CN113549599B - 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用 - Google Patents

靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113549599B
CN113549599B CN202110820716.6A CN202110820716A CN113549599B CN 113549599 B CN113549599 B CN 113549599B CN 202110820716 A CN202110820716 A CN 202110820716A CN 113549599 B CN113549599 B CN 113549599B
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
cell
cells
cxcr5
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110820716.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113549599A (zh
Inventor
杜红伟
赵海芳
郑骏年
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xuzhou Medical University
Original Assignee
Xuzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou Medical University filed Critical Xuzhou Medical University
Priority to CN202110820716.6A priority Critical patent/CN113549599B/zh
Publication of CN113549599A publication Critical patent/CN113549599A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113549599B publication Critical patent/CN113549599B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明提供一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR‑T细胞、核酸、载体、慢病毒以及CAR‑T细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。本发明第一方面提供一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括靶向CXCR5的抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域来源于人CXCL13，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明提供的CAR‑T细胞可以靶向并杀灭CXCR5高表达的肿瘤细胞，并防止肿瘤复发，可用于制备治疗肿瘤的药物中。

Description

靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞、核酸、载体、慢病毒及CAR-T 细胞的应用
技术领域
本发明涉及一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞、核酸、载体、慢病毒以及CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗是通过基因工程技术使T淋巴细胞表达特异性抗体的结合位点，使其不依赖主要组织相容性复合体递呈来识别肿瘤相关抗原，从而杀伤肿瘤细胞。目前特异性靶向CD19的CAR-T细胞疗法，在血液肿瘤中已取得了良好的治疗效果。然而由于癌细胞中的CD19基因表达水平降低，或CD19突变导致CAR-T细胞不能再识别癌细胞，会导致癌细胞逃逸，从而导致50％左右的患者复发。因此，寻找新的癌细胞特异性抗原，并研发靶向该类抗原的CAR-T细胞，具有非常重要的临床应用价值。
CXCR5是趋化因子CXCL13的受体，在成熟B细胞和小部分T细胞，即Tfh细胞中表达，但在B细胞前体细胞和浆细胞中不表达。与CD19在所有B细胞中表达相比，CXCR5在B细胞血液肿瘤中的表达特异性更好，是CAR-T治疗的一个更好靶点。
鉴于以上原因，我们利用CXCL13和CXCR5的特异性相互作用，用CXCL13作为CXCR5的特异抗原结合结构域，研发了靶向CXCR5的CAR-T，并在多种肿瘤模型中评估了其抗肿瘤活性。
发明内容
本发明提供一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞，该CAR-T细胞能够表达靶向CXCR5的嵌合抗原受体，特异性的识别和杀伤CXCR5高表达的肿瘤细胞，适用于相应肿瘤疾病的治疗。
本发明还提供一种包括上述嵌合抗原受体编码序列的核酸以及包括该核酸的载体和慢病毒。
本发明第一方面提供一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括靶向CXCR5的抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内结构域，其中，
所述抗原结合结构域来源于人CXCL13，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种CAR-T细胞，能够表达靶向CXCR5的嵌合抗原受体，图1为本发明提供的嵌合抗原受体的设计示意图，如图1所示，该嵌合抗原受体包括靶向CXCR5的抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内结构域，其中，位于胞外的抗原结合结构域来源于人CXCL13，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明根据CXCL13和CXCR5的特异性相互作用，设计了一种CAR-T细胞，该细胞能够靶向并杀灭CXCR5高表达的肿瘤细胞，并防止肿瘤复发，可用于制备治疗肿瘤的药物中，提高肿瘤疾病的治疗效果。
进一步地，所述铰链区和跨膜结构域选自CD8α的铰链区和跨膜结构域，具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
进一步地，所述胞内共刺激结构域选自CD28的胞内共刺激结构域，具有如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
进一步地，所述胞内结构域选自CD3ζ的胞内结构域，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
进一步地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供一种核酸，所述核酸包括本发明第一方面提供的嵌合抗原受体的编码序列。
本发明第三方面提供一种载体，所述载体包括本发明第二方面提供的核酸。
本发明第四方面提供一种慢病毒，所述慢病毒包括本发明第三方面提供的载体。
本发明第五方面提供上述任一所述的CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为CXCR5阳性。
本发明提供的CAR-T细胞可以靶向并杀灭CXCR5高表达的肿瘤细胞，并防止肿瘤复发，可用于制备治疗肿瘤的药物中，提高肿瘤疾病的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的嵌合抗原受体的设计示意图；
图2为CXCL13-CAR-T细胞流式检测结果；
图3为构建得到的293T-WT、293T-CXCR3和293T-CXCR5这三种293T细胞系流式细胞仪检测结果；
图4为NT、CXCL13-CAR-T细胞与293T-WT、293T-CXCR3和293T-CXCR5三种293T细胞系共培养5天后，T细胞(CD3+)和剩余癌细胞(GFP+)的流式细胞仪检测结果；
图5为NT、CXCL13-CAR-T细胞与293T-WT、293T-CXCR3和293T-CXCR5三种293T细胞系共培养5天后，IFNγ和IL2的检测结果；
图6为CA46、SU-DHL-6和Daudi这三种B淋巴瘤细胞中CXCR5表达情况的流式细胞仪检测结果；
图7为NT、CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养5天后残留癌细胞的比例示意图；
图8为NT、CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后上清液中IFNγ和IL-2的含量检测结果；
图9为荷瘤小鼠分别注射NT或CXCL13-CAR-T细胞后的IVIS成像图片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释：
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒的细胞。
术语“结构域”是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域。
术语“共刺激”是指淋巴细胞激活第二信号的来源，共刺激通常由参与适应性免疫的免疫细胞(例如T细胞)表面共刺激分子及其受体相互作用而产生。
术语“铰链区”是组成IgG、IgA和IgD类免疫球蛋白分子的一种结构域，位于CH1和CH2间，连接Fab和Fc段，或者连接如CD8、CD4、PD1等膜蛋白的胞外功能结构域与跨膜区之间的区段。该区段富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。
术语“CXCL13”也称为B淋巴细胞趋化因子，是CXCR5趋化因子受体的配体。上述趋化因子和受体在恶性肿瘤的转移和侵袭的调节中表现出作用。与正常组织相比，CXCL13和CXCR5在多种癌组织类型中为局部上调。在这些恶性肿瘤的患者的血清中CXCL13水平也会升高，另外，可溶性CXCL13趋化因子在体内和体外都可以增强恶性肿瘤细胞的增殖和迁移。
术语“CD8α”是T淋巴细胞表面表达的糖蛋白，在免疫系统中介导细胞之间相互作用。CD8抗原作为T淋巴细胞中T细胞受体的共受体，共同识别抗原递呈细胞呈递的抗原信息。
术语“CD28”是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，可与B细胞表面的CD80结合，可促进T细胞的增殖分化，是T细胞活化的第二信号。
术语“CD3ζ”是I型跨膜蛋白，是T细胞抗原受体复合体的一部分，参与T细胞激活。
术语“慢病毒载体”是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
术语“293T细胞”是293细胞通过基因技术派生出的细胞系，瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。
术语“治疗”是指减轻或消除病症和/或伴随的症状的方法。
术语“肿瘤”是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。
术语“淋巴瘤”是指免疫系统的淋巴细胞的恶性肿瘤。
术语“转染”是指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞。
术语“感染”是指在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。
实施例1靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞的制备
1-1、携带嵌合抗原受体的编码序列的慢病毒载体的制备
利用基因合成技术，根据GeneBank:NM_001371558.1提供的人CXCL13蛋白的mRNA序列，合成人CXCL13基因的cDNA全长序列，人CXCL13基因具有如SEQ ID NO:6所示的序列，表达靶向CXCR5的抗原结合结构域CXCL13，编码CD8α铰链区和跨膜结构域的核酸具有如SEQID NO:7所示的序列，编码CD28胞内共刺激结构域的核酸具有如SEQ ID NO:8所示的序列，编码CD3ζ胞内结构域的核酸具有如SEQ ID NO:9所示的序列，通过XbaI和BamHI酶切后克隆入慢病毒载体，构建得到pCDH-CXCL13-CD8α-CD28-CD3ζ载体，该载体包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
此外，在靶向CXCR5的抗原结合结构域，即CXCL13的基础上，本领域技术人员可根据常规技术手段替换CAR结构中的铰链区(例如IgG-Fc、CD4)、跨膜结构域、胞内共刺激结构域(如4-1BB、HVEM、OX40、ICOS、CD80、CD86、TIM3、LAG3等)和胞内结构域(如Fc-receptor、BCR)，得到基因序列不同的嵌合抗原受体。
1-2、含有上述慢病毒载体的慢病毒制备
将5×106293T细胞接种于10cm的细胞培养皿中，16小时之后，将4μg构建得到的慢病毒载体、4μg psPAX2质粒和2μg pHCMV-HDRD质粒混合，然后将混合物与GeneJuice转染试剂(购自Merck Millipore)混匀，静置10分钟，然后转染293T细胞；转染48小时之后，收集含有慢病毒的培养上清，用0.45μm过滤器过滤后在-80℃下冻存待用。
1-3、CAR-T细胞的制备和体外扩增
从健康的志愿者外周血中分离PBMC淋巴细胞，然后加入CD3和CD28抗体包被的24孔板中，1×106个细胞每孔。24小时之后，加入IL7和IL15(5ng/mL)，刺激两天后收集T细胞，计数待用。
用上述慢病毒感染刺激好的T细胞，具体感染步骤如下：取1mL表达含有嵌合抗原受体的慢病毒上清，加入retronectin包被的24孔板中，2000g离心1.5小时，离心结束后弃上清，加入5×105个刺激好的T细胞，1000g离心10min，将细胞置于37℃细胞培养箱中培养，72小时后更换新鲜培养基，此后，每两天更换一次培养基，感染4天后，取5×105个细胞，用抗CXCL13的抗体(R&D systems.)染CAR-T细胞表面的CAR，并用流式细胞仪检测嵌合抗原受体的表达情况。
为了便于表述，将能够表达靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞命名为CXCL13-CAR-T细胞，图2为CXCL13-CAR-T细胞流式细胞仪检测结果，如图2所示，88％以上的CAR-T细胞是CXCL13阳性，说明CXCL13-CAR-T细胞可高表达该嵌合抗原受体。
之前有文章报道CXCL13也是CXCR3的配体，为了验证CXCL13-CAR-T细胞的特异性，我们将293T-WT、293T-CXCR3和293T-CXCR5这三种293T细胞系(如图3所示)，与对照T细胞(未被慢病毒感染的T细胞，NT)和CXCL13-CAR-T细胞共培养，T细胞与癌细胞比例为1:1，共培养5天后，将T细胞和293T细胞全部收集，分别用CD3抗体和GFP标记T细胞和癌细胞，然后用流式细胞仪检测残留癌细胞的比例，并使用ELISA检测IFNγ和IL-2的量。
图4为NT、CXCL13-CAR-T细胞与293T-WT,293T-CXCR3和293T-CXCR5三种293T细胞系共培养5天后，T细胞(CD3+)和剩余癌细胞(GFP+)的流式细胞仪检测结果，如图4所示，CXCL13-CAR-T细胞特异性杀伤过表达CXCR5的293T细胞，而对野生型293T和过表达CXCR3的293T细胞并无杀伤作用。以上结果表明，CXCL13并不与CXCR3结合，而只特异的与CXCR5结合，因此CXCL13-CAR-T只特异杀伤CXCR5阳性细胞。
图5为NT、CXCL13-CAR-T细胞与293T-WT、293T-CXCR3和293T-CXCR5三种293T细胞系共培养5天后，IFNγ和IL2的检测结果，其中，a为IFNγ的检测结果，b为IL2的检测结果，如图5所示，CXCL13-CAR-T细胞与293T-CXCR5细胞共培养后释放出大量的细胞因子IFNγ和IL2，也进一步验证了CXCL13-CAR-T细胞能够特异性识别并靶向杀伤CXCR5+细胞。
为了检测CXCL13-CAR-T细胞杀伤CXCR5+癌细胞的能力，将CA46、SU-DHL-6和Daudi这三种CXCR5+B淋巴瘤细胞(如图6所示)与对照T细胞(未被慢病毒感染的T细胞，NT)、CXCL13-CAR-T细胞共培养，对照T细胞/CXCL13-CAR-T细胞与癌细胞比例均为1:5，共培养5天后，收集所有细胞，分别用CD3-APC和CD19-PE(Biolegend)的抗体来标记T细胞和癌细胞，然后用流式细胞仪检测残留癌细胞的比例。
图7为NT、CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养5天后残留癌细胞的比例示意图，如图7所示，共培养5天后，CXCL13-CAR-T细胞能完全将这三种B淋巴瘤细胞清除。
在采用上述方法共培养24小时后取上清，用ELISA检测IFNγ和IL-2的含量，具体包括如下步骤：将B细胞淋巴瘤细胞CA46、SU-DHL-6和Daudi以5×105每孔加入24孔细胞培养板中，同时加入1×105NT、CXCL13--CAR-T细胞，T细胞与癌细胞的比例为1:5，每孔2mL细胞培养基，共培养24小时后，收集1mL上清，用IFNγ和IL2的ELISA试剂盒(Mabtech)检测共培养上清中这两种细胞因子的量。
图8为NT、CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后上清液中IFNγ和IL-2的含量检测结果，其中，a为NT、CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后上清液中IFNγ的含量检测结果，b为NT、CXCL13-28ζ-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后上清液中IL-2的含量检测结果，如图8所示，NT与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后上清液中几乎检测不到IFNγ和IL-2，而CXCL13-CAR-T细胞与三种CXCR5+B淋巴瘤细胞共培养24h后检测到大量的细胞因子IFNγ和IL-2，进一步验证了CXCL13-CAR-T细胞能够识别并靶向杀伤这三种B淋巴瘤细胞。
为了检测CXCL13-CAR-T细胞在体内杀伤B淋巴瘤细胞的能力，将过表达萤光素酶的Daudi淋巴瘤细胞通过尾静脉注射入NCG(NOD/ShiltJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt)小鼠体内，每只小鼠注射2×106个Daudi细胞，构建小鼠的淋巴瘤模型。4天后，用NT或CXCL13-CAR-T细胞对荷瘤小鼠进行治疗，每只小鼠注射10×106个T细胞，每周通过IVIS仪器监测肿瘤生长情况。
图9为荷瘤小鼠分别注射NT或CXCL13-CAR-T细胞后的IVIS成像图片，如图9所示，CXCL13-CAR-T细胞能够完全杀伤并清除小鼠体内的肿瘤细胞，并在后续7周的跟踪监测中，所有CXCL13-CAR-T处理的小鼠，未观察到肿瘤复发现象。以上结果表明CXCL13-CAR-T细胞可以在小鼠肿瘤模型中高效杀伤CXCR5阳性肿瘤细胞，并且防止复发。
综上，CXCL13-CAR-T细胞可以替代CD19-CAR-T细胞治疗复发难治CXCR5阳性肿瘤，如B细胞血液肿瘤，或Tfh癌变导致的T细胞血液肿瘤等，而且，CXCL13-CAR-T细胞可以为经过CD19-CAR-T细胞治疗后复发的病人提供二次治疗，从而提高治愈率。CAR分子通常是来源于小鼠的特异性单克隆抗体的可变区序列，在人体内具有免疫原性，因此CAR-T在回输入人体后容易被自身免疫系统识别为外源物质从而被免疫系统清除，不利于CAR-T在体内的长期生存，因此不能起到在体内长期监控的作用，这也是导致肿瘤复发的一个重要原因，同时也是导致相同CAR-T二次治疗不具有明显治疗效果的主要原因，而CXCL13是人自身表达的蛋白，在人体内不具有免疫原性，不会被人免疫系统识别而被清除，因此具有在体内长期生存的先天优势，从而可以起到长期监控，减少复发的巨大优势。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞、核酸、载体、慢病毒及CAR-T细胞的应用
<130> CNCNP202109677
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> 人（homo sapiens）
<400> 1
Met Glu Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser
1 5 10 15
Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg
20 25 30
Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile
35 40 45
Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu
50 55 60
Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro
100 105
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> 人（homo sapiens）
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> 人（homo sapiens）
<400> 3
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人（homo sapiens）
<400> 4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工合成（Artificial）
<400> 5
Met Glu Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser
1 5 10 15
Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg
20 25 30
Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile
35 40 45
Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu
50 55 60
Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro Thr Thr Thr
100 105 110
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
115 120 125
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
130 135 140
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
145 150 155 160
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
165 170 175
Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
180 185 190
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
195 200 205
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
210 215 220
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
225 230 235 240
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
245 250 255
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
260 265 270
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
275 280 285
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
290 295 300
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
305 310 315 320
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
325 330
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> 人（homo sapiens）
<400> 6
atggagttca tctcgacatc tctgcttctc atgctgctgg tcagcagcct ctctccagtc 60
caaggtgttc tggaggtcta ttacacaagc ttgaggtgta gatgtgtcca agagagctca 120
gtctttatcc ctagacgctt cattgatcga attcaaatct tgccccgtgg gaatggttgt 180
ccaagaaaag aaatcatagt ctggaagaag aacaagtcaa ttgtgtgtgt ggaccctcaa 240
gctgaatgga tacaaagaat gatggaagta ttgagaaaaa gaagttcttc aactctacca 300
gttccagtgt ttaagagaaa gattccc 327
<210> 7
<211> 207
<212> DNA
<213> 人（homo sapiens）
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207
<210> 8
<211> 123
<212> DNA
<213> 人（homo sapiens）
<400> 8
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 9
<211> 339
<212> DNA
<213> 人（homo sapiens）
<400> 9
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 10
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial）
<400> 10
atggagttca tctcgacatc tctgcttctc atgctgctgg tcagcagcct ctctccagtc 60
caaggtgttc tggaggtcta ttacacaagc ttgaggtgta gatgtgtcca agagagctca 120
gtctttatcc ctagacgctt cattgatcga attcaaatct tgccccgtgg gaatggttgt 180
ccaagaaaag aaatcatagt ctggaagaag aacaagtcaa ttgtgtgtgt ggaccctcaa 240
gctgaatgga tacaaagaat gatggaagta ttgagaaaaa gaagttcttc aactctacca 300
gttccagtgt ttaagagaaa gattcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 360
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 420
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 480
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggagt 540
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 600
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 660
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 720
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 780
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 840
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 900
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 960
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 996

Claims (7)

1.一种靶向CXCR5阳性细胞的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括靶向CXCR5的抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内结构域，其中，
所述抗原结合结构域来源于人CXCL13，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述铰链区和跨膜结构域选自CD8α的铰链区和跨膜结构域，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
所述胞内共刺激结构域选自CD28的胞内共刺激结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述胞内结构域选自CD3ζ的胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸包括权利要求1-2任一项所述嵌合抗原受体的编码序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求3所述的核酸。
5.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包括权利要求4所述的载体。
6.权利要求1-2任一项所述的CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为CXCR5阳性。
CN202110820716.6A 2021-07-20 2021-07-20 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用 Active CN113549599B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110820716.6A CN113549599B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110820716.6A CN113549599B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113549599A CN113549599A (zh) 2021-10-26
CN113549599B true CN113549599B (zh) 2024-02-20

Family

ID=78103508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110820716.6A Active CN113549599B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113549599B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111378625A (zh) * 2020-03-18 2020-07-07 华东师范大学 一种cxcl13趋化型car－t细胞的制备和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111094349A (zh) * 2017-08-23 2020-05-01 马克思-德布鲁克-分子医学中心亥姆霍兹联合会 嵌合抗原受体和结合cxcr5的car-t细胞

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111378625A (zh) * 2020-03-18 2020-07-07 华东师范大学 一种cxcl13趋化型car－t细胞的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113549599A (zh) 2021-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112142854B (zh) 免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用
CN108752482B (zh) 携带截短或未截短的髓样细胞触发性受体信号结构的嵌合抗原受体及其应用
CN110606893B (zh) 一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法
CN111944054B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
US20220340927A1 (en) Methods and compositions for the modification and delivery of lymphocytes
KR20240046645A (ko) 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
CN109320615A (zh) 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
US11325948B2 (en) Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
CN113896801B (zh) 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
US20200255864A1 (en) Methods and compositions for genetically modifying and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof
CN112500497B (zh) Cltx-nkg2d双特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
US20210317408A1 (en) Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
CN108822216B (zh) 携带截短或未截短的自然细胞毒性受体信号结构的嵌合抗原受体及其应用
WO2020047527A2 (en) Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
CN111944053B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
CN109824783B (zh) 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用
CN116814664B (zh) 一种扩展肿瘤识别表位的cea嵌合抗原受体t细胞的制备与应用
WO2018103734A1 (zh) 嵌合抗原受体及其用途和制备方法
CN108699163B (zh) 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
CN113549599B (zh) 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用
WO2022135578A1 (zh) Claudin18.2嵌合抗原受体以及其用途
CN109824782B (zh) 抗cd19抗体和muc1抗原肽的偶联物及其应用
CN113913385A (zh) 一种抑制蛋白阻断型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其用途
CN114702596B (zh) 靶向人cd33和nkg2dl的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2024041618A1 (zh) 联合表达cd40l的工程化免疫细胞及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant