MXPA05013923A - Anticuerpos nk receptores de pan-kir2dl y su utilizacion en diagnostico y terapia. - Google Patents

Anticuerpos nk receptores de pan-kir2dl y su utilizacion en diagnostico y terapia.

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MXPA05013923A
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Abstract

La presente invencion se relaciona con composiciones novedosas y metodos para regular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Mas en particular, la invencion se relaciona con anticuerpos especificos que regulan la actividad de las celulas NK y permiten una potenciacion de la citotoxicidad de las celulas NK en sujetos mamiferos. La invencion tambien se relaciona con fragmentos y derivados de estos anticuerpos, asi como tambien con las composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos y sus usos, en particular en terapia, para aumentar la actividad o citotoxicidad de las celulas NK en sujetos.

Description

ANTICUERPOS NK RECEPTORES DE PAN-KIR2DL Y SU UTILIZACIÓN EN DIAGNÓSTICO Y TERAPIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y derivados de los mismos que tienen reacción cruzada con dos o más receptores inhibidores presentes en la superficie celular de la células NK y potencian la citotoxicidad de las células NK en sujetos mamíferos o en una muestra biológica. La invención también se relaciona con los métodos para producir estos anticuerpos, fragmentos, variantes y derivados; las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos; y el uso, de estas moléculas y composiciones, en particular en terapia, para aumentar la actividad o citotoxicidad de las células NK en sujetos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células citoliticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) son una sub-población de linfocitos, implicados en la inmunidad no convencional. Las células NK se pueden obtener mediante varias técnicas conocidas en este campo, tales como por ejemplo, a partir de muestras sanguíneas, citaféresis, recolecciones, etc. Las características y propiedades biológicas de las células NK incluyen la expresión de antigenos superficiales entre los que se incluyen CD16, CD56, y/o CD57; la ausencia del complejo alfa/beta o gamma/delta TCR sobre la superficie celular; la capacidad para unirse y exterminar las células que fracasan en la expresión de antigenos "auto" MHC/HLA mediante la activación de enzimas citoliticas especificas; la capacidad para exterminar células tumorales u otras células enfermas que expresen un receptor-ligando de activación de NK; la capacidad para liberar citoquinas que estimulan o inhiben la respuesta inmunitaria; y la capacidad para experimentar ciclos múltiples de división celular y producir células hijas con similares propiedades biológicas a las de la célula madre. Dentro del contexto de esta invención, las células NK "activas" designan células NK biológicamente activas, más particularmente células NK que tienen la capacidad de lisar células blanco. Por ejemplo, una célula NK "activa" es capaz de exterminar células que expresen un receptor-ligando activante NK y fracasan en expresar antigenos "auto" MHC/HLA (células KIR-inco patibles) . Con base en sus propiedades biológicas, se han propuesto diversas estrategias terapéuticas y de vacuna en la técnica que dependen de una modulación de las células NK. Sin embargo, la actividad de las células NK se regula por un mecanismo complejo que implica tanto la estimulación como las señales inhibidoras. Por consiguiente, una terapia suministrada por células NK eficaces puede requerir tanto una estimulación de estas células como una neutralización de las señales inhibidoras . Las células NK se regulan por receptores inhibidores clase I-especificos del complejo de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés) (Kárre et al, Loen et al, 1989) . Estos receptores específicos se unen a los determinantes polimórficos de las moléculas clase I de MHC o HLA presentes en otras células e inhiben la lisis de las células NK. En seres humanos, ciertos miembros de una familia de receptores denominados receptores similares a Ig exterminadores (KIR, por sus siglas en inglés) reconocen grupos de alelos clase I de HLA. Los KIR son una gran familia de receptores presentes en ciertos subconjuntos de linfocitos, entre los que se incluyen las células NK. La nomenclatura para los KIR se basa en el número de dominios intracelulares (KIR2D o KIR3D) y si la cola citoplásmica es ya sea larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS) . Dentro de los seres humanos, la presencia o ausencia de un KIR determinado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en cada individuo. Dentro de la población humana también existe un nivel relativamente alto de polimorfismo de las moléculas KIR, con ciertas moléculas KIR que estarán presentes en algunos, aunque no en todos los individuos. Ciertos productos genéticos KIR provocan la estimulación de la actividad de linfocitos cuando se unen a un ligando adecuado. La totalidad de los KIR estimuladores confirmados tienen una cola citoplásmica corta con un residuo transmembrana cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene un motivo inmunoestimulador (ITAM, por sus siglas en inglés) . Otros productos genéticos con KIR son inhibitorios por naturaleza. Todos los KIR inhibidores confirmados tienen una gran cola citoplásmica y parecen interactuar con diferentes subconjuntos de antigenos HLA que dependen del subtipo KIR. Los KIR inhibidores exhiben en su porción intracitoplásmica uno o varios motivos inhibidores que seleccionan fosfatasa. Los receptores KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias KIR2DL y KIR3DL. Los receptores KIR que tienen dos dominios Ig (KIR2D, por sus siglas en inglés) identifican los alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.2) o el producto genético estrechamente relacionado KIR2DL3 reconoce un epitope compartido por los alotipos (Cwl, 3, 7 y 8), de HLA-C del grupo 2, mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce un epitope compartido por los alotipos (Cw2, 4, 5 y 6) de HLA-C del grupo 1 reciproco. El reconocimiento por KIR2DL1 se establece por la presencia de un residuo Lys en la posición 80 de los alelos HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 se establece por la presencia de un residuo Asn en la posición 80. De manera importante, la gran mayoría de los alelos HLA-C tienen ya sea un residuo Asn o uno Lys en la posición 80. Un KIR con tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70) , reconoce un epitope compartido por los alelos HLA-Bw4. Por último, un homodimero de moléculas con tres dominios Ig KIR3DL2 (pl40) reconoce HLA-A3 y -All. Aunque los KIR inhibidores y otros receptores inhibidores de la clase-I (Moretta et al, 1997; Valiante et al, 1997a; Lanier, 1998) se pueden co-expresar por células NK, en cualquier repertorio NK de un individuo determinado existen células que expresan un KIR individual y de esta forma, las células NK correspondientes se bloquean únicamente por células que expresan un grupo de alelos clase I especifico. La población de células NK o clones que son KIR que no coinciden, es decir, la población de células NK que expresan KIR que no son compatibles con una de las moléculas HLA de un hospedero, han mostrado ser los medidores más probables del efecto anti-leucemia por injerto observado en trasplante alogeneico (Ruggeri et al., 2002). Una forma de reproducir este efecto en un individuo determinado podría ser utilizar reactivos que bloqueen la interacción KIR/HLA. Los anticuerpos monoclonales específicos para KIR2DL1 han mostrado que bloquean la interacción de los alelos KIR2DL1 con Cw4 (o lo semejante) (Moretta et al., 1993) . Los anticuerpos monoclonales contra KIR2DL2/3 también se ha descrito que bloquean la interacción de los alelos KIR2DL2/3 con HLAC 3 (o lo semejante) (Moretta et al., 1993). Sin embargo, el uso de estos reactivos en situaciones clínicas podria requerir el desarrollo de dos mAb terapéuticos para tratar a todos los pacientes, sin importar si cualquier paciente determinado está expresando los alelos HLA-C clase 1 o clase 2. Además, podria ser necesario pre-determinar cuál tipo de HLA estuvo expresando cada paciente antes de decidir cuál anticuerpo terapéutico utilizar, dando por resultado con esto en costo de tratamiento mucho mayor. Watzl et al., Tissue Antigens, 56, p. 240 (200) produjeron anticuerpos de reacción cruzada que reconocen múltiples isotipos de los KIR, aunque aquellos anticuerpos no exhiben potenciación de la actividad de las células NK. G. M. Spaggiara et al., Blood, 100, pp. 4098-4107 (2002) llevaron a cabo experimentos utilizando muchos anticuerpos monoclonales contra diversos KIR. Uno de estos anticuerpos, NKVSFl, se dice que reconoce un epitope común de CD158a (KIR2DL1) , CD158b (KIR2DL2) y p50.3 (KIR2DS4) . No se sugiere cuál NKVSFl puede potenciar la actividad de las células NK y no hay sugerencia de cuál se podria utilizar como un terapéutico. Por consiguiente, procedimientos prácticos y eficaces en la modulación de la actividad de células NK hasta la fecha no hablan estado disponibles en la técnica y todavía se requiere la intervención de HLA alelo-específico utilizando reactivos específicos HLA.
SUMARIO DE IA INVENCIÓN La presente invención actualmente proporciona anticuerpos, composiciones y métodos novedosos que superan las dificultades actuales en la activación de células NK y proporcionan • características y beneficios ventajosos adicionales. En un aspecto de ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo individual que facilita la activación de células NK humanas virtualmente en todos los seres humanos. Más particularmente, la invención proporciona anticuerpos específicos novedosos que tienen reacción cruzada con diversos grupos KIR inhibidores y neutraliza sus señales inhibidoras, dando por resultado en la potenciación de la citotoxicidad de células NK y células NK que expresan estos receptores KIR inhibidores.
Esta capacidad de reacción cruzada con múltiples productos genéticos KIR permite que los anticuerpos de la invención se utilicen eficazmente para aumentar la actividad de las células NK en la mayoría de los sujetos humanos, sin la preocupación o gasto de pre-determinar el tipo de HLA del sujeto. En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y derivados de cualquiera de los mismos, en donde el anticuerpo, fragmento, o derivado tiene reacción cruzada con al menos dos receptores KIR inhibidores en la superficie de células NK, neutraliza las señales inhibidoras de las células NK, y potencia la actividad de las células NK. De mayor preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común de receptores KIR2DL humanos. Incluso más específicamente, el anticuerpo de esta invención se une al menos a los receptores KIR2DL1, KIR2DL2, y KIR2DL3. Para los fines de esta invención, el término "KIR2DL2/3" se refiere a cualquiera o ambos de los receptores KIR2DL2 y KIR2DL3. Estos dos receptores tienen una homología muy alta, probablemente son formas alélicas del mismo gen, y se consideran en la técnica que son intercambiables. Por consiguiente, se considera que KIR2DL2/3 será una molécula KIR inhibidora para los fines de esta invención y por lo tanto un anticuerpo que tiene reacción cruzada únicamente con KIR2DL2 y KIR2DL3 y ninguno de los otros receptores KIR inhibidores está dentro del alcance de esta invención. El anticuerpo de esta invención inhibe específicamente la unión de las moléculas MHC o HLA al menos dos receptores KIR inhibidores y facilita la actividad de las células NK. Se hace referencia a ambas actividades mediante el término "neutralizar la actividad inhibidora de KIR", en el sentido en el que se utiliza en la presente. La capacidad de los anticuerpos de esta invención para "facilitar la actividad de las células NK", "facilitar la citotoxicidad de las células NK", "facilitar las células NK", "potenciar la actividad de las células NK", "potenciar la citotoxicidad de las células NK", o "potenciar las células NK" en el contexto de esta invención significa que el anticuerpo permite que las células NK expresen un receptor KIR inhibidor sobre su superficie que será capaz de lisar células que expresen sobre su superficie un ligando correspondiente para aquel receptor KIR inhibidor particular (por ejemplo, un antígeno HLA particular) . En un aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo que inhibe específicamente la unión de las moléculas HLAC a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL2/3. En otro aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo que facilita la actividad de las células NK in vivo.
Debido a que al menos uno de KIR2DL1 o KID2DL2/3 está presente en al menos aproximadamente 90% de la población humana, las modalidades más preferidas de esta invención son capaces de facilitar la actividad de las células NK contra la mayoría de las células alotipo-asociadas HLA-C, los alotipos HLA-C del grupo 1 y los alotipos HLA-C del grupo 2 respectivamente. De esta forma, las composiciones de esta invención se pueden utilizar para activar o potenciar eficazmente las células NK en la mayoría de los individuos humanos, típicamente en aproximadamente el 90% de los individuos humanos o más. Por consiguiente, una composición de anticuerpo individual de acuerdo con la invención se puede utilizar para tratar a la mayoría de sujetos humanos, y rara vez habrá la necesidad de determinar grupos alélicos o utilizar cócteles de anticuerpos. La invención demuestra, por primera vez, que se pueden generar anticuerpos de reacción cruzada y neutralizantes contra los KIR inhibidores, y que estos anticuerpos permiten la activación eficaz de las células NK en una amplia gama de grupos humanos . Un objetivo particular de esta invención de esta forma reside en un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente a receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3 e invierte la inhibición de la citotoxicidad de células NK suministrada por estos KIR. En una modalidad, el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. Opcionalmente, el anticuerpo que compite con el anticuerpo DF200 no es el anticuerpo DF200 mismo. En otra modalidad, el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal NKVSFl, opcionalmente en donde el anticuerpo que compite con el anticuerpo NKVSFl no es el anticuerpo NKVSFl. En otra modalidad, el anticuerpo compite con anticuerpo 1-7F9. De preferencia, los anticuerpos son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. El término "compite con", cuando hace referencia a un anticuerpo monoclonal particular (por ejemplo, DF200, NKVSFl, 1-7F9, EB6, GL183) significa que un anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal (por ejemplo, DF200, NKVSFl, 1-7F9, EB6, GL183) en un análisis de unión utilizando ya sea moléculas KIR recombinantes o moléculas KIR expresadas en la superficie. Por ejemplo, si un anticuerpo reduce la unión DF200 a una molécula KIR en un análisis de unión, el anticuerpo "compite" con DF200. Un anticuerpo que "compite con" DF200 puede competir con DF200 para la unión al receptor humano KIR2DL1, el receptor humano KIR2DL2/3, o los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo que se une a los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3, invierte la inhibición de la citotoxicidad de las células NK suministrada por estos KIR, y compite con DF200, 1-7F9 o NKVSFl para ia unión al receptor humano KIR2DL1, el receptor humano KIR2DL2/3, o los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3. Opcionalmente, el anticuerpo no es NKVSFl. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano o humanizado. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se une a los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3, invierte la inhibición de la citotoxicidad de las células NK suministradas por estos KIR, y compite con EB6 para la unión al receptor humano KIR2DL1, compite con GL183 para la unión al receptor humano KIR2DL2/3, o compite tanto con EB6 para la unión al receptor human KIR2DL1 como GL183 para la unión al receptor humano KIR2DL2/3. Opcionalmente, el anticuerpo no es NKVSFl; opcionalmente el anticuerpo no es DF200. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano o humanizado. En un aspecto ventajoso, la invención proporciona un anticuerpo que compite con DF200 y reconoce, se une, o tiene inmunoespecificidad para práctica o esencialmente el mismo, o los mismos, epítopes o "sitio epitópico" o una molécula KIR como el anticuerpo monoclonal DF200. De preferencia, la molécula KIR es un receptor humano KIR2DL1 o un receptor humano KIR2DL2/3. Un objetivo particular de esta invención reside en un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une a un determinante común presente en los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3 e invierte la inhibición de la citotoxicidad de las células NK suministrada por estos KIR. El anticuerpo más específicamente se une sustancialmente al mismo epítope sobre KIR como un anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 o el anticuerpo NKVSFl producido por el hibridoma NKVSFl, en donde el anticuerpo no es NKVSFl. En una modalidad preferida, el anticuerpo de esta invención es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo más preferido de esta invención es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. El hibridoma que produce el anticuerpo DF200 se ha depositado en la recolección de cultivos CNCM, como el No. de identificación "DF200", No. de registro CNCM I-3224, registrado el 10 de junio de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rué du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia. El anticuerpo NKVSFl está disponible de Serotec (Cergy Sainte-Christophe, Francia), No. de ref. de catálogo MCA2243. NKVSFl también se denomina como pan2D mAb en la presente. La invención también proporciona fragmentos funcionales y derivados de los anticuerpos descritos en la presente, que tienen especificidad y actividad sustancialmente similar al antígeno (por ejemplo, que pueden tener reacción cruzada con el anticuerpo precursor y que potencian la actividad citotóxica de las células NK que expresan los receptores KIR inhibidores) , entre los que se incluyen, sin limitación, un fragmento Fab, un fragmento Fab' 2, una inmunoadhesina, un diacuerpo, un CDR, y un ScFv. Además, los anticuerpos de esta invención pueden ser humanizados humanos o quiméricos. La invención también proporciona derivados de anticuerpos que comprenden un anticuerpo de la invención conjugado o unido covalentemente a una toxina, un radionúclido, una entidad detectable (por ejemplo, un átomo de flúor), o un soporte sólido. La invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo según se describió anteriormente, un fragmento del mismo, o un derivado de cualquiera de los mismos. Por consiguiente, la invención también se relaciona con el uso de un anticuerpo según se describe en la presente en un método para la elaboración de un medicamento. En modalidades preferidas, el medicamento o composición farmacéutica se destina al tratamiento de un cáncer u otro trastorno proliferativo, una infección o para utilizarse en trasplante. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo que se une al menos dos diferentes productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sobre las células NK que expresan al menos uno de los dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes, en donde el anticuerpo se incorpora en un liposoma. Opcionalmente, la composición comprende una sustancia adicional seleccionada de una molécula de ácido nucleico para el suministro de genes para terapia génica; una molécula de ácido nucleico para el suministro de ARN anti-sentido, ARNi o ARNsi para suprimir un gen en una célula NK; o una toxina o un fármaco para el exterminio dirigido de células NK incorporadas adicionalmente en el liposoma. La invención también proporciona los métodos para regular la actividad de las células NK humanas in vitro, ex vivo, o in vivo, que comprende poner en contacto las células NK humanas con una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención, un fragmento de este anticuerpo, un derivado de cualquiera de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende al menos uno de cualquiera de los mismos. Los métodos preferidos comprenden la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de esta invención y se dirigen al aumento de la actividad citotóxica de las células NK humanas, de mayor preferencia ex vivo o in vivo, en un sujeto que tenga un cáncer, una enfermedad infecciosa o una enfermedad inmunológica. En aspectos adicionales, la invención proporciona un hibridoma que comprende: (a) un linfocito B proveniente de un hospedero mamífero (típicamente un hospedero mamífero no humano) que se haya inmunizado con un antígeno que comprende un epítope presente en un polipéptido KIR inhibidores, fusionado a (b) una célula inmortalizada (por ejemplo, una célula de mieloma), en donde el hibridoma produce un anticuerpo monoclonal que se une al menos dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes y es capaz de neutralizar al menos sustancialmente la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan al menos dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes. Opcionalmente, el hibridoma no produce el anticuerpo monoclonal NKVSF 1. De preferencia, el anticuerpo se une a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL2/3. De preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común presente en KIR2DL1 y KIR2DL2/3. De preferencia, el hibridoma produce un anticuerpo que inhibe la unión de una molécula del alelo HLA-c que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de una molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos. De preferencia, el hibridoma produce un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 sobre ya sea KIR2DL1 o KIR2DL2/3 o tanto en KIR2DL1 como en KIR2DL2/3. Un ejemplo de este hibridoma es DF200. La invención también proporciona los métodos para producir un anticuerpo que tenga reacción cruzada con múltiples productos genéticos KIR2DL y que neutralice la actividad inhibidora de estos KIR, el método comprende los pasos de: (a) inmunizar un mamífero no humano con inmunógeno que comprende un polipéptido KIR2DL; (b) preparar los anticuerpos a partir de un mamífero inmunizado, en donde los anticuerpos se unen al polipéptido KIR2DL; (c) seleccionar los anticuerpos de (b) que tienen reacción cruzada con al menos dos productos genéticos KIR2DL diferentes; y (d) seleccionar los anticuerpos de (c) que potencian las células NK. En una modalidad, el mamífero no humano es un animal transgénico manipulado mediante ingeniería genética para que exprese un repertorio de anticuerpos humanos (por ejemplo, un mamífero no humano que comprende locus de inmunoglobulina humana y supresiones de los genes de inmunoglobulina naturales, tales como por ejemplo, un XenomouseMR (Abgenix-Fremont, CA, USA) o un mamífero no humano que comprende un minilocus de genes que codifican para Ig humano, tal como por ejemplo, el HuMab-mouseMR (Medarex-Princeton, NJ, USA) ) . Opcionalmente, el método comprende también seleccionar un anticuerpo que se una a una célula NK o polipéptido KIR de primate, de preferencia, un mono cynomolgus . Opcionalmente, la invención también comprende un método para evaluar un anticuerpo, en donde se administra un anticuerpo producido de acuerdo con el método anterior a un primate, de preferencia un mono cynomolgus, de preferencia en donde el mono se observa para la presencia o ausencia de una indicación de toxicidad del anticuerpo. Los inventores también proporcionan un método para producir un anticuerpo que se una al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sobre una población de células NK se expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR inhibidor; b) preparar anticuerpos provenientes de un animal inmunizado, en donde los anticuerpos se unen al polipéptido KIR; c) seleccionar los anticuerpos de (b) que tienen reacción cruzada con al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes; y seleccionar los anticuerpos de (c) que tengan la capacidad de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de loa citotoxicidad de las células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidores humano diferentes, en donde el orden de los pasos (c) y (d) se invierte opcionalmente y cualquier número de los pasos se repite opcionalmente 1 o más veces. De preferencia, el polipéptido KIR inhibidor utilizado para la inmunización es un polipéptido KIR2DL y los anticuerpos seleccionados en el paso (c) tienen reacción cruzada con al menos KIR2DL1 y KIR2DL2/3. De preferencia, el anticuerpo reconoce un determinante común presente en al menos dos productos genéticos del receptor KIR diferentes; de mayor preferencia, los KIR son KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Opcionalmente, el método comprende también seleccionar un anticuerpo que se una a un primate, de preferencia, un mono cynomolgus, una célula NK o un polipéptido KIR. Opcionalmente, la invención comprende además un método para evaluar un anticuerpo, en donde el anticuerpo producido de acuerdo con el método anterior se administra a un primate, de preferencia un mono cynomolgus, de preferencia en donde mono se observa para la presencia o ausencia de una indicación de toxicidad del anticuerpo. Opcionalmente, en los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo seleccionado en el paso c) o d) no es NKVSFl. De preferencia, el anticuerpo preparado en el paso (b) en los métodos anteriores es un anticuerpo monoclonal. De preferencia, el anticuerpo seleccionado en el paso (c) en los métodos anteriores inhibe la unión de una molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de una molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos.
De preferencia, los anticuerpos seleccionados en el paso (d) en los métodos anteriores provocan una potenciación en la citotoxicidad NK, por ejemplo cualquier potenciación sustancial, o al menos una potenciación del 5%, 10%, 20%, 30% o mayor en la citotoxicidad NK, por ejemplo, al menos aproximadamente una potenciación del 50% de la potenciación de la citotoxicidad de NK dirigida (por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% (tal como por ejemplo, aproximadamente el 65-100%) de la citotoxicidad de las células NK) . De preferencia, el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200 sobre KIR2DL1 y/o KIR2DL2/3. Opcionalmente, el método también comprende alternativamente el paso adicional de elaborar fragmentos de los anticuerpos monoclonales seleccionados, produciendo derivados de los anticuerpos monoclonales seleccionados (por ejemplo, mediante conjugación con un radionúclido, agente citotóxico, molécula reportera o lo semejante) , o elaborando derivados de los fragmentos de anticuerpo producidos provenientes o que comprendan las secuencias que corresponden a las secuencias de estos anticuerpos monoclonales.
La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo que se une a al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: (a) seleccionar, a partir de una biblioteca o repertorio, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo' que tenga reacción cruzada con al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidor humano diferentes, y (b) seleccionar un anticuerpo de (a) que sea capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK en una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidor humano diferentes. De preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común presente en KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Opcionalmente, el anticuerpo seleccionado en el paso (b) no es NKVSFl. De preferencia, el anticuerpo seleccionado en el paso (b) inhibe la unión de una molécula del alelo HLA-c que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de una molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos. De preferencia, el anticuerpo seleccionado en el paso (b) provoca una potenciación en la citotoxicidad NK, por ejemplo cualquier potenciación sustancial, o al menos una potenciación del 5%, 10%, 20%, 30% o mayor en la citotoxicidad NK, por ejemplo, al menos una potenciación de aproximadamente el 50% de la potenciación de citotoxicidad de NK dirigida (por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% (tal como por ejemplo, aproximadamente el 65-100%) de la citotoxicidad de las células NK) . De preferencia, el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200 sobre KIR2DL1 y/o KIR2DL2/3. Opcionalmente el método comprende el paso adicional de producir fragmentos de los anticuerpos monoclonales seleccionados, produciendo derivados de los anticuerpos monoclonales seleccionados, o produciendo derivados de los fragmentos del anticuerpo monoclonal seleccionado. Adicionalmente, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que se una al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) cultivar o un hibridoma de la invención bajo condiciones que permitan la producción del anticuerpo monoclonal; y b) separar el anticuerpo monoclonal del hibridoma. Opcionalmente, el método comprende el paso adicional de elaborar fragmentos del anticuerpo monoclonal, elaborando los derivados del anticuerpo monoclonal, o elaborando los derivados de estos fragmentos del anticuerpo monoclonal. De preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común presente en KIR2DL1 y KIR2DL2/3. También se proporciona por la presente invención un método para producir un anticuerpo que se una al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK en una población de células NK que expresa al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los lasos de: a) aislar a partir de un hibridoma de la invención un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal; b) modificar opcionalmente el ácido nucleico de tal forma que se obtenga un ácido nucleico que comprenda una secuencia que codifique para un anticuerpo modificado o derivado que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia funcional del anticuerpo monoclonal o es prácticamente similar al mismo (por ejemplo, es al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% (tal como por ejemplo, aproximadamente el 70-99%) idéntico a esta secuencia) seleccionado de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, .un anticuerpo de cadena individual, un fragmento inmunorreactivo de un anticuerpo, o una proteína de fusión que comprenden este fragmento inmunorreactivo; c) insertar el ácido nucleico o el ácido nucleico modificado (o el ácido nucleico relacionado que codifica para la misma secuencia de aminoácidos) en un vector de expresión, en donde el anticuerpo codificado o fragmento de anticuerpos es capaz de expresarse cuando el vector de expresión está presente en una célula hospedera desarrollada bajo condiciones adecuadas; d) transfectar una célula hospedera con el vector de expresión, en donde la célula hospedera de otra manera no produce la proteina inmunoglobulina; e) cultivar la célula hospedera transfectada bajo condiciones que provoquen la expresión del anticuerpo o fragmento del anticuerpo; y f) aislar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido por la célula hospedera transfectada. De preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común presente en KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Se apreciará que la invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK en células NK que expresan al menos uno de los dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes, el anticuerpo estará presente en una cantidad eficaz para potenciar perceptiblemente la citotoxicidad de las células NK en un paciente o en una muestra biológica que comprende células NK; y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. De preferencia, el anticuerpo se une a un determinante común presente en KIR2DL1 y KIR2DL2/3. La composición opcionalmente puede comprender además un segundo agente terapéutico seleccionada de, por ejemplo, un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un agente apoptótico, un segundo anticuerpo que se une e inhibe un receptor KIR inhibidor, un agente anti-infeccioso, un agente dirigido, o un compuesto complementario. Los agentes inmunomoduladores ventajosos se pueden seleccionar de IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, o IFN-gamma. Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, car inomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotero, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16) , 5-fluorouracilo (5FU) , citosina arabinosido, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptoteecina, actinomicina-D, mitomicina-C, cisplatina (CDDP, por sus siglas en inglés) , aminopterina, combretastatina (s) , otros vincaalquiloides y derivados o profármacos de los mismos. Los ejemplos de agentes hormonales incluyen leuprorelina, goserelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifeno, flutamida, nilutamida, ciproterona, bicalutamidanastrozol, exemestano, letrozol, fadrozolmedroxi, clormadinona, megestrol otros agonistas LHRH, otros anti-estrógenos, otros anti-andrógenos, otros inhibidores del aromatasa, y otro progestagenos . De preferencia, el segundo anticuerpo que se une o inhibe a un receptor KIR inhibidor es un anticuerpo o derivado o fragmento del mismo que se une a un epítope de un receptor KIR inhibidor que difiere del epítope unido por el anticuerpo que se une a un determinante común presente en al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes. La invención proporciona además un método para potenciar perceptiblemente la actividad de las células NK en un paciente que necesita del mismo, que comprende el paso de administrar al paciente una composición de acuerdo con la invención. Un paciente que necesita de la potenciación de la actividad de las células NK puede ser cualquier paciente que tenga una enfermedad o trastorno en donde la potenciación puede estimular, intensificar y/o inducir un efecto terapéutico (o estimula, intensifica y/o induce este efecto en al menos una proporción sustancial de pacientes con la enfermedad o trastorno y características sustancialmente similares para el paciente -como se puede determinar por ejemplo, mediante prueba clínica) . Un paciente que necesita de este tratamiento puede estar padeciendo, de, por ejemplo, cáncer, otro trastorno proliferativo, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmunitario. De preferencia, el método comprende el paso adicional de administrar al paciente un agente terapéutico adicional adecuado seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un agente apoptótico, un segundo anticuerpo que se une e inhibe a un receptor KIR inhibidor, un agente anti-infeccioso, un agente dirigido o un compuesto complementario, en donde el agente terapéutico adicional se administra al paciente como una forma de dosificación individual junto con el anticuerpo, o como una forma de dosificación por separado. La dosificación del anticuerpo (o fragmento/derivado del anticuerpo) y la dosificación del agente terapéutico adicional colectivamente son suficientes para inducir, estimular y/o intensificar perceptiblemente una respuesta terapéutica en el paciente que comprende la potenciación de la actividad de las células NK. Cuando se administra por separado, el anticuerpo, fragmento, o derivado y el agente terapéutico adicional se administran convenientemente bajo condiciones (por ejemplo, con respecto a la temporización, número de dosis, etc.) que de por resultado en un beneficio terapéutico combinado perceptible para el paciente.
Además mediante la presente invención se abarcan anticuerpos de la invención que sean capaces de unirse específicamente a un primate no humano, de preferencia un mono, células NK y/o receptores KIR de mono. También se abarcan los métodos para evaluar la toxicidad, especificación y/o actividad o eficacia de los anticuerpos de la invención que sean candidatos a medicamentos. En un aspecto, la invención abarca un método por determinar una dosificación de un anticuerpo que sea tóxica para un animal o tejido blanco al administrar un anticuerpo de la invención a un animal recipiente primate no humano que tenga células NK, y valorar cualesquiera efectos tóxicos o dañinos o adversos del agente sobre el animal, o de preferencia sobre un tejido blanco. En otro aspecto, la invención es un método para identificar un anticuerpo que sea tóxico para un animal o tejido blanco al administrar un anticuerpo de la invención a un animal recipiente primate no humano que tenga células NK, y valorar cualesquiera efectos tóxicos o dañinos o adversos del agente sobre el animal, o de preferencia sobre un tejido blanco. En otro aspecto, la invención es un método para identificar un anticuerpo que sea eficaz en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o tumor al administrar un anticuerpo de la invención a un modelo de primate no humano de infección, enfermedad o cáncer, e identificar el anticuerpo que mejore la infección, enfermedad o cáncer o un síntoma, del mismo. De preferencia, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo que (a) tenga reacción cruzada con al menos dos receptores KIR humanos inhibidores en la superficie de las células NK humanas, y (b) que tenga reacción cruzada con células NK o un receptor KIR del primate no humano. Además se abarca por la presente invención un método para detectar la presencia de células NK que porten un KIR inhibidor sobre su superficie celular en una muestra biológica o un organismo viviente, el método comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra biológica u organismo viviente con un anticuerpo de la invención, en donde el anticuerpo se conjuga o se une covalentemente a una entidad detectable; y b) detectar la presencia del anticuerpo en la muestra biológica u organismo viviente. La invención también proporciona un método de purificación a partir de células NK de muestra que portan un KIR inhibidor sobre su superficie celular que comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención bajo condiciones que permitan que las células NK porten un KIR inhibidor sobre su superficie celular para unirse al anticuerpo, en donde el anticuerpo se conjuga o se une covalentemente a un soporte sólido (por ejemplo, perla, una matriz, etc.); y b) eluir las células NK unidas a partir del anticuerpo conjugado o unido covalentemente a un soporte sólido. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o derivado de cualquiera de los mismos, que comprende la región variable ligera o una o más de las CDR de región variable ligera del anticuerpo DF200 o el anticuerpo Pan2D según se ilustra en la Figura 12. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o derivativo de cualquiera de los mismos que comprende una secuencia que es bastante similar a la totalidad o prácticamente toda la secuencia de región variable ligera de DF200 o Pan2D o una o más de las CDR de región variable ligera de uno o ambos de estos anticuerpos. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o derivativo de cualquiera de los mismos, que comprende la región variable pesada o una o más de las CDR de región variable ligera del anticuerpo DF200 según se ilustra en la Figura 13. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de cualquiera de los mismos que comprende una secuencia que es bastante similar a la totalidad o prácticamente toda la secuencia de región variable pesada de DF200. Estos aspectos y características adicionales de la invención se describirán adicionalmente en otra parte de la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa el anticuerpo monoclonal DF200 que se une a un determinante común de diversos receptores KIR2DL humanos. La Figura 2 representa el anticuerpo monoclonal DF200 que neutraliza la inhibición suministrada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK positivas KIR2DL1 sobre células blanco positivas C 4. La Figura 3 representa el anticuerpo monoclonal DF200, un fragmento Fab de los anticuerpos convencionales específicos DF200 y KIR2DL1 o KIR2DL2/3 que neutralizan la inhibición suministrada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK positivas KIR2DL1 sobre células blanco positivas Cw4 y la inhibición suministrada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK positivas KIR2DL2/3 sobre células blanco positivas C 3. La Figura 4 representa la reconstitución de la lisis celular mediante clones NK de células blanco positivas Cw4 de HLA en presencia de fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos DF200 y EB6. Las Figuras 5 y 6 representan los anticuerpos monoclonales DF200, NKVSFl (pan2D) , los anticuerpos humanos 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 y 1-6F1, y los anticuerpos convencionales específicos KIR2DL1 o KIR2DL2/3 que neutralizan la inhibición suministrada por KIR2DL de la citotoxicidad de células NK positivas KIR2DL1 sobre células blanco positivas Cw4 (células transfectadas C 4 en la Figura 5 y células EBV en la Figura 6) . La Figura 7 representa un mapa de epítopes que muestra los resultados de experimentos de unión competitiva obtenidos mediante análisis de resonancia con plasmón superficial (BIAcore®) con anticuerpos anti-KIR para KIR2DL1 donde los círculos sobrepuestos designan el traslape en la unión para KIR2DL1. Los resultados muestran que 1-7F9 es competitivo con EBß y 1-4F1, aunque no con NKVSFl y DF200, sobre KIR2DL1. El anticuerpo 1-4F1 a su vez es competitivo con EBß, DF200, NKVSFl y 1-7 F9. El anticuerpo NKVSFl compite con DF200, 1-4F1, y EB6, pero no 1-7F9, sobre KIR2DL1. DF200 compite con NKVSFl, 1-4F1, y EBß, pero no 1-7F9, sobre KIR2DL1.
La Figura 8 representa un mapa de epítopes que muestra los resultados de los experimentos de unión competitiva obtenidos mediante análisis BIAcore® con los anticuerpos anti-KIR para KIR2DL3 en donde los círculos sobrepuestos designan el traslape en la unión para KIR2DL3. Los resultados muestran que 1-4F1 es competitivo con NKVSFl, DF200, gll83, y 1-7F9 sobre KIR2DL3.1-7F9 es competitivo con DF200, gll83, y 1-4F1, pero no con NKVSFl, sobre KIR2DL3. NKVSFl compite con DF200, 1-4F1, y GL183, pero no 1-7F9, sobre KIR2DL3. DF200 compite con NKVSFl, 1-4F1 y 1-7F9, pero no con GL183, sobre KIR2DL3. La Figura 9 representa un mapa de epítopes que muestra los resultados de los experimentos de unión competitiva obtenidos mediante análisis BIAcore® con anticuerpos anti-KIR para KIR2DS1 donde los círculos sobrepuestos designan el traslape en la unión para KIR2DS1. Los resultados muestran que el anticuerpo 1-4F1 es competitivo con NKVSFl, DF200 y 1-7F9 sobre KIR2DS1. El anticuerpo 1-7F9 es competitivo con 1-4F1, pero no es competitivo con DF200 y NKVSFl sobre KIR2DS1. NKVSFl compite con 1-4F1 y DF200, pero no con 1-7F9, sobre KIR2DS1. DF200 compite con 1-4F1 y NKVSFl, pero no con 1-7F9, sobre KIR2DS 1. La Figura 10 representa la valoración mAb de NKVSFl (pan2D) que demuestra la unión del mAb a las células NK cynomolgus. Las células NK cynomolgus (volumen de NK en el día 16) se incubaron con diferente cantidad de mAb de Pan2D seguido por anticuerpos anti-ratón IgG (H+L) de fragmentos F(ab')2 de cabra conjugados con PE. El porcentaje de células positivas se determinó con un control isotípico (IgGl de ratón purificado) . Las muestras se produjeron por duplicado. Intensidad de fluorescencia mediana = MFI . La Figura 12 proporciona una alineación comparativa de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables ligeras y las CDR de región variable ligera de los anticuerpos DF200 y mAb de Pan2D. La Figura 13 proporciona la región variable pesada del anticuerpo DF200.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos novedosos o derivados de los mismos que se unen a determinantes comunes de receptores KIR inhibidores humanos, de preferencia un determinante presente en al menos dos productos genéticos KIR2DL diferentes, y provocan la potenciación de células NK que expresan al menos uno de aquellos receptores KIR. La invención expone, para primera vez, esta reacción cruzada y los anticuerpos neutralizantes se pueden producir, lo cual representa un resultado inesperado y abre un camino hacia terapias novedosas y eficaces con base en NK, en particular en sujetos humanos. En una modalidad preferida, el anticuerpo no es el anticuerpo monoclonal NKVSFl . Dentro del contexto de esta invención, un "determinante común" designa un determinante o epítope que se comparte por diversos productos genéticos de los receptores KIR inhibidores humanos. De preferencia, el determinante común se comparte por al menos dos miembros del grupo del receptor KIR2DL. De mayor preferencia, el determinante se comparte por al menos KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Ciertos anticuerpos de esta invención, además de reconocer múltiples productos genéticos de KIR2DL, también pueden reconocer los determinantes presentes sobre otros KIR inhibidores, tales como por ejemplo, el producto genético del grupo del receptor KIR3DL. El determinante o epítope puede representar un fragmento peptídico o un epítope conformacional compartido por los miembros. En una modalidad específica, el anticuerpo de esta invención se une específicamente a prácticamente el mismo epítope reconocido por el anticuerpo monoclonal DF200. Este determinante está presente tanto en KIR2DL1 como en KIR2DL2/3.
Dentro del contexto de esta invención, el término anticuerpo que "se une" a un determinante común designa un anticuerpo que se une al determinante con especificidad y/o afinidad. El término "anticuerpo" en el sentido en el se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales, así como también a fragmentos y derivados de los anticuerpos policlonales y monoclonales a menos que se establezca de otra manera o se contradiga claramente por contexto. Dependiendo del tipo de dominio constante en cadenas pesadas, los anticuerpos de longitud total típicamente se asignan a una de cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Varias de estas se dividen adicionalmente en subclases o isotipos, tales como por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, y lo semejante. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de inmunoglobulinas se denominan "alfa", "delta", "épsilon" "gamma" y "mu", respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas también se conocen. IgG y/o IgM son las clases preferidas de anticuerpos empleados en esta invención debido a que son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y debido a que se producen con mayor facilidad en un establecimiento de laboratorio. De preferencia, el anticuerpo de esta invención es un anticuerpo monoclonal. Debido a que una de las metas de la invención es bloquear la interacción de un KIR inhibidores y su ligando HLA correspondiente in vivo sin vaciar las células NK, típicamente se prefieren los isotipos que corresponden a los receptores Fe que suministran una baja función efectora, tal como por ejemplo, IgG4. Los anticuerpos de esta invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas conocidas en este campo. Típicamente, los mismos se producen mediante la inmunización de un animal no humano, de preferencia un ratón, con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR inhibidor, de preferencia un polipéptido KIR2DL, de mayor preferencia un polipéptido KIR2DL humano. El polipéptido KIR inhibidor puede comprender la secuencia de longitud total de un polipéptido KIR inhibidor humanos, o un fragmento o derivado del mismo, típicamente un fragmento inmunogénico, es decir, una porción del polipéptido que comprende un epítope expuesto sobre la superficie de la célula que expresa un receptor KIR inhibidor. Estos fragmentos típicamente contienen al menos aproximadamente 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia del polipéptido maduro, incluso de mayor preferencia al menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos de la misma.
Los fragmentos típicamente se derivan esencialmente del dominio extra-celular del receptor. Incluso de mayor preferencia el polipéptido es un KIR2DL humano que incluye al menos, uno, de mayor preferencia ambos, dominios Ig intracelulares, del polipéptido KIRDL de longitud total y es capaz de imitar al menos a un epítope conformacional presente en un receptor KIR2DL. En otras modalidades, el polipéptido comprende al menos 8 aminoácidos consecutivos de un dominio Ig intracelular de las posiciones 1-224 del aminoácido del polipéptido KIR2DL1 (numeración de aminoácidos de acuerdo con el sitio web PRO que describe la familia genética KIR, http: // ww.ncbi.nlm.nih. gov/prow/guide/1326018082.htm) . En una modalidad más preferida, el inmunógeno comprende un polipéptido KIR2DL humano tipo silvestre en una membrana de lípidos, típicamente en la superficie de una célula. En una modalidad específica, el inmunógeno comprende células NK intactas, en particular células NK humanas intactas, opcionalmente tratadas o usadas. El paso de inmunizar un mamífero no humano con un antígeno se puede llevar a cabo de cualquier forma conocida en la técnica para estimular la producción de anticuerpos en un ratón (véase, por ejemplo, E. Harlow and D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, NY (1988) ) .
El inmunógeno luego se suspende o disuelve en un amortiguador, opcionalmente con un adyuvante, tal como por ejemplo, adyuvante Freund completo. Los métodos para determinar la cantidad de inmunógeno, tipos de amortiguadores y cantidades de adyuvante se conocen por aquellos con experiencia en la técnica y no se limitan de ninguna forma a la presente invención. Estos parámetros pueden ser diferentes para diferentes inmunógenos, aunque se dilucidan fácilmente. De manera similar, la ubicación y frecuencia de inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos también es bien conocida en la técnica. En un protocolo de inmunización típico, los animales no humanos se inyectan intraperitonealmente con el antígeno en el día 1 y nuevamente aproximadamente una semana después. Esto está seguido por inyecciones de refuerzo del antígeno aproximadamente en el día 20, opcionalmente con un adyuvante tal como por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. Las inyecciones de refuerzo se realizan intravenosamente y se pueden repetir durante varios días consecutivos. Esto está seguido por una inyección de refuerzo en el día 40, ya sea intravenosa o intraperitonealmente, típicamente sin el adyuvante. Este protocolo da por resultado en la producción de linfocitos B productores de anticuerpos antigeno-específicos después de aproximadamente 40 días. También se pueden utilizar otros protocolos por tiempos mayores de tal forma que den por resultado en la producción de linfocitos B que expresen un anticuerpo dirigido al antígeno utilizado en la inmunización. Para la preparación del anticuerpo policlonal, el suero se obtiene de un animal no humano inmunizado y los anticuerpos presentes en el mismo se aislan mediante técnicas bien conocidas. El suero se puede purificar por afinidad utilizando cualquiera de los inmunógenos mostrados anteriormente unidos al soporte sólido para obtener anticuerpos que reaccionen con los receptores de KIR inhibidores. En una modalidad alternativa, los linfocitos provenientes de un mamífero no humano inmunizado se aislan, se desarrollan in vitro, y luego se exponen al inmunógeno en el cultivo celular. Los linfocitos luego se recolectan y se lleva a cabo el paso de fusión descrito más adelante. Para anticuerpos monoclonales, el siguiente paso es el aislamiento de esplenocitos provenientes de un mamífero no humano inmunizado y la posterior fusión de aquellos esplenocitos con una célula inmortalizada para formar un hibridoma productor de anticuerpos . El aislamiento de los esplenocitos provenientes de un mamífero no humano es bien conocido en la técnica e implica típicamente retirar el bazo de un mamífero no humano anestesiado, cortándolo en pequeñas porciones y extraer los esplenocitos de la cápsula esplénica y a través de una malla de nylon de un depurador celular en un amortiguador adecuado para producir una suspensión celular individual. Las células se lavan, se someten a centrifugación y se vuelven a suspender en un amortiguador que lise cualesquiera glóbulos rojos. La solución se centrifuga nuevamente y los linfocitos restantes en el sedimento se vuelven a suspender por último en amortiguador recién preparado. Una vez aislados y presentes en la suspensión celular individual, los linfocitos se pueden fusionar a una línea de células inmortales. Esta es típicamente un línea celular de mieloma de ratón, aunque se conocen en la técnica muchas otras líneas de células inmortales útiles para la creación de hibridomas . Las líneas de mieloma murino preferidas incluyen de manera enunciativa, aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A., X63 Ag8653 y las células SP-2 disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. La fusión se efectúa utilizando polietilenglicol o lo semejante. Los hibridomas resultantes luego se desarrollan en medio selectivo que contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma madres, sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma madre crecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT, por sus siglas en inglés) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento de las células HGPRT-deficientes . Los hibridomas típicamente se hacen crecer en una capa alimentadora de macrófagos . Los macrófagos de preferencia provienen de acoplamientos para cría del mamífero no humano utilizado para aislar esplenocitos y típicamente se seban con el adyuvante de Freund incompleto o los diversos días similares antes de la colocación en placas de los hibridomas. Los métodos de fusión se describen en Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", pp. 59-103 (Academia Press, 1986), la exposición del mismo se incorpora en la presente como referencia. Las células se dejan crecer en el medio de selección durante tiempo suficiente para la formación de colonias y la producción de anticuerpos. Esto usualmente se lleva a cabo entre aproximadamente 7 y 14 días. Las colonias de hibridomas luego se analizan para la producción de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con múltiples productos genéticos del receptor KIR inhibidores. El análisis típicamente es un análisis tipo ELISA colorimétrico, aunque se puede emplear cualquier análisis que se pueda adaptar a las cavidades en las que se desarrollan los hibridomas. Otros análisis incluyen inmunoprecipitación y radioinmunoanálisis . Las cavidades positivas para la producción de anticuerpos deseados se examinan para determinar si están presentes una o más colonias distintas. Si está presente más de una colonia, las células se pueden volver a clonar y desarrollar para asegurar que únicamente una célula individual ha dado origen a la producción de colonias del anticuerpo deseado. Las cavidades positivas con una colonia evidente individual se vuelven a clonar típicamente y se vuelven a analizar para asegurar que se está detectando y produciendo únicamente un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos también se pueden producir mediante la selección de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas, según se expone por ejemplo en Ward et al., Nature, 341 (1989) p. 544). Los anticuerpos de esta invención son capaces de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK; en particular la inhibición suministrada por los receptores KIR2DL y más particularmente al menos la inhibición tanto de KIR2DL1 como de KIR2DL2/3. Estos anticuerpos de esta forma son anticuerpos "neutralizantes" o "inhibidores", en el sentido en que los mismos bloqueen, al menos parcial y detectablemente, la trayectoria de señalización inhibidora suministrada por los receptores KIR cuando interactúan con las moléculas clase I de MHC. De manera más importante, esta actividad inhibidora se exhibe con respecto a diversos tipos de receptores KIR inhibidores, de preferencia diversos productos genéticos del receptor KIR2DL, y de mayor preferencia al menos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3 de tal forma que estos anticuerpos se puedan utilizar en diversos sujetos con alta eficacia. La disminución de la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK se puede valorar mediante diversos análisis o pruebas, tales como por ejemplo, análisis de unión o celulares. Una vez que se identifica un anticuerpo con reacción cruzada con múltiples receptores KIR inhibidores, este se puede probar por su capacidad para neutralizar el efecto inhibidor de aquellos receptores KIR en células NK intactas. En una variante específica, la actividad neutralizante se puede ilustrar por la capacidad del anticuerpo, para reconstituir la lisis mediante los clones NK KIR2DL-positivos de blancos HLA-C positivos. En otra modalidad específica, la actividad neutralizante del anticuerpo se define por la capacidad del anticuerpo para inhibir la unión de las moléculas HLA-C a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL3 (o el KIR2DL2 estrechamente relacionado) , de preferencia adicionalmente a media que esta es la capacidad del anticuerpo para alterar: la unión de una molécula HLA-C seleccionada de Cwl, Cw3, Cw7, y Cw8 (o de la molécula HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80) al KIR2DL2/3; y - la unión de una molécula HLA-C seleccionada de Cw2, Cw4, Cw5 y Cwß (o de una molécula HLA-C que tiene un residuo Lys en la posición 80) al KIR2DL1. En otra variante, la actividad inhibidora de un anticuerpo de esta invención se puede valorar en un análisis de citotoxicidad con base celular, según se expone en los Ejemplos proporcionados en la presente. En otra variante, la actividad inhibidora de un anticuerpo de esta invención se puede valorar en un análisis para liberación de citoquinas, en donde las células NK se incuban con el anticuerpo de prueba y una línea celular blanco que expresa un alelo HLA-C reconocido por una molécula KIR de la población NK, para estimular la producción de citoquinas de células NK (por ejemplo, la producción de IFN-? y/o GM-CSF) . En un protocolo de ejemplo, la producción IFN-? a partir de PBMC se valora mediante tinción de la superficie celular e intracitoplásmica y análisis mediante citometría de flujo después de aproximadamente 4 días en cultivo. En resumen, se puede agregar Brefeldin A (Sigma Aldrich) a una concentración final de aproximadamente 5 µg/ml durante al menos aproximadamente 4 horas de cultivo. Las células luego se pueden incubar con mAb anti-CD3 y anti-CD56 antes de la permeabilización (IntraPrepMR; Beckman Coulter) y teñir con PE-anti-IFN-? o PE-anti-IgGl (Pharmingen) . La producción de GM-CSF e IFN-? a partir de células NK policlonales activadas se puede medir en los sobrenadantes utilizando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R & D Systems, Minneapolis, MN; IFN-?: OptElA set, Pharmingen) . Los anticuerpos de esta invención pueden neutralizar parcial o completamente la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK. El término "neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa la capacidad de aumentar al menos en aproximadamente el 20%, de preferencia al menos en aproximadamente el 30%, al menos en aproximadamente el 40%, al menos en aproximadamente el 50% o más (por ejemplo, aproximadamente 25-100%) de la lisis específica obtenida en la misma proporción con células NK o líneas de células NK que no se bloqueen por su KIR, según se mide por una prueba para liberación de cromio clásica de citotoxicidad, en comparación con el nivel de lisis específica obtenida sin el anticuerpo cuando se coloca una población de células NK que expresa un KIR determinado en contacto con una célula blanco que expresa la molécula clase I de MHC cognada (reconocida por el KIR expresado sobre la célula NK) . Por ejemplo, los anticuerpos preferidos de esta invención son capaces de inducir la lisis de las poblaciones celulares blanco compatibles o antologas que coinciden o HLA es decir, las poblaciones celulares que no se podrían lisar eficazmente mediante las células NK en ausencia del anticuerpo. Por consiguiente, los anticuerpos de esta invención también se pueden definir como la facilitación de la actividad de las células NK in vivo . Alternativamente, el término "neutralizar la inhibición suministrada por KIR" significa que en un análisis con cromio utilizando un clon de célula NK o un transfectante que expresa uno o diversos KIR inhibidores y una célula blanco que expresa únicamente un alelo HLA que se reconoce por uno de los KIR sobre la célula NK, el nivel de citotoxicidad obtenido con el anticuerpo deberá ser al menos aproximadamente del 20%, de preferencia al menos aproximadamente del 30%, al menos aproximadamente del 40%, al menos aproximadamente del 50% (por ejemplo, aproximadamente del 25-100%) , o más de la citotoxicidad obtenida con una molécula clase I de anti-MHC bloqueante, tal como por ejemplo, el anticuerpo clase I anti-MHC W6/32. En una modalidad específica, el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200 (producido por el hibridoma DF200) . Estos anticuerpos se denominan en la presente como "anticuerpos similares a DF200". En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los "anticuerpos similares a DF200" más preferidos de esta invención son anticuerpos distintos al anticuerpos monoclonal NKVSFl. Se prefiere en mayor media el anticuerpo monoclonal DF200 (producido por el hibridoma DF200) . El término "se une sustancialmente al mismo epítope o determinante como" un anticuerpo de interés significa que un anticuerpo "compite" con el anticuerpo de interés. El término "se une sustancialmente al mismo epítope o determinante como" el anticuerpo monoclonal DF200 significa que un anticuerpo "compite" con DF200. En general, un anticuerpo que "se une sustancialmente al mismo epítope o determinante como" el anticuerpo monoclonal de interés (por ejemplo, DF200, NKVSFl, 17F9) significa que el anticuerpo "compite" con el anticuerpo de interés de cualquiera de una o más moléculas KIR, de preferencia una molécula KIR seleccionada del grupo que consiste de KIR2DL1 y KIR2DL2/3. En otros ejemplos, un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope o determinante sobre una molécula KIR2DL1 como el anticuerpo de interés "compite" con el anticuerpo de interés para la unión a KIR2DL1. Un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope o determinante sobre una molécula KIR2DL2/3 como el anticuerpo de interés "compite" con el anticuerpo de interés para la unión a KIR2DL2/3. El término "se une esencialmente el mismo epítope o. determinante como" un anticuerpo de interés significa que un anticuerpo "compite" con el anticuerpo de interés para cualesquiera y todas las moléculas KIR a las cuales el anticuerpo de interés se une específicamente. El término "se une esencialmente al mismo epítope o determinante como" el anticuerpo monoclonal DF200 significa que un anticuerpo "compite" con DF200 para cualesquiera y todas las moléculas KIR a la cuales DF200 se une específicamente. Por ejemplo, un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítope o determinante como los anticuerpos monoclonales DF200 o NKVSFl "compite" con DF200 o NKVSFl respectivamente para la unión a KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 y KIR2DS2. La identificación de uno o más anticuerpos que se unen sustancial o esencialmente al mismo epítope como los anticuerpos monoclonales descritos en la presente se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de una variedad de análisis de selección inmunológica en los cuales se puede valorar la competencia de anticuerpos. Varios de estos análisis se practican de manera rutinaria y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,660,827, otorgada el 26 de agosto de 1997 que se incorpora específicamente en la presente como referencia) . Se debe entender que la determinación real del epítope al cual un anticuerpo descrito en la presente se une no se requiere de ninguna forma para identificar un anticuerpo que se une al mismo o prácticamente el mismo epítope como el anticuerpo monoclonal descrito en la presente. Por ejemplo, donde los anticuerpos de prueba que serán examinados se obtienen a partir de diferentes fuentes animales, o incluso son de un isotipo Ig diferente, se puede emplear un análisis de competencia simple en el cual el control (DF200, por ejemplo) y los anticuerpos de prueba se combinan (o se pre-adsorben) y se aplican a una muestra que contiene tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3 cada uno se conoce para estar unido por DF200. Los protocolos con base en los ELISA, radioinmunoanálisis, transferencia Western, y el uso de análisis BIACORE (como se muestra, por ejemplo, en la sección de Ejemplos) son adecuados para utilizarse en estos estudios de competencia simple. En ciertas modalidades, se podría premezclar los anticuerpos control (DF200, por ejemplo) con cantidades variables de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, aproximadamente 1:10 o aproximadamente 1:100) durante un período de tiempo antes de la aplicación a la muestra del antígeno KIR inhibidor. En otras modalidades, el control y las cantidades variables de los anticuerpos de prueba simplemente se pueden combinar durante la exposición a la muestra del antígeno KIR. Siempre y cuando se pueda distinguir la unión de los anticuerpos libres (por ejemplo, al utilizar técnicas de separación o lavado para eliminar los anticuerpos disgregados) y DF200 de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, al utilizar anticuerpos secundarios especie-específicos o isotipo-específicos o al marcar específicamente DF200 con una marca detectable) podría dar la capacidad de determinar si los anticuerpos de prueba reducen la unión de DF200 a los dos antígenos KIR2DL diferentes, indicando que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente al mismo epítope como DF200. La unión de los anticuerpos control (marcados) en ausencia de un anticuerpo completamente relevante puede servir como el valor de alto control. El valor de bajo control se puede obtener al incubar los anticuerpos marcados (DF200) con anticuerpos sin marcar exactamente del mismo tipo (DF200) , donde la competencia se podría presentar y reducir la unión de los anticuerpos marcados. En un análisis de prueba, una reducción significativa en la reactividad de anticuerpos marcados en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativa de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epítope, es decir, uno que "tiene reacción cruzada" con el anticuerpo marcado (DF200) . Cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión de DF200 a cada uno de los antígenos KIR2DL1 y de KIR2DL2/3 en al menos aproximadamente el 50%, tal como por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, o de mayor preferencia al menos aproximadamente el 70% (por ejemplo, aproximadamente el 65-100%), a una proporción de DF200: anticuerpo de prueba entre aproximadamente 1:10 y 1:100 se considera para ser un anticuerpo que se une prácticamente al mismo epítope o determinante como DF200. De preferencia, este anticuerpo de prueba reducirá la unión de DF200 a cada uno de los antígenos KIR2DL en al menos aproximadamente el 90% (por ejemplo, aproximadamente el 95%) .
La competencia se puede valorar por ejemplo mediante una prueba de citometría de flujo. En esta prueba, las células que portan un KIR determinado se pueden incubar primer con DF200, por ejemplo, y luego con el anticuerpo de prueba marcado con un fluorocromo o biotina. Se dice que el anticuerpo se completa con DF200 si la unión obtenida en la preincubación con una cantidad saturada de DF200 es de aproximadamente el 80%, de preferencia de aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 40% o menos (por ejemplo, de aproximadamente el 30%) de la unión (según se mide por medio de fluorescencia) obtenida por el anticuerpo sin preincubación con DF200. Alternativamente, se dice que un anticuerpo se completa con DF200 si la unión obtenida con un DF200 marcado (mediante un fluorocromo o biotina) sobre células preincubadas con una cantidad saturada del anticuerpo de prueba es de aproximadamente el 80%, de preferencia aproximadamente el 50%, aproximadamente el 40%, o menos (por ejemplo, aproximadamente el 30%) de la unión obtenida sin preincubación con el anticuerpo. Un análisis de competencia simple en el cual un anticuerpo de prueba se pre-adsorbe y se aplica a una concentración saturada a una superficie sobre la cual se inmovilizan tanto K1R2DL1 como KIR2DL2/3 también se puede emplear ventajosamente. La superficie en el análisis de competencia simple de preferencia es una microplaqueta BIACORE (u otro medio adecuado para análisis de resonancia con plasmón superficial) . El anticuerpo control (por ejemplo, DF200) luego se pone en contacto con la superficie a una concentración saturada de KIR2DL1 y KIR2DL2/3 y la unión superficial de KIR2DL1 y KIR2DL2/3 del anticuerpo control se mide. Esta unión del anticuerpo control se compara con la unión del anticuerpo control para la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL2/3 en ausencia del anticuerpo de prueba. En un análisis de prueba, una reducción significativa en la unión de la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL2/3 por el anticuerpo control en presencia del anticuerpo de prueba indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epitope como el anticuerpo control de tal forma que el anticuerpo de prueba "tiene reacción cruzada" con el anticuerpo control. Cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión del anticuerpo control (tal como por ejemplo DF200) a cada uno de los antígenos KIR2DL1 y KIR2DL2/3 en al menos aproximadamente el 30% de mayor preferencia aproximadamente el 40% se puede considerar para ser un anticuerpo que se una sustancialmente al mismo epítope o determinante como un control (por ejemplo, DF200) . De preferencia, este anticuerpo de prueba reducirá la unión del anticuerpo control (por ejemplo, DF200) a cada uno de los antígenos KIR2DL en al menos aproximadamente el 50% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, o más) . Se apreciará que se puede invertir el orden de los anticuerpos control y de prueba: es decir, el anticuerpo control se puede unir primero a la superficie y el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la superficie después en un análisis de competencia. De preferencia, el anticuerpo que tiene mayor afinidad para los antígenos KIR2DL1 y KIR2DL2/3 se une primero a la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL2/3, a medida que se esperará que la disminución en la unión observada para el segundo anticuerpo (asumiendo que los anticuerpos tienen reacción cruzada) será de mayor magnitud. En los ejemplos y en, por ejemplo, Saunal and Regenmortel, (1995) J. Inmunol. Methods 183:33-41, se proporcionan ejemplos adicionales de estos análisis, la exposición del mismo se incorpora en la presente como referencia. Mientras que se describe en el contexto de DF200 para fines de ejemplificación, se apreciará que los análisis de selección inmunológica descritos anteriormente también se pueden utilizar para identificar anticuerpos que compitan con NKVSFl, 1-7F9, EB6, GL183, y otros anticuerpos de acuerdo con la invención. En el momento de la inmunización y producción de anticuerpos en un vertebrado o célula, se pueden realizar los pasos de selección particular para aislar los anticuerpos según se reivindica. Con respecto a esto, en una modalidad específica, la invención también se relaciona con los métodos para producir los anticuerpos, que comprenden: (a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR inhibidores; (b) preparar anticuerpos provenientes del animal inmunizado, en donde los anticuerpos se unen al polipéptido KIR; (c) seleccionar los anticuerpos de (b) que tienen reacción cruzada con al menos dos productos genéticos KIR inhibidores diferentes, y (d) seleccionar los anticuerpos de (c) que sean capaces de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes . La selección de un anticuerpo que tiene reacción cruzada con al menos dos productos genéticos de KIR inhibidor diferentes se puede alcanzar al seleccionar el anticuerpo contra dos o más antígenos KIR inhibidores diferentes, por ejemplo, según se describió anteriormente. En una modalidad más preferida, los anticuerpos preparados en el paso (b) son anticuerpos monoclonales. De esta forma, el término "preparar anticuerpos a partir de un animal inmunizado" en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye obtener linfocitos B provenientes de un animal inmunizado y utilizar aquellos linfocitos B para producir un hibridoma que exprese anticuerpos, así como también, obtener anticuerpos directamente del suero de un animal inmunizado. En otra modalidad preferida, los anticuerpos seleccionados en el paso (c) son aquellos que tienen reacción cruzada con al menos KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Todavía en otra modalidad preferida, los anticuerpos seleccionados en el paso (d) provocan que al menos aproximadamente el 10% de lisis específica suministrada por células NK exhiba al menos un KIR reconocido por el anticuerpo, y de preferencia al menos aproximadamente el 40% de lisis específica, al menos aproximadamente el 50% lisis específica, o de mayor preferencia al menos aproximadamente el 70% de lisis específica (por ejemplo, aproximadamente el 60-100% lisis específica) , según se mide en un análisis para liberación de cromio estándar, hacia una célula blanco que expresa la molécula clase I de HLA cognada, en comparación con la lisis o citotoxicidad obtenida en la misma proporción efectora/blanco con células NK que no se bloquean por su KIR. Alternativamente, los anticuerpos seleccionados en el paso (d) cuando se utilizan en un análisis de cromio que emplea un clon de célula NK que expresa uno o varios KIR inhibidores y una célula blanco que expresa únicamente un alelo HLA que se reconoce por uno de los KIR sobre el clon NK, el nivel de citotoxicidad obtenida con el anticuerpo debe ser de al menos aproximadamente el 20%, de preferencia al menos aproximadamente el 30%, o más de la citotoxicidad obtenida con un mAb clase I anti-MHC bloqueante tal como por ejemplo, el anticuerpo clase I anti-MHC de W6/32. Se puede cambiar el orden de los pasos (c) y (d) del método descrito recientemente. Opcionalmente, el método también puede comprender alternativamente los pasos adicionales de producir fragmentos del anticuerpo monoclonal o derivados del anticuerpo monoclonal de estos fragmentos, por ejemplo, según se describe en alguna parte en la presente. En una modalidad preferida, el animal no humano utilizado para producir los anticuerpos de acuerdo con los métodos aplicables de la invención es un mamífero, tal como por ejemplo, un roedor (por ejemplo, ratón, rata, etc.), bovino, porcino, caballo, conejo, cabra, oveja, etc. También, el mamífero no humano se puede modificar genéticamente o manipular mediante ingeniería genética para producir anticuerpos "humanos" tales como por ejemplo, el Xenomouse^ (Abgenix) o HuMAb-MouseMR (Medarex) . En otra variante, la invención proporciona un método para obtener un anticuerpo que comprende: (a) seleccionar, a partir de una biblioteca o repertorio, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de un anticuerpo monoclonal, o un derivado de cualquiera de los mismos que tenga reacción cruzada con al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidores humanos diferentes, y (b) seleccionar un anticuerpo, fragmento o derivado de (a) que sea capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidor humano diferentes . El repertorio puede ser cualquier (recombinante) de anticuerpos o fragmentos de los mismos, exhibidos opcionalmente por cualquier estructura adecuada (por ejemplo, fagos, bacterias, complejo sintético, etc.). La selección de anticuerpos inhibidores se puede realizar según se describió anteriormente y se ilustra adicionalmente en los ejemplos. De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un hibridoma que comprende un linfocito B proveniente de un hospedero no humano, en donde el linfocito B produce un anticuerpo que se une a un determinante presente en al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes y el anticuerpo es capaz de neutralizar la actividad inhibidora de los receptores. De mayor preferencia, el hibridoma de este aspecto de la invención no es un hibridoma que produzca el anticuerpo monoclonal NKVSFl. El hibridoma de acuerdo con este aspecto de la invención se puede crear según se describió anteriormente mediante la fusión de esplenocitos provenientes de un mamífero no humano inmunizado con una línea celular inmortal. Los hibridomas producidos mediante esta fusión se pueden seleccionar por la presencia de este anticuerpo de reacción cruzada según se describe en algún lugar en la presente. De preferencia, el hibridoma produce un anticuerpo que reconoce un determinante presente en al menos dos productos genéticos KIR2DL diferentes, y provoca la potenciación de las células NK que expresan al menos uno de aquellos receptores KIR. Incluso de mayor preferencia, el hibridoma produce un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope o determinante como DF200 y que potencia la actividad de las células NK. De mayor preferencia, este hibridoma es el hibridoma DF200 que produce el anticuerpo monoclonal DF200. Los hibridomas que se confirman para producir un anticuerpo monoclonal de esta invención se pueden agrupar en grandes cantidades en un medio adecuado, tal como por ejemplo, DMEM o RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascíticos en un animal. Después de un desarrollo suficiente para producir el anticuerpo monoclonal deseado, el medio de crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal (o el fluido ascítico) se separa de las células y se purifica el anticuerpo monoclonal presente en el mismo. La purificación típicamente se alcanza mediante electroforesis en gel, diálisis, cromatografía utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa, o un Ig anti-ratón unido a un soporte sólido tal como por ejemplo, perlas de azarosa o sefarosa (todos descritos, por ejemplo, en el Manual para Purificación de Anticuerpos, Amersham Biosciences, publicación No. 18-1037-46, Edición AC, la exposición del cual se incorpora en la presente como referencia) . El anticuerpo unido típicamente se eluye de las columnas de proteína A/proteína G utilizando amortiguadores con pH bajo (amortiguadores de glicina o acetato o pH 3.0 o menos) con la neutralización inmediata de las fracciones que contienen el anticuerpo. Estas fracciones se reúnen, dializan, y concentran según sea necesario. De acuerdo con una modalidad alternativa, el ADN que codifica para un anticuerpo que se une a un determinante presente en al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, se aisla del hibridoma de esta invención y se coloca en un vector de expresión adecuado para la transfección en un hospedero adecuado. El hospedero luego se utiliza para la producción recombinante del anticuerpo, o variantes del mismo, tal como por ejemplo, una versión humanizada de ese anticuerpo monoclonal, fragmentos activos del anticuerpo, o anticuerpos quiméricos que comprenden la porción de reconocimiento del antígeno del anticuerpo. De preferencia, el ADN utilizado en esta modalidad codifica para un anticuerpo que reconoce un determinante presente en al menos dos productos genéticos KIR2DL diferentes, y provoca la potenciación de las células NK que expresan al menos uno de aquellos receptores KIR. Incluso de mayor preferencia, el ADN que codifica para un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope o determinante como DF200 y que potencia la actividad de las células NK. De mayor preferencia, ese ADN codifica para el anticuerpo monoclonal DF200. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar soluciones de ensayo de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifiquen para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células hospederas tales como por ejemplo, células de E. coli, células COS de simio, células ováricas de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , o células de mieloma que de otra manera no produzcan la proteina inmunoglobulina para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. La expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica para el anticuerpo es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Skerra et al., Curr. Opnion in Inmunol., 5, pp. 256 (1993) ; y Pluckthun, Inmunol . Revs . , 130, el pp. 151 (1992) .
Fragmentos y derivados de un Anticuerpo monoclonal Los fragmentos y derivados de los anticuerpos de esta invención (que se abarca por el término "anticuerpo" o "anticuerpos", en el sentido en el que se utiliza en esta solicitud, a menos que se establezca o contraindique de otra manera por contexto) de preferencia un anticuerpo similar a DF-200, se puede producir mediante técnicas que son conocidas en este campo. Los "fragmentos inmunorreactivos" comprenden una porción del anticuerpo intacto, en general el sitio o región variable de unión con antígeno. Los ejemplos de fragmentos de los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2, y los fragmentos Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consiste en una secuencia sin interrumpir de residuos de aminoácido contiguos (denominado en la presente como un "fragmento de anticuerpo de cadena individual" o "polipéptido de cadena individual") , incluyendo sin limitación (1) las moléculas Fv(scFv) de cadena individual (2) los polipéptidos de cadena individual que contiene únicamente un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin una entidad de cadena pesada asociada y (3) los polipéptidos de cadena individual que contienen únicamente una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin una entidad de cadena ligera asociada; y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de los fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos Fab o F(ab')2 se pueden producir mediante la digestión de proteasas de los anticuerpos aislados, de acuerdo con técnicas convencionales. Se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos se pueden modificar utilizando métodos conocidos, por ejemplo, para disminuir la depuración in vivo y obtener un perfil farmacocinético más conveniente, el fragmento se puede modificar con polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) . Los métodos para acoplar un PEG de conjugación sitio-específicamente a un fragmento Fab' se describen en, por ejemplo, Cytokine 16 (3) : 106-119 (2001) y Delgado et al, Br. J. Cáncer 73 (2) : 175-182 (1996), las exposiciones de los mismos se incorporan en la presente como referencia. En un aspecto particular, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo que comprenden la secuencia de región variable de cadena ligera de DF-200 según se muestra en la Figura 12. En otro aspecto particular, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo que comprenden la secuencia de región variable de cadena ligera de Pan2D según se muestra en la Figura 12. En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de los mismos que comprenden una o más de las CDR de región variable ligera de DF-200 según se muestra en la Figura 12. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de los mismos que comprenden una o más de las CDR de región variable más ligera de Pan2D según se muestra en la Figura 12. Las variantes/análogos funcionales de estas secuencias se pueden generar al realizar las sustituciones, adiciones y/o supresiones adecuadas en estas secuencias de aminoácidos expuestas utilizando técnicas estándar, que se pueden auxiliar por la comparación de las secuencias. De esta forma, por ejemplo, los residuos CDR que se conservan entre Pan2D y DF-200 pueden ser blancos adecuados para la modificación ya que los residuos pueden no contribuir a los diferentes perfiles en competencia que estos anticuerpos tienen con respecto a otros anticuerpos expuestos en la presente (aunque Pan2D y DF-200 compitan) y de esta forma puede no contribuir a la especificidad de estos anticuerpos para sus epítopes respectivos particulares. En otro aspecto, las posiciones donde está presente un residuo en una secuencia de uno de estos anticuerpos, pero no en otro, pueden ser adecuadas para las supresiones, sustituciones y/o inserciones . En un aspecto particular, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo que comprenden la secuencia de región variable de cadena pesada de DF-200 según se muestra en la Figura 13. En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de los mismos que comprenden una o más de las CDR de región variable pesada de DF-200 según se muestra en la Figura 13. Las variantes/análogos funcionales de estas secuencias se pueden generar al realizar las sustituciones, adiciones y/o supresiones adecuadas en estas secuencias de aminoácidos expuestas utilizando técnicas estándar, que se pueden auxiliar por la comparación de la secuencia. En otro aspecto, las posiciones donde está presente un residuo en una secuencia de uno de estos anticuerpos, pero no en otro, pueden ser adecuadas para las supresiones, sustituciones, y/o inserciones. Alternativamente, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de esta invención, de preferencia, un anticuerpo similar a DF-200, se puede modificar para que codifique para un fragmento de esta invención. El ADN modificado luego se inserta en un vector de expresión y se utiliza para transforma o transfectar una célula adecuada, que luego se exprese el fragmento deseado. En una modalidad alternativa, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de esta invención, de preferencia un anticuerpo similar a DF-200, se puede modificar antes de la inserción en un vector de expresión, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias no humanas homologas (por ejemplo, Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81, el pp. 6851 (1984) ) , o mediante la unión covalente a la secuencia que codifica para inmunoglobulina todos o parte de la secuencia codificante para un polipéptido sin inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tengan la especificidad de unión del anticuerpo original. Típicamente, estos polipéptidos sin inmunoglobulina se sustituyen para los dominios constantes de un anticuerpo de la invención. De esta forma, de acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo de esta invención, de preferencia un anticuerpo similar a DF-200, se humaniza. Las formas "humanizadas" de los anticuerpos de acuerdo con esta invención son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como por ejemplo, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de unión con antígenos de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina urina. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región determinante complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) del recipiente se reemplazan por los residuos provenientes de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donador) mientras que mantenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas del anticuerpo original. En algunos casos, los residuos con estructura Fv de la inmunoglobulina humana se pueden reemplazar por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran an ya sea el anticuerpo receptor o en la CDR importada o secuencias de estructura. Estas modificaciones se realizan para retinar y optimizar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad o al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o prácticamente todas las regiones CDR de aquellas del anticuerpo original y todas o prácticamente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe, por sus siglas en inglés) , típicamente la ce una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales véase Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992) . Los métodos para humanizar los anticuerpos de esta invención son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo y a partir del anticuerpo original. Estos residuos de aminoácidos murinos u otros no humanos con frecuencia se denominan como residuos "de importación", que típicamente se extraen de un dominio variable "de importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321, el pp. 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)). Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly et al., patente de los Estados Unidos No. 4,816,567), en donde prácticamente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente a partir del anticuerpo original. En la práctica, los anticuerpos humanizados de acuerdo con esta invención típicamente son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos provenientes de sitios análogos en el anticuerpo original.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que serán utilizados para la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado "de adaptación óptima", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de esta invención se selecciona contra la biblioteca total de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que está más cercana a la del ratón luego se acepta como la trama humana (FR, por sus siglas en inglés) para el anticuerpo humanizado (Sims et al. , J. Inmunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. , Mol. Biol., 196, pp. 901 (1987)). Otro método utiliza una trama particular de la secuencia consensual de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma trama se puede utilizar diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Inmunol . , 51, pp. 1993)). Además es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para múltiples receptores KIR inhibidores y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias paternales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina comúnmente están disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los programas de computadora están disponibles e ilustran y exhiben las probables estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis para la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que influyen en capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias consensúales y de importación de tal forma que la característica deseada del anticuerpo, tal como por ejemplo, la afinidad aumentada para los antígenos blanco se alcance. En general, los residuos CDR están implicados de manera más directa y sustancial en la influencia de la unión con antígenos . Otro método para producir anticuerpos monoclonales humanizados" es utilizar un XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como el ratón utilizado para la inmunización. Un XenoMouse es un hospedero murino de acuerdo con esta invención que haya tenido sus genes de inmunoglobulina reemplazados por genes de inmunoglobulina humana funcional. De esta forma, los anticuerpos producidos por este ratón o en los hibridomas producidos a partir de los linfocitos B de este ratón, ya están humanizados. El XenoMouse se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,162,963 que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. Un método análogo se puede alcanzar utilizando un HuMAb-MouseMR (Medarex) . Los anticuerpos humanos también se pueden producir de acuerdo con otras diversas técnicas, tales como por ejemplo, al utilizar, para la inmunización, otros animales transgénicos que se hayan sometido a ingeniería genética para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), o mediante la selección de repertorios de anticuerpos utilizando métodos que exhiban fagos. Estas técnicas se conocen por el experto y se pueden implementar iniciando a partir de anticuerpos monoclonales según se expone en la presente solicitud. Los anticuerpos de la presente invención, de preferencia un anticuerpo similar a DF-200, también se pueden . derivar a anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) , en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa con las secuencias correspondientes en el anticuerpo original, mientras que el resto de las cadenas es idéntica u homologa con las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclases de anticuerpos, así como también los fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)). Otros derivados dentro del alcance de esta invención incluyen anticuerpos funcionalizados, es decir, anticuerpos que se conjugan o se unen covalentemente a una toxina, tal como por ejemplo, ricina, toxina de la difteria, abrina y Pseudomonas exotoxina; para una entidad detectable, tal como por ejemplo, una entidad fluorescente, un radioisótopo o un agente formador de imágenes; o para un soporte sólido, tal como por ejemplo, perlas de agarosa o lo semejante. Los métodos para conjugación o unión covalente de estos otros agentes a anticuerpos son bien conocidos en la técnica. La conjugación a una toxina es útil para el exterminio dirigido de células NK que exhiben uno de los receptores KIR de reacción cruzada sobre su superficie celular. Una vez que el anticuerpo de la invención se une a la superficie celular de estas células, éste se internaliza y la toxina se libera al interior de la célula, exterminando selectivamente esa célula. Esta utilización es una modalidad alternativa de la presente invención. La conjugación a una entidad detectable es útil cuando el anticuerpo de esta invención se utiliza para fines de diagnóstico. Estos fines incluyen de manera enunciativa; analizar las muestras biológicas para la presencia de células NK que portan el KIR de reacción cruzada sobre su superficie celular y detectar la presencia de células NK que portan el KIR de reacción cruzada en un organismo viviente. Estos métodos de análisis y detección también son modalidades alternativas de la presente invención. La conjugación de un anticuerpo de esta invención a un soporte sólido es útil como una herramienta para la purificación por afinidad de las células NK que portan el KIR de reacción cruzada sobre su superficie celular proveniente de una fuente, tal como por ejemplo, un fluido biológico. Este método de purificación es otra modalidad alternativa de la presente invención, como es la población purificada resultante de células NK. En una modalidad alternativa, un anticuerpo que se une a un determinante común presente en al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sobre las células NK que expresan al menos uno de los dos receptores de KIR inhibidor humano diferentes de esta invención, incluyendo NKVSFl, se pueden incorporar en liposomas ("inmunoliposomas") , solo o con otra sustancia para el suministro dirigido a un animal. Estas otras sustancias incluyen ácidos nucleicos para el suministro de genes para terapia génica o para el suministro de ARN antisentido, ARNi o ARNsi para suprimir un gen en una célula NK, o toxinas o fármacos para el extermino dirigido de células NK. El moldeo por computadora de dominios extra-celulares de KIR2DL1, -2 y -3 (KIR2DL1-3) , con base en sus estructuras cristalinas publicadas (Maenaka et al. (1999), Fan et al . (2001), Boyington et al, . (2000)), predice la implicación de ciertas regiones o KIR2DL1, -2 y -3 en la interacción entre los anticuerpos monoclonales de ratón con reacción cruzada KIR2DL1 de la interacción y los anticuerpos de monoclonal de ratón KIR2DL1-3, DF200 y NKVSFl. De esta forma, en una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen exclusivamente a KIR2DL1 dentro de una región definida por los residuos de aminoácidos (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192) . En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a KIR2DL1 y KIR2DL2/3 sin la interacción con los residuos de aminoácidos fuera de la región definida por los residuos (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192) . En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a KIR2DL1 y que no se unen a un mutante de KIR2DL1 en el cual R131 es Ala. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a KIR2DL1 y que no se unen a un mutante de KIR2DL1 en el cual R157 es Ala. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a KIR2DL1 y que no se unen a un mutante de KIR2DL1 en el cual R158 es Ala. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a los residuos (131, 157, 158) de KIR2DL1. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a K1R2DS3 (R131W) , pero no a KIR2DS3 tipo silvestre. En otra modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen tanto a KIR2DL1 como a KIR2DL2/3 así como también a KIR2DS4. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen tanto a KIR2DL1 como a KIR2DL2/3, pero no a KIR2DS4. La determinación de que un anticuerpo se una dentro de una de las regiones del epítope definidas anteriormente se puede llevar a cabo de maneras conocidas para el experto en la técnica. Como un ejemplo de estos métodos de mapeo/caracterización, una región de epítopes para un anticuerpo antí-KIR se puede determinar la "impresión de huellas" del epítope utilizando la modificación química de las aminas/carboxilos expuesto en la proteína KIR2DL1 o KIR2DL2/3. Un ejemplo específico de esta técnica de impresión de huellas es el uso de HXMS (intercambio de hidrógeno-deuterio detectado mediante espectrometría másica) en donde se presenta un intercambio de hidrógeno/deuterio del receptor y los protones de la amida de la proteína de ligandos, la unión y el retrointercambio, en donde los grupos con estructura de amida que participan en la unión de proteínas se protegen del retrointercambio y por lo tanto permanecen deuterizado. Las regiones relevantes se pueden identificar en este punto mediante proteolisis péptica, separación mediante cromatografía en líquidos de alto desempeño con microperforaciones rápidas, y/o espectrometría másica mediante ionización con electro-rocío. Véase, por ejemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267(2) pp. 252-259 (1999) y/o Engen, J.R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Otro ejemplo de una técnica para identificación de epítopes adecuada es el mapeo de epítopes mediante resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) , en donde típicamente la posición de las señales en espectros NMR bidimensionales del antígeno libre y el antígeno complejado con el péptido de unión con antígenos, tal como por ejemplo, un anticuerpo, se comparan. El antígeno típicamente se marca selectiva e isotópicamente con 15N de tal forma que en el espectro NMR se observen únicamente las señales que correspondan al antígeno y no las señales provenientes del péptido de unión con antígenos. Las señales del antígeno que se originan de los aminoácidos implicados en interacción con el péptido de unión con antígenos típicamente desviarán la posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre, y los aminoácidos implicados en la unión se pueden identificar de esa forma. Véase, por ejemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); y Saito and Patterson, Méthods. 1996 Jun; 9(3): 516-24. El mapeo/caracterización de epítopes también se puede realizar utilizando métodos de espectrometría másica. Véase, por ejemplo, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35 (4) :493-503 y Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 1 de mayo; 71 (9) : 1792-801. Las técnicas para digestión de proteasa también se pueden utilizar en el contexto del mapeo e identificación de epítopes. Las regiones/secuencias relevantes determinantes antigénicas se pueden determinar mediante la digestión con proteasa, por ejemplo, al utilizar tripsina en una proporción de aproximadamente 1:50 para KIR2DL1 o KIR2DL2/3 o la digestión o/n a 37 °C y pH 7-8, seguida por análisis de espectrometría másica (MS, por sus siglas en inglés) para la identificación de péptidos. Los péptidos protegidos de la escisión con tripsina mediante el aglutinante anti-KIR se pueden identificar posteriormente mediante la comparación de muestras sometidas a la digestión con tripsina y las muestras incubadas con el anticuerpo y luego someterse a digestión por ejemplo mediante tripsina (revelando con esto una impresión de huellas para el aglutinante) . En uno de los métodos de caracterización de epítopes similares se pueden utilizar otras enzimas similares a quimiotripsina, pepsina, etc., también o alternativamente.
Además, la digestión enzimática puede proporcionar un método rápido para analizar si una secuencia determinante antigénica potencial está dentro de una región del KIR2DL1 en el contexto de un polipéptido Anti-KIR que no se expone en la superficie y, por consiguiente, la mayoría probablemente no relevante en los términos de inmunogenicidad/antigenicidad. Véase, por ejemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27 (1) : 15-9 para un análisis de técnicas similares.
Reactividad cruzada con monos Cynomolgus Se ha encontrado que el anticuerpo NKVSFl también se une a las células NK provenientes de monos cynomolgus, véase el Ejemplo 7. Por lo tanto la invención proporciona un anticuerpo, así como también fragmentos y derivados de los mismos, en donde el anticuerpo, el fragmento o derivado tiene reacción cruzada con al menos dos receptores KIR humanos inhibidores en la superficie de las células NK humanas, y se une además a las células NK provenientes de monos cynomolgus. En una modalidad de la misma, el anticuerpo no es el anticuerpo NKVSFl. La invención también proporciona un método para probar la toxicidad de un anticuerpo, así como también, los fragmentos y derivados del mismo, en donde el anticuerpo, fragmento o derivado tiene reacción cruzada con al menos dos receptores KIR humanos inhibidores en la superficie de las células NK humanas, en donde el método comprende probar el anticuerpo en un mono cynomolgus .
Composición y Administración La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, así como también fragmentos y derivados del mismo, en donde el anticuerpo, fragmento o derivado tiene reacción cruzada con al menos dos receptores KIR inhibidores en la superficie de las células NK, neutraliza sus señales inhibidoras y potencia la actividad de aquellas células, en cualquier vehículo adecuado en una cantidad eficaz para potenciar detectablemente la citotoxicidad de células NK en un paciente o en una muestra biológica que comprende células NK. La composición además comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones también se denominan como "composiciones de anticuerpo de esta invención". En una modalidad, las composiciones de anticuerpo de esta invención comprenden un anticuerpo expuesto en las modalidades de anticuerpo anteriores. El anticuerpo NKVSFl se incluye dentro del alcance de los anticuerpos que pueden estar presentes en las composiciones de anticuerpos de esta invención. El término "muestra biológica", en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye de manera enunciativa un fluido biológico (por ejemplo, suero, linfa, sangre) , muestra celular o muestra de tejidos (por ejemplo, médula ósea) . Los portadores farmacéuticamente aceptables que se puedan utilizar en estas composiciones incluyen de manera enunciativa: intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecítina, proteínas de suero, tales como por ejemplo, albúmina de suero humana, sustancias amortiguadoras tales como por ejemplo, fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, glicérido parcial, mezclas de ácidos grasos, vegetales saturados, agua, sales o electrólitos, tales como por ejemplo, sulfato de protamina, fosfato monoácido de sodio, fosfato monoácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil, las substancias celuloso-basadas, el glicol del polietilenpirolidona, sustancias con base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y grasa de lana. Las composiciones de esta invención se pueden emplear en un método para potenciar la actividad de las células NK en un paciente o una muestra biológica. Este método comprende el paso de poner en contacto la composición con el paciente o muestra biológica. Este método será útil para fines tanto de diagnóstico como terapéuticos . Para utilizarse junto con una muestra biológica, la composición de anticuerpos se puede administrar al mezclarla simplemente o al aplicarla directamente a la muestra, dependiendo • de la naturaleza de la muestra (fluida o sólida) . La muestra biológica se puede poner en contacto directamente con el anticuerpo en cualquier dispositivo adecuado (placa, bolsa, matraz, etc.). Para utilizarse junto con un paciente, la composición se debe preparar para la administración al paciente. Las composiciones de la presente se pueden administrar oral, parenteralmente, mediante rocío por inhalación, tópicamente, rectal, nasal, bucal, vaginalmente o vía un depósito implantado. El término "parenteral" en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye -técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-artícular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. De preferencia, las composiciones se administran oral, intraperitoneal o intravenosamente . Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser acuosas o una suspensión oleaginosa. Estas suspensiones se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas en este campo utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución inyectable estéril o suspensión en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1, 3-butandiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles, como un solvente o medio de suspensión. Para este fin, cualquier aceite fijo insípido se puede emplear incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como por ejemplo, ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación de soluciones inyectables, como son aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como por ejemplo, aceite de oliva o aceite de ricino, en especial en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones oleosas o suspensiones también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como por ejemplo, carboximetilcelulosa o agentes de dispersión similares que se utilizan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Para los fines de formulación también se pueden utilizar otros tensioactivos comúnmente utilizados tales como por ejemplo, Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o intensificadores de biodisponibilidad que se utilizan comúnmente en la elaboración de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de esta invención se pueden administrar oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo de manera enunciativa, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de "las tabletas para uso oral, los portadores utilizados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se agregan típicamente agentes lubrificantes, tales como por ejemplo, estearato de magnesio. Para administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz deshidratado. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden agregar cierto agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes. Alternativamente, las composiciones de esta invención se pueden administrar en la forma de supositorios para administración rectal. Estos se preparan al mezclar el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Estos materiales incluyen: manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles . Las composiciones de esta invención también se pueden administrar tópicamente, en especial cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos que tengan fácil acceso para la aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel, o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede llevar a cabo en una formulación para supositorio rectal (véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada. También se pueden utilizar parches tópicamente-transdérmicos . Para aplicaciones tópicas, las composiciones se pueden formular en un ungüento adecuado que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen de manera enunciativa: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones se pueden formular en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores adecuados incluyen de manera enunciativa: aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbate 60, cera de cetilésteres, alcohol ceterarílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Para uso oftálmico, las composiciones se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina estéril con pH ajustado, isotónica, o, de preferencia, como soluciones en solución salina estéril con pH ajustado, isotónica, ya sea con o sin un conservador tal como por ejemplo, cloruro de bencilalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones se pueden formular en un ungüento tal como por ejemplo, petrolato. Las composiciones de esta invención también se pueden administrar mediante aerosol nasal o inhalación. Estas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo de la formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para intensificar la biodisponibilidad, fluorocarburos, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales. Se ha mostrado que diversos anticuerpos monoclonales serán eficientes en situaciones clínicas, tales como por ejemplo, Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) o Xolair (Omalizumab) , y regímenes de administración similares (es decir, formulaciones y/o dosificaciones y/o protocolos de administración) se pueden utilizar con los anticuerpos de esta invención. Los esquemas y dosificaciones para la administración del anticuerpo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden determinar de acuerdo con métodos conocidos para estos productos, por ejemplo, utilizando las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, un anticuerpo presente en una composición farmacéutica de esta invención se puede suministrar a una concentración de 10 mg/ml en ya sea 100 mg (10 ml) o 500 mg (50 ml) de viales de uso individual. El producto se formula para administración IV en 9.0 mg/ml de cloruro de sodio, 7.35 mg/ml de citrato sódico dihidratado, 0.7 mg/ml de polisorbate 80, y agua estéril para inyección. El pH se ajusta a 6.5. Una variación de dosificación adecuada de ejemplo para un anticuerpo en una composición farmacéutica de esta invención puede estar entre aproximadamente 10 mg/m2 y 500 mg/m2. Sin embargo, se apreciará que estos esquemas son de ejemplo y que un esquema y régimen óptimos se pueden adaptar tomando en cuenta la afinidad y tolerancia del anticuerpo particular en la composición farmacéutica que se debe determinar en pruebas clínicas. Las cantidades y esquema de inyección de un anticuerpo en una composición farmacéutica de esta invención que sature las células NK durante 24 horas, 48 horas 72 horas o una semana o un mes se determinará considerando la afinidad del anticuerpo y sus parámetros farmacocinéticos. De acuerdo con otra modalidad, la composición de anticuerpos de esta invención puede comprender además otro agente terapéutico, incluyendo los agentes utilizados normalmente para el fin terapéutico particular para el cual se está administrando el anticuerpo. El agente terapéutico adicional normalmente estará presente en la composición en cantidades utilizadas típicamente para ese agente en una monoterapia para la enfermedad o condición particular que será tratada. Estos agentes terapéuticos incluyen de manera enunciativa: agentes terapéuticos, utilizados en el tratamiento de cánceres, agentes terapéuticos utilizados para tratar una enfermedad infecciosa, agentes terapéuticos utilizados en otras inmunoterapias, citoquinas (tales como por ejemplo, IL-2 o IL-15) , otros anticuerpos y fragmentos de otros anticuerpos . Por ejemplo, están disponibles varios agentes terapéuticos para el tratamiento de cánceres. Las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención se pueden combinar con cualesquiera otros métodos empleados generalmente en el tratamiento de la enfermedad particular, en particular un tumor, una enfermedad por cáncer, u otra enfermedad o trastorno que exhiba el pacientes . Siempre y cuando un procedimiento terapéutico particular se sepa que no será dañino para la condición del paciente en sí mismo, y no contrarreste significativamente la actividad del anticuerpo en una composición farmacéutica de esta invención, se contempla su combinación con la presente invención. Junto con el tratamiento de tumores sólidos, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar en combinación con procedimientos clásicos, tales como por ejemplo, cirugía, radioterapia, quimioterapia, y lo semejante. La invención por lo tanto proporciona terapias combinadas en las cuales se utiliza una composición farmacéutica de esta invención simultáneamente con, antes, o después de la cirugía o tratamiento con radiación; o se administran a pacientes con, antes, o después de la quimioterapia convencional, agentes radioterapéuticos o antiangiogénicos, o inmunotoxinas dirigidas o coaguligandos . Cuando se utilizan uno o más agentes en combinación con una composición que contiene anticuerpos de esta invención en un régimen terapéutico, no existe requerimiento para los resultados combinados que serán aditivos a los efectos observados cuando se conduce cada tratamiento por separado. Aunque en general son convenientes efectos al menos aditivos, podría ser benéfico cualquier efecto anti-cáncer aumentado anteriormente a una de las terapias individuales. También, no existe un requerimiento particular para el tratamiento combinado que exhiba efecto sinérgico, aunque ciertamente es posible y ventajoso. Para practicar la terapia anti-cáncer combinada, simplemente se podría administrar a un animal una composición de anticuerpos de esta invención en combinación con otro agente anti-cáncer de una manera eficaz para que de por resultado en sus acciones anit-cáncer combinadas dentro del animal. Los agentes por lo tanto se podrían proporcionar en cantidades eficaces y durante periodos de tiempo eficaces para que den por resultado en su presencia combinada dentro de la vasculatura tumoral y sus acciones combinadas en el entorno del tumor. Para alcanzar este objetivo, una composición de anticuerpos de esta invención y agentes anti-cáncer se puede administrar al animal simultáneamente, ya sea en una composición combinada individual, o como dos composiciones distintas utilizando diferentes vías de administración. Alternativamente, la administración de una composición de anticuerpos de esta invención puede preceder, o seguir, al tratamiento con agentes anti-cáncer mediante, por ejemplo, intervalos que varían de minutos a semanas y meses. Se podría estar seguro que el agente anti-cáncer y un anticuerpo en la composición de anticuerpos de esta invención ejerzan un efecto ventajosamente combinado sobre el cáncer. La mayoría de agentes anti-cáncer se podría administrar antes de una composición del anticuerpo KIR inhibidor de esta invención en una terapia anti-angiogénica. Sin embargo, cuando se utilizan inmunoconjugados de un anticuerpo en la composición de anticuerpos de esta invención, se pueden administrar simultánea o posteriormente diversos agentes anti-cáncer. En algunas situaciones, incluso puede ser conveniente extender el periodo de tiempo para el tratamiento significativamente, donde se requiere un lapso de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ú 8) o incluso varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ú 8) entre la administración respectiva del agente anti-cáncer y el tratamiento anti-cáncer y la administración de la composición de anticuerpos de esta invención. Esto podría ser ventajoso en circunstancias en donde se pretende que el tratamiento anti-cáncer destruya sustancialmente el tumor, tal como por ejemplo, mediante cirugía o quimioterapia, y la administración de una composición de anticuerpos de esta invención se destino a evitar la micrometástasis o el re-desarrollo de tumores. También se prevé que se utilizará más de una administración de ya sea una composición con base en el anticuerpo KIR inhibidor de esta invención o el agente anti-cáncer. Estos agentes se pueden administrar intercambiablemente, o se pueden alternar en días o semanas; o un ciclo de tratamiento con una composición de anticuerpos KIR inhibidores de esta invención, seguido por un ciclo de terapia con agente anti-cáncer. En cualquier caso, para alcanzar la regresión del tumor utilizando una terapia combinada, todos lo que se requiere es suministrar ambos agentes en una cantidad combinada eficaz para ejercer un efecto anti-tumor, sin importar las veces de administración . En los términos de cirugía, se puede ' practicar cualquier intervención quirúrgica en combinación con la presente invención. Junto con la radioterapia, se contempla cualquier mecanismo para inducir el daño del ADN localmente dentro de células cancerígenas, tal como por ejemplo, irradiación gamma, Rayos X, irradiación UV, microondas e incluso emisiones electrónicas y lo semejante. El suministro dirigido de radioisótopos a células cancerígenas también se contempla, y se puede utilizar junto con un anticuerpo dirigido u otros medios de dirección. En otros aspectos, se pueden administrar compuestos o regímenes inmunomoduladores en combinación o como parte de las composiciones de anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos preferidos de compuestos inmunomoduladores incluyen citoquinas . En estos procedimientos combinados se pueden emplear diversas citoquinas. Los ejemplos de citoquinas útiles en las combinaciones contempladas por esta invención incluyen ILl-alfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Las citoquinas utilizadas en el tratamiento de combinación o las composiciones de esta invención se administran de acuerdo con regímenes estándar, consistentes con indicaciones clínicas tales como por ejemplo, la condición del paciente y la toxicidad relativa de la citoquina.
En ciertas modalidades, las composiciones terapéuticas que comprenden el anticuerpo KIR inhibidor de reacción cruzada de la presente invención se pueden administrar en combinación o pueden comprender adicionalmente un agente para terapia quimioterapéutica u hormonal . En los métodos de tratamiento combinado expuestos en la presente se puede utilizar una variedad de terapia hormonal y agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos contemplados como de ejemplo incluyen de manera enunciativa: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos citotóxicos, vincaalcaloides, por ejemplo, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, dauno icina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotero, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16) , 5-fluorouracilo (5FU) , citosina arabinosido, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina-C, cisplatin (CDDP) , aminopterina, combretastatina (s) y derivados y profármacos de los mismos. Los agentes hormonales incluyen de manera enunciativa: por ejemplo, agonistas LHRH tales como por ejemplo, leuprorelina, goserelina, triptorelina, y buserelina; anti-estrógenos tales como por ejemplo, tamoxifeno y toremifeno; anti-andrógenos tales como por ejemplo, flutamida, nilutamida, ciproterona y bicalutamida; inhibidores de aromatasa tales como por ejemplo, anastrozol, exemestano, letrozol y fadrozol; y progestagenos tales como por ejemplo, medroxi, clormadinona y megestrol. Como se entenderá por aquellos con experiencia normal en la técnica, las dosificaciones adecuadas de agentes quimioterapéuticos se aproximará a aquellas empleadas en terapias clínicas en donde los quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros quimioterapéuticos. A manera de ejemplo únicamente, se pueden utilizar agentes tales como por ejemplo, cisplatina, y otros ADN alquilante. La cisplatina se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de cáncer, con dosificaciones eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas de 20 mg/m2 durante 5 días cada tres semanas para un total de tres cursos. La cisplatina no se absorbe oralmente y por lo tanto se debe suministrar mediante inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitonealmente . Los agentes quimioterapéuticos útiles adicionales incluyen compuestos que interfieren con la replicación del ADN, la mitosis y la segregación cromosómica, y los agentes que interrumpen la síntesis y fidelidad de los precursores polinucleotídicos . Varios agentes quimioterapéuticos de ejemplo para terapia combinada se listan en la Tabla C de la patente de los Estados Unidos No.6, 524, 583, la exposición de estos agentes y las indicaciones se incorporan específicamente en la presente co o referencia. Cada uno de los agentes listados son de ejemplo y no limitantes. El experto se dirige a "Remington's PharmaceuticalSciences" 15ava edición, capítulo 33, en particular las páginas 624-652. Probablemente se presentará una variación en la dosificación, dependiendo de la condición que será tratada. El médico que está administrando el tratamiento será capaz de determinar la dosificación adecuada para el sujeto individual. Las composiciones del anticuerpo KIR inhibidor de reacción cruzada presentes de esta invención se pueden utilizar en combinación con cualquiera de una o más de otras terapias anti-angiogénicas o puede comprender además agentes anti-angiogénicos . Los ejemplos de estos agentes incluyen anticuerpos neutralizantes, ARN antisentido, ARNsi, ARNi, aptámeros y ribozimas de ARN para uno dirigidos contra VEGF o los receptores VEGF (patente de los Estados Unidos No. 6,524,583, la exposición de la cual se incorpora en la presente como referencia) . Las variantes de VEGF con propiedades antagónicas, también se pueden emplear, según se describe en la WO 98/16551, incorporada específicamente en la presente como referencia. Los agentes anti-angiogénicos de ejemplo adicionales que son útiles junto con la terapia combinada se listan en la Tabla D de la patente de los Estados Unidos No. 6,524,583, la exposición de estos agentes e indicaciones ser incorporan específicamente en la presente como referencia. Las composiciones del anticuerpo KIR inhibidor de esta invención también se pueden utilizar ventajosamente en combinación con los métodos para inducir apoptósis o pueden comprender, agentes apoptóticos. Por ejemplo, se han identificado que varios oncogenes inhiben la apoptósis, o muerte celular programada. Los oncogenos de ejemplo en esta categoría incluyen de manera enunciativa: bcr-abl, bcl-2 (distintos de bcl-1, ciclina DI; números de acceso GenBank M14745, X06487; patentes de los Estados Unidos Nos. 5,650,491; y 5,539,094; cada uno incorporado en la presente como referencia) y los miembros familiares que incluyen Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, y A20. La sobre-expresión de bcl-2 se descubrió primero en linfomas de linfocitos T. El encogen bcl-2 funciona mediante la unión e inactivación Bax, una proteína en la trayectoria apoptótica. La inhibición de la función bcl-2 previene la inactivación de Bax, y permite que prosiga la trayectoria apoptótica. La inhibición de esta clase de oncogenos, por ejemplo, utilizando secuencias, nucleotídicas antisentido ARNi, ARNsi o compuestos químicos de molécula pequeña, se contempla para utilizarse en la presente invención para proporcionar una mejora de la apoptósis (patentes de los Estados Unidos Nos. 5,650,491; 5,539,094; y 5,583,034; cada uno incorporada en la presente como referencia) . Las composiciones del anticuerpo KIR inhibidor de esta invención también pueden comprender o se pueden utilizar en combinación con moléculas que comprenden una porción blanco, por ejemplo, anticuerpo, ligando, o un conjugado de los mismos, dirigido a un marcador específico de una célula blanco ("agente blanco") , por ejemplo, una célula tumoral blanco. Hablando en general, los agentes blanco para utilizarse en aquellos aspectos adicionales de la invención de preferencia reconocerán los antígenos tumorales accesibles que de preferencia o específicamente, se expresen en el sitio del tumor. Los agentes blanco en general se unirán a un componente superficie-expresado, superficie-accesible o superficie-localizado de una célula tumoral. Los agentes blanco de preferencia exhibirán propiedades de alta afinidad; y no ejercerán efectos secundarios in vivo significativos contra los tejidos normales, que sostienen la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados de: corazón, riñon, cerebro, hígado, médula ósea, colon, mama, próstata, tiroides, vesícula biliar, pulmón, adrenales, músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel u otro órgano para sostener la vida o tejido en el cuerpo humano. El término "no ejerce efectos secundarios significativos", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere al hecho de que un agente blanco, cuando se administra in vivo, producirá únicamente efectos secundarios insignificantes o clínicamente manejables, tales como por ejemplo, aquellos encontrados normalmente durante la quimioterapia. En el tratamiento de tumores, una composición de anticuerpos de esta invención adicionalmente puede comprender o se puede utilizar en combinación con compuestos complementarios. Los compuestos complementarios pueden incluir a manera de ejemplo, antieméticos tales como por ejemplo, antagonistas de serotonina y terapias tales como por ejemplo, fenotiazinas, benzamidas sustituidas, antihistaminas, butirofenonas, corticoesteroides, benzodiazepinas y cannabinoides; bisfosfonatos tales como por ejemplo, ácido zoledrónico y ácido pamidrónico; y factores para crecimiento hematopoieticos tales como por ejemplo, eritropoietina y G-CSF, por ejemplo, filgrastima, lenograstima y darbepoietina. En otra modalidad, dos o más anticuerpos de esta invención que tengan diferentes reactividades cruzadas, incluyendo NKVSFl, se pueden combinar en una composición individual para neutralizar los efectos inhibidores de muchos productos genéticos KIR inhibidor como sea posible. Las composiciones que comprenden combinaciones de anticuerpos KIR inhibidores de reacción cruzada de esta invención, o fragmentos o derivados de los mismos, incluso permitirán una utilidad más amplia debido a que probablemente existe como un pequeño porcentaje de la población humana que puede carecer de cada uno de los productos genéticos de KIR inhibidor reconocidos por un anticuerpo de reacción cruzada individual. De manera similar, una composición de anticuerpos de esta invención puede comprender adicionalmente uno o más anticuerpos que reconozcan los subtipos KIR inhibidor individual. Estas combinaciones nuevamente podrían proporcionar una utilidad más amplia en un ajuste terapéutico. La invención también proporciona un método para potenciar la actividad de las células NK en un paciente que necesita del mismo, que comprende el paso de administrar una composición de acuerdo con esta invención al paciente. El método se dirige más específicamente al aumento de la actividad de células NK en pacientes que tengan una enfermedad en la cual es benéfica la actividad de células NK aumentada, que implica, afecta o se provoca por células susceptible a lisis mediante células NK, o que se provoca o se caracteriza por una actividad de células NK insuficiente, tal como por ejemplo, un cáncer, u otro trastorno proliferativo, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmunológico. Más específicamente, los métodos de la presente invención se utilizan para el tratamiento de una variedad de cánceres y otras enfermedades proliferativas entre las que se incluyen de manera enunciativa carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, próstata, páncreas, estómago, cerviz, tiroides y piel, incluyendo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoieticos de linaje linfoideo, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkins, linfoma que no es de Hodgkins, linfoma de células pilosas y linfoma de Burketts; tumores hematopoieticos de linaje mieloideo, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de la tiroides y teratocarcinoma. Los trastornos preferidos que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen tumores hematopoieticos de linaje linfoideo, por ejemplo, tumores de linfocitos T y linfocitos B, incluyendo de manera enunciativa trastornos de linfocitos T tales como por ejemplo leucemia T-prolinfocítica (T-PLL, por sus siglas en inglés) , incluyendo la del tipo de célula pequeña y célula ceriforme; leucemia linfocítica granular grande (LGL, por sus siglas en inglés) de preferencia del tipo de linfocito T; síndrome de Sezary (SS, por sus siglas en inglés) ; linfoma leucémico de linfocitos T en adultos (ATLL, por sus siglas en inglés) ; linfoma hepatoesplénico a/d T-NHL; linfoma de linfocitos T periférico/post-tímico (subtipos pleo órficos e inmunoblásticos) ; linfoma de linfocitos T angioinmunoblásticos; linfoma de linfocitos T; angiocéntricos (nasales) ; linfoma de células grandes anaplástica (Ki 1+) ; linfoma de linfocitos T intestinales; T-linfoblásticos; y linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL) . De acuerdo con la invención también se pueden tratar otros trastornos proliferativos, incluyendo por ejemplo, hiperplasias, fibrosis (en especial pulmonar, aunque también otros tipos de fibrosis, tales como por ejemplo, fibrosis renal) , angiogénesis, psoriasis, ateroesclerosis y proliferación de músculo liso en vasos sanguíneos, tal como por ejemplo, estenosis o restenosis después de una angioplastia. El anticuerpo KIR inhibidor de reacción cruzada de esta invención se puede utilizar para tratar o evitar enfermedades infecciosas, incluyendo de preferencia cualesquiera infecciones provocadas por virus, bacterias, protozoarios, mohos y hongos. Estos organismos infecciosos virales incluyen de manera enunciativa: hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, influenza, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (HSV-1, por sus siglas en inglés), herpes simplex tipo 2 (HSV-2, por sus siglas en inglés) , rinderpest, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de papiloma, cito egalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de parotiditis, virus del sarampión, virus de rubéola, virus de polio y virus de inmunodeficiencia humana tipo I tipo 2 (VIH-1, VIH-2) . Las infecciones bacterianas que se pueden tratar de acuerdo con esta invención incluyen de manera enunciativa: infecciones provocadas por los siguientes: Staphylococcus; Streptococo, incluyendo S. pyogenes; Enterococcl ; Bacillus, incluyendo Bacillus anthracis, y Lactobacillus; histeria ; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella incluyendo G. vagínalis ; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulga is ; Treponerna ; Camplyobacter, Pseudomonas incluyendo Raeruginosa ; Legionella ; Neisseria incluyendo N. gonorrhoeae y N. meningitides ; Flavobacterium incluyendo F. meningosepticum y F. odoraturn; Brucella ; Bordetella incluyendo B. pertussis y B. bronchiseptíca ; Escherichia incluyendo E. coli , Klebsiella ; Enterobacter, Serratia incluyendo S . marcescens y S. liquefaciens; Edwardsiella ; Proteus incluyendo P. mirabilis y P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiaceae incluyendo R . fickettsfi , Chlamydia incluyendo C. psi ttaci y C. trachorna tis; Mycobacterium incluyendo M. tuberculosis , M. intracellulare , M. folluiturn, M. laprae, M. aviu , M. bovis , M. africanum, M. kansasii , M. intracellulare, y M. lepraernuriu ; y Nocardía . Las infecciones por protozoarios que se pueden tratar de acuerdo con esta invención incluyen de manera enunciativa: infecciones provocadas por leishmania, kokzidioa, y trypanosoma. Una lista completa de las enfermedades infecciosas se puede encontrar en el sitio web del Centro Nacional para Enfermedades Infecciosas (NCID, por sus siglas en inglés) en el Centro para el Control de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) (http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/), esta lista se incorpora en la presente como referencia. Todas estas enfermedades son candidatas para el tratamiento utilizando los anticuerpos KIR inhibidor de reacción cruzada de la invención. Estos métodos para tratar diversas enfermedades infecciosas pueden emplear la composición de anticuerpos de esta invención, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos y/o agentes de terapéuticos conocidos para el tratamiento de estas enfermedades, incluyendo agentes anti-virales, agentes anti-micóticos, agentes antibacterianos, antibióticos, agentes anti-parasíticos y agentes anti-protozoarios. Cuando estos métodos implican tratamientos adicionales con agentes terapéuticos adicionales, aquellos agentes se pueden administrar junto con los anticuerpos de esta invención como cualquier forma de dosificación individual o como las formas de dosificación por separado, múltiples. Cuando se administran como una forma de dosificación por separado, el agente adicional se puede administrar antes que, simultáneamente con, o después de la administración del anticuerpo de esta invención. En la siguiente sección experimental se describirán aspectos y ventajas adicionales de esta invención, los cuales se deben considerar como ilustrativos y no limitantes del alcance de esta solicitud.
EJEMPLO 1 Purificación de los PBL y generación de lineas de células NK policlonales o clónales Los PBL se derivaron de donadores sanos mediante gradientes Ficoll Hypaque y el vaciado de células adherentes plásticas . Para obtener células NK enriquecidas, los PBL se incubaron con anti-CD3, anti-CD4 y anti-HLA-DR mAbs (30 minutos a 4°C), seguido por perlas magnéticas anti-ratón de cabra (Dynal) (30 minutos a 4°C) y la selección inmunomagnética mediante métodos conocidos en la técnica (Pende et al., 1999). Las células CD3", CD4", DR~ se cultivaron en células alimentadoras irradiadas y 100 U/ml de interieucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) y 1.5 ng/ml fitohemaglutinina A (Gibco BRL) para obtener poblaciones de células NK policlonales. Las células NK se clonaron al limitar la dilución y los clones de las células NK se caracterizaron mediante citometría de flujo para la expresión de receptores de superficie celular. Los mAb utilizados fueron JT3A (IgG2a, anti-CD3), EB6 y GL183 (IgGl anti-KIR2DLl y KIR2DL3 respectivamente) , XA-141 IgM (anti-KIR2DLl con la misma especificidad como EB6) , anti-CD4 (HP2.6), y anti-DR (DI.12, IgG2a) . En lugar de JT3A, HP2.6, y DR1.12 que se produjeron por los solicitantes, los mAb disponibles comercialmente de las mismas especificidades se pueden utilizar (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) . EB6 y GL183 están disponibles comercialmente (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. ) . XA-141 no está disponible comercialmente, pero EB6 se puede utilizar para la reconstitución control de la lisis como se describe en (Moretta et al., 1993). Las células se tiñeron con los anticuerpos adecuados (30 minutos a 4°C) seguido por los anticuerpos anti-ratón policlonales conjugados con PE o FITC (Southern Biotechnology Associates Inc) . Las muestras se analizaron mediante análisis citofluorométrico sobre un aparato FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . En este estudio se utilizaron los siguientes clones. CP11, CN5 y CN505 son clones KIR2DL1 positivos y se tiñeron mediante EBß ( (IgGl anti-KIR2DLl) o XA-141 (IgM anti-KIR2DLl con la misma especificidad en comparación con los anticuerpos EB6) . CN12 y CP502 son clones KIR2DL3 positivos y se tiñeron mediante el anticuerpo GLl83(IgGl anti-KIR2DL3) . La actividad citolítica de los clones NK se valoró mediante un análisis para liberación de 51Cr de 4 horas estándar en el cual se probaron las células NK efectoras sobre las líneas de células positivas Cw3 o Cw4 conocidas por su sensibilidad a la lisis de células NK. Todos los blancos se utilizaron a 5000 células por cavidad en una placa de microtitulación y la proporción efectora: blanco se indica en las Figuras (usualmente 4 efectoras por células blanco) . El análisis citolítico se realizó con o sin sobrenadante de anticuerpos monoclonales indicados a una 1/2 dilución. El procedimiento fue esencialmente el mismo según se describe en (Moretta et al., 1993).
EJEMPLO 2 Generación de nuevos mAb Los mAb se generaron al inmunizar ratones Balb C de 5 semanas de edad con líneas de células NK policlonales o monoclonales activadas según se describe en (Moretta et al., 1990). Después de diferentes fusiones de células, los mAb se seleccionaron primero por su capacidad para tener una reacción cruzada con líneas ciclones de células NK EBß y GL183 positivas. Los anticuerpos monoclonales positivos se seleccionaron adicionalmente por su capacidad para reconstituir la lisis mediante los clones NK EBß positivos o GL183 positivos de los blancos Cw4 o Cw3 positivos respectivamente. La tinción celular se llevó a cabo como sigue. Las células se tiñeron con un panel de anticuerpos (1 µg/ml o 50 µl del sobrenadante, 30 minutos a 4°C) seguido por fragmentos F(ab')2 de cabra PE-conjugados anti-ratón IgG (H+L) o fragmentos F(ab')2 de cabra PE-conjugados IgG anti-humano (Fe gamma) anticuerpos (Beckman Coulter) . El análisis citofluorométrico se realizó en un aparato Epics XL.MCL (Beckman Coulter) . Uno de los anticuerpos monoclonales, el DF200 mAb, se encontró que reaccionó con diversos miembros de la familia KIR incluyendo KIR2DL1, KIR2DL2/3. Las células tanto KIR2DL1+ como KIR2DL2/3+ se tiñeron brillantemente con DF200mAb (Figura 1) . Los clones con NK que expresan uno u otro (o incluso ambos) de estos receptores inhibidores clase I-específicos de HLA se utilizaron como células efectoras contra células blanco que expresan uno o más alelos HLA-C. Los análisis de citotoxicidad se llevaron a cabo como sigue. La actividad citolítica de las líneas celulares YTS-KIR2DL1 o YTS-Eco se valoró mediante un análisis para liberación, de 51 Cr de 4 horas estándar. Las células efectoras se probaron en líneas celulares EBV positivas o negativas de HLA-Cw4 y 721.221 células transfectadas con HLA-Cw4. Todos los blancos se utilizaron a 3000 células por cavidad en una placa de titulación. La proporción efectora/blanco se indica en las Figuras. El análisis citolítico se realizó con o sin los fragmentos de longitud total o F(ab')2 indicados de anticuerpos de ratón o humanos monoclonales. Como se esperaba, los clones KIR2DL1+ NK exhibieron poca si es que la hay actividad citolítica contra células blanco que expresan HLA-Cw4 y los clones KIR2DL3+ NK exhibieron poca o ninguna actividad sobre los blancos Cw3 positivos. Sin embargo, en presencia de DF200mAb (utilizado para enmascarar sus receptores KIR2DL) los clones NK se volvieron inestables para reconocer sus ligandos HLA-C y exhibieron una fuerte actividad citolítica sobre los blancos Cw3 o Cw4. Por ejemplo, la línea celular C1R (línea celular CW4+ EBV, ATCC n°CRL 1993) no se exterminó por los clones KIR2DL1+ NK (CN5/CN505) , pero la inhibición se podría invertir eficientemente mediante el uso de cualquier DF200 a un mAb anti-KIR2DLl convencional. Por otro lado, los clones NK que expresan el fenotipo KIR2DL2/3+KIR2DLl" (CN12) exterminaron eficientemente las células ClR y este exterminio no se afectó por el DF200mAb (Figura 2) . Se obtuvieron resultados similares con los clones NK KIR2DL2-o KIR2DL3 positivos sobre blancos Cw3 positivos. De manera similar, la línea celular Cw4+ 221 EBV no se exterminó por las células NK KIR2DL1"1" transfectadas, aunque la inhibición se podría invertir eficientemente mediante el uso de cualquier DF200,' un fragmento Fab DF200, o un mAb anti-KIR2DLl convencional EBß o XA141. También, una línea celular Cw3+ 221 EBV no se exterminó por las células KIR2DL2+ NK, aunque esta inhibición se podría invertir por el uso de cualquier DF200 o un fragmento Fab DF200. Por último, la última línea celular Cw3+ 221 EBV no se exterminó por células NK KIR2DL3+, aunque esta inhibición se podría invertir por el uso de cualquier fragmento Fab DF200 o un GL183 o Y249 del mAb de anti-KIR2DL3 convencional. Los resultados se muestran en la Figura 3. Los fragmentos F(ab')2 también se probaron por su capacidad para reconstituir la lisis de los blancos Cw4 positivos. Los fragmentos F(ab')2 de los Ab DF200 y EBß ambos fueron capaces de invertir la inhibición de la lisis mediante células NK KIR2DLl-transfectadas de la línea celular 221 Cw4 transfectada y la línea celular Cw4+ TUBO EBV. Los resultados se muestran en la Figura 4.
EJEMPLO 4 Generación de nuevos mAb humanos Se generaron mAb anti-KIR monoclonales humanos al inmunizar ratones transgénicos manipulados mediante ingeniería genética para expresar un repertorio de anticuerpo humano con proteína KIR recombinante. Después de diferentes fusiones celulares, los mAb primero se seleccionaron por su capacidad para tener reacción cruzada con la proteina KIR2DL1 y KIR2DL2 inmovilizada. Se encontró que diversos anticuerpos monoclonales, incluyendo 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 y 1-6F1, reaccionan con de KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Los anticuerpos monoclonales positivos se seleccionaron adicionalmente por su capacidad para reconstituir la lisis mediante transfectantes NK EBß positivos que expresan células blanco KIR2DL1 de Cw4-positivo blanco. Las células NK que expresan los receptores inhibidores clase I-específicos de HLA se utilizaron como células efectoras contra células blanco que expresan uno o más alelos HLA-C (Figura 5 y ß) . Los análisis de citotoxicidad se llevaron a cabo según se describió anteriormente. La proporción efectora/blanco se indica en las Figuras, y los anticuerpos se utilizaron en ya sea 10 ug/ml o 30 ug/ml. Como se esperaba, las células KIR2DL1"1" NK exhibieron poca si es que la hay actividad citolítica contra células blanco que expresan HLA-Cw4. Sin embargo, en presencia de 1-7F9 mAb, las células NK se volvieron incapaces de reconocer sus ligandos HLA-C y exhibieron una fuerte actividad citolítica sobre los blancos Cw4. Por ejemplo, las dos líneas celulares probadas (las líneas celulares HLA-Cw4 transfectadas 721.221 y la Cw4+ EBV ) no se exterminaron por las células KIR2DL1+ NK, aunque la inhibición se podría invertir eficientemente mediante el uso de cualquier Mab 1-7F9 o un EBß del mAb anti-KIR2DLl convencional. Abs DF200 y panKIR (también denominados como NKVSFl) se compararon con 1-7F9. Los anticuerpos 1-4F1, 1-6F5 y 1-6F1 por otro lado no fueron capaces de reconstituir la lisis celular mediante células NK sobre blancos Cw4 positivos.
EJEMPLO 5 Análisis de Biacore de DF200 mAb/KIR2DLl e interacciones DF200 mAb/KIR2DL3 Producción y purificación de proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes KIR2DL1 y KIR2DL3 se produjeron en E. coli . El. ADNc que codifica para el dominio extracelular total de KIR2DL1 y KIR2DL3 se amplificó mediante PCR a partir del vector del clon 47.11 de pCDM8 (Biassoni et al, 1993) y el vector del clon ß RSVS (gpt)183 (Wagtman et al, 1995) respectivamente, utilizando los siguientes cebadores: sentido: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3 ' anti-sentido: 5' -CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3' . Los mismos se clonaron en el vector de expresión pMLl en el marco con una secuencia que codifica para una señal de biotinilación (Saulquin et al, 2003) . La expresión de proteínas se realizó en la cepa bacteriana BL21(DE3) (Invitrogen). Las bacterias transfectadas se desarrollaron a OD60o=0.6 a 37 °C en medio suplementado con ampicilina (100 µg/ml) y la expresión se indujo con IPTG 1 mm. Las proteínas se recuperaron a partir de cuerpos de inclusión bajo condiciones desnaturalizantes (8 M de urea) . Se realizó un replegamiento de proteínas recombinantes en Tris 20 mm, pH 7.8, amortiguador de NaCl 150 mm que contuvo L-arginina (400 mm, Sigma) y ß-mercaptoetanol (1 mm) , a temperatura ambiente, al disminuir la concentración de urea en una diálisis de seis pasos (4, 3, 2, 1 0.5 y urea 0 M, respectivamente). El glutatión reducido y oxidado (5 mm y 0.5 mm respectivamente, Sigma) se agregó durante los pasos de diálisis con urea 0.5 y 0. Por último, las proteínas se dializaron extensivamente contra Tris 10 mm, pH 7.5, amortiguador de NaCl 150 mm. Las proteínas recicladas, solubles, se concentraron y luego se purificaron en una columna de exclusión por tamaños Superdex 200 (Pharmacia; sistema AKTA) . Las mediciones de resonancia por plasmón superficial se realizaron en un aparato Biacore (Biacore) . En todos los experimentos Biacore, el amortiguador HBS suplementado con tensioactivo P20 al 0.05% sirvió como un amortiguador de ejecución. Inmovilización proteínica Las proteínas KIR2DL1 y KIR2DL3 recombinantes producidas según se describió anteriormente se inmovilizaron covalentemente a grupos carboxilo en la capa de dextrano sobre un Sensor Chip CM5 (Biacore) . La superficie de la microplaqueta sensora se activó con EDC/NHS (N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidahidrocloruro y N-hidroxisuccinimida, Biacore) . Las proteínas, en amortiguador de acoplamiento (acetato 10 mm, pH 4.5) se inyectaron. Se realizó la desactivación de los grupos activados restantes utilizando etanolamina 100 mm pH 8 (Biacore) .
Mediciones de afinidad Para las mediciones cinéticas, se aplicaron diversas concentraciones del anticuerpo soluble (1 x 10~7 a 4 x 10_1 M) sobre la muestra inmovilizada. Las mediciones se realizaron a una velocidad de flujo continuo de 20 µl/min. Para cada ciclo, la superficie de la microplaqueta sensora se regeneró mediante 5 µl de inyección de NaOH 10 mm a pH 11. Para el análisis de datos se utilizó el programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore). El analito soluble (40 µl a diversas concentraciones) se inyectó a una velocidad de flujo de 20 µl/min en amortiguador de HBS, sobre capas de dextrano que contienen 500 ó 540 unidades de reflectancia (RU, por sus siglas en inglés), y 1000 ó 700 RU de KIR2DL1 y KIR2DL3, respectivamente. Los datos son representativos de 6 experimentos independientes. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1. Análisis BIAcore de DF200 mAb que se une a KIR2DL1 y KIR2DL3 inmovilizados.
KD: Constante de disociación.
EJEMPLO 6 Análisis de unión competitiva Biacore de anticuerpos anti-KIR murinos y humanos El análisis de mapeo para epítopes -se llevó a cabo sobre KIR2DL1 inmovilizado (900 RU) , KIR 2DL3 (2000 RU) y KIR2DS1 (1000 RU) con anticuerpos anti-KIR 2D DF200, Pan2D, gll3 y EBß, y anticuerpos anti-KIR 2D humanos 1-4F1, 1-ßFl, 1-6F5 y 1-7F9 según se describió anteriormente (Gauthier et al 1999, Saunal and van Regenmortel 1995) . Todos los experimentos se realizaron a velocidad de flujo de 5 µl/min en amortiguador de HBS con inyección 2 minutos de diferentes anticuerpos a 15 µg/ml. Para cada acoplamiento del análisis de unión competitiva de anticuerpos se realizó en dos pasos. En el primer paso, el priemr antiucuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) se inyectó en la proteina blanco KIR 2D seguida por el segundo mAb (sin la eliminación del primer mAb) y el segundo valor RU de mAb (RU2) según se supervisó. En el segundo paso, el segundo mAb se inyectó primero, directamente sobre la proteína KIR 2D desnuda, y el valor RU de mAb (RUI) se supervisó. La inhibición porcentual de la segunda unión de mAb a la proteína KIR 2D primero se calculó mediante: 100* (1-RU2/RU1) . Los resultados se muestran en la Tablas 2, 3 y 4, en donde los anticuerpos designados "primer anticuerpo" se listan sobre las columnas verticales y el "segundo anticuerpo" se listan sobre la columna horizontal. Para cada combinación de anticuerpos probada, los valores para el nivel de unión directo (RU) de los anticuerpos a la microplaqueta se listan en la tabla, en donde la unión directa del segundo anticuerpo a la microplaqueta KIR2D se lista en la porción superior del campo y el valor para la unión del segundo anticuerpo a la microplaqueta KIR2D cuando el primer anticuerpo está presente se lista en la porción inferior del campo. A la derecha de cada campo se lista la inhibición porcentual de la segunda unión de anticuerpos. La Tabla 2 muestra la unión de una microplaqueta KIR2DL1, la Tabla 3 muestra la unión de anticuerpos a una microplaqueta KIR2DL3, y la Tabla 4 muestra la unión de anticuerpos a una microplaqueta KIR2DS1. La unión competitiva de anticuerpos murinos DF200, NKVSFl y EBß, y anticuerpos humanos 1-4F1, 1-7F9 y 1-6F1 a KIR2DL1, KIR2DL2/3 y KIR2DS1 inmovilizados se valoró. El mapeo de epítopes (Figura 7) a partir de los experimentos con la unión de anticuerpos anti-KIR a KIR2DL1 mostró que (a) el anticuerpo 1-7F9 es competitivo con EB6 y 1-4F1, pero no con NKVSFl y DF200; (b) el anticuerpo 1-4F1 a su vez es competitivo con EB6, DF200, NKVSFl y 1-7F9; (c) NKVSFl compite con DF200, 1-4F1 y EB6, pero no con 1-7F9; y (d) DF200 compite con NKVSFl, 1-4F1 y EB6, pero no con 1-7F9. el mapeo de epítopes (Figura 8) a partir de los experimentos con la unión de anticuerpos anti-KIR a KIR2DL3 mostró que (a) 1-4F1 es competitivo con NKVSFl, DF200, gll83 y 1-7F9; (b) 1-7F9 es competitivo con DF200, gll83 y 1-4F1, pero no con NKVSFl; (c) NKVSFl compite con DF200, 1-4F1 y GL183, pero no con 1-7F9; y (d) DF200 compite con NKVSFl, 1-4F1 y 1-7F9, pero no con GL183. El mapeo de epítopes (Figura 9) a partir de experimentos con la unión de anticuerpos anti-KIR a KIR2DS1 mostró que (a) 1-4F1 es competitivo con NKVSFl, DF200 y 1-7F9; (b) 1-7F9 es competitivo con 1-4F1 pero no es competitivo con DF200 y NKVSFl; (c) NKVSFl compite con DF200, y 1-4F1, pero no con 1-7F9; y (d) DF200 compite con NKVSFl y 1-4F1, pero no con 1-7F9.
EJEMPLO 7 Valoración de mAb anti-KIR con células NK cynomolgus El anticuerpo anti-KIR NKVSFl se probó por su capacidad para unirse a células NK provenientes de monos cynomolgus . La unión del anticuerpo a células NK de mono se muestran en la Figura 10.
Purificación de PBMC de mono y generación de volumen de células NK policlonales Se prepararon PMRC de Cynomolgus Macaque a partir de un tubo CPT con citrato de sodio (Becton Dickinson) . La purificación de las células NK se realizó mediante el vaciado negativo (equipo de enriquecimiento de células NK de Macaque, Stem Cell Technology) . Las células NK se cultivaron en células alimentadoras humanas irradiadas, 300 U/ml Interleucina 2 (Proleucina, Chiron Corporation) y 1 ng/ml de fitohemaglutinina A (Invitrogen, Gibco) para obtener poblaciones de células NK policlonales .
Valoración del mAb Pan2D con células NK cynomolgus Las células NK Cynomolgus (volumen NK en el día 16) se incubaron con diferentes cantidades de mAb de Pan2D seguido por anticuerpos IgG (H+L) de anti-ratón con fragmentos F(ab')2 de cabra PE-conjugados. El porcentaje de células positivas se determinó con un control isotópico (IgGl purificado de ratón) . Las muestras se realizaron por duplicado. Intensidad de fluorescencia media = MFI .
I-1 Cn O O Cp Tabla 2: mapeo del epítope KIR2DL1 <— Segundo Ab —» Cp O p O Cp Tabla 3: mapeo del epítope KIR2DL3 <- Segundo Ab -> Primer Ab DF200 Pan2D gll83 1-4 Fl 1-7 F9 1-6 Fl 1-6 F5 (abajo) DF200 75% 20% 1270 75% 520 62% 550 16% 440 4% 320 200 460 420 Pan2D 95% 85% 2250 68% 880 15% 840 8% 560 18% 730 750 770 460 gll83 8% 40% 1300 75% 670 76% 530 18% nd 330 160 430 1-4 Fl 1140 82% 2400 63% 1240 73% 1050 87% 210 890 330 140 1-7 F9 770 42% 870 5% 800 75% 1000 63% 450 830 200 270 1-6 Fl 790 4% 990 0% 620 8% 760 1090 570 1-6 F5 800 5% 990 4% nd 760 950 H-1 Ol o Cp O Cp Tabla 4: mapeo del epítope KIR2DS1 <- Segundo Ab ->• EJEMPLO 8 Mapeo de epitopes de la unión DF200- y pan2D-a KIR2DL1 El modelaje por computadora de los dominios extracelulares de KIR2DL1, -2 y -3 (KIR2DL1-3) , se basa en sus estructuras cristalinas publicadas (Maenaka et al. (1999), Fann et al . , (2001), Boyington et al . (2000)), predijo la participación de los aminoácidos R131 (código de aminoácidos de una sola letra) en la interacción entre KIR2DL1 y los anticuerpos monoclonales de ratón con reacción cruzada KIR2DL1-3 ((mAb) DF200 y pan2D. Para verificar esto, se prepararon proteínas de fusión que consisten del dominio extracelular completo de KIR2DL1 (aminoácidos H1-H224), ya sea tipo silvestre o de punto mutado (por ejemplo, R131W) (sustitución de W por R en la posición 131 de aminoácidos (del término N) en KIR2DL1) , funcionado a Fe humano (hFc, por sus siglas en inglés) .
El material y los métodos utilizados para producir y evaluar las diversas proteínas de fusión KIR2DLl-hFc se han descrito (winter and Long (2000) ) . En resumen, se generaron KIR2DL1 (R131W) -hFc que codifican para los vectores de ADNc, mediante mutagénesis con base en PCR (Quickchange II, Promega) de CL42-Ig, un vector de ADNc publicado para la producción del KIR2DLl-hFc tipo silvestre (Wagtmann et al . (1995)). KIR2DLl-hFc y KIR2DL1 (R131W) -hFc se produjeron en células COS7 y se aislaron del medios para cultivo de tejidos, esencialmente como se describe (Wagtmann et al . , (1995)). Para probar su plegamiento correcto, se incubaron KIR2DLl-hFc y KIR2DL1 (R131W) -hFc con células LCL721.221 que expresan ya sea HLA-Cw3 (sin el ligando KIR2DL1) o HLA-Cw4 (ligando KIR2DL1) , y la interacción entre las proteínas de fusión KIR-Fc y las células analizadas mediante FACS, una técnica estándar para el estudio de interacciones de proteínas en la superficie celular. Un ejemplo de experimentos independientes se proporciona en la Figura 11, Panel A.
Como se predijo a partir de la literatura, ninguna de las proteínas de fusión KIR2DLl-hFc se unen a células LCL721.221 que expresan HLA-C 3. Por el contrario, tanto KIR2DLl-hFc como KIR2DL1 (R131W) -hFc se unen a células LCL721.221 que expresa HLA-Cw4, confirmando con esto su plegamiento correcto. La unión de KIR2DL1 y KIR2DLl-hFc (Rl31W)-hFc a los mAb KIR-específicos (DF200, pan2D, EBß y GL183) se estudió utilizando ELISA, una técnica estándar para estudiar las interacciones de proteínas. En resumen, KIR2DL1 (R131W)-hFc y KIR2DLl-hFc se unieron a placas de 96 cavidades vía los anticuerpos anti-humanos de cabra, después de lo cual se agregaron los mAb KIR-específicos a diversas concentraciones (0-1 µg/ml en PBS) . Las interacciones entre las variantes KIR2DLI-hFc y los mAb se visualizaron mediante espectrofotometría (450 nm) , utilizando anticuerpos secundarios peroxidasa-acoplados específicos para anticuerpos de ratón para convertir el sustrato TMB. Uno de los ejemplos de experimentos independientes se proporciona en la Figura 11, panel B. Mientras que el GL183 del mAb KIR2DL2-3-específico no es capaz de unirse a ninguna de las proteínas de fusión KIR2DLl-hFc el mAb KIR2DLl-específico EB6, DF200 y pan2D se unió a las variantes KIR2DLl-hFc en una forma dependiente de la dosis. La mutación puntual individual (R131W) afectó la unión de DF200 y pan2D con una reducción en la unión en comparación con el tipo silvestre de -10% a concentraciones mayores de Ab (1 µg/ml) , lo que confirma que R131 forma parte del sitio de unión de DF200 y pan2D en el dominio extra-celular 2 de KIR2DL1. Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, solicitudes de patente y patentes, citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada referencia se hubiera indicado individual y específicamente para estar incorporada como referencia y donde se muestre en su totalidad en la presente. Todos los títulos y subtítulos se utilizan en la presente por conveniencia únicamente y no se deben interpretar como limitantes de la invención de ninguna forma . Cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente y en todas las variaciones posibles de los mismos se abarca por la invención a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "uno" y "una" y "el" y referencias similares según se utilice en el contexto de la descripción de la invención se deben interpretar para cubrir tanto en el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. La mención de variaciones de valores en la presente pretende simplemente servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor por separado que esté dentro de la variación, a menos que se indique de otra manera en la presente, y cada valor por separado se incorpora en la especificación como si se mencionara individualmente en la presente. A menos que se establezca de otra manera, todos los valores exactos proporcionados en la presente son representativos de los valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los valores de ejemplo exactos proporcionados con respecto a un factor particular o medición se pueden considerar también para que proporcionen una medición aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente" cuando sea adecuado) .
Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualesquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como por ejemplo") proporcionados en la presente, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no posee una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se indique de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación se debe interpretar como indicador de que cualquier elemento es esencial para la práctica de la invención a menos que se establezca explícitamente. La cita e incorporación de los documentos de patente en la presente se realiza por conveniencia únicamente y no refleja ninguna visión de la validez, patentabilidad y/o la capacidad de hacer respetar estos documentos de patente. La descripción en la presente de cualquier aspecto o modalidad de la invención utilizando términos tales como por ejemplo "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar apoyo a un aspecto similar o modalidad de la invención que "consiste de" "consiste esencialmente de" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca de otra manera o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en la presente que comprende un elemento particular se debe entender como la descripción de una composición que consiste en ese elemento, a menos que se establezca de otra manera o se contradiga claramente por el contexto) . Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalente de la materia mencionada en los aspectos o reivindicaciones presentadas en la presente al grado máximo permitido por la ley aplicable .
LISTA DE SECUENCIAS <110> INNATE PHARMA ÜNIVERSITA DI GENOVA <120> Composiciones y métodos para regular la actividad de células NK <130> B0214WO <140> PCT/IB2004/002464 <141> 2004-07-01 <150> US 60/483,894 <151> 2003-07-02 <150> US 60/545,471 <151> 2004-02-19 <160> 12 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe lie Ser lie Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn He Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu He Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 115 120 125 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln He Phe Ser Phe Leu Leu He Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val He Met Ser Arg Gly Gln He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp He Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr He Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 He Lys Arg 130 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Thr Pro Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val He Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe He Ser Arg Leu Ser He Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asn Asp Thr Ala He Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Arg Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus usculus <400> 10 Gly Phe Ser Phe Thr Pro Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Val He Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe He Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Asn Pro Arg Pro Cly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10 REFERENCIAS Moretta, A., Bottino, C, Pende, D. , Tripodi, G. , Tambussi, G., Viale, 0., Orengo, A., Barbaresi, M., Merli, A., Ciccone, E., and et al. (1990). Identification of four subsets of human CD3-CD16+ natural killer (NK) cells by the expression of clonally distributed functional surface molecules: correlation between subset assignment of NK clones and ability to medíate specific alloantigen recognition. J Exp Med 172, 1589-1598.
Moretta, A., Vítale, M., Bottino, C, Orengo, A. M. , Morelli, L., Augugliaro, R., Barbaresi, M., Ciccone, E., and Moretta, L. (1993) . P58 molecules as putative receptors for major histocompatibility complex (MHC) class I molecules in human natural killer (NK) cells. Anti-p58 antibodies reconstitute lysis of MHC class I-protected cells in NK clones displaying different specificities . J Exp Med 178, 597-604.
Pende, D., Parolini, S., Pessino, A., Sivori, S., Augugliaro, R. , Morelli, L., Marcenaro, E., Accame, L., Malaspina, A., Biassoni, R. , et al. (1999). Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Medl90, 1505-1516.
Ruggeri, L., Capanni, M., Urbani, E., Perruccio, K., Shlomchik, W. D., Tosti, A., Posati, S., Rogaia, D., Frassoni, F., Aversa, F., et al. (2002). Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 295, 2097-2100.
Wagtmann N, Biassoni R, Cantoni C, Verdiani S, Malnati MS, Vítale M, Bottino C, Moretta L, Moretta A, Long EO.
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Saulquin X, Gastinel LN, Vivier E. Crystal structure of the human natural killer cell activating receptor KIR2DS2 (CD158J) J Exp Med. 2003 Apr 7; 197 (7): 933-8.
Gauthier, L., Lemmers, B., Guelpa-Fonlupt, V., Fougereau, M., and Schiff, C. µ-SLC physico-chemical interactions of the human preB cell receptor: implications for VH repertoire selection and cell signaling at the preB cell stage. Journal of Immunology, 162., 41-50. (1999).
Saunal, H. and Van Regenmortel, M. H. V., Mapping of viral conformation epitopes using biosensor measurements . Journal of Immunology, 183:33-41 (1995).
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Maenaka K; Juj i T; Stuart DI; Jones EY. Structure with Folding and design, Vol. 7 (4) pp. 391-398 (1999).
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Winter CC; Long EO. Natural Killer Cells Protocols (edited by Campbell KS and Colonna M) . Human Press, pp. 219-238 (2000) .

Claims (55)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK en las células NK que expresan al menos uno de los dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes.
  2. 2. El anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo no es NKVSFl. 3. El anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se une a KIR2DL1 y KIR2DL2/
  3. 3.
  4. 4. El anticuerpo según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unión de la molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de la molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos.
  5. 5. El anticuerpo según la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200.
  6. 6. El anticuerpo según la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
  7. 7. El anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal DF200 o un fragmento del mismo.
  8. 8. El anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, diacuerpos, fragmento de anticuerpo de cadena individual, o un anticuerpo multiespecífico que comprende varios fragmentos de anticuerpo diferentes.
  9. 9. El anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
  10. 10. Un hibridoma caracterizado porque comprende : a) un linfocito B proveniente de un hospedero mamífero no humano que se ha inmunizado con un antígeno que comprende un epítope presente en un polipéptido KIR inhibidor, fusionado a; b) una célula inmortalizada; en donde el hibridoma produce un anticuerpo monoclonal que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes y es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes.
  11. 11. El hibridoma según la reivindicación 10, caracterizado porque el hibridoma no produce el anticuerpo monoclonal NKVSFl.
  12. 12. El hibridoma según la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo se une a KIR2DL1 y KIR2DL2/3.
  13. 13. El hibridoma según la reivindicación 12, caracterizado porque el hibridoma produce un anticuerpo que inhibe la unión de una molécula del alelo HLA-c que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de una molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos.
  14. 14. El hibridoma según la reivindicación 12, caracterizado porque el hibridoma produce un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200.
  15. 15. El hibridoma según la reivindicación 14, caracterizado porque el hibridoma.es DF200.
  16. 16. Un método para producir un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferente, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK en una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR inhibidor; b) preparar los anticuerpos provenientes del animal inmunizado, en donde los anticuerpos se unen ál polipéptido KIR, c) seleccionar los anticuerpos de (b) que tienen reacción cruzada con al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, y d) seleccionar los anticuerpos de (c) que sean capaces de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, en donde se invierte opcionalmente el orden de los pasos (c) y (d) .
  17. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo seleccionado en el paso c) o d) no es NKVSFl.
  18. 18. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo preparado en el paso (b) es un anticuerpo monoclonal.
  19. 19. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido KIR inhibidor utilizado para la inmunización es un polipéptido KIR2DL y los anticuerpos seleccionados en el paso (c) tienen reacción cruzada con al menos KIR2DL1 y KIR2DL2/3.
  20. 20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo seleccionado en el paso (c) inhibe la unión de la molécula del alelo HLA-c que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de la molécula del alelo HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos.
  21. 21. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque los anticuerpos seleccionados en el paso (d) provocan una potenciación de al menos el aproximadamente 50% en la citotoxicidad NK.
  22. 22. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200.
  23. 23. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque comprende el paso adicional de producir fragmentos de los anticuerpos monoclonales seleccionados .
  24. 24. Un método para producir un anticuerpo que se une al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) seleccionar, a partir de una biblioteca o repertorio, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que tenga reacción cruzada con al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidor humano diferentes; y b) seleccionar un anticuerpo de (a) que sea capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresen al menos dos productos genéticos del receptor KIR2DL inhibidor humano diferentes.
  25. 25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo seleccionado en el paso b) no es NKVSFl.
  26. 26. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo seleccionado en el paso (b) inhibe la unión de la molécula del alelo HLA-c que tiene un residuo Lys en la posición 80 para un receptor KIR2DL1 humano, y la unión de una molécula de alelo de HLA-C que tiene un residuo Asn en la posición 80 para los receptores KIR2DL2/3 humanos.
  27. 27. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo seleccionado en el paso (b) provoca al menos una potenciación del 50% en la citotoxicidad NK.
  28. 28. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal DF200.
  29. 29. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque comprende el paso adicional de producir fragmentos de los anticuerpos monoclonales seleccionados .
  30. 30. Un método para producir un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) cultivar un hibridoma según cualquiera de las reivindicación 10 a 15 bajo condiciones que provoquen la expresión del anticuerpo monoclonal; y b) separar el anticuerpo monoclonal del hibridoma.
  31. 31. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque comprende el paso adicional de producir fragmentos del anticuerpo monoclonal.
  32. 32. Un método para producir un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizado porque el anticuerpo. es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre una población de células NK que expresan al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, el método comprende los pasos de: a) aislar de un hibridoma según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 el ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal; b) modificar opcionalmente el ADN para que codifique para un anticuerpo modificado o derivado seleccionado de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena individual, o un fragmento inmunorreactivo de un anticuerpo; c) insertar el ADN o ADN modificado en un vector de expresión, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de expresarse cuando el vector de expresión está presente en un hospedero desarrollado bajo condiciones adecuadas; d) transfectar una célula hospedera con el vector de expresión, en donde la célula hospedera no produce de otra manera la proteína inmunoglobulina; e) cultivar la célula hospedera transfectada bajo condiciones que provoquen la expresión del anticuerpo o fragmento del anticuerpo; y f) aislar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido por la célula hospedera transfectada.
  33. 33. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une al menos a dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizada porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre células NK que expresan al menos dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes, el anticuerpo está presente en una cantidad eficaz para potenciar detectablemente la citotoxicidad de células NK en un paciente o en una muestra biológica que comprende células NK; y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  34. 34. La composición según la reivindicación 33, caracterizada además porque comprende un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un agente apoptótico, un segundo anticuerpo que se une a e inhibe a un receptor KIR inhibidor, un agente anti-infeccioso, un agente blanco o un compuesto complementario.
  35. 35. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el agente inmunomodulador se selecciona de IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFNbeta o IFN-gamma.
  36. 36. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el agente quimioterapéutico se selecciona de agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotero, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16) , 5-fluorouracilo (5FU) , citosina arabinosido, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomycina-D, mitomicina-C, cisplatin (CDDP) , aminopterina, combretastatina (s) , otros vica-alquiloides, y derivados o profármacos de los mismos.
  37. 37. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el agente hormonal se selecciona de leuprorelina, goserelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifena, flutamida, nilutamida, anastrozol, exemestano, letrozol, fadrozol, medroxi, clormadinona, megestrol, otros antagonistas LHRH, otros anti-estrógenos, otros anti'-andrógenos, otros inhibidores de aromatasa, y otro progestágenos .
  38. 38. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el compuesto complementario se selecciona de fenotiazinas, benzamidas sustituidas, antihistaminas, butirofenonas, corticoesteroides, benzodiazepinas, cannabinoides; ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, eritropoietina y G-CSF, filgrastima, lenograstima, darbepoietina, otras darbepoietina antiemética, otros antagonistas de serotonina, otro bisfosfonatesores distintos a factores de crecimiento hematopoietico .
  39. 39. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque los agentes anti-apoptóticos son una secuencia nucleotídica anti-sentido, ARNi, ARNsi o un compuesto químico de molécula pequeña que inhibe la expresión de un gen seleccionado de bcr-abl, bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al o A20.
  40. 40. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el agente anti-angiogénico se selecciona de anticuerpos neutralizantes, ARN antisentido, ARNsi, ARNi, aptámeros o ríbosomas de ARN dirigidos contra un gen que codifica para VEGF, un gen que codifica para uno de los receptores VEGF, VEGF, o un receptor VEGF; o una variante de VEGF que posee propiedades antagónicas contra VEGF.
  41. 41. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque el segundo anticuerpo que se une e inhibe a un receptor KIR inhibidor es un anticuerpo o un derivado o fragmento del mismo que se une a un epítope de un receptor KIR inhibidor que difiere del epítope unido por el anticuerpo que se une a un determinante común presente en al menos dos diferentes productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes.
  42. 42. Un método para potenciar la actividad de las células NK en un paciente que necesita del mismo, caracterizado porque comprende el paso de administrar al paciente una composición según la reivindicación 33.
  43. 43. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente está padeciendo de cáncer, otro trastorno proliferativo, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmunológico.
  44. 44. El método según la reivindicación 43, caracterizado porque el paciente está padeciendo de carcinoma de célula escamosa, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkins, linfoma que no es de Hodgkins, linfoma de células pilosas, linfoma de Burketts, leucemias mielógenas agudas o crónicas, leucemia promielocítica, fibrosarcoma, rabdomioscarcoma; melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwannomas; fibrosarcoma, rabdomioscaroma, osteosarcoma, 'melanoma, xeroderma pigmentosu , queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo, teratocarcinoma, otro carcinoma de la vejiga, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, próstata, páncreas, estómago, cerviz, tiroides o piel, otros tumores hematopoieticos de linaje linfoideo, otros tumores hematopoieticos de linaje mieloideo, otros tumores de origen mesenquimatoso, otros tumores del sistema nervioso central o periférico u otros tumores de origen mesenquimatoso.
  45. 45. El método según la reivindicación 44, caracterizado porque el paciente está padeciendo un tumor hematopoietico de linaje linfoideo.
  46. 46. El método según la reivindicación 45, caracterizado porque el tumor se selecciona de leucemia T-prolinfocítica (T-PLL) incluyendo el tipo de célula pequeña y de célula cerebriforme; leucemia linfocítica granular grande (LGL) del tipo de linfocitos T; síndrome Sezary (SS) ; linfoma leucémico de linfocitos T en adultos (ATLL) ; T-NHL linfoma del hepatosplénico a/d; linfoma de linfocito T periférico/pos-tímico del subtipo pleomórfico o inmunoblástico; linfoma de linfocitos T angioinmunoblásticos; linfoma de linfocitos T angiocéntricos (nasales) ; linfoma de célula grande anaplástica (Ki 1+) ; linfoma de linfocitos T intestinales; leucemia T-linfoblástica o linforna/leucemia (T-Lbly/T-todos) .
  47. 47. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente está padeciendo de un trastorno proliferativo seleccionado de hiperplasias, fibrosis, angiogénesis, psoriasis, ateroesclerosis, estenosis o restenosis después de una angioplastia, y otras enfermedades caracterizadas por proliferación de músculo liso en vasos sanguíneos.
  48. 48. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente está padeciendo de una enfermedad infecciosa provocada por un virus seleccionado de hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, influenza, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (HSV-1) , herpes simplex tipo 2 (HSV-2) , rinderpest, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de papiloma, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, coxsackie virus, virus de parotiditis, virus de sarampión, virus de rubéola, virus de polio o virus de inmunodeficiencia humana tipo I o tipo 2 (VIH-1, VIH-2) .
  49. 49. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente está padeciendo de una enfermedad infecciosa provocada por una bacteria, protozoario o parásito seleccionado de Staphylococcus; S . pyogenes; Enterococcl; Bacillus, anthracis, Lactobacillus , Listeria; Corynebacterium diphtheriae; G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris ; Treponerna ; Camplyobacter, Raeruginosa; Legionella; N. gonorrhoeae, N. meningitides ; F. meningoseptícum; F. odoraturn; Brucella; B. pertussis y B. bronchi séptica; E. coli , Klebsíella ; Enterobacter, S. marcescens S. liquefaciens; Edwardsiella; P. írabilis; P. vulgaris; Streptobacillus; R. fickettsfi, C. psittaci; C. trachornatis; M. tuberculosis , M. intracellulare , M. folluiturn, M. laprae, M. aviu , M. bovís , M. africanum, M. kansasii , M. intracellulare; M. lepraernurium; Nocardia, otras Pseudomonas, otros Neisseria, otra Flavobacteria, otra Bordetella, otra Escherichia, otra Serratia, otra Proteus, otra Rickettsiaceae, otra Chlamydia, otra Micobacteria, leishmania, kokzidioa, trypanosoma, chlamydia o rickettsia.
  50. 50. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque comprende el paso adicional de administrar al paciente un agente terapéutico adicional adecuado seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un agente apoptótico, un segundo anticuerpo • que se une e inhibe un receptor KIR inhibidor, un agente anti-infeccioso, un agente blanco o un compuesto complementario en donde el agente terapéutico adicional se administra al paciente como una forma de dosificación individual junto con el anticuerpo, o como una forma de dosificación por separado.
  51. 51. El anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga o se une covalentemente a una toxina, una entidad detectable, o un soporte sólido.
  52. 52. Un método para detectar la presencia de células NK que portan un KIR inhibidor sobre su superficie celular en una muestra biológica o un organismo viviente, el método caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra biológica u organismo viviente con un anticuerpo según la reivindicación 51, en donde el anticuerpo se conjuga o se une covalentemente a una entidad detectable; y b) detectar la presencia del anticuerpo en la muestra biológica u organismo viviente.
  53. 53. Un método para purificar a partir de una muestra células NK que portan un KIR inhibidor sobre su superficie celular caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo según la reivindicación 51 bajo condiciones que permitan que las células NK porten un KIR inhibidor sobre su superficie celular para unirse al anticuerpo, en donde el anticuerpo se conjuga o se une covalentemente a un soporte sólido; y b) eluir las células NK unidas del anticuerpo conjugado o unido covalentemente a un soporte sólido.
  54. 54. Una composición que comprende un anticuerpo que se une a un determinante común presente sobre al menos dos productos genéticos del receptor KIR inhibidor humano diferentes, caracterizada porque el anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición suministrada por KIR de la citotoxicidad de células NK sobre las células NK que expresan al menos uno de los dos receptores KIR inhibidores humanos diferentes, en donde el anticuerpo se incorpora en un liposoma.
  55. 55. La composición según la reivindicación 54, caracterizada porque una sustancia adicional se seleccionada de una molécula de ácido nucleico para el suministro de genes para terapia génica; una molécula de ácido nucleico para el suministro de ARN antisentido, ARNi o ARNsi para suprimir un gen en una célula NK; o una toxina o un fármaco para el exterminio dirigido de células NK se incorpora adicionalmente en el liposoma.
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