CN113226357A - 双特异性缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种缀合物，所述缀合物包含：i)至少一个结合CD40的第一特异性结合分子，其中所述第一特异性结合分子是CD40的激动剂；和ii)至少一个结合标签部分的第二特异性结合分子，其中所述标签部分不是癌症抗原，其中所述第一特异性结合分子和第二特异性结合分子是包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白，并且共价连接。所述缀合物可以与包含以下的标签构建体组合：i)标签部分，其不是癌症抗原；和ii)抗原，其是癌症抗原或衍生自病原体的抗原；其中所述抗原是多肽并且所述标签部分与所述抗原共价连接，所述组合用于在疗法中使用以刺激受试者针对所讨论的抗原产生免疫应答。

Description

双特异性缀合物
技术领域
本发明涉及新颖缀合物，所述缀合物包含能够与CD40特异性结合的第一结合分子，所述CD40通过共价连接(特别包括肽键)与能够与标签部分结合的第二结合分子结合以形成缀合物-标签复合物。标签部分可以作为进一步包含抗原的标签构建体的一部分提供。本发明进一步涉及缀合物与这种标签-抗原构建体的复合物，以及这种复合物在疗法中的用途，特别是在癌症治疗中的用途。
背景技术
调节免疫应答的单克隆抗体(mAb)在癌症治疗中被证明是非常有效的，越来越多的证据表明这样的应答可以被用来提供持久的肿瘤根除。针对不同靶的各种抗体已经被开发出来，例如靶向免疫检查点CTLA-4和PD-1，这支持T细胞免疫可以为癌症提供有效治疗的观点。用与抗原呈递细胞(APC)上的共刺激受体CD40激动性结合的免疫刺激性mAb也获得了有希望的临床数据。
CD40是TNF受体超家族的成员(可替代地称为TNF受体超家族成员5；TNFRSF5)，并且在抗原呈递细胞(APC)(例如B细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和单核细胞)、连同上皮细胞和内皮细胞以及某些肿瘤细胞上表达。当被其主要表达于成熟T细胞上的配体(CD40配体；CD40L，也称为CD154)激活时，CD40激活APC，并且诱导先天和适应性免疫应答。激动性CD40剂，例如抗CD40抗体，可用于诱导免疫系统，以预防癌细胞的增殖和/或杀伤癌细胞，从而为癌症提供有效的治疗方法。特别地，由激动性CD40剂激活的APC可刺激T细胞，包括效应T细胞，特别是CD8+细胞毒性T细胞，导致T细胞介导的癌细胞(例如肿瘤)破坏。如果APC是巨噬细胞，也可能有直接的癌细胞杀伤，对于CD40阳性的肿瘤可以观察到直接的抗肿瘤机制，其中抗CD40抗体与肿瘤细胞的结合可以诱导凋亡。
各种抗CD40抗体处于临床前或临床开发阶段，包括抗体ADC-1013、CP-870,893、Chi Lob 7/4、SEA-CD40和APX005M。抗体ADC-1013在WO 2016/023960中有描述，并且在WO2015/091853和US 2017/0342159中提出了用于抗癌的各种其他抗CD40抗体。ChiLob 7/4在US 2009/0074711中有描述，SEA-CD40在US 2017/0137528中有描述，CP-870,893在US2017/0342159中有描述，APX005M(有时可替代地简称为APX005)在WO 2014/070934中有描述。
有效刺激(或引发)T细胞不仅需要CD40刺激，还需要呈递抗原(在MHC的背景下，用于与T细胞受体(TCR)结合)。因此，有利的是APC在T细胞刺激的背景下将抗原交叉呈递给T细胞，换句话说，摄取、处理和呈递(细胞外来源的)抗原给T细胞。然而，抗原性材料可能并不总是存在(例如，如果肿瘤已经切除)，并且在这种情况下CD40激动剂在导致有效T细胞刺激方面可能具有较差的功效。CD40刺激也可能不足以激活T细胞(例如，如果作为输注产品的CD40激动剂存在剂量限制毒性)。因此，提供APC上CD40的激动性激活和同时提供抗原到APC的递送将是有益的。本发明解决了这一需求。
发明内容
特别地，提供了双特异性缀合物，其对CD40并且最终对抗原性组分都是特异性的，并且可用于激活抗原呈递细胞，特别是DC，特别是在疗法的背景下。根据抗原的不同，疗法可以是癌症的预防性或治疗性治疗，或者感染的预防性或治疗性治疗(激活的T细胞可以靶向并杀伤感染的细胞)。
双特异性缀合物包含两个共价偶联在一起的单独的特异性结合部分。第一结合部分对CD40是特异性的。然而，本发明的缀合物不是提供对抗原直接特异性的第二特异性结合部分，而是包含对标签特异性的第二结合部分。标签可以作为构建体的一部分提供，其中标签与抗原共价偶联。因此，通过与标签结合，第二结合部分(以及因此缀合物)可以间接地与抗原结合，这提供了一种灵活的方法，通过所述方法可以改变抗原，因为在抗原和抗体之间没有化学连接。换言之，缀合物和标签构建体之间可形成复合物，所述复合物提供CD40激动剂(即用于激活APC)和抗原(即用于由APC呈递)两者。这有利地允许灵活地制备用于个性化药物的缀合物和复合物。不是制备包含直接融合到CD40激动剂(例如CD40结合剂)的抗原或融合到激动剂的抗原特异性结合剂的缀合物(这将需要为每个患者费力地合成和生产单独的缀合物)，而是本发明允许生产通用药剂，即双特异性(CD40和标签特异性)缀合物，其可根据特定个体患者的需要，通过结合到包含不同抗原但相同标签的不同标签构建体，定制用于个体的个性化使用。这样，只需要制备单独的标签构建体，这在制备患者特异性治疗剂的容易性和成本方面提供了益处。进一步认为，与直接和共价融合到CD40结合剂的抗原相比，或者与单独提供CD40结合剂和抗原相比，抗原与CD40结合剂的非共价结合可能有利于复合物的功效。
因此，在第一方面，本公开提供了缀合物，其包含：
i)结合CD40的第一特异性结合分子，其中所述第一特异性结合分子是CD40的激动剂；以及
ii)结合标签部分的第二特异性结合分子；
其中所述第一特异性结合分子和第二特异性结合分子共价连接。
更具体地，该方面提供了缀合物，其包含：
i)至少一个结合CD40的第一特异性结合分子，其中所述第一特异性结合分子是CD40的激动剂，并且是包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白；以及
ii)至少一个结合标签部分的第二特异性结合分子，其中所述标签部分不是癌症抗原，
其中所述第一特异性结合分子和第二特异性结合分子是包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白，并且彼此共价连接。
特别地，第一特异性结合分子可结合CD40(当其定位在细胞，更特别是抗原呈递细胞的表面时)。CD40可以是人CD40。
如上所述，在一个实施方案中，特异性结合分子是特异性结合蛋白，特别是抗原结合蛋白，即基于抗体的分子，如下文进一步描述。在特定实施方案中，第一特异性结合分子是抗体。在另一个具体的实施方案中，第二特异性结合分子是单链抗体构建体。
缀合物包含至少一个第一特异性结合分子和至少一个第二特异性结合分子。因此，它可以包含两个或更多个第一和/或第二特异性结合分子。在一个实施方案中，缀合物可包含一个第一特异性结合分子和两个或更多个，例如2-4个，第二特异性结合分子。在这样的实施方案中，第一特异性结合分子可以是二价的，或者可以具有2或更高的化合价。可替代地或另外地，在这样的实施方案中，第二特异性结合分子可以是单价的。
缀合物可以结合的标签部分可以采取包含与抗原共价连接的标签部分的标签构建体的形式。可产生或获得特异性结合蛋白的任何部分可用作标签部分。然而，在特定实施方案中，标签部分不是癌症抗原。在另一个实施方案中，标签部分不是在哺乳动物细胞表面上表达的蛋白，或者标签部分不包含以下或不由以下组成：在哺乳动物细胞表面上表达的哺乳动物蛋白中存在的氨基酸序列。在一个实施方案中，标签部分不包含以下或不由以下组成：哺乳动物蛋白中存在的氨基酸序列。
在一个实施方案中，标签部分可以是或可以包含已知的天然B细胞表位。在另一个实施方案中，标签部分不包含已知的B细胞表位。在一个实施方案中，标签部分不包含已知的人B细胞表位。在另一个实施方案中，标签部分不包含天然B细胞表位，特别是不包含是人中天然B细胞表位的表位。
在另一个实施方案中，标签部分是肽。方便地，标签部分可以是合成产生的肽。在另一个实施方案中，抗原是抗原性肽。因此，标签构建体可以是包含作为标签序列(或结构域)的第一序列(或结构域)和作为抗原序列(或结构域)的第二序列(或结构域)的多肽。换句话说，标签构建体可以是包含标签肽和抗原肽的融合多肽(可替代地称为融合肽或融合蛋白)。
值得注意的是，在标签构建体包含肽标签部分和肽抗原的情况下，标签部分和肽抗原来衍生自不同的来源。例如，标签部分可以是具有来自第一蛋白的氨基酸序列的肽，并且抗原是具有来自第二蛋白的氨基酸序列的肽。优选地，标签部分的序列衍生自与抗原序列不同的物种。例如，标签可以是细菌、病毒或真菌来源的。例如，标签序列可以源自微生物毒素(例如破伤风毒素，Ttx)。因此，标签构建体不是自然界中存在的序列，其一部分起标签部分的作用，另一部分起抗原的作用。相反，在标签构建体包含肽标签部分和肽抗原的情况下，标签构建体具有人工序列。
缀合物包含至少一个结合CD40的第一特异性结合分子。这意味着第一特异性结合分子能够结合CD40，更特别地特异性结合CD40。类似地，至少一个第二特异性结合分子结合标签部分，这意味着第二特异性结合分子能够结合标签部分，更具体地，特异性结合标签部分。
在另一方面，本公开提供了如本文所定义的缀合物和标签构建体的复合物(或其之间的复合物)，所述标签构建体包含共价附接至抗原的标签部分，其中所述标签构建体的标签部分非共价结合到缀合物的第二特异性结合分子。
根据缀合物中的第二特异性结合分子和/或第二特异性结合分子的数目，复合物可包含一个或多个，例如两个或更多个标签构建体。
复合物因此包含针对CD40的特异性结合分子和抗原。抗原可以是癌症抗原或病原体的抗原。抗原可以被T细胞识别(更特别地，当抗原以MHC分子形式存在时，可以被T细胞的TCR识别)，并且T细胞可被复合物激活或刺激。T细胞可以特别是效应T细胞，更特别地可以是CD4+或CD8+T细胞。
在一个特定方面，本公开还提供了标签构建体，其包含：
i)标签部分；以及
ii)抗原，所述抗原是癌症抗原或衍生自病原体的抗原；
其中所述标签部分与所述抗原共价连接。
在一个实施方案中方面提供了标签构建体，其包含：
i)标签部分，其不是癌症抗原；以及
ii)抗原，其是癌症抗原或衍生自病原体的抗原；
其中所述抗原是多肽，并且所述标签部分与所述抗原共价连接。
在特定实施方案中，标签部分不包含B细胞表位。
在另一个实施方案中，抗原是抗原性多肽。可替代地或另外地，标签部分是标签肽。
还提供了药物组合物，其包含：
i)如本文所定义的缀合物；或者
ii)如本文所定义的标签构建体；或者
iii)如本文所定义的复合物，
连同与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂一起。
进一步提供了如本文所定义的用于疗法中的复合物。类似地，提供了产品，其包含如本文所定义的缀合物和如本文所定义的标签构建体，作为用于在疗法中单独、同时或顺序使用的组合制剂。在这方面应当理解，术语“产品”广义地指的是缀合物和标签构建体的任何组合，它们可以一起提供用于治疗用途，例如以单独的配制剂施用，同时或在不同时间施用，通过相同或不同的施用途径施用，或在同一配制剂中一起施用。因此，在本发明的这方面中，可替代地参考包含缀合物和标签构建体的药物组合，或参考在疗法中与标签构建体组合使用的缀合物，或反之亦然。
特别地，复合物和产品用于治疗或预防癌症，或用于治疗或预防感染(即病原体感染)。在这方面应当理解，癌症可以是其细胞表达抗原的癌症，或者感染可以是由表达抗原的病原体引起的。
在另一个方面，进一步提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：
i)本文定义的复合物或包含所述复合物的药物组合物；或者
ii)本文定义的缀合物(或包含所述缀合物的药物组合物)和本文定义的标签构建体(或包含所述标签构建物的药物组合物)。
还提供了治疗或预防受试者中的感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
i)本文定义的复合物或包含所述复合物的药物组合物；或者
ii)本文定义的缀合物(或包含所述缀合物的药物组合物)和本文定义的标签构建体(或包含所述标签构建物的药物组合物)。
特别地，施用有效量的复合物、或缀合物和标签(或药物组合物)。
本公开进一步提供了如本文所定义的复合物在制备用于在受试者中治疗或预防癌症或用于治疗或预防感染的药物中的用途。类似地，本公开提供了如本文所定义的缀合物和如本文所定义的标签构建体在制备用于在受试者中治疗或预防癌症或用于治疗或预防感染的药物中的用途。
在仍另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含如本文定义的缀合物和如本文定义的标签构建体。
可以提供这样的试剂盒用于治疗用途。因此，试剂盒可用于制备用于本文定义和描述的疗法中的复合物。试剂盒可包含一个或多个标签构建体，特别是不同种类的标签构建体。因此，可以提供两个或更多个不同的标签构建体，每个标签构建体含有不同的抗原，其中相同的标签结合到每个单独的抗原。在一个实施方案中，试剂盒可包含标签构建体的文库。
在另一方面，本公开内容提供了激活表达识别抗原的TCR的T细胞的体外或离体方法，所述方法包括使抗原呈递细胞(APC)与以下接触：
i)如本文定义的缀合物和如本文定义的标签构建体，其中所述标签构建体包含被所述TCR识别的抗原；或者
ii)如本文定义的复合物，其中所述复合物的标签构建体包含被所述TCR识别的抗原。
特别地，这样的方法包括使所述APC与所述T细胞接触。
序列表的简要说明
Figure BDA0003077620280000061
Figure BDA0003077620280000071
Figure BDA0003077620280000081
附图说明
图1显示了对在各种刺激物(双特异性抗体、其亲本、单克隆抗体和对照)存在下培养的BMDC上清液进行IL-12ELISA的结果。在所有情况下，均使用表达人CD40的BMDC。每种抗体均以表1中提供的名称缩写表示。
A显示了在基于CP-870,893的抗体存在下培养的BMDC的结果；B显示了在基于ABS-1150的抗体存在下培养的BMDC的结果。将来自在1μg/ml LPS存在下培养的BMDC的上清液用作阳性对照，并且将单独培养基用作阴性对照。给出每个测试浓度的重复项的平均值。评估范围从0.0064nM-500nM的抗体的滴定。
如下所述，每种抗体均以8种不同浓度进行测试。对于每种抗体，显示了使用所有8种浓度的结果，其中使用最高浓度的结果在左侧，使用最低浓度的结果在右侧。对于某些抗体，在最低抗体浓度下产生的IL-12水平太低，无法在图表上看到。因此，例如，如果仅显示特定抗体的四个结果，则这些结果对应于使用该抗体的四个最高浓度时获得的结果。LPS以一个浓度的重复项的平均值表示，培养基代表背景激活状态。
图2显示了BMDC/T细胞共培养实验后的T细胞活性水平(如通过基于CPRG水解的分光光度法测量)。将BMDC与以下一起温育：显示浓度为10nM的抗体构建体(如所示，基于CP-870,893的构建体的结果显示在左边，基于ABS-1150的构建体的结果显示在右边；抗体以表1中提供的名称的缩写表示)和浓度为125nM(A)或250nM(B)的SLP UU-05，或浓度为125nM(C)或250nM(D)的SLP UU-10。每图中的水平线表示在无抗体对照中获得的T细胞激活的基础水平。数据表示为重复值的平均值+SEM。
图3显示了体内实验的结果，其中向野生型C57Bl/6小鼠注射表达人CD40的BMDC和表达Thy1.1和识别I类MHC中的gp100的TCR的转基因T细胞。结果显示，在注射该肽的小鼠中，对于组中每只单独小鼠(和平均+/-SD)，识别SLP UU-30中存在的表位的增殖T细胞的水平。左分图(A)显示了在以下中获得的结果：单独施用的UU-30(左)、UU-30与Bi-1双特异性抗体、UU-30和IgG1亚类的单克隆亲本抗体CP-870,893的小鼠；和PBS对照(右)。右分图(B)显示相同，除了双特异性抗体是Bi-2双特异性抗体，单克隆亲本抗体是IgG2亚类的CP-870,893。在两个分图中，与单独注射UU-30的小鼠相比，注射UU-30与双特异性抗体的组合的小鼠的特异性T细胞增殖显示出统计学上显著的增加(显著值通过单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验确定，*代表调整后的p值<0.05)。同样在两个分图中，相对于仅注射UU-30的小鼠，在注射了UU-30与亲本单克隆抗体组合的小鼠中显示了特异性T细胞增殖的非显著(ns)差异。
图3C显示了UU-30肽单独或与ABS-1150/1151的各种双特异性或亲本抗体组合，以相同的方式在体内评估ABS-1150/1151的结果。当将UU-30与该肽和Bi-10和Bi-12双特异性抗体的各个组合进行比较时，在T细胞增殖方面建立了显著差异，然而当UU-30与亲本抗体组合时，在T细胞增殖方面没有显著差异。采用单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验进行统计学分析，**表示P<0.01并且*P表示<0.05。
图4显示了各种推定的TTx衍生标签肽的圆二色光谱结果，以展示其二级结构。
图5显示ELISA实验的结果，以确定从接受DTP疫苗强化剂之前或之后的个体获得的血清中的抗体与推定标签肽的结合。显示了在四种不同浓度的血清下与四种推定标签肽(包括已知的MTTE肽)结合的抗体水平。如图所示，在所有血清浓度下，与SEQ ID NO:10、13和14的推定标签的抗体结合是最小的。正如预期的那样，在较低的两种浓度下，可以看到与MTTE有显著的抗体结合，其中从DTP强化疫苗后的血清中可以看到比DTP强化疫苗前更高的抗体结合水平。
图6描绘了根据本发明的代表性的(A)缀合物，(B)标签构建体和(C)复合物。图6A显示了缀合物，其包含作为第一特异性结合分子的激动性抗CD40IgG抗体和作为第二特异性结合分子的对标签部分(例如标签肽)特异性的两个scFv，每个结合到抗体的单独的CH3结构域，从而提供四价缀合物(对于CD40的两价和对于标签肽的两价)。图6B显示了包含与抗原肽连接的标签部分(例如标签肽)的标签构建体。图6B显示了复合物，其包含通过标签部分(例如标签肽)结合至缀合物的两个scFv的每一个的标签构建体。
图7显示了小鼠中引流淋巴结(左侧图)和非引流淋巴结(右侧图)中增殖T细胞的百分比。如图所示，根据本发明的双特异性缀合物和标签构建体的共同施用比单独施用双特异性缀合物或单独施用标签构建体更有效地刺激抗原特异性T细胞应答。如下所述，以低(L)、中(M)或高(H)的量施用缀合物和构建体。星号表示统计显著性(*p<0.05)。
图8显示了将FITC标记的肽与Bi-17(含有抗FITC scFv FITC-8的双特异性缀合物)一起温育的效果。左侧的标度表示荧光强度。如图所示，在添加Bi-17之前，检测到高荧光信号(在0分钟时)。添加高浓度的Bi-17会完全淬灭荧光。随着Bi-17浓度降低，使得存在过量的经FITC标记的肽，淬灭也降低。
图9显示树突状细胞对经FITC标记的肽的摄取，如通过细胞荧光测量。“FITC-NLV”表示所有荧光细胞，“FITC-NLV[Q]”表示具有细胞内荧光(通过台盼蓝淬灭外部荧光信号获得)的细胞。A展示树突状细胞摄取裸肽；B展示当肽作为双特异性抗体复合物应用于树突状细胞时，肽的摄取。
图10显示当与根据本发明的双特异性结合物和标签构建体(含有CMV抗原)接触时，对CMV抗原特异性的T细胞(如通过培养物中CMV特异性T细胞的比例测量)的扩增。如图所示，当细胞与双特异性抗原和标签构建体接触时，与单独的双特异性抗原或单独的标签构建体相比，观察到显著更特异性的T细胞扩增。***p<0.001，****p<0.0001，NS＝不显著。
图11显示抗CD40抗体ABS-1150/1151对树突状细胞的CD86(A)和CD40(B)细胞表面表达的作用。将IgG1同种型抗体(X-SM083-ab-1)的作用与IgG2同种型抗体(X-SM083-ab-2)的作用进行比较。对蛋白表达的作用以相对于未刺激细胞的倍数变化表示。对于每种抗体，多个柱代表滴定范围内的不同浓度(从左到右，从高浓度到低浓度)。如图所示，IgG2同种型在增加CD86细胞表面表达和减少CD40细胞表面表达方面比IgG1同种型具有更大的作用。
图12显示了通过质谱法测量的UU-30肽在小鼠血浆中的稳定性。在血浆中单独温育所述肽，与两种抗CD40单克隆抗体组合温育所述肽，并与本发明的两种双特异性抗体复合温育所述肽。UU-30肽与本发明的双特异性抗体的复合大大增加了其在小鼠血浆中的稳定性。
图13显示了通过质谱法测量的3种推定肽标签部分在小鼠血浆(圆圈)和人血浆(正方形)中的稳定性。所测试的肽是UU-50(SEQ ID NO:10)，UU-51(SEQ ID NO:12)和UU-52(SEQ ID NO:13)。
图14显示了黑色素瘤小鼠模型中的肿瘤负荷。比较仅施用标签构建体UU-30的小鼠(UU-30含有黑色素瘤抗原gp100的表位，如下文详述)和施用标签构建体UU-30与结合UU-30标签部分的双特异性抗体Bi-10的组合的小鼠在肿瘤接种后20天的肿瘤体积。如图所示，与本发明的双特异性抗体组合施用UU-30导致比单独施用UU-30更低的肿瘤生长。
具体实施方式
本发明涉及双特异性缀合物，其包含至少两个共价连接在一起的特异性结合分子，第一特异性针对CD40，第二特异性针对标签部分。
特异性结合分子可以是所讨论的靶分子，即CD40或标签部分的任何结合伴侣(例如亲和力结合伴侣)。即，它可以是与CD40或标签部分结合的任何分子(即，能够与CD40或标签部分结合的任何分子)。在一个优选的实施方案中，特异性结合分子是特异性结合蛋白，但是它可以是任何分子，包括例如核酸分子，例如适体。“特异”是指分子以可以区别于与非靶分子的结合的方式，特别是以更大的结合亲和力与其靶结合。即，结合分子不与其他非靶分子结合，或不以可察觉或显著的程度结合，或以较低的亲和力与此类其他分子结合。“特异于”可以替代地表示为“针对”。
术语“CD40”是指来自任何物种的CD40。因此，它可以是人CD40或其在其他物种中，特别是在其他哺乳动物中的等价或相应分子。优选地，它是人CD40。人CD40的氨基酸序列示于SEQ ID NO:50。特别地，第一特异性结合分子结合以其天然状态的CD40，并且更特别地当CD40位于细胞表面上时，或更特别地当在细胞表面上表达时。
第一特异性结合分子能够激动CD40。即，分子能够激活CD40。换句话说，第一特异性结合分子能够增强CD40信号传导。在不存在CD40L的情况下，第一特异性结合分子可以与CD40结合并增强CD40的信号传导。可替代地，它可以与CD40结合：CD40L复合并增强CD40信号传导。第一特异性结合分子可以完全阻断CD40L与CD40的结合，或者可以降低CD40L与CD40的结合，或者可以既不降低也不阻断CD40L与CD40的结合。因此，它可以与接近CD40上的CD40L结合位点的表位结合，或与重叠的表位结合，或与不同于CD40L结合位点的单独的表位结合。它可以通过诱导构象变化来完全或部分影响CD40L结合位点。第一特异性结合分子可增加(即激活或刺激)表达CD40的细胞的活性，特别是表达CD40的APC，例如树突状细胞、或B细胞、巨噬细胞、单核细胞或任何髓样细胞。细胞可以是CD11b阳性或CD11c阳性。在特定实施方案中，第一特异性结合分子能够激活DC。
当通过CD40进行信号传导时，会激活诸如DC之类的专门APC，这会触发几种生物学事件，包括免疫细胞激活、增殖以及细胞因子和趋化因子的产生。用于确定由CD40激活DC或其他APC的方法是本领域已知的(参见例如Schonbeck等人2001,Cell Mol Life Sci.[细胞与分子生命科学],58:40-43，和WO 2015/091853和US 2017/0342159)，并在下面实施例中描述。
本领域中还已知和报道了如何确定特异性抗CD40结合分子调节(或增加)APC(如DC)活性的能力，例如通过测量细胞表面标志物(如CD86和CD80)的水平、测量细胞因子释放(如DC释放IL-12)，和/或通过测量抗CD40结合分子诱导的T细胞活性(如IFN-γ)的分泌)。在下面的实施例1中描述了体外T细胞激活测定。
在一些实施方案中，第一特异性结合分子可以以5μg/ml或更低，例如4、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.4、0.3或0.2μg/ml或更低的效价(通常在0.1μg/ml和以上规定的上限之间)(以EC50测量，例如如WO 2015/091853的实施例3所述)增加DC的激活。
如本领域众所周知的，CD40是细胞表面蛋白。配体或激动剂的结合后，CD40可被内化。TNFR内化可以是调节免疫激活的方式。CD40抗体的内化率可以不同。不受理论的束缚，抗体内化可能与激动能力有关。因此，如果期望抗CD40抗体来驱动CD40的可测量的内化。抗体-CD40复合物的内化导致靶细胞内化与第二特异性结合分子结合的标签构建体中的抗原，因此可促进抗原交叉呈递。因此，特别优选的是，第一特异性结合分子在与CD40结合后诱导CD40内化。CD40内化可以如以下实施例中所述通过实验测量。
标签部分可以是任何部分(例如分子)，其是第二特异性结合分子的结合配偶体，并且可以用于允许缀合物结合到包含标签部分的标签构建体。因此，标签部分是亲和结合对的成员。它可以是可以被特异性结合分子靶向的任何化学实体。因此，标签部分的性质不受限制，并且可以是任何类型的分子，例如肽，或任何有机分子，或任何小分子。例如，它可以是半抗原。优选地，标签部分是肽。术语“肽”在本文中广泛使用，包括多肽和蛋白，并且不意味着对氨基酸残基的数量的限制，而是表示分子的蛋白性质。因此，术语“肽”与“多肽”同义或可互换。肽可以是包含两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。氨基酸是天然的或合成的，并且是D或L旋光异构体。标签部分可以是天然分子或其片段或部分，或者可以是人工或合成分子。标签部分和标签肽在下面进一步描述。
对于根据本发明的用途，标签部分作为标签构建体的一部分提供，其中标签部分共价附接至抗原，如本文其他地方所述。因此，标签部分通常是合成产生的。
如上所述，在一个实施方案中，标签部分不是癌症抗原，因此在该实施方案中，第二特异性结合分子不与癌症抗原结合。特别地，标签部分不是人癌症抗原。标签部分不是癌症抗原包括标签部分不是癌症抗原的一部分，即它不是来自癌症抗原的氨基酸序列。特别地，标签部分不是来自癌症抗原的表位。
如下面进一步描述的，癌症抗原(或肿瘤抗原)包括肿瘤特异性抗原(即，由突变产生的新表位)和肿瘤相关抗原。如本文所述的癌症抗原特别是可在癌症疗法中靶向的蛋白，例如通过治疗性抗体或其他药物实体靶向的蛋白。
在一个实施方案中，标签部分不包含任何B细胞表位。在特定实施方案中，标签部分不包含任何人B细胞表位。标签部分可以被设计或选择成使其不与任何内源性抗体相互作用，或不以任何显著或实质程度的相互作用，所述内源性抗体可存在于施用所述缀合物或包含所述缀合物的复合物的受试者中。在一个实施方案中，可以避免本发明的缀合物与施用本发明的缀合物和标签的受试者体内的内源性抗体之间竞争结合标签部分。因此，在一个实施方案中，第二特异性结合分子可在与标签部分的结合方面胜过受试者的任何内源性抗体，例如在首次施用缀合物时。
不包含任何B细胞表位(例如人B细胞表位)的标签部分可以是非免疫原性的，以避免在施用时对标签部分(或对除标签构建体的抗原以外的缀合物/复合物的任何部分)产生免疫应答。
可替代地，在一个实施方案中，标签部分可以不包含任何天然B细胞表位(例如，标签部分可以不包含任何天然人类B细胞表位)。所谓“天然B细胞表位”是表位，指受试者，例如人(特别是施用缀合物的患者)在施用缀合物之前没有针对所述表位的循环抗体。在该实施方案中，向受试者施用标签部分可能随时间诱导抗标签抗体。
在这方面应当理解，标签部分中的给定氨基酸序列(或其他分子)是否代表B细胞表位可能取决于施用所述标签部分的受试者的物种、受试者的MHC库以及受试者先前暴露于什么抗原。因此，衍生自人受试者所暴露的肽或蛋白的标签部分可包含人B细胞表位，但所述表位序列可不作为其他物种中的B细胞表位或不是通用的B细胞表位。
所谓“通用”B细胞表位是指与群体中大多数个体中存在的抗体结合的B细胞表位。例如，通用人B细胞表位是表位，给定群体中的大多数个体具有针对所述表位的抗体。通用B细胞表位可以是但不限于存在于疫苗中通常施用的蛋白或肽中的表位。例如，破伤风毒素(TTx)包含许多通用B细胞表位。不受理论约束，认为这是因为破伤风类毒素(TTd)是TTx的灭活形式，在全世界几乎所有人接种的破伤风疫苗中施用。在一个实施方案中，通用人B细胞表位是由群体中至少75％的个体的内源性抗体识别的B细胞表位。通用B细胞表位可以可替代地定义为普通B细胞表位。
B细胞表位可以是线性的(连续的氨基酸序列)，也可以是构象的(蛋白的一系列非连续的氨基酸，在蛋白的二级或三级结构的背景下被抗体识别)。
例如，基于TTx肽(如下文进一步描述)的标签肽可以包含某些序列，这些序列是人B细胞表位(例如，MTTE表位，其是如下文和实施例中描述的天然线性B细胞表位)，因为抗TTx抗体经常在人受试者中发现，并且因此可以与某些TTx衍生肽相互作用。然而，由于小鼠没有暴露过破伤风类毒素并且因此没有产生识别破伤风类毒素的抗体，因而通常没有针对MTTE的循环抗体。然而，并不是所有的TTx衍生肽都是(或含有)通用人B细胞表位，并且这可以通过如下文进一步讨论的筛选来确定。
在另一个实施方案中，标签部分可包含天然B细胞表位(例如天然人B细胞表位)。在该实施方案中，如果标签部分与第二特异性结合分子相比，由内源性循环抗体结合的强度较低(即较弱)，则可能是有利的。当裸肽相对于其在其衍生的蛋白背景下的构象(并针对其产生内源性抗体)时标签肽如果采用不同的构象也可能是有利的，因为在这种情况下内源性抗体可能不结合裸肽，或者可能仅弱地结合它。特别地，第二特异性结合分子可以比施用本发明的缀合物和标签部分的受试者中的内源性循环抗体更强地结合标签部分。
抗体/特异性结合分子与标签部分结合的强度可以以解离常数(Kd)的形式定量。Kd越大，交互作用越弱(反之亦然)。标签部分与抗体或特异性结合分子之间的结合相互作用的Kd可以通过本领域已知的多种方法来确定，例如表面等离子体共振(SPR)。因此，在一个实施方案中，标签部分包含天然人B细胞表位，但以比它被人内源性循环抗体结合更低的Kd与第二特异性结合分子结合。特别地，标签部分可以包含天然B细胞表位，但以比它被要治疗的受试者的内源性循环抗体结合更低的Kd与第二特异性结合分子结合。标签部分与第二特异性人抗体之间的相互作用的Kd可以是例如比要治疗的受试者中标签部分与内源性循环抗体之间的相互作用的Kd的约二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一、五十分之一、一百分之一或一千分之一或更少。
在特定实施方案中，标签部分是非哺乳动物肽。也就是说，标签部分可以具有以下(包括以下或由以下组成)的肽：哺乳动物中未发现的氨基酸序列。哺乳动物中未发现的氨基酸序列是指哺乳动物在其基因组中未编码的氨基酸序列。因此，例如，由驻留在哺乳动物肠道中的肠道细菌分泌的、因而可以从哺乳动物分离的细菌蛋白，就本申请而言，不被认为是“在哺乳动物中发现”。因此，肽不是哺乳动物蛋白，也不是哺乳动物蛋白的片段。因此，在该实施方案中，第二特异性结合分子不结合哺乳动物蛋白。
可替代地，标签部分可以是在哺乳动物细胞表面上不表达的肽。也就是说，标签部分不是哺乳动物细胞表面蛋白，或衍生自哺乳动物细胞表面蛋白的肽(例如，哺乳动物表面蛋白的一部分或片段)。在该实施方案中，第二特异性结合分子不结合哺乳动物细胞表面蛋白。
标签肽可被选择或设计为不包括任何人序列，即标签肽可不包括与人中产生多肽的氨基酸序列相对应(或获得或衍生自人中产生多肽的氨基酸序列)的任何氨基酸序列。也就是说，标签部分(或标签肽)可以是非人肽，即标签部分不是人蛋白或人蛋白的一部分或片段。与上述哺乳动物肽的讨论等价，非人肽具有以下(包括以下或由以下组成)：人未发现的氨基酸序列。在人中未发现的氨基酸序列是人基因组未编码的氨基酸序列，因此不是由天然人细胞产生的。因此，在该实施方案中，第二特异性结合分子不结合人蛋白。
在另一个实施方案中，标签肽可被选择或设计为不包括任何犬序列，使得标签肽不包括与狗中产生多肽的氨基酸序列相对应(或获得或衍生自狗中产生多肽的氨基酸序列)的任何氨基酸序列。因此，在该实施方案中，第二特异性结合分子不结合犬蛋白。
标签肽可以是天然肽，即具有衍生自天然蛋白序列的序列的肽。在这种情况下，优选肽序列衍生自非哺乳动物或非人来源的蛋白，例如衍生自原核生物或微生物蛋白，例如细菌蛋白或酵母蛋白等。如以下所示的实施例中，标签肽可衍生自破伤风梭菌。可替代地，标签肽可以具有人工序列，即自然界中未发现的氨基酸序列。因此，第二特异性结合分子可以结合原核或微生物蛋白，例如细菌蛋白。可替代地，第二特异性结合分子可以仅结合人工序列，使得第二特异性结合分子不结合任何天然存在的蛋白。
在特定实施方案中，标签肽具有α-螺旋结构。在另一个实施方案中，标签肽是非结构化的，即它不采用特定的二级结构。如实施例中详述的，可以使用可公开获得的软件(Jpred4(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/,Drozdetskiy等人,Nucl.AcidsRes.[核酸研究]43(W1):W389-W394,2015)和PASTA 2.0(http://protein.bio.unipd.it/ pasta2/,Walsh等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]42(W):W301-W307,2014)。肽二级结构可以通过圆二色光谱法通过实验确定，如本领域公知的(参见例如Greenfield,N.,NatProtoc.[自然方案]1(6):2876-2890,2006)。
在一个实施方案中，选择标签肽的考虑因素是该肽不应具有可变的结构。换句话说，不受理论的束缚，可能期望标签肽的结构不取决于背景而变化或改变。例如，当标签肽在溶液中“裸”时(即未修饰)，当它与支持物结合时(即固定的)，以及当它的N末端和/或C末端被修饰时(例如如果肽是在与抗原的融合蛋白的背景下合成的，或化学标记的)，可能期望标签肽的结构是相同的。如果多肽具有可变的结构，在某些情况下，它可能不能以高亲和力结合第二特异性结合分子。圆二色光谱法例如可以用于确定标签肽的结构在背景之间是否改变。
在特定实施方案中，标签肽可包含CD4表位(即，CD4+T细胞识别或可识别的表位)。CD4表位可以衍生自破伤风毒素或任何其他病原体衍生的抗原。通过将APC上的CD4表位呈递给T辅助细胞，从而吸引对识别标签构建体的抗原中的CD8+表位的CD8+T细胞的帮助，标签肽中这种表位的存在可使标签本身起佐剂的作用。
在特定实施方案中，标签肽衍生自破伤风毒素。衍生自破伤风毒素的合适的标签肽序列的实例包括如下所述的MTTE，其包含已知的人CD4表位并且具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。衍生自破伤风毒素的合适的标签肽的其他实例包括SEQ ID NO:10-14的那些，其不包括任何已知的通用人CD4表位。因此，第二特异性结合分子可以结合破伤风毒素，特别是在SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10-14中的任何一个处。在另一个实施方案中，标签肽是MTTE的一部分，例如至少5个氨基酸氨基酸。例如，标签肽可以是MTTE的5-16、6-15、7-14、8-13或10-12个氨基酸的片段。标签肽也可以是SEQ ID NO:10-14的破伤风毒素衍生肽之一的一部分，例如SEQ ID NO:10-14中任一个的至少5个氨基酸的片段(例如8-15、10-15、8-12或10-12个氨基酸的片段)。标签肽可以是衍生自破伤风毒素的肽，其为SEQ ID NO:121(其为SEQ ID NO:12的片段)，或者衍生自破伤风毒素的肽的任何一种，其为SEQ ID NO:122、123、124和125(其为SEQ ID NO:13的片段)。因此，第二特异性结合分子可以在SEQ ID NO:121-125中的任何一个处结合破伤风毒素。
第一和第二特异性结合分子是共价连接的。这包括各自的分子通过共价键直接彼此连接，或者它们通过接头分子或接头基团共价连接(即它们可以通过共价连接直接或间接地彼此连接)。本领域已知并在文献中广泛描述了如何将两个分子，特别是两个蛋白或多肽连接在一起，无论是直接(例如通过肽键，或通过激活各自分子中的化学基团，以允许它们一起相互作用(例如反应)的方式)，还是通过接头间接地连接在一起。例如，特定的结合分子可以与能够与存在于另一结合分子(或实际上存在于接头分子)中的硫醇基团反应的双官能剂反应，例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。酰胺和硫醚键可以例如用间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯实现。许多接头分子是已知的，并且在本领域中是标准的，用于将缀合物的组成部分连接在一起，包括在抗体构建体领域中，并且可以使用任何此类接头。
在第一和第二结合分子是多肽或蛋白的情况下，它们可以通过肽键或通过方便地采用氨基酸序列形式的接头的中间体直接彼此连接。因此，缀合物可以采取以下的形式或可以包含以下：融合蛋白(或融合多肽)，其中第一和第二特异性结合蛋白(或其组成多肽，例如其链)直接连接在一起，或通过接头序列间接连接。例如，通常接头可以采用GGGGSn的形式(SEQ ID NO:51)，其中n通常可以是1-10，例如2-6。代表性的接头(其中n＝2)显示在SEQ ID NO:49中。除了将两个结合分子(或其链或其部分)连接在一起以外，该接头不发挥任何功能或效应子的作用。
第一和第二特异性结合蛋白，或其组成多肽(例如，链)，可以以任何顺序连接，例如：第一特异性结合蛋白(或其链)的N-或C末端与第二特异性结合蛋白(或其链)的N-或C末端连接。
如上所述，在一个优选的实施方案中，特异性结合分子是特异性结合蛋白，更特别地，它们可以是抗原结合蛋白。本文使用术语“抗原结合蛋白”表示包含从抗体获得或衍生的抗原结合结构域或基于抗体的抗原结合结构域的结合蛋白。因此，抗原结合蛋白可以是基于抗体或类似抗体的分子，其包含抗体的结合位点或衍生自抗体的结合位点。因此，它是免疫学结合剂。抗原结合蛋白可以例如包含来自抗CD40抗体的轻链和/或重链可变区，或来自抗CD40抗体的CDR。抗原结合蛋白因此可以是天然抗体或其片段，或人工或合成抗体，或抗体构建体或衍生物(例如单链抗体，如下文进一步讨论)。为了避免疑问，根据本发明，抗原结合结构域不是来自T细胞受体(TCR)。因此，为了避免疑问，根据本发明的抗原结合蛋白不包括TCR。
优选地，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段或衍生物。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子。因此，抗体包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。VH和VL包含与抗原相互作用的结合域。VH和VL可以再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常具有3个CDR(可用于定义抗原结合结构域/位点)和4个FR。抗体的恒定区可以介导抗体与各种细胞或因子的结合。抗体的Fc区由两个重链的恒定区的部分构成(根据抗体的类别，它们为Fc贡献两个或三个恒定结构域)，并且该区域特别可以结合存在于某些细胞(包括APC)上的Fc受体，并且可以在抗体刺激细胞的能力中发挥作用。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。该抗体可以是任何同种型(或类别)，其由重链中恒定结构域的类型决定。因此，它可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。优选地，它是IgG抗体。这些类中的几个进一步分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等，并且抗体可以是任何亚类。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。本发明人证明了IgG2亚类的IgG抗体(即IgG2抗体)对CD40具有特别强的内化作用。激动性IgG2抗体与CD40的结合在驱动CD40的内化方面特别有效。重要的是，激动性IgG2抗体在驱动CD40内化方面比IgG1抗体更有效。如下文实施例所示，IgG2抗体在驱动CD40内化方面比具有相同抗原结合结构域的IgG1抗体更有效，这表明抗体同型在驱动CD40内化以及因此与第二特异性结合分子结合的任何抗原的内化方面的重要性。因此，IgG2同种型抗体的使用可导致更好的MHC I类或II类抗原负载，并因此更好的免疫激活。鉴于其在驱动CD40内化中的功效，作为CD40激动剂的IgG2抗体特别优选用作本发明缀合物中的第一结合分子。
哺乳动物抗体的“轻链”被分配为两种明显不同的类型之一：kappa(κ)和lambda(λ)，基于其恒定结构域的氨基酸序列和其可变结构域框架区的一些氨基酸。在一些实施方案中，kappa(κ)轻链是优选的。
在一些实施方案中，特异性结合分子，特别是第一特异性结合分子(结合CD40)是抗体或其片段。特别地，它是完整的或完全的抗体(即，包含H和L链恒定区的完整互补体的“全长”抗体)。在其他实施方案中，特异性结合分子，特别是第二特异性结合分子是工程化的或合成的抗体构建体。
特异性结合分子可以是抗体的抗原结合片段，即保留抗体与抗原(例如CD40或标签部分)特异性结合的能力的片段。这样的片段是公知的，例子包括Fab'、Fab、F(ab')2、Fv、Fd或dAb片段，其可根据本领域公知的技术制备。
可替代地，特异性结合分子可以是合成的或人工构建体，即包含抗原结合结构域但经基因工程化或人工构建的抗体样分子。这包括嵌合或CDR接枝抗体，以及单链抗体和其它构建体，例如scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体、二抗体、单结构域抗体(DABs)、TandAb二聚体、重链抗体如VHH、和骆驼抗体等。scFv典型地包括(从N末端至C末端)VH区，其通过接头序列连接到VL区。接头可以是如上所述的氨基酸序列。示例性的接头序列是GGGGS4。但是，单链抗体的替代形式也是可能的。此类分子的制备在本领域中是众所周知的，并且可以按照与完整抗体相同的方式来筛选它们的效用。
第一和第二特异性抗原结合蛋白可以是人蛋白或人源化蛋白。人蛋白可包含VH和VL区，其中框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列，如果恒定区包含在蛋白中，则还包括恒定区。然而，这样的蛋白可以包括不由人种系Ig序列编码的氨基酸，例如由随机或位点特异性突变引入的突变)。人源化蛋白可包含衍生自另一物种(例如小鼠)种系的CDR序列，其接枝到人框架序列或人“支架”序列上，和/或其中改变非人可变区的某些氨基酸以更好地对应于人抗体中典型存在的氨基酸。因此，人源化蛋白是包含人衍生和非人衍生的序列的嵌合蛋白。非人序列可以是最小的。
在另一个实施方案中，可以将缀合物设计用于兽医，特别是用于狗。在该实施方案中，第一特异性结合分子可以是犬特异性结合分子，例如犬抗体。在该实施方案中，第一特异性结合分子是犬CD40的激动剂，并且优选具有犬重链恒定区。该抗体可以是犬IgG抗体。犬亚类IgGB在某种程度上是人IgG2的犬等效物，因此，由于IgG2亚类优选用于人的相同原因，用于犬的缀合物优选使用作为犬CD40激动剂的IgGB抗体作为第一特异性结合分子。
因此，可以根据本领域公知的技术和原理，通过重组或合成手段制备、表达、分离或产生抗原结合蛋白。
优选的是，缀合物对于其两个靶中的每一个，即对于CD40和标签部分中的每一个，具有多于一个的结合结构域。换句话说，优选地，缀合物对于每个靶具有至少2的化合价。在这种情况下，化合价可以视为等同于靶结合结构域的数量。因此，化合价可被视为靶结合结构域。因此，第一和/或第二特异性结合分子各自可具有多于一个(抗原)结合结构域和/或缀合物可包含多于一个第一和/或第二特异性结合分子。因此，特异性结合分子可以是单价的，或者它可以具有两个或更多的化合价，即它可以包含一个、或两个或更多的结合结构域，例如2-6，或2-4个结合结构域。此外，缀合物可包含一个第一或第二特异性结合分子，或其可包含两个或更多个第一和/或第二特异性结合分子，例如2-6个或2-4个第一和/或第二特异性结合分子。在特异性结合分子具有多于一的化合价的情况下，在一个实施方案中，缀合物可包含一个特异性结合分子，例如一个具有2或更多(例如2)的化合价的第一特异性结合分子。在特异性结合分子具有1的化合价的情况下，在一个实施方案中，缀合物可包含两个或更多个特异性结合分子，例如两个或更多个(例如2-4个)单价第二特异性结合分子。应当理解，在存在多个第二特异性结合伴侣的情况下，它们对相同的靶肽是特异性的。当缀合物中存在多个第一或第二特异性结合配偶体时，每个第一特异性结合分子和每个第二特异性结合分子通常是相同的，但可以是不同的(例如，每个缀合物可以包含结合CD40的单个二价第一特异性结合分子和两个不同的单价第二特异性结合分子，每个单价第二特异性结合分子结合不同的标签部分，或者每个单价第二特异性结合分子针对相同的标签部分，但例如结合到其中的不同位点)。
在一个优选的实施方案中，第一特异性结合分子是二价的。此外，在这样的实施方案中，第二特异性结合分子可以是单价的，并且缀合物可以包含两个第二特异性结合分子。因此，在这样的实施方案中，缀合物是四价的。从上面的讨论中将认识到，不同形式的四价缀合物是可能的。例如，通过使多于一个第二特异性结合分子(例如2、3或4或更多)与一个第一特异性结合分子缀合，可以增加缀合物的化合价。可替代地或另外地，可以缀合多于一个的第一特异性结合分子。
术语“结合亲和力”是指结合分子结合或不结合其结合伴侣或靶的倾向。结合亲和力可以通过确定结合伴侣的解离常数(Kd)来定量。类似地，结合分子与其靶结合的特异性可以根据结合分子对其靶的比较解离常数(Kd)与结合分子和非靶分子的解离常数相比较来定义。典型地，特异性结合分子对其靶的Kd将是其相对于另一个非靶分子的Kd的低于二分之一，优选低于五分之一、十分之一、十五分之一、二十分之一、三十分之一、四十分之一、五十分之一、一百分之一或二百分之一。结合亲和力和离解常数可以用公知的方法容易地测定。WO 2015/091853中描述了许多这样的方法。第一和第二特异性结合分子能够以是其与另一非靶分子结合的亲和力的至少2、5、10、50、100或200倍的亲和力结合其靶。
第一和第二特异性结合分子可以以至少约10、5、4、3、2或1μM，或至少约1000nM(即10、5、4、3、2或1μM，或1000nM或更小)亲和力(Kd)结合它们各自的靶，但可表现出更高的亲和力，例如约900、800、700、600、500、400、300、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、10、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01nM或更小。亲和力可以使用例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振法(例如BIAcore)或荧光偏振测定法来测定。
特异性结合分子与其靶之间的相互作用强度可替代地基于其解离速率(koff或kd，解离速率常数，s-1)来定量。通过其可以计算受体-配体相互作用的解离速率的方法在本领域中是公知的，例如表面等离子体共振和停流分析。第一和第二特异性结合分子可以以0.0015s-1或更小，例如0.001或0.0005s-1或更小，或10-4、5x10-5或10-5s-1或更小的解离速率结合它们各自的靶。相互作用的解离速率与其半衰期直接相关(半衰期＝1/koff)。因此，例如，以0.0005s-1的解离速率相互作用时，半衰期为1/0.0005s，即2000秒或33分钟。
与CD40结合的亲和力常数(KD/Kd)通常在1-10nM的范围内。缔合速率(ka)通常可以在0.4-3.4x1061/M的范围内。解离速率常数(kd)通常可以在1-10x10-31/s的范围内。
在一个实施方案中，结合CD40的第一特异性结合分子可以是包含抗体的抗原结合结构域和Fc区的抗原结合蛋白。如上所述，在某些情况下，例如包含特定类或亚型(例如IgG1)的恒定区的抗原结合分子，对于结合分子也包含Fc区是有益的。这可以例如增强CD40阳性细胞的活化，或者有利于分子的稳定性或半衰期。但是，这不是必需的要求。
在某些实施方案中，第一特异性结合分子是完整抗体，特别是单克隆抗体。在另一个实施方案中，它是抗体的F(ab’)2片段。如上所述，抗体或片段可以是任何类别或同种型。然而，在特定实施方案中，它是IgG抗体，更特别地是IgG1或IgG2抗体。在某些实施方案中，IgG2形式是优选的。例如，它可以是完整的IgG2抗体或F(ab’)2IgG2抗体片段。
因此，第一特异性结合分子可以是抗CD40抗体或抗体片段或从其衍生或获得的抗原结合蛋白。已经描述了广泛的抗CD40抗体，并且是可用的。如上所述，可以使用描述于以下中的抗CD40抗体：WO 2016/023960、WO 2015/091853、US 2017/032159、US 2009/0074711、US 2017/0137528、US 2017/0342159和WO 2014/070934以及这些中的任何一种，或者基于这些或衍生自这些的抗体或抗体片段或抗体构建体。这些文献提出了各种抗体的CDR和/或VH和VL序列，使得能够制备抗原结合蛋白和包含这种基于它们的序列的缀合物。它们还描述了各种抗体变体以及人抗体或人源化抗体的制备。可替代地，可以根据公知的方法生成抗CD40抗体。
如上所述，测定和筛选抗CD40抗体的CD40激动剂活性的方法在本领域是公知的和可用的，例如通过测定抗体诱导骨髓DC产生IL-12的能力来测定DC细胞激活，例如通过ELISA。以这种方式，可以鉴定和选择激动性第一特异性结合分子。
抗体可以是选自CP-870,893、APX005M、ADC-1013、Chi Lob 7/4、SEA-CD40、ABS-1132/1133、ABS-1140/1135和ABS-1150/1151的抗体。这些抗体中的任何一种都可以原样使用，或者它们可以用作制备用作一个或多个第一特异性结合分子的抗体衍生物的基础。
特别地，可提及以下抗体，其可用作第一特异性结合分子，或作为第一特异性结合分子的基础(例如衍生片段或其他衍生物或构建体)(除非另有说明，此处和全文中呈现的CDR序列如IMGT所鉴定)：
(i)抗体ABS-1150/1151，其描述于WO 2015/091853。该抗体的VH和VL序列分别在SEQ ID NO:23和24中列出(相应的DNA序列分别在SEQ ID NO:25和26中列出)。VHCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:17-19中列出，并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:20-22中列出。在WO 2015/091853中也描述了ABS-1132/1133和ABS-1140/1135，其提供了这些抗体的CDR序列以及完整的VL和VH序列。
(ii)抗体CP-870,893，其描述于US 2017/0342159。该抗体的VH和VL序列分别在SEQ ID NO:27和28中列出(相应的DNA序列分别在SEQ ID NO:29和30中列出)。VHCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:64-66(如由IMGT鉴定)中列出，并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:67-69(如由IMGT鉴定)中列出。
(iii)抗体ADC-1013，其描述于WO 2016/023960。该抗体的VH和VL序列分别在SEQID NO:37和38中列出(相应的DNA序列分别在SEQ ID NO:39和40中列出)。VHCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:31-33(如由IMGT鉴定)中列出，并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQID NO:34-36(如由IMGT鉴定)中列出。VHCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:138-140(如由Kabat鉴定)并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:141-143(如由Kabat鉴定)中列出。
(iv)抗体ChiLob 7/4，其描述于US 2009/0074711。该抗体的VH和VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO:52和53中列出。
(v)抗体SEA-CD40，其描述于US 2017/0137528。该抗体的VH和VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO:54和55中列出。
(vi)抗体APX005M，其描述于WO 2014/070934。该抗体的VH和VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO:56和57中列出。VHCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:58-60(如由IMGT鉴定)中列出，并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:61-63(如由IMGT鉴定)中列出。VHCDR1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:144-146(如由Kabat鉴定)中列出，并且VLCDR 1、2和3的序列分别在SEQ ID NO:147-149(如由IMGT鉴定)中列出。
抗原结合蛋白可包含来自每个相应抗体的VH和/或VL的一个或多个CDR，或其变体。
因此，缀合物的第一特异性结合分子可以是包含至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)的抗原结合蛋白，其中：
(i)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:17、18和19中列出的氨基酸序列，并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:20、21和22中列出的氨基酸序列；或者
(ii)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:31、32和33中列出的氨基酸序列；并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:34、35和36中列出的氨基酸序列；或者
(iii)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:58、59和60中列出的氨基酸序列；并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:61、62和63中列出的氨基酸序列；或者
(iv)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:64、65和66中列出的氨基酸序列，并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:67、68和69中列出的氨基酸序列；或者
(v)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:138、139和140中列出的氨基酸序列，并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:141、142和143中列出的氨基酸序列；或者
(vi)(a)VH区域包含VHCDR 1、2和3，所述VHCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:144、145和146中列出的氨基酸序列，并且
(b)VL区域包含VLCDR 1、2和3，所述VLCDR 1、2和3分别包含以下(或在一个实施方案中由以下组成)：SEQ ID NO:147、148和149中列出的氨基酸序列；
任选地，其中除SEQ ID NO.21的VLCDR2以外的所述CDR序列中的一个或多个被1、2或3个序列修饰所修饰，或者其中SEQ ID NO.21的VLCDR2被1或2个序列修饰所修饰。
因此，CDR序列可以任选地是包含相对于上述SEQ ID NO中列出的序列的序列修饰的变异序列。序列修饰可以是氨基酸的取代、添加或缺失，特别是取代或添加，更特别是取代。该取代可以是保守的取代。在一个实施方案中，CDR包含1或2个或1个修饰。优选地，在给定可变区域中的CDR 1和2中的一个或多个被修饰，并且CDR3未被修饰。在某些优选的实施方案中，CDR未被修饰。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸往往具有相似的性质，因此对多肽的结构或功能重要的氨基酸的保守取代可以预期比在相同位置的非保守氨基酸取代对多肽的结构/功能的影响更小。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)，非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，保守氨基酸取代可以被认为是一种取代，其中特定的氨基酸残基被相同家族中的不同氨基酸残基取代。然而，CDR序列中氨基酸残基的取代也可以是非保守取代，其中一个氨基酸残基用具有属于不同家族的侧链的另一个氨基酸残基取代。
变体CDR在功能上与它们各自对应的天然未修饰的CDR等同。功能等同是指蛋白或氨基酸序列(这里是CDR)保留或基本上保留其衍生或基于(即与其对应)的蛋白或氨基酸序列(这里是CDR)的功能或活性。特别地，功能等同变体可保留相应(未修饰的)蛋白或氨基酸序列的至少70％，或更特别地至少75％、80％、85％、90％或95％的活性或功能。在实践中，这意味着变体CDR不负面影响或基本上不负面影响其存在于其中的抗原结合蛋白的功能或活性或性质(与天然或未修饰的抗原结合蛋白(例如抗体)相比，或与CDR区域未修饰的抗原结合蛋白相比)。原则上，这意味着变体CDR不影响抗原结合蛋白的结合特异性，即该蛋白保留了与CD40特异性结合的能力。此外，与天然或未修饰的抗原结合蛋白或具有未修饰的CDR区的抗原结合蛋白相比，抗原结合蛋白的结合亲和力没有显著降低。然而，抗原结合蛋白的结合亲和力可通过修饰CDR区，特别是CDR 1和/或2而提高。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO:23、27、37、52、54或56中任一个中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、27、37、52、54或56具有至少70％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:24、28、38、53、55或57中任一个中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24、28、38、53、55或57具有至少70％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含：
(a)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:23具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少70％序列同一性的序列；或者
(b)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:27具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少70％序列同一性的序列；或者
(c)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:37具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38具有至少70％序列同一性的序列；或者
(d)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:52中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:52具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53具有至少70％序列同一性的序列；或者
(e)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:54具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55具有至少70％序列同一性的序列；或者
(f)VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:56具有至少70％序列同一性的序列，所述VH区包含SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57具有至少70％序列同一性的序列。
因此可以看出，在这样的实施方案中，抗原结合蛋白可以包含VH和VL区域，所述VH和VL区域包含序列，所述序列是上述SEQ ID NO中列出的VH和VL区域序列的变体，即其包含相对于所述SEQ ID NO的序列修饰，只要它们满足至少70％序列同一性的要求。这样的序列修饰可以是一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。上面讨论了序列修饰。特别地，氨基酸取代可以是保守取代。变体序列可以在功能上与它们各自的亲本序列等同，如上文所定义和解释的。在某些实施方案中，在这样的变体序列中，CDR序列不被修饰。因此，在某些实施方案中，CDR序列可以如上面给出的CDR序列中所述。
根据上述任何实施方案的抗原结合蛋白也可以包含恒定区。因此，抗原结合蛋白可包含人轻链区，所述人轻链区包含分别如SEQ ID NO:45和46中列出的κ和λ恒定结构域序列的全部或部分，或与之具有至少70％序列同一性的序列。更特别地，抗原结合蛋白可包含Fc区。如上所述，Fc区可以来自任何类型的抗体，特别它可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区。
因此，抗原结合蛋白可包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:41、42、43或44中任一个中列出的序列，或与其具有至少70％序列同一性的序列。特别地，第一特异性结合分子可包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:41或42中任一个中列出的序列，或与其具有至少70％序列同一性的序列。前面关于变体序列、序列修饰和功能等同的讨论也适用于这一上下文。因此，恒定区或其结构域可以包括相对于天然序列的一个或多个序列修饰。例如，已知的突变可能改变或影响含有这种经修饰(经突变)的恒定区的抗体或抗体构建体的性质。一种这样的突变体，IgG2 C127S，在下面的实施例1中描述。该突变体锁定在IgG2B构象上，已发现该构象增强IgG2抗体启动免疫应答的能力。IgG2C127S变体的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:15中。从序列比较可以明显看出，天然IgG2恒定序列(SEQ IDNO:42所示)的位置14的半胱氨酸残基被C127S变体(SEQ ID NO:15所示)中的丝氨酸取代。
因此，抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是具有至少70％序列同一性的特定序列的变体。在特定实施方案中，序列同一性可以是至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
序列同一性％可以通过任何方便的方法来评估。然而，为了确定序列之间的同一性程度，对序列进行多次比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson,Higgins,Gibson,Nucleic Acids Res.[核酸研究],22:4673-4680,1994)。如果需要，可以将ClustalW算法与BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:10915-10919,1992)一起使用，并且缺口开放惩罚为10和缺口延伸惩罚为0.1，使得在两个序列之间获得最高级别的匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。可用于比对序列的其他方法是Needleman和Wunsch的比对方法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443,1970)，如Smith和Waterman(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展],2:482,1981)修订，从而在两个序列之间获得最高级别的匹配，并且在两个序列之间确定相同氨基酸的数目。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，并且包括例如Carillo和Lipton所描述的那些方法(Carillo和Lipton,SIAM J.Applied Math.[应用数学杂志],48:1073,1988)和在Computational Molecular Biology[计算分子生物学],Lesk,编辑Oxford UniversityPress[牛津大学出版社],纽约,1988,Biocomputing:Informatics and GenomicsProjects[生物计算：信息学和基因组学项目]中所描述的那些方法。
通常，将使用计算机程序进行这种计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller,CABIOS,4:11-17,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],85:2444-2448,1988；Pearson,Methodsin Enzymology[酶学方法],183:63-98,1990)和缺口BLAST(Altschul等人,Nucleic AcidsRes.[核酸研究],25:3389-3402,1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux,Haeberli,Smithies,Nucleic Acids Res.[核酸研究],12:387,1984)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白序列比对(Holm,Trends inBiochemical Sciences[生物化学科学趋势],20:478-480,1995；Holm,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],233:123-38,1993；Holm,Nucleic Acid Res.[核酸研究],26:316-9,1998)。
在未修饰(即参考)的氨基酸(或核苷酸)序列的整个长度上确定序列同一性(即进行全局序列比对)。
通过提供参考点，根据本发明的具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列可以使用具有缺省参数的ALIGN程序(例如可在因特网上的GENESTREAM网络服务器，IGH，蒙彼利埃(Montpellier)，法国上获得)来确定。
第二特异性结合分子可以是上述任何类型的抗原结合蛋白。然而，在特定实施方案中，它可以是合成抗体构建体，特别是单链抗体。在一个实施方案中，第二特异性结合分子是scFv。
第二结合分子的特异性将取决于标签部分，并且根据上面的讨论，第二结合分子将对标签部分具有结合亲和力。制备对给定或选择的标签部分具有特异性的结合分子，特别是包括抗原结合蛋白，在本领域技术人员的常规技术范围内。实际上，抗体-标签部分对在本领域中是已知的和可获得的，例如抗体-半抗原对。基于可用的抗体序列(蛋白和DNA)，本领域技术人员容易制备各种基于抗体的构建体，包括单链抗体和scFv。此外，一旦鉴定和制备了所期望的标签部分，例如标签肽，则常规事项是针对其生成特异性结合剂，或筛选结合分子文库以鉴定针对其的适当或合适的特异性结合分子。用于产生和选择抗体的技术，以及用于确定它们的序列和编码它们的序列的技术，以及用于制备基于抗体的抗原结合结构域的衍生抗体构建体的技术是众所周知的。下面的实施例1描述了两个针对肽部分的scFv第二结合分子(称为pTAG-scFv)。可制备针对其他标签肽的等同scFV第二结合分子。
优选地，第二特异性结合分子以高亲和力结合标签部分(并且更特别地结合当包含在本文定义的标签构建体中时的标签部分)。在这方面应当理解，当第二结合分子存在于缀合物中时，第二结合分子能够结合标签部分以形成具有长半衰期的复合物。长半衰期是指相互作用的koff(kd)为0.0015s-1或更小，优选为0.0005s-1或更小(如上所述)。
在特定实施方案中，scFv结合SEQ ID NO:6的MTTE。结合MTTE的scFv的实例包括14GIIICII-b(SEQ ID NO:47)和1BIIICI-b(SEQ ID NO:48)。14GIIICII-b scFv的CDR在SEQID NO:126-131中列出。VHCDR 1、2和3分别具有SEQ ID NO:126-128中列出的氨基酸序列。VLCDR 1、2和3分别具有SEQ ID NO:129-131中列出的氨基酸序列。1BIIICI-b scFv的CDR在SEQ ID NO:132-137中列出。VHCDR 1、2和3分别具有SEQ ID NO:132-134中列出的氨基酸序列。VLCDR 1、2和3分别具有SEQ ID NO:135-137中列出的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二特异性结合分子是scFv，其包含具有SEQ ID NO:126-131中列出的氨基酸序列的六个CDR。在另一个实施方案中，第二特异性结合分子是scFv，其包含具有SEQ ID NO:132-137中列出的氨基酸序列的六个CDR。在又一个实施方案中，第二特异性结合分子是scFv，其包含SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性氨基酸。
第二特异性结合分子可以与第一特异性结合分子的轻链或重链共价连接。如上所述，第二特异性结合分子可在分子的任一末端或其组成部分(例如多肽或链)的任一末端，例如在其C-或N末端与第一特异性结合分子连接。在特定实施方案中，第二特异性结合分子连接到第一抗原结合蛋白的重链或轻链的C末端。因此，第二特异性结合分子可以连接到轻链(CL)的恒定区或重链的恒定区的恒定结构域(CH结构域)，例如CH3结构域。然而，第二结合分子(例如scFv)可以附接到重链或轻链的N末端。
在一个实施方案中，第一特异性结合分子可以是完整的抗体，例如IgG抗体，第二特异性结合分子可以连接到VH或VL，或更优选连接到其CL或CH3结构域。更具体地，第二特异性结合分子可连接到每条链的VH、VL、CL或CH3结构域。更特别地，两个第二特异性结合分子中的每一个可以连接到两个链中的每一个中的相同(在相同类型的意义上)结构域。然而，在其他实施方案中，第二特异性结合分子可以连接到两个链中的不同结构域(即不同类型的结构域)，例如，在相同或另一个链中，一个第二结合分子可以连接到CL结构域，并且一个第二结合分子可以连接到CH3结构域。在一个实施方案中，第二结合分子可连接到每条链的CL和CH3结构域(即，缀合物可包含4个第二结合分子)。
在一个优选的实施方案中，缀合物包含一个第一特异性结合分子(其为抗体)，以及两个第二特异性结合分子(其为scFv)，其中：
i)一个scFv缀合到所述抗体的每条重链的CH3结构域；或者
ii)一个scFv缀合到所述抗体的每条轻链的CL结构域。
(i)的缀合结构如图6所示。
本公开和本发明还延伸到核酸分子，所述核酸分子包含编码如本文所定义的缀合物的核苷酸序列，所述缀合物包含第一和第二特异性结合分子，其中所述第一和第二结合分子各自是特异性结合蛋白。更具体地，如本文所公开的，第一和第二结合分子是抗原结合蛋白或其链。因此，在一个实施方案中，核苷酸序列可编码多肽，所述多肽包含对CD40特异性的第一抗原结合蛋白(例如抗体)的VH区或VL区和对标签部分特异性的scFv。更特别地，多肽可包含抗CD40抗体的重链或轻链和对标签部分特异性的scFv。scFv可以直接或间接(即通过接头氨基酸序列)连接至轻链或重链的N末端，或更优选C末端。根据该方面的任何实施方案的核酸分子可以是DNA或RNA。特别地，核酸分子可包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含如本文所定义的VH或VL区的多肽，或更特别地编码包含如本文所定义的VH区的重链或包含如本文所定义的VL区的轻链的多肽。例如，核酸分子可包含SEQ ID NO:25、26、29、30、39或40中列出的核苷酸序列或与任何前述序列(分别编码抗体ABS-1150的VH和VL、抗体CP-870,893的VH和VL以及抗体ADC-1013的VH和VL)具有至少70％序列同一性的序列。在某些实施方案中，序列同一性可以是至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
因此，核苷酸序列可以是具体核苷酸序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述核酸序列的取代、缺失或添加变体。变体多核苷酸可包含SEQ ID NO中给出的序列的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30、多达40、多达50、多达75或更多个核苷酸取代和/或缺失。变体核苷酸序列可以是简并序列。确定核苷酸序列同一性的方法是本领域众所周知的。在未修饰的(即参考)核苷酸序列的整个长度上确定这种同一性。
测量核苷酸序列同一性的算法是本领域已知的。例如，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可用于计算同一性(例如，以其默认设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research[核酸研究]12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法也可用于计算同一性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol[分子进化杂志]36:290-300；Altschul,S,F等人(1990)J Mol Biol[分子生物学杂志]215:403-10中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Centrefor Biotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915-10919)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4、以及两条链的比较作为默认值。
因此，本发明的缀合物可以由编码并能够表达它的多核苷酸产生或以多核苷酸的形式递送。当缀合物包含两条或更多条链时，核酸分子可编码一条或多条链。例如，本发明的多核苷酸可编码轻链、重链或两者。可以提供两个核酸分子，其中一个编码轻链，另一个编码相应的重链。这样的核酸分子或一对核酸分子可以一起表达，从而产生缀合物。
核酸分子可以按照本领域公知的方法合成，如Sambrook等人(1989,MolecularCloning-a laboratory manual[分子克隆-实验室手册]；Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社])中的实施例所述。
可以以表达盒的形式提供核酸分子，所述表达盒包括可操作地连接至编码核苷酸序列的控制序列，从而允许缀合物在体内表达。这些表达盒又通常在载体(例如质粒或重组病毒载体)内提供。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许其缀合物或链表达的任何载体。
因此，本公开和本发明还包括重组构建体，所述重组构建体包含连接到异源核酸序列的如本文所定义的核酸分子。本文所用的“异源”是指与本文所述的核酸分子没有天然连接的核酸序列，即在自然界中与本文所述的核酸分子没有连接的核酸序列。在构建体中，本文所述的核酸分子的侧翼可以是限制性位点(即，由一个或多个限制性内切酶识别的核苷酸序列)，以使本发明的核酸分子易于克隆。“重组”构建体是使用重组技术(例如分子克隆)合成的核酸构建体。
本文中关于构建体使用的术语“连接的”可以简单地表示核酸分子直接连接到异源核酸序列。在优选实施方案中，在重组构建体中，本文公开的核酸分子可操作地连接到异源表达控制序列。
因此，还提供了包含如本文所定义的核酸分子的表达盒，或包含如本文所定义的核酸分子或重组构建体的载体。在分子生物学领域中常规构建表达载体，并且可以例如包括使用质粒DNA和适当的引发剂、启动子、增强子、终止子和其他元件，例如可能需要的聚腺苷酸化信号，其定位在正确的取向上，以便允许缀合物或其链的表达。
其他合适的载体对于本领域技术人员是显而易见的，并且包括例如克隆载体。
本公开和本发明还包括已被修饰以表达本文定义的缀合物或其组成多肽(例如链)的细胞。因此，还提供了包含如本文所定义的核酸分子、重组构建体或载体的细胞，所述细胞是引入了这样的分子、构建体或载体的细胞。细胞可以定义为宿主细胞或生产宿主细胞。
这样的细胞包括瞬时的，或优选稳定的高级真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低级真核细胞，如酵母或原核细胞，如细菌细胞。细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、NSO和COS细胞。优选地，所选择的细胞系将是一种不仅稳定，而且允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达的细胞系。可以使用常规方法培养这样的细胞以产生缀合物。
缀合物用于结合标签部分。如上所述，标签部分可以是可提供特异性结合分子的任何分子或实体。然而，方便地，它可以是标记肽，因为这可以容易地设计或选择以使免疫原性等最小化。如上所述，标记肽优选是非人肽。
如以下实施例1中所述，可以筛选肽文库以鉴定可能的标签肽。例如，可获得或衍生自非人蛋白序列(例如细菌蛋白，例如破伤风毒素(TTx))的肽文库，并对其进行筛选以鉴定具有合适特征的肽。这些特征可以包括，例如，良好的水溶性、α-螺旋结构和非免疫原性，特别是肽不与受试者，最显著的是人受试者中的任何内源性免疫相关联(也就是说，肽不包含任何B细胞表位，特别是任何通用人B细胞表位)。肽文库可以以各种方式产生，包括合成肽的制备。筛选可以使用各种可用软件程序和/或通过结构或其他分析以计算机方式进行。B细胞表位的缺乏可以通过筛选与受试者血清的结合来确定。
从TTx肽片段文库中筛选肽，鉴定出SEQ ID NO:10-13的肽。SEQ ID NO.14是SEQID NO.10的具有加帽末端的衍生物，如实施例1所述。可以使用任何这些，特别是SEQ IDNO:10、13和14。可以以与实施例1中所述类似的方式筛选其他肽文库，以鉴定其他合适的肽标签。
如上所述，标签部分含有CD4表位可能是有利的，肽可以被设计为含有或可以被筛选为含有这样的表位。已特别鉴定出某些肽含有所谓的通用T辅助表位，并且这样的表位可包含在标签肽内。已在某些TTx肽中鉴定出通用表位，例如公知的P2和P30 T辅助表位，并且在一个实施方案中，标签肽可包括这些表位中的一个或两个。在另一个实施方案中，标签肽可以不包括CD4表位。
如上所述，标签部分可以作为包含与抗原共价连接的标签部分的标签构建体的一部分提供。所述连接可以是直接或间接的，即标签部分可以通过接头与抗原连接。接头可以如上所述。在一个实施方案中，标签构建体可以包含与抗原肽连接的标签肽，即作为融合多肽。融合可以是直接的或间接的，例如通过接头肽。标签肽和抗原肽可以以任一顺序连接，即标签肽可以在抗原肽的N末端或C末端。在另一个实施方案中，抗原(例如肿瘤抗原)包埋在标签构建体中，即存在抗原的N末端和C末端的标签部分。因此，标签构建体可包含侧翼是标签部分的抗原，使得标签部分位于所述构建体的N末端和C末端。
因此，缀合物可以用于非共价地结合包含标签部分的标签构建体。以这种方式，可通过结合的标签构建体形成包含与缀合联物非共价连接的抗原的复合物。因此，复合物包含抗原和针对CD40的特异性结合分子。如上所述，标签构建体是合成的或人工的构建体，或在人体(或更广泛地是施用所述缀合物或复合物的受试者的身体)之外产生的生物构建体。因此，本文中的复合物不包括缀合与细胞内或细胞上(例如原位在受试者体内的细胞内或细胞上，或在分离的细胞或细胞培养物内或上等)的蛋白之间的复合物。它也不包括缀合物与哺乳动物蛋白之间的复合物，所述哺乳动物蛋白是可在哺乳动物受试者中出现或发现的天然蛋白，例如可在细胞表面表达的蛋白。复合物是作为分离的复合物提供的。
如上所述，这样的复合物可用于激活APC(通过与细胞表面的CD40结合)，同时将抗原递送至APC。因此，在被激活的同时，APC被诱导摄取、加工和在其细胞表面呈现MHC上的抗原。因此，复合物允许(即使能或促进)APC的同时激活和由APC呈递抗原。APC可以是例如上面列出的任何APC，特别是包括DC。
使用复合物的APC激活可以在体外、离体或在体内进行。因此，可以将APC与复合物在体外或离体接触，或者可以将复合物(或其组成部分)施用于受试者以在体内激活APC。因此，复合物可以具有医学和非医学用途，并且本文涵盖了所有此类用途。例如，分离或培养的APC可与复合物接触，例如在实验室环境中，例如用于研究、开发或测试目的。这可以通过预混合缀合物和标签构建体来实现，以形成复合物，然后将复合物施加到APC上。可替代地，可以将缀合物和标签构建体分别应用于APC，以使复合物在APC培养物中形成。
此外，如上所述，复合物可以用于激活T细胞，特别是表达识别抗原的TCR的T细胞。具体地，当由APC呈递时(即在MHC的情况下)，T细胞识别抗原。因此，可以将由复合物激活的或用于由复合物激活的APC与T细胞接触。因此，例如，APC可在复合物(或其组成部分)存在下培养或温育，随后APC可与T细胞接触，例如共培养，或在T细胞存在下进一步温育。可替代地，可以将复合物(或其组成部分)、APC和T细胞一起温育或共培养。
为了在疗法中使用(包括治疗性治疗和预防性治疗)，复合物可以施用给受试者，如下文更详细描述的。可替代地，可以将缀合物和标签构建体分别施用于受试者，以使得复合物在体内形成，也如下所述。由复合物激活并呈递抗原的APC可体内激活T细胞，所述T细胞表达识别呈递的抗原的TCR。
因此，根据本公开和本发明的复合物的使用允许T细胞被激活。这特别包括效应T细胞，并且特别是CD8+细胞毒性T细胞。这样的细胞毒性T细胞(CTL)可因此被引发以攻击和破坏T细胞识别的细胞，即表达抗原的细胞。如上所述，复合物的标签部分(或组成部分)可以包含CD4表位，并且因此可以起到激活CD4+T细胞的作用。此外，抗原可以包括CD4和/或CD8表位。因此，CD4+细胞可以被激活。以这种方式激活的CD4+细胞可增强免疫应答，例如由内源激活的CD8+细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，CD4+和CD8+细胞均可被复合物激活。复合物的使用可使T细胞激活和T细胞对其靶细胞的应答得到改善。特别地，与单独使用CD40的特异性结合分子(即亲本第一特异性结合分子)相比(例如，与单独使用时缀合物的相同第一特异性结合分子相比)或在与抗原单独组合使用时(即，与使用第一亲本特异性结合分子(如在缀合物中使用)和在复合物中结合的构建体中使用的抗原的混合物相比)，T细胞激活和T细胞免疫应答可得到改善。下面的实施例1证明，与亲本抗体相比，根据本发明原理制备的缀合物的激动活性水平可以提高，并且缀合物可以至少保留亲本抗体的激动活性水平。通过改变缀合物中抗体的种类，可以改善激活APC的激动活性。
抗原可以是期望递送至携带CD40的细胞，特别是APC(例如DC)的任何抗原。因此，抗原可以是APC期望呈递的任何抗原。因此，这可以是抗原，当由APC呈递时，它被T细胞识别，期望激活。在治疗的背景下，期望激活识别与期望治疗或预防的疾病或病症相关的抗原的T细胞。因此，抗原可以是由期望消融或更具体地以靶向消融的细胞(例如在其表面)表达的抗原。因此，抗原可以是癌症抗原或与感染相关的抗原，例如病原体的抗原或衍生自病原体的抗原。因此，T细胞的靶细胞可以是癌细胞或被病原体感染的细胞。病原体可以是病毒或细胞内病原体。
因此，抗原可以是肽。因此，抗原可以包含以下或由以下组成：包含一个或多个抗原表位的肽。表位可以是CD4+和/或CD8+T细胞表位。抗原可以是癌细胞或病原体或其一部分表达的蛋白或多肽。特别地，抗原可以是由癌细胞表达的新抗原，即由癌细胞中的体细胞突变产生的抗原，其不是由非癌细胞表达的。因此，抗原肽可包含一个或多个新表位。这样的新表位可以例如由移码突变产生。此类突变可能发生在显示微卫星不稳定性(MSI)的癌症中。各种新抗原和新表位是已知的，并且在各种不同癌症的背景下在文献中进行了描述。可替代地或另外地，抗原肽可以是或可以包含来自肿瘤相关抗原或癌病毒抗原的一个或多个表位。同样，肿瘤相关抗原在本领域中是公知的并且在文献中被广泛描述，包括例如癌症睾丸抗原和hTERT抗原。病毒抗原也是众所周知和描述的。已知的、经验证的癌症抗原(肿瘤特异性新表位和肿瘤相关抗原)的全面列表可在网上公开获得：“癌症抗原肽数据库”可访问https://caped.icp.ucl.ac.be/Peptide/list。肿瘤抗原的广泛列表也在Wang&Wang,Cell Research[细胞研究]27:11-37,2017中提供。
抗原可以是天然存在的肽分子或天然存在的蛋白的片段或部分。可替代地，它可以是合成肽，例如被设计和制备成包含一个或多个不同表位的肽，例如，这些表位不是天然一起出现的。这样的合成肽可包含直接连接在一起或通过接头或间隔序列间接连接在一起的两个或更多个表位。这种含合成表位的肽(例如合成长肽，SLP)的合成是本领域已知的，并且可以使用已知的SLP肽。
另一方面，本发明提供包含如本文定义和描述的缀合物或复合物的组合物和配制剂。在一个实施方案中，这样的配制剂或组合物可包含与标签构建体一起的缀合物。缀合物和标签构建体可单独配制或提供，或在单一组合物中一起配制或提供。因此，本发明提供药物组合物，其包含如本文所定义的复合物以及药学上可接受的载剂或赋形剂。类似地，本发明提供药物组合物，其包含如本文所定义的缀合物和至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂，以及药物组合物，其包含如本文所定义的标签构建体和至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂。还提供了如上定义的试剂盒或组合产品，其分开地包含本文定义的缀合物和标签构建体。在这样的试剂盒和产品中，缀合物和标签构建体可以单独提供在含有药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物中。
如本文所用，“药学上可接受的载剂或赋形剂”包括在生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
优选地，载剂或赋形剂适合于肠胃外，例如皮内、静脉、肌肉内或皮下施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，可以将复合物或其组成成分包被在材料中，以保护复合物或组分不受酸和可能使其失活或变性的其他自然条件的作用。
优选的药学上可接受的载剂包括水性载剂或稀释剂。可用于药物组合物、试剂盒和产品中的合适水性载剂的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载剂的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。恰当的流动性可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的粒径来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
药物组合物、产品或试剂盒还可包含药学上可接受的抗氧化剂。它们还可以含有辅助剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂、和分散剂。可以同时通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来确保阻止微生物的存在。还可能期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射药物形式的吸收。
治疗组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：视需要将活性剂(例如复合物)以所需量并入含有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后进行灭菌微孔过滤。通常，分散体通过以下来制备：将活性剂并入含有基本分散介质和来自上文所列举的那些的所需其他成分的无菌媒剂中。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性剂加上任何另外的所需成分的事先经无菌过滤的溶液产生所述活性剂加上任何另外的所需成分的粉末。
药物组合物、产品和试剂盒可包含另外的活性成分以及其复合物或组分，例如包含另外的治疗剂或预防剂。因此，复合物可用作单一疗法或作为联合疗法的一部分，例如用于癌症的治疗。
本文所述的试剂盒或组合产品可另外包含使用说明书。
本文定义的复合物或包含本文定义的缀合物和标签构建体的组合产品可以用于疗法中。本发明的组合产品包含如本文定义的缀合物和如本文定义的标签构建体，作为在疗法中同时或顺序使用的组合制剂。也就是说，当根据本发明使用本文公开的组合产品时，即在疗法中，缀合物和标签构建体同时或顺序地施用给受试者。如本文所用，“同时”施用是指通过相同的施用途径并且在基本上相同的位置同时或至少基本上同时地将两种组分施用给受试者。如本文所用，“顺序”施用是指将两种组分在不同时间施用给受试者。特别地，在开始第二组分的施用之前，完成第一组分的施用。
由于本发明的性质，两种组分的顺序施用要求两者(即缀合物和标签构建体)都必须通过相同的途径并在基本上相同的位置施用。此外，尽管缀合物和标签构建体的施用可以在时间上间隔开，但是当两种组分都已经施用时，施用之间的间隔应当使得允许形成复合物。因此，例如，两种组分可以在彼此之间的1小时之内，或更具体地在彼此的40、30、20、15、10、8、7、6或5、4、3、2、1或0分钟之内施用。
提及用于治疗目的施用给受试者的本发明复合物理解为是指包含复合物两种组分(即本发明的缀合物和本发明的标签构建体)的预混合组合物(例如溶液)，所述组分可以以包含复合物及其两种单独组分的动态平衡存在。
疗法可以是治疗性或预防性的。复合物(和组合产品)因此可以用作治疗性疫苗或预防性疫苗。在治疗应用中，复合物或组合物以足以治愈、减轻或部分阻止所述病症或其一种或多种症状的量施用给已经患有障碍或病症的受试者。这样的治疗性治疗可导致疾病症状的严重程度降低，或无症状期的频率或持续时间增加。足以完成其的量定义为“治疗有效量”。特定目的的有效剂量取决于疾病或病症的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
预防性治疗可包括预防病症，或延迟病症的发展或发病。例如，复合物可用于预防感染，或用于降低感染可能发展的程度，或用于预防癌症发展或复发、延迟癌症发展或复发或降低癌症发展或复发的程度，或例如用于预防或降低转移的程度。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物受试者。受试者尤其可以是哺乳动物受试者。特别是，受试者可以是人，或者实验室动物、家畜、家养动物、竞赛动物或动物园动物等。因此，受试者可以是灵长类或啮齿动物。在一个优选的实施方案中，受试者是人。如上所述，本发明可用于兽医学，在这种情况下，受试者是非人哺乳动物。在特定实施方案中，受试者可以是狗，在这种情况下，可以使用本发明的犬缀合物，如上所述。
特别地，复合物(和组合产品)可用于治疗或预防癌症。癌症是指任何恶性或恶性前的赘生性病症。因此，癌症可以是任何器官、组织或细胞类型的任何癌症。包括以实体瘤形式出现和不显示实体瘤的癌症。因此，包括造血癌。
癌症可以是前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌、头颈癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤或皮肤癌。也可能是肾上腺癌、骨癌、脑癌、食道癌、眼癌、胃癌、口腔癌、阴茎癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。肥大细胞肿瘤和血管肉瘤也可以根据本发明进行治疗。在犬疗法的情况下，本发明可用于治疗犬可传播的性病(CTVT)或犬黑素瘤或其他犬恶性肿瘤。
癌症可以是新诊断的，对治疗来说是初次的，也可以是复发的或难治的，也可以是复发的和难治的，也可以是原发的或转移的。
如上所述，包含在缀合物中的CD40结合剂以及因此的复合物通过激动CD40来激活免疫系统。特别地，可以激活T细胞。随后的免疫应答对邻近的或可接近的肿瘤细胞产生抗癌作用，而不考虑肿瘤的CD40表达。因此，复合物可以对CD40阳性和CD40阴性癌症均有效，
除了由CD40结合剂提供的激动性免疫激活效应外，复合物还提供抗原，其可被处理并呈递给被激活的T细胞，因此T细胞可被引发以靶向表达抗原的癌细胞。
在癌症抗原存在较少或减少的情况下，例如在肿瘤已经手术切除的情况下，或在抗-CD40治疗不能在肿瘤内递送的情况下，这可能是特别有利的。复合物提供了在激活激动信号附近提供癌症抗原的手段。
可以基于受试者和特定癌症来选择癌症抗原，从而允许个性化医学。例如，可以对受试者的癌症进行基因谱分析，从而选择合适的抗原。可以提供抗原库或文库，或包含抗原的标签构建体，根据受试者的癌症类型，可以从中制备或选择合适的标签构建体。
复合物(和组合产品)也可用于治疗或预防感染。本发明可特别用于针对病毒感染的疗法中，例如由爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒(例如HHV-6)、细小病毒B19、人乳头瘤病毒(HPV)和罗斯河病毒引起的感染，尽管原则上任何病毒感染都可根据本发明治疗。细胞内细菌感染也可以根据本发明进行治疗，例如布鲁氏菌病(由布鲁氏菌(Brucella)属的细菌物种引起)，Q热病(由伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)引起)，衣原体物种引起的疾病，例如衣原体病(由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)引起)和肺炎(由肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)引起)，麻风病(由麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和Mycobacterium lepromatosis)以及结核病，包括散播性结核(由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起)。细胞内真菌或原生动物感染也可通过本发明治疗，包括利什曼原虫病(由利什曼原虫属的锥虫引起)和弓形虫病(由顶复门原虫刚地弓形虫引起)。
抗原(例如癌症抗原或病原体来源的抗原)可被选择为被要治疗的受试者中的特定T细胞亚群识别，所述T细胞表达已知识别所选抗原的TCR。特别地，抗原可基于其被用于要治疗的受试者的过继细胞疗法中的T细胞识别而选择。
例如，在过继细胞疗法中，可以从受试者获得T细胞，并且分离出识别目的抗原的T细胞。分离的T细胞然后可以被扩增和/或以其他方式治疗以刺激其效应子功能，然后被重新输注入要治疗的受试者中。在这种情况下，由重新输注入的T细胞识别的抗原可以用于标签构建体中。然后可以将本发明的复合物施用于受试者，以使抗原激活重新输注入的T细胞。
可替代地，可以从要治疗的受试者或供体获得T细胞，并进行基因修饰以表达识别靶抗原的TCR。基因修饰的T细胞然后可以被扩增和/或以其他方式治疗以刺激其效应子功能，然后被输注入(或重新输注入)要治疗的受试者中。在这种情况下，由基因修饰的T细胞识别的抗原可以用于标签构建体中。然后可以将本发明的复合物施用于受试者，以使抗原激活输注入的T细胞。将本发明的复合物的施用与过继细胞疗法相结合的方法在癌症的治疗中特别有用，在这种情况下，标签构建体中使用的抗原是癌症抗原。
因此，在特定实施方案中，本发明提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(i)从所述受试者获得T细胞；
(ii)分离识别靶癌症抗原的T-细胞，并任选地扩增所分离的T-细胞；
(iii)将所述分离的T细胞重新输注入所述受试者；以及
(iv)给所述受试者施用本发明的复合物，其中所述标签构建体包含所述靶癌症抗原。等同地，在步骤(iv)中，可以可替代地向受试者分开施用本发明的缀合物和本发明的标签构建体。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：
(i)从所述受试者或供体获得T细胞；
(ii)基因修饰所述T细胞以表达识别靶癌症抗原的TCR,并且任选地在基因修饰之前或之后扩增所述T细胞；
(iii)将所述基因修饰的T细胞输注入所述受试者中；以及
(iv)给所述受试者施用本发明的复合物，其中所述标签构建体包含所述靶癌症抗原。等同地，在步骤(iv)中，可以可替代地向受试者分开施用本发明的缀合物和本发明的标签构建体。
如上所述，标签部分可包含人B细胞表位(至少在某些个体中)，或者在暴露期间可随时间产生针对标签部分的抗体，但标签部分可与要治疗的受试者中的内源性循环抗体相比更强地被第二特异性结合分子结合。在一个实施方案中，可分析要治疗的受试者中内源性循环抗体结合的标签部分，以将它们与要治疗的受试者的内源性循环抗体的相互作用及其与本发明的一个或多个第二特异性结合分子的相互作用的强度进行比较。选择比内源性循环抗体更强地结合本发明的第二特异性结合分子的标签部分。然后给受试者施用所选择的标签部分和包含结合所述标签部分的相关第二特异性结合分子的缀合物的组合。
在另一个实施方案中，可将包含B细胞表位的标签部分与包含以高亲和力(即低Kd，这不允许内源性抗体在施用组合后胜过缀合物和标签的相互作用)结合标签部分的第二特异性结合分子的缀合物组合施用给要治疗的受试者。使用以高亲和力结合标签部分的第二特异性结合分子可避免第二特异性结合分子在与标签的结合方面被受试者的内源性抗体胜过，或被这样的内源性抗体交换。
在上述实施方案中，提及的利用本发明的缀合物和标签构建体的组合的疗法包括以本发明的复合物形式的组分的共同施用和两种组分的单独施用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者的癌症或感染的方法，所述方法包括：
i)鉴定以高亲和力进行相互作用的标签部分和第二特异性结合分子；
ii)选择包含(i)的第二特异性结合分子的本发明的缀合物和包含(i)的标签部分和抗原的本发明的标签构建体；以及
iii)给所述受试者施用(ii)的标记构建体和(ii)的缀合物的组合。
这种方法可以看作是利用包含第二特异性结合分子的缀合物，所述第二特异性结合分子结合标签部分，其亲和力高于所述标签部分被受试者内源性抗体结合的亲和力。
如上所述，本发明的复合物或缀合物和标签构建物可用作单一疗法，或与其他治疗剂联合使用。因此，在癌症的治疗中，其他治疗剂可以是抗癌剂，如本领域已知的多种类别的化学治疗剂，或免疫剂，包括例如干扰素、免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4抗体)和其他免疫增强剂(例如抗OX40激动性抗体)。其他治疗剂在治疗癌症或感染方面可能是有益的，例如抗增殖或抗炎细胞因子，以及抗增殖、免疫调节或影响血液凝固的因子，或血管生成抑制剂。对于感染的治疗，另一种(或第二)治疗剂可以是抗微生物剂，例如抗生素剂、抗真菌剂或抗病毒剂。
复合物或包含所述复合物的组合物，或其缀合物和标签构建体组分，可通过以下一种或多种途径施用：使用本领域已知的多种方法中的一种或多种进行施用。类似地，缀合物和标签构建体可以通过这些相同的方法单独施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。优选的施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注，例如直接到肿瘤部位。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射。可替代地，可以使用非肠胃外途径，例如局部、表皮或粘膜施用途径。首选局部施用，包括瘤周、瘤旁、瘤内、病灶内、病灶周、腔内输注、膀胱内施用、和吸入。但是，复合物或组合物也可以全身施用。
在单独施用缀合物和标签构建体的实施方案中，即它们不首先预混合形成复合物，必须经由相同的途径施用缀合物和标签构建体。优选地，它们都在相同(或基本相同)部位局部施用，例如皮内施用，使得两种组分在施用后迅速混合并组合形成复合物。在这些实施方案中，两种组分必须同时或相继快速地给受试者施用，以避免第一组分的施用和第二组分的施用之间的延迟。这确保在第一组分降解或从施用部位过度扩散之前施用第二组分，并使复合物形成成为可能。
本发明抗体的合适剂量可以由熟练的医学从业者确定。可以改变本发明药物组合物和产品中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述活性成分的量有效地实现对于特定的受试者(即患者)、组合物和施用方式的所需的治疗应答，而对所述患者没有毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所采用的特定复合物/缀合物的活性、施用途径、施用时间、复合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
本发明的复合物(或缀合物)的合适剂量可以例如在约0.1μg/kg至约100mg/kg要治疗患者体重的范围内。例如，合适的剂量可以是每天约0.1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的所期望应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者剂量可以是根据治疗情况的紧急程度成比例地减少或增加。以剂量单位形式配制肠胃外组合物特别有利，以易于施用和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于要被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载剂相关的所期望疗效的活性化合物的预定量。
复合物/缀合物和标签构建体可以单剂量或多剂量施用。可以通过相同或不同的途径并在相同或不同的位置施用多个剂量。可替代地，复合物可以作为持续释放配制剂施用，在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率可以根据患者中抗体的半衰期和所需的治疗持续时间而变化。施用的剂量和频率也可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，可以在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。在治疗性应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。在示例性剂量方式中，将复合物(或缀合物和标签构建体的组合)以周期每周施用一次、每两周施用一次或每三周施用一次给药受试者，重复2-10次。
两种或更多种药剂的联合施用可以多种不同方式实现。在一个实施方案中，复合物和另一种试剂可以单一组合物一起施用。在另一个实施方案中，作为组合疗法的一部分，可以在分开的组合物中施用复合物和另一种药剂。例如，复合物可以在另一种药剂之前、之后或同时施用。本发明的复合物可与肿瘤靶向抗体、靶向疗法、途径抑制剂或靶向例如PD-1、PD-Ll、CD137、GITR、OX40、CTLA-4、CD27、HVEM、LtBR和LAG3的其他免疫调节抗体组合或依次施用。此外，复合物也可以与局部放射结合。类似地，当将缀合物和标签构建体分别施用于受试者时，可以共同施用这样的另外的疗法。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不应将其解释为限制性的。
实施例
实施例1
材料与方法
细胞
B3Z(Karttunen等人,PNAS[美国国家科学院院刊]89(13):6020-6024,1992)，一种在鼠I类MHC H-2Kb的背景下表达识别卵白蛋白肽OVA257-264的TCR的鼠T细胞杂交瘤(SIINFEKL，SEQ ID NO:1)，用于评估肽负载和随后的抗原呈递。B3Z细胞在IL-2启动子的控制下表达β-半乳糖苷酶，当T细胞激活和增殖后，该酶将被表达。β-半乳糖苷酶能够水解底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)，从而导致颜色变化，其幅度与B3Z T细胞激活水平相应。因此，可以通过分光光度法检测和测量B3Z活化。
Pmel-1小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(美国)，小鼠品系005023，下文进一步描述)是具有T细胞的转基因小鼠，所述T细胞在鼠I类MHC H-2Db的背景下表达对鼠gp100特异性的TCR(25-33)肽(SEQ ID NO:2，黑色素瘤抗原gp100的氨基酸25-33)，并且在H-2Db的背景下也识别相应的人gp100序列。通过收集成年Pmel-1小鼠的脾脏和腹股沟淋巴结来分离Pmel-1 T细胞。将这些器官在70μm的细胞过滤器上研磨而切碎，随后的细胞通过该细胞过滤器以实现单细胞悬浮液。分离T细胞，并将分离的T细胞用于过继T细胞转移实验。
抗体和多肽
基于CP-870,893和ABS-1150/1151的可用轻链和重链序列(有时在此可替代地称为ABS-1150)，抗CD40抗体由药物发现和开发(DDD)平台，生命科学实验室(SciLifeLab)(瑞典)制造，或从绝对抗体公司(Absolute Antibody)(英国)定制购买。测试了九种双特异性抗CD40抗体和6种亲本激动性人抗CD40抗体。表1描述了所使用的抗体。抗体在HEK293细胞中表达，并通过使用蛋白A的亲和色谱法和制备型尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化。通过LAL生色内毒素测定法测定，内毒素水平<1EU/mg。合成长肽(SLP)购自卡帕拉科学公司(CapraScience)(瑞典)。表2提供了所使用的SLP的氨基酸序列。
小鼠
将成年C57BL/6小鼠和雄性Pmel-1转基因小鼠饲养在乌普萨拉生物医学中心(Uppsala Biomedical Center，BMC，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)的动物设施中。所有动物实验均已获得乌普萨拉地区动物伦理委员会的批准。
骨髓细胞分离和骨髓树突状细胞(BMDC)分化
在无菌条件下从成年雌性tghCD40小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓细胞(Mangsbo等人,Clin Cancer Res[临床征研究]；21(5)；1115-1126,2015)。来自tghCD40的BMDC表达人CD40。去除软组织后，骨骼用70％乙醇消毒，然后通过切开骨骺暴露骨髓。使用IMDM培养基将骨髓细胞冲洗出骨骼，直到骨骼的核心变白。使细胞团通过70μm细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。通过离心洗涤细胞，然后在补充有10％DMSO的FBS中于-160℃冷冻直至使用。
为了BMDC分化，将骨髓前体细胞(如上所述分离)解冻并在完全IMDM培养基(即添加10％FBS、1％青霉素/链霉素、1％HEPES和0.5％2-巯基乙醇的IMDM培养基)中以浓度2.5x105个细胞/ml在非组织培养处理(TCT)板中在20ng/ml mGM-CSF存在下培养八天。在第3天和第6天交换一半的培养基，并用20ng/ml mGM-CSF的新鲜完全IMDM代替。在第8天，通过用预热的IMDM培养基温和洗涤板来收获细胞，并进行流式细胞术以检测DC分化标志物(CD11b和CD11c)和激活标志物(CD86和MHC-II)。
BMDC成熟和激活方案
骨髓前体细胞分化8天后，将1x105未成熟的BMDC铺在96孔TCT板中。将抗CD40抗体(参见表1)以500-0.0064nM的浓度添加到每个孔中。在收集上清液之前，在补充有20ng/mLmGM-CSF的IMDM培养基中将BMDC培养48小时，然后进行针对IL-12的ELISA以评估不同抗体的激动性刺激能力。作为阳性对照，在1μg/ml LPS(代替抗体)存在下，对如上所述培养的BMDC的上清液进行IL-12ELISA；作为阴性对照，ELISA在IMDM培养基上进行。测试一式两份进行。
表1
Figure BDA0003077620280000411
“scFv附加位置”是指scFv所附接的亲本抗体上的位置。通过肽接头(SEQ ID NO:49)完成附加。IgG2的C127S突变体被锁定为IgG2B构象，并且已经发现增强IgG2抗体启动免疫应答的能力(White等人,Cancer Cell[癌细胞]27:138-148,2015)。
抗体ABS-1150和CP-870,893的VH和VL序列分别显示在SEQ ID NO:23和24，以及27和28中。人IgG1和IgG2恒定结构域和人κ和λ恒定结构域序列分别显示在SEQ ID NO:41、42、45和46中，scFv 14GIIICII-b、IBIIICI-b和FITC-8的序列分别显示在SEQ ID NO:47、48和70中。
体外T细胞激活测定
骨髓前体细胞分化8天后，将25,000个未成熟的BMDC铺在96孔TCT板中。将包含浓度为125nM或250nM的UU-05或UU-10SLP(表2)以及上述各种抗CD40抗体之一的混合物添加到未成熟的BMDC培养物中。24小时后，收集含有肽/抗体混合物的上清液，并在对BMDC的干扰最小情况下用预热的IMDM离心将孔洗涤两次。
将B3Z T细胞添加到BMDC中，并将共培养物再温育24小时，然后通过添加裂解缓冲液(100mMβ-巯基乙醇、0.125％IGEPAL CA-630、9mM MgCl2和1.8μg/ml CPRG)裂解细胞。裂解细胞以使β-半乳糖苷酶进入CPRG。通过在裂解缓冲液中温育6小时后读取595nm处的培养基的吸光度来确定颜色变化。
表2
肽 序列 SEQ ID NO
UU-05 FIGITELKKLESKINKVFLEQLESIINFEKLAAAAAK 3
UU-10 LEQLESIINFEKLAAAAAK 4
UU-30 FIGITELKKLESKINKVFAVGALKVPRNQDWLGVPRQL 5
体内实验设置
将成年雌性C57BL/6小鼠(体重18-20g)用于体内抗原摄取模型。第0天C57BL/6小鼠组(每组6-10只)经尾静脉注射接受来自Pmel-1小鼠11×106个脾细胞(i.v.)和1x105个tghCD40未成熟BMDC(右侧足垫注射)。在第1天，抗CD40抗体与UU-30肽(含有gp100(25-33)序列，表2)的不同组合注射在右侧脚垫上以研究体内肽摄取。72小时后，收集脾脏和右侧腘淋巴结，通过70μm细胞过滤器获得单细胞悬浮液。通过CD90.1(一种在宿主T细胞上不表达的同源标志物)的流式细胞术染色来评估Pmel-1细胞在腘淋巴结中的积累和激活。结果的统计分析采用单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验。
流式细胞术
以下来自生物传奇公司(Biolegend)(美国)的荧光标记抗体用于流式细胞术(克隆)：CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、CD90.1(OX-7)、ICOS(C398.4A)、I-A/I-E(M5/114.15.2)、CD86(GL-1)。BD生物科学公司(BD Biosciences)(美国)的hCD40(5C3)抗体也用于流式细胞术。对于流式细胞术染色，在将抗体染色混合物添加到细胞之前，通过离心在流式细胞术试管/板中沉淀1-5x105个细胞。将细胞在4℃下温育20分钟，然后在补充有1％BSA的PBS中洗涤。细胞在CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特生命科学公司(Beckman Coulter LifeScience)，美国)中运行。
IL-12ELISA
ELISA平板在4℃下用纯化的抗小鼠IL-12抗体(克隆C15.6，生物传奇公司)包被过夜。将板在补充有1％BSA的PBS中封闭，然后稀释至合适的浓度以在线性区域内进行预期的读取。将培养上清液添加至ELISA板。此后，添加生物素化的抗鼠IL-12二抗(克隆C17.8，生物传奇公司)，然后添加链霉亲和素/HRP(代码P0397，达克/安捷伦(Dako/Agilent)，美国)，并将板在室温下温育1小时。最后，通过添加TMB(34028，西格玛公司(Sigma)，美国)进行ELISA反应，然后用1M H2SO4终止反应。在450-570nm处读取吸光度。
数据分析
使用FlowJo软件(佛罗吉公司(FlowJo,LLC)，美国)分析来自流式细胞术的数据。使用GraphPad Prism 7(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，美国)绘制图表并进行统计分析。
标签肽选择
破伤风毒素肽文库(103种肽，在WO 2011/115483的表1中列出)用于筛选具有以下特征的α螺旋肽：
·良好的溶解度
·优选地，对标签序列没有内源性抗体应答
为了预测肽的结构，使用了以下软件：JPRED4(http:// www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4；Drozdetskiy等人,Nucleic Acids Res[核酸研究]43(W1):W389-W394,2015)和PASTA 2.0(http://protein.bio.unipd.it/pasta2；Walsh等人,Nucleic Acids Res[核酸研究]42(W1):W301-W307,2014)。为了预测溶解度，使用了Innovagen肽溶解度计算器(https://pepcalc.com/peptide-solubility- calculator.php)。使用PDBsum(可通过欧洲生物信息学研究所网站(https:// www.ebi.ac.uk/)获得)使用破伤风毒素晶体结构的PDB ID 5n0b，分析破伤风毒素蛋白中的目的位置。
圆二色谱(CD)光谱
为进行CD光谱分析，将目的肽溶解在50mM磷酸钠pH 6中至浓度0.2mg/ml。使用了JASCO J-1500CD光谱仪，在每次分析之前和之间，用水冲洗比色杯。在每个肽之间，使用2％的Hellmanex洗涤比色杯。缓冲液用于基线测量。
标签肽ELISA
将生物素化的肽包被在链霉亲和素板上，然后用含BSA的溶液封闭ELISA板。封闭后，将多肽与不同浓度的白喉、破伤风和百日咳疫苗接种前后的供体血清温育，随后用抗人IgG HRP抗体检测与多肽结合的人抗体。在使用H2SO4终止反应之前，使用TMB进行了测定。
结果
体外BMDC和T细胞激活
使用双特异性抗体和亲本单克隆抗体在以下浓度范围内评估了BMDC的体外激活：0.0064nM、0.032nM、0.16nM、0.8nM、4nM、20nM、100nM和500nM。
使用表1中列出的10种双特异性抗体和相应的6种亲本单克隆抗体测试了BMDC和T细胞的体外激活。该体外工作的结果列于下表3。
在HEK293细胞中进行抗体的瞬时生产，并确认抗体制剂的内毒素低/游离且单体级分>95％。进行SPR和ELISA(单靶和双靶分析)以及稳定性评估结果，并且根据此，所有抗体的亲和力都在亲本抗体和与之相结合的靶的范围内。如上所述，在功能上评估了抗体构建体的激动特性和抗原负载能力(通过T细胞激活测定)。通过测量hCD40转基因小鼠的BMDC产生的IL12p40水平，通过IL-12ELISA，在上述浓度范围将细胞与抗体构建体温育后，评估激动特性。图1中显示了与每种抗体构建体温育期间BMDC产生的IL-12p40的量。基于图1所示的结果，表3总结了每个抗体构建体所显示的激动活性水平(即每个抗体构建体引起的DC激活水平)。
表3
Figure BDA0003077620280000441
Figure BDA0003077620280000451
如上所示，对于基于CP-870,893抗CD40抗体的双特异性构建体，显示的激动活性水平可以取决于所附接的scFv。尽管发现某些scFv相对于亲本抗体大大增强抗体构建体的激动能力(参见例如Bi-1、Bi-2和Bi-3，它们各自包含14GIIICII-b scFv，以及Bi-7，其包含IBIIICI-b scFv)，其他scFv模拟亲本抗体的活性(参见Bi-17，其包含抗FITC scFv)。IgG2亲本抗体比IgG1亲本抗体具有更高水平的激动活性，并且在双特异性设计中，IgG2同种型也显示出比使用IgG1同种型的双特异性设计更高的活性。在IgG2结构中引起刚性铰链的突变并不改善相对于天然IgG2序列的激动活性(将结果与天然IgG2同型和IgG2C127S同型进行比较)。同样如表3所示，将scFv附接到ABS-1150抗CD40抗体上对其激动活性水平的影响要小得多。
在T细胞激活测定中，将BMDC与含有相关抗体构建体和UU-05肽(SEQ ID NO:3)的混合物一起温育。UU-05在其N末端包含最小的破伤风毒素表位(MTTE)，该表位起着肽标签的作用。MTTE是破伤风毒素(TTx)α链的短片段，其包含对于包括B细胞表位所必需的最小序列，因此可以针对其产生抗体。在WO 2011/115483中描述了MTTE的识别。在UU-05中用作肽标签的MTTE具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6的MTTE是人(特别是已接种TTd的人)中的天然人B细胞表位；值得注意的是，除非小鼠在接种情况下暴露于破伤风类毒素，否则小鼠不具有针对SEQ ID NO:6的MTTE的抗体(即，在本实验设置中，小鼠不具有针对MTTE的内源性抗体，因为这种抗体的产生未被诱导)。紧接MTTE的C末端是卵白蛋白(OVA)片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，包含SEQ ID NO:1的OVA表位。UU-05的C末端紧邻卵清蛋白片段的C末端，具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
24小时后，如上所述洗涤BMDC并添加B3Z T细胞。如上所述，当展示在H-2Kb鼠MHCI中时，B3Z T细胞识别SEQ ID NO:1的OVA肽。当识别到它们的同源肽/MHC后，T细胞被激活。如上所述，基于细胞产生的β-半乳糖苷酶(其在IL-2启动子的控制下(并且因此在细胞被激活时表达))，通过分光光度法定量激活。如表3所示，将B3Z T细胞与预先与抗体构建体一起温育的BMDC和抗原肽UU-05温育导致T细胞激活。作为对照，将BMDC与不含抗原肽UU-05而是含UU-10的抗体混合物一起温育。随后将这些BMDC与B3Z T细胞一起温育不会引起T细胞激活。
为了证明标签肽通过改善肽的负载来改善T细胞激活，如上所述进行BMDC/T细胞共培养实验，其中BMDC与各种抗体构建体(每个在10nM)和浓度为125nM或250nM的UU-05或UU-10肽温育。UU-10肽(SEQ ID NO:4)包含与UU-05相同的OVA片段和C末端，但缺少N末端MTTE标签。这意味着UU-05被双特异性构建体中的抗MTTE scFv结合，但UU-10不结合，使得能够评估发明人的“引入”策略的成功。
实验结果(就获得的T细胞激活水平而言)显示在图2中。该图说明T细胞激活仅发生在抗原肽包含可与双特异性缀合物的scFv部分相互作用(即与scFv结合)的标签时，而不发生在DC与抗体和抗原的简单混合物接触时。值得注意的是，与应用具有相同抗原肽的亲本抗体版本相比，所有双特异性构建体，无论设计、抗CD40抗体或scFv，当应用带有经标签化的抗原肽的DC时，显示出改善的T细胞激活。表3中列出的T细胞激活水平基于图2中显示的数据。
体内T细胞激活
如上所述，给小鼠施用Pmel-1 T细胞，然后施用抗CD40抗体与抗原性肽UU-30的组合。UU-30具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，并且在其N末端包含SEQ ID NO:6的MTTE序列，其C末端紧邻是具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的人gp100表位的片段。在鼠类H-2Db I类MHC的背景下，此gp100片段被Pmel-1鼠类T细胞识别，这些T细胞在相同MHC的背景下表达了对鼠类gp100(25-33)片段具有特异性的TCR。SEQ ID NO:9包含人gp100表位，该人gp100表位的侧翼是鼠侧翼肽，以制备合成的长肽，该长肽可以在加工后由鼠APC呈递。
体内实验是使用UU-30与X-SM083-bi-1和X-SM083-bi-2(在上表1中定义)组合进行的。Pmel-1 T细胞可以在野生型C57BL/6小鼠中追踪，因为它们表达同基因标志物Thy1.1(也称为CD90.1)。在收集腘淋巴结并制备单细胞悬浮液(如上所述)后，通过流式细胞术对悬浮液进行染色和分析，以测量小鼠中Pmel-1细胞的增殖。增殖被确定为整个CD8+T细胞群体中Thy1.1+细胞的积累。结果显示在图3中，并证明相对于仅施用UU-30肽的小鼠，施用UU-30和双特异性抗体的小鼠中的Thy.1.1+细胞的具有统计学显著性的增加。在施用UU-30和相应亲本抗体的混合物的小鼠中没有看到这种增加，这表明scFv附接到亲本抗体上以允许抗原肽结合到抗体上增强了T细胞对抗原的应答。
标签肽选择
通过筛选TTx蛋白的片段的文库以鉴定合适的标签序列来鉴定合适的标签肽。全长TTx蛋白具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列，UniProt条目P04958。期望合适的标签肽以显示以下特征：良好的溶解性，α螺旋结构且不与任何内源性免疫力相关(即序列应不含B细胞表位)。如上所述进行的计算机模拟分析确定了四种特定的推定标签肽：SM083P001(SEQ ID NO:10，对应于SEQ ID NO:16的氨基酸609-630)；SM083P002(SEQ ID NO:11，对应于SEQ ID NO:16的氨基酸81-101)；SM083P003(SEQ ID NO:12，对应于SEQ ID NO:16的氨基酸285-309)；和SM083P004(SEQ ID NO:13，对应于SEQ ID NO:16的氨基酸225-245)。
预期所有四种鉴定出的肽主要具有α-螺旋二级结构并且不包含β-折叠。还通过用Asp残基在N末端和用Arg残基在C末端对SM083P001的末端加帽来产生第五推定标签肽，得到肽SM083P005(SEQ ID NO:14)。进行加帽以试图改善肽的α-螺旋结构的稳定性。预测除SM083P004外的所有推定标签肽都是高度可溶的；预测SM083P004的溶解度相对较差。
通过圆二色光谱法分析了具有N末端生物素化的肽，以检查其二级结构，其结果显示在图4中。除了上述5种推定的标签肽外，还分析了N末端生物素化的MTTE(SEQ ID NO:6)。发现肽SM083P004和SM083P005显示出α螺旋二级结构；其他则是非结构化的。对N末端聚乙二醇化或生物素化的肽，或裸肽(即未修饰肽)的结构进行了CD分析，以评估其在N末端修饰时的构象是否发生了变化。这表明SM083P001与经过N末端修饰的相比，其裸肽的构象改变。在N末端修饰时，SM083P003和SM083P004没有显示构象变化。
为确认这三种目的肽不包含任何B细胞表位，评估了这些肽的抗体结合力，这些抗体是从健康志愿者DTP疫苗加强免疫前后的血清中获得的，我们从中已经确定在DTP加强后，针对已知的通用B细胞表位(MTTE)的抗体增加。MTTE肽用作阳性对照。如图5所示，正如预期的(假定它是已知的TTx B细胞表位)，MTTE被血清中的抗体结合，而其他肽则没有。这证明了SEQ ID NO:10、13和14的肽特别适合用作根据本发明的标签肽。
使用最近接受过破伤风类毒素疫苗接种的多达8个供体的血清重复进行该实验。进行了疫苗接种前后的血清测试(对于SM083P001、SM083P004、SM083P005和MTTE，测试4个供体疫苗接种前和8个供体疫苗接种后的血清；对于SM083P002和SM083P003，数量分别为3和7)。只有MTTE肽和肽SM083P002显示以滴度高于400与抗体结合，并且只有MTTE肽被来自所有供体的内源性抗体识别(表4)。
表4
Figure BDA0003077620280000481
这些结果表明，所选的破伤风衍生的肽不是通用B细胞表位，并且在疫苗接种方案开始时，由于对破伤风的预先形成的免疫，不太可能存在针对这些肽的内源性预先存在的抗体。
实施例2-治疗性施用后T细胞激活的全身扩散
材料与方法
对成年雌性C57BL/6小鼠(18-20g体重)施用来自Pmel-1小鼠的CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记的脾细胞和如以上实施例1中所述的tghCD40未成熟BMDC(参见“体内实验设置”)。在第1天，如上所述施用抗体和UU-30肽的各种组合。本实施例中使用的抗体是Ab-2和Bi-10，其分别以7.5pmol(低，L)；15pmol(中，M)；和22.5pmol(高，H)的剂量施用。UU-30肽以18.75pmol(L)、37.5pmol(M)和56.25pmol(H)的剂量施用。
72小时后，收集引流的腘淋巴结和非引流的腹股沟淋巴结，通过70μm细胞过滤器获得单细胞悬浮液。通过流式细胞术评估Pmel-1细胞的积累和增殖。根据同源标志物CD90.1的表达来门控Pmel-1 T细胞，并根据CFSE膜染料的稀释度来测量增殖T细胞的数量。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验对每个剂量水平进行统计分析，将肽组与每个抗体/肽组进行比较。
结果
Bi-10抗体是双特异性抗体，其能够结合UU30中的肽标签；Ab-2抗体是亲本抗CD40抗体，因此不能结合UU30肽。在引流淋巴结和非引流淋巴结中，与以所有剂量单独施用肽相比，Bi-10和UU30的共同施用导致T细胞增殖增强，而Ab-2和UU30的共同施用不导致T细胞增殖的任何增加(图7)。使用低剂量多肽和Bi-10抗体时引流淋巴结中以及使用高剂量多肽和Bi-10抗体时在非引流淋巴结中，T细胞增殖有统计学意义的增加。因此，根据本发明的标签构建体和双特异性抗体的共同施用驱动抗原特异性T细胞的增殖。
实施例3-标签和四价抗体上的scFv之间相互作用的稳定性
材料与方法
双特异性抗体Bi-17包含识别FITC的FITC-8scFv。scFv位于抗CD40抗体的重链的C末端(即，它被编码在IgG2恒定区的C末端)。FITC-8scFv的氨基酸序列在SEQ ID NO:70中列出。
Bi-17双特异性抗体由绝对抗体公司(英国)生产。抗体在HEK293细胞中表达，并通过使用蛋白A的亲和色谱法和制备型尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化。通过SDS-PAGE确定纯度为>98％，并且通过分析型SEC确定单体含量为94％。通过LAL生色内毒素测定法测定，内毒素水平<1EU/mg。
CD14单核细胞和PBMC分离。
用SepMate(干细胞技术公司(Stemcell Technologies))和细胞密度梯度
Figure BDA0003077620280000491
Paque Premium(通用医疗保健公司(GE Healthcare))根据制造商的方案通过Ficoll分离从健康志愿者捐献的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用MACS人CD14微珠分离试剂盒(梅旖旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))进一步进行CD14单核细胞分离。分离的CD14+细胞在完全RPMI GlutaMAX培养基(补充有10％FBS、1％100IU/ml青霉素/链霉素、10mM HEPES和0.1mMβ-巯基乙醇(吉布科公司(Gibco))，加上150ng/ml hGM-CSF和50ng/mlhIL-4(Peprotech公司))中培养6天，以驱动细胞分化为未成熟的树突状细胞。每2-3天更换一半的培养基(用新鲜培养基)。
细胞内肽追踪
CD14+细胞培养6天，然后收获单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)，并在96孔平底组织培养板中接种1x105个细胞/孔(萨斯泰特公司(Sarstedt))。将单独的肽UU-44(900nM)，单独的抗体Bi-17(300nM)或单独的肽UU-44(900nM)加抗体Bi-17(300nM)添加到每个孔中，并对培养物进行温育。肽UU-44具有SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列。FITC通过氨基己酸接头与肽的N末端缀合。SEQ ID NO:71包含来自CMV蛋白pp65的人HLA-A2表位(SEQ ID NO:72)。
用冰冷的PBS处理每个时间点的细胞以终止内化，然后保持在冰上，直到通过流式细胞术(基于FITC的检测)进行分析。为了检测细胞内肽，使用台盼蓝来淬灭细胞外信号。
淬灭
将UU-44肽在黑色Nunc MaxiSorp板中的PBS+1％BSA中稀释至300nM的浓度。将靶向抗体Bi-17连续稀释。使用FLUOstar Omega在485nM激发和520nM发射下测量荧光。在添加抗体后的0时间点，然后在2、5和30分钟，测量单独肽的荧光。
结果
在150-600nM处的Bi-17完全淬灭了300nM肽UU-44的荧光信号(图8)。这表明Bi-17中的两个scFv均具有功能并能充分结合标签，从而每个双特异性抗体可结合两个UU-44肽。随着时间的推移保持淬灭(此处测量长达30分钟)。当存在过量的游离肽时，可以按预期测量荧光强度(y轴)。因此，Bi-17抗体的抗FITC scFv的结合可淬灭所有FITC荧光信号。该相互作用在低nM范围内(
Figure BDA0003077620280000501
等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]18:852-856,2000)。
MoDC对肽UU-44的内化显示在图9中。该图显示了FITC阳性(即已内化UU-44肽)的MoDC的比例。图9A显示了单独的肽UU-44的内化。随着时间的流逝，肽的摄取逐渐增加(正如预期的那样，因为该实验是在封闭系统中进行的)。
图9B显示了当与双特异性抗体Bi-17组合应用于细胞时，肽UU-44的内化。最初，观察到低荧光信号，因为该肽与Bi-17结合且FITC信号被scFv淬灭。从2小时到6小时，细胞内FITC信号逐渐增加，表明该肽已被细胞稳定地内化，因为转运蛋白抗体与CD40结合并自身被内化。肽从双特异性抗体中的释放发生在细胞内，并随时间增加，从而形成肽的储库，所述肽被递送用于随时间的加工和抗原呈递。因此，经由双特异性抗体的肽递送可以在一段时间内提供抗原以用于MHC I类呈递。
实施例4-感染性疾病特异性T细胞的扩增
材料与方法
从CMV阳性、HLA-A2阳性供体中获得单核细胞和T细胞，并根据制造商的方案进行Ficoll分离以从血液中分离PBMC。为了进一步分离，根据制造商的方案，MACS珠用于CD14+单核细胞的阳性选择和T细胞的阴性选择。在hGM-CSF和IL4存在下将CD14+单核细胞培养6天，并在第0、3和5天添加细胞因子。
在第6天，收获、计数和铺板MoDC，然后如下添加抗体和肽：在一个样品中仅添加200nM肽UU-44，在另一个样品中仅添加100nM双特异性抗体Bi-17，并在第三个样品中添加200nM UU-44和100nM Bi-17。对于最终样品，将Bi-17抗体和UU-44肽混合并在37℃下温育30分钟，然后添加到样品中，以形成肽-抗体复合物。
成熟后一天，将来自同一供体的T细胞以T细胞:MoDC为5:1的比例添加到培养物中。然后将培养物温育7天，随后通过使用四聚体染色进行分析以检测对UU-44的pp65表位具有特异性的T细胞的扩增。UU44、Bi-17和UU44/Bi-17组间差异的统计学显著性采用单因素ANOVA和Tukey多重比较检验进行评估。
结果
每个培养物中针对UU-44中CMV pp65表位特异性的T细胞比例如图10所示。数据表明，用单独肽UU-44或用单独双特异性抗体Bi-17温育免疫细胞，相对于对照，并没有导致pp65特异性T细胞的任何增加。将免疫细胞与肽UU-44组合双特异性抗体Bi-17温育导致pp65特异性T细胞的统计学显著增加，表明使用本发明的缀合物/肽复合物驱动抗原特异性T细胞的扩增。
实施例5-靶蛋白内化
材料与方法
如上所述，人CD14+细胞在6天内分化为未成熟的DC，并以1x105个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板(Sarsedt)中。将ABS-1150/1151克隆X-SM083-ab-1(IgG1)和X-SM083-ab-2(IgG2)以滴定范围(3.9-500nM)与LPS和未刺激的细胞一起使用以研究抗体的激动特性及其对CD40表达的影响。
将测试抗体以不同浓度(在滴定范围内)添加至树突状细胞，然后在37℃下温育48小时。LPS(1ug/ml)用作阳性对照。使用以下标志物通过FACS评估DC激活：CD14-APC-Cy7(HCD14)、HLA-DR PE-Cy5(L243)、CD86-BV421(IT2.2)、CD40-FITC(5C3)、CD1a-PE(HI149)和CD83-APC(HB15e)，和IL12 p40夹心ELISA(生物传奇公司ELISA MAX试剂盒，目录号430704)。
所用的检测抗体CD40-FITC(5C3)可以被ABS-1150/1151封闭(数据未显示)。然而，由于在将测试抗体施用于细胞和FACS分析之间已经过去了48小时，因此认为这不会影响所获得的结果。
结果
CD40在被本发明抗体接合后需要内化，以确保靶细胞摄取抗原。IgG1或IgG2格式的ABS-1150/1151抗体被用于刺激人MoDC，并研究这两种抗体的激动活性以及靶蛋白表面表达。就相对于未刺激的细胞的CD86表达倍数变化而言，ABS-1150/1151抗体的IgG2亚型在上调CD86方面优于IgG1亚型(请参见图11A)。对于其他激活/成熟标志物的表达和IL12的产生，获得了相似的结果(数据未显示)。
IgG2亚型抗体也引起CD40细胞表面表达的降低，这在使用IgG1亚型时未观察到(图11B)。因此，IgG2亚型抗体在促进CD40内化方面优于IgG1亚型抗体，这在本发明中是有利的。这也得到图2中数据的支持，该数据显示IgG2格式的ABS-1150/1151相对于IgG1格式改善了抗原呈递。
实施例6-结合双特异性抗体后肽的血浆稳定性增加
材料与方法
肽UU-30(SEQ ID NO:5)购自卡帕拉科学公司(瑞典)。双特异性抗体X-SM083-bi-9和X-SM083-bi-12(以下简称Bi-9和Bi-12)及其对应的亲本单克隆抗体对应物X-SM083-ab-1和X-SM083-ab-3(ab-1和ab-3)由药物发现和开发平台生命科学实验室(瑞典)生产(参见实施例1和表1)。小鼠血浆(含有K2EDTA作为抗凝剂)购自创新研究公司(InnovativeResearch)(美国)。LC级乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)从密理博公司(Millipore)获得。MS级甲酸(HCOOH)从VWR公司获得。使用1型milliQ水(在25℃，18.2mΩ.cm，密理博公司)制备流动相。
将1μM UU-30肽与结合(Bi-9和Bi-12)和非结合抗体(Ab-1和Ab-3)抗体分别以0.5:1和1:1的Ag:Ab摩尔比混合，以获得<1％的游离肽。将复合物在600rpm搅拌下与预热至37℃的小鼠血浆混合。通过添加三倍体积的冰冷甲醇终止反应。在将血浆添加到肽之前，向零分钟样品中添加100％冰冷甲醇。将样品涡旋并在3220×g和4℃下离心20分钟，然后蒸发上清液，然后通过LC-MS/MS分析之前在100μL 2％ACN；0.05％HCOOH；97.5％H2O为中重新构干材料。为了比较，类似地制备不添加任何抗体的UU-30样品。
分析是基于在连接到Acquity UHPLC系统的QTrap6500上以正电喷雾模式通过LC-MS/MS监测肽的转变。将10μL样品等分试样注入设置为60℃的BEH C8柱(2.1×50mm，1.7μm)中，以500μL/min用在1.6分钟内0％至100％流动相B的线性梯度洗脱。流动相A的组成为0.1％HCOOH:99.9％H2O和流动相B的组成为0.1％HCOOH:99.9％ACN。针对UU-30在MRM模式下监测的转变设置为862.4>1012.6(DP，120V；CE，38V)，718.8>810.3(DP，120V；CE 30V)和616.2>740.1(DP，100V；CE，18V)。毛细管电压设置为5.5kV，温度设置为450℃，气体1和2设置为60au，帘气设置为40au。
结果
肽与较大蛋白的缔合理论上可以改善该肽的血清稳定性。因此，根据本发明的肽标签构建体在与双特异性肽的复合物的情况下可以具有改善的半衰期。使用质谱法，我们评估了包含T细胞表位和MTTE标签的UU-30肽与双特异性抗体复合时，与仅与非结合抗体混合时相比，是否在血浆中具有改善的半衰期。
发现UU30与根据本发明的双特异性抗体的复合导致肽的半衰期相对于肽在血浆中游离时显著增加(图12和表5)。
表5
Figure BDA0003077620280000531
根据本发明的肽构建体的半衰期的改善提供了产生针对T细胞表位的有效免疫应答的更大机会。因此，使用本发明的双特异性抗体增加了针对靶抗原产生有效免疫应答的可能性。
实施例7-血浆中的肽标签稳定性
测试了在实施例1中鉴定的潜在标签肽SM083P001(SEQ ID NO:10)、SM083P003(SEQ ID NO:12)和SM083P004(SEQ ID NO:13)，以确定它们在血浆中的稳定性。
材料与方法
这三种肽购自卡帕拉科学公司。小鼠血浆(含K2EDTA抗凝剂)购自创新研究公司，而人血浆(含柠檬酸钠抗凝剂)购自乌普萨拉大学医院。LC级乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购自密理博公司。MS级甲酸(HCOOH)从VWR公司订购。使用1型milliQ水(在25℃，18.2mΩ.cm，密理博公司)制备流动相。
将10μM的每种肽在人或小鼠血浆中温育，在37℃和600rpm的搅拌下温育长达17小时。通过添加三倍体积的冰冷甲醇终止温育。在将血浆添加到肽之前，向零分钟样品中添加100％冰冷甲醇。将样品涡旋并在3220×g和4℃下离心20分钟，然后蒸发上清液，然后通过LC-MS/MS分析之前在100μL 2％ACN，0.05％HCOOH，97.5％H2O为中重新构干材料。
分析是基于在连接到Acquity UHPLC系统的微TQ-S上以正电喷雾模式通过LC-MS/MS监测肽的转变。将10μL样品等分试样注入设置为60℃的BEH C8柱(2.1×50mm，1.7μm)中，以500μL/min用在1.6分钟内0％至100％流动相B的线性梯度洗脱。流动相A的组成为0.1％HCOOH，99.9％H2O和流动相B的组成为0.1％HCOOH，99.9％ACN。对于SM083P001，在MRM模式下监测的转变为875.54>1097.22和875.54>1170.51(CE，15V；锥孔，27V)，对于SM083P003为728.21>838.31和728.21>943.62(CE，25V；锥孔，21V)并且对于SM083P004为814.88>1078.33和814.88>1136.44(CE，20V；锥孔，25V)。对于毛细管电压，将源条件设置为2kV，气体温度设置为600℃。
结果
如图13和表6所示，所有三种肽在小鼠和人血浆中均显示出良好的半衰期，从而支持了它们在本发明中作为标签肽的用途。
表6
Figure BDA0003077620280000542
实施例8-新型抗标签肽scFv的产生
进行噬菌体展示选择以分离识别潜在标签肽SM083P001-5(SEQ ID NO:10-14)的scFv。
材料与方法
来自原始文库的噬菌体展示选择
对于所有五种生物素化肽抗原(SM083P001-0005，见实施例1)，使用两个内部构建的人合成scFv噬菌体文库SciLifeLib1和SciLifeLib2(在设计和构建上与先前报道类似)(
Figure BDA0003077620280000541
A.等人,Protein Eng Des Sel[蛋白工程化涉及与筛选]29,427-437,2016)进行噬菌体展示。选择是通过将肽固定在链霉亲和素涂覆的顺磁珠(Dynabeads M-280，赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientifice)，#11206D)上进行的，选择过程中的大部分步骤是自动化的，并用Kingfisher Flex机器人进行。在第1轮和第2轮的噬菌体-抗原温育步骤之前，在链霉亲和素包被的珠上预选择噬菌体储库，以除去非特异性结合物或链霉亲和素结合物。通过逐渐减少抗原量(浓度范围为200-50nM)和增加洗涤次数和强度(5-10次)来增加不同轮间的选择压力。用胰蛋白酶洗脱噬菌体。将回收的噬菌体在Top10F’大肠杆菌中繁殖，在37℃的琼脂平板上过夜(第1轮)或在30℃的溶液中过夜(第2-4轮)。通过感染过量的M13K07辅助噬菌体(新英格兰实验室(New England Biolabs)，#N0315S)和经由添加IPTG诱导的scFv表达来制备噬菌体储库。将过夜培养物进行PEG/NaCl沉淀，重悬于选择缓冲液(PBS中的2％(w/v)BSA，0.05％(v/v)Tween-20)中，并用于下一轮选择。
可溶性scFv的重新克隆和表达
为了产生可溶性scFv，从每个选择轨道的第三和第四轮中分离出噬菌粒DNA。在池中，将编码scFv片段的基因亚克隆到筛选载体中，提供scFv以及在C末端的三FLAG标签和六组氨酸(His)标签的分泌信号。随后将构建体转化进入TOP10大肠杆菌。对于每个选择轨道，从第3轮和第4轮中总共挑选188个菌落并在96孔板中培养，并评估表达的scFv(上清液)的结合。
初步ELISA和测序
选择的scFv的结合最初通过ELISA评估。每个克隆都针对其靶肽和链霉亲和素进行测试，所有测试一式两份。将在PBS中稀释至1μg/ml的链霉亲和素在4℃下包被在聚苯乙烯384孔板(康宁公司(Corning)，#3700)上过夜。将生物素化的肽添加到PBT(PBS中的0.5％(w/v)BSA，0.05％(v/v)Tween-20)中，然后添加scFv(培养上清液)。通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的α-FLAG M2抗体进行结合检测，然后与生色底物Ultra TMB-ELISA一起温育。通过添加1M硫酸停止信号发展，并在450nm处测量吸光度。对在ELISA中被视为阳性的克隆进行DNA测序(GATC生物技术公司(GATC Biotech)，科隆，德国)。
第二ELISA
在次级ELISA筛选中进一步分析每个选择轨道鉴定的所有序列唯一性克隆。在此，评估了与SM083P001、SM083P003和SM083P004的N末端聚乙二醇化肽变体的结合。此外，在scFv的子集上，在第三ELISA中分析了结合，其中中性亲和素被用作生物素化肽的捕获表面，而不是在噬菌体选择和初步ELISA筛选中使用的链霉亲和素。
使用表面等离子体共振(SPR)进行亲和力测量
亲和力测量是在Biacore T200生物传感器仪器(通用医疗保健公司)上对所选scFv的子集进行的。SM083P003和SM083P004肽是用预先固定的链霉亲和素捕获在传感器芯片SA上。一个链霉亲和素表面未经修饰并用作参考表面。在运行缓冲液中制备了每个scFv克隆和参考抗体的5倍稀释系列，范围是0.16-100nM，并依次在芯片表面注射。解离阶段后，芯片表面用10mM甘氨酸HCl(pH 2.1)再生。通过减去作为链霉亲和素固定表面的参考表面的应答曲线，获得了scFv克隆的应答曲线传感图。使用Biacore T200评估3.1软件分析数据，并假设1:1Langmuir结合模型计算动力学参数。
表位作图
SM083P003(Y-SM083-p03-B06和C06)和SM083P004(Y-SM083-p04-C04，D04，F04，G04和H04)特异性ScFv结合剂使用15-mer肽进行详细表位作图。SM083P003的长度为25aa，而SM083P004的长度为21aa。但是，为了研究是否可以在不影响抗体结合的情况下允许将来的修饰，评估了一组跨37aa区域的15-mer肽，即在以下序列DANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIAN KLSQVTSCNDP(SEQ ID NO:73)中发现的肽上进行了SM083P003特异性scFv分析，而在TIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEII(SEQ ID NO:74)中发现的肽上评估抗SM083P004。带下划线的区域分别对应于SM083P003和SM083P004，围绕它们的序列是在破伤风毒素中自然发现的序列。从JPT肽技术有限公司(JPT Peptide Technologies GmbH)(德国)处订购了46种15-mer肽，它们在N末端带有生物素部分，在C末端带有甘氨酸酰胺并且涵盖具有1个氨基酸移位的SM083P003和SM083P004(表7)。
将384孔ELISA板在4℃下用PBS中的2μg/ml链霉亲和素包被过夜。洗涤和封闭后(PBS中的5％BSA)，使肽结合1小时。将所有scFv克隆在PBT中稀释至2μg/ml(PBS中的0.5％(w/v)BSA，0.05％(v/v)Tween-20)并结合1小时。通过使用如上所述的HRP缀合的α-FLAG M2抗体，能够进行结合的检测。一式两份测定每个样品，从中取平均吸光度值，其中减去空白孔背景。等于或大于0.5的吸光度值被认为是正值。
表7
用于抗SM083P003 scFv作图的肽 用于抗SM083P004 scFv作图的肽
1 DANLISIDIKNDLYE(SEQ ID NO:75) TIGKSKYFQDPALLL(SEQ ID NO:98)
2 ANLISIDIKNDLYEK(SEQ ID NO:76) IGKSKYFQDPALLLM(SEQ ID NO:99)
3 NLISIDIKNDLYEKT(SEQ ID NO:77) GKSKYFQDPALLLMH(SEQ ID NO:100)
4 LISIDIKNDLYEKTL(SEQ ID NO:78) KSKYFQDPALLLMHE(SEQ ID NO:101)
5 ISIDIKNDLYEKTLN(SEQ ID NO:79) SKYFQDPALLLMHEL(SEQ ID NO:102)
6 SIDIKNDLYEKTLND(SEQ ID NO:80) KYFQDPALLLMHELI(SEQ ID NO:103)
7 IDIKNDLYEKTLNDY(SEQ ID NO:81) YFQDPALLLMHELIH(SEQ ID NO:104)
8 DIKNDLYEKTLNDYK(SEQ ID NO:82) FQDPALLLMHELIHV(SEQ ID NO:105)
9 IKNDLYEKTLNDYKA(SEQ ID NO:83) QDPALLLMHELIHVL(SEQ ID NO:106)
10 KNDLYEKTLNDYKAI(SEQ ID NO:84) DPALLLMHELIHVLH(SEQ ID NO:107)
11 NDLYEKTLNDYKAIA(SEQ ID NO:85) PALLLMHELIHVLHG(SEQ ID NO:108)
12 DLYEKTLNDYKAIAN(SEQ ID NO:86) ALLLMHELIHVLHGL(SEQ ID NO:109)
13 LYEKTLNDYKAIANK(SEQ ID NO:87) LLLMHELIHVLHGLY(SEQ ID NO:110)
14 YEKTLNDYKAIANKL(SEQ ID NO:88) LLMHELIHVLHGLYG(SEQ ID NO:111)
15 EKTLNDYKAIANKLS(SEQ ID NO:89) LMHELIHVLHGLYGM(SEQ ID NO:112)
16 KTLNDYKAIANKLSQ(SEQ ID NO:90) MHELIHVLHGLYGMQ(SEQ ID NO:113)
17 TLNDYKAIANKLSQV(SEQ ID NO:91) HELIHVLHGLYGMQV(SEQ ID NO:114)
18 LNDYKAIANKLSQVT(SEQ ID NO:92) ELIHVLHGLYGMQVS(SEQ ID NO:115)
19 NDYKAIANKLSQVTS(SEQ ID NO:93) LIHVLHGLYGMQVSS(SEQ ID NO:116)
20 DYKAIANKLSQVTSC(SEQ ID NO:94) IHVLHGLYGMQVSSH(SEQ ID NO:117)
21 YKAIANKLSQVTSCN(SEQ ID NO:95) HVLHGLYGMQVSSHE(SEQ ID NO:118)
22 KAIANKLSQVTSCND(SEQ ID NO:96) VLHGLYGMQVSSHEI(SEQ ID NO:119)
23 AIANKLSQVTSCNDP(SEQ ID NO:97) LHGLYGMQVSSHEII(SEQ ID NO:120)
结果
来自原始文库的噬菌体展示选择以及随后的结合筛选和测序
使用SciLifeLib 1和2对五种肽SM083P001-0005平行进行了总共10个噬菌体选择轨道。在初步ELISA中，从10个轨道的每个中选取188个克隆并进行分析。对于除SM083P002以外的所有肽，均鉴定出阳性克隆。阳性克隆的后续测序导致总共22个唯一性克隆(表8和9)。
在第二ELISA中分析所有序列唯一性克隆。在此，评估了与在肽的N末端部分和生物素之间具有PEG化间隔子的肽的结合。如表8所总结，只有八个序列唯一性scFv通过了此选择标准。同样，为了确保现在的八个scFv不依赖链霉亲和素与它们的同源肽相互作用，使用中性亲和素作为生物素化肽的捕获表面来评估结合。可以得出结论，所有八个scFv均独立于捕获表面而结合其同源肽(数据未显示)。
表8
Figure BDA0003077620280000571
表9
scFv 靶肽 序列
Y-SM083-p03-C06 SM083P003 SEQ ID NO:150
Y-SM083-p04-C04 SM083P004 SEQ ID NO:151
Y-SM083-p04-D04 SM083P004 SEQ ID NO:152
Y-SM083-p04-F04 SM083P004 SEQ ID NO:153
Y-SM083-p04-G04 SM083P004 SEQ ID NO:154
Y-SM083-p04-H04 SM083P004 SEQ ID NO:155
亲和力测量(SPR)
通过表面等离振子共振来计算scFv的子集与同源肽结合的动力学参数，包括缔合速率常数(kd(M-1s-1))、解离速率常数(kd(s-1))和解离平衡(KD(M))。结果示于表10中。
表10
scFv 靶肽 ka(M-1s-1) kd(s-1)) K<sub>D</sub>(M)
Y-SM083-p04-C04 SM083P004 3.8x10+04 6.2x10-04 1.6x10-08
Y-SM083-p04-D04 SM083P004 1.3x10+05 4.3x10-04 3.3x10-09
Y-SM083-p04-G04 SM083P004 2.0x10+04 1.8x10-03 8.9x10-08
Y-SM083-p04-H04 SM083P004 3.8x10+04 4.5x10-04 1.2x10-08
表位作图
通过在15-mer肽阵列上进行表位作图，可以将scFv的表位作图到9-15aa长的窗口(表11)。尽管未计算与同源肽和较短的15-mer肽的相对亲和力，但这表明肽修整是可能的。
表11
Figure BDA0003077620280000581
实施例9-双特异性抗体的体内作用
材料与方法
8周大的雄性B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J小鼠(在此称为pmel小鼠)用于体内肿瘤实验。将小鼠在乌普萨拉生物医学中心的动物设施中饲养，并通过瑞典乌普萨拉动物试验伦理委员会批准了动物实验。
将小鼠分为两个治疗组(每组n＝2)。第1组接种18.75pmol肽UU-30，而第2组接种18.75pmol UU-30和7.5pmol双特异性抗体Bi-10的组合。疫苗接种是通过初免-加强-加强的方式通过皮内注射到后踝中进行的。为了进行初免和首次加强，将4x105个表达tghCD40的未成熟骨髓衍生树突细胞(BMDC)与疫苗混合，分别在第0天和第4天注射到右侧后踝中。在第8天，第二次加强是与4x105个tghCD40未成熟BMDC混合施用至左侧后踝。在第5天，将75,000个B16-F1黑色素瘤细胞接种到右侧胁。每隔一天测量一次肿瘤大小，以追踪肿瘤的进展。
结果
如图14所示，到肿瘤接种后20天，仅接种肽UU-30的小鼠已发展出平均体积超过400mm3的肿瘤。接种了肽UU-30和Bi-10的组合的小鼠已经发展出肿瘤，平均体积仅为100mm3。这表明根据本发明的疫苗接种在刺激抗肿瘤免疫应答方面是有效的。
实施例10-抗MTTE scFv的产生和根据SPR的结合特征
材料与方法
小规模生产和纯化
IBIIICI和14GIIICII克隆的VH和VL结构域序列是通过对杂交瘤细胞进行测序(由绝对抗体公司(克里夫兰(Cleveland)，英国)执行)获得的。
通过将重链的可变结构域经由甘氨酸-丝氨酸接头((Gly4Ser)4)融合到抗体的轻链的可变结构域，生成了相应的scFv构建体(SEQ ID NO:47和48)。将scFv基因亚克隆到筛选载体中，提供scFv以及在C末端的三FLAG标签和六组氨酸(His)标签的分泌信号。scFv基因的合成和亚克隆外包给金斯瑞公司(GenScript)(皮斯卡特维(Piscataway)，新泽西州，美国)。随后将构建体转化进入TOP10大肠杆菌。使用固定金属亲和色谱(IMAC)在重力流下将裂解的细胞的细菌上清液进行Ni-NTA纯化，并将缓冲液更换为PBS。在还原条件下通过凝胶电泳分析纯化的scFv片段，以确定纯度和完整性。
表面等离子体共振(SPR)测量
使用Biacore T200(通用医疗保健公司)通过SPR对scFv克隆进行亲和力测量。使用NHS-EDC化学通过伯胺偶联将α-FLAG M2抗体固定在CM5 S芯片上，从而通过其FLAG标签捕获scFv。将由五种不同浓度(0.16nM至100nM)的生物素化MTTE肽(SEQ ID NO:6)构成的5倍稀释系列依次注入流动池，从而与捕获的scFv片段结合。作为阴性对照，类似地注入了加扰的MTTE序列。表面的再生是在酸性条件下使用10mM甘氨酸-HCl在pH 2.2下完成的。将获得的单周期动力学数据拟合到1:1Langmuir结合模型，动力学参数ka(1/Ms)、kd(1/s)和KD(M)使用软件BIAevaluation检索。
结果
小规模生产和纯化
细菌表达和纯化的scFv片段的凝胶电泳显示高纯度，其中一个主要蛋白带对应于scFv的预期分子量(数据未显示)。
表面等离子体共振(SPR)测量
使用单周期动力学方法确定IBIIICI-b和14GIIICII-b与MTTE肽结合的动力学参数，包括缔合速率常数(ka(M-1s-1))、解离速率常数(kd(s-1))和解离平衡(KD(M))。结果示于表12中。没有检测到与加扰的阴性对照肽(未显示)的结合。
表12
scFv k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
IBIIICI-b 9.2x10<sup>5</sup> 4.8x10<sup>-4</sup> 5.2x10<sup>-10</sup>
14GIIICII-b 1.8x10<sup>5</sup> 3.2x10<sup>-4</sup> 1.8x10<sup>-9</sup>
Figure IDA0003077620350000011
Figure IDA0003077620350000021
Figure IDA0003077620350000031
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Figure IDA0003077620350000911

Claims (29)

1.一种缀合物，所述缀合物包含：
i)至少一个结合CD40的第一特异性结合分子，其中所述第一特异性结合分子是CD40的激动剂；以及
ii)至少一个结合标签部分的第二特异性结合分子，其中所述标签部分不是癌症抗原，
其中所述第一特异性结合分子和第二特异性结合分子是包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白，并且共价连接。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第一特异性结合分子：
(i)还包含抗体的Fc区；和/或
(ii)是二价；和/或
(iii)是单克隆抗体；和/或
(iv)是单克隆抗体的F(ab’)2片段；和/或
(v)结合人CD40，并且是人CD40的激动剂。
3.如权利要求1或2所述的缀合物，其中所述第一特异性结合分子是IgG同种型抗体。
4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述第一特异性结合分子是IgG2同种型抗体。
5.如权利要求3或4所述的缀合物，其中所述第一特异性结合分子是选自以下的抗体：CP-870,893、APX005M、ADC-1013、ChiLob 7/4、SEA-CD40和ABS-1150/1151，或包含所述抗体中的任何一种的抗原结合结构域的抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述第二特异性结合分子是scFv。
7.如权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中所述第一特异性结合分子和所述第二特异性结合分子都是人的或人源化的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述第二特异性结合分子与所述第一特异性结合分子的轻链或重链共价连接。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中所述缀合物包含一个第一特异性结合分子以及两个第二特异性结合分子，所述第一特异性结合分子是抗体，所述第二特异性结合分子是scFv，并且：
i)一个scFv缀合到所述抗体的每条重链的CH3结构域；或者
ii)一个scFv缀合到所述抗体的每条轻链的CL结构域。
10.如权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述标签部分不包含人B细胞表位。
11.如权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述标签部分包含B细胞表位。
12.如权利要求11所述的缀合物，其中所述B细胞表位是非人B细胞表位。
13.如权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述标签部分是肽。
14.如权利要求13所述的缀合物，其中所述肽包含人工或非天然氨基酸序列，或由哺乳动物蛋白中未发现的氨基酸序列组成。
15.如权利要求13所述的缀合物，其中所述肽包含非人氨基酸序列的氨基酸序列。
16.如权利要求13至15中任一项所述的缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:6或10-14中任一个列出的氨基酸序列。
17.一种复合物，所述复合物包含如权利要求1至16中任一项所定义的缀合物和标签构建体，所述标签构建体包含共价附接至抗原的标签部分，其中所述标签构建体的标签部分与该第二特异性结合分子非共价结合，并且所述标签部分如权利要求1或11至16中任一项所定义。
18.如权利要求17所述的复合物，其中所述抗原是癌症抗原。
19.如权利要求18所述的复合物，其中所述癌症抗原是新抗原、肿瘤相关抗原或衍生自肿瘤病毒的抗原。
20.如权利要求17所述的复合物，其中所述抗原衍生自病原体。
21.一种标签构建体，所述标签构建体包含：
i)标签部分，其不是癌症抗原；以及
ii)抗原，其是癌症抗原或衍生自病原体的抗原；
其中所述抗原是多肽，并且所述标签部分与所述抗原共价连接。
22.如权利要求21所述的构建体，其中所述标签部分如权利要求11至16中任一项所定义。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
i)如权利要求1至16中任一项所定义的缀合物；或者
ii)如权利要求21或22所定义的标签构建体；或者
iii)如权利要求17至20中任一项所定义的复合物，
和至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂。
24.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1至16中任一项所定义的缀合物和如权利要求21或22所定义的标签构建体。
25.如权利要求17至20中任一项所定义的复合物或如权利要求24所定义的试剂盒，用于在疗法中使用。
26.一种产品，所述产品包含如权利要求1至16中任一项所定义的缀合物和如权利要求21或22所定义的标签构建体，作为用于在疗法中分开、同时或顺序使用的组合制剂。
27.如权利要求17至19中任一项所定义的复合物，如权利要求24所定义的试剂盒或如权利要求26所定义的产品，用于在治疗或预防癌症中使用。
28.如权利要求20所定义的复合物，如权利要求24所定义的试剂盒或如权利要求26所定义的产品，用于在治疗或预防感染性疾病中使用。
29.一种激活表达识别抗原的TCR的T细胞的体外或离体方法，所述方法包括使抗原呈递细胞与以下接触：
i)如权利要求1至16中任一项所定义的缀合物和如权利要求21或22所定义的标签构建体，其中所述标签构建体包含由所述TCR识别的抗原；或者
ii)如权利要求17至20中任一项所定义的复合物，其中所述复合物的标签构建体包含由所述TCR识别的抗原。
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