CN108192943B - 表达cd40l的哺乳动物细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文报道了用于在存在IL‑2和IL‑21的情况下共培养兔B‑细胞集合或单个放置的兔B‑细胞的共培养系统，其中表达CD40L的CHO细胞用作饲养细胞。

Description

表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途
本申请是申请日为2012年11月21日、发明名称为“表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途”的中国专利申请201280057401.X(国际申请号PCT/EP2012/073232)的分案申请。
本专利申请是B-细胞培养领域。本文报道了这样的培养系统，其用于刺激和扩展兔和人来源的抗体分泌细胞，如激活的B-细胞、成浆细胞以及在存在兔或人表达CD40L的饲养细胞的情况下从疾病中存活后免疫的兔或人分离的B-细胞。
发明背景
已经报道，来自不同物种的分离的B-细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实际上，这正常通过将原代B-细胞与杂交瘤配偶体融合产生无限增殖B-细胞系或无限增殖化来克服。对于兔，还开发了浆细胞瘤融合配偶体(Spieker-Polet,H.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)9348-9352，但是杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于兔B-细胞在体外的持续存活，提供必要的激活刺激剂和存活因子是必需的。已经描述了多种化合物，如IL-2、IL-4、IL-10及其他(参见例如Zubler,R.,等,Eur.J.Immunol.14(1984)357-363和J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。
在生理学上,B-细胞在遭遇特异抗原加例如通过CD40/CD40L途径(综述于Néron,S.,等,Arch.Immunol.Ther.Exp.59(2011)25-40)和/或通过来自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树状突细胞或T细胞辅助的额外激活后被激活。
在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定化的抗CD40抗体或CD40L模拟CD40/CD40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并且仅描述了与使用不同饲养混合物(例如Zubler混合物；IL-4、IL-10等)(Zubler,R.，上文)或胸腺细胞上清液(TSN)的其他所需刺激剂的组合。
Weitkamp,J-H.,等,(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了针对来自利用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B-细胞的轮状病毒产生重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报道了针对多个近亲抗原产生多个分离抗体的方法。在WO 2008/144763和WO 2008/045140中分别报道了针对IL-6的抗体及其用途，以及用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。在US 2007/0269868中报道了用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。Masri等(在Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报道了从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中获得的功能性Fab片段在大肠杆菌(E.coli)中的克隆与表达。在WO2007/031550中报道了用于制备免疫球蛋白文库的方法。
在WO 2009/10515中报道了制备表达有用的抗体的杂交细胞的方法。在WO 2008/085878中报道了中和葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B的高亲和力抗体。Amanna,I.J.和Slifka,M.K.报道了通过两种独立的且互补的方法定量稀有的记忆B-细胞群体(J.Immunol.Meth.317(2006)175-185)。在WO 2011/052545中报道了用于产生抗原特异性B-细胞群体的方法。
发明概述
本文报道了用于从兔(或人)B-细胞开始快速、有效并可重复地产生兔(或人)抗体并包括至少一个培养步骤的新方法。
本文进一步报道了可以与表达兔CD40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的兔B-细胞刺激和培养系统。
本文进一步报道了可以与表达人CD40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的人B-细胞刺激和培养系统。
如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下/与其一起共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。
在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤：培养分泌抗体的兔B-细胞和表达兔CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。
在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤：在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的兔B-细胞和表达兔CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。
在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。
在一个实施方案中，在培养开始时加入IL-2和IL-21。
在一个实施方案中，在培养开始时单独加入IL-2和IL-21。
在一个实施方案中，兔B-细胞是未经处理的或非成熟的兔B-细胞。
在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤：培养分泌抗体的人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。
在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。
如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤：在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。
在一个实施方案中，在培养开始时加入白细胞介素。
在一个实施方案中，在培养开始时单独加入白细胞介素。
在一个实施方案中，人B-细胞是成熟的人B-细胞。
在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
如本文报道的一个方面是包含表达兔CD40L的CHO细胞和IL-2以及IL-21的试剂盒。
如本文报道的一个方面是包含表达人CD40L的BHK细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6的试剂盒。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含IL-2和IL-21。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含IL-2和IL-21和IL-6。
在一个实施方案中，所述白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2或IL-21的情况下共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞。
如本文报道的一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞。
如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞或BHK细胞。
如本文报道的一个方面是用于共培养B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞或CHO细胞。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是用于培养分泌T-细胞抑制化合物的B-细胞的方法，其包括共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞。
如本文报道的一个方面是用于培养分泌抗体的B-细胞的方法，其以以下顺序包括
i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第一步次培养，和
ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的随后第二次共培养。
在一个实施方案中，所述第一次和第二次共培养在相同的培养容器中进行。
在一个实施方案中，用于培养分泌抗体的B-细胞的方法包括共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，由此向培养中加入第一种促有丝分裂刺激剂，然后向所述培养中加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后至少一小时加入抗体产生刺激剂。在一个实施方案中，在向培养中加入促有丝分裂刺激剂后一至三天加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，所述促有丝分裂刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan 1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)，和II型干扰素(例如IFNγ)。还可以通过抗IgG、抗CD20和/或抗CD27抗体诱导B-细胞激活。
在一个实施方案中，所述抗体产生刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)，和II型干扰素(例如IFNγ)。还可以通过抗IgG、抗CD20和/或抗CD27抗体诱导B-细胞刺激。
在一个实施方案中，在第一次共培养开始时加入促有丝分裂刺激剂。
在一个实施方案中，在第一次共培养开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天加入所述促有丝分裂刺激剂。
在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天后加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，共培养中的每一次进行5-14天。
在一个实施方案中，培养5-21天的总时长。在一个实施方案中，培养6-14天的总时长。
在一个实施方案中，在第二次共培养开始前去除促有丝分裂刺激剂。在一个实施方案中，通过交换培养上清液和或用中性培养基洗涤细胞进行去除。
如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a)共培养放置的(deposite)分泌抗体的B-细胞集合或单个B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，
b)分离编码特异性结合抗原的抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列之核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列之核酸，
c)培养包含在一个或多个表达盒中含有b)中分离的核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体的细胞，
d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)B-细胞群体(其获得自实验动物或人的血液)，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色B-细胞群体的细胞，
c)将B-细胞染色群体的单个细胞或来自B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，
d)在存在表达CD40L的哺乳动物细胞和任选地IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养放置的单独B-细胞，
e)测定在单独的B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色兔B-细胞群体的细胞，
c)将兔B-细胞染色群体的单个细胞或来自兔B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，
d)在存在表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的兔B-细胞，
e)测定在兔B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)人B-细胞群体，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色人B-细胞群体的细胞，
c)将人B-细胞染色群体的单个细胞或来自人B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的容器，其为多孔平板的一个孔)，
d)在存在表达人CD40L的哺乳动物细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养放置的人B-细胞，
e)测定在人B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
在一个实施方案中，细胞集合包含约10个B-细胞至约1,000,000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞至约100,000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞。
如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a)共培养分泌抗体的兔B-细胞的集合或分泌抗体的单个放置的兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21，
b)分离编码特异性结合抗原的抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列之核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列之核酸，
c)培养包含在一个或多个表达盒中含有b)中分离的核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体的细胞，
d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色B-细胞群体的细胞，
c)将B-细胞染色群体的单个细胞或来自B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的的容器，其为多孔平板的一个孔)，
d)在存在表达CD40L的哺乳动物细胞以及任选地IL-2和IL-21的情况下培养放置的单独的B-细胞，
e)测定在单独的B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸或其编码轻链和/或重链可变域的人源化形式的变体用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)兔B-细胞群体，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1-3，或2-3种荧光染料)染色兔B-细胞群体的细胞，
c)将兔B-细胞染色群体的单个细胞或来自兔B-细胞染色群体的细胞集合放置在单独的容器中(在一个实施方案中是这样的的容器，其为多孔平板的一个孔)，
d)在存在表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的兔B-细胞，
e)测定在兔B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，细胞集合包含约10个B-细胞至约1,000,000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞至约100,000个B-细胞。在一个实施方案中，所述集合包含约500个B-细胞。
如本文报道的一个方面是表达兔CD40L的哺乳动物细胞在共培养分泌抗体的兔B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
在一个实施方案中，所述兔CD40L具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
如本文报道的一个方面是表达人CD40L的哺乳动物细胞在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞。
在一个实施方案中，所述人CD40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
如本文报道的一个方面是SAC在共培养分泌抗体的B-细胞和表达CD40L的哺乳动物细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21在共培养兔B-细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是表达人CD40L的哺乳动物细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养人B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下培养单个放置的兔B-细胞或兔B-细胞集合与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL-2并且IL-21是人IL-21或小鼠IL-21。
如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养单个放置的人B-细胞或人B-细胞集合与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是表达兔CD40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21在共培养兔B-细胞用于改善细胞生长中的用途。
如本文报道的一个方面是表达人CD40L的哺乳动物细胞、IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培养人B-细胞用于改善细胞生长中的用途。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
如本文报道的一个方面是用于改善兔B-细胞的细胞生长的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下培养单个放置的兔B-细胞或兔B-细胞集合与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL-2并且IL-21是人IL-21或小鼠IL-21。
如本文报道的一个方面是用于改善人B-细胞的细胞生长的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下培养单个放置的人B-细胞或人B-细胞集合与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。
在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。
附图详述
本文报道的主题提供了用于从兔(或人)B-细胞开始快速、有效并可重复地产生兔(或人)抗体并包括至少一个培养步骤的一般性可应用方法。
已经发现，添加表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21可以改善兔B-细胞的生长特性，即兔B-细胞(单个放置的细胞或作为细胞集合)比在缺少表达兔CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下可以更快速地生长至高细胞密度。因此，短时间内在培养上清液中获得高的兔B-细胞密度和相应地高IgG浓度是可能的。
本文报道的一个方面是表达兔CD40L的CHO细胞。
如本文报道的一个方面是表达兔CD40L的CHO细胞与IL-2和IL-21一起在共培养兔B-细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是可以与表达兔CD40L的CHO细胞或其他饲养细胞组合使用，以提供高度有效的B-细胞刺激和培养系统的合成饲养混合物。
本文报道的一个方面是表达人CD40L的BHK细胞。
如本文报道的一个方面是表达人CD40L的BHK细胞与IL-2和/或IL-21一起在共培养人B-细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是可以与表达人CD40L的BHK细胞或其他饲养细胞组合使用，以提供高度有效的B-细胞刺激和培养系统的合成饲养混合物。
本领域技术人员已知的方法和技术(其用于实施本发明)描述于例如Ausubel,F.M.,编辑,Current Protocols in Molecular Biology,卷I-III(1997),Wiley和Sons；Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中。
定义
出于本文中的目的，“受体人构架”是包含来自人免疫球蛋白构架或如下文定义的人共有构架的轻链可变域(VL)构架或重链可变域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“来自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示羧基α-氨基酸组，其可以直接或以前体形式由核酸编码。可以通过由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码各氨基酸。每个氨基酸由至少一个密码子编码。不同密码子编码同一个氨基酸称为“遗传密码的简并性”。如本申请中所用的术语“氨基酸”表示天然发生的羧基α-氨基酸并且包括丙氨酸(三字母密码：ala，一字母密码：A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体外的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链的部分自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有5大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“克隆”表示来自/源自单个B-细胞的分裂和分泌抗体的B-细胞群体。因此，B-细胞克隆产生单克隆抗体。
如本文所用，术语“表达”指细胞内发生的转录和/或翻译过程。可在细胞中存在的相应mRNA量的基础上测定细胞中目的核酸序列的转录水平。例如，可通过RT-PCR或Northern杂交对从目的序列转录的mRNA进行定量(参阅Sambrook，等，1989，上文)。可通过多种方法，例如通过ELISA，通过测定多肽的生物活性，或通过使用不依赖该活性的测定，如Western印迹或放射免疫测定，使用识别并结合多肽的免疫球蛋白对目的核酸编码的多肽进行定量(参见Sambrook,等，1989，上文)。
“表达盒”指含有用于细胞中至少所含核酸表达的必需调节元件，如启动子和多腺苷酸化位点的构建体。
以瞬时表达或持久表达进行基因的表达。目的多肽一般是分泌的多肽，并因而含有N-端延伸(也称为信号序列)，其为多肽通过细胞壁转运/分泌到细胞外基质中所必需的。一般而言，信号序列可来自编码分泌的多肽的任何基因。如果使用异源信号序列，其优选为宿主细胞识别和加工的(即通过信号肽酶切割的)一种序列。例如对于在酵母中的分泌，待表达的异源基因的天然信号序列可以被来自分泌基因的同源酵母信号序列所取代，如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉森氏酵母属(Hansenula)α-因子前导序列，第二种描述于US 5,010,182中)、酸性磷酸酶信号序列，或白假丝酵母(C.albicans)葡萄糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞表达中，目的蛋白质的天然信号序列对于人或鼠类起源的免疫球蛋白是令人满意的，尽管其他哺乳动物信号序列是合适的，如相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌信号序列，例如单纯性疱疹糖蛋白D信号序列。编码该前区段的DNA片段框内连接，即有效连接至编码目的多肽的DNA片段。
术语“实验动物”表示非人动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、骆马、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、鲨鱼和爬行类动物。在一个实施方案中，实验动物是哺乳动物。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其含有恒定区的至少一部分。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或缺失。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中氨基酸的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat,E.A.,等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242,卷1-3中所述。
术语“饲养混合物”表示不同添加物，如生长因子、细胞因子和/或促进B-细胞激活和/或存活和/或抗体分泌的其他蛋白质的组合。饲养混合物可以是例如从胸腺细胞的培养上清液(TSN)(其是细胞因子的非限定性组合)中获得的天然的饲养混合物，或饲养混合物可以是合成的饲养混合物，例如包含IL-21和/或IL-2和/或IL-6的混合物。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“细胞”或“宿主细胞”指其中可以转染或转染例如编码异源多肽的核酸的细胞。术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞，和用于表达核酸并产生编码的多肽的真核细胞。在一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，任选地是CHO K1细胞(ATCC CCL-61或DSM ACC 110)或CHO DG44细胞(也称为CHO-DHFR[-]、DSM ACC 126)或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan,D.,等,Biochemistry 26(1987)2959-2963)，或CHO-S细胞、或Super-CHO细胞(Pak,S.C.O.,等Cytotechnol.22(1996)139-146)。如果这些细胞不适合于在无血清培养基或悬浮液中生长，那么有待在目前方法使用之前进行适应。如本文所用，表述“细胞”包括受试者细胞及其后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试者细胞和来自其中的培养物，而不考虑转化或次代培养的次数。也理解，由于有意的或无意突变，所有后代在DNA含量上不必完全相同。包括具有与如在最初转化的细胞中所筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的变体后代。
“人抗体”是拥有这样的氨基酸序列的一种抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的或来自利用人抗体所有组成成分或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列选集中最常存在的氨基酸残基的构架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选集来自可变域序列亚组。一般地，序列亚组是如Kabat,E.A.,等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242,卷1-3中所述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，上文中所述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，上文中所述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以包含来自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)上。(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1,CDR-H2和CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102上。(Kabat,E.A.,等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242,卷1-3)。除了VH中的CDRl外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩短的CDR或a-CDR的CDR的区内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102上。(参见Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有说明，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等，上文编号。
术语“标记”表示表面标志物的存在或缺失，其可以通过添加特异性结合和标记的抗表面标志物抗体来确定。因此，在与各自的特异性结合和标记的抗表面标记物抗体温育后，例如在荧光标记物的情况下通过荧光的出现确定表面标记物的存在，而通过荧光的缺失确定表面标记物的缺失。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即群体包含的各抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示自基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术制备待根据本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。
“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N至C端，每条重链具有可变区(VH)，又称作可变重链结构域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有可变区(VL)，又称作可变轻链结构域或轻链可变域，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型(称作卡帕(κ)和拉姆达(λ))中的一种。
“核酸”或“核酸序列”(所述术语在该申请中可互换使用)指由各核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或在RNA中为u)组成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修饰。该多核苷酸分子可以是天然发生的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一个或多个天然发生的多核苷酸分子与一个或多个合成的多核苷酸分子的组合。该定义中也包括的是天然发生的多核苷酸分子，其中一个或多个核苷酸改变(例如通过诱变)、缺失或添加。核酸可以是分离的或整合在另一核酸中的，例如在表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列。
本领域技术人员熟知程序和方法来将例如多肽的氨基酸序列转变成编码该氨基酸序列的对应核酸序列。因而，核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列，同样在于由其编码的多肽的氨基酸序列。
术语“特异性结合”及其语法等同物表示，抗体以10-7M或更小的解离常数(Kd)结合其靶标，在一个实施方案中以10-8M-10-13M的解离常数结合其靶标，在其他实施方案中以10-9M-10-13M的解离常数结合其靶标。所述术语进一步用于表示，所述抗体不特异性结合存在的其他生物分子，即其以10-6M或更大的解离常数(Kd)结合其他生物分子，在一个实施方案中以10-6M-1M的解离常数结合其他生物分子。
“转染载体”是提供在宿主细胞中表达转染载体中所包含的编码核酸/结构基因所有所需元件的核酸(也表示为核酸分子)。转染载体包含原核质粒增殖单位，例如对于大肠杆菌而言依次包含原核复制起点和赋予对原核选择剂抗性的核酸，还包含在转染载体中的，赋予对真核选择剂抗性的一个或多个核酸和编码目的多肽的一个或多个核酸。优选的是每一种位于表达盒内的赋予对选择剂抗性的核酸和编码目的多肽的核酸，由此每一个表达盒包含启动子、编码核酸和转录终止子，包括多腺苷酸化信号。基因表达一般处于启动子控制下，并且此结构基因称为“有效连接”所述启动子。类似的，如果调节元件调节核心启动子的活性，那么调节元件与核心启动子有效连接。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,其中每个结构域包含4个保守的构架区(FR)和3个高变区(HVR)。(参见例如Kindt,T.J.,等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如，Portolano,S.,等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.,等,Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及整合到其已经引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“年轻动物”表示在出现性成熟以前的动物。例如，年轻仓鼠的年龄是小于6周，特别是小于4周。例如，年轻小鼠的年龄是小于8周，特别是小于5周。
免疫
在本文报道的方法中，可以使用/加工从例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔或人获得的B-细胞。
在一个实施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或balb/c-小鼠。
在一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(仓鼠属(Cricetulusmigratorius))、中国仓鼠(中国仓鼠(Cricetulus griseus))和叙利亚仓鼠(Mesocricetulus auratus)。在一个实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。
在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞。在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZW)兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia-突变品系的兔、basilea突变品系的兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除的兔，及其杂交育种的兔。在一个实施方案中，从免疫兔或针对具体抗原接种后的兔获得兔B-细胞。
在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞。在一个实施方案中，从非接种的健康人，或从针对具体抗原接种后的人，或从患有疾病的人，或从已经从疾病中存活的人获得人B-细胞。接种可以是向人或从具体疾病中存活者施用具体疫苗。
B-细胞的来源和分离
免疫实验动物或接种的人的血液提供了产生抗体的B-细胞的高度多样性。从中获得的B-细胞分泌抗体，其在CDR内几乎没有相同的或重叠的氨基酸序列，因此显示了高度多样性。
在一个实施方案中，从免疫后4天直至免疫后15天或直至最近的加强获得例如从实验动物的血液获得的实验动物的或人的B-细胞。
在一个实施方案中，从免疫或最近加强后4天直至至多9天后获得B-细胞。
该时间跨度允许本文报道的方法具有高度灵活性。在该时间跨度内，提供最精确抗体的B-细胞从脾迁移到血液中(参见例如Paus,D.,等,JEM 203(2006)1081–1091；Smith,K.G.S.,等,The EMBO J.16(1997)2996–3006；Wrammert,J.,等,Nature 453(2008)667-672)。
共培养前的选择步骤
可从外周血单核细胞(PBMC)中富集产生特异性结合抗原的抗体的B-细胞。因此，在本文报道的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)获得B-细胞或从外周血单核细胞(PBMC)富集B-细胞集合。
可以通过使用淘选方法分别减少或富集不产生结合目的抗原的抗体的细胞，或以同样方法分别减少或富集产生结合目的抗原的抗体的细胞。其中结合配偶体呈现为附着到表面并且如果进一步加工结合的细胞，那么在细胞群体中选择性富集与配偶体结合的细胞，或者如果进一步加工溶液中剩余的细胞，那么在细胞群体中减少与配偶体结合的细胞。
本文报道的方法在一个实施方案中包括选择步骤，其中基于细胞表面标志物和荧光激活的细胞分选/门控选择产生特异性抗体的B-细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B-细胞。为了从不同实验动物物种中选择B-细胞，可以使用不同的细胞表面标志物。
通过标记非靶标细胞群体和非特异性结合的淋巴细胞，可以选择性去除这些细胞。在此去除步骤中，一般可实现不完全的去除。虽然去除不是定量的，但是其为剩余细胞的后续荧光标记提供了优势，因为可减少或甚至最小化干扰细胞的数目。
可以使用不同的表面标志物标记不同的细胞群体，如CD3+-细胞(T-细胞)、CD19+-细胞(一般而言是B-细胞)、IgM+-细胞(成熟的天然B-细胞)、IgG+-细胞(成熟的B-细胞)、CD38+-细胞(例如成浆细胞)和IgG+CD38+-细胞(前浆细胞)。
用于选择成熟的IgG+-B-细胞，如记忆B-细胞、成浆细胞和浆细胞的免疫荧光标记可以用于本文报道的方法中。
为了选择或富集B-细胞，单个标记或双标记或三标记细胞。
需要进行标记，其导致标记约0.1％-2.5％的总细胞群体。
在一个实施方案中，通过标记在群体中0.1％-2.5％的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。在一个实施方案中，通过标记在群体中0.3％-1.5％的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。在一个实施方案中，通过标记在群体中0.5％-1％的B-细胞上存在的表面分子选择B-细胞。
单细胞放置
本文报道的方法在一个实施方案中包括将B-细胞群体的B-细胞放置为单细胞的步骤。
在一个实施方案中，通过荧光激活的细胞分选(FACS)放置为单细胞。
在一个实施方案中，特异性标记的B-细胞放置为单细胞。在一个实施方案中，标记是用荧光标记的抗体标记细胞表面标志物。
在一个实施方案中，本文报道的方法提供了单克隆抗体。
本文报道的所有方法的一个实施方案中，B-细胞是成熟的B-细胞并且成熟的B-细胞放置为单细胞。
用于从实验动物的血液获得的B-细胞的免疫荧光标记也可以用于标记从实验动物(如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的脾和其他免疫器官中获得的B-细胞。
多细胞放置
本文报道的方法在一个实施方案中包括放置B-细胞集合的步骤。在该B-细胞集合中，从外周血经历磁力亲和珠或FACS分离后，每孔中放置了全部的B-细胞。
在一个实施方案中，放置了约500个B-细胞。
在一个实施方案中，放置了约2,500个B-细胞。
在单个实验中，放置的B-细胞的总数例如对于人B-细胞而言可以增加至多90,000个B-细胞或更多。
共培养
本文报道了产生抗体的B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞(如CHO或BHK细胞)的共培养。
因此，在本文报道的所有方法的一个实施方案中，B-细胞集合或单个放置的B-细胞与表达CD40L的CHO细胞在存在IL-2和IL-21或饲养混合物的情况下共培养。
早已共培养约3、4、5、6、7、8、10、15或21天后，尤其3、4或5天后(约2,500个B-细胞的集合)，或尤其6、7或8天后(单个放置的B-细胞或约500个B-细胞的集合)，可以在上清液中获得充足的抗体分子。利用由此提供的抗体量，可以进行不同分析，以更详细地表征抗体，例如关于结合特异性。利用在筛选/选择过程中的该早期阶段中对抗体的改善表征，可以减少所需核酸分离物和必须进行的测序反应的数量。
本文报道的所有方法的一个实施方案是在存在饲养混合物的情况下产生抗体的B-细胞与表达CD40L的CHO细胞的共培养。
所述饲养混合物可以是天然的饲养混合物或合成的饲养混合物。
天然的饲养混合物是例如胸腺细胞上清液(TSN)。其含有适当的可溶因子，但该试剂是异质的，成分描述并不充分并且在动物之间不同。
合成的饲养混合物是所谓的“Zubler饲养混合物”。其由鼠类细胞因子的确定组合组成(2ng/ml IL-1β、50ng/ml IL-2、10ng/ml IL-10和2ng/ml TNFα)。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，饲养混合物是胸腺细胞培养上清液。在一个实施方案中，B-细胞不是人B-细胞。
在一个实施方案中，从各年轻动物胸腺的胸腺细胞培养中获得胸腺细胞培养上清液。与从成体动物血液中分离胸腺细胞相比，尤其适合使用年轻动物的胸腺。
在一个实施方案中，从人的血液中获得的人T-细胞培养中获得胸腺细胞培养上清液。
一般而言，本文报道的方法中的B-细胞与表达CD40L的CHO细胞的共培养步骤可以在许多额外步骤之前并也可以在这些步骤之后。
已经发现，表达兔CD40L的CHO细胞与IL-2和IL-21以及SAC的共培养可以用于激活早期(非成熟的或不成熟的)兔B-细胞。这些B-细胞不表达CD138。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，产生抗体的B-细胞与表达CD40L的CHO细胞的共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且CD40L是兔CD40L。在一个实施方案中，培养基基本上不含IL-4，即不向培养基中加入IL-4。在一个实施方案中，IL-2和IL-21与培养基一起在培养开始时被加入。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，产生抗体的兔B-细胞与表达兔CD40L的CHO细胞的共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下，由此培养基基本上不含IL-4，并且由此IL-2和IL-21与培养基一起在培养开始时被加入。
已经发现，使用包含B-细胞、表达CD40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21的共培养基系统导致B-细胞的改善增殖，即与不包含IL-2、IL-21和表达CD40L的哺乳动物细胞中的一种、两种或全部的系统相比，所述B-细胞更快速地分裂并且在更短的时间里在培养上清液中分别可以获得更高的细胞密度和抗体滴度。
还已经发现，对于兔B-细胞而言，包含表达兔CD40L的CHO细胞、人或鼠IL-2以及人或鼠IL-21的共培养系统尤其适合。
通过IgG产生表征共培养的细胞
对于共培养后分泌的IgG的(定性和定量)测定，一般可以使用本领域技术人员已知的所有方法，如ELISA。在本文报道的所有方法的一个实施方案中，使用EILSA。对于人IgG水平的测定，已经使用了流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)技术(可从BDBiosciences获得)。
根据表征结果，可以获得，即选择B-细胞克隆。
通过扩展和增殖表征共培养的细胞
对于细胞扩展的(定性和定量)测定，可以使用不同的读出系统(商品化的细胞活性测试“细胞滴度发光”(Promega)、CFSE稀释法、3HThymidin掺入或细胞培养图像)评估共培养的B-细胞的增殖或生存力。
mRNA的分离、克隆与测序
产生高抗体滴度的B-细胞克隆提供了一些量的允许使用简并PCR引物的编码(近亲)单克隆轻链和重链可变区的mRNA，并且避免了对高度特异性引物的需要。也减少了所需要的PCR循环数。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR使用轻链和重链可变域的简并PCR引物。
对于B-细胞，可以分离总mRNA并逆转录成cDNA。利用各引物可以扩增近亲VH和VL区的编码核酸。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，氨基酸序列来自扩增的可变域的编码核酸。通过定位EVQL/QVQL至VSS(VH区)和DIVM/DIQM至KLEIK(VL区)的氨基酸序列鉴定可变域的编码核酸的精确起点和终点。
本文报道
本文报道的是分泌抗体的B-细胞通过以下途径的共刺激：(i)使用照射的哺乳动物，例如CHO(中国仓鼠卵巢)或BHK(幼仓鼠肾)，例如兔起源的或人起源的CD40L转染的饲养细胞的CD40/CD40L(CD154)途径，和(ii)各细胞因子或包含例如人或小鼠白细胞介素2(IL-2)和21(IL-21)，和/或热杀死的福尔马林固定的葡萄球菌A菌株Cowan 1颗粒(SAC)的饲养混合物对培养基的补充。
本发明的方面和实施方案
如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情况下共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
具有在存在IL-2和IL-21的情况下兔B-细胞(单个放置的细胞或细胞集合)与表达(例如细胞表面呈递的)兔CD40L的哺乳动物细胞的共培养步骤时，提供了快速、有效且可重复的方法用于从兔B-细胞开始产生兔或人抗体。
在一个实施方案中，兔B-细胞是天然的兔B-细胞或非成熟的兔B-细胞。
在一个实施方案中，兔B-细胞是IgG+B-细胞。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2。
在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含IL-4。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
在一个实施方案中，所述兔CD40L具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
在一个实施方案中，在用抗原最后一次免疫或加强兔后4-9天后获得兔B-细胞。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个：
-从免疫的兔中获得B-细胞，和/或
-单个放置所述B-细胞，和/或
-共培养B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞，和/或
-从共培养的兔B-细胞中获得编码兔抗体的可变域的核酸，和/或
-将兔抗体的可变域人源化，和/或
-培养包含编码抗体的可变域的核酸的哺乳动物细胞并从细胞或培养基中回收抗体。
如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。
具有人B-细胞(单个放置的细胞或细胞集合)与表达(例如细胞表面呈递的)人CD40L的哺乳动物细胞的共培养步骤时，提供了有效且可重复的方法用于从人B-细胞开始产生人抗体。
在一个实施方案中，从人的血液中获得人B-细胞。
在一个实施方案中，兔B-细胞是IgG+B-细胞。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL-6。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。
在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，IL-6是人IL-6。
在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含IL-4。
在一个实施方案中，所述人CD40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
在一个实施方案中，在用抗原或疫苗免疫人后4-9天后获得B-细胞。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤中的一个或多个：
-从免疫的或接种的或患有疾病或从疾病中存活的人的血液中获得B-细胞，和/或
-单个放置所述B-细胞，和/或
-共培养B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞，和/或
-从共培养的人B-细胞中获得编码人抗体的可变域的核酸，和/或
-培养包含编码人抗体的可变域的核酸和任选地编码人抗体的
恒定区的核酸的哺乳动物细胞并从细胞或培养基中回收抗体。
本文报道的一个方面是IL-2和IL-21用于共培养B-细胞与饲养细胞的用途。
向B-细胞与饲养细胞的共培养中加入IL-2和IL-21提供了高度有效的B-细胞刺激和改善的生长特性，如改善的生长速率和/或抗体分泌。
在一个实施方案中，饲养细胞是表达CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
本文报道的一个方面是IL-2和/或IL-21用于共培养B-细胞与饲养细胞的用途。
向B-细胞与饲养细胞的共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL-6提供了高度有效的B-细胞刺激和改善的生长特性，如改善的生长速率和/或抗体分泌。
在一个实施方案中，饲养细胞是表达CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养B-细胞与饲养细胞以及IL-2和IL-21的步骤。
在一个实施方案中，饲养细胞是表达CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
如本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括共培养B-细胞与饲养细胞以及IL-2和/或IL-21和/或L-6的步骤。
在一个实施方案中，饲养细胞是表达CD40L的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
如本文报道的一个方面是包含表达兔CD40L的CHO细胞、IL-2以及IL-21的试剂盒。
如本文报道的一个方面是包含表达人CD40L的BHK细胞和IL-2或IL-21或IL-6或其组合的试剂盒。
本文报道的一个方面是用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的B-细胞的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或两者的情况下共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞。
如果分泌T-细胞抑制性化合物的B-细胞必须从单个或集合的B-细胞开始扩增，并且由于分泌的T-细胞抑制性化合物会降低或消除饲养细胞的作用而不能使用来自T-细胞(例如胸腺瘤细胞)的饲养细胞，则该共培养系统是有用的。
本文报道的表达CD40L的CHO细胞可以用于产生T-细胞特异性抗体。使用由T-细胞组成的或包含T-细胞抗原的饲养系统(如胸腺瘤细胞系EL4-B5)并不合适，因为B-细胞产生的T-细胞特异性抗体会干扰培养系统。对了T-细胞特异性抗体分泌(B-)细胞的培养，人造的T-细胞独立系统将是理想的，如本文报道的系统。
在一个实施方案中，抗原不是CD40L。
在一个实施方案中，T-细胞抑制性化合物是特异性结合T-细胞表面抗原的抗体。
在一个实施方案中，B-细胞是兔B-细胞并且饲养细胞是表达兔CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和IL-21。
在一个实施方案中，B-细胞是人B-细胞并且饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。
在一个实施方案中，向共培养中加入IL-2和/或IL-21和/或IL-6。
如本文报道的一个方面是用于培养分泌抗体的B-细胞的方法，其以以下顺序包括
i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第一次共培养，和
ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的随后第二次共培养。
在首先在存在促有丝分裂刺激剂，然后在存在抗体产生刺激剂的情况下的B-细胞连续培养时，B-细胞的共培养在扩增B-细胞的第一期和诱导抗体分泌的第二期是分开的。
在一个实施方案中，所述第一次和第二次共培养在相同的培养容器中进行。
在一个实施方案中，用于培养分泌抗体的B-细胞的方法包括共培养B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞，由此向培养中加入第一种促有丝分裂刺激剂，然后向所述培养中加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后至少一小时加入抗体产生刺激剂。在一个实施方案中，在向培养中加入促有丝分裂刺激剂后一至三天加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，所述促有丝分裂刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan 1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)、II型干扰素(例如IFNγ)、交联抗IgG抗体、交联抗CD20抗体和交联抗CD27抗体。
在一个实施方案中，所述抗体产生刺激剂选自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)、II型干扰素(例如IFNγ)、交联抗IgG抗体、交联抗CD20抗体和交联抗CD27抗体。在一个实施方案中，在第一次共培养开始时加入促有丝分裂刺激剂。
在一个实施方案中，在第一次共培养开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天加入所述促有丝分裂刺激剂。
在一个实施方案中，在加入促有丝分裂刺激剂后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天加入抗体产生刺激剂。
在一个实施方案中，共培养的每一次进行5-14天。
在一个实施方案中，培养5-21天的总时长。在一个实施方案中，培养6-14天的总时长。
在一个实施方案中，在第二次共培养开始前去除促有丝分裂刺激剂。在一个实施方案中，通过交换培养上清液和或用中性培养基洗涤细胞进行去除。
如本文报道的一个方面是用于产生特异性地结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a)共培养分泌抗体的单个放置的B-细胞或B-细胞集合与表达CD40L的哺乳动物细胞，
b)培养包含在一个或多个表达盒内含有编码步骤a)中共培养的B-细胞分泌的抗体可变区或其变体的核酸的细胞，
d)从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，共培养是在存在促有丝分裂刺激剂和/或抗体产生刺激剂的情况下。
在一个实施方案中，所述第一次和/或第二次共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2。
在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含IL-4。
在一个实施方案中包括共培养
i)在存在促有丝分裂刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的第一次共培养，和
ii)在存在抗体产生刺激剂的情况下B-细胞与表达CD40L的哺乳动物细胞的随后第二次共培养。
在一个实施方案中方法包括以下步骤
ab)分离编码特异性结合抗原的抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸并分离编码所述抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供分泌抗体的(成熟的)B-细胞群体，
b)用至少一种荧光染料染色B-细胞群体的细胞，
c)在单独的容器中放置B-细胞染色群体的单个细胞，
d)在存在表达CD40L的哺乳动物细胞以及IL-2和IL-21的情况下培养放置的各B-细胞，
e)测定在各B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g)在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域的编码核酸用于表达抗体，
h)在细胞中引入核酸，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
在一个实施方案中，从动物或人的血液中获得B-细胞。
在一个实施方案中，用1-3种，或2-3种荧光染料进行染色。
在一个实施方案中，所述容器是多孔板的孔。
在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，或BHK细胞，或NS0细胞，或Sp2/0细胞。
如本文报道的一个方法是表达兔CD40L的哺乳动物细胞、IL-2和IL-21在共培养分泌抗体的兔B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2。在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2。
在一个实施方案中，IL-21是人IL-21。在一个实施方案中，IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是鼠类IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，IL-2是鼠类IL-2并且IL-21是人IL-21。
在一个实施方案中，培养是在缺少IL-4的情况下。在一个实施方案中，培养基不含IL-4。
在一个实施方案中，所述兔CD40L具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
如本文报道的一个方面是表达人CD40L的哺乳动物细胞与IL-2和/或IL-21和/或IL-6一起在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是BHK细胞。
在一个实施方案中，所述人CD40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
如本文报道的一个方法是SAC在共培养分泌抗体的B-细胞中的用途。
在一个实施方案中，共培养是与表达CD40L的哺乳动物细胞和/或IL-2的共培养。
提供以下实施例、图和序列，以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中得以显示。应理解，可以在所示方法中进行修饰，但不背离本发明的精神。
附图说明
图1 2,500个纯化的兔B-细胞与5,000个γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞或EL4-B5细胞共培养7天后B-细胞的增殖。
图2在存在或缺失不同刺激物的情况下共培养6天后B-细胞与饲养细胞的共培养的显微图像：a)EL4-B5细胞与Zubler混合物，b)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21，c)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-2，d)wt-CHO细胞与人IL-21以及人IL-2，e)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21以及人IL-2，f)表达rbCD40L的CHO细胞与人IL-21以及人IL-2和SAC。
图3每孔750个分选的人IgG+记忆B-细胞与5,000个γ-照射的表达CD40L的BHK细胞以及所示饲养混合物共培养。显示了8天后分离的人记忆B-细胞的增殖。
图4未触及(untouched)的分离的人B-细胞的增殖。从PBMC分离后，每孔90,000个集合的人B-细胞与γ-照射的表达CD40L的BHK细胞以及所示饲养混合物共培养。显示了7天后的增殖(绝对细胞数量)。
图5显示通过FACS分析的作为增殖程度的CFSE稀释的点状图。显示了门控CD19+B-细胞(Y-轴)的CFSE染色(X-轴)。
图6温育3天后的B-细胞簇(在没有饲养细胞的情况下培养的)。单独(a)或在存在人IL-2(b)或IL-2和SAC(c)的情况下培养三天的人B-细的显微图像。
图7每孔500个分选的兔IgG+B-细胞与10,000个γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)；1:mu IL-2,2:hu IL-2,3:mu IL-21,4:hu IL-21,5:hu IL-2和hu IL-21,6:hu IL-2和mu IL-21,7:mu IL-2和hu IL-21,8:mu IL-2和mu IL-21；y-轴:rb IgG[μg/ml]。
图8图7的共培养的CTG生存力测定的结果。
图9每孔500个融化的分选兔IgG+B-细胞与10,000个γ-照射的CHO-K1细胞(低于检测极限)或10,000个γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)；1:mu IL-2,2:hu IL-2,3:muIL-21,4:hu IL-21,5:hu IL-2和hu IL-21,6:hu IL-2和mu IL-21,7:mu IL-2和hu IL-21,8:mu IL-2和mu IL-21；y-轴:rb IgG[μg/ml]。
图10图9的共培养的CTG生存力测定的结果。
图11每孔500个分选的兔IgG+B-细胞与10,000个γ-照射的CHO-K1细胞(右边的条；由于低于检测极限而不可见)或10,000个γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞(左边的条)以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)。
图12图11的共培养的CTG生存力测定的结果。
图13实施例14中低B-细胞密度(500个B-细胞)的B-细胞与饲养细胞的共培养的显微图像。
图14每孔2500个分选的兔IgG+B-细胞与10,000个γ-照射的CHO-K1细胞(右边的条)或10,000个γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞(左边的条)以及不同来源的IL-2和IL-21及其组合共培养。显示了7天后培养上清液的抗体滴度(中位数)。
序列描述
SEQ ID NO:01 兔CD40L的氨基酸序列
SEQ ID NO:02 人CD40L的氨基酸序列
SEQ ID NO:03 小鼠CD40L的氨基酸序列
实施例
材料和方法
重组DNA技术
使用如Sambrook,J.,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
DNA序列测定
通过在SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)上进行的双链测序测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
GCG’s(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)软件包版本10.2和Infomax’s Vector NTI Advance套件版本8.0用于序列创建、基因定位、分析、注释和阐明。
基因合成
通过Geneart GmbH(Regensburg,Germany)制备编码兔CD40L的期望基因区段的cDNA。所述基因区段的侧翼是单个的限制性核酸内切酶切割位点，以利于如下所述克隆表达构建体。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。
细胞因子
Zubler混合物：2ng/ml小鼠IL-1β、50ng/ml小鼠IL-2、10ng/ml小鼠IL-10和2ng/ml小鼠TNFα(终浓度)
测试用于建立确定的细胞因子混合物的细胞因子(如果没有另行说明，以终浓度给出)：
Figure BDA0001552989320000391
Figure BDA0001552989320000401
动物
野生型新西兰白兔用作血液来源。根据Institutional Animal Care and Use委员会指导方针和Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care(Germany,Europe)圈养并维持它们。
平板的包被
无菌链霉抗生物素包被的6孔板(细胞培养级)与PBS中浓度为0.5-1μg/ml的生物素化抗原在室温下温育1小时。用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠,pH 9.55)中的2μg/ml非生物素化的蛋白质抗原在4℃过夜包被无菌细胞培养6孔板。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
兔外周血单核细胞(PBMC)的分离
在用于进行分离兔PBMC的淋巴细胞哺乳动物(lympholytemammal)(CedarlaneLaboratories)或Ficoll Paque Plus(GE Healthcare,cat.#17-1440-03)上密度离心之前，用1xPBS将含EDTA的全血稀释两倍。用抗体染色之前洗涤PBMC两次。
EL4-B5培养基
RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,Germany)，其补充有10％FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素(PAA,Pasching,Austria)、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,Germany)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)
巨噬细胞/单核细胞的清除
无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。每个孔填充有最多4ml培养基和高达来自免疫的兔的6x106个外周血单核细胞，并且允许在培养箱中37℃下结合1小时。上清液中50％的细胞用于淘选步骤；剩余的50％的细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。
蛋白质抗原上B-细胞的富集
蛋白质抗原包被的6孔组织培养板用高达6x106个细胞/4ml培养基接种并允许在培养箱中37℃下结合1小时。在蛋白质抗原上的富集步骤之后，通过1xPBS小心地洗涤孔1-2次去除非粘附的细胞。通过胰蛋白酶在培养箱中37℃下10分钟，然后在培养基中洗涤两次来分离剩余的粘附细胞。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术(分选和分析)
用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,Germany)。
对于表面染色，细胞与PBS中最佳稀释的抗兔IgG FITC抗体在暗中4℃下滚动温育30分钟。离心后，通过抽吸去除上清液。PBMC用冰冷的PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，将PBMC在冰冷的PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前加入浓度为5μg/ml的碘化丙啶(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)，以分辨死亡细胞和活细胞。在其他实验中，通过FACS单个放置染色细胞。
配置有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences,USA)的Becton DickinsonFACSAria用于收集和分析数据。
增殖测定
a)Cell Titer Glo(CTG)生存力测定
根据制造商的说明书使用CTG生存力测定(Promega；#G7571)。
b)3H胸腺嘧啶核苷测定
温育6天后，加入3H胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/孔)并进一步温育16小时。用微孔板闪烁计数器(Wallac)测定细胞增殖过程中3H胸腺嘧啶核苷的掺入。
c)显微镜分析
对于显微图像的获得，使用与高分辨率相机(Leica DFC290HD)组合的来自Leica的相差显微镜(Leica DM IL)。
d)通过CFSE标记分析B-细胞激活
用无菌磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤分离的B-细胞。将高达1x107个细胞重悬浮于1ml无蛋白质的PBS中并与终浓度为2.5μM的CFSE(#C34554,Invitrogen/MolecularProbes)在37℃下温育3-10分钟。通过加入过量的补充FCS的培养基终止CFSE装载。用含FCS的培养基充分洗涤后，B-细胞用于共培养实验中。在所指示的时间点后，通过流式细胞术分析(FL-1通道)验证因CFSE稀释的CD19+门控(B-)细胞增殖。
B-细胞培养
通过类似于Zubler，R.H.等(参见例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-363；J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)所述的方法制备B-细胞培养。简言之，在培养箱中具有210μ1/孔EL4Β5培养基和Pansorbin细胞(1:20000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5％兔胸腺细胞上清液和γ-照射的EL4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×104/孔)的96孔板中，在5％CO2的气氛中37℃下培养单个分选的B-细胞7天。为了筛选去除B-细胞培养上清液，并立即收获细胞用于可变区基因回收或在100μl RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,Germany)中冰冻于-80℃。
相应地培养人B-细胞。表达人CD40L的饲养细胞(BHK细胞)和指示的饲养混合物用于共培养。
实施例1
全长兔CD40L的表达质粒的产生
从GenBank,检索号XP_002720374(SEQ ID NO:01)获取兔CD40L基因的氨基酸序列。
兔CD40L CDNA序列XP_002720374–SEQ ID NO:01
Figure BDA0001552989320000431
氨基酸序列回翻译(back-translated)成编码核酸序列(DNA)。
质粒7111号
将编码合成的兔CD40L cDNA的基因区段克隆到cDNA表达载体中。在该表达载体中，其表达受来自以下的截短的缺失内含子A的立即早期增强子和启动子的控制：包括人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(UTR)的人巨细胞病毒(HCMV)，其中包括具有剪接供体和受体位点的内含子A，具有其信号锚定序列和来自牛生长激素的强多腺苷酸化信号的全长兔CD40L基因。表达质粒也含有来自载体pUC18的复制原点和β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行质粒扩增。
质粒7112号
以与质粒7111号相同的方式构建质粒7112号，但是其含有额外的潮霉素抗性基因用于稳定转染的哺乳动物细胞系的产生/选择。
实施例2
表达兔CD40L的CHO-K1细胞的产生
根据制造商的说明书，用兔CD40L编码质粒(#7112)转染CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞(例如使用脂质体转染法或具有Nucleofector程序U-17的Nucleofector试剂盒T(Lonzaformerly Amaxa,VCA-1002))。转染后，将细胞在6孔板中培养24小时，直至加入0.5mg/ml潮霉素，以建立选择压力。转染后2周，给培养基补充10％FCS(v/v)。5周的扩展和选择期后，使用交叉反应的多克隆山羊抗鼠CD40L一级抗体(R&D Systems；AF1163)和抗山羊IgG二级抗体(Alexa488-labeled；Molecular Probes；#A11055)在FACS Aria上分析转染的细胞。具有最高平均荧光强度(前5％)的细胞用于在U形底96孔板中进行单细胞分选。扩展额外的2周后，通过FACS分析克隆的兔CD40L表达。
同样，获得表达人CD40L的BHK细胞。
实施例3
照射饲养细胞用于共培养
在CHO rbCD40L培养基中的选择压力(0.5mg/ml潮霉素)下培养稳定表达兔CD40L的CHO克隆并储存于液氮中直至进一步的使用。
使用细胞作为分选的兔B-细胞的刺激剂之前传代两次，从培养基中去除潮霉素并在共培养前的一天，将培养基转换成兔B-细胞培养基。在50Gy的γ-照射前收集细胞并调整至1x106/ml的细胞浓度。在此之后，将1x104个细胞在每孔100μl的U形底96孔板中进行平板培养，在500xg下离心1分钟并在37℃下温育过夜。
实施例4
来源于兔外周血的分泌抗体的原代细胞(ASC)的分离程序
对于兔B-细胞的分离，使用非免疫的新西兰白兔的全血。
在一些方法中，第一步通过淋巴细胞分离密度离心(Biozol；#CL5120)或FicollPaque Plus(GE Healthcare,cat.#17-1440-03)分离淋巴细胞群体。在第二步中，兔淋巴细胞与FITC标记的抗兔IgG特异性抗体(终浓度＝10μg/ml；STAR121F；Serotec)温育。然后通过抗FITC微珠(#130-048-701；Miltenyi Biotec)纯化FITC+细胞(rbIgG+细胞)(集合放置)。
在其他方法(“单个细胞放置”)中，通过FACS技术选择FITC+细胞(参见材料和方法)。
实施例5
共培养系统的建立
在先前的实验中，刺激细胞与兔B-细胞主要以2：1的比例进行共培养。
如实施例4中所述，在通过使用FACS Aria利用刺激细胞制备的平板上分选单个兔B-细胞。对于单个B-细胞共培养，一个兔B-细胞放置在10,000个照射的饲养细胞的单层上。如果显示(If indicated)在100μlB-细胞培养基中加入饲养混合物(例如标准补充物为25ng/ml IL-21、50U/ml IL-2和1:10,000SAC)，共培养物在37℃和5％CO2中培养6天。
实施例6
通过IgG-特异的ELISA观察抗体产生
共培养后，转移150μl培养上清液用于后续的兔IgG测定。通过加入FCS和DMSO将扩展的兔B-细胞储存在96孔格中的液氮中。
任选地，温育长度延长到至多11-14天。因此，加入150μl新鲜制备的兔B-细胞培养基与饲养混合物以及SAC，并再次评估上清液中兔IgG的浓度。
实施例7
IgG+兔B-细胞的培养
单个分选的IgG+兔B-细胞与鼠类胸腺瘤细胞系EL4-B5以及兔胸腺细胞上清液(TSN)和SAC组合培养1周或在存在表达兔CD40L的CHO细胞系(10,000个细胞/孔；+/-额外的SAC)的情况下培养1周。用重组细胞因子IL-2和IL-21替换TSN。
6天后，进行兔IgG特异的ELISA并测定(所有孔中的)兔IgG+孔的百分比(rbIgG生产力的测定)。
结果：
当使用包含表达兔CD40L的CHO细胞与IL-2和IL-21的混合物的共培养系统时，兔IgG+孔的百分比更高(7.1％相对于6.7％(利用EL4-B5细胞时))。如果也向表达兔CD40L的CHO细胞中加入SAC，那么差异会加大(17.9％相对于6.7％)。如下表中所示，通过使用来自针对不同抗原的不同免疫活动的兔B-细胞获得类似结果。
表：包含不同饲养混合物的B-细胞共培养。显示了IgG+孔的百分比。
Figure BDA0001552989320000461
Figure BDA0001552989320000462
Figure BDA0001552989320000471
Figure BDA0001552989320000472
在IgG+CD138+双阳性分选的B-细胞的共培养中，添加细胞因子和SAC的rbCD40L系统不产生产生IgG的B-细胞克隆。与EL4-B5细胞(包括TSN和SAC)的共培养导致B-细胞克隆和IgG产生，如在下表中所示(22.2％相对于没有观察到显著的增殖相对于6.0％)。
表：IgG+CD138+分选的B-细胞的共培养。
Figure BDA0001552989320000473
(*没有观察到显著增殖)
实施例8
合成的兔B-细胞培养系统
2500个兔IgG+B-细胞/孔与照射的表达兔CD40L的CHO细胞或EL4-B5细胞(每次5,000个)在不添加TSN的情况下共培养。除了没有任何补充物的共培养外，测试了添加重组人IL-2相对于Zubler-Mix的影响。共培养7天后，使用早期所述的CTG测定法测定了B-细胞的增殖。包含rbCD40L细胞的共培养导致B-细胞增殖(参见下表和图1)。可以看出，补充IL-2相比于添加所谓的Zubler-Mix导致改善的增殖。
表：在存在不同饲养组分(培养基、SAC、γ-照射的EL4-B5或表达rbCD40L的细胞) 和额外细胞因子的情况下兔B-细胞的增殖。
Figure BDA0001552989320000481
以1:10的比例培养每孔500个兔B-细胞和所示的饲养细胞和刺激物(参见下表)。培养7天后，兔B-细胞与表达rbCD40L的CHO细胞的共培养物与没有CD40L表达的细胞相比，观察到其改善了细胞生长(通过CTG测定法测定)。
表：B-细胞增殖[RLU/CTG测定法]。用所示的细胞系统和额外的重组细胞因子/混 合物共培养500个B-细胞/孔7天。
Figure BDA0001552989320000491
在存在表达rbCD40L的饲养细胞的情况下检测增殖效果。原则上，添加重组IL-2和IL-21增加细胞生长。在这些条件下，添加SAC没有显示改善。相反，在其他条件下，添加SAC轻微改善了增殖。相反，IL-2、IL-21或其组合均不能导致包含EL4-B5的共培养物的改善。示例性孔示于图2中，其中在与rbCD40L细胞(和所示细胞因子/混合物)的共培养中获得最高增殖和细胞密度。在相同的实验中，相同的共培养系统在7天后也导致改善的兔IgG产生。表达rbCD40L的细胞和添加IL-21或IL-2/IL-21的组合均具有作用(参见下表)。
表：7天后500个B-细胞/孔的IgG产生[ng/ml]:IL-2和IL-21
Figure BDA0001552989320000492
Figure BDA0001552989320000501
在两次单独的实验中，单个分选的兔B-细胞和兔B-细胞集合与EL4-B5细胞或表达rbCD40L的细胞在存在多种组合的TSN和SAC与IL-2/IL-6/IL-21的情况下进行共培养。在下表中，显示了结果(计数了可检测到兔IgG产生的孔的数量)。表达rbCD40L的饲养细胞与TSN和SAC的组合不能导致与EL4-B5系统相当的IgG产生。另一方面，在兔B-细胞和表达rbCD40L的细胞与所示细胞因子如(hu)IL-2和IL-21的组合的共培养产生了显著更多的IgG(由IgG+孔的百分比或数量显示)。利用单独添加SAC和rbCD40L刺激细胞没有检测到IgG+孔。SAC增加了IL-2/21补充的rbCD40L饲养系统的IgG应答(参见下表)。
表：单个分选的B-细胞的兔IgG产生(rbIgG+孔(左边柱)的百分比或IgG+孔(右边 柱)的绝对数量)。
Figure BDA0001552989320000511
表：放置的B-细胞集合的兔IgG产生(IgG+孔的数量或百分比)。
Figure BDA0001552989320000521
实施例9
用于产生T细胞抑制抗体的系统
利用T细胞特异的抗原免疫后，产生了抗体集合，其不仅结合给定的抗原，也显示潜在的激动作用。如果培养系统基于T-细胞(像胸腺瘤细胞系EL4-B5)，那么所获得的抗体负面干扰T-细胞生物学并还干扰饲养系统。
单个分选的B-细胞，例如兔B-细胞或人B-细胞与EL4-B5饲养细胞或表达CD40L的细胞共培养(参见例如实施例5)。因此，单个分选的B-细胞来自用T-细胞抗原免疫的动物。
单个分选的B-细胞与所示饲养混合物共培养。共培养约7天后，测定B-细胞克隆的数量并评估培养上清液的IgG含量(如材料和方法以及实施例6中所述)。
可以利用来自抗原免疫后的人或野生型或转基因动物的(单个分选的或集合的)B-细胞进行共培养，例如已知具有T-细胞抑制性质的。
实施例10
连续B-细胞培养系统的产生
来自免疫的哺乳动物的单个分选的B-细胞与照射的表达CD40L的细胞共培养。在第一个培养期，加入不同的促有丝分裂因子(例如细胞因子)(参见下文列表)并在存在促有丝分裂因子的情况下持续1-14天。第一个培养期后，从培养基中(通过将培养基变成无促有丝分裂因子的培养基和/或洗涤细胞或通过透析或离心/沉降)去除促有丝分裂因子并在存在抗体产生刺激剂的情况下继续培养(参见下文列表)。在共培养3或5或7或21天后的第二个培养期中测试培养上清液中的IgG浓度。
促有丝分裂刺激剂可以选自下述列表：CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-14、白细胞介素-21、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)，和II型干扰素(例如IFNγ)、交联的抗IgG抗体，交联的抗CD20抗体和交联的抗CD27抗体。
抗体产生刺激剂可以选自下述列表：CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白细胞介素-1(α/β)、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-21、白细胞介素-33、SAP(信号传递淋巴细胞激活分子[SLAM]相关蛋白质)、葡萄球菌A菌株Cowan 1颗粒(SAC；热杀死的、福尔马林固定的)、TLR配体如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)α、I型干扰素(例如IFNα/β)，和II型干扰素(例如IFNγ)、交联的抗IgG抗体，交联的抗CD20抗体和交联的抗CD27抗体。
实施例11
用于产生人抗体的共培养系统
如上文实施例中所述测试了在存在表达人CD40L的BHK细胞的情况下不同细胞因子在促进人B-细胞生长中的作用。
将Ficoll分离的人PBMC(2x105个)接种在96孔板中并在存在所示刺激物的情况下培养8天。任选地，加入CD3/CD28抗体，以诱导多克隆T-细胞刺激。如从下表中可见，重组人IL-21诱导最高的人IgG产生(不依赖于额外的T-细胞激活)。
表：8天后人IgG的产生
人PBMC加… w/o[μg/ml] CD3/CD28[μg/ml]
培养基 0.22 0.09
LPS 0.00 0.00
TNFα 0.11 0.00
huIL-6 0.16 0.02
huIL-21 4.31 0.00
分离的人外周IgG+B-细胞(分别为750个/孔和2,500个/孔)与γ-照射的表达人CD40L的BHK细胞在存在不同刺激物的情况下共培养(参见下表和图3)。
表.8天后人外周B-细胞的相对增殖[％]
Figure BDA0001552989320000551
可以看出，分离的IgG+记忆B-细胞(利用MACS试剂盒#130-094-350分离)以及IgG+B-细胞(直接通过抗IgG-微珠(MACS试剂盒#130-047-501)分离)对不同的刺激物响应类似。仅添加IL-21(或组合)导致共培养8天后改善的增殖响应。利用IL-2、IL-6或其组合的共刺激不增强作用，添加SAC也不增强。
测试上清液中IgG产生。从下表中可以看出，在与表达huCD40L的BHK细胞的共培养中，添加IL-21及其组合导致改善的IgG产生。
表：8天后人IgG的产生。
Figure BDA0001552989320000561
Figure BDA0001552989320000562
也评估了未触及的分离的人B-细胞的增殖。使用Dynal Kit 113.13D(Invitrogen)从PBMC中分离B-细胞，计数并将90,000个CFSE-标记的B-细胞/孔与γ-照射的表达人CD40L的BHK细胞(CFSE-阴性)共培养。结果示于下表和图4中。
表：B-细胞增殖(通过CD19+细胞的FACS分析计数的绝对细胞数)。
Figure BDA0001552989320000571
通过仅添加IL-21或IL-2/IL-21或IL-21/IL-6/IL-21增加绝对细胞数量。
示例性点状图显示通过FACS分析的作为增殖程度的CFSE稀释(参见图5)：添加IL-21或IL-2和IL-2/-6的组合增加了B-细胞的增殖(所示为CD19+门控细胞)。
从激活的B-细胞、T-细胞、NK-细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、血小板、浆细胞和红细胞中清除(Dynal试剂盒,Invitrogen,#113.13D)的未触及的人未经处理的B-细胞与γ-照射的表达人CD40L的BHK细胞和多种额外刺激物用于共培养。在下表中显示了50,000个初始放置的B-细胞/孔的增殖。
表：与照射的huCD40L BHK细胞共培养7天后未经处理的B-细胞(50,000个/孔)的 增殖(通过FACS分析检测的增殖的B-细胞的数量)。
Figure BDA0001552989320000581
Figure BDA0001552989320000591
添加IL-21(单独或与IL-2和/或IL-6组合)导致改善的B-细胞生长。
实施例12
使用SAC的B-细胞培养系统
在测定增殖(CTG测定法)或人IgG产生(ELISA)之前存在所示补充物的情况下将分离的人B-细胞(使用阴性B-细胞分离试剂盒(#113.13D,Invitrogen)从未经处理的的人PBMC中分离的5x104细胞/孔)在96孔圆底平板中培养并温育6天。结果示于下表中。
表.
Figure BDA0001552989320000592
可以看出，SAC与IL-2的组合，和在较小程度上IL-2与IL-6的组合导致改善的B-细胞增殖和IgG产生。温育3天后的示例性B-细胞簇示于图6中。
使用纯化的外周兔B-细胞的集合，添加SAC导致增加的B-细胞增殖(参见下表)。
表：在存在不同饲养组分(培养基、SAC、γ-照射的EL4-B5或表达rbCD40L的细胞) 和额外细胞因子的情况下兔B-细胞的增殖。
Figure BDA0001552989320000601
表：B-细胞增殖[RLU/CTG测定法]，用所示细胞系统和额外的重组细胞因子/混合 物将500个B-细胞/孔共培养7天。
Figure BDA0001552989320000602
Figure BDA0001552989320000611
添加SAC也导致培养的B-细胞的IgG产生增加(IgG阳性孔的数量和/或IgG分泌)。
实施例13
兔B-细胞共培养
在不添加TSN的情况下，500个兔IgG+B-细胞/孔与γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞或γ-照射的CHO-K1细胞(每种10,000个)共培养。除了没有任何补充物的共培养外，测试了添加重组人IL-2、重组鼠类IL-2、重组人IL-21、重组鼠类IL-21及其组合的影响。共培养7天后，使用先前描述的ELISA测定B-细胞上清液中的抗体滴度。在存在IL-2和IL-21的情况下包含rbCD40L细胞的共培养导致B-细胞增殖和抗体分泌(参见图7和8)。
实施例14
兔B-细胞共培养
在不添加TSN的情况下，从冰冻的和融化的兔IgG+PBMC分离的每孔500个B-细胞与γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞或γ-照射的CHO-K1细胞(每种10,000个)共培养。除了没有任何补充物的共培养外，测试了添加重组人IL-2、重组鼠类IL-2、重组人IL-21、重组鼠类IL-21及其组合的影响。共培养7天后，使用先前描述的ELISA测定B-细胞上清液中的抗体滴度。在存在IL-2和IL-21的情况下包含rbCD40L细胞的共培养导致B-细胞增殖和抗体分泌(参见图9和10)。
实施例15
合成的兔B-细胞培养系统
低B-细胞密度：
在不添加TSN的情况下，500个兔IgG+B-细胞/孔(从NZW兔分离)与γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞或γ-照射的CHO-K1细胞(每种10,000个)共培养。除了没有任何补充物的共培养外，测试了添加重组人IL-2、重组鼠类IL-2、重组人IL-21、重组鼠类IL-21及其组合的影响。共培养7天后，使用先前描述的ELISA测定B-细胞上清液中的抗体滴度。在存在IL-2和IL-21的情况下包含rbCD40L细胞的共培养导致B-细胞增殖和抗体分泌(参见图11和12)。
高B-细胞密度：
在不添加TSN的情况下，2500个兔IgG+B-细胞/孔(如在先前低密度实验中从NZW兔分离)与γ-照射的表达兔CD40L的CHO细胞或γ-照射的CHO-K1细胞(每种10,000个)共培养。除了没有任何补充物的共培养外，测试了添加重组人IL-2、重组鼠类IL-2、重组人IL-21、重组鼠类IL-21及其组合的影响。共培养7天后，使用先前描述的ELISA测定B-细胞上清液中的抗体滴度。在存在IL-2和IL-21的情况下包含rbCD40L细胞的共培养导致B-细胞增殖和抗体分泌(参见图14)。
实施例16
合成的B-细胞培养系统的动力学分析
从如实施例4中所述的NZW兔全血的PBMC中磁力富集兔IgG+细胞。比例为1:20的每孔500个兔B-细胞与γ-照射的兔CD40L+CHO饲养细胞或对照γ-照射的CHO-K1饲养细胞(每种10,000个；如实施例1-3中所述产生)在缺少或存在IL-2、IL-21或IL-2和IL-21的组合(相同起源或不同起源，例如小鼠和人)的情况下进行培养。培养1、2、3、4、5、6和7(d1-d7)后，评估兔B-细胞与表达兔CD40L的CHO细胞的共培养物的上清液中的兔IgG产生和细胞生长。这些数据与无CD40L表达的饲养细胞和/或在缺少额外的外源刺激物(相同的单个白细胞介素或白细胞介素的组合)的情况下共培养的细胞进行比较。通过CTG测定法并通过显微镜分析测定生长和增殖动力学(参见上文)。
白细胞介素以下列最终浓度应用/使用：
-50U/ml的鼠类IL-2(Roche Diagnostics GmbH,cat#11271164001)
-50U/ml的人IL-2(Roche Diagnostics GmbH,cat.#11147528001)
-1倍-3倍ED50浓度范围内的人IL-21，所述浓度根据IL-21的批次(eBioscience,cat.#14-8219)在10-100ng/ml之间变化
-100ng/ml的鼠类IL-21(R&D Systems,cat.#594-ML)。
序列表
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<400> 1
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Thr Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Lys Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Pro Lys Lys Glu Ile Asn Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Leu Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Ser Ser Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Thr Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Lys Val Lys Arg Gln Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Gln Glu Pro Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Ser Gly Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Ala Arg Ser Ser Ser Lys Thr Cys Glu Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Asp Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Ala Ser Gln Val Asn His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 3
<211> 260
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 3
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
85 90 95
Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
100 105 110
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
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130 135 140
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145 150 155 160
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Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu
180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
195 200 205
Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu
210 215 220
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly
245 250 255
Leu Leu Lys Leu
260

Claims (13)

1.用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2和IL-21以及IL-6的情况下共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK或CHO细胞的步骤，其中IL-4不存在于所述培养中。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述B-细胞是非成熟的B-细胞。
3.权利要求1的方法，其特征在于所述人B-细胞是单个放置的B-细胞。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述人B-细胞是IgG阳性的B-细胞（IgG+ B-细胞）。
5.IL-2和IL-21和IL-6用于在IL-4不存在的情况下共培养人B-细胞与饲养细胞的用途，其中所述饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK或CHO细胞。
6.权利要求5的用途，其特征在于所述饲养细胞是表达人CD40L的BHK细胞。
7.用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21和IL-6且不存在IL-4的情况下共培养人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK或CHO细胞。
8.用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a）在存在IL-2和IL-21和IL-6且不存在IL-4的情况下共培养分泌抗体的人B-细胞的集合或单个分泌抗体的人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK或CHO细胞，
b）培养包含在一个或多个表达盒内含有编码步骤a）中共培养的人B-细胞分泌的抗体可变区或其变体的核酸的细胞，
c）从细胞或培养基中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
9.权利要求8的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a）提供分泌抗体的人B-细胞群体，
b）用至少一种荧光染料染色人B-细胞群体的细胞，
c）将B-细胞染色群体的单个细胞放置在单独的容器中，
d）在存在表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK或CHO细胞和IL-2和IL21和IL-6且不存在IL-4的情况下培养放置的各人B-细胞，
e）测定在各人B-细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f）通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列，并由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域的编码核酸，
g）在表达盒中引入单克隆抗体轻链和重链可变域编码核酸用于表达抗体，
h）在细胞中引入核酸，
i）培养细胞并从细胞或细胞培养上清液中回收抗体，并由此产生抗体，其特异性结合抗原。
10.权利要求9的方法，其特征在于，所述染色使用1-3种或2-3种荧光染料进行；将B-细胞染色群体的单个细胞分别放置在多孔平板的一个孔中。
11.权利要求9的方法，其特征在于，步骤(a)中的分泌抗体的人B-细胞群体为分泌抗体的成熟人B-细胞。
12.表达人CD40L的哺乳动物细胞BHK细胞、IL-2、IL-21和IL-6在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途，其中所述应用在不存在IL-4的情况下进行。
13.表达人CD40L的哺乳动物细胞CHO细胞、IL-2、IL-21和IL-6在共培养分泌抗体的人B-细胞中的用途，其中所述应用在不存在IL-4的情况下进行。
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