CN1333373A - 激发型抗人cd40单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法以及应用,以高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株为免疫原,以不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株为阴性对照,经免疫,细胞融合、筛选、鉴定获得稳定分泌特异性鼠抗人CD40的杂交瘤细胞株,制备抗肿瘤生物制剂。它不仅可使B细胞扩增,还可以使外围血来源的单核细胞扩增和分化成熟为树突状细胞,以及激发T细胞的功能,扩增和诱导DCs成熟一步完成,使临床应用成为可能。用单抗诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡及增强肿瘤细胞免疫原性,用于体外激发T淋巴细胞,并用于过继治疗肿瘤。

Description

激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法及其应用

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法及其应用。

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，尽管随着化放疗和手术疗法等手段的不断提高，许多肿瘤患者可获得临床意义上的缓解，但仍不能免避肿瘤残留细胞复发所致的死亡。肿瘤的发生是由逃避免疫监视的变异细胞恶性增殖，其逃避机制之一是由于机体抗原递呈细胞特别是树突状细胞在数量和功能上的异常，致使机体的肿瘤抗原特异性T细胞处于免疫耐受状态。因此通过改变T细胞免疫耐受状态并激发机体特异性抗肿瘤免疫应答，以清除和控制肿瘤残留细胞，成为肿瘤免疫治疗的重要手段。

树突细胞(dendritic cells，DCs)是体内专业的抗原递呈细胞，是初次和再次免疫应答有力的开启者。DCs是唯一可以激发幼稚性T细胞的抗原递呈细胞，且较其它抗原细胞包括巨噬细胞(Mφ)和B细胞的抗原递呈作用强100倍以上，在诱导机体特异性细胞免疫中起着极其重要的作用。DCs激发T细胞依赖的免疫反应，在体外诱导并经抗原刺激的DCs回输入体内也可迁移到淋巴组织，并致敏T细胞，激发细胞免疫反应。因而，采用DCs体外激发或同时负载肿瘤抗原或者将目的基因转染DCs作为免疫疫苗，可有效地激发机体特异性的抗肿瘤主动免疫，对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用。

在应用DCs进行肿瘤治疗中关键的技术之一是设法在体外获得大量用于治疗目的的DCs。传统的在体外扩增树突状细胞的方法是将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及肿瘤坏死因子α(TNFα)加于体外培养的CD34+造血前体细胞，所获得的树突状细胞高表达CD40(Nature 1992；360：258-261/J Exp Med 1997；185：341-349)。这些细胞依赖GM-CSF生存，但它们还能在CD40L转染的L细胞中培养继续存活和生长。树突状细胞在CD40分子被激发后导致一些与抗原递呈相关的重要形态变化、如细胞浆内容物减少和树突状突增多，以及表型改变、CD40的激发导致了高水平表达MHCII类抗原和上调辅助分子如CD58、CD80/B7和CD86/B70，而这些分子有助于提高抗原递呈能力和增强对T细胞的激发作用。由于体内CD34+细胞数量很少，不宜获得，使得体外扩增的DCs在数量上难以满足临床治疗用量(单次用量≥1×10⁶细胞)。用TNF和GM-CSF诱导的树突状细胞仍然需要经过CD40分子的激发才能最终分化成熟而发挥激发T细胞的功能，若用CD40L转基因细胞激发DCs成熟，不宜最终获得高纯度的DCs(有CD40L细胞污染)，故不宜用于临床治疗。鉴此，研制可溶性的CD40分子激动剂(可溶性CD40配体或激发型抗CD40单抗)，将为临床应用带来便利。

文献报导的各种抗CD40单抗均采用正常细胞或可溶性CD40融和蛋白为免疫原获得，其中抗CD40单抗mAb89和G28-5因其能与IgM抗体或佛波脂(Phorbol esters)共刺激使纯化的B细胞扩增而著名，但这些单抗却不能有效激发树突状细胞(Eur J Immunol，1989；19：1463-67/Nature，1991；353；678-9)。抗CD40单抗5D12、3A8和3C6为阻断型单抗，可用来阻断B细胞的扩增(美国专利号：6004552)。

本发明的目的在于提供了一种激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法及其应用，该方法取材方便且来源丰富，通过该方法取得的激发型抗人CD40单克隆抗体用于B细胞体外扩增；用于在体外诱导DCs及促使其分化成熟一步完成、DCs可用于临床；用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡和提高其免疫原性，达到治疗肿瘤的目的。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

一种激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG2)为免疫原，免疫Balb/C小鼠；免疫小鼠脾脏细胞与小鼠SP2/0细胞株进行融和；以高表达CD40分子的肿瘤细胞株(多发性骨髓瘤细胞株XG2、B淋巴瘤细胞株Daudi)阳性对照和不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG7、XG1)阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定，经复筛及亚克隆后获得稳定分泌特异鼠抗人CD40杂交瘤细胞株，命名为5C11和2G11，并再体外持续传代，分批冻存；规模化细胞培养或生产腹水、分离纯化和单抗的特性鉴定并获得激发型抗人CD40单抗纯品。

激发型抗人CD40单克隆抗体应用包括以下三方面：

一.激发型抗人CD40单克隆抗体用于B细胞体外扩增。

采用激发型抗人CD40单克隆抗体5C11或2G11在体外扩增B细胞的方法：

1.纯度＞98％扁桃体B细胞；LCD32为转染FcγRII(人CD32)的鼠成纤维细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养(法国B.Klein博士赠送INSERM.U475)；激发型抗人CD40单克隆抗体5C11和2G11(本发明提供的方法制备的)。

2.在B细胞培养体系中，加入经丝裂霉素5×10⁷、50ug丝裂霉素/ml处理洗涤后LCD32 5×10⁴细胞/ml，5C11或2G11 1ug/ml及人重组IL-4 100U/ml(购自Diaclone公司法国)；

3.在B细胞培养体系中再加入人重组IL-2 500U/ml(购自上海华新公司)，人重组IL-6 1ng/ml及人重组FL 50ng/ml(购自Immugene公司美国)的不同组合，培养，在调整细胞浓度后，更换新鲜培养基、细胞因子及LCD32，计数(胎盘兰染色)。

二.激发型抗人CD40单克隆抗体用于诱导树突状细胞DCs分化成熟以及在体外激发T细胞的主要试剂。

采用激发型抗人CD40单克隆抗体5C11和2G11诱导树突状细胞分化成熟以及在体外激发T细胞的方法。

取肿瘤患者或供血员新鲜外周血50～100ml用淋巴细胞分离液(Ficoll/Paque)分离得到外周血单个核细胞(PBMNC)，将PBMNC贴壁培养、去除非贴壁细胞，在贴壁生长的单核细胞中加入细胞因子：人重组IL-4 100～1000U/ml、粒巨细胞集落刺激因子GM-CSF1000U/ml、和激发型抗人CD40单抗CD40mAb-5C11或2G11 1～10μg/ml，若干天后收集获得树突状细胞(DCs)。

三.激发型抗CD40单克隆抗体用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡和提高其免疫原性的方法。

1.在肿瘤病人CD40阳性的肿瘤细胞中加入激发型抗人CD40单抗5C11或2G11 1～10微克/毫升，培养24～96小时。

2.T淋巴细胞的激发：用淋巴细胞分离液分离获得患者外周血单个核细胞，将其按10～20∶1与经激发型抗人CD40单抗处理(步骤1)的肿瘤细胞共培养，同时加入人重组白细胞介素-2(rhIL-2)500～1000U/毫升，培养7～14天，激发后的T细胞可回输机体以过继免疫治疗肿瘤。

本发明提供的激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法，将高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG2)为免疫原、以不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG7、XG1)为阴性对照，所获得的激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11和2G11)，除同样具有使B细胞扩增的功能只外，可使外围血来源的CD14+的单核细胞扩增和分化为树突状细胞DCs，并且经抗CD40单抗5C11激发后的DCs还具有成熟的标志和明显激发T细胞的功能。本发明提供的方法，扩增和诱导DCs成熟一步完成，且克服了用CD40L转基因细胞诱导Dcs成熟中的细胞污染问题，使临床应用成为可能。同时，由于外周血取材方便且来源丰富，解决了用CD34+细胞诱导DCs方法中细胞量不足的问题。用于体外激发T淋巴细胞并用于过继治疗肿瘤。本发明提供的采用激发型抗CD40单克隆抗体用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞凋亡或提高其免疫原性、用于体外激发T淋巴细胞并用于过继治疗肿瘤。本发明所提供的抗CD40激发型单抗5C11和2G11，它们在体外可以导致B细胞淋巴瘤和MM的生长抑制和凋亡，并能提高这些肿瘤对化/放疗的敏感性。同时，这些肿瘤细胞CD40分子的激发还导致其CD95(Fas)及粘附分子ICAM-1的表达，有助于细胞毒性T细胞(CTLs)对其杀伤。因CD40分子的激发，在正常免疫细胞往往介导增殖与分化成熟，而在许多肿瘤细胞，CD40分子的激发介导了细胞凋亡以及诱导其抗原性。这两方面正是肿瘤免疫治疗所要达到的目标，激发型抗人CD40单抗起到了双功能分子的作用，是较为理想的抗肿瘤生物制剂。

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是5C11杂交瘤细胞株染色体核型图

图2是杂交瘤细胞株5C11和2G11增殖曲线。

图3是5C11和抗CD40单抗MAB竞争抑制试验。

图4是Western bolt免疫印迹分析。

图5是CD40分子在不同细胞上的表达。

图6是CD40培养体系中扁桃体B细胞成团族状生长。

图7是不同培养体系中B细胞的增殖作用。

图8是不同细胞因子组合诱导树突状细胞增殖曲线。

图9是混合淋巴细胞反应。

图10是5C11引起XG2和Daudi细胞的同型聚集。

图11是5C11引起XG2和Daudi细胞株的生长抑制效应。

图12是流式细胞仪分析5C11诱导肿瘤细胞的凋亡。

图13是XG2和Daudi粘附分子的变化。

图14是T细胞杀伤结果。

附图说明：附图说明：

图1. 5C11杂交瘤细胞株染色体核型分析。

图2.杂交瘤细胞株5C11(A)、2G11(B)增殖曲线，横坐标为培养时间，单位小时；纵坐标代表活细胞数量，单位A：×10⁵细胞/毫升，B：×10⁴细胞/毫升。

图3.为流式细胞仪分析图。1：XG2细胞株散点图，横坐标表示侧像散射荧光强度，纵坐标表示前像散射荧光强度；2：XG2阴性对照，荧光素PE标记的小鼠IgG直标单抗；3：XG2与抗CD40单抗5C11作用后，加荧光素PE标记的鼠抗人CD40单抗MAB89；4：XG2阳性对照，荧光素PE标记的鼠抗人CD40单抗MAB89：5：XG2阳性对照，一抗为5C11，二抗为荧光素FITC标记的羊抗小鼠IgG2；6：Daudi细胞株散点图，横轴表示侧像散射，纵轴表示前像散射；7：Daudi阴性对照，荧光素PE标记的小鼠IgG直标单抗：8：Daudi与抗CD40单抗5C11作用后，加荧光素PE标记的鼠抗人CD40单抗MAB89；9：Daudi阳性对照，荧光素PE标记的鼠抗人CD40单抗MAB89；10：Daudi阳性对照，一抗为5C11、二抗为荧光素FITC标记的羊抗小鼠IgG。

图4. 1：分子量标准，单位是千道尔顿(KD)；2：CD40分子表达阴性的Jurkat细胞株膜蛋白提取液；3：XG2细跑株膜蛋白提取液；4：CD40分子表达弱阳性的Raji细胞株膜蛋白提取液；5：Daudi细胞株膜蛋白提取液。

图5.为流式细胞仪分析图，阴影部分为阴性对照(一抗为小鼠IgG抗体，二抗为荧光素FITC标记的羊抗小鼠IgG)，空心部分为CD40表达情况(一抗为鼠抗人CD40单抗，二抗为荧光素FITC标记的羊抗小鼠IgG)。1：外周血单个核细胞；2外周血T细胞；3：外周血B细胞；4：扁桃体B细胞；5：Daudi细胞株；6：xG2细胞株。

图6.CD40培养体系中扁桃体B细胞成团族状生长。

图7.不同培养体系中B细胞的增殖作用。

图8.横坐标为培养大数，纵坐标为细胞数量(×10⁵/毫升)。1：细胞因子组合为GM-CSF+IL-4+5C11；2：细胞因子组合为单独5C11；3：细胞因子组合为GM-CSF+IL-4；4：阴性对照，为单独培养基。

图9. 1：外周血单个核细胞+脐带血单个核细胞；2：植物血凝素PHA+脐带血单个核细胞；3：GM-CSF联合1L-4诱导的DCs+脐带血单个核细胞；4：抗CD40单抗5C11联合GM-CSF与IL-4诱导的DCs+脐带血单个核细胞。

图10.放大倍数为250。1：XG2细胞；2：Daudi细胞。

图11.A：XG2细胞株：B：Daudi细胞株。1：单独培养基；2：阴性对照单抗(小鼠IgG)；3：抗CD40单抗5C11(10微克/毫升)。

图12.流式细胞仪分析图。横坐标为碘化丙碇(P1)对应荧光强度，纵坐标为荧光素标记的Annexin-V对应荧光强度。1：XG2阴性对照；2：加5C11培养48小时的XG2细胞；3.Daudi阴性对照：4：加5C11培养48小时的Daudi细胞。

图13.经抗CD40单抗5C11激发后，XG2(A)和Daudi(B)粘附分子的变化。空心代表处理前，阴影代表处理后。

图14. 1为阴性对照，2为抗CD40单抗处理组。A为XG2，B为Daudi细胞。

实施例1。

激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法，采用高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG2)为免疫原、以不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG7、XG1)为阴性对照，按Kohler和Milstein建立的方法进行，Nature1975，256：495-96。

1.XG1、XG2、XG6、XG7是苏州大学生物技术研究所建立的多发性骨髓瘤细胞株系，置于含10％胎牛血清及rIL-6 3ng/ml的RPMI1640(Gibical公司)中常规培养，其中XG2的CD40分子的表达异常高(阳性率为99％、荧光强度达625)，XG6有微弱的CD40分子表达，而XG1和XG7均不表达可检测性CD40分子；B淋巴瘤细胞株Daudi，T急淋巴细胞株Jurkat(均购自ATCC)用含10％胎牛血清的RPMI1640(Gibical公司)培养基中长期培养。这些细胞株均无支原体污染。XG2作为免疫原细胞，而其它细胞作为阳性或阴性筛选的靶细胞。

2.采用高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG2)为免疫原，将XG2细胞10⁷/500μl/只鼠(注射前经丝裂霉素处理)加入等体积的福氏不完全佐剂，免疫Balb/C小鼠，间隔3周，共3次。在末次免疫的第四天取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株按常规方法进行融合，共融合了20块96孔板。以高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG2阳性对照及不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG7阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定；继而用高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株Daudi阳性对照及不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG1阴性对照，作进一步筛选和鉴定。阳性克隆以有限稀释法单克隆化，经过三次有限稀释法亚克隆，使克隆的阳性率达99％，经复筛及亚克隆后获得稳定分泌特异性鼠抗人CD40的杂交瘤细胞株，命名为2G11和5C11，并在体外持续传代(40代)后，仍能稳定分泌特异性抗体，分批冻存；规模化细胞培养或生产腹水、分离纯化和单抗的特性鉴定并获得激发型抗人CD40单抗纯品。

杂交瘤细胞株2G11和5C11的特征：杂交瘤细胞株2G11和5C11，其亲本细胞为小鼠SP2/0骨髓瘤细胞株和多发性骨髓瘤细胞株XG2免疫后的小鼠脾脏细胞，染色体分析这两株杂交瘤染色体数目为92-108，并见中着丝粒标记染色体1-2个，亚中着丝粒标记染色体1个，微小体1-2个，如图1所示。该细胞株的倍增时间是17小时，杂交瘤细胞株2G11和5C11增殖曲线，如图2所示。该杂交瘤分泌特异性抗人CD40分子的单克隆抗体，抗体均为小鼠IgG1亚类。

3.单抗的特性鉴定方法：(1)mAb效价测定：诱生腹水按本室建立的常规方法进行，效价测定采用间接免疫荧光法；(2)mAb的Ig亚类测定，采用试纸快速测定(Argen公司法国)；(3)腹水型mAb的纯化及定量：按Phamacia公司方案采用Protein G柱分离纯化，定量采用染料结合比色法(BSA标准蛋白作对照)(AnalBiochem，1996：236：302)；(4)CD40抗原在各类细胞系上的表达：采用常规的间接免疫荧光法，用流式细胞仪分析；(5)抗体识别原位点的竞争实验：XG2及Daudi细胞1×10⁶，先用纯化后的mAb10ug/100ul孵育45min，PBS洗涤2次，加鼠抗人CD40-PE直标单抗(克隆mAb89购自法国Immunotech公司)2ug/100ul孵育30min，同时用CD40-PE 2ug/100ul作为阳性对照，鼠IgG1-PE(购自法国Immunotech公司)为阴性对照，用流式细胞仪分析细胞膜荧光表达强度；(6)mAb的Western blot鉴定：将XG2、Daudi、XG7、Raji、Jurkat细胞各1×10⁷用PBS洗两遍后，去除上清，加入50ul 1倍的加样缓冲液，在水中煮沸15min，用10％SDS-PAGE凝胶进行分离，一抗为5C11，二抗为羊抗鼠Ig-POD(购自德国Boehringe公司)，显色按该公司Western blot Kit所提供的方法进行。

单抗的特性鉴定结果：(1)腹水效价：免疫荧光测定腹水效价为1：1000；(2)mAb亚类鉴定为小鼠IgG1型；(3)5C11在各细胞系上的表达见表1(A、B)，

表1A CD分子在淋巴细胞肿瘤细胞株伤的表达(阳性率，荧光对数)

        XG1     XG2          XG6          XG7     DaudiMAb89       -       99％   625   30％    20   -       99％   235C11        -       99％   745   25.5％  17   -       99％   22表1B CD40分子在在淋巴细胞上的表达

  PBMN  T       MQ      B        DC        Tonsil B

  CMAb89 5％+  -       90％+   98％+    96％+++   98％++5C11  5％+  -       90％+   98％+    96％+++   98％++Note：5C11 and mAb89 recognize the same CD40 distnbution pattern on a

  series of cell lines and on lymphocytes(Fluorescence intensity：

  +positive，++bright，+++very bright)

结果表明：5C11所识别的细胞谱系与Immunotech公司抗CD40mAb(克隆mAb89)相似；(4)单抗的抗体竞争试验结果，如图3所示，5C11能将XG2及Daudi上的CD40抗原位点100％封闭，与法国Immunotech公司CD40mAb识别位点相似；(5)western blot显示5C11能识别分子量在50KD左右的特异蛋白条带，如图4所示。

实施例2，激发型抗人CD40单克隆抗体用于B细胞体外扩增。

1.激发型抗人CD40单克隆抗体5C11和2G11的制备，采用实施例1所述。LCD32为转染FcγRII(人CD32)的鼠成纤维细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养(法国B.Klein博士赠送INSERM.U475)。扁桃体B细胞的制取，将外科手术的扁桃体除去包膜(标本获自苏州大学附属第一医院五官科)，压碎并筛网过滤，所得的单细胞悬液经两次E花环及Ficoll分离去除T细胞，再经贴壁培养2小时去除单核细胞，获得纯度＞98％的B细胞。

2.CD40体外培养系统的建立：将LCD32经丝裂霉素5×10⁷、50ug丝裂霉素/ml处理，洗涤后调至5×10⁴细胞/ml，分别加入5C11或2G111ug/ml及人重组IL-4 100U/ml(购自Diaclone公司法国)，人重组IL-2 500U/ml(购自上海华新公司)，人重组IL-6 1ng/ml及人重组FL 50ng/ml(购自Immugene公司美国)的不同组合，B细胞最终浓度为2×10⁵/ml，于24孔培养板中(购自Nunc公司)培养。于培养的5、10、15天计数(胎盘兰染色)。每隔5天在调整细胞浓度后，更换新鲜培养基、细胞因子及LCD32。每组作3个复孔。

结果表明：1.CD40分子在B细胞和B细胞肿瘤的表达：外周血单个核细胞(PBMNC)中极少部分细胞呈CD40弱阳性表达；而来源于外周血和扁桃体的B细胞均表达CD40分子；人MM细胞株异常高表达CD40，B淋巴细胞株细胞也均呈强阳性，而外周血T细胞不表达CD40分子，如图5所示。2.5C11+LCD32促进扁桃体B细胞的存活和成团族状生长：在B细胞培养体系中，加入抗CD40mAb5C11和转染人CD32(FcγR)的鼠L细胞，在培养的24小时后观察到B细胞成同源型聚集，继而呈大小不等的团族状，如图6所示。抗CD40mAb2G11具有与5C11类似的效应。3.5C11+LCD32培养体系虽能使B细胞在体外培养中存活和形成集落，但在扩增数量上并不明显。单在培养的24小时后即观察到B细胞成同源性聚集，继而呈大小不等变化，5C11+LCD32培养体系能够使B细胞在体外培养中存活和形成集落，而在B细胞培养体系中加入人重组IL-4(100U/ml)后，可显著地促使培养细胞在体外较长期的增殖，细胞数绝对值在培养后15天增加了3倍之多，而对照组的细胞在培养后第3天开始明显下降，在培养的第15天时所有的细胞均死亡，如图7所示。4.在B细胞培养体系中再加入人重组IL-2 500U/ml(购自上海华新公司)，人重组IL-6 1ng/ml及人重组FL 50ng/ml(购自Immugene公司美国)的不同组合，在培养体系中加入其它的一些细胞因子如IL-2、IL-6、Flt3L等可协同IL-4使B细胞增殖，但这种增殖作用必须依赖IL-4的存在。

实施例3。

1.激发型抗人CD40单克隆抗体5C11和2G11用于诱导树突状细胞分化成熟以及在体外激发T细胞的方法。

肿瘤患者或供血员新鲜外周血50～100ml用淋巴细胞分离液(F1coll/Paque)密度梯度离心分离得到单个核细胞(PBMNC)，将PBMNC按1×10⁷细胞/3ml/孔置于含10％胎牛血清的RPMI1640中培养(6孔培养板)，2小时后去除非贴壁细胞，贴壁生长的单核细胞中加入下列组合的细胞因子：人重组白细胞介素4(IL-4)100U/ml(购自法国Diaclone公司)、粒巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)1000U/ml(购自北京医科大学)、激发型抗人CD40D单克隆抗体CD40mAb-5C11 1μg/ml和TNFa 100U/ml(日本东京大学岛治教授赠送)，用相差显微镜观察细胞的形态变化，每隔3天计数细胞活率(胎盘兰染色)，并更换新鲜培养基。于培养的第七天检测DCs的诱导率及表型(CD11a和CD83表达阳性率)。第八天收集获得的树突状细胞DCs。

2.DCs对T细胞的激发。

混合淋巴细胞培养(MLR)：常规分离脐带血单个核细胞，将用不同方法诱导的DCs与脐带血单个核细胞按1∶20混合，即DCs：1×10⁴，脐带血单个核细胞2×10⁵加于96孔板，以与DCs来源同一供体的PBMNCs作为阴性对照、PHA作为阳性对照。5％CO₂、37℃培养72小时，加入MTT继续培养6小时，吸弃上清，酸化异丙醇溶解甲赞颗粒并测定570nm下的OD值。按下列公式计算刺激指数(Stimulate Index，SI)SI＝(实验组OD值)/(对照组OD值)。

5C11能代替TNFa和GM-CSF使外周单核细胞来源的DCs扩增和分化成熟，如图8所示；IL-4+GM-CSF与5C11不仅可以使外周单核细胞来源的DCs扩增和分化成熟，还可以使诱导的细胞数量显著增加，所诱导的DCsCD1a阳性率达80％，CD83阴性率达58％，证实5C11能通过对CD40分子的激发作用，介导外周单核细胞向DCs分化及增殖。用激发型抗人CD40单抗诱导的DCs具有明显的激发T细胞的作用，混合淋巴细胞反应结果显示，如图9所示，加用激发型抗CD40单抗后诱导的DCs具有明显的激发T细胞的功能，其刺激指数高于用IL-4+GM-CSF+TNFα诱导的DCs及PHA。

2.树突状细胞的应用方法

获得的DCs可直接回输机体用于治疗，或与肿瘤抗原共培养后回输机体，或在体外先激发机体T淋巴细胞(与机体外周血单个核细胞或T细胞混合培养)，激发后的T细胞再回输人体。

实施例4，激发型抗CD40单克隆抗体用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡或提高其免疫原性的方法。

1.肿瘤病人CD40阳性的肿瘤细胞：细胞株XG2是苏州大学生物技术研究所建立的多发性骨髓瘤细胞株，置于含10％胎牛血清及rIL-6 3ng/ml的RPMI1640(Gibical公司)中常规培养；B淋巴瘤细胞株Daudi(购自ATCC)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5％CO₂中长期培养。U266、8266为IL-6非依赖MM细胞株(均购自ATCC)，用含10％小牛血清的RPMI1640(Gibical公司)培养。

2.激发型抗人CD40单抗处理肿瘤细胞：将XG2、Daudi细胞株2×10⁵/ml培养于24孔板，加1～10微克/毫升不同浓度的单抗5C11或2G11，于培养的24hrs、48hrs、72hrs、96hrs计数(胎盘兰染色)以观察细胞增殖。每组作3个复孔。

3.细胞凋亡分析PI检测：2005g 10min离心收获1×106细胞，经PBS洗涤2次后，加入1ml的70％乙醇4°固定过夜。离心收集细胞，以PBS洗涤2次，再加入100ug/ml Rnase A，于37°放置30min，继而细胞置于含有34mmol/L的柠檬酸钠、50ug/ml碘化丙啶(Propidiumiodide)液体500ul中，避光于4°共育30min，用流式细胞仪的标准程序进行分析。Annexin-V标记按Boehringe公司的说明书进行，简述之：1×10⁶细胞用PBS洗涤两次，重悬于100ul标记液中[HEPESbuffer(HEPES/NaoH，ph7.4；140mM NaCl；and 5mM CaCl₂)含2μl annexin和2ul PI(50μg/ml)]，室温放置20min，用HEPES buffer洗两次，用流式细胞仪(Coulter)分析。

4.与免疫原性及抗原递呈相关的表面分子分析：包括MHC-II抗原、CD95(Fas)、CD80(B7)、CD54(ICAM-1)、CD58(ICAM-3)的分析。用单抗采用流式细胞仪测定。分别采用荧光素PE标记的鼠抗人MHC-DR、抗人CD95、抗人CD80、抗人CD54、抗人CD58的直标型单抗进行(均购自法国Immunotech公司)，阴性对照为荧光素PE标记的小鼠IgG。

5.T淋巴细胞的激发：用淋巴细胞分离液分离获得患者外周血单个核细胞，将其按10～20∶1与经激发型抗人CD40单抗处理(步骤2)的肿瘤细胞共培养，同时加入人重组白细胞介素-2(rhIL-2)1000U/毫升。培养7天，收集激发的T细胞。激发后的T细胞可输回机体以过继免疫治疗肿瘤。

6.T细胞体外杀伤试验：用51Cr标记法标记肿瘤细胞(参考曹雪涛主编.白细胞介素2的基础与临床，北京科学技术出版社，1990.183)，将胎盘兰染色有95％活力的XG2、Daudi细胞(1×10⁶/ml)用100微居⁵¹Cr在37℃水浴中标记1小时，再用含10％胎牛血清的RPM11640将细胞洗三遍，重悬于完全培养基中，按1∶10比例与新鲜分离的外周血单个核细胞或经步骤5收集的T细胞于96孔培养板共培养，(即肿瘤细胞1×10⁴，T细胞1×10⁵/100μl)。阴性对照孔仅加肿瘤细胞，阳性对照加入1％TritonX-100。于培养的72小时在γ记数仪上检测。

结果表明：1)抗CD40mAb 5C11使XG2及Daudi细胞发生同型聚集：在IL-6依赖性MM细胞株XG2及B淋巴瘤细胞株Daudi细胞的培养体系中加入1μg的5C11，在培养后24hrs，光镜下观察肿瘤细胞均呈明显的同型聚集，并在48hrs后细胞凝集成团如图10所示。2)5C11使XG2和Daudi细胞的生长抑制：在单抗处理后的XG2和Daudi细胞，光镜下其除发生同型聚集外，生长缓慢，经不同培养时间的细胞计数和凋亡率分析表明，5C11对XG2和Daudi细胞呈剂量依赖性生长抑制，在5μg/ml已达最大抑制剂量，如图11所示。3)5C11介导XG2细胞的凋亡：5C11处理后的XG2细胞，24hrs镜下观察其形态发生改变，细胞膜开始皱缩，细胞浆颗粒增多。随即用Annexln-V测定，发现细胞呈现凋亡，如图12所示。4)5C11处理增加了Daudi细胞的免疫原性：流式细胞仪分析显示XG2和Daudi细胞在激发型抗人CD40单抗处理后，发生一系列与免疫原性相关的粘附分子变化，如图13所示，XG2细胞株CD54明显增加，Daudi细胞在CD40分子激发后，CD58、CD95增加表达。5)激发型抗人CD40单抗5C11处理肿瘤细胞，增加其免疫原性，获得了具有特异性杀伤功能的T淋巴细胞。如图14所示，T细胞杀伤能力明显增加。

Claims (11)

1.一种激发型抗人CD40单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG2)为免疫原，免疫Balb/C小鼠；免疫小鼠脾脏细胞与小鼠SP2/0细胞株进行融和，以高表达CD40分子的肿瘤细胞株阳性对照和不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株(XG7、XG1)阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定，经复筛及亚克隆后获得稳定分泌特异鼠抗人CD40杂交瘤细胞株，并再体外持续传代，分批冻存；规模化细胞培养或生产腹水、分离纯化和单抗的特性鉴定并获得激发型抗人CD40单抗纯品。

2.如权利要求1所述的CD40单克隆抗体的制备方法，其特征在于高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG2阳性对照和不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG7阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定；继而用高表达CD40分子的B淋巴瘤细胞株Daudi阳性对照和不表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株XG1阴性对照，作进一步筛选和鉴定。

3.如权利要求1所述的CD40单克隆抗体的制备方法，其特征在于采用有限稀释法亚克隆。

4.激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11和2G11)用于B细胞体外扩增。

5.激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11和2G11)用于诱导树突状细胞DCs分化成熟以及在体外激发T细胞。

6.激发型抗CD40单克隆抗体(5C11和2G11)用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡和提高其免疫原性。

7.如权利要求4所述的抗人CD40单克隆抗体5C11或2G11用于B细胞体外扩增的方法，其特征在于在B细胞培养体系中，加入经丝裂霉素5×10⁷、50ug丝裂霉素/ml处理洗涤后LCD32 5×10⁴细胞/ml，5C11或2G11 1ug/ml及人重组IL-4 100U/ml(购自Diaclone公司法国)。

8.如权利要求7所述的抗人CD40单克隆抗体5C11或2G11用于B细胞体外扩增的方法，其特征在于在B细胞培养体系中再加入人重组IL-2 500U/ml(购自上海华新公司)，人重组IL-6 1ng/ml及人重组FL 50ng/ml(购自Immugene公司美国)的不同组合。

9.如权利要求5所述的激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11和2G11)用于诱导树突状细胞DCs分化成熟以及在体外激发T细胞的方法，其特征在于取肿瘤患者或供血员新鲜外周血50～100ml用淋巴细胞分离液(Ficoll/Paque)分离得到外周血单个核细胞(PBMNC)，将PBMNC贴壁培养、去除非贴壁细胞，在贴壁生长的单核细胞中加入细胞因子：人重组IL-4 100～1000U/ml、粒巨细胞集落刺激因子GM-CSF 1000U/ml和激发型抗人CD40单抗CD40mAb-5C11或2G11 1～10μg/ml，若干天后收集获得树突状细胞(DCs)。

10.如权利要求6所述的激发型抗CD40单克隆抗体(5C11和2G11)用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡和提高其免疫原性的方法，其特征在于：

(1).在肿瘤病人CD40阳性的肿瘤细胞中加入激发型抗人CD40单抗5C11或2G11 1～10微克/毫升，培养24～96小时。

(2).T淋巴细胞的激发：用淋巴细胞分离液分离获得患者外周血单个核细胞，将其按10～20∶1与经激发型抗人CD40单抗处理(步骤1)的肿瘤细胞共培养，同时加入人重组白细胞介素-2(rhIL-2)500～1000U/毫升，培养7～14天，激发后的T细胞可回输机体以过继免疫治疗肿瘤。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于步骤(1)中激发型抗人CD40单抗5C11或2G11的加入量为5微克/毫升。

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