WO2004087911A1 - １個の抗原特異的ｂリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

１個の抗原特異的ｂリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法 Download PDF

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WO2004087911A1
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antigen
specific
lymphocytes
lymphocyte
cells
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Atsushi Muraguchi
Hiroyuki Kishi
Kihachiro Tohbo
Minoru Ueno
Hiroyoshi Nakazato
Eiichi Tamiya
Masayasu Suzuki
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Toyama New Industry Organization
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an antigen-specific antibody-producing hybridoma using one antigen-specific B lymphocyte and a method for producing a monoclonal antibody.
  • antigen-specific antibody-producing hybridomas have been produced to produce monoclonal antibodies.
  • a hybridoma is produced, and then a hybridoma clone producing an antigen-specific antibody is screened.
  • production of hybridomas is not very efficient. That is, not all B lymphocytes become hybridomas, but some B lymphocytes that have undergone cell fusion with myeloma become hybridomas.
  • hybridomas are prepared using spleen cells stimulated with an antigen, not only hybridomas that produce antigen-specific antibodies are produced, but most of the hybridomas that are produced produce antibodies that are irrelevant. Or does not produce the antibody itself.
  • hybridomas proliferate while dropping chromosomes, hybridomas that have produced antibodies may not be able to produce antibodies due to loss of antibody chromosomes.
  • the growth of such cells is usually faster than the antibody-producing hybridomas, and if left alone, most of the cells in culture will be cells that do not produce antibodies. Therefore, the hybridomas that you want As soon as a well is found, the cells of the well are spread on a 96-well plate so that one cell becomes one well (limited dilution method), and the desired antibody-producing hybridoma is again screened.
  • One Jung (secondary screening) c After detecting the desired hybridoma, it is necessary to complete the process up to the second screening promptly and before the cell condition deteriorates.
  • the probability of obtaining an antigen-specific antibody-producing B lymphocyte cell line is very low because of the low frequency of lymphocyte cell lines that can be established. It takes about one month to establish a cell line. In addition, established B lymphocyte cell lines produce low amounts of antibodies.
  • hybridomas can be produced, but in the case of humans, an efficient hybridoma system has not been created. In the case of mice, hybridomas can be produced. Conventionally, hybridomas have been produced by immunizing a mouse with an antigen and removing spleen or lymph nodes from the mouse.
  • lymphocytes were prepared, prepared by the approximately 10 8 lymphocytes and about 10 7 myeloma mouth Ichima cells using polyethylene da recall, or voltage is more fused to the application of, the HAT like It is screened using ELISA, flow cytometry, etc. to determine whether the hybridomas that have been grown and grown on the selection medium produce antigen-specific antibodies, and select antigen-specific antibody-producing hybridomas (lymphocytes).
  • Functional Search Method (Revised 5th Edition) 'Edited by Junichi Yada and Michio Fujiwara, edited by Chugai Medical Co., Ltd., 1994. Laboratory Manual by Ea Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, ppl39-pp244, 1988).
  • the present invention provides a method for simply selecting lymphocytes that specifically react with a specific antigen, not only antigen-specific lymphocytes with relatively high frequency, but also antigen-specific lymphocytes with low frequency,
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an antigen-specific antibody-producing hybridoma from the selected antigen-specific B lymphocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody from the prepared antigen-specific antibody-producing hybridoma.
  • the present invention provides a method for selecting one B lymphocyte that specifically reacts with an antigen (hereinafter, referred to as an antigen-specific B lymphocyte), culturing the selected antigen-specific B lymphocyte, and growing the antigen by culture.
  • the present invention relates to a method for producing an antigen-specific antibody-producing hybridoma, comprising producing a hybridoma by fusing specific B lymphocytes with myeloma cells.
  • the culture of the selected antigen-specific B lymphocytes is performed in the co-presence of an interleukin containing an anti-CD40 antibody or a CD40 ligand (CD40-L) and interleukin 4 (IL-4). thing,
  • the culturing of the selected antigen-specific B lymphocytes is performed in the co-presence of a mitogen (for example, LPS or the like) capable of proliferating B lymphocytes, or • the selected antigen-specific B lymphocytes Culture in the presence of anti-CD40 antibodies or interleukins and mitogens containing CD40L and IL-4 (eg, LPS);
  • a mitogen for example, LPS or the like
  • Selection of the one antigen-specific lymphocyte is performed using a flow cytometer or a microwell array chip,
  • the selection of one antigen-specific lymphocyte is performed by adding an antigen to each microwell of an antigen-specific lymphocyte detection microwell array chip having a plurality of microwells containing one subject lymphocyte, Detecting the lymphocytes that have reacted with, and removing the detected antigen-specific lymphocytes from the microwell; and
  • Antigen-specific lymphocytes can be less than 0.1% in frequency.
  • the present invention further relates to a method for producing a monoclonal antibody using the hybridoma produced by the method of the present invention.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a method of measuring a change in the concentration of intracellular Ca ions by using a Ca ion-dependent fluorescent dye.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the process from dispensing cells to a microwell array chip, stimulating antigen, and removing the cells in a method using a fluorescent dye.
  • Fig. 3 shows the results of measuring the antibodies against OVA in the serum of mice immunized with OVA by ELISA.
  • Figure 4 shows the results of ELISA measurement of antibodies in the culture supernatant of hybridomas producing OVA-specific antibodies established by the method.
  • B lymphocytes that specifically reacted with an antigen are detected, and a hybridoma is produced from the B lymphocytes.
  • spleen cells prepared from immunized mice are directly fused with myeloma cells without any treatment, to produce hybridomas and to produce antigen-specific antibodies. The investigation began after the Hypri-doma bred.
  • B-lymphocytes producing antigen-specific antibodies are first detected and collected, and the collected antigen-specific B-lymphocytes are used. Make a pre-doma.
  • Selection of one antigen-specific lymphocyte can be performed using, for example, a flow cytometer or a microwell array chip.
  • Selection of one antigen-specific lymphocyte using a flow cytometer can be performed by a conventional method.
  • an antigen is added to each microwell of an antigen-specific lymphocyte detection microwell array chip having a plurality of microwells containing one specimen lymphocyte, Next, one antigen-specific lymphocyte can be obtained by detecting the lymphocyte that has reacted with the antigen and removing the detected antigen-specific lymphocyte from the microwell. This method will be described more specifically.
  • a microwell array chip having a plurality of microwells and each microwell containing one lymphocyte to be tested can be used.
  • the inclusion of one test lymphocyte in each microwell allows antigen-specific lymphocytes to be identified at the cellular level.
  • the test lymphocyte that reacts with the antigen can be identified as a single cell.
  • Antigen-specific lymphocytes can be detected as a single cell. Then, one of the detected antigen-specific lymphocytes is removed and used for the production of hybridomas. Used ⁇ However, the same microwell may contain cells other than lymphocytes together with the subject lymphocytes.
  • the shape and dimensions of the microwell are not particularly limited, but the shape of the microwell can be, for example, a cylindrical shape, and in addition to the cylindrical shape, a rectangular parallelepiped, an inverted conical shape, or the like.
  • the dimensions of the cylindrical microwell may be, for example, 5 to 100 ⁇ ⁇ in diameter, preferably 5 to 15 m, and 5 to 100 / ⁇ in depth, preferably 5 to 30 ⁇ m. it can.
  • the number of microwells present in a single microwell array chip from the viewpoint of particularly but limit not the case the frequency of antigen-specific lymphocytes often from 1 to 10 5 is about 500, 1 cm 2 per, for example, it is 2,000 to 100,000 pieces ranging der Rukoto.
  • the test well lymphocytes are stored in the microwell together with the culture solution. Examples of the culture solution include the following.
  • the subject lymphocytes can be of blood origin, for example, B lymphocytes or T lymphocytes. Other examples include lymphocytes derived from lymphoid tissues such as tonsils (lymph nodes) and spleen, and lymphocytes infiltrating a diseased site such as cancer-infiltrating lymphocytes.
  • the method for detecting antigen-specific lymphocytes includes adding an antigen to each microwell of the microphone array array chip, stimulating cells, and detecting cells that react with the antigen.
  • the addition of the antigen to each microwell can be performed as follows. 1. Add the antigen solution using a pipe to cover the entire surface of the microwell array chip.
  • the antigen detected by this method is not particularly limited, but may be, for example, a protein, peptide, DNA, RNA, lipid, or sugar chain.
  • the antigen can be a bacterium, virus, autoantigen, cancer antigen or allergen, or the like.
  • lymphocytes are suspended in a culture solution, dispensed into a well, and then At temperature or 37 ° C, it can be performed by culturing in air or C0 2 incubator. Detection of cells that react with the antigen can be performed as follows.
  • an antigen binds to an antigen receptor (immunoglobulin) on a B lymphocyte
  • intracellular signaling occurs first, followed by cell proliferation and antibody production. Therefore, cells that react with the antigen can be detected by detecting intracellular signal transduction, cell proliferation, and antibody production by various methods.
  • the detection of cells that respond to the antigen by detecting intracellular signal transduction can be performed, for example, by using a Ca ion-dependent fluorescent dye to change the concentration of intracellular Ca ions. +
  • a Ca ion-dependent fluorescent dye Fura-2, Fluo-3 or Fluo-4 is introduced into B lymphocytes. Then, when B lymphocytes are stimulated with the antigen, the intracellular Ca ion concentration increases. As a result, Ca ions bind to the ion-dependent fluorescent dye, and the fluorescence intensity is enhanced. It is shown in blue when the Ca ion concentration is low and reddish when it is high.
  • B lymphocytes (antigen-specific) whose intracellular Ca ions have been increased by stimulation with an antigen can be detected using a microarray chip.
  • Detection of cells that respond to the antigen by detecting cell proliferation can also be performed, for example, by counting the number of cells using a live cell-specific fluorescent dye.
  • This method is specifically 'when cultured 37 ° C, 3 days at antigen stimulate B lymphocytes to C0 2 incubator in data, cells are grown. After the cells have proliferated, Fluorescein diacetate (FDA) is present in the culture broth. ) Heat the solution. These reagents penetrate the membranes of living cells and are degraded by esterases in the cells, producing membrane-impermeable fluorescent dyes.
  • FDA Fluorescein diacetate
  • the number of living cells is measured by measuring the sum of the fluorescence intensities emitted by the living cells in the well using a fluorescence microscope or a microarray scanner.
  • By measuring antibody production cells that react with the antigen can also be detected.
  • Antibody production can be detected by measuring the antibody immunochemically. 'More specifically, when cultured 37 ° C, 1 week at stimulating B lymphocyte antigen C0 2 incubator ⁇ , antibody is secreted into the culture medium. Antigen-specific antibodies secreted into the culture solution are detected by ELISA (enzyme-labeled immunosorbent assay).
  • signal transduction, cell proliferation, and antibody production can be detected by using mitogen, lectin, antibody, cytokin, PMA, and Ca ionophore.
  • mitogen, lectin, antibody, cytokin, PMA, and Ca ionophore The following describes details of microwell array chips in a method using a fluorescent dye. The process from dispensing the vesicles, stimulating the antigen, and removing the vesicles will be described with reference to FIG.
  • the cells to be placed in the pellet can be obtained by separating the lymphocyte fraction from the spleen and lymph nodes of the mouse immunized with the antigen, and then separating and purifying the B lymphocyte fraction.
  • the cells are suspended in a ⁇ 1 ⁇ 3 / ⁇ (2 ⁇ ) solution, kept at room temperature for 30 minutes, and the cells are washed with a buffer solution to remove the dye not loaded into the cells.
  • the cells are then dispensed into microwells.
  • the fluorescence of unstimulated cells is measured.
  • the fluorescence intensity ( ⁇ ) at that time is measured.
  • the antigen solution is poured into the gap between the slide glass and the cover glass, exchanged with the buffer, and the fluorescence of the cells stimulated by the antigen is measured. Measure the fluorescence intensity ( ⁇ ) 1-2 minutes after stimulation. Select cells with a high fluorescence intensity ratio ( ⁇ / ⁇ ) before and after stimulation.
  • one selected antigen-specific B lymphocyte is cultured, and the antigen-specific B lymphocyte proliferated by the culture is fused with myeloma cells to produce a hybridoma. It is practically difficult to produce a hybridoma using only one B lymphocyte. Therefore, first, one antigen-specific B lymphocyte is cultured and expanded.
  • the culture of antigen-specific B lymphocytes can be performed, for example, in the presence of an anti-CD40 antibody or an interleukin including CD40 ligand (CD40L) and interleukin 4 (IL-4). In this way, antigen-specific B lymphocytes proliferate upon stimulation with CD40 and IL-4.
  • hybridomas can be produced using B lymphocytes stimulated with mitogens such as LPS (for example, (1) Van Snick JL, Coulie P, Monoclonal anti-IgG autoantibodies derived from lipopolysacchari de-activated spleen cells of 129 / Sv mice.Journal of Experimental Medicine, 155: 219-230, 1982. (2) Lange M, Le Guern C, Cazenave PA, Covalent coupling of antigens to chemically activated lipopolisaccharide: a tool for in vivo and in vitro specific B cell stimulation. See Journal of Immunological Methods, 63: 123-131, 1983. ). There is no example in which one antigen-specific B lymphocyte was proliferated and used to produce a hybridoma. The culture of the antigen-specific B 'lymphocytes can be specifically performed as follows.
  • the well also contains a cell culture medium (10 ° /. RPMI1640 medium with FCS) containing 200 L of interleukin-4 (IL-4).
  • IL-4 interleukin-4
  • CD40 and IL-4 signals instead of using a soluble anti-CM0 antibody or CD40L, introduce the CD40L and IL-4 genes and attach CD40L and IL-4.
  • Cells can be pre-incubated in a 96-well plate, and then recovered antigen-specific B lymphocytes can be cultured It is.
  • lymphocytes prepared from a mouse immunized with an antigen are added to a microarray array chip, and antigen-specific B lymphocytes are first identified by applying antigen stimulation.
  • the one antigen-specific B lymphocyte identified is proliferated and used to produce a hybridoma.
  • the antigen-specific B lymphocyte detection method using a microwell array chip can detect infrequently antigen-specific B lymphocytes, producing hybridomas that produce antibodies to antigens, which has been difficult until now. It is possible to do.
  • the conventional method for producing hybridomas required labor and time, but the use of microwell array chips enables the detection of antigen-specific B lymphocytes in a short time, saving labor and time. become. ' Example
  • Microarray array chip See Fig. 2
  • the microwell array chip is manufactured using poly (dimethylsiloxane) (PDMS) or silicon, and a microwell having a diameter of 10 m and a depth of 20 ⁇ is placed vertically and horizontally on a 2 cm x 2 cm chip. They are arranged at im intervals (the distance from the center of the microphone opening to the center is 40 ⁇ ). A sticker with a thickness of 1 mm and a width of about lmm and a length of 2 cm is attached to both sides of the chip.
  • PDMS poly (dimethylsiloxane)
  • silicon silicon
  • a microwell having a diameter of 10 m and a depth of 20 ⁇ is placed vertically and horizontally on a 2 cm x 2 cm chip. They are arranged at im intervals (the distance from the center of the microphone opening to the center is 40 ⁇ ).
  • a sticker with a thickness of 1 mm and a width of about lmm and a length of 2 cm is attached to both sides of the chip.
  • This device basically uses a microarray scanner (CRBIO IIe) of Hitachi Software Engineering (Yokohama Corporation), with the following changes.
  • One of the installed lasers (Cy3, 532 nm; Cy5, 635 nm) is replaced with a 47'3 nm laser (Cy5, 635 nm).
  • Detection of activated B lymphocytes using a microwell array chip (see Fig. 2) Add the above cell suspension to the above microwell array chip and let stand for 5 minutes You. Wash out the cells that have not entered the microwell using RPMI1640 / 10% FCS solution. The diameter of the lymphocyte is about lO / im, and the diameter of the microwell used is 10, so one microphone cell contains one lymphocyte. Place the cover glass over the seal and apply RPMI1640 / 10 ° / between the tip and the force glass. Fill FCS solution. Insert the microwell array chip into a microarray scanner, scan at 2.5 ⁇ resolution, and save the data (fluorescence data before antigen stimulation: ⁇ ).
  • the cells are sorted under a microscope by using a glass capillary with a micromanipulator.
  • HAT selection medium RPMI1640, 1 10 one 4 M hypoxanthine, 4 10- 7 M aminopterin, 1. 6 10- 5 M thymidine
  • Hybridoma production method (alternative method)
  • BALB / c mice were injected subcutaneously with ovalbumin (0VA) 10 s mixed with Complete Freund Adjuvant. Two weeks later, a mixture of 10 g of 0VA in Incomplete Freund Adjuvant was injected subcutaneously into the same mouse. Two weeks later, a mixture of 10 ⁇ g of 0VA in Incomplete Freund Adjuvant was subcutaneously into the same mouse. Injected. Thereafter, mouse sera was collected, and the production of antibodies against OVA was checked by ELISA in the following manner. The detection of anti-VAA antibody in serum was performed as follows.
  • a 96-well plate was coated with OVA protein and blocking was performed to prevent non-specific binding.
  • Diluted serum obtained from the mouse immunized in each well was added, reacted at room temperature for 2 hours, washed, added with anti-mouse immunoglobulin labeled with alkaline phosphatase, and further added at room temperature for 2 hours. It was allowed to react. After washing, an alkaline phosphatase substrate was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes. Then, the absorbance at 414 nm was measured. The results are shown in Figure 3. Loading cells with fluorescent dye
  • Microwell array chip (silicon, tube diameter 10 ⁇ , tube depth Splenocytes (10 5 / ⁇ ) loaded with a fluorescent dye were added to about 15 ⁇ , perm pitch 20 m, about 240,000 ⁇ l) to remove extra cells that did not enter the gel. After covering the chip with force glass, it enters Hitachi Software Engineering Co., Ltd. CRBI0 Ile-FITC, and emits Fluo-4 fluorescence at 473 nm excitation wavelength and 535 nm emission wavelength, then 535 nm excitation wavelength at 585 pm CellTracker Orange fluorescence was scanned at the fluorescence wavelength.
  • the chip was taken out of the scanner, buffer B contained between the chip and the force pad was removed, and OVA (100 ⁇ g / mL) dissolved in buffer B was added thereto.
  • the chip was inserted into the scanner, and one minute after the addition of the OVA, scanning was performed at a resolution of 2.5 ⁇ .
  • the ratio of the fluorescence of Fluo-4 before and after stimulation was calculated, and the address of the cells where the ratio of fluorescence increased by 5 to 10 times was identified.
  • the chip was set on a fluorescence microscope, and the OVA-specific B lymphocytes identified using a scanner above were collected using a micromanipulator while observing under a microscope. Collected B lymphocytes [50,000 irradiated (50 Gy) EL4 cells, 500 U / mL human]: L-2, 5 ng / mL PMA, and culture of human T cells stimulated with PWM Kiyoshi (5% v / v)] to including 10% FCS 1 week cultured in RPMI1640 medium containing (200 / L / wel l) (37.
  • B lymphocytes The proliferation of B lymphocytes was observed with an optical microscope, and the cells were collected from the wells in which the cells were growing and transferred to an eppendorf tube. Approximately 200 mouse myeloma cells (X63.Ag8.6653) were added thereto and centrifuged at -2000 rpm for 2 minutes. The supernatant was carefully removed without disturbing the cell sediment, and 1 mL of RPMI 1640 medium (without FCS) was added. The cells were suspended and centrifuged at 2,000 rpm for 2 minutes. The supernatant was carefully removed so as not to loosen the cell sediment, and further centrifuged at 2,000 rpm for 10 seconds to carefully remove the supernatant completely so as not to loosen the cell sediment.
  • a 96-well plate was coated with OVA protein, and blocking was performed to prevent nonspecific binding.
  • a dilution of the hybridoma culture supernatant was added to each well (PBS).
  • PBS PBS
  • 2 ⁇ g / mL OVA or ⁇ -globulin was added to another well at the same time as the addition of the hybridoma culture medium. After reacting at room temperature for 2 hours, washing was performed, alkaline phosphatase-labeled anti-mouse immunoglobulin was added, and the reaction was further performed at room temperature for 2 hours. After washing, an alkaline phosphatase substrate was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes, and then the absorbance at 414 nm was measured.
  • Fig. 4 shows the results.
  • antigen-specific antibody-producing B lymphocytes are selected, collected, and used to produce a hybridoma, thereby producing an antigen-specific antibody in comparison with a conventional hybridoma production method.
  • the labor of screening for hybridomas is greatly reduced, and the efficiency of hybridoma production is greatly improved. Specifically, it is as follows.
  • hybridomas proliferate, hybridomas that do not produce antigen-specific antibodies also proliferate, but since antigen-specific antibody-producing B lymphocytes are initially selected and enriched, The frequency of such negative cells is reduced.

Abstract

１個の抗原特異的Bリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法を提供する。抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法は、ある抗原に特異的に反応するBリンパ球（抗原特異的Bリンパ球）を１個選択し、選択した抗原特異的Bリンパ球を培養し、培養により増殖した抗原特異的Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製することを含む。この方法により作製されたハイブリドーマを用いて、モノクローナル抗体を製造する。

Description

明細書
1個の抗原特異的 Bリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマの 作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法 技術分野
本発明は、 1個の抗原特異的 Bリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイプ リ ドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法に関する。 背景技術
従来から、 モノクローナル抗体を製造するために、 抗原特異的抗体産生ハイ プリ ドーマが作製されている。 従来のハイブリ ドーマの作製方法では、 ハイブ リ ドーマを作製した後に抗原特異的抗体を産生するハイプリ ドーマクローンを スクリーニングする。 しかし、 ハイプリ ドーマの作製はあまり効率の良いもの ではない。すなわち、全ての Bリンパ球がハイプリ ドーマになるわけではなく、 ミエローマと細胞融合を起こした Bリンパ球の一部がハイブリ ドーマになるか らである。ま.た、抗原で刺激した脾細胞を用いてハイプリ ドーマを作製しても、 抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマだけができるわけではなく、 できてくるハ イブリ ドーマのほとんどは関係ない抗体を産生しているか、 抗体自身を産生し ていない。 例えば、 従来の方法で目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマを見つけよ うとする場合、 免疫したマウスから取ってきた脾細胞を使ってミエローマとの 細胞融合を行い、 9 6ゥエルプレート 10枚くらいに蒔く。全部の細胞を使うと もっと蒔けるが、 1人でスクリーニングを行う場合は時間的制限があり、 残り はフリーズなどして保存する。 この方法により、 通常 500個くらいのゥエルの ハイブリ ドーマが増殖する。 ところが、 500個のゥエルからハイプリ ドーマが全て同じようなスピードで 増殖してくるわけではなく、 早く増殖するものもあればゆつくり増殖するもの もある。 従って、 500 個全部の増殖を同時にチヱックできない。 まず、 顕微鏡 下でどのゥエルから細胞が増殖してきており、 抗体をチェックするのに適した 細胞数まで増殖しているかをチェックする。 その上で、 適当なゥエルから細胞 上清を採取し、 抗原特異的抗体を産生しているかをチヱックする。 この細胞の チェックと細胞上清のチェックは素早く行う必要がある。 というのは、 ハイブ リ ドーマはどんどん増殖するので、 放っておくと増殖しすぎて培地の栄養状態 が悪くなり死滅するからである。 従って、 欲しいハイプリ ドーマが死んでしま わないうちにスクリ一二ングし終わらなければならない。 また、 目的のハイプリ ドーマが増殖しているゥエルが見つかった場合、 その ゥエルには通常、 目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマのほかに別の抗体 を産生しているハイプリ ドーマが増殖していることがしばしばある。 また、 ハ イブリ ドーマ自体染色体を落としながら増殖するので、 抗体を産生していたハ イブリ ドーマが抗体の染色体を喪失してしまうことにより抗体を作らなくなる 場合もある。 このような細胞の増殖は通常、 抗体を産生しているハイプリ ドー マよりも速いことが多く、 放っておくと培養している細胞のほとんどが抗体を 産生していない細胞になってしまう。 従って、 欲しいハイブリ ドーマが増殖し ているゥエルが見つかるとすぐにそのゥエルの細胞を 9 6ゥエルプレートに 1 個の細胞が 1個のゥエルになるようにまき直して （限界希釈法） 、 もう一度、 ほしい抗体産生ハイプリ ドーマをスクリ一ユングし直す（二次スクリ一ユング） c 目的のハイプリ ドーマを検出後、 二次スクリーニングまでを速やかに、 細胞の 状態が悪くならないうちに終えてしまう必要がある。 上記のように、 全ての作製したハイプリ ドーマをスクリーニングせずに、 一 部だけを使ってスクリ一ユングすることになることがあるので、 頻度の低い抗 原特異的抗体産生ハイプリ ドーマを得ることはむずかしくなる。 より具体的には、人の抗原特異的抗体の場合、末梢 Bリンパ球を EBウィルス で形質転換させ株化して抗原特異的抗体を産生している細胞をスクリ一二ング する方法がある （リンパ球機能検索法. (改訂 5版） 矢田純一、藤原道夫編著、 中外医学社、 1994年、 「ヒ トモノクローナル抗体作製への EBウィルストランス フォーム B細胞の利用」水野文雄、大里外誉郞、 pp381_391)。 この方法の場合、 樹立できるリンパ球細胞株の頻度が低いことから、 抗原特異的抗体産生 Bリン パ球細胞株を得られる確率は非常に低い。 また、 細胞株の樹立に 1ヶ月程度か かり時間がかかる。 さらに、 樹立ざれた Bリンパ球細胞株が産生する抗体量は 少ない。 マウスの場合はハイプリ ドーマを作製することができるが、 人の場合 は効率のよいハイプリ ドーマの系は作成されていない。 マウスの場合、 ハイブリ ドーマを作製することができる。 従来、 ハイブリ ドー マの作製は、 マウスを抗原で免疫し、 そのマウスから脾臓あるいはリンパ節を 取りだし、 リンパ球を調製し、 調製した約 108個のリンパ球と約 107個のミエ口 一マ細胞とをポリエチレンダリコールを用いて、 ないしは電圧をかけることに より融合させ、 HAT等の選択培地で培養し、増殖してきたハイプリ ドーマが抗原 特異的抗体を産生しているかを ELISA、フローサイトメ トリー等を用いてスクリ 一ユングし、 抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマを選択する （リンパ球機能検 索法 （改訂 5版） ' 矢田純一、 藤原道夫編著、 中外医学社、 1994年、 「B細胞ハ イブリ ドーマによるモノクローナル抗体作製法」 成内秀夫、 pp574 - 576、 Monoclonal antibodies in Antibodies : A Laboratory Manual by Ea Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, ppl39-pp244, 1988)。 この方法を用いることにより、 300〜400ゥエルからハイ プリ ドーマが増殖するが、 その中で抗原特異的抗体を産生しているハイブリ ド 一マが増殖しているゥエルは数％である。この数は用いた抗原によって異なるが、 抗原特異的抗体産生 Bリンパ球の頻度が低い場合、 この方法でハイプリ ドーマ を作製すること.は困難である。 そこで本発明は、 頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球は勿論のこと、 頻度 の低い抗原特異的リンパ球であっても、 簡便に特定の抗原に特異的に反応する リンパ球を選択し、 この選択された抗原特異的 Bリンパ球から、 抗原特異的抗 体産生ハイプリ ドーマを作製する方法を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 作製された抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマからモノ ク口ーナル抗体を製造する方法を提供することも目的とする。 . 発明の開示 本発明は、 ある抗原に特異的に反応する Bリンパ球 （以下、 抗原特異的 B y ンパ球という） を 1個選択し、 選択した抗原特異的 B リンパ球を培養し、 培養 により増殖した抗原特異的 Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイプリ ド 一マを作製することを含む、 抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマの作製方法に 関する。 上記作製方法においては、 前記選択した抗原特異的 Bリンパ球の培養は、 抗 CD40抗体または CD40リガンド （CD40—L) 及びインターロイキン 4 (IL- 4) を含 むィンターロイキンの共存下で行うこと、
前記選択した抗原特異的 B リンパ球の培養は、 B リンパ球を増殖することが できるマイ ト一ゲン （例えば、 LPSなど） の共存下で行うこと、 または • 前記選択した抗原特異的 B リンパ球の培養は、 抗 CD40抗体または CD40Lお よび IL- 4を含むインターロイキンおょぴマイトーゲン （例えば、 LPSなど） の 共存下で行うこと、
前記 1個の抗原特異的リンパ球の選択はフローサイトメータ、 またはマイク ロウェルアレイチップを用いて行うこと、
前記 1個の抗原特異的リンパ球の選択は、 1個の被検体リンパ球が含まれる マイクロウヱルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイ チップの各マイクロウヱルに抗原を添加し、 次いで、 抗原に反応したリンパ球 を検出し、 検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すこと により行うこと、 並びに
抗原特異的リンパ球は、 頻度が 0 . 1 %以下であることができる。 さらに本発明は、 上記本発明の方法により作製されたハイプリ ドーマを用い て、 モノクローナル抗体を製造する方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 細胞内 Caイオンの濃度変化を Caイオン依存性の蛍光色素を用いる ことにより測定する方法の説明図である。
図 2は、 蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細 胞の分注、 抗原刺激、 取り出しまでについての説明図である。
図 3は OVAで免役したマウス血清中の OVAに対する抗体を ELISAにより測定 した結果である。
図 4は方法で樹立した OVA特異的抗体を産生するハイプリ ドーマの培養上清 中の抗体を ELISAにて測定した結果である。 発明を実施するための最良の形態
血液中のリンパ球は 1個 1個がそれぞれ別々の抗原に反応する。 そこで、 本 発明では、 例えば、 抗原に特異的に反応した Bリンパ球を検出し、 この Bリン パ球から、 ハイプリ ドーマを作製する。 従来のハイプリ ドーマの作製では、 免疫したマウスから調製してきた脾細胞 を何の処理もせず、直接ミエローマ細胞と融合して、ハイブリ ドーマを作製し、 抗原特異的な抗体を産生しているかは、 ハイプリ ドーマが增殖してから調べは じめた。 それに対して本発明の方法では、 抗原特異的な抗体を作っている Bリ ンパ球をまず検出、 採取し、 採取された抗原特異的 Bリンパ球を用いて、 ハイ プリ ドーマを作製する。
[抗原特異的リンパ球の選択]
1個の抗原特異的リンパ球の選択は、 例えば、 フローサイトメータ、 または マイクロウェルァレイチップを用いて行うことができる。
フローサイトメータを用いる 1個の抗原特異的リンパ球の選択は、 常法によ り行うことができる。
マイクロゥヱルアレイチップを用いた方法では、 例えば、 1個の被検体リン パ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイク ロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、 次いで、 抗原に反 応したリンパ球を検出し、 検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルか ら取り出すことにより、 1個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。 この 方法について、 より具体的に説明する。
(マイク口ウエノレアレイチップ)
マイクロウエノレアレイチップとしては、 複数のマイクロウェルを有し、 かつ 各マイクロウェルが被検体リンパ球を 1個含むことができるものを使用するこ とができる。 各マイクロウヱルが被検体リンパ球を 1個含むことで、 抗原特異 的リンパ球を細胞レベルで特定することが可能になる。 即ち、 このマイクロウ エルアレイチップを用いると、 マイクロウェルに含まれる被検体リンパ球が 1 個であることから、 抗原に反応する被検体リンパ球を 1個の細胞として特定で. き、結果として、抗原特異的リンパ球を 1個の細胞として検出できる。そして、 検出された 1個の抗原特異的リンパ球を取り出して、 ハイプリ ドーマの作製に 用いる < 但し、 同一のマイクロウェルには、 リンパ球以外の細胞が被検体リンパ球と ともに含まれていても良い。 リンパ球以外の細胞であれば、 抗原に反応せず、 検出されることもないからである。 マイクロウヱルの形状や寸法には特に制限はないが、 マイクロウェルの形状 は、 例えば、 円筒形であることができ、 円筒形以外に、 直方体、 逆円錐型等で あることもできる。 また、 円筒形のマイクロウェルの寸法は、 例えば、 直径 5 〜100 ^ πι、 好ましくは 5〜： 15 mであり、 深さ 5〜100 /ί πι、 好ましくは 5〜30 μ mであることができる。
1 つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、 特に制 限はないが、抗原特異的リンパ球の頻度が 105個に 1個から多い場合には約 500 個であるという観点から、 1cm2当たり、 例えば、 2，000〜100，000個の範囲であ ることができる。 マイクロウェルには、 被検体リンパ球が培養液とともに格納されている。 培 養液としては、 例えば、 以下のものを挙げることができる。
1. 137mM NaCl, 2. 7 mM KC1, 1. 8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, lmg/mlグルコース， lmg/ral BSA, 20mM HEPES (pH7. )
2. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 RPMI1640培地
3. lmg/ml BSA含有 RPMI1640培地
4. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 Dulbecco's MEM培地 5. lmg/ml BSA含有 Dulbecco's MEM培地 被検体リンパ球は血液由来であることができ、 例えば、 Bリンパ球または T リンパ球であることができる。 それ以外に扁桃腺（リンパ節）、 脾臓等のリンパ 組織由来リンパ球、 がん浸潤リンパ球などの病変部位浸潤リンパ球等を挙げる ことができる。
(抗原特異的リンパ球の検出方法） '
抗原特異的リンパ球の検出方法は、 上記マイク口ゥヱルアレイチップの各マ イクロウェルに抗原を添加し、 細胞を刺激し、 抗原に反応する細胞を検出する ことを含む。 各マイクロウェルへの抗原の添加は、 以下のように行うことができる。 1. ピぺットを用いてマイクロウェルアレイチップ全面を覆うように抗原液 を添加する。
2. 1ゥエルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。 この方法により検出される抗原には、 特に制限はないが、 例えば、 タンパク 質、 ペプチド、 DNA、 RNA、 脂質、 または糖鎖等であることができる。 また、 抗 原は、 細菌、 ウィルス、 自己抗原、 がん抗原またはアレルゲン等であることが できる。 細胞の培養は、 例えば、 リンパ球を培養液に懸濁させ、 ゥエルに分注後、 室 温あるいは 37°Cにて、 空気中あるいは C02インキュベータ内にて培養すること で行うことができる。 抗原に反応する細胞の検出は、 以下のように行うことができる。
例えば、 B リンパ球の抗原受容体 （免疫グロブリン） に抗原が結合するとま ず細胞内シグナル伝達が起こり、 それに続いて細胞増殖、 抗体産生が起こる。 従って、 細胞内シグナル伝達、 細胞増殖、 抗体産生を種々の方法により検知す ることにより、 抗原に反応する細胞を検出することができる。 細胞内シグナル伝達を検出することによる、 抗原に反応する細胞の検出は、 例えば、 細胞内 Caイオンの濃度変化を Caイオン依存性の蛍光色素を用いるこ とにより行うことができる。 +
細胞内 Caイオン濃度変化は、蛍光色素として Fura-2、Fluo - 3あるいは Fluo-4 を用い、 検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用い る。 具体的には、 図 1に示すように、 Bリンパ球に Caイオン依存性蛍光色素であ る Fura- 2、 Fluo- 3あるいは Fluo - 4を導入する。 次いで抗原で Bリンパ球を刺 激すると、 細胞内 Caイオン濃度が上昇する。 その結果、 Caイオンが イオン 依存性蛍光色素に結合し、 蛍光強度が増強される。 Caイオン濃度が低いと青つ ぽぃ色、 高いと赤っぽい色で示されている。 この方法では、 抗原で刺激される ことにより細胞内 Caイオンが上昇した Bリンパ球（抗原特異的） を、マイクロ ゥヱルアレイチップを用いて検出できる。 細胞増殖を検出することによる、 抗原に反応する細胞の検出は、 例えば、 細 胞数を、 生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによつても行うことがで きる。 この方法は、 具体的には、' 抗原で B リンパ球を刺激し C02インキュベー タ内にて 37°C、 3 日間培養すると、 細胞が増殖する。 細胞が増殖後、 培養液中 にフルォレツセイン ·ジアセテート（Fluorescein diacetate (FDA) )あるレ、は力 ルポキシ · フルォレツセィン · ジァセテート .スクシンィミジノレ ·エステノレ (Carboxy-f luorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE) )溶液をカロ る。 これらの試薬は生細胞の膜を透過し、細胞内でエステラーゼによって分解され、 膜不透過性の蛍光色素を生成する。 この蛍光色素の発光は細胞数に比例するた めゥエル内の生細胞が発光する蛍光強度の和を蛍光顕微鏡あるいはマイクロア レイスキャナーを用いて計測することにより生細胞数を測定する。 抗体産生を計測することによつても、 抗原に反応する細胞の検出を行うこと ができる。 抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することにより検出できる。' 具体的には、 抗原で B リンパ球を刺激し C02インキュベータ內にて 37°C、 1 週間培養すると、 抗体が培養液中に分泌される。 培養液中に分泌された抗原特 異的抗体を ELISA法（酵素標識免疫吸着法）により検出する。
尚、 この検出方法では、 マイ トゲン、 レクチン、 抗体、 サイト力イン、 PMA、 Caィオノフォアを用いても、 シグナル伝達、 細胞増殖、 抗体産生を検出するこ とができる。 以下に、 蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細 胞の分注、 抗原刺激、 取り出しまでについて図 2に基づいて説明する。
( 1 ) 細胞の分注
ゥヱル 1つずつに細胞を入れる。
ゥヱルに入れる細胞は、 抗原により免疫したマウスの脾臓、 リンパ節からリ ンパ球画分を分離後、 Bリンパ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、 Ρ1ιιο3/ΑΜ (2 μ Μ)溶液に細胞を懸濁させ、室温に 30分置き、 さらに緩衝 液で細胞を洗浄し、 細胞内に負荷されなかった色素を除去する。
その後この細胞をマイクロウェルに分注する。
チップの両側にプラスチックシールを貼り、 その上にカバーグラスを^せ、 緩衝液を満たすことで、 乾燥を防ぐ。
( 2 ) 蛍光測定
まず、 未刺激の細胞の蛍光を測定する。 その際の蛍光強度（Α)を測定する。 次レヽで抗原溶液をスライドグラスとカバーグラスの隙間に流し入れ緩衝液と 交換し、 抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。 刺激後 1〜 2分後の 蛍光強度（Β)を測定する。 刺激前後の蛍光強度比（Β/Α)の高いゥエルの細胞を選 別する。
( 3 ) 抗原刺激に反応した細胞の取り出し
スライドグラスと力パーグラスの隙間に空気を入れると、 カバーグラスは容 易に剥がれる。 抗原刺激により反応した細胞を、 未刺激の細胞の蛍光強度と抗 原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比（Β/Α)により選別し、 取り出す。 レヽィプリ ドーマの作製]
本発明の方法では、 選択した 1個の抗原特異的 Bリンパ球を培養し、 培養に より増殖した抗原特異的 Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイプリ ドー マを作製する。 1個の Bリンパ球だけではハイプリ ドーマを作製することは事 実上困難である。 そこで、 まず、 1個の抗原特異的 Bリンパ球を培養し、 増殖 させる。 抗原特異的 Bリンパ球の培養は、 例えば、 抗 CD40抗体または CD40リ ガンド （CD40L) 及びインターロイキン 4 (IL-4) を含むインターロイキンの共 存下で行う事ができる。 この方法では、 CD40と IL - 4による刺激で抗原特異的 B リンパ球は増殖する。 この増殖方法自体は公知である （Banchereau J， de Paoli P, Valle A, Garcia E, Rousset F. Long-term human Bcell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40. Science 251 : 70-72， 1991) 。 し力 し、 従来、 ハイブリ ドーマの作製にこの方法を用いた例は無い。 また、 Bリンパ球の培養は、 Bリンパ球を増殖することができるマイ トーゲン (例えば、 リポポリサッカライ ド （LPS) など） の共存下で行うこと、 'または抗 CM0抗体または CM0Lおよび IL- 4を含むィンターロイキンおょぴ LPSの共存 下で行うことができる。 B細胞の増殖を誘導するものとして、 LPS以外に、例え ば、 PMA (phorbol 12-myristate 13 - acetate)、 Caィオノフォア、 抗免疫グロブ リン抗体等を挙げることができる。
LPS等のマイト一ゲンで刺激した B リンパ球を用いてハイブリ ドーマが作製 できることは公知である （例えば、 （1) Van Snick JL, Coulie P, Monoclonal anti-IgG autoantibodies derived from lipopolysacchari de-activated spleen cells of 129/Sv mice. Journal of Experimental Medicine, 155 : 219 - 230， 1982. (2) Lange M, Le Guern C, Cazenave PA, Covalent coupling of antigens to chemically activated lipopolisaccharide： a tool for in vivo and in vitro specific B cell stimulation. Journal of Immunological Methods, 63： 123 - 131， 1983参照。）。 伹し、 1個の抗原特異的 Bリンパ球を増殖させ、 ハイプリ ドーマ 作製に用いた例はない。 抗原特異的 B 'リンパ球の培養は、具体的には、以下の様に行うことができる。
1 . マイクロウェルから回収した抗原特異的 Bリンパ球は、 あらかじめ抗 CD40抗体あるいは CD40 リガンド （CD40L) をコートしておいた 96ゥエル プレートのゥエルに移す。このゥエルの中には 200 Lのィンターロイキン 4 (IL-4) が入った細胞培養液 （10°/。 FCS入り RPMI1640培地） もあらかじ め入っている。
2 . 9 6ゥエルプレートを C02 インキュベータ （5% C02) に移し 37 °Cで 1 週間から 10日間、 細胞を培養する。
3 . CD40および IL-4のシグナ^/により増殖した Bリンパ球をゥエルから回 収し、 定法にしたがってミエローマ細胞と融合させハイプリ ドーマを作製 する。
4 . CD40 と IL- 4のシグナルを加えるときに、 可溶性の抗 CM0抗体あるい は CD40Lを使用する代わりに、 CD40Lと IL - 4の遺伝子を導入し CD40Lと IL-4 を産生する付着性の細胞をあらかじめ 96 ゥヱルプレートのゥエルに培養 しておき、 その上で回収した抗原特異的 Bリンパ球を培養することも可能 である。
5 . IL - 4に加えて、 IL - 2， IL-5, IL- 6等を加えてもよレヽ。 本発明のハイプリ ドーマ作製方法では、 抗原で免疫したマウスから調製した リンパ球をマイクロゥヱルアレイチップに添加し、 抗原刺激を加えることによ りまず抗原特異的 Bリンパ球を同定する。 この同定した 1個の抗原特異的 Bリ ンパ球を増殖させ、 それを用いてハイプリ ドーマを作製する。 従って、 増殖し 抗体を産生するハイプリ ドーマの大部分は抗原特異的抗体を産生すると予想さ れる。 マイクロウヱルアレイチップを用いた抗原特異的 Bリンパ球の検出法は 頻度の低い抗原特異的 B リンパ球を検出できるため、 これまで困難であった抗 原に対する抗体を産生するハイプリ.ドーマを産生することが可能である。 . また、 従来のハイプリ ドーマ作製法では、 人手および時間がかかったが、 マ イクロウェルアレイチップを用いることにより抗原特異的 Bリンパ球の検出が 短時間でおこなえるため、 人手および時間の節約が可能になる。' 実施例
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
1. Bリンパ球の分離
抗原で免疫したマウスの脾臓およびリンパ節より リンパ球画分を分離し、 さ らに AutoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) を用いてリン パ球画分から Β ンパ球画分をさらに分離精製する。 2. Fluo3の細胞への導入 （図 1参照）
2 x 106個の Bリンパ球を 2 M F1U03/AM (同仁、 熊本） /loading buff er (137mM NaCl, 2. 7 mM KC1, 1. 8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, lmg/mlグノレコース， lmg/ml BSA, 20mM HEPES (pH7. 4) )に懸濁し、 室温に 30分インキュベーションする。 loading bufferで細胞を洗浄し、 細胞内に導入されなかった Fluo3/AMを除く。 その後細 胞を ΚΡΜΠ640/10% FCS溶液に懸濁する。
3. マイクロゥヱルアレイチップ （図 2参照）
マイクロゥェルアレイチップは poly (dimethylsiloxane) (PDMS)あるいはシ リコンを用いて作製されており、直径 10 m、深さ 20 μ ηιのマイクロウヱルが 2 cm X 2 cmのチップ上に縦 ·横 30 i mの間隔 （マイク口ゥエルの中心から中心までの 距離は 40 μ πι) で配置されている。 チップの両側には厚さ 1讓幅約 lmm長さ 2cmの シールを貼る。
4. マイクロアレイスキャナー
本装置は基本的に日立ソフトエンジニアリング （横浜巿） のマイクロアレイ スキャナー （CRBIO IIe) を用いており、 以下の変更を加えている。 搭載されて いるレーザー （Cy3用， 532 nm; Cy5用， 635 nm) のうちの 1本（Cy5用， 635 nm) を 47'3nmのレーザーと置換してある。
5. マイクロウェルアレイチップを用いた活性化 Bリンパ球の検出 （図 2参照） 上記マイクロウェルアレイチップに上記細胞懸濁液を添加し、 5分間静置す る。 マイクロウヱルに入らなかった細胞を RPMI1640/10% FCS溶液を用いて洗い 流す。 リンパ球の直径は約 lO /i mであり、 使用するマイクロウヱルの直径が 10 であるためにひとつのマイク口ゥヱルにはリンパ球は 1個入る。カバーグラ スを上記シールの上に置き、 チップと力パーグラスの間に RPMI1640/10°/。 FCS溶 液を満たす。 このマイクロウェルァレイチップをマイクロアレイスキャナーに 揷入し、 解像度 2. 5 μ ηιでスキャンし、 データを保存する （抗原刺激前の蛍光の データ ： Α)。 次に、 チップと力パーグラスの間の RPMI1640/10% FCS溶液を除き、 そこへ RPMI 1640/10% FCS溶液に溶解させた抗原 （lO i g/mL) を加える。 抗原を加えて 1 分後にマイクロウェルアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、 解 像度 2. 5 μ ηιでスキャンし、データを保存する（抗原刺激後の蛍光のデータ： Β)。 刺激前後の蛍光強度の比（Β/Α)を計算し、比の大きいゥエルを特定する。 この ゥエルの中に抗原特異的 Βリンパ球が存在する。
6. マイクロウェルからの細胞の分取。
マイクロマニピュレータを用いてガラスキヤピラリーを用いることにより顕 微鏡下で細胞を分取する。
7. ハイ.プリ ドーマの作製方法
1) 9 6穴プレートのゥヱルに lO ^i g/mLの抗 CD40抗体 （eBioscience社） を加 え、 一晚インキュベーションすることにより、 抗 CM0抗体をゥエルにコーテ ィングしておく。 分離した細胞を 96穴プレートのゥヱルにあらかじめ加えて おいた培地（10°/。FCS含有 RPMI1640、100 U/mlリコンビナント IL- 4 (eBioscience 社） に加え、 37°C、 5% C02存在下で、 約 1週間から 1 0日培養する。
2)細胞をゥエルから回収しエツペンドルフチューブに移す。そこへ約 200個の マウスミエローマ細胞 （X63. Ag8. 653) を加え、 2000回転、 2分間遠心する。
3)細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、 1 mlの RPMI1640培 地 （FCS不含） を加え、 細胞を懸濁し、 2000回転、 2分間遠心する。
4)細胞の沈渣をほぐさ いよう注意深く上清を取り除き、 さらに 2000回転、 10秒間遠心する。
5)細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を完全に取り除く。
6) 20 μ 1の 30%ポリエチレンダリコール（Sigma)を加え、軽く細胞を撹拌する。
7) 2000回転、 5分間遠心する。 500 1の RPMI1640培地 （FCS不含） を加え、 細胞を懸濁する。 次に 20°/。FCS含有 RPMI1640培地を 500 1添加し、 細胞を懸 濁する。
8) 2000回転、 5分間遠心後、 上清を取り除き、 細胞を 1 mlの 20% FCS含有 HAT 選択培地に懸濁する。 さらに、 20 mlの 20% FCS含有 HAT選択培地を加え、 2 ml ずつ 24ゥエルプレートのゥエルに添加する。
HAT選択培地： RPMI1640, 1 10一4 M hypoxanthine, 4 10— 7M aminopterin, 1. 6 10—5 M thymidine
9) 37°C、 5%C02存在下で約 7〜 8日培養する。
10)ハイプリ ドーマの増殖を光学顕微鏡下で観察し、培養上清中の抗体を ELISA 法等を用いて検出する。 8. ハイブリ ドーマの作製方法 （別法）
1) Bリンパ球を 〔50， 000個の放射線照射 （50 Gy) した EL4細胞、 500U/mL ヒ ト IL - 2、 5 ng/mL PMA、 PWMで刺激したヒ ト T細胞の培養上淸 （5% v/v) ] を含む 10%FCS含有 RPMI1640培地 （200 L/well) で 1週間培養 （37 °C， 5% C02) す る。
2)培養上清を 100 / L除き、 そこへ 10, 000個の放射線照射 （50 Gy) した CD40リガ ンドを発現させた付着細胞と 5 ng/mLヒ ト IL- 4を加え、 〔500U/mL ヒ ト IL- 2、 5 ng/mL PMA、 P丽で刺激したヒ ト T細胞の培養上清 （5% v/v：)〕 を含む 10%FCS含有 RPMI1640培地 （200 L/well) で 1週間培養 （37 。C， 5% C02) する。
3)培養上清を lOO L除き、 そこへ 10， 000個の放射線照射 （50 Gy) した CD40リガ ンドを発現させた付着細胞を加え、 〔5 ng/mLヒ ト IL - 4 、 500U/mL ヒ ト IL- 2、 5 ng/mL PMA、 P丽で刺激したヒ ト T細胞の培養上清 （5% v/v) ] を含む 10°/。FCS 含有 RPMIIMO培地 （200 /i L/well) で 1週間培養 （37 °C， 5% C02) する。
以下、 上記「7.ハイプリ ドーマの作製方法」 の 2)〜10)の操作と同様の操作を 繰り返して、'ハイプリ ドーマを検出した。
(抗 OVA抗体産生ハイプリ ドーマの調製）
以下に抗 0VA抗体産生ハイプリ ドーマの調製例を示す。
免疫
BALB/c マウスの皮下に卵白アルブミン （0VA) 10 s を Complete Freund Adjuvant に混合したものを注入した。 2週間後に 0VA10 g を Incomplete Freund Adjuvant に混合したものを同マウス皮下に注入した。 さらに 2週間後 に 0VA10 μ gを Incomplete Freund Adjuvantに混合したものを同マウス皮下に 注入した。 その後、 マウス血清を採取し、 ELISAにて OVAに対する抗体が産生 されていることを以下の方法によりチェックした。 血清中の抗 OVA抗体の検出は以下のように行った。
96穴プレートに OVA蛋白をコーティングし、非特異的な結合が起こらないよ うにプロッキングを行った。 この各ゥエルに免疫したマウスより得た血清を希 釈したものを添加し、 室温で 2時間反応させた後、 洗浄し、 アル力リフォスフ ァターゼ標識抗マウス免疫グロプリンを添加し、 さらに室温で 2時間反応させ た。洗浄後、 アルカリフォスファタ一ゼの基質を加え、室温で 15分反応させた 後、 414nmの吸光度を測定した。 結果を図 3に示す。 細胞への蛍光色素の負荷
2週間後に PBSに溶解させた OVAlO /^ gを腹腔内に注入した。 4日後に脾臓を 取り出し、 脾細胞を調製した。 脾細胞を Ι μ Μ Fluo-4 AM、 1 μ Μ CellTracker Orange, 0. 02% Pluronic F-127を含む緩衝液 A(20 mM HEPES, pH7. 4, 137 mM NaCl, 2. 7 mM C1, 1. 8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mg/mL glucose, 1 mg/mL BSA) に lOVmLの細胞密度になるように懸濁し、 30分間室温にてインキュベーションし た。 その後同緩衝液 A にて細胞を洗浄し、 細胞に取り込まれなかった Fluo-4 および CellTracker Orangeを除いた後、 細胞を 105/ 1^になるように 10%FCS を含む RPMI1640液 （緩衝液 に懸濁した。
0VA特異的 Bリンパ球の検出
マイクロウェルアレイチップ （シリコン製、 ゥエル直径 10 μ πι、 ゥヱル深さ 約 15 μ ηι、 ゥヱルピッチ 20 m， 約 24万ゥエル） に蛍光色素を負荷した脾細胞 ( 105/ μ Ι) を添加し、 ゥヱルに入らなかった余分な細胞を除去した。 力バーグ ラスでチップを覆った後日立ソフトウェアエンジニアリング （株） 製 CRBI0 Ile-FITCに揷入し、 473nmの励起波長、 535nmの蛍光波長で Fluo- 4の蛍光を、 次いで 535nmの励起波長、 585pmの蛍光波長にて CellTracker Orangeの蛍光を スキャンした。 次に、 チップをスキャナーから取り出し、 チップと力パーダラ スの間に入っている緩衝液 Bを除去し、 そこへ緩衝液 Bに溶解させた OVA ( 100 μ g/mL) を添加した。 チップをスキャナーに挿入し、 OVA添加後 1分後に解像 度 2· 5 πιでスキャンした。刺激前および刺激後の Fluo- 4の蛍光の比を計算し、 蛍光の比が 5倍から 10倍増加した細胞のァドレスを特定した。
0VA特異的 Bリンパ球の回収および培養
チップと力パーグラスの間入っていた緩衝液 Bを除去し、 カバーグラスを外 した。 その後乾燥しないように緩衝液 Bをチップに添加した。 チップを蛍光顕 微鏡にセットし、 顕微鏡下で観察しながらマイクロマニピュレータを用いて上 でスキャナーを用いて同定した OVA特異的 Bリンパ球を回収した。 回収した B ンパ球を 〔50, 000個の放射線照射（50 Gy) した EL4細胞、 500U/mL ヒ ト]: L- 2、 5 ng/mL PMA、 PWMで刺激したヒ ト T細胞の培養上清 （5% v/v)〕 を含 む 10%FCS含有 RPMI1640培地 （200 / L/wel l) で 1週間培養 （37。 (：， 5% C02) し た。次に培養上清を 100 除き、そこへ 10， 000個の放射線照射（50 Gy)した CM0 リガンドを発現させた付着細胞と 5 ng/mLヒト IL - 4を力！]え、 〔500U/mL ヒ ト IL-2、 5 ng/mL PMA、 PWMで刺激したヒ ト T細胞の培養上清 （5% v/v) ) を含む 10%FCS 含有 RPMI 1640培地 （200 17^11) で 1週間培養 （37。C， 5% C02) した。 さら に培養上清を 100 ^ L除き、 そこへ 10， 000個の放射線照射 （50 Gy) した CD40リガ ンドを発現させた付着細胞を加え、 〔5 ng/mLヒト IL- 4、 500U/mL ヒ ト IL- 2、 5 ng/mL PMA、 P丽で刺激したヒ ト T細胞の培養上清 （5% v/v)〕 ·を含む 10%FCS含有 RPMI1640培地 （200 μ !7^11) で 1週間培養 （37。C, 5% C02) した。 ハイブリ ドーマの作製
B リンパ球の増殖を光学顕微鏡にて観察し、 細胞が増殖しているゥエルから 細胞を回収しエツペンドルフチューブへ移した。 そこへ約 200個のマウスミエ ローマ細胞 （X63. Ag8. 653) を加え、— 2000 回転、 2分間遠心した。 細胞の沈渣 をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、 1 mLの RPMI 1640培地 （FCS不含） を加え、 細胞を懸濁し、 2000回転、 2分間遠心した。 細胞の沈渣をほぐさない よう注意深く上清を取り除き、 さらに 2000回転、 10秒間遠心し細胞の沈渣を ほぐさないよう注意深く上清を完全に取り除いた。 20 μ Lの 30%ポリエチレング リコール （Sigma) を加え、軽く細胞を撹拌後、 2000回転、 5分間遠心した。' 500 Lの RPMIIMO培地 （FCS不含） をカロえ、 細胞を懸濁した。 次に 20% FCS含有 RPMI 1640培地を 500 z L添加し、 細胞を懸濁した。 2000回転、 5分間遠心後、 上清を取り除き、 細胞を 1 mLの 20% FCS含有 HAT選択培地 （RPMI1640, 1 x 10一4 M hypoxanthine, 4 x 10— 7M aminopterin, 1. 6 10 ° M thymidine) に懸獨し た。 さらに、 20 mLの 20% FCS含有 HAT選択培地を加え、 2 mLずつ 24ゥヱルプ レートのゥヱルに添加し、 37。C、 5%C02存在下で？〜 10日培養した。 ハイブリ ド 一マの増殖を光学顕微鏡下で観察し、 培養上清中の抗 0VA抗体を、 下記に示す ELISA法を用いて検出した。 図 4は検出したハイプリ ドーマの培養上清中の抗 OVA抗体の ELISAの結果を示している。 培養上清の希釈倍数に応じて吸光度が 変化しており、 可溶性の OVAを培養上清に加えることで、 ゥヱル底面の OVAに 対する抗体の結合が特異的に阻害されることから、 培養上清中に抗 OVA抗体が 産生されていることがわかる。 ハイプリ ドーマ上清中の抗 OVA抗体の検出は以下のように行った。
96穴プレートに OVA蛋白をコーティングし、非特異的な結合が起こらないよ うにブロッキングを行った。 この各ゥエルにハイブリ ドーマの培養上清を希釈 したものを添加した （PBS)。 また、 ELISA反応の特異性を検討するために別の ゥエルにはハイブリ ドーマの培養上淸を加える時に同時に 2 μ g/mLの OVAある いは γ - globulinを添加した。 室温で 2時間反応させた後、 洗浄し、 アルカリ フォスファタ一ゼ標識抗マウス免疫グロブリンを添加し、 さらに室温で 2時間 反応させた。 洗浄後、 アルカリフォスファタ一ゼの基質を加え、'室温で 15分反 応させた後、 414nmの吸光度を測定した。 結果を図 4に示す。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 抗原特異的抗体産生 Bリンパ球を選択、 採取し、 これを利 用してハイプリ ドーマを作製することで、 従来のハイプリ ドーマの作製方法に 比べて、 抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングの手間が大幅に 省け、 ハイプリ ドーマの作製効率等は大幅に改善される。 具体的には、 以下の 通りである。
(a) 扱う細胞数が減るので、プレートにまくときのゥエル数が減少する。扱 う細胞数が少ないのでスクリ一二ングにかける時間が減り、 スクリ一二ングす る人の負担が軽減する。
(b) ハイプリ ドーマが増殖してきたときに、抗原特異的抗体を産生していな いハイプリ ドーマも増殖してくるが、 抗原特異的抗体産生 Bリンパ球を初めに 選択、 濃縮しているので、 このようなネガティブの細胞の頻度が減少する。
(c) , また、マイクロウェルアレイチップを用いて頻度の低い抗原特異的抗体 産生 B細胞を検出、 採取して、 増殖させ、 確実にハイプリ ドーマを作製するこ とで、 これまでは作製することができなかった頻度の低い抗原特異的抗体産生 B細胞由来のハイプリ ドーマを作製することが可能になる。

Claims

請求の範囲
1 . ある抗原に特異的に反応する B リンパ球 （以下、 抗原特異的 B リンパ球 という） を 1個選択し、 選択した抗原特異的 B リンパ球を培養し、 培養により 増殖した抗原特異的 Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイプリ ドーマを 作製することを含む、 抗原特異的抗体産生ハイプリ ドーマの作製方法。
2 . 前記選択した抗原特異的 Bリンパ球の培養は、 抗 CD40抗体または CD40 リガンド （CD40L) 及ぴインターロイキン 4 (IL-4) を含むインターロイキンの 共存下で行う請求項 1に記載の方法。
3 . 前記選択した抗原特異的 Bリンパ球の培養は、 B リンパ球を増殖するこ とができるマイ トーゲンの共存下で行う請求項 1に記載の方法。
4 · 前記選択した抗原特異的 Bリンパ球の培養は、 抗 CD40抗体または CD40L および IL- 4 を含むインターロイキンおよびマイトーゲンの共存下で行う請求 項 1に記載の方法。
5 . 前記 1個の抗原特異的リンパ球の選択はフローサイトメータ、 またはマ イクロウヱルアレイチップを用いて行う請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の 方法。
6 . 前記 1個の抗原特異的リンパ球の選択は、 1個の被検体リンパ球が含ま れるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウエルァ レイチップの各マイクロウヱルに抗原を添加し、 次いで、 抗原に反応したリン パ球を検出し、 検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出す ことにより行う請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
7 . 抗原特異的リンパ球は、 頻度が 0 . 1 %以下である請求項 1〜6のいず れか 1項に記載の方法。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の方法により作製されたハイプリ ド 一マを用いて、 モノクローナル抗体を製造する方法。
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