［４－（フェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート、ジフェニル［４－（ｐ－ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、ジフェニル［４－（ｐ－ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート等が挙げられる。
これらの化合物のうち、４－（２－クロロ－４－ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４－フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート（株式会社ＡＤＥＫＡ製、アデカオプトマーＳＰ－１７２）、ジフェニル［４－（フェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート（サンアプロ株式会社製、ＣＰＩ－２１０Ｓ）、ジフェニル［４－（ｐ－ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、ジフェニル［４－（ｐ－ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート（サンアプロ株式会社製、ＨＳ－１ＰＧ）が好ましい。
硬化性樹脂組成物中のカチオン重合開始剤の含有量は、全固形分中、０．１～１０質量％が好ましく、０．５～５質量％であることがより好ましい。硬化性樹脂組成物におけるカチオン重合開始剤の含有量が０．１質量％以上であれば、硬化性樹脂組成物の活性エネルギー線露光による硬化時間を適切なものとすることができる。また、硬化性樹脂組成物におけるカチオン重合開始剤の含有量が１０質量％以下であれば、活性エネルギー線による露光後の現像性が良好である。
《（ｃ）溶剤》
硬化性樹脂組成物の溶剤としては、レジストの溶剤として通常用いられるものを特に制限なく用いることができ、例えば、γ－ブチロラクトン等のラクトン類；アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、シクロヘキサノン、メチル－ｎ－ペンチルケトン（２－ヘプタノン）、メチルイソペンチルケトン等のケトン類；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール等の多価アルコール類；メトキシブチルアセテート、エチレングリコールモノアセテート、ジエチレングリコールモノアセテート、プロピレングリコールモノアセテート、ジプロピレングリコールモノアセテート等のエステル結合を有する化合物、前記多価アルコール類又は前記エステル結合を有する化合物のモノメチルエーテル、モノエチルエーテル、モノプロピルエーテル、モノブチルエーテル等のモノアルキルエーテル又はモノフェニルエーテル等のエーテル結合を有する化合物等の多価アルコール類の誘導体［これらの中では、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、プロピレングリコールモノメチルエーテル（ＰＧＭＥ）が好ましい］；ジオキサン等の環式エーテル類；乳酸メチル、乳酸エチル（ＥＬ）、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ピルビン酸メチル、ピルビン酸エチル、メトキシプロピオン酸メチル、エトキシプロピオン酸エチル等のエステル類；アニソール、エチルベンジルエーテル、クレジルメチルエーテル、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、エチルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、イソプロピルベンゼン、トルエン、キシレン、シメン、メシチレン等の芳香族系有機溶剤；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。中でも、ＰＧＭＥＡ、ＰＧＭＥ、γ－ブチロラクトン、ＥＬが好ましい。溶剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
硬化性樹脂組成物中の溶剤の含有量は、特に制限されず、支持体３１０上に塗布可能な濃度で適宜設定すればよい。例えば、硬化性樹脂組成物の固形分濃度が１～７０質量％の範囲内となる含有量とすればよい。
（工程３）
例えば、硬化性樹脂膜３３０の表面に、目的のパターン形状のフォトマスクを載置し、紫外線等の活性エネルギー線を照射する。その後、現像工程、及び必要に応じてポストベーク工程を経ることにより、硬化性樹脂膜３３０をパターニングすることができる。
図３（ｃ）に示すように、本工程では、第１の硬化性樹脂膜３３０をパターニングして、第１の貫通孔１１０ｚ及び凹部１２０の底部１２０ｚがパターニングされた第１の膜３３０ａを得る。
（工程４）
図３（ｄ）に示すように、本工程では、第１の膜３３０ａ上に第２の硬化性樹脂膜３４０を積層する。第１の膜３３０ａ上に硬化性樹脂組成物を塗布し、硬化性樹脂組成物に含まれる溶剤成分を揮発させることにより、第１の膜３３０ａ上に硬化性樹脂膜３４０を積層することができる。本工程において、硬化性樹脂組成物としては、上述した第１の硬化性樹脂膜３３０に置けるものと同様のものを用いることができる。
（工程５）
図３（ｅ）に示すように、本工程では、第２の硬化性樹脂膜３４０をパターニングして、第１の貫通孔１１０ｚに連続する第２の貫通孔１１０ｙ及び凹部１２０の側部１２０ｙがパターニングされた第２の膜３４０ａを得る。硬化性樹脂膜３４０のパターニングは、上述した硬化性樹脂膜３３０のパターニングと同様にして行うことができる。凹部１２０の側部１２０ｙは、凹部１２０の壁部、凹部１２０の側壁部等といいかえることができる。
ここで、第１の貫通孔１１０ｚ及びこれに連続する第２の貫通孔１１０ｙは、図１に示すフィルター膜１００の貫通孔１００を構成する。また、上述した凹部１２０の底部１２０ｚ及び凹部１２０の側部１２０ｙは、図１に示すフィルター膜１００の凹部１２０を構成する。
（工程６）
図３（ｅ）に示すように、本工程では、下地膜３２０を溶解して、支持体３１０から、フィルター膜１００となる第１の膜３３０ａ及び第２の膜３４０ａの積層物を剥離する。下地膜３２０の溶解は、工程５で得られた構造体を、下地膜３２０の材質に対応する剥離剤に浸漬すること等により行うことができる。
以上の工程により、上述したフィルター膜を製造することができる。
［構造体］
本実施形態の構造体は、上述したフィルター膜と、フィルター膜の他方面に対向するように、前記フィルター膜から離間して配置された基板とを備える。上述したように、フィルター膜の一方面とは、フィルター膜の凹部が開口している面である。
図４（ａ）は、本実施形態の構造体の一例である、構造体４００の上面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）に示す構造体４００のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、構造体４００は、フィルター膜１００と、フィルター膜１００の他方面１４０に対向するように、フィルター膜１００から離間して配置された基板４１０とを備える。
図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、本実施形態の構造体は、フィルター膜１００と基板４１０の他にも、構造体のフレームを構成する部材４２０等を更に備えていてもよい。図４（ａ）及び（ｂ）に示す構造体の例では、フィルター膜１００と基板４１０との間の空間は液体が流れる流路として機能する。具体的には、フィルター膜１００の一方面側から供給した液体は、フィルター膜１００の貫通孔１１０を通過してフィルター膜１００と基板４１０との間の空間に流入し、構造体４００の開口部４３０に向かって流れ、排出される。すなわち、開口部４３０は、フィルター膜１００の一方面側から供給した液体の排出口として機能する。
基板４１０及び部材４２０の材質は、特に限定されないが、例えば、粒子を捕捉して顕微鏡で観察する場合等には、透明な材質であることが好ましい。また、例えば、粒子を捕捉した後、蛍光観察を行う場合等には、自家蛍光が少ない材質であることが好ましい。また、粒子として細胞を捕捉する場合には、細胞毒性を有しない材質であることが好ましい。また、細胞の接着性が低い材質であることが好ましい。
基板４１０及び部材４２０の具体的な材質としては、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）樹脂、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、エポキシ樹脂等が挙げられる。
本実施形態の構造体において、フィルター膜１００と基板４１０との間の距離は、特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、構造体４００を用いて、後述する細胞の選別方法を実施する場合等には、フィルター膜１００の他方面１４０と基板４１０との間の距離は、例えば５０～１０００μｍであってもよく、例えば１００～５００μｍであってもよい。
［粒子を捕捉する方法］
本実施形態の粒子を捕捉する方法は、上述したフィルター膜の凹部が開口している側の面（一方面）に、粒子の分散液（懸濁液）を接触させることを含む。本実施形態の方法において、粒子は上述したものと同様である。
フィルター膜の一方面に粒子の分散液を接触させる方法としては、例えば、分散媒に懸濁された粒子（粒子の分散液）をフィルター膜１００の一方面１３０側から供給すること等が挙げられる。粒子の分散媒としては、特に制限されず、水、緩衝液、等張液、培地等が挙げられ、目的に応じて適宜用いることができる。
図５（ａ）～（ｃ）は、本実施形態の方法を説明する模式図である。まず、図５（ａ）に示すように、フィルター膜１００の一方面１３０側から粒子Ｐの分散液を導入する。その結果、粒子Ｐの分散媒は貫通孔１１０を通過してフィルター膜１００の他方面１４０側に流出する。図５（ａ）中、矢印は分散媒の流れを表す。貫通孔１００は、粒子Ｐ １個が通過できない形状又は大きさを有している。このため、粒子Ｐは、貫通孔１００を通過することができず、フィルター膜１００の一方面１３０側に残存する。
続いて、図５（ｂ）に示すように、粒子Ｐが、分散媒の流れに沿って移動し、フィルター膜１００の貫通孔１１０に近接する。図５（ｂ）中、矢印は粒子が移動する向きを表す。続いて、図５（ｃ）に示すように、貫通孔１１０に近接した粒子Ｐが、貫通孔１１０に近接して配置された凹部１２０に収容され、捕捉される。
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、粒子を効率よく捕捉することができる。また、実施例において後述するように、粒子は細胞を含んでいてもよい。
［細胞の選別方法］
本実施形態の細胞の選別方法は、複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であり、上述した構造体のフィルター膜の凹部が開口している側の面（一方面）に細胞の分散液を接触させて、細胞を凹部１つあたり１単位ずつ捕捉することと、凹部に捕捉された細胞に分泌物を分泌させ、分泌物を、基板の表面の、凹部に近接した領域に蓄積させることと、分泌物の蓄積により生じる変化を検出することと、前記変化を指標として目的の細胞を選別することと、を含む。
本実施形態において、細胞１単位とは、細胞が１個ずつ解離している場合には細胞１個を意味し、複数の細胞が集合して細胞塊を形成している場合には、細胞塊１個を意味する。
細胞１単位を構成する細胞は、分泌物を分泌する細胞であれば特に限定されず、例えば動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル、トリ、サメ等の動物由来の細胞）；植物細胞；昆虫細胞；酵母等の真菌；大腸菌等の細菌等が挙げられる。
また、これらの細胞に分泌性タンパク質、分泌性ポリペプチド又は分泌シグナルを挿入したタンパク質、ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した細胞であってもよい。
細胞が分泌する分泌物は天然由来であってもよいし、遺伝子工学を利用した非天然のものであってもよい。分泌物としては、特に限定されず、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）や免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ））、インターロイキン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５等）、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ－γ等）、造血因子（コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン等）、細胞増殖因子（上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子等）、細胞傷害因子（腫瘍壊死因子、リンフォトキシン）、アディポカイン（脂肪組織から分泌されるレプチン、腫瘍壊死因子等）、神経栄養因子（神経成長因子等）等のサイトカイン、抗生物質や色素等微生物の代謝産物、ペプチドホルモンやステロイドホルモン、微生物ホルモン、分泌性タンパク質、分泌シグナルを挿入したタンパク質等が挙げられる。
天然由来の抗体分子としては免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）や免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられる。また、非天然由来の抗体分子としては、ＦａｂやｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ等の抗体断片、単ドメイン抗体、抗体様の性質を有する人工蛋白質分子等が挙げられる。
本実施形態において使用できる細胞として、抗体分子を分泌する細胞、サイトカイン産生細胞やホルモン分泌細胞等が挙げられる。
抗体分子を分泌する細胞としては、特に限定されず、Ｂ細胞等の抗体産生細胞やミエローマ細胞と融合したハイブリドーマ、抗体をコードする遺伝子を導入した、動物細胞、酵母等の真菌、大腸菌等の細菌等が挙げられる。
サイトカイン産生細胞としては、特に限定されず、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、肝クッパー細胞、ストローマ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。
ホルモン分泌細胞としては、特に限定されず、脳下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、ラクトトロピン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、コルチコトロピン産生細胞、中間下垂体細胞、メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する細胞、オキシトシン分泌細胞、バソプレッシン分泌細胞、セロトニン分泌細胞、エンドルフィン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、ガストリン分泌細胞、セクレチン分泌細胞、コレシストキニン分泌細胞、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ボンベシン分泌細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸素性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ステロイドホルモン（鉱質コルチコイド又は糖質コルチコイド）産生細胞、テストステロン分泌細胞、エストロゲン分泌細胞、プロゲステロン分泌細胞、腎臓の傍糸球体装置の細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞等が挙げられる。
本実施形態の方法において、構造体は、例えば、図４（ａ）及び（ｂ）に示す構造体４００と同様の構造を有していてもよい。本実施形態の方法では、上記の細胞を構造体のフィルター膜の凹部１つあたり１単位ずつ捕捉する。続いて、凹部に捕捉された細胞に分泌物を分泌させる。その結果、基板４１０の表面の凹部に近接した領域に、分泌物が蓄積する。
本実施形態において、「分泌物が蓄積する」とは、分泌物が基板４１０の表面に、接触、滞留、結合、集合又は集積することであるということもできる。分泌物が基板４１０の表面に接触すること等により、基板４１０の表面における何らかの変化を検出することが可能となる。
本明細書において、分泌物と接触すること等により基板４１０の表面に何らかの変化が生じることを「分泌物に応答する」ということもできる。例えば、基板４１０の表面に細胞が配置されている場合、分泌物に対する応答態様としては、分泌物に接触することで、例えば、基板４１０の表面に配置された細胞の形態が変化する、細胞が死亡する、細胞の増殖能が変化する、細胞内の物質量（イオン、ｐＨ等）が変化する、細胞内の遺伝子の転写が活性化する等の態様が挙げられる。
構造体のフィルター膜の凹部に捕捉された細胞１単位が分泌する分泌物の評価を、基板４１０の表面で迅速に行うためには、基板４１０における分泌物の評価位置と、分泌物を分泌する細胞の位置が１対１で対応していることが好ましい。これにより、目的の細胞を選別することが容易になる。
基板４１０の表面には、フィルター膜の凹部に捕捉された細胞１単位から分泌される分泌物と親和性を有する物質が配置されていることが好ましい。ここで、「親和性を有する」とは、直接的に又は間接的に結合することを意味する。
基板４１０の表面に配置される物質は、凹部に捕捉された細胞から分泌される分泌物と結合するものであれば特に限定されず、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド、タンパク質等の生体高分子又は種々の化学物質が挙げられる。
例えば、分泌物が抗体である場合には、基板４１０の表面に配置される物質は、抗原に該当するあらゆるものが含まれ、ペプチド、タンパク質、抗原を外因的又は内因的に発現している細胞等が挙げられる。
抗原の発現部位が核内又は細胞質内である場合、細胞膜を溶解又は破砕して、抗原を露呈させたものを用いることが好ましい。また、細胞膜上に抗原を外因的又は内因的に発現している細胞を用いてもよい。この場合、細胞膜を溶解又は破砕しなくても抗体が抗原にアクセスすることができる。
すなわち、基板４１０の表面に、分泌物と親和性を有する生体分子の発現細胞が積層されているか、分泌物と親和性を有する生体分子が積層されているか、分泌物と親和性を有する化合物が積層されていることが好ましい。
本実施形態の方法により、例えば、膜タンパク質に対する抗体産生細胞を選別することができる。ここで、「膜タンパク質」とは、生体膜に付着しているタンパク質を意味する。膜タンパク質は、脂質二重膜を貫通したものであってもよく、脂肪酸鎖等によって脂質二重層に結合する膜内在性タンパク質であってもよく、非共有結合によって脂質二重層の親水性部分や他の膜タンパク質に結び付く表在性膜タンパク質であってもよい。膜タンパク質は、複数回膜貫通型であってもよいし、一回膜貫通型であってもよい。
膜タンパク質としては、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、リガンド依存性イオンチャネル、電位依存性イオンチャネル、トランスポーター等が挙げられる。
基板４１０、基板４１０の表面に非特異的に結合した物質を除去するための流路構造を有することが好ましい。例えば、図４（ｂ）に示すように、構造体４００のフィルター膜１００の他方面１４０と基板４１０との間の空間は液体が流れる流路として機能する。
液体が流れる流路は、基板４１０の表面に生じる変化を検出するための検出用物質、例えば、基板４１０の表面に配置された物質に結合した分泌物を検出するための検出用物質を通液するためのものであってもよい。
検出用物質は、標識された物質であることが好ましい。例えば、分泌物が抗体である場合には、検出用物質としては、例えば、抗体のＦｃ部分等に特異的に結合する標識抗体等が挙げられる。標識としては、酵素標識、蛍光標識、ビオチン標識、放射性物質による標識等が挙げられる。
本実施形態の方法により目的の細胞を選別した後、選別した細胞を回収することができる。フィルター膜の凹部に捕捉された細胞の回収方法は、特に限定されず、例えば、マニュピレーター、ピペット等を用いて行うことができる。
本明細書において引用される全ての技術文献は、参照としてその全体が本明細書中に援用される。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられ、発明を限定する意図として理解されてはならない。異なる定義が明示されていない限り、本明細書で用いられる用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有するものとして解釈され、かつ、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本明細書で用いられる用語「含む」は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを排除しない。
本明細書及び特許請求の範囲において、特に明示されていない場合であって、文脈において矛盾しない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の各名詞が表す対象は、一又は複数存在してもよいことが意図される。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（構造体の製造）
図４（ａ）及び（ｂ）に示すような形状の構造体を製造した。
《フィルター膜の製造》
シリコン基板上に、下地膜形成用組成物をスピンコータ―（１５００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で１分間、１２０℃で３分間プリベークし、下地膜を形成した。
続いて、下地膜上に硬化性樹脂組成物（特開２００８－１８０８７７号公報、特開２０１１－１１１５８８号公報参照。）をスピンコータ―（１５００ｒｐｍ、７０秒）で塗布し、ホットプレートにより６０℃で２分間プリベークした。その後、ｉ線ステッパー（型式「ＮＳＲ－２２０５ｉ１４Ｅ」、ニコン製）を用いてパターン露光を行い、ホットプレートにより９０℃で９０秒間露光後加熱を行った。その後、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）を用いた浸漬法により、３０秒間の現像処理を行った。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１２０℃で１分間ポストベークし、第１の貫通孔及び凹部の底部がパターニングされた第１の膜を得た。
続いて、第１の膜上に前記硬化性樹脂組成物をスピンコータ―（１０００ｒｐｍ、７０秒）で塗布し、ホットプレートにより１２０℃で３分間プリベークした。その後、ｉ線ステッパー（型式「ＮＳＲ－２２０５ｉ１４Ｅ」、ニコン製）を用いてパターン露光を行い、ホットプレートにより１２０℃で２分間露光後加熱を行った。その後、ＰＧＭＥＡを用いた浸漬法により、９０秒間の現像処理を行った。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１８０℃で１５分間ポストベークし、第１の貫通孔に連続する第２の貫通孔及び凹部の側部がパターニングされた第２の膜を得た。この結果、第１の膜及び第２の膜の積層物であるフィルター膜が得られた。
図１（ｃ）は、製造したフィルター膜の走査型電子顕微鏡写真である。製造したフィルター膜は、一辺１５μｍの正方形の開口部を有する四角柱形状の凹部と、短辺５μｍ、長辺１５μｍの四角柱形状の貫通孔を有していた。凹部の高さは１５μｍであった。また、凹部間のピッチは３０μｍであり、貫通孔間のピッチは３０μｍであった。また、フィルター膜全体に存在する凹部の数は１．５×１０６個であった。
（フィルター膜の剥離）
第２の膜を形成後の基板を剥離剤に浸漬し、下地膜を溶解した。この結果、シリコン基板からフィルター膜が剥離した。
（構造体の製造）
《構造体のフレームの製造》
射出形成により、ポリスチレン製のフレームを作製した。
《フィルター膜及び基板の接合》
フィルター膜、ポリスチレン製の基板及び前記フレームを接着剤で接合し、実施例１の構造体を得た。フィルター膜は、凹部が開口する面の反対側の面（他方面）が基板と対向するように接合した。フィルター膜の他方面と基板との間の距離は２５０μｍであった。
［比較例１］
実施例１と同様の方法により、図４（ａ）及び（ｂ）に示すような形状の比較例１の構造体を製造した。比較例１の構造体は、実施例１の構造体とフィルター膜の構造のみが異なっていた。比較例１の構造体のフィルター膜は、実施例１の構造体のフィルター膜と、同じ形状、同じサイズ、同じ数の凹部を有していたが、貫通孔を有しないものであった。
［実験例１］
（細胞の捕捉効率の評価）
実施例１及び比較例１の構造体を用いて細胞を捕捉し、細胞の捕捉効率を評価した。捕捉する細胞として、生細胞染色用蛍光色素であるＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学研究所製）で染色したＮａｍａｌｗａ細胞を用いた。細胞の培地にはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。
まず、実施例１及び比較例１の構造体のフィルター膜に２ｍＬの培地をそれぞれ添加し、フィルター膜及び構造体の内部が濡れた状態にした。続いて、フィルター膜に存在する凹部と同数の細胞（１．５×１０６個）が分散した５ｍＬの培地を、各構造体のフィルター膜の凹部が開口する面側（一方面側）に加えた。
続いて、流路を通して排出された培地を細胞の添加から１分以内に合計４ｍＬ除去し、そのまま静置した。続いて、１０分間静置後にフィルター膜に焦点を合わせて蛍光顕微鏡観察を行い、凹部に捕捉された細胞をカウントした。蛍光顕微鏡（倍率１０倍）の１視野あたりの凹部の数は９８９個であった。
図６（ａ）は、実施例１の構造体のフィルター膜の代表的な蛍光顕微鏡写真である。倍率は１０倍であった。また、図６（ｂ）は、比較例１の構造体のフィルター膜の代表的な蛍光顕微鏡写真である。倍率は１０倍であった。また、下記表１に１視野あたりの凹部に捕捉された細胞をカウントした代表的な結果を示す。
Figure 0007045924000001
この結果、実施例１の構造体のフィルター膜によれば、効率よく細胞を捕捉することができることが明らかとなった。
［実験例２］
（細胞の選別）
実施例１の構造体を用いて、目的タンパク質を発現する細胞の選別を行った。目的タンパク質として、膜タンパク質であるＲＡＮＫＬに対するマウスモノクローナル抗体を使用した。
２９３ＦＴ細胞に、上記モノクローナル抗体をコードする遺伝子を導入した。続いて、遺伝子を導入した２９３ＦＴ細胞の集団から、上記モノクローナル抗体を発現する細胞を選別した。
まず、実施例１の構造体の開口部４３０から０．０５ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸バッファー（ＰＢＳ）で希釈したフィブロネクチン（型式「０６３－０５５９１」、和光純薬）を導入し、４℃で一晩静置して、構造体の基板表面にフィブロネクチンをコーティングした。
続いて、構造体の開口部４３０からＰＢＳを通液して、余分なフィブロネクチンを洗浄除去した。続いて、構造体の開口部４３０から、膜タンパク質であるＲＡＮＫＬを発現させたＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞を導入して播種し、４８時間培養した。
続いて、抗体遺伝子を導入した２９３ＦＴ細胞を、蛍光色素であるＣｅｌｌＢｒｉｔｅ（ＴＭ）Ｏｒａｎｇｅ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（型式「３００２２」、Ｂｉｏｔｉｕｍ社）で染色した。続いて、蛍光色素で染色した２９３ＦＴ細胞を、構造体のフィルター膜上に播種し、フィルター膜の凹部１個あたり１個ずつ捕捉した。
続いて、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（型式「＃Ａ１１００１」、ライフテクノロジーズ社）をウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＭＥＭα培地で５００倍希釈し、構造体のフィルター膜上に導入し、ＣＯ２インキュベーター中で３時間静置した。この結果、２９３ＦＴ細胞が分泌したマウスモノクローナル抗体、基板上のＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞が発現した膜タンパク質、及びＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体からなる抗原抗体複合体が形成された。
続いて、構造体の開口部４３０からＦＢＳ添加ＭＥＭα培地を通液して洗浄を行い、未反応の抗体を除去した。続いて、蛍光顕微鏡（型式「ＣＫＸ４１」、オリンパス社製）で細胞を観察した。
図７は、構造体の基板側から撮影した代表的な蛍光顕微鏡写真である。その結果、２９３ＦＴ細胞が赤色蛍光により検出された。また、目的のマウスモノクローナル抗体を分泌した２９３ＦＴ細胞の近傍に、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞が発現した膜タンパク質に結合したマウスモノクローナル抗体の存在が緑色蛍光により検出された。
これらの蛍光を検出した結果、マウスモノクローナル抗体を発現する２９３ＦＴ細胞を細胞１個レベルで特定し、選別することができた。図７中、マウスモノクローナル抗体を発現する２９３ＦＴ細胞を矢印で示す。
以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換及びその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
本発明によれば、粒子を効率よく捕捉する技術を提供することができる。
１００，１００ａ，１００ｂ…フィルター膜、１１０，１１０ａ，１１０ｂ…貫通孔、１１０ｚ…第１の貫通孔、１１０ｙ…第２の貫通孔、１２０，１２０ａ，１２０ｂ…凹部、１２０ｚ…凹部の底部、１２０ｙ…凹部の側部、１３０…一方面、１４０…他方面、３１０…支持体、３２０…下地膜、３３０，３４０…硬化性樹脂膜、３３０ａ…第１の膜、３４０ａ…第２の膜、４００…構造体、４１０…基板、４２０…部材、４３０…開口部、Ｐ…粒子。

Claims (9)

  1. 細胞捕捉用フィルター膜であって、
    貫通孔と、細胞１単位を収容可能な大きさを有する凹部とを有し、
    前記凹部は、前記細胞捕捉用フィルター膜の一方面に開口しており、
    前記一方面における前記貫通孔は、前記細胞１単位が通過できない形状又は大きさであり、
    前記貫通孔と前記凹部とが隣接して配置されており、
    前記凹部は、前記細胞捕捉用フィルター膜における前記貫通孔の形成されていない部分の表面に設けられている、細胞捕捉用フィルター膜。
  2. 複数の前記貫通孔及び複数の前記凹部を有し、前記貫通孔の数と前記凹部の数との比（貫通孔：凹部）が、１：５～１００：１である、請求項１に記載の細胞捕捉用フィルター膜。
  3. 前記細胞１単位の投影面積相当径が、０．０１μｍ以上１ｍｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞捕捉用フィルター膜。
  4. 前記貫通孔の面における形状の重心と、前記凹部の面における形状の重心との間の距離が、前記細胞１単位の投影面積相当径の０．５～１０倍である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞捕捉用フィルター膜。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞捕捉用フィルター膜の製造方法であって、
    支持体上に、溶解可能な下地膜を積層することと、
    前記下地膜上に第１の硬化性樹脂膜を積層することと、
    前記第１の硬化性樹脂膜をパターニングして、第１の貫通孔及び前記凹部の底部がパターニングされた第１の膜を得ることと、
    前記第１の膜上に第２の硬化性樹脂膜を積層することと、
    前記第２の硬化性樹脂膜をパターニングして、前記第１の貫通孔に連続する第２の貫通孔及び前記凹部の側部がパターニングされた第２の膜を得ることと、
    前記下地膜を溶解して、前記支持体から、前記細胞捕捉用フィルター膜となる前記第１の膜及び前記第２の膜の積層物を剥離することと、
    を含む、細胞捕捉用フィルター膜の製造方法。
  6. 請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞捕捉用フィルター膜と、
    前記細胞捕捉用フィルター膜の他方面に対向するように、前記細胞捕捉用フィルター膜から離間して配置された基板と、
    を備える、構造体。
  7. 細胞又は細胞塊を捕捉する方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞捕捉用フィルター膜の前記凹部が開口している側の面に、細胞又は細胞塊の分散液を接触させること、を含む、細胞又は細胞塊を捕捉する方法。
  8. 複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、
    請求項６に記載の構造体の前記細胞捕捉用フィルター膜の前記凹部が開口している側の面に前記細胞の分散液を接触させて、前記細胞を前記凹部１つあたり１単位ずつ捕捉することと、
    前記凹部に捕捉された前記細胞に前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を、前記基板の表面の、前記凹部に近接した領域に蓄積させることと、
    前記分泌物の蓄積により生じる変化を検出することと、
    前記変化を指標として目的の細胞を選別することと、
    を含む、細胞の選別方法。
  9. 前記基板の表面に、前記分泌物と親和性を有する生体分子の発現細胞が積層されているか、前記分泌物と親和性を有する生体分子が積層されているか、又は、前記分泌物と親和性を有する化合物が積層されている、請求項８に記載の細胞の選別方法。
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