CN114380911B

CN114380911B - 靶向人cd40抗原的人源化单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114380911B
Application number: CN202210031835.8A
Authority: CN
Inventors: 张学光; 黄子逸; 傅丰庆
Original assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: WO2023134520A1; CN114380911A

Abstract

本发明提供一种激发型抗人CD40分子的人源化单克隆抗体，所述抗人CD40单克隆抗体为huXG40，包括重链和轻链，所述huXG40的重链可变区VH的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；huXG40的轻链可变区VL的氨基酸序列为SEQ ID NO.2相同；该人源化抗体能有效抑制结肠癌小鼠肿瘤生长，介导CD8+T淋巴细胞向肿瘤组织浸润，为靶向CD40分子的肿瘤免疫治疗提供必要的物质基础。

Description

靶向人CD40抗原的人源化单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向人CD40抗原的人源化单克隆抗体及其应用，即一种激发型人源化单克隆抗体，可特异性识别人CD40分子，动物实验证实该单克隆抗体可促进T淋巴细胞向肿瘤组织浸润，能够抑制小鼠肿瘤生长。

背景技术

CD40属于TNF受体超家族，广泛分布于单核细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞、内皮细胞、造血前体细胞以及B淋巴细胞上。研究发现，一定程度的激发CD40分子可抑制某些B细胞恶性肿瘤的体外增殖，在EBV+的恶性淋巴瘤中，活化的CD40通过诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长。CD40配体主要表达于活化的CD4+T细胞表面。CD40和CD40L的相互作用可以诱发CD40分子的聚集，从而启动CD40分子的信号转导，活化B细胞，调节体液免疫,增加T细胞、DC和巨噬细胞功能，诱导细胞因子产生，调节细胞免疫。

利用单克隆抗体研究CD40信号通路，对于阐明肿瘤、免疫缺陷病、自身免疫病等疾病的发病机制以及临床治疗具有非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向人CD40抗原的人源化单克隆抗体及其应用，从而为肿瘤细胞免疫治疗提供新靶点；并挖掘CD40单克隆抗体作为单独治疗或与其他药物联合用药的临床价值。

本发明所提供的靶向人CD40分子的人源化单克隆抗体，为huXG40抗体，包括有重链和轻链，其中重链可变区(VH)的氨基酸序列如下：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGFTFTTYVIQWVKQRPGQGLEWIGSIQPYNDFTKYNEKFKGKATLTSDKSSNTAYMELSSLTSEDSALYYCVRWGEGNFWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1)；

轻链可变区(VL)的氨基酸序列如下：

DIVMTQTPLSLSVSLGDQVSISCRSSQTLVNSNGQTYLHWYLQKPGQSPKVLIYQLSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCTQSTRVPYCFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)。

另一个方面，本发明所提供的huXG40抗体还可用于制备靶向人CD40分子的的制品；

本发明还提供了一种药物组合物，其中包含有本发明的huXG40抗体。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明所提供的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明所提供的激发型抗人CD40分子的人源化单克隆抗体能有效抑制结肠癌小鼠肿瘤生长，介导CD8+T淋巴细胞向肿瘤组织浸润，为靶向CD40分子的肿瘤免疫治疗提供必要的物质基础。

附图说明

图1：抗人CD40单抗huXG40蛋白电泳染色鉴定图；

图2：huXG40单克隆抗体竞争结合母本鼠源CD40单抗的抗原位点图，用于比较不同浓度的人源CD40抗体huXG40与鼠源mXG40竞争结合L929/CD40转基因细胞的能力；其中A为L929/CD40细胞，B为阴性对照单加PE标记羊抗鼠二抗；C为阴性对照单加PE标记羊抗人二抗；D为阳性对照人源抗体huXG40；E为5.0μg huXG40+1μg mXG40；F为2.5μg huXG40+1μgmXG40；G为0.5μg huXG40+1μg mXG40；H为0.1μg huXG40+1μg mXG40；

图3：人源化CD40单抗huXG40亲和力检测图，其中ka为结合常数，kd为解离常数，KD为亲和常数；

图4：抗CD40单抗huXG40能够识别人CD40分子(hCD40)的实验图，

图A为FCM检测huXG40对Daudi细胞上CD40分子的识别图，其中阴性对照为同型对照Isotype Control，阳性对照为商品化人CD40抗体Biolegend Anti-hCD40 Ab 0.2μg/mL；三个浓度梯度huXG40：0.1μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL；

图B为CD40人源化小鼠脾脏细胞活化及流式检测图，其中阳性对照为商品化人CD40抗体Biolegend Anti-hCD40 Ab 1μg/mL；三个浓度梯度huXG40：0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL；

图5：抗CD40单抗诱导CD40人源小鼠骨髓来源的巨噬细胞表达D80、CD86的效果图；

图6：抗人CD40单抗治疗结肠癌CRC小鼠及肿瘤浸润CD8+T细胞的数量变化图，其中A为小鼠尾静脉注射抗人CD40单抗200ug/只，横坐标天数，纵坐标为肿瘤体积(mm³)，阴性对照为PBS；

B为PBS组与抗体治疗组(Anti-CD40 Ab)小鼠肿瘤重量(g)；

C为PBS组与抗体治疗组(Anti-CD40 Ab)肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞百分比。

具体实施方式

本发明说明书中筛选靶向人CD40分子的人源化单克隆抗体，以及验证其功能的总体步骤如下：

1、流式细胞术鉴定抗人CD40单抗

选用L929/CD40细胞株作为检测细胞，收集huXG40纯化抗体作为一抗，以PE标记的羊抗人Fc段抗体作为二抗，利用流式细胞仪对其进行检测。

2、Protein G亲和层析柱分离纯化huXG40和Lowy法定量

采用CHO真核细胞表达huXG40单抗，起始细胞浓度调整至2×10⁶/ml并培养7d后收集表达上清，经超滤浓缩系统浓缩，按Phamacia公司提供的方案，采用Protein G亲和层析柱分离纯化后经Lowy法定量，抗体过滤除菌后分装于-20℃保存。

3、蛋白电泳对huXG40重链和轻链的鉴定和纯度的初步检测

纯化后的抗体经12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考马斯亮蓝染色过夜，脱色液脱色后，成像摄片，设标准蛋白为分子量对照，比对分子量大小。

4、huXG40抗原结合表位的鉴定

将L929/CD40细胞株和已制备的抗人CD40人源抗体(huXG40)于4℃反应40min，充分洗涤后，再和母本鼠源抗体mXG40于4℃反应40min，充分洗涤后，加入PE-羊抗小鼠二抗，流式细胞术检测。

5、huXG40识别Daudi细胞和人源小鼠脾细胞表面的CD40分子

取对数生长期的Daudi细胞与huXG40单抗及相应的同型对照IgG在4℃孵育40min，洗涤后再加入二抗4℃孵育20min，PBS缓冲液洗涤2次后，重悬细胞并经流式细胞仪检测细胞表面CD40的表达。分离CD40人源小鼠脾细胞，参照上述方法流式检测抗体识别人源小鼠脾细胞表面CD40分子。

6、抗CD40单抗诱导人源化CD40小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)表达CD80，CD86

取CD40人源小鼠的骨髓细胞，用PBS重悬后1200rpm 5min离心，弃上清。配制添加(20ng/ml)小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的DMEM培养基，培养4天诱导BMDM，使用CD40单抗huXG40处理24h，anti-CD80和anti-CD86抗体染色后流式分析CD80和CD86表达水平。

7、分析抗人CD40单抗对结肠癌CRC的影响

构建MC-38结肠癌荷瘤小鼠模型，尾静脉注射抗人CD40单抗或PBS，监测肿瘤大小同时分析大剂量抗CD40单抗huXG40对结肠癌小鼠CD8+T细胞浸润情况。

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。本发明具体实施例中所使用的主要试剂有：人源抗体CD40(huXG40)、鼠源抗体CD40(mXG40)；PBS、1640培养基、胎牛血清、PE-羊抗人Fc二抗、PE-鼠抗人Fc二抗、CD40抗原蛋白均为市售产品，此外下述具体实施例中所采用的未特别提及的试剂、操作工具和仪器等均为本领域常规试剂、操作工具和仪器，不再赘述。

实施例1：流式细胞术鉴定人源化CD40单抗与母本鼠源抗体竞争识别抗原表位

选用L929/CD40细胞株作为检测细胞，收集huXG40纯化抗体作为一抗，以PE标记的羊抗人Fc段抗体作为二抗，利用流式细胞仪对其进行检测。采用CHO真核细胞表达huXG40单抗，起始细胞浓度调整至2×10⁶/ml并培养7d后收集表达上清，经超滤浓缩系统浓缩，按Phamacia公司提供的方案，采用Protein G亲和层析柱分离纯化后经Lowy法定量，抗体过滤除菌后分装于-20℃保存。纯化后的抗体经12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考马斯亮蓝染色过夜，脱色液脱色后，成像摄片，设标准蛋白为分子量对照，比对分子量大小。

纯化后的huXG40 SDS-PAGE电泳显示人CD40抗体重链和轻链位置和大小(图1)。测序确定huXG40抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列如下：

轻链可变区(VL)的氨基酸序列如下：

为了鉴定人源CD40单抗huXG40与母本鼠源CD40单抗mXG40识别抗原位点的差异，收集L929/CD40转基因细胞，PBS洗涤后重悬调整细胞浓度为5×10⁵/管，采用免疫荧光标记竞争实验，加入不同浓度梯度的第一种抗体人源CD40单抗huXG40(5.0μg,2.5μg,1.0μg,0.5μg/管)，4℃作用40min并用PBS洗涤两遍后，加入第二种鼠源CD40单抗mXG40(1.0μg/管)4℃作用40min，PBS洗涤两遍，PE标记羊抗鼠IgG抗体作为二抗4℃反应20min，PBS洗涤两遍后流式细胞仪分析。

结果显示，5.0μg,2.5μg浓度的人源化单抗huXG40可有效阻断母本鼠源单抗mXG40与转基因细胞上CD40分子的特异性结合，当第一种抗体浓度降低至1.0μg和0.5μg，此阻断效应也随之减弱，提示本研究获得的1株人源单抗与鼠源CD40抗体识别不同的CD40抗原表位(图2)。

实施例2：人源化CD40单抗与抗原结合能力及亲和力检测

将CD40抗原蛋白配成100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM和1.56nM梯度稀释的7个浓度，96孔板上样，选择人Protein G探针，固定相为抗原，流动相为人CD40单抗huXG40，根据实验方案将结合时间设定为180s，解离时间为300s。

检测人源单抗的结合及解离常数，计算亲和力，确定huXG40亲和常数(KD)为7.54E-10(图3)。

实施例3：抗CD40单抗huXG40能够识别hCD40分子

取对数生长期的Daudi细胞与huXG40及相应的同型对照IgG在4℃孵育40min，洗涤后再加入相应的二抗4℃孵育20min，用PBS缓冲液洗涤2次后，重悬细胞并经流式细胞仪检测细胞表面CD40的表达。流式分析结果显示，本研究构建的huXG40能识别、结合Daudi细胞表面CD40分子。进一步利用CD40人源化小鼠对huXG40抗体进行鉴定，取人源小鼠脾脏细胞，按照上述流式检测方案证实，huXG40可识别人源小鼠脾细胞CD40分子(图4)。

实施例4：抗人CD40人源化抗体在体外具有良好的激发功能

1)诱导BMDM：取人源化CD40小鼠股骨和胫骨骨髓，使用红细胞裂解液裂解红细胞后，将骨髓细胞转移至含10％胎牛血清和20ng/mL小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的DMEM中培养基中，置于37℃5％的二氧化碳培养箱中培养4d；

2)使用CD40单抗处理细胞：诱导BMDM成功后，使用0.5μg/mL和5μg/mL抗CD40单抗处理处理细胞24h；

3)染色分析：染色前先用anti-CD16/32抗体孵育细胞15min，阻断非特异性抗体与细胞的结合，然后用anti-CD80和anti-CD86流式抗体染色，4℃避光室温孵育30分钟，染色完成后使用流式细胞仪对细胞进行分析，并使用FlowJo对数据进行分析。

结果显示，与对照组相比，抗CD40单抗处理的BMDM的CD86表达显著增加(图5)。

实施例5：抗人CD40单抗治疗CRC小鼠及肿瘤浸润CD8+T细胞的数量变化检测

1)构建MC-38荷瘤小鼠模型：取6-8周龄、同性别的人源化CD40小鼠(n＝3)，将10⁶个MC-38细胞种植于小鼠背部。待肿瘤体积约为50mm³时，尾静脉给予荷瘤小鼠抗人CD40单抗(200ug/只)或磷酸盐缓冲液(PBS)治疗；

2)监测肿瘤大小：每两天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)、短径(b)和高度(c)，按照V＝a×b×c公式计算肿瘤体积。测量小鼠肿瘤体积并记录；

3)分析肿瘤组织：在造模结束后，处死小鼠分离肿瘤组织，称取肿瘤重量。将每个肿瘤取相同质量进行研磨，并使用70μm的滤膜过滤制成单细胞悬液。用anti-CD16/32抗体孵育细胞15min，阻断非特异性抗体与细胞结合，然后使用anti-CD45、anti-CD3、anti-CD8流式抗体进行染色，4℃避光室温孵育15-30分钟，随后使用流式细胞仪检测肿瘤组织中免疫细胞浸润情况，并使用FlowJo对数据进行分析。

结果显示，与对照组相比，抗人CD40单抗显著地抑制MC-38细胞生长(图6A)，肿瘤重量明显减轻(图6B)，同时抗人CD40单抗治疗组肿瘤组织中的CD8⁺T细胞浸润明显增加(图6C)。

序列表

<110> 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司

<120> 靶向人CD40抗原的人源化单克隆抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Gln Pro Tyr Asn Asp Phe Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Trp Gly Glu Gly Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Gln Leu Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Thr Gln Ser

85 90 95

Thr Arg Val Pro Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种靶向人CD40分子的人源化单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体包含有重链和轻链，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备靶向人CD40分子的制品中的应用。