JP2003519240A

JP2003519240A - タンパク質を移送する方法

Info

Publication number: JP2003519240A
Application number: JP2001550354A
Authority: JP
Inventors: エル．タイコシンスキ，マーク; チェン，アオシァン; ツェン，グオシン
Original assignee: TR Associates LLC
Current assignee: TR Associates LLC
Priority date: 2000-01-03
Filing date: 2001-01-03
Publication date: 2003-06-17
Also published as: CA2396399A1; EP1246901A4; US20040161806A1; AU2472501A; WO2001049825A1; US6316256B1; IL150570A0; US20020037583A1; IL150570A; EP1246901A1

Abstract

(57)【要約】１又は２以上のタンパク質を細胞に移送する方法を開示する。移送されるタンパク質は、融合タンパク質の形態であり、トランスシグナリング及び/又は接着作用を有するタンパク質又はペプチドをエンコードする少なくとも１つのドメインを含む。融合タンパク質は、細胞膜と結合した脂質化タンパク質と接合することにより細胞に移送される。本発明によってタンパク質を受けた細胞を使用する方法についても開示する。これは、癌ワクチンにおける使用、癌又は自己免疫疾患の治療における使用、及び共刺激物質の限界レベルの決定における使用を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本件は、ナショナル・インスチチューツ・オブ・ヘルス(National Institutes
of Health)からのＲ０１ＣＡ−７４９５８及びＲ０１ＡＩ−３１０４４に基づ
く援助を一部受けている。

【０００２】

【発明の分野】

本発明は、１又は２以上のタンパク質を細胞に移送する新規な方法に関する。
その方法は、他の用途に加えて、癌及び自己免疫性の病気の治療に有効であり、
共刺激活性化閾値及び共刺激体間の協動的相互作用を決定するのに有用である。

【０００３】

【背景情報】

細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬｓ)などのＴ細胞は、腫瘍、ウィルス感染及び他
の感染症に対して、効果的なヒト免疫応答に重要な要素である。Ｔ細胞は、標的
となる細胞の表面上のＭＨＣクラスI分子により示される抗原ペプチドを認識す
ることにより、新生物又はウィルスに感染した細胞を破壊する。Ｔ細胞の活性化
は、Ｔ細胞の表面の抗原受容体及び共刺激受容体により信号を組み合わせること
による。免疫学的監視では、多くのメカニズムが、腫瘍細胞及びウィルスに感染
した細胞の脱出に寄与している。そのメカニズムの１つは、これらの細胞は、Ｔ
細胞の活性化に必要な共刺激分子を欠いていることである。腫瘍細胞及び他の抗
原提示細胞表面の共刺激体の発現に基いて、免疫治療の方法が開発され、予測さ
れている。

【０００４】抗原提示細胞(ＡＰＣｓ)は、表面の共刺激分子によりＴ細胞の活性化能力に関
心が向けられている。ＡＰＣｓは、それらの表面に共阻害物質を発現することに
より、欠失ＡＰＣｓ、又は”人工的veto細胞”に変換される。これは、例えば米
国特許第5,242,687号、第5,601,828号、第5,623,056号に記載されている。その
ような共阻害物質を細胞上の共阻害受容体に結合し、Ｔ細胞を不活性化させる。

【０００５】腫瘍細胞のようなＡＰＣｓ上に共刺激物質と共阻害物質を発現する１つの方法
は、遺伝子の移送である。ＡＰＣ及び腫瘍細胞工学に用いられる際に、遺伝子移
送技術は欠点がある。例えば、腫瘍細胞などのＡＰＣｓは、トランスフェクト能
力が不足する場合が多い。また、トランスフェクションの処理は、面倒で時間が
掛かる。更に、共刺激物質(又は共阻害物質)よりも多く発現させることは困難で
ある。これらの及び他の問題は、ＡＰＣ及び腫瘍細胞工学への遺伝子治療の広範
な適用の妨げとなっている。

【０００６】タンパク質移送は、ＡＰＣ及び他の細胞技術にとって、遺伝子移送に多くの利
点をもたらす。これらの利点としては、トランスフェクト能力の乏しい細胞(例
えば、生検に由来する腫瘍細胞)を修正できること、同じ細胞表面に発現する多
重タンパク質を単純化できること、その処理を比較的容易に迅速に行うことが挙
げられる。組み換え型のＧＰＩ修正の共刺激物質、及びタンパク質移送用のＭＨ
Ｃタンパク質誘導体の使用が、報告されている［Brunschwig et al J.Immunol.,
155:5498(1995);McHugh et al Proc Natl.Acad. Sci. USA,92:8059(1995); and
McHugh et al Cancer Res.,59:2433(1999)］。しかし、ＧＰＩタンパク質移送法
の欠点は、トランスフェクトされた細胞の膜からＧＰＩタンパク質の清浄化が大
規模となる点にある。

【０００７】文献［J.Immunol Methods,158:57(1993) Kim andPeacock］には、細胞間の相
互作用を容易にする人工受容体で細胞をコートするのに、パルミチン酸塩と結合
したタンパク質Ａを用いることが報告されている。特に、パルミチン酸と化合し
たタンパク質Ａを用いて細胞の表面に抗体を付着させる方法が報告されている。
前記文献は、抗体以外の物質を細胞に付着させるために、脂質化(lipidated)タ
ンパク質の使用を開示していない。従って、それらの修正された細胞は、抗原に
対する人工的な受容体以外の作用はない。

【０００８】文献［Phillips et al IMMUNITY, 5:163-172(August, 1996)］には、タイプII
の細胞膜タンパク質であるＣＤ９４の免疫グロブリン及びエクドドメインについ
て、ＣＤ８リーダーセグメントであるＦｃドメインを用いた融合タンパク質を調
製することが報告されている。本発明の移送方法は、タイプI及びタイプIIの両
方に適用可能であるが、前記文献には開示も提案もされていない。

【０００９】文献［Darling et al Gene Therapy,4(12):1350-60(Dec. 1997)］には、タン
パク質移送について、ビオチン／アビジンシステムを用いることが報告されてい
る。この方法は、標的細胞のビオチン化、移送されるべきタンパク質にアビジン
グループを付着すること、及びビオチン化された標的細胞及びアビジンタグされ
たタンパク質を組み合わせることを含む。この方法は、細胞表面上の多重タンパ
ク質を摂動する共有結合修飾(covalent modifications)に依存する等、かなりの
制約を受ける。

【００１０】従って、タンパク質及びペプチドの細胞への効率的且つ定量的な移送が依然と
して必要とされている。更に、機能を保持する免疫調整分子を所定の細胞に取り
付けることのできる方法が更に必要とされている。

【００１１】

【発明の要約】

本発明は、トランス信号の伝達、及び／又は細胞表面に付着する機能を有する
ドメインを定量的に移送する方法を提供することにより、上記の要請に応じるも
のである。一般に、ドメインはこれらの機能の一方又は両方を有する細胞外ドメ
インである。好ましい実施例に於いて、免疫調整分子の細胞外ドメインが用いら
れる。より具体的には、本発明の方法は、２段階のタンパク質移送方法を提供す
るもので、段階的な量のタンパク質を、細胞表面へ送達するものである。本発明
の方法は、少なくとも２つのドメインからなる融合タンパク質を利用し、１つの
ドメインは免疫調整機能を有する分子をエンコードするものが好ましい。融合タ
ンパク質を、脂質化タンパク質によってコーティングされた細胞に加えることに
よって、例えば免疫調整分子の細胞外ドメインにつて精密な滴定が達成される。

【００１２】本発明のタンパク質移送方法は、広範な適用ができる。例えば、本方法を用い
て共刺激物質に存在する閾を確立し、ＡＰＣの表面共刺激が誘引されたＴ細胞応
答の大きさ及び品質の両方に命令できるレベルを確立することができる。本方法
は、また癌ワクチンの生成にも適用可能であり、これらのワクチンはインビボで
有意的な抗腫瘍効果を示す。更に、本方法は病原性Ｔ細胞を排除するのに用いら
れる１又は２以上の共阻害物質を発現する人工的veto細胞を生成するのに用いら
れる。本発明の方法に従って生成された細胞は、それゆえに、癌の治療及び自己
免疫性の病気の治療に役立つ。ここで記載された方法はまた、例えばＴ細胞の活性化に関する免疫学的な問題
の研究、アポトーシス信号を無効にする共刺激物質の使用、共刺激物質に対する
共阻害物質の機能、癌の治療に用いられる共刺激物質の相互作用、自己免疫性病
気の治療に於ける共阻害物質の使用に用いられ、動物モデルの確立に用いられる
。

【００１３】

【発明の詳細な記載】

本発明は、細胞に１又は２以上のタンパク質を移送する方法に関し、一般的に
脂質化(lipidate)されたタンパク質である第１タンパク質にて細胞の表面をコー
トする工程と、コートされた細胞を融合タンパク質である第２タンパク質にて接
触させる工程を具える。融合タンパク質は、脂質化されたタンパク質に対して親
和性を有する第１ドメインと、ペプチド、タンパク質又はその誘導体或いはフラ
グメントを有し、トランス信号の伝達及び／又は接着機能を有する第２ドメイン
を含んでいる。細胞外ドメインを用い、第２ドメインは免疫調整機能を有するこ
とが好ましい。ペプチド及びタンパク質に関して用いられる”誘導体(derivativ
e)”とは、類似体のようなペプチド及びタンパク質の変形を意味し、例えばペプ
チド鎖内の１又は２以上のアミノ酸が除去され、加えられ、又は代替アミノ酸に
置換されたものが挙げられる。 ”フラグメント”とは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の一部を意味
する。ペプチド及びタンパク質の”誘導体”及び”フラグメント”は、野生型の
ペプチド又はタンパク質の生理学上の機能を維持するものであり、それゆえ生理
学的に活性化であると理解されるであろう。

【００１４】本発明の方法は、脂質二分子膜を有する如何なる細胞にも適用できる。例えば
、当該技術分野で公知の手段によって採取できるものであれば、如何なる種類の
自己細胞を用いることができる。どんなアロジェニックのほ乳類の細胞株を用い
ることも本発明の範囲に含まれる。本発明での使用に適したアロジェニック細胞
株の例として、ＥＬ−４細胞(マウスの胸腺腫の細胞)、２９３細胞(ヒトの腎臓
細胞)、Ｋ５６２細胞(ヒトの白血病細胞)、Daudi細胞(ヒトのＢ細胞株)及びＪＹ
細胞(ヒトのＢ細胞株)があるが、これらに限定されない。これらの細胞は、バー
ジニア州のマナサスにあるAmerican Type Culture Collectionから商業的に入手
可能である。市販されていない細胞株も本発明の範囲に含まれる。

【００１５】脂質化され得るものであれば如何なるタンパク質も、本方法での使用に適して
いる。実験は、両方とも市販されているタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇを含むが
、これに限定されない。同様に如何なる脂質について脂質化されたタンパク質を
調製するのに用いられる。脂質は、約１２から２２の間の炭素鎖を有する脂質が
好ましく、１６の炭素鎖を有する脂質(パルチミン酸塩)が最も好ましい。脂質の
鎖の長さは、ユーザの必要性及び要望に基づいて変えることができる。当該技術
分野の専門家であれば、第１タンパク質の脂質化された部分は、細胞の膜を作る
リン脂質二重層に取り付けられ、又はリン脂質二重層に組み込まれることが理解
されるであろう。これがここで用いられる”細胞の表面をコートする”の語の意
味である。

【００１６】細胞をコートするのに用いられる脂質化タンパク質の量は、ユーザの必要及び
要望に基づいて異なり、選択された特定の脂質及び特定のタンパク質に基づいて
異なる。細胞全体を覆うのに十分な量の脂質化されたタンパク質を用いるのが好
ましい。この量は、一般的に５×１０⁶個の各細胞に対して、脂質化されたタン
パク質は、約３０マイクログラム以上である。

【００１７】細胞をコートした後、細胞を第２タンパク質に接触させる。第２タンパク質は
、例えば当該技術分野で標準的に用いられるＤＮＡ組換え技術を通じて２つの異
なるドメインが融合して、単一ＤＮＡ配列を形成する融合タンパク質である。第
１ドメインは、融合タンパク質のアミノ酸の末端、又はカルボキシル基の末端の
何れかに取り付けられる。第１ドメインは、ペプチド、タンパク質又はその誘導体及びフラグメントをエ
ンコードし、脂質化されたタンパク質に対し親和性を有する。それゆえに、脂質
化タンパク質内で使用されるタンパク質は、融合タンパク質の第１ドメインによ
ってエンコードされたタンパク質とともに理想的に選択され、互いに親和性を持
ったタンパク質が用いられる。タンパク質間の親和性は、Biacore技術又は当業
界によく知られている他の方法によって決定される。この親和性故に、融合タン
パク質は、既に細胞膜内に組み込まれた脂質化されたタンパク質に結合する。こ
のようにして、融合タンパク質は、細胞に移送される。特に好ましい組み合わせ
としては、パルチミン酸タンパク質Ａ、及びＦｃ領域をエンコードする第１ドメ
インを用いる。例えば、Ｆｃγ１と指定されるヒト免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ
１)のＦｃ領域を用いることができる。融合タンパク質に於ける他の適切な第１
ドメインとしては、ロイシンジッパー(ロイシンが数基繰り返されたアミノ酸の
構造)タンパク質ドメインと単一鎖のＦｖ誘導ドメインである。

【００１８】融合タンパク質の第２ドメインは、ペプチド、タンパク質又はその誘導体及び
フラグメントをエンコードしたもので、免疫調整機能を有し、第２の細胞にトラ
ンス信号を伝達することができる。実施例は、共刺激と共阻害物質を含むがこれ
らに限定されない。他の適当な共刺激物質として限定されるものではないが、Ｂ
７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｌ
ＦＡ−３、ＣＤ３０Ｌｉｇａｎｄ(ＣＤ３０Ｌ)、ＣＤ４０Ｌｉｇａｎｄ(ＣＤ４
０Ｌ)、４−ＩＢＢＬｉｇａｎｄ(４−１ＢＢＬ)及び熱安定性抗原を挙げること
ができる。同様に、他の適当な共刺激物質として限定されるものではないが、Ｃ
Ｄ８、ＦａｓＬ及びＰＰ１４を挙げることができる。

【００１９】重要なことは、本発明の融合タンパク質は、タイプI又はタイプIIのどちらか
のタンパク質であってもよいことである。タイプIIのタンパク質を細胞に移送す
る方法は、これまで報告されていない。本発明の方法は、タイプI及びタイプII
のタンパク質に等しく適用可能であるから、本発明の方法は、当該技術に実質的
な前進をもたらす。タイプIの膜タンパク質の例としては、Ｂ７−１、Ｂ７−２
及びＣＤ４８があり、タイプIIの膜タンパク質の例としては、ＦａｓＬｉｇａ
ｎｄ(ＦａｓＬ又はＣＤ９５Ｌ)、ＣＤ４０Ｌ及び４−ＩＢＢＬがある。タイプIIのタンパク質については、第１ドメインはタイプIIのタンパク質のカ
ルボキシル基の末端で融合され、分子の官能性末端(functional ends)を保つ。
これらの記載は、共刺激物質、共阻害物質及び本発明に従って移送されるべき他
のタンパク質を余すことなく記載したものではない。またこれに限定されるもの
ではないが、ヒト及びマウスの形態を含む種々の分子の全ての形態を反映してい
る。

【００２０】本方法により提供される他の重要な利点は、融合タンパク質が細胞に移送され
た後、融合タンパク質のトランス信号伝達機能を有する部分は、この機能を維持
することである。このようにして、本方法に従って調製される細胞は、第２の細
胞のカウンター受容体を通じて結合とトランス信号の伝達により、免疫応答を導
出することができる。

【００２１】更にまた、１又は２以上の融合タンパク質を単一細胞をコートするのに用いる
ことができる。このようにして、例えば２、３、４又はそれより多くのトランス
信号を伝達する免疫調整タンパク質が細胞に移送される。共刺激物質及び共阻害
物質の場合に於いて、そのようなタンパク質の組合せは最も大きな免疫学的効果
を有するように選択され、付加的な利益又は相乗作用の利益までも有する組み合
わせが選択され、本方法に従って用いられる。

【００２２】本方法は、タンパク質が定量的に細胞の表面に送達される点において、更なる
特徴を有している。上記の如く、細胞を完全にコートするのに、十分な脂質化タ
ンパク質を用いることが好ましい。細胞に移送される融合タンパク質の量は、そ
れ故に、コートされた細胞に接触させるのに用いられる融合タンパク質の量によ
り決定される。このように、融合タンパク質の量は、限定的要因又は決定的要因
である。２以上の融合タンパク質を用いるとき、コート細胞に接触させるために
所定比の融合タンパク質が用いられ、タンパク質はほぼこれらの比のままで細胞
に移送されるだろう。

【００２３】本発明の方法は、インビボ又はインビトロの何れの状態でも実行することがで
きる。インビボの方法では、脂質化タンパク質及び融合タンパク質は、患者に直
接注入される。注入は脂質化タンパク質及び融合タンパク質が予め混合された状
態で、連続的に(この場合、脂質化されたタンパク質が最初に注入される)又は同
時に行うことができる。注入は、例えば腫瘍内で局在化されるが、例えば血管内を全身に流れる。本発
明の方法及び該方法によって作られる細胞は、他の技術で報告された方法と違っ
て、特に高いタンパク質安定性を有しており、本方法のインビボで適用を実際的
なものとしている。インビトロの方法に於いては、患者からの細胞の抽出物、及
びその次の細胞のコートと接触を含む。或いは、市販で入手されるアロジェニッ
ク型細胞も用いられる。何れの場合も、治療された細胞を患者に注入することが
できる。

【００２４】細胞の種類、第１タンパク質、第２タンパク質、及びインビボ、インビトロ及
び他の送達技術に関する上記記載の全ては、ここで開示される発明の全ての実施
例に等しく適用される。

【００２５】本発明は更に、Ｔ細胞内で共刺激物質の活性化閾値を決定する方法に関するも
のである。これらの方法は、上記したとおり、一般的には、１又は２以上の融合
タンパク質を細胞に移送することを含む。タンパク質が移送される細胞は、次に
Ｔ細胞と混合される。Ｔ細胞は、例えば当該技術分野で公知の方法により、末梢
血の単核細胞から採取される。実施例の項で記載したような当該技術分野で公知
の手段に従って、サイトカイン分泌のレベルを測定できるのと同様に、Ｔ細胞の
増殖についても、もし増殖があれば測定できる。

【００２６】本発明は更に、本タンパク質移送技術を用いて病気を治療する方法に関するも
のである。これらの方法は、一般的に上記の方法に従ってインビトロで調製され
た有効な量の細胞を患者に投与することを含み、又はインビボでタンパク質を投
与することも含む。インビボ又はインビトロの何れかに於ける標的細胞への融合
タンパク質の移送により、方法は実施される。インビトロの方法では、抽出され
た自己細胞又はアロジェニック型細胞の何れかを、脂質化されたタンパク質にて
コートし、１または２以上の融合タンパク質に接触させる。次に、有効量の細胞
は患者に投与される。インビボの方法については、有効な量の融合タンパク質を
、有効量の細胞へ移送するのに十分な量の脂質化タンパク質及び１又は２以上の
融合タンパク質が、患者に投与される。

【００２７】ここで用いられる”病気”は、癌、自己免疫性及びアロ免疫性の疾患を意味し
、関節炎、関節リューマチ、喘息、移植片対宿主疾患、器官拒絶反応、全身性紅
斑性狼蒼、アトピー性アレルギー、炎症性内臓疾患、多重硬化症及びアレルギー
性皮膚炎を挙げることができるが、これらに限定されない。方法は、インビボの方法に於ける脂質化タンパク質及び融合タンパク質、又は
インビトロの方法に於けるコートされ接触した細胞が、患者の１又は２以上の腫
瘍に直接注入される点で、特に癌の治療に適用できる。”患者”は、ここではヒ
トを含む動物界のメンバーを指す。本方法は、一般的に少なくとも最小限の免疫
応答を作り出すことのできる患者に対して適用できる。

【００２８】本発明のタンパク質移送方法により作られる有効な量の細胞は、本発明の治療
方法に用いられる。有効な量は、患者に所定量のタンパク質を搬送する細胞が所
望の結果をもたらすのに必要な細胞の量である。一般的に、所望の結果とは例え
ば免疫性応答の刺激、又は免疫性応答の抑制化である。癌の治療の場合に於いて、有効な量は患者を腫瘍の成長に対して保護し、又は
腫瘍の除去とまではいかなくても腫瘍を現象させることのできる量である。自己
免疫性又はアロ免疫性の疾患の場合に於いて、有効な量とは、治療されるべき自
己免疫性又はアロ免疫性疾患の１又は２以上の症状を除去しないまでも、症状を
緩和することのできる量である。この有効量は、患者のサイズ、患者の免疫系の
状態、患者の免疫応答能力、病気の種類及び重症度のようなファクターによって
、患者毎に異なることが理解されるであろう。各患者に対する適当な有効量は、
当該技術分野にて熟練した者により決定されるであろう。有効量は一般的に腫瘍
内の約１０⁷個以上の修飾細胞、又は１００μｇのＦｃ融合タンパク質である。

【００２９】本発明は更に、本発明のタンパク質移送方法に従って調製され、適当な担体に
入れられた細胞を含む癌ワクチンに関するものである。適合性の問題が生じない
限りどんな適切な担体をも用いることができる。例えばＰＢＳ、及び無血清媒体
を挙げることができる。ワクチンは種々の融合タンパク質を含めることができる
。夫々が異なる融合タンパク質を有する異なる細胞、又はそれに付着した１又は
２以上の融合タンパク質を有する細胞を例として用いることができる。このよう
に、免疫調整タンパク質の”カクテル”は、本ワクチンに含められ、本方法に従
って患者に導入される。カクテル内にて用いる具体的な免疫調整タンパク質は、
当該技術分野にて熟練した者により、治療される患者、及び患者の病気の種類及
び重症度のようなファクターに基づいて決定される。異なるタイプの腫瘍を治療
するのに、異なる組み合わせを用いることができる。カクテルは予め混合され、
腫瘍の母地に注入され、それによって腫瘍が抑制される。ワクチンは、予め免疫
を有する患者をその後の腫瘍攻撃から保護する場合や既に存在する腫瘍を治療す
る場合の両方に効果的であることが判っている。

【００３０】

【実施例】

本実施例は、発明の説明を目的とするものであり、如何なる場合にも本発明を
限定するように解釈されるべきではない。

【００３１】実験１次に述べる実験は、パルミチン酸タンパク質(palmitated protain)Ａを用いて
Ｂ７−１・Ｆｃγ₁融合タンパク質を細胞に移送する方法を明らかにする。

【００３２】タンパク質Ａのパルミチン酸化(palmitation) 組換えタンパク質Ａ（カルビオケム(Calbiochem)，ラ・ホラ，ＣＡ）を、文献
[Kim and Peacock, J.Immunol Methods, 158:57(1993)]に記載されたように、パ
ルミチン酸塩のＮ−ヒドロキシこはく酸イミド(N-hydroxysuccinimide)エステル
（シグマ，セントルイス，ＭＯ）で誘導した。簡単に説明すると、パルミチン酸
塩のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドエステルの保存溶液を、タンパク質Ａを約１
.５ｍｇ/ｍｌの濃度で含む溶液として作製した。該溶液を、タンパク質１ｍｌ当
たり約１０μｇのエステルとなる比で混合した。該溶液を、約１８時間の間、継
続的に混ぜつつ室温で培養した。脂質誘導タンパク質Ａを、３０ｍｌセファデク
ス(Sephadex)Ｇ−２５（シグマ）コラムを用いて、文献[Huang,et al.,J.Biol.C
hem.,225:8015(1980)]に記載されている要領にて精製した。このタンパク質生成
物を、本明細書では”ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ”と称する。該タンパク質生成物を、
ビシンコニン酸キット（バイオ−ラド(Bio-Rad)，リッチモンド，ＣＡ）を用い
て計量し、フィルタ滅菌し、使用されるまで４℃で保存した。

【００３３】 [パル-プロトＡの細胞膜結合(incorporaton)] ダウディ(Daudi)ＥＬ−４及びＫ５６２細胞（３−７×１０⁶/ｍｌ）を、夫々
、ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウィットテイカー(BioWittaker)，ウォーカー
ズビル，ＭＤ）で３回洗浄した後、同じ培地内で別々に再懸濁した。ｐａｌ-ｐ
ｒｏｔＡ（又は、陰性対照たる非誘導タンパク質Ａ）を、異なる濃度で細胞懸濁
液に加えて、混合物を、継続的に混ぜつつ、４℃で２時間培養した。細胞表面へ
のｐａｌ-ｐｒｏｔＡの結合を調べるために、細胞を、緩衝液（０．２５％Ｂ
ＳＡ/０．０１％アジ化ナトリウム/ＰＢＳ）の中で２度洗浄し、同じ緩衝液で
希釈化された１００μｇ/ｍｌＦＴＣ−ヒトＩｇＧ（シグマ）１００μｌを加え
て、１時間培養した。細胞を、その緩衝液で２度洗浄し、ＦＡＣＳｔａｒ(商標)
フローサイトメータ（ベクトンディキンソン(Becton Dickinson)，マウンテンビ
ュー，ＣＡ）で分析した。

【００３４】最適化実験の第１セットでは、ｐａｌ-ｐｒｏｔＡの効率的な結合が、ＦＩＴ
Ｃ結合ヒトＩｇＧと共に検出されたように、４種類の細胞株(cell line)（図１
Ａ）に示された。陰性対照の場合、非誘導タンパク質Ａは、同じ細胞に結合する
能力を欠いている。ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメータによる解析のデータを、
任意単位の蛍光強度の常用対数対ＥＬ−４細胞数、としてプロットした。細胞結
合は、図１Ｂに示すように、用量依存性があり、ｐａｌ-ｐｒｏｔＡが約３３μ
ｇ/ｍｌにてプラトー状態に入った。ＥＬ−４細胞を、３３μｇ/ｍｌのｐａｌ-
ｐｒｏｔＡを加えて、指示された時間間隔で培養した。図１Ｃに示すように、ｐ
ａｌ-ｐｒｏｔＡの結合は速く行われ、細胞に加えた直後に開始し、約１時間で
プラトーに達した。このデータは、多数の異なる細胞株を本タンパク質移送方法
に用いることができること、及び脂質化されたタンパク質が細胞内に非常に速く
結合されたことを示している。

【００３５】 [組換えＢ７−１・Ｆｃγ₁の調製] Ｆｃγ₁とインフレーム(in-frame)でリンクされた、完全(complete)ヒトＢ７
−１細胞外ドメインをエンコードする発現プラスミドｐＣＤＭ８/Ｂ７Ｉｇは、
米国基準菌株保存機構(American Type Culture Collection)（マナサス，ＶＡ）
から入手した。Ｆｃγ₁をエンコードする配列を、ＸａｂＩで消化し、クレノー(
Klenow)フラグメントで充填し(filling-in)、続いてＨｉｎｄIIIで消化すること
により、ｐＣＤＭ８/Ｂ７Ｉｇから移動させた。移動したフラグメントを、Ｈｉ
ｎｄIIIで、ＥＢＶエピソーマル発現ベクタｐＲＥＰ７β（インビトロゲン(Invi
trogen)，サンディエゴ，ＣＡ）にサブクローン化し、ＢａｍＨＩ部位に充填し
た。プラスミドを、２９３個の細胞（ヒト腎臓細胞株；米国基準菌株保存機構）
にトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢ耐性コロニーを、１０ｍＭグルタミ
ン、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び２００μ/ｍｌハイグロマイシンＢが
加えられた無血清ウルトラカルチャー(Ultra Culture)（バイオウィットテイカ
ー）培地に集めた。集められたＦｃγ₁を、タンパク質Ａアガロース（ライフテ
クノロジーズ(Life Technologies)，ジャーマンタウン，ＭＤ）アフィニティー
クロマトグラフィーを用いて馴化培地から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確
認した。このタンパク質は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの上で培養さ
れた。該タンパク質を、図２に示すように、還元状態（レーン２）及び非還元状
態（レーン３）下にある約８０ｋＤＡのドミナントシングルバンドとして、クー
マシーブルー（Coomassie blue)で視覚化した。その同定は、ＥＬＩＳＡを用い
て確認したところ、組換えタンパク質は、ヒトＢ７−１特異性ｍＡｂ、ＢＢ−１
に対しては強く接合したが、対照抗体に対しては接合しなかった（データは示さ
ず）。

【００３６】 [Ｆｃγ₁タンパク質の移送] ｐａｌ-ｐｒｏｔＡでプレコートされた細胞を、一度洗浄し、ＲＰＭＩ１６４
０培地（３−７×１⁶ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）に再懸濁した。ｐＲＥＰ７Ｂがトランス
フェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２/ＲＥＰ７ｂ)を、３３μｇ/ｍｌのタン
パク質Ａを加えて２時間、３３μｇ/ｍｌのＦｃγ₁融合タンパク質を加えて１時
間、そして１次抗体としてＢＢ−１及び２次抗体としてＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウ
スＩｇＧを加えて、順次培養した。タンパク質の送達をモニターするために、１
０⁶個の細胞を、上記と同じ緩衝液で２度洗浄し、１００μｇの緩衝液で、１μ
ｇのヒトＢ７−１特異性ｍＡｂＢＢ−１（ファーミンジェン(PharMingen)，サ
ンディエゴ，ＣＡ）を与えて１時間氷上で培養した。細胞を、１度洗浄し、２次
抗体として、１：１００で希釈化された１００μｌのＦＩＴＣ結合ヤギＦ(ａｂ'
)₂抗マウスＩｇ（ベーリンガー(Boehringer)，インディアナポリス，ＩＮ）で（
１時間氷上で）免疫染色し、ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメータで分析した。

【００３７】抗Ｂ７−１ＢＢ−１ｍＡｂ及びＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧでＫ５６２
細胞を免疫染色することによって検出されたように、図３Ａは、Ｋ５６２細胞が
ｐａｌ-ｐｒｏｔＡでプレコートされた場合に、２番目に付加されたＢ７−１・
Ｆｃγ₁が細胞表面に付着したことを示している。対照Ｆｃ融合タンパク質（Ｃ
Ｄ２８・Ｆｃγ₁）がＢ７−１・Ｆｃγ₁に置換された場合は、ＢＢ−１の接合は
観察されず、ＢＢ−1 ｍＡbのＢ７−１特異性が実証されている。非誘導タンパ
ク質Ａがｐａｌ-ｐｒｏｔＡに置換された場合は、ＢＢ−１の接合は観察されず
、融合タンパク質の付着に対する脂質アンカーの依存性が示されている。

【００３８】 [細胞表面に外的に(exogeneously)結合されたＢ７−１・Ｆｃγ₁の評価] ヒトＢ７−１・Ｆｃγ₁を、ヨウ素ビード（ピアース(Pierce)，ロックフォー
ド，ＩＬ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってヨウ化し、ラベル化されたタ
ンパク質を、セファデクスＧ−２５コラム（ファルマシア(Pharmacia)，ピスカ
ータウェイ，ＮＪ）を用いて精製した。その特異性を、未ラベル化のＢ７−１
・Ｆｃγ₁を加えることにより、２.１×１0⁶ｃｐｍ/μｇに調節し、タンパク質
の移送を先に記載した要領で行ない、ラベル化されたタンパク質を置換した。全
ての実験を２回行った。非特異結合をコントロールするために、超過量の未ラベ
ルのヒトＩｇＧ（シグマ）を加えて、特に、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁のタンパク質Ａ
への結合をブロックした。繰り返して洗浄を行った後、細胞ペレットのカウント
を、ガンマカウンタ（１２７２クリニガンマ(Clinigamma);ＬＫＢインストゥル
メンツ，ガイザースバーグ，ＭＤ）で求めた。Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の特異性結合
に起因したカウントを、ヒトＩｇＧにより得られる非特異的数に減じることによ
り計算した。１細胞の平均分子数を、公式Ａ×Ｂ^-1×Ｃ^-1×Ｎ_Aにより計算した
。ここで、Ａは、測定された細胞ペレットの放射能（ｃｐｍ）であり、Ｂは、ｃ
ｐｍ/ｍｏｌとして表されるラベル化タンパク質の比活性であり、Ｃは細胞ペレ
ット内の細胞数であり、Ｎ_Aはアボガドロ定数である。

【００３９】図３Ｂに示すように、Ｋ５６２細胞が過剰のｐａｌ-ｐｒｏｔＡ（３３μｇ/ｍ
ｌ）でプレコートされた場合、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の表面レベルは、加えられた
Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の濃度に依存した。表面のＢ７−１エピトープレベルは、３
３μｇ/ｍｌでプラトーに達した。エピトープ密度は、Ｂ７−１のトランスフェ
クトされたＫ５６２細胞上のもの(データは示さず)と同様であった。１細胞当た
りのペインティングされたＢ７−１・Ｆｃγ₁の平均数を、¹²⁵Ｉでラベル化され
たＢ７−１・Ｆｃγ₁を用いて測定した。さらに、表１に示すように、ペインテ
ィング工程の間に試薬濃度が増加すると、Ｋ５６２細胞は、これにつれて増加す
るＢ７−１・Ｆｃγ₁を組み込んだ。

【００４０】表１．Ｋ５６２細胞上へのＢ７−１・Ｆｃγ₁のペインティング

【表１】ａペインティング工程中のＢ７−１・Ｆｃγ₁最終濃度。ｂ値は、Material and Methodsの記載に基づいて測定された。¹²⁵Ｉでラベル化
されたＢ７−１・Ｆｃγ₁の比活性は、２.１×１０⁶ｃｐｍ/μｇである。

【００４１】採用した中で最も低い濃度（０.０３３μｇ/ｍｌ）では、約４６０個の分子が
、Ｋ５６２細胞の各々に固定された。採用した中で最も高い濃度（３３μｇ/ｍ
ｌ）では、約４６０,０００個のＢ７−１・Ｆｃγ₁分子が組み込まれた。総合す
ると、これらのデータは、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁を、ｐａｌ-ｐｒｏｔＡがコートさ
れた細胞に、計量的に加えることができることを証明している。

【００４２】 [増殖検定(Proliferation assays)] ＰＢＭＣを、フィコール密度遠心法で、新鮮な全血から単離した。Ｔ細胞を、
リンパ−クイック(Lympho-kwik)（ワンラムダ(One Lambda)，カノガパーク，Ｃ
Ａ）を用いて、２ラウンドのトリートメントを行って精製した。Ｔ細胞の純度を
、アクセサリー細胞が存在しない状態で、フィトヘモアグルチニン（”ＰＨＡ”
）又はＰＭＡへの増殖応答の欠如によって検証した。ヒトＣＤ３特異性ｍＡｂ
ＨＩＴ３ａ（ファーミンジェン）を、指示された濃度で９６ウェルプレートに結
合し、この形態で、Ｔ細胞への第１活性化信号(first activating signal)を与
えるために使用した。あるいは、ＰＨＡを、可溶な形態で第１信号源として使用
した。陰性対照ベクタｐＲＥＰ７βをトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ
５６２/ｐＲＥＰ７β）を、ｐａｌ-ｐｒｏｔＡでプレコートし、次にＢ７−１・
Ｆｃγ₁でコートした。各増殖検定では、１×１０⁵個のＴ細胞を、４×１０⁴個
のＢ７−１・Ｆｃγ₁でコートすると共に、マイトマイシンＣで処理されたＫ５
６２/ＲＥＰ７β細胞を与えて、６０時間３７℃で培養した。ウェルを、培養期
間の最後の１６時間、１μＣｉ[³Ｈ]チミジンでパルスした。細胞を採取し、こ
れらをベータプレート液体シンチレーションカウンタでカウントした。

【００４３】増殖検定では、ＰＨＡ及びＢ７−１・Ｆｃγ₁がコートされたＫ５６２/ＲＥＰ
７β（すなわち、ＥＢＶエピソーマル発現ベクタｐＲＥＰ７βで、安定にトラン
スフェクトされたＫ５６２細胞）を、Ｔ細胞に夫々第１及び第２信号を与えるた
めに使用した。Ｋ５６２/ＲＥＰ７β細胞は、検出可能なＢ７−１を欠いており
（データは示さず）、試験用の適切な陰性対照に、Ｋ６５２/Ｂ７−１をトラン
スフェクトされた細胞（すなわち、ヒトＢ７−１ｃＤＮＡ配列を含むｐＲＥＰ
７βベクタで、安定にトランスフェクトされたＫ５６２細胞）を与える。Ｋ５６
２/Ｂ７−１をトランスフェクトされた細胞、及びＢ７−１・Ｆｃγ1ヲコートさ
れたＫ５６２/ＲＥＰ７βの表面Ｂ７−１レベルを、免疫染色により測定した。
平均蛍光強度は、夫々、５５０ｎｍと４５０ｎｍであった。図４Ａに示すように
、ＰＨＡ濃度が最適濃度以下では（＜０.５μｇ/ｍｌ）、Ｋ５６２/ＲＥＰ７β
ではなく、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁をコートされたＫ５６２/ＲＥＰ７βのＴ細胞の増
殖促進は、有意的に認められる。その共刺激効果は、Ｋ５６２/Ｂ７−１をトラ
ンスフェクトされた細胞で得られる効果と同程度であった。観察された共刺激の
Ｂ７−１・Ｆｃγ₁/ｐａｌ-ｐｒｏｔＡ依存性は、（非誘導）タンパク質ＡとＢ
７−１・Ｆｃγ₁の組合せで、又はｐａｌ-ｐｒｏｔＡと対照ＣＤ８・Ｆｃγ₁の
組合せで処理された細胞が、Ｔ細胞の増殖を促進しないことにより検証された。
高いＰＨＡ濃度では（＞１μｇ/ｍｌ）、Ｂ７−１陽性細胞ほどではないが、Ｋ
５６２/ＲＥＰ７βもＴ細胞の増殖を共刺激した。

【００４４】細胞関連Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の共刺激作用をさらに確めるために、プレートに
結合された抗ヒトＣＤ３ｍＡｂを、さらに生理的な第１信号としてＰＨＡに置
換して増殖試験を行った。このセッティングでは、図４Ｂに示すように、抗ＣＤ
３ｍＡｂ濃度が適量以下の場合（＜１０μｇ/ｍｌ）、細胞関連Ｂ７−１・Ｆｃ
γ₁は、トランスフェクトされた細胞で同じレベルで発現された陰性Ｂ７−１よ
りも、さらに著しく共刺激した。さらに、陰性対照Ｆｃ融合タンパク質として用
いられたＣＤ８・Ｆｃγ₁は、同じ条件下で共刺激しなかった。総合すると、こ
れらの結果は、ｐａｌ-ｐｒｏｔＡを介して細胞膜に繋がれたＢ７−１・Ｆｃγ₁ は、効果的にＴ細胞の増殖を共刺激することを証明している。

【００４５】全てのＴ細胞の調製におけるアクセサリー細胞の効率的な欠乏は、共刺激のソ
ースの不存在によるＰＭＡ又はＰＨＡへの応答の欠如を示すことによって立証さ
れた。図４Ａ及びＢに示された点は、３つのサンプルの平均値とＳＥである。デ
ータは、少なくとも３つの独立した実験を代表しており、同様な結果が得られた
。

【００４６】 [細胞関連Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の共刺激活性化における濃度依存性] 以上により得られた効果的な共刺激物質タンパク質移送方法で、Ｂ７−１の共
刺激の量的側面を評価した。このために、Ｔ細胞の増殖検定を、異なる濃度のＢ
７−１・Ｆｃγ₁でペインティングされたＫ５６２/ＲＥＰ７βを用いて行った。
図５Ａに示されたように、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁媒介性(mediated)共刺激の濃度依
存性は、最適濃度以下（０.２５又は０.５μｇ/ｍｌ）のＰＨＡを第１信号源と
して使用することにより、容易に立証することができる。例えば、ＰＨＡが０.
５μｇ/ｍｌであると、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁閾値濃度（０.１μｇ/ｍｌ）に達した
とき、Ｔ細胞の増殖が観察された。そして、増殖レベルは、約３.３μｇ/ｍｌで
プラトーに達するまで、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁濃度の増加に伴って上昇し続けた。
ＰＨＡが低濃度では(０.２５μｇ/ｍｌ)、Ｂ７−１はより高い閾値濃度（１μｇ
/ｍｌ）に達したとき、Ｔ細胞の増殖が観察された。このことは共刺激物質の閾
値が第１信号の強さで調節されることを示している。

【００４７】図５Ｂに示すように、抗ヒトＣＤ３ｍＡｂをＰＨＡに代わる第１信号源とし
て用いた場合、同様な結果が得られた。さらに、プレートに結合された抗ＣＤ３
ｍＡｂが最適濃度以下（０.３７又は１.１μｇ/ｍｌ）で存在するときは、Ｂ７
−１・Ｆｃγ₁の濃度が閾値に達した後のみ、共刺激が観察された。そして、増
殖の用量依存性のさらなる増加も認められた。ゆえに、第１信号が（ＰＨＡ又は
抗ＣＤ３ｍＡｂであるかに関わらず）最適状態に及ばないとき、Ｔ細胞を増殖
させるにはＢ７濃度は閾値に達することが要求され、Ｔ細胞の増殖の程度は、共
刺激物質レベルで決められる。

【００４８】 [分泌されたサイトカインのＥＬＩＳＡ測定と、個別のサイトカイン応答のＢ
７−１共刺激物質の閾値の序列(hierarchy)の決定] プレートに結合されたＨＩＴ３ａ又はＰＨＡの何れかを第１信号源として用い
て、４８ウェルプレートに５×１０⁶個の処理済のＫ５６２/ＲＥＰ７β細胞（Ｂ
７−１・Ｆｃγ₁は陽性又は陰性）を与えて、全１０⁶個のＴ細胞を培養した。上
清を４８時間後に集めて、ヒトＩＦＮ−γとＩＬ−２のためのＥＬＩＳＡを、市
販のＥＬＩＳＡキットを用いて製造業者（ジェンザイム(Genzyme)，ケンブリッ
ジ，ＭＡ）のプロトコルに従って実行した。具体的には、ＥＬＩＳＡを用いて、
ペインティングされたＢ７−１・Ｆｃγ₁濃度及び最適濃度以下の第１刺激濃度
を変化させ、これに応答するＴ細胞サイトカインの分泌を測定した。図６Ａに示
すように、所定のＰＨＡ用量では、最小及び最大のサイトカイン応答を引き出す
Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の濃度は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２について、ＩＦＮ−γ＜
ＩＬ−２である一般的な序列と異なった。図６Ｂに示すように、第１信号源とし
て抗ＣＤ３ｍＡｂ（３.３μｇ/ｍｌ）が用いられた場合、サイトカイン応答に
ついての同様の序列が観察された。例えば、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁の濃度が０.３３
μｇ/ｍｌであると、ＩＦＮ−γのアウトプットは、最大応答の６０％であるが
、ＩＬ−２のアウトプットは、底の(basal)レベルを超える増加はなかった（図
６Ｂ）。Ｂ７−１共刺激物質の閾値に関するこの観測されたＩＦＮ−γ＞ＩＬ−
２なる序列は、ＴＣＲ活性化限界について記載された順序と一致する。Ｂ７−１
レベルは、Ｔ細胞増殖応答の程度を調節できることが立証されており、Ｂ７−１
レベルは、活性化されたＴ細胞により生じたサイトカインの比を変えることによ
り、免疫応答の特性を決定できることが立証された。

【００４９】 [細胞内のサイトカイン生成の分析、及び単一細胞レベルのカイトサイト応答
に係る序列的共刺激物質閾値に関する証拠の評価] バルクＴ細胞群でＥＬＩＳＡの検出結果を立証するために、マルチパラメータ
フローサイトメトリック解析を行い、個々の細胞について細胞内のＩＦＮ−γ及
びＩＬ−２レベルを評価した。１０⁶個のＴ細胞の全部を、４８時間、４８ウェ
ルプレートで、５×１０⁵個のＢ７−１・Ｆｃγ₁がコートされたＫ５６２/ＲＥ
Ｐ７β細胞を与えて培養した。さらに、プレートに結合されたＨＩＴ３ａ又はＰ
ＨＡの何れかを、第１信号のソースとして使用した。モネシン(Monesin)（シグ
マ）を３μＭの最終濃度で加えて、混合物をさらに６時間培養し、細胞内にカイ
トサイトを蓄積させた。その後、細胞を集めて、これら細胞を、氷上で２０分間
１００μｌの細胞固定液[４％パラホルムアルデヒド/ＰＢＳ（ｐＨ７.４）]で培
養して固定し、染色緩衝液（０.１％サポニン/１％熱不活性化ＦＣＳ/０.１％ア
ジ化ナトリウム/ダルベッコ（Dulbecco）のＰＢＳ）で２度洗浄した。０.５μｇ
のＦＩＴＣ抗ＩＦＮ-γと０.５μｇのＰＥ抗ＩＬ−２Ａｂｓ(ファーミンジェン
)を含む１００μｌの染色緩衝液を用いて、氷上で１時間培養することにより、
細胞内のカイトサイトの免疫染色を行なった。次に、細胞を、サポニンなしの染
色緩衝液で１度洗浄した。前方光散乱/側方光散乱パラメータを用いて、Ｔ細胞
をゲートし、各々について２−５×１０⁴個の細胞を分析した。

【００５０】Ｂ７−１・Ｆｃγ₁が低濃度のとき、Ｔ細胞は、ＩＮＦ−γのみのプロデュー
サ(producer)により支配される。しかしながら、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁が高濃度の
とき、ＩＦＮ−γとＩＬ−２の２重プロデューサが大量に出現した（図７）。Ｂ
７−１・Ｆｃγ₁濃度が最高のときでさえ、ＩＬ−２のみのプロデューサの数は
ほとんど観察されなかった。これらの結果は、バルクＴ細胞カイトサイン応答の
データと一致しており、ＩＮＦ−β応答では、ＩＬ−２応答よりも要求されるＢ
７−１の共刺激物質が少ないことを示している。

【００５１】実験２細胞膜結合タンパク質Ａの温度効果について研究した。移送されたタンパク質
は、Ｔ細胞を準備するために、細胞に結合されて体内で留まる必要があり、少な
くとも数時間の共刺激物質の安定した関与を必要とする。脂質化タンパク質が細
胞膜に移送される反応温度は、細胞膜上のタンパク質の長期間の保持に多大な影
響を与えることが明らかになった。タンパク質移送反応は、４℃、２５℃又は３
７℃で行われた。パルミチン酸タンパク質Ａは、Ｋ５６２細胞へ移送された。ｈ
Ｂ７−１・Ｆｃを、¹²⁵Ｉでラベル付けし、実験１で述べた方法により、タンパ
ク質Ａをコートされた細胞へ移送した。４℃を超える温度で起こり得るエンドサ
イトーシスの干渉を防ぐため、移送反応の前に、代謝阻害剤アジ化ナトリウム及
び２−デオキシグルコースで細胞を処理した。

【００５２】細胞膜上におけるタンパク質の長期間保持を調べるために、細胞を十分に洗浄
し、結合していないタンパク質を排除した。続いて、３日経過するまで、３７℃
で１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁して培養した。数回の間隔で、
懸濁液の一部を取って、細胞をペレット化した。細胞ペレットに残存している
放射線レベルの量を、前記懸濁液の一部における放射線カウントの全数と比較し
た。これら２つの量の比を、細胞膜上にまだ残っている移送タンパク質の相対部
分として計算した。図８に表されたように、より高いタンパク質移送反応温度と
、より長い期間の保持レートとの間に、直接的な関係が存在する。さらに重要な
事に、４℃から３７℃へ移送温度が上昇すると、移送されたタンパク質は、３日
間、３７℃の生理的温度で細胞膜上に結合したままであり、有意的な損失はなか
った（最初の６時間以降）。

【００５３】実験３ハーレン(Harlen)[米国，インディアナポリス]から購入したＣ３Ｈ/ＨｅＮマ
ウスを、Ｔ細胞から作られた細胞ワクチン[アブラハムホックベルグ(Avranham
Hochberg)，ハダサ(Hadassah)大学病院，から入手]を用いて免疫化した。このワ
クチンを、パルミチン酸タンパク質Ａと、ｍＢ７−１・Ｆｃ、ｍ４＝１ＢＢＬ・
Ｆｃ、及びｈＣＤ４０Ｌ・Ｆｃ融合タンパク質とを用いて、実験１で概略を述べ
た手順にほぼ従って調製した。基本的には、細胞４０×１０⁶個当たり４０μｇ
のタンパク質Ａとなる比で、細胞を、３７℃にて脂質化タンパク質Ａでコートし
た。そして、細胞４×１０⁷個当たり２０μｇの全タンパク質となる比で、細胞
を、３つの融合タンパク質が同じ割合である混合物を与えて４℃で培養した。細
胞ワクチンを、１回当たり１０⁶個の細胞なる分量で、マウスに皮下注入した。
注入は、一週間に１回行ない、３週間続けた。最後の注入から１週間後、１０⁶
個の野生型Ｔ５０腫瘍細胞を、マウスの後ろの横腹に皮下注入した。図９に示す
ように、細胞ワクチンは、免疫化されたマウスの生存率を改善した。図９におい
て、白丸は治療なしの対照群（ｎ＝６）、四角は、タンパク質Ａの移送で作られ
た対照ワクチンを受容した別の対照群（ｎ＝５）、黒丸は、タンパク質Ａと複合
化された免疫共刺激タンパク質Ｂ７−１、４−１ＢＢＬ、及びＣＤ４０Ｌによる
タンパク質移送で生成された細胞ワクチンを受容した試験群（ｎ＝６）である。

【００５４】実験４ＤＢＡ/２Ｊマウスを、ジャクソン(Jackson)研究所，マイン，から購入した。
該マウスに致死量の５１７８Ｙ−Ｒ腫瘍細胞を内皮接種し、腫瘍接種の後、５日
目、６日目及び７日目に、細胞ワクチンの皮下注入をした。ここで、実験３と同
じ細胞ワクチンを、１回当たり１０⁶個の細胞となる分量で使用した。図１０は
、細胞ワクチンを投与治療したマウスの生存率が向上したことを示している。図
１０において、白丸は治療なしの対照群（ｎ＝８）、四角は、タンパク質Ａの移
送で作製された対照ワクチンを受容した別の対照群（ｎ＝８）、黒丸は、タンパ
ク質Ａと複合化された免疫共刺激タンパク質によるタンパク質移送で生成された
細胞ワクチンを受容した試験群（ｎ＝８）である。

【００５５】実験５パルミチン酸タンパク質Ａと、ＦａｓＬ・Ｆｃ、Ｂ７−１・Ｆｃ、４−１ＢＢ
Ｌ・Ｆｃ、及びＣＤ４０Ｌ・Ｆｃ融合タンパク質を、脂質化タンパク質Ａを３部
、各融合タンパク質を１部の割合で生体外で混合することにより、ワクチンを調
製した。次に、腫瘍１部位につき全タンパク質４μｇとして、タンパク質混合物
を皮下注入した。続いて、ワクチンを腫瘍に直接注入した。ワクチン内の免疫共
刺激タンパク質は、インシチューでの腫瘍細胞の免疫原性特性を変化させた。

【００５６】ＤＢＡマウスに、致死量のＬ５１７８Ｙ−Ｒ腫瘍細胞を接種させた。腫瘍塊が
約５０ｍｍ²の大きさに成長したとき、癌ワクチンを腫瘍部位に直接注入した。
ワクチンは、予め、パルミチン酸タンパク質Ａと組み合わされている。このタン
パク質Ａは、本方法に従って、インシチューで腫瘍細胞に共刺激物質を固定する
能力を与える。図１１に示すように、間接的に脂質化された共刺激物質で処理さ
れたマウスは、有意の差をもって長く生存した。図１１において、白丸は、処理
なしの対照群（ｎ＝６）で、四角は、脂質化タンパク質Ａのみが注入された別の
対照群（ｎ＝７）、黒丸は、脂質化タンパク質Ａと複合化された免疫共刺激タン
パク質が注入された試験群（ｎ＝７）である。

【００５７】実験６ＦａｓＬ用の融合タンパク質を生成するために、ＡＴＣＣから得たヒトＦｃ
γ₁ドメインのコード配列を、文献[Immunity,5:163,1996]に報告された融合方法
に従って、ＦａｓＬの細胞外ドメインのためのコード配列のＮ−ターミナスで融
解した。タンパク質Ａでコートされた細胞に付着させて標準の致死検定(killing
assey)で確認すると、精製された融合タンパク質は、十分機能的であった。Ｆ
ａｓＬは、例えば、活性化Ｔ細胞のような他の細胞の表面に存在する別のタンパ
ク質Ｆａｓと接合する細胞表面タンパク質である。ＦａｓＬがＦａｓに接合する
と、Ｆａｓを発現する細胞は、アポトーシスを起こす。注目すべきことに、Ｆａ
ｓＬ・Ｆｃ融合タンパク質は、脂質化タンパク質を通過して細胞表面に移送され
た後に、アポトーシス活性を維持した。

【００５８】Ｆｃ−ＦａｓＬ融合タンパク質が、細胞表面にアンカリングされた後に機能的
であるか否かをより具体的に確認するために、標準のＪＡＭ検定を行う。エフェ
クタ細胞はＣＨＯ細胞であり、これを、パルミチン酸タンパク質Ａ（ｐａｌ−ｐ
ｒｏｔＡ）で、続いてＦｃ融合タンパク質でペインティングした。ターゲット細
胞は、ジャーカット(Jurkat)細胞であり、構造的にＦａｓを発現し、Ｆａｓ/Ｆ
ａｓＬ媒介アポトーシスの影響を受ける。標準のＪＡＭ検定を、P.Matzinger（J
.Immunol.Methods,145:185-192,1991）に記載されたプロトコルに従って実行し
た。簡単に述べると、２×１０⁴個の３Ｈチミジンでラベル付けされた標的ジャ
ーカット細胞を、実験１で先述したように、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡでプレコートし
た（ＡＴＣＣからの）２×１０⁵個のＣＨＯ細胞で共培養し、続いて３０μｇ/ｍ
ｌのＦｃ−ｈＦａｓＬ融合タンパク質又は対照融合タンパク質でペインティング
した。それら細胞を、湿雰囲気下でＣＯ₂５％の培養器の中で、３７℃で１８時
間、９６ウェルプレート内の２００μｍのＲＰＭＩ−１０の中で共培養した。Ｊ
ＡＭ検定の結果を得るために、細胞及びそれらの培地を、（増殖検定について第
１実施例で用いたように）ハーベスタを用いてファイバーグラスフィルタに吸引
した。特異性致死率(％)(specific killing)は、(Ｓ−Ｅ)/Ｓ×１００に基づい
て計算した。ここで、Ｓ＝エフェクタ細胞からの自然放出(spontaneous release
)、Ｅ＝エフェクタ細胞の存在下での実験放出(experimenrtal release)である
。

【００５９】図１２は、その結果をまとめたものである。ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ及びＦｃ−ｈ
ＦａｓＬでペインティングされたＣＨＯ細胞をエフェクタ細胞として用いた場合
、致死作用は有意的な差をもってされた。陰性対照として用いたＣＨＯ細胞がｐ
ａｌ−ｐｒｏｔＡ及び対照Ｆｃ融合タンパク質（ｈＣＤ８０−Ｆｃ又はｈＣＤ２
８−Ｆｃ）でペインティングされた場合、特異性致死は観察されなかった。Ｆｃ
−ｈＦａｓＬの表面接着依存性(anchorage-dependence)は、パルミチン酸化され
ていないタンパク質及びＦｃ−ｈＦａｓＬでＣＨＯ細胞がペインティングされた
陰性対照により明らかになった。致死作用の特異性は、ｍＡｂＮＯＫ−１を中
性化するＦａｓＬによる致死作用を完全にブロックすることにより明らかになっ
た。一方、対照抗体は致死作用をブロックしなかった。

【００６０】総括すると、これらの結果は、Ｆｃ−ｈＦａｓＬが、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡを通
過して細胞表面に移送された後に、その機能を保持し、Ｆａｓ陽性ジャーカット
細胞内でアポトーシスを引き出すことを示している。

【００６１】上記の実験例は、本発明の方法の効果を明らかにする。脂質化タンパク質を使
用したが、融合タンパク質は、エクスビボ及びインシチューで細胞の移送ができ
る。注目すべきは、これらの融合タンパク質は、移送の後に免疫制御作用を保持
していることである。実施例は、イミテーション後の感染及び予め存在する腫瘍
に対するこの保持された作用を明らかにしている。本方法は、インビボ及びイン
ビトロの双方で有効であることが明らかにされた。

【００６２】本発明の特定の実施例は説明の目的で記載されており、当該技術分野の通常の
知識を有する者には、請求の範囲に規定された発明から逸脱することなく本発明
の細部を変更できることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃを含み、実験１の方法に従って脂質化タンパク質で細
胞をコートした効果を示す。

【図２】実験１で調製された組換え体Ｂ７−１・Ｆｃγ₁のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示
す。

【図３】実験１に記載されたように、本発明の方法が融合タンパク質の移送(図３Ａ参
照)を定量的に達成できる(図３Ｂ参照)ことを示す。

【図４】実験１に記載されたように、ＰＨＡ(図４Ａ)又は抗ＣＤ３ｍＡｂ(図４Ｂ)の何
れかを第１信号として用いて、(表示した)種々のタンパク質の存在下で、Ｔ細胞
増殖の刺激を示す。

【図５】実験１に記載されたように、ＰＨＡ(図５Ａ)又は抗ＣＤ３ｍＡｂ(図５Ｂ)の何
れかを第１信号として用いて、Ｔ細胞の増殖に対するＢ７−１の閾濃度を示す。

【図６】実験１に記載されたように、ＰＨＡ(図６Ａ)又は抗ＣＤ３ｍＡｂ(図６Ｂ)の何
れかを第１信号として用いて、ＩＬ−２生成に対するＩＦＮ−γについてのＢ７
の濃度閾値の比較を示す。

【図７】実験１に記載されたように、ＩＬ−２生成に対するＩＦＮ−γについてのＢ７
−１の濃度閾について比較用単一細胞の分析を示す。

【図８】実験２に記載されたように、タンパク質移送中の反応温度が、移送されたタン
パク質の安定性に及ぼす影響を示す。

【図９】実験３に記載されたように、免疫後の腫瘍誘導から患者を守る本発明の癌ワク
チンの効果を示している。

【図１０】実験４に記載されたように、予め存在する腫瘍の治療に於ける本発明の癌ワク
チンの効果を示している。

【図１１】実験５に記載されたように、共刺激物質の腫瘍内への注入による本癌ワクチン
の効果を示す。

【図１２】実験６に記載されたように、ＪＡＭ検定の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チェン，アオシァンアメリカ合衆国 19087 ペンシルベニア，ウェイン，イートンドライブ 126 (72)発明者ツェン，グオシンアメリカ合衆国 19087 ペンシルベニア，ウェイン，イートンドライブ 126 Ｆターム(参考） 4B065 AA92X AA93X BA30 BD39 BD50 CA44 4C084 AA02 BA01 BA08 BA23 BA36 BA41 CA18 CA62 DA01 MA02 NA14 ZB072 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB63 CA04 MA02 MA66 NA10 NA14 ZB07 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１タンパク質で細胞の表面をコートする工程と、前記細胞を
第２タンパク質と接触させる工程とを含み、前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質であり、前記第２タンパク質は、前記第１タンパク質に対して親和性を有する第１ドメ
インと、ペプチド、タンパク質、又はその誘導体或いはフラグメントからなり、
トランスシグナリング及び/又は接着作用を有する第２ドメインとを具えている
融合タンパク質である、細胞にタンパク質を移送する方法。
【請求項２】前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質の少なくともいず
れか一方は、細胞外ドメインである請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記第２タンパク質は、免疫制御作用を有する請求項１に記載
の方法。
【請求項４】前記細胞に移送されるタンパク質の量は、接触工程において用
いた第２タンパク質の量で決定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記第１タンパク質は、Ｃ１２乃至Ｃ２２脂質で脂質化されて
いる請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記脂質は、Ｃ１６である請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質Ａ及び脂質化タンパ
ク質Ｇからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記第１タンパク質は、パルミチン酸タンパク質Ａである請求
項７に記載の方法。
【請求項９】前記第１ドメインは、前記第２タンパク質のアミノ末端に繋が
る請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記第１ドメインは、前記第２タンパク質のカルボキシル末
端に繋がる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記第２ドメインは、タイプI細胞膜タンパク質の一部をエ
ンコードする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記第２ドメインは、タイプII細胞膜タンパク質の一部をエ
ンコードする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記第２ドメインは、共刺激物質をエンコードする請求項１
に記載の方法。
【請求項１４】前記第２ドメインは、共阻害物質をエンコードする請求項１
に記載の方法。
【請求項１５】前記共刺激物質は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ
３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、及び熱安定性抗原からなる群から選択される
請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】前記第２タンパク質は、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁である請求項１
に記載の方法。
【請求項１７】前記共阻害物質は、ＣＤ８、Ｆａｓリガンド、及び免疫グロ
ブリンの単鎖Ｆｖ誘導体からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】前記コートされた細胞は、２以上のタイプの第２タンパク質
と接触し、第２タンパク質の各タイプは夫々異なっている請求項１に記載の方法
。
【請求項１９】前記第２タンパク質は、予め定められた比率で導入される請
求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記コート工程及び前記接触工程は生体内で行われる請求項
１に記載の方法。
【請求項２１】前記コート工程及び前記接触工程は生体外で行われる請求項
１に記載の方法。
【請求項２２】前記接触した細胞を患者に注入する工程をさらに含む請求項
１８に記載の方法。
【請求項２３】請求項１の方法により生成された細胞。
【請求項２４】ａ）複数の細胞の表面を第１タンパク質でコートする工程と
、ｂ）前記細胞を第２タンパク質と接触させる工程と、ｃ）工程ｂの接触した細胞をＴ細胞と混合する工程と、ｄ）Ｔ細胞増殖のレベルを決定する工程とを含み、前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質であり、前記第２タンパク質は、前記第１タンパク質に対して親和性を有する第１ドメ
インと、共刺激物質の第２ドメインとを具えている融合タンパク質である、Ｔ細
胞内の共刺激物質活性の閾値を決定する方法
【請求項２５】ｅ）サイトカイン分泌レベルを決定する工程をさらに含む請
求項２１に記載の方法。
【請求項２６】複数の細胞の表面を第１タンパク質でコートする工程と、前記細胞を第２タンパク質と接触させる工程と、有効な量の前記コートされた細胞を患者に投与する工程とを含み、前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質であり、前記第２タンパク質は、前記第１タンパク質に対して親和性を有する第１ドメ
インと、ペプチド、タンパク質、又はその誘導体或いはフラグメントからなり、
疾病の治療に特異性のトランスシグナリング又は接着作用を有する第２ドメイン
とを具えている融合タンパク質である、患者の疾病を治療する方法。
【請求項２７】前記疾病は、癌、自己免疫疾患、及びアロ免疫病からなる群
から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記疾病は癌であり、前記投与は腫瘍への注入により行われ
る請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記細胞は、自己に由来する請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】前記細胞は、アロジェニックである請求項２６に記載の方法
。
【請求項３１】前記細胞は、アロジェニック細胞株である請求項３０に記載
の方法。
【請求項３２】第１タンパク質及び第２タンパク質とを患者に投与すること
によって、複数の細胞にタンパク質を移送する工程を含み、前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質であり、前記第２タンパク質は、前記第１タンパク質に対して親和性を有する第１ドメ
インと、ペプチド、タンパク質、又はその誘導体或いはフラグメントからなり、
疾病の治療に特異性のトランスシグナリング及び/又は接着作用を有する第２ド
メインとを具えている融合タンパク質であり、患者の中にある有効量の細胞は、そこに移送された融合タンパク質を有してい
る、患者の疾病を治療する方法。
【請求項３３】前記第１タンパク質及び前記第２タンパク質は、連続的に投
与される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記第１タンパク質及び前記第２タンパク質は、同時に投与
される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】前記投与は、局所注入によって行われる請求項３２に記載の
方法。
【請求項３６】前記投与は、全身注入によって行われる請求項３２に記載の
方法。
【請求項３７】請求項１に記載の方法で、生成された細胞を、適当な担体の
中に含む癌ワクチン。
【請求項３８】前記第１タンパク質は、脂質化タンパク質Ａ及び脂質化タン
パク質Ｇからなる群から選択される請求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項３９】前記第１タンパク質は、パルミチン酸タンパク質Ａである請
求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項４０】前記第１ドメインは、前記第２タンパク質のアミノ末端に繋
がる請求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項４１】前記第１ドメインは、前記第２タンパク質のカルボキシル末
端に繋がる請求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項４２】前記第２ドメインは、タイプI細胞膜タンパク質の一部をエ
ンコードする請求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項４３】前記第２ドメインは、タイプII細胞膜タンパク質の一部をエ
ンコードする請求項３７に記載の癌ワクチン。
【請求項４４】前記第２ドメインは、共刺激物質をエンコードする請求項３
７に記載の癌ワクチン。
【請求項４５】前記第２ドメインは、共阻害物質をエンコードする請求項３
７に記載の癌ワクチン。
【請求項４６】前記共刺激物質は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ
３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、及び熱安定性抗原からなる群から選択される
請求項４６に記載の癌ワクチン。
【請求項４７】前記第２タンパク質は、Ｂ７−１・Ｆｃγ₁である請求項１
に記載の方法。
【請求項４８】前記共阻害物質は、ＣＤ８、Ｆａｓリガンド、及び免疫グロ
ブリンの単鎖Ｆｖ誘導体からなる群から選択される請求項４５に記載の癌ワクチ
ン。
【請求項４９】前記ワクチンは、２以上の第２タンパク質を含む請求項３７
に記載の癌ワクチン。
【請求項５０】前記ワクチンは、２以上の細胞型を含み、各細胞型はそこに
移送された夫々異なる融合タンパク質を有する請求項３７に記載の癌ワクチン。