JP4382524B2

JP4382524B2 - 生体分子含有粒子固定化担体及び生体分子含有粒子の固定化方法

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Publication number: JP4382524B2
Application number: JP2004051708A
Authority: JP
Inventors: 宏増原; 勇王; 陽一郎細川; 千恵松原
Original assignee: Kyoritsu Chemical and Co Ltd
Current assignee: Kyoritsu Chemical and Co Ltd
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2024-02-26
Also published as: JP2005241439A

Description

本発明は生体分子含有粒子固定化担体及び生体分子含有粒子の固定化方法に関する。より詳しくは、タンパク質などの生体分子と化学物質との結合やその結合の阻害を解析することができる生体分子含有粒子固定化担体及び生体分子含有粒子の固定化方法に関する。
本発明の目的は、生体分子を含む粒子が活性を維持した状態で基板に強固に固定化された生体分子含有粒子固定化担体、および生体分子を含む粒子を変性させることなく生体分子の活性を維持した状態で基板に強固に固定することができる生体分子含有粒子の固定化方法を提供することにある。

ヒトをはじめとする様々な生物種において、ゲノム解析が行われており、中にはヒトのように全配列が解析された生物種も存在している。今後は、ゲノム情報の解析に加えて、遺伝子によって発現する酵素、免疫分析において重要な抗原抗体、生体のシグナル伝達に関与する細胞膜レセプタータンパク質等の生体機能分子の機能解析に研究の中心が移っていくものと考えられる。
また、今後の医薬、医療分野における中心的な課題として、ゲノム創薬やテーラーメード医療を挙げることができる。これらは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）又はマイクロサテライト部を含むＤＮＡ断片の解析や、多様な一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析によって実現される。

生体分子の機能解析においては、多数の生体分子の中から有用な生体分子をスクリーニングしなければならない。多数の生体分子の中から有用なタンパク質やＤＮＡをスクリーニングする方法としては、ＤＮＡやタンパク質などの生体分子を基板上に固定化したＤＮＡチップやプロテインチップを使用したスクリーニング方法が提案されている。
ＤＮＡチップやプロテインチップを作成する上で問題となるのが、ＤＮＡやタンパク質等の微小な生体分子を基板上にその活性を低下させず固定化する方法である。

ＤＮＡやタンパク質等を微粒子状にして基板上に固定化する方法として、特許文献１には、基板及び微粒子に吸収のない波長を有するレーザー光（Ｎｄ^３＋：ＹＡＧレーザー、１０６４ｎｍ）を、光重合剤が溶解されたエチレングリコール中に分散させた微粒子に集光照射して該微粒子を捕捉し、光重合剤に吸収される波長を有するレーザー光（Ｎｄ^３＋：ＹＡＧレーザーの第三高調波、３５５ｎｍ）を前記捕捉された微粒子に集光照射して、光重合剤の重合開始閾値を利用して微粒子の周囲のみを硬化させて、微粒子を基板に固定する方法が開示されている。

特開２００３−７１８００号公報

図１０に、特許文献１記載の方法で微粒子を基板上に固定化する方法の概略を示す。特許文献１記載の方法では、ＤＮＡやタンパク質で作製した微粒子（Ａ）を、光重合剤を含有するエチレングリコール（Ｂ）に分散させて、この溶液にＮｄ^３＋：ＹＡＧレーザーの第三高調波で波長３５５ｎｍのレーザー光を照射して、微粒子の周囲の溶液を重合させることにより、微粒子を基板（Ｃ）上に固定することができる。
しかしながら、この方法では、基板（Ｃ）上に微粒子（Ａ）を強固に固定化することができるものの、図１０の（Ｂ）に示すように、微粒子（Ａ）が重合したアクリルアミド（Ｄ）中に埋没してしまう場合があった。また紫外線を微粒子（Ａ）の周囲に照射するために、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子が変性する場合があった。

即ち、本発明は、生体分子を含む粒子が活性を維持した状態で基板に強固に固定化された生体分子含有粒子固定化担体、および生体分子を含む粒子を変性させることなく生体分子の活性を維持した状態で基板に強固に固定することができる生体分子含有粒子の固定化方法を提供することを課題とする。

請求項１に係る発明は、基板と該基板の表面上に固定された生体分子を含む粒子とからなり、該粒子は光硬化された光硬化性樹脂によって該光硬化性樹脂に埋没せずに生体分子の活性を維持した状態で該基板上に固定されており、前記光硬化性樹脂は、前記粒子が分散される分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しないことを特徴とする生体分子含有粒子固定化担体に関する。
請求項２に係る発明は、前記光硬化性樹脂が水非溶解性の光硬化性樹脂であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子含有粒子固定化担体に関する。
請求項３に係る発明は、前記粒子は、生体分子により構成される分子性結晶、生体分子を担持した金粒子若しくは高分子粒子、細胞、生体分子を含むミセル、ベシクルからなる群から選択される一種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体分子含有粒子固定化担体に関する。
請求項４に係る発明は、前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖からなる群から選択される一種以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の生体分子含有粒子固定化担体に関する。
請求項５に係る発明は、生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下した後に、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を照射して薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法に関する。
請求項６に係る発明は、生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下した後に、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を、薄層の生体分子を含む粒子が接する部分或いはその近傍に集光させて薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法に関する。
請求項７に係る発明は、生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下し、基板及び薄層並びに生体分子を含む粒子に吸収されない波長を有するレーザー光を分散液中に分散された生体分子を含む粒子に照射して生体分子を含む粒子を捕捉し、次いで、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を、薄層の生体分子を含む粒子が接する部分或いはその近傍に集光させて薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法に関する。

本発明に係る生体分子含有粒子固定化担体によれば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖などの生体分子を含む粒子が、生体分子の活性を維持した状態で基板に強固に固定化された生体分子含有粒子固定化担体を提供することができる。
本発明に係る生体分子含有粒子の固定化方法によれば、生体分子を含む粒子を変性させることなく生体分子の活性を維持した状態で基板に強固に固定することができる。
また本発明に係る生体分子含有粒子の固定化方法によれば、生体分子を含む粒子を任意に配列することができる。

以下、本発明に係る生体分子含有粒子固定化担体及び生体分子含有粒子の固定化方法について詳述する。
まず、本発明の第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法について、図面を参照しつつ説明する。
図１は、本発明の第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法の概略工程について説明した図である。

第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法では、まず、生体分子を含む粒子（Ｍ）が分散された分散液を、表面に光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）が積層された基板（１０）上に滴下する（図１の（Ａ）工程）。分散液を基板（１０）上に滴下するには、マイクロピペット（Ｐ）等を用いればよい。

基板（１０）上に固定化される生体分子含有粒子（Ｍ）は特に限定されず、生体分子により構成される分子性結晶、生体分子を担持した金粒子若しくは高分子粒子、細胞、生体分子を含むミセル、ベシクルなどを例示することができる。
生体分子含有粒子（Ｍ）に含まれる生体分子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸、糖、抗原、抗体、酵素などを例示することができる。
特に本発明では、タンパク質を固定化することが好ましく、結晶性タンパク質封入体を固定化することがより好ましい。
結晶性タンパク質封入体とは、昆虫ウイルスが形成する１００ｎｍ〜１０μｍ程度の大きさのタンパク質結晶構造体の内部に、生理活性を保持した状態でタンパク質分子を取り込ませたものである。この構造体は多角体と呼ばれており、ウイルスによってコードされたポリヘドリンと呼ばれるタンパク質が結晶状に会合して形成された結晶構造体である。

基板（１０）上に固定化される生体分子含有粒子（Ｍ）の大きさは特に限定されないが、例えば、１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍである。

生体分子含有粒子（Ｍ）は分散媒（Ｌ）に分散されて分散液とされる。分散媒（Ｌ）は特に限定されず、生体分子含有粒子（Ｍ）を変性させることがなく、且つ基板（１０）上に積層された光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）を溶解したり、或いは薄層（１１）を分解したりすることがない分散媒（Ｌ）であればよく、具体的には、水、緩衝液、界面活性剤添加水溶液、培養液などを例示することができ、水を用いることが好ましい。
生体分子含有粒子（Ｍ）は分散媒（Ｌ）に任意の濃度となるように、例えば、１０^９〜１０^２１個／ｌ、好ましくは１０^１２〜１０^１８個／ｌの濃度となるように添加されて、分散液とされる。

生体分子含有粒子（Ｍ）が固定化される基板（１０）は、通常の固定化担体の基板（１０）として用いられるものであれば特に限定されない。好ましくは、表面に積層される光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）を硬化させることができる波長を有する光を透過させることができるものを例示することができ、例えば、ガラス板、石英、サファイアなどを例示することができる。

基板（１０）の形態も特に限定されず、図２の（Ａ）に示すような、両面が平坦面とされたプレート形状の基板（１０）を例示することができる。図２の（Ａ）に示すような基板（１０）を使用する場合、基板（１０）上に滴下される分散液が基板（１０）上に留まるように、基板（１０）の光硬化性樹脂組成物が積層された面に、貫通孔（２１）が設けられた薄膜（２０）をさらに積層して使用する。貫通孔（２１）が設けられた薄膜（２０）としては、シリコーンゴムなどの有機固体膜を例示することができる。分散液は貫通孔（２１）内に滴下される。
また図２の（Ｂ）に示すような、表面に底面が平坦面とされた凹部（１３）が形成された基板（１０）を使用することもできる。凹部（１３）の底面に光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）が積層される。図２の（Ｂ）に示すような基板（１０）を使用する場合、凹部（１３）内に分散液が滴下される。

基板（１０）の表面には、光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）が積層されている。基板（１０）の表面に積層される光硬化性樹脂組成物は、分散媒（Ｌ）に溶解したり、或いは分散媒（Ｌ）と接触することにより分解したりすることがない光硬化性樹脂組成物であればよく、例えば、光重合性プレポリマー、光重合性希釈剤、光重合開始剤を含む紫外線性樹脂組成物などの光硬化性樹脂組成物を例示することができる。
光硬化性樹脂組成物は２００〜４５０ｎｍ、好ましくは２００〜４００ｎｍの波長の光によって硬化するものが好ましい。尚、４００ｎｍ以下の紫外線領域の光によって影響を受け易い生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に固定する場合は、４００〜４５０ｎｍの波長の光によって硬化する光硬化性樹脂組成物を用いればよい。４００ｎｍ以下の紫外線領域の光によって影響を受け難い生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に固定する場合は、４００〜４５０ｎｍの波長の光によって硬化する光硬化性樹脂組成物に加えて、２００〜４００ｎｍの波長の光によって硬化する紫外線硬化性樹脂組成物を使用することができる。

光重合性プレポリマーとしては、エステルアクリレート、エーテルアクリレート、ウレタンアクリレート、エポキシアクリレート、アミノ樹脂アクリレート、アクリル樹脂アクリレート、不飽和ポリエステルなどを例示することができる。
光重合性プレポリマーの含有量は特に限定されないが、組成物全量中２０〜９０重量％、好ましくは４０〜８０重量％とされる。

光重合性希釈剤としては、２−エチルヘキシルアクリレート、エトキシジエチレングリコールアクリレート、フエノキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、ジシクロペンテニルアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ヒドロキシピバリン酸ネオペンチルグリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ビス（アクリロキシエチル）ビスフェノールＡ、メリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールヘキアクリレート、ビニルシクロヘキセンモノオキサイド、ヒドロキシブチルビニールエーテル、シクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル、シクロヘキセンジエポキシド、カプロラクトンポリオールなどを例示することができる。
光重合性希釈剤の含有量は特に限定されないが、組成物全量中１０〜５０重量％、好ましくは１５〜４５重量％とされる。

光重合開始剤としては、アセトフェノン、ベンゾフェノン、フルオレイン、ベンズアルデヒド、アンスラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール、３−ブロモアセトフェノン、４−アリルアセトフェノン、ｐ−ジアセチルベンゼン、３−メトキシベンゾフェノン、キサントーン、ベンゾイル、ベンゾイルメチルエーテル、ビス（４−ジメチルアミノフェニル）ケトン、ベンジルメトキシケタール、２−クロロチオキサトーンなどを例示することができる。
光重合開始剤の含有量は特に限定されないが、組成物全量中０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％とされる。

また、増感剤を添加することもできる。増感剤としては、アセトフェノン、３−メチルアセトフェノン、プロピオニフェノン、ベンゾフェノン、４−クロロベンゾフェノン、４−エチルベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、ベンゾイン、キサントーン、フルオレノン、フルオレン、ベンズアルデヒド、アンスラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール、ベンゾインエチルエーテルなどを例示することができる。
増感剤を配合する場合、増感剤の含有量は特に限定されないが、組成物全量中０．０１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％とされる。

また充填剤を添加することもできる。充填剤としては、水に溶解しないものが望ましく、アルミナ、シリカ、タルク、マイカ、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンなどを例示することができる。
充填剤を配合する場合、含有量は特に限定されないが、組成物全量中０．５〜９０重量％、好ましくは１０〜３０重量％とされる。

光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）は、少なくとも基板（１０）表面の分散液が滴下される箇所に、略均一な厚さで積層されていればよい。光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）の厚さは、生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に強固に固定化することができる厚さであればよく、具体的には１０ｎｍ以上であればよく、１〜１００μｍであることがより好ましい。
光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）の厚さが１０ｎｍ未満の場合、生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に強固に固定化することができない場合がある。

基板（１０）表面上に分散液を滴下（図１の（Ａ）では、薄膜（２０）を基板（１）上に積層して、貫通孔（２１）内に滴下している。）した後、ガラス板（３０）などで分散液を封入する。
次いで、光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）を硬化させることができる波長を有する光を照射して（図１の（Ｂ）参照）、光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）を硬化させる（図１の（Ｃ）参照）。尚、図１中、硬化した光硬化性樹脂は１２で示している。
基板（１０）表面上に分散液を滴下した後、静置すると、分散液中の生体分子含有粒子（Ｍ）は、基板（１０）表面上に積層された光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）上に沈殿した状態となる。この状態で、光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）を硬化させることができる波長を有する光を照射することにより、光硬化性樹脂組成物を硬化させる。光硬化性樹脂組成物が硬化することにより、光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）と接していた生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に固定化することができる。

光硬化性樹脂組成物を硬化させることができる光は、光硬化性樹脂組成物の略全面にわたって照射しても構わないが、薄層（１１）の生体分子含有粒子（Ｍ）が接する部分或いはその近傍に集光レンズ（４１）（例えば、１０〜１００倍の対物レンズ）などで集光させて照射することもできる。この場合、基板（１０）の表面に積層された光硬化性樹脂組成物のうち、生体分子（Ｍ）と接した部分又はその近傍のみを硬化させることができる。
光硬化性樹脂組成物を硬化させることができる光は、基板（１０）の薄層（１１）が積層された面側から薄層（１１）に対して照射しても良く、また基板（１０）の薄層（１１）が積層された面の反対側の面側から薄層（１１）に対して照射しても良い。特に本発明では、基板（１０）の薄層（１１）が積層された面と反対側の面側から薄層（１１）に対して照射することが好ましい。こうすることにより、光硬化性樹脂組成物を硬化させることができる光として紫外線を用いた場合でも、生体分子含有粒子（Ｍ）に与える影響を最小限に抑えることができる。

光硬化性樹脂組成物を硬化させることができる光は、光硬化性樹脂組成物を硬化させることができる波長、具体的には２００〜４５０ｎｍ、好ましくは２００〜４００ｎｍの波長の光であればよい。
２００〜４５０ｎｍの波長の光を照射することができる装置（４０）としては、紫外線ライトや、３５５ｎｍのＮｄ^３＋：ＶＹＯ_４レーザー、３２５ｎｍのＨｅＣｄレーザー、３５５ｎｍのＮｄ^３＋：ＹＡＧレーザーなどの紫外線レーザーを例示することができる。

最後に、基板（１０）上に残った未硬化の薄層（１１）や、基板（１０）上に固定化されなかった生体分子含有粒子（Ｍ）を洗浄、除去することによって、本発明に係る生体分子含有粒子固定化担体を得ることができる（図１の（Ｄ）参照）。

本発明に係る生体分子含有粒子固定化担体は、生体分子含有粒子（Ｍ）が光硬化性樹脂によって基板（１０）の表面に固定化されている。しかも、生体分子含有粒子（Ｍ）は光硬化性樹脂に埋没していないので、生物活性を保持したまま、基板（１０）上に固定することができる。

次に、本発明の第二実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法について、図面を参照しつつ説明する。
図３は第二実施形態に係る生体分子含有粒子（Ｍ）の固定化方法の概略工程について記した説明図である。
第二実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法が、上述した第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法と相違する点は、基板（１０）表面上に生体分子含有粒子（Ｍ）の分散液を滴下した後に、レーザーマニピュレーション法によって生体分子含有粒子（Ｍ）を捕捉して、生体分子含有粒子（Ｍ）を任意の位置に移動して、生体分子含有粒子（Ｍ）の配列を行う点である（図３の（Ｂ）参照）。

レーザーマニピュレーション法とは、レーザー光の光圧によって微小物体をトラッピングする技術である。レーザーマニピュレーション法に関しては、例えば特開平２−９１５４５号公報や特開２００３−９４３９６号公報に開示されている。
生体分子含有粒子（Ｍ）に照射されるレーザー光（トラッピングレーザー）を照射することができる装置（５０）としては、基板（１０）及び薄層（１１）並びに生体分子含有粒子（Ｍ）に吸収されない波長を有するレーザー光を照射することができる装置が好ましく、１０６４ｎｍのＶＹＯ_４レーザーや１０６４ｎｍのＹＡＧレーザーなどを例示することができる。

第二実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法では、まず、生体分子含有粒子（Ｍ）が分散された分散液を、表面に光硬化性樹脂組成物からなる薄層（１１）が積層された基板（１０）上に、マイクロピペット（Ｐ）などを用いて滴下する（図３の（Ａ）参照）。
次いで、図３の（Ｂ）に示されるように、装置（５０）から照射されたトラッピングレーザーを集光レンズ（５１）によって基板（１０）表面上に滴下された生体分子含有粒子（Ｍ）に集光させて生体分子含有粒子（Ｍ）を捕捉して、生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）表面上の任意の位置に配列する。
その後、図３の（Ｃ）〜（Ｆ）に示されるように、上述した第一実施形態に係る方法と同様の方法によって、生体分子含有粒子（Ｍ）を基板（１０）上に固定化する。

以上説明した以外の構成については、上述した第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法と同様であり、説明を省略する。尚、図１の（Ａ）は図３の（Ａ）に相当し、図１の（Ｂ）は図３の（Ｄ）に相当し、図１の（Ｃ）は図３の（Ｅ）に相当し、図１の（Ｄ）は図３の（Ｆ）に相当する。

第二実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法で得られる生体分子含有粒子固定化担体は、レーザーマニピュレーション法によって生体分子含有粒子（Ｍ）が任意の位置に非接触で移送されるので、生体分子含有粒子が任意に配列されている。

以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（試験例１：ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶／蛍光ビーズの基板への固定）
図４は、試験例１で使用した装置の概略を示す図である。
３２ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス（１００）の表面に、紫外線硬化性樹脂組成物（協立化学産業株式会社製、商品名：「ワールドロックNo.8130H2」）をスピンコーター（ミカサ株式会社製、スピンコーター1H-D7）により回転塗布して、紫外線硬化性樹脂からなる薄層（１１０）を積層した。
カバーガラス（１００）の一方の面に積層された薄層（１１０）上に、中央に１ｍｍ×１ｍｍの大きさの貫通孔が設けられた厚さ０．１ｍｍのシリコーンシート（２００）を載置した。次いで、シリコーンシート（２００）の貫通孔の部分に、Enhanced green fluorescent protein（ＥＧＦＰ）封入タンパク質結晶（株式会社プロテインクリスタル製）又は蛍光ビーズ（Ｎ）の水（Ｌ）分散液を滴下して、シリコーンシート（２００）の貫通孔をカバーガラス（３００）で密閉した。
カバーガラス（１００）の紫外線硬化性樹脂組成物が積層された面と反対側の面から、ＵＶライト（４０１）（３６６ｎｍ、UVP,INC社製、商品名：MODEL UVGL-25 MINERALIGHT LAMP）を３０分間照射した。
シリコーンシート（２００）を取り除き、カバーガラス（１００）の表面をアセトンで洗浄して、未硬化の樹脂組成物や余剰の分散液を除去した。
尚、ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶は、「京都工芸繊維大学博士論文、池田敬子、２００１」や「K.Ikeda, A.S.Nagaoka, S.Winkler, K.Kotani, H.Yagi, K.Nakanishi, S.Miyajima, J.Kobayashi, and H.Mori, J.Virology, 75(2001), 988」に記載されている方法に準ずる方法で調製したものを使用した。

カバーガラス（１００）の表面を顕微鏡で観察して透過像を撮影した。また蛍光顕微鏡により、蛍光像を撮影した。結果を図５に示す。
図５に示されるとおり、カバーガラスの表面にタンパク質結晶と蛍光ビーズが固定化されていることが、透過像及び蛍光像の双方で確認することができた。薄層（１１０）のＵＶライト照射部位は、タンパク質結晶又は蛍光ビーズを保持した状態で硬化したことが確認された。
また、蛍光像によって、ＥＧＦＰの蛍光発光が確認されたことから、ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶はＥＧＦＰの活性が維持された状態のまま、カバーガラス（１００）上に固定されたことが確認された。

（試験例２：樹脂硬化のレーザーパワー依存性）
図６は試験例２で使用した装置の概略構成を示す部分断面図である。この装置において、ＵＶパルスレーザー（４０２）としては、Ｎｄ^３＋：ＹＶＯ_４レーザー（繰り返し周波数３５ＫＨｚ、パルス幅８ｎｓ）（スペクトラ・フィジックス社（米国）製、商品名「J30-B9S-355QL」）を使用した。
表面に、紫外線硬化性樹脂組成物（協立化学産業株式会社製、商品名：「ワールドロックNo.8130H2」）をスピンコーター（ミカサ株式会社製、スピンコーター１H-D7）により回転塗布して紫外線硬化性樹脂からなる薄層（１１０）を積層した３２ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス（１００）を、倒立型顕微鏡（オリンパス社製、商品名「IX81」）の自動ステージ（Ｓ）に載置した。カバーガラス（１００）の一方の面に積層された薄層（１１０）上に、中央に１ｍｍ×１ｍｍの大きさの貫通孔が設けられた厚さ０．１ｍｍのシリコーンシート（２００）を載置して、シリコーンシートの貫通孔の内部に水（Ｌ）を滴下した後、シリコーンシートの貫通孔をカバーガラス（３００）で密封した。
Ｎｄ^３＋：ＹＶＯ_４レーザーの第三高調波（３５５ｎｍ、９．３５μＷ）（スペクトラ・フィジックス社（米国）製、商品名「J30-B9S-355QL」）を、倒立型顕微鏡のダイクロイックミラー（４２０）で反射させて、２０倍の対物レンズ（４１０）を通じて紫外線硬化性樹脂の任意の箇所に１秒間照射した。
カバーガラス（３００）を取り除いた後、カバーガラス（１００）表面をアセトンで洗浄して、未硬化の樹脂組成物や余剰の分散液を除去した。
次いで、カバーガラス（１００）の表面を顕微鏡で観察して透過像を撮影した。
また、レーザーパワーを変動させた場合の紫外線硬化性樹脂の硬化の程度を、上記と同様の方法によって観察した。

紫外線硬化性樹脂の透過像を図７に示す。この結果によれば、１．１４μＷ以上のレーザーパワーで紫外線硬化性樹脂を硬化させることが確認できた。
また硬化した紫外線硬化性樹脂の蛍光像を撮影したところ、弱いながらも蛍光を発することが確認された。

（試験例３：ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶の基板への固定）
試験例３では、試験例２と同様の試験装置を使用した。
即ち、表面に、紫外線硬化性樹脂組成物（協立化学産業株式会社製、商品名：「ワールドロックNo.8130H2」）をスピンコーター（ミカサ株式会社製、スピンコーター１H-D7）により回転塗布して紫外線硬化性樹脂からなる薄層（１１０）を積層した３２ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス（１００）を、倒立型顕微鏡（オリンパス社製、商品名「IX81」）の自動ステージ（Ｓ）に載置した。カバーガラス（１００）の一方の面に積層された薄層（１１０）上に、中央に１ｍｍ×１ｍｍの大きさの貫通孔が設けられた厚さ０．１ｍｍのシリコーンシート（２００）を載置して、シリコーンシートの貫通孔の内部にＥＧＦＰ封入タンパク質結晶（株式会社プロテインクリスタル製）の水（Ｌ）分散液を滴下した後、シリコーンシートの貫通孔をカバーガラス（３００）で密封した。
Ｎｄ^３＋：ＹＶＯ_４レーザーの第三高調波（３５５ｎｍ、９．３５μＷ）（スペクトラ・フィジックス社（米国）製、商品名「J30-B9S-355QL」）を、倒立型顕微鏡のダイクロイックミラー（４２０）で反射させて、２０倍の対物レンズ（４１０）を通じて紫外線硬化性樹脂の任意の箇所に１秒間照射した。
カバーガラス（３００）を取り除いた後、カバーガラス（１００）表面をアセトンで洗浄して、未硬化の樹脂組成物や余剰の分散液を除去した。

カバーガラス（１００）の表面を顕微鏡で観察して透過像を撮影した。また、蛍光顕微鏡により蛍光像を撮影した。結果を図８に示す。
図８に示すように、ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶を基板上に一個ずつ固定化できることが確認された。薄層（１１０）の紫外線レーザー照射部位は、ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶を保持した状態で硬化したことが確認された。薄層（１１０）の硬化部位の直径は約３０μｍであった。
また、蛍光像によって、ＥＧＦＰの蛍光発光が確認されたことから、ＥＧＦＰ封入タンパク質結晶はＥＧＦＰの活性が維持された状態のまま、カバーガラス（１００）上に固定されたことが確認された。

（試験例４：Ｃｄｋ５封入タンパク質結晶の基板への固定）
試験例４では、試験例２と同様の試験装置を使用した。
即ち、表面に、紫外線硬化性樹脂組成物（協立化学産業株式会社製、商品名：「ワールドロックNo.8130H2」）をスピンコーター（ミカサ株式会社製、スピンコーター１H-D7）により回転塗布して紫外線硬化性樹脂からなる薄層（１１０）を積層した３２ｍｍ×２４ｍｍのカバーガラス（１００）を、倒立型顕微鏡（オリンパス社製、商品名「IX81」）の自動ステージ（Ｓ）に載置した。カバーガラス（１００）の一方の面に積層された薄層（１１０）上に、中央に１ｍｍ×１ｍｍの大きさの貫通孔が設けられた厚さ０．１ｍｍのシリコーンシート（２０）を載置して、シリコーンシート（２００）の貫通孔にCyclin-dependent kinase 5（Ｃｄｋ５）封入タンパク質結晶（株式会社プロテインクリスタル製）の水（Ｌ）分散液を滴下した後、シリコーンシート（２００）の貫通孔をカバーガラス（３００）で密封した。
Ｎｄ^３＋：ＹＶＯ_４レーザーの第三高調波（３５５ｎｍ、９．３５μＷ）（スペクトラ・フィジックス社（米国）製、商品名「J30-B9S-355QL」）を、倒立型顕微鏡のダイクロイックミラー（４２０）で反射させて、２０倍の対物レンズ（４１０）を通じて紫外線硬化性樹脂の任意の箇所に１秒間照射した。
カバーガラス（３００）を取り除いた後、カバーガラス（１００）表面をアセトンで洗浄して、未硬化の樹脂組成物や余剰の分散液を除去した。
尚、Ｃｄｋ５封入タンパク質結晶は、「京都工芸繊維大学博士論文、池田敬子、２００１」や「K.Ikeda, A.S.Nagaoka, S.Winkler, K.Kotani, H.Yagi, K.Nakanishi, S.Miyajima, J.Kobayashi, and H.Mori, J.Virology, 75(2001), 988」に記載されている方法に準ずる方法で調製したものを使用した。

カバーガラス（１００）の表面を顕微鏡で観察して透過像を撮影した。また蛍光顕微鏡により、蛍光標識抗原抗体反応による蛍光像を撮影した。結果を図９に示す。
図９に示すように、Ｃｄｋ５封入タンパク質結晶をカバーガラス（１００）上に一個ずつ固定化できることが確認された。薄層（１１０）の紫外線レーザー照射部位は、Ｃｄｋ５封入タンパク質結晶を保持した状態で硬化したことが確認された。薄層（１１０）の硬化部位の直径は約３０μｍであった。
また、蛍光標識抗原抗体反応によって蛍光発光が確認されたことから、Ｃｄｋ５封入タンパク質結晶はＣｄｋ５の活性が維持された状態のまま、カバーガラス（１００）に固定されたことが確認された。

本発明に係る生体分子含有粒子固定化担体は、生体分子を含む粒子が、その活性が保持された状態で基板上に強固に固定化されており、ＤＮＡチップやプロテインチップなどとして好適に利用することができる。
本発明に係る生体分子含有粒子の固定化方法は、生体分子の活性を保持した状態で、生体分子を含む粒子を基板上に強固に固定化することができるので、ＤＮＡチップやプロテインチップの製造方法として好適に利用することが可能である。

第一実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法の概略工程を示した図である。（Ａ）は生体分子含有粒子が分散された分散液を基板上に滴下する工程を、（Ｂ）は光硬化性樹脂組成物が積層された基板に紫外線を照射する工程を、（Ｃ）は（Ｂ）工程により光硬化性樹脂組成物が硬化した状態を、（Ｄ）は基板上の未硬化樹脂組成部や余剰の分散液を除去した状態を、それぞれ示す。（Ａ）及び（Ｂ）は本発明で用いられる基板の一例を示す斜視図である。第二実施形態に係る生体分子含有粒子の固定化方法の概略工程を示した図である。（Ａ）は生体分子含有粒子が分散された分散液を基板上に滴下する工程を、（Ｂ）はレーザーマニピュレーション法によって、生体分子含有粒子を移動、配列する工程を、（Ｃ）は（Ｂ）工程により、生体分子含有粒子を配列した状態を、（Ｄ）は光硬化性樹脂組成物が積層された基板に紫外線を照射する工程を、（Ｅ）は（Ｄ）工程により光硬化性樹脂組成物が硬化した状態を、（Ｆ）は基板上の未硬化樹脂組成部や余剰の分散液を除去した状態を、それぞれ示す。試験例１で使用した実験装置の概略を示す図である。試験例１の結果を示す光学顕微鏡写真である。各光学顕微鏡写真の横方向の実際の長さは約０．５ｍｍである。試験例２〜４で使用した実験装置の概略を示す部分断面図である。試験例２の結果を示す光学顕微鏡写真である。各光学顕微鏡写真の横方法の実際の長さは、約１００μｍである。試験例３の結果を示す光学顕微鏡写真である。各光学顕微鏡写真の横方法の実際の長さは、約１ｍｍである。試験例４の結果を示す光学顕微鏡写真である。各光学顕微鏡写真の横方法の実際の長さは、約０．５ｍｍである。従来の生体分子含有粒子の固定化方法の概略工程を示した図である。（Ａ）は光重合剤が溶解されたエチレングリコール中の粒子に紫外線を照射する工程を、（Ｂ）は（Ａ）工程により基板上に固定化された粒子の状態を、それぞれ示す。

符号の説明

１０基板
１００カバーガラス
１１薄層
１１０薄層
１２硬化した薄層
１３凹部
２０薄膜
２００シリコーンシート
２１貫通孔
３０ガラス板
３００カバーガラス
４０ボンディングレーザー
４０１ＵＶライト
４０２ＵＶパルスレーザー
４１集光レンズ
４１０対物レンズ
４２０ダイクロイックミラー
５０トラッピングレーザー
５１集光レンズ
Ａ微粒子
Ｂ光重合剤を含有するエチレングリコール
Ｃ基板
Ｄアクリルアミド
Ｌ分散媒
Ｍ生体分子含有粒子
Ｎ蛍光ビーズ
Ｐマイクロピペット
Ｓステージ

Claims

基板と該基板の表面上に固定された生体分子を含む粒子とからなり、該粒子は光硬化された光硬化性樹脂によって該光硬化性樹脂に埋没せずに生体分子の活性を維持した状態で該基板上に固定されており、前記光硬化性樹脂は、前記粒子が分散される分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しないことを特徴とする生体分子含有粒子固定化担体。
前記光硬化性樹脂が水非溶解性の光硬化性樹脂であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子含有粒子固定化担体。
前記粒子は、生体分子により構成される分子性結晶、生体分子を担持した金粒子若しくは高分子粒子、細胞、生体分子を含むミセル、ベシクルからなる群から選択される一種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体分子含有粒子固定化担体。
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖からなる群から選択される一種以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の生体分子含有粒子固定化担体。
生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下した後に、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を照射して薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法。
生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下した後に、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を、薄層の生体分子を含む粒子が接する部分或いはその近傍に集光させて薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法。
生体分子を含む粒子が分散媒に分散された分散液を、表面に前記分散媒に不溶であり且つ前記分散媒と接触しても分解しない光硬化性樹脂組成物からなる薄層が積層された基板上に滴下し、基板及び薄層並びに生体分子を含む粒子に吸収されない波長を有するレーザー光を分散液中に分散された生体分子を含む粒子に照射して生体分子を含む粒子を捕捉し、次いで、該薄層を硬化させることができる波長を有する光を、薄層の生体分子を含む粒子が接する部分或いはその近傍に集光させて薄層を硬化させて生体分子を含む粒子を基板上に固定することを特徴とする生体分子含有粒子の固定化方法。