NO20160264A1 - Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav. - Google Patents

Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav. Download PDF

Info

Publication number
NO20160264A1
NO20160264A1 NO20160264A NO20160264A NO20160264A1 NO 20160264 A1 NO20160264 A1 NO 20160264A1 NO 20160264 A NO20160264 A NO 20160264A NO 20160264 A NO20160264 A NO 20160264A NO 20160264 A1 NO20160264 A1 NO 20160264A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
kir2dl1
antibodies
cells
antibody fragment
Prior art date
Application number
NO20160264A
Other languages
English (en)
Other versions
NO342318B1 (no
Inventor
Søren Berg Padkjaer
Alessandro Moretta
Mariella Della Chiesa
Pascale Andre
Laurent Gauthier
Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Original Assignee
Univ Of Genoa
Innate Pharma Sas
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Of Genoa, Innate Pharma Sas, Novo Nordisk As filed Critical Univ Of Genoa
Publication of NO20160264A1 publication Critical patent/NO20160264A1/no
Publication of NO342318B1 publication Critical patent/NO342318B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

Oppfinnelsens område
Den foreliggende oppfinnelse angår antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som kryssreagerer med to eller flere inhibitoriske reseptorer som er tilstede på celleoverflaten til NK-celler og som forsterker NK-cellers cytotoksisitet i pattedyrindivider eller i en biologisk prøve. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for å fremstille slike antistoffer, fragmenter, varianter og derivater; farmasøytiske preparater som omfatter tilsvarende; og anvendelsen av slike molekyler og preparater, spesielt i terapi, for å øke NK-celleaktivitet eller
-cytotoksisitet i individer.
Bakgrunn
Naturlige dreper (NK)-celler er en underpopulasjon av lymfocytter, som er involvert i ikke-konvensjonell immunitet. NK-celler kan oppnås ved hjelp av ulike teknikker som er kjent for fagmannen, slik som fra blodprøver, cytaferesis, innsamlinger, osv.
Karakteristika og biologiske egenskaper til NK-celler inkluderer ekspresjonen av overflateantigener, inkludert CD16, CD56 og/eller CD57; fraværet av alfa/beta-eller gamma/delta TCR-komplekset på celleoverflaten; evnen til å binde til og drepe celler som ikke uttrykker "egne" MHC/HLA-antigener gjennom aktiveringen av spesifikke cytolytiske enzymer; evnen til å drepe tumorceller eller andre syke celler som uttrykker en NK-aktiverende reseptorligand; evnen til å frigjøre cytokiner som stimulerer eller hemmer immunresponsen; og evnen til å gjennomgå flere runder celledeling og fremstille datterceller med lignende biologiske egenskaper som foreldrecellen. I denne betydning av oppfinnelsen betyr "aktive" NK-celler biologiske aktive NK-celler, nærmere bestemt NK-celler som har evnen til å lysere målceller. F.eks. er en "aktiv" NK-celle i stand til å drepe celler som uttrykker en NK-aktiverende reseptorligand og som ikke uttrykker "egne" MHC/HLA-antigener (KIR-uforen elige celler).
Basert på deres biologiske egenskaper har det blitt foreslått ulike terapeutiske strategier og vaksinestrategier som er avhengig av en modulering av NK-celler. Imidlertid er NK-celleaktivitet regulert gjennom en kompleks mekanisme som involverer både stimulerende og inhibitoriske signaler. Effektiv NK-cellemediert terapi kan følgelig kreve både en stimulering av disse cellene og en nøytralisering av inhibitoriske signaler.
NK-celler er negativt regulert av det store histokompatibilitetskomplekset (major histocompatibility complex, MHC) klasse I-spesifikke inhibitoriske reseptorer (Karre et a., 1986; Ohlén et al., 1989). Disse spesifikke reseptorene binder til polymorfe determinanter av MHC klasse I-molekyler eller HLA tilstede på andre celler og hemmer NK-cellelysis. I mennesker gjenkjenner visse medlemmer av en familie av reseptorer kalt dreper-Ig-lignende reseptorer ("Killer lg-like receptors";KIR) grupper av HL A-klasse I-alleler.
KIR er en større reseptorfamilie som er tilstede på visse undergrupper av lymfocytter, inkludert NK-celler. Nomenklaturen for KIR er basert på antallet ekstracellulære domener (KIR2D eller KIR3D) og hvorvidt den cytoplasmatiske halen enten er lang (KIR2DL eller KIR3DL) eller kort (KIR2DS eller KIR3DS). Innenfor mennesker er nærværet eller fraværet av en gitt KIR variabel fra én NK-celle til en annen innenfor den NK-populasj onen som er tilstede i ett enkelt individ. Innenfor den humane populasjon er det også et relativt høyt nivå av KIR-molekylpolymorfisme, hvor visse KIR-molekyler er tilstede i enkelte men ikke i alle individer. Visse KIR-genprodukter forårsaker stimulering av lymfocyttaktivitet når de bindes til en passende ligand. De bekreftede stimulerende KIR har alle en kort cytoplasmatisk hale med en ladet transmembranrest som er forbundet med et adaptermolekyl som har et immunostimulerende motiv (ITAM). Andre KIR-genprodukter er av natur inhibitoriske. Alle bekreftede inhibitoriske KIR har en lang cytoplasmatisk hale og synes å reagere med ulike undersett av HLA-antigener avhengig av KIR-undertypen. Inhibitoriske KIR har i deres intracytoplasmatiske del én eller flere inhibitoriske motiv som rekrutterer fosfataser. De kjente inhibitoriske KIR-reseptorer inkluderer medlemmer av KIR2DL- og KIR3DL-underfamiliene. KIR-reseptorer med to Ig-domener (KIR2D) identifiserer HLA-C-allotyper: KIR2DL2 (tidligere kalt p58.2) eller det nært beslektede genproduktet KIR2DL3 gjenkjenner en epitop som deles av gruppe 2 HLA-C-allotyper (Cwl, 3, 7 og 8), mens KIR2DL1 (p58.1) gjenkjenner en epitop som deles av de tilsvarende gruppe 1 HLA-C-allotyper (Cw2, 4, 5 og 6). Gjenkjennelsen av KIR2DL1 dikteres av nærværet av en Lys-rest i posisjon 80 i HLA-C-alleler.
KIR2DL2- og KIR2DL3-gjenkjenning dikteres av nærværet av en Asn-rest i posisjon 80. Hovedsakelig har hovedandelen av HLA-C-alleler enten en Asn- eller en Lys-rest i posisjon 80. En KIR med tre Ig-domener, KIR3DL1 (p70) gjenkjenner en epitop som deles av HLA-Bw4-alleler. Endelig gjenkjenner en homodimer av molekyler med tre Ig-domener KIR3DL2 (pl40) HLA-A3 og -Al 1.
Selv om inhibitoriske KIR og andre klasse I-inhibitoriske reseptorer (Moretta et al., 1997; Valiante et al., 1997a; Lanier, 1998) kan uttrykkes sammen i NK-celler er det i ethvert individs NK-repertoar celler som uttrykker én enkelt KIR og følgelig tilsvarende NK-celler som kun blokkeres av celler som uttrykker én bestemt klasse I-spesifikk allelgruppe.
NK-cellepopulasjonen eller kloner som er KIR-feiltilpasset (mismatched), dvs. hvor NK-cellepopulasjonen som uttrykker KIR ikke er kompatibel med et HLA-molekyl i en vert, er vist å være den mest sannsynlige mediator til anti-leukemitransplantateffekten som ses i allogene transplantasjoner (Ruggeri et al., 2002). En måte å reprodusere denne virkningen i et gitt individ vil være å anvende reagenser som blokkerer KIR/HLA-interaksjonen.
Monoklonale antistoffer som er spesifikke for KIR2DL1 er vist seg å blokkere interaksjonen til KIR2DL1 med Cw4 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al., 1993). Monoklonale antistoffer mot KIR2DL2/3 er også blitt beskrevet å blokkere interaksjonen av KIR2DL2/3 med HLACw3 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al., 1993). Anvendelsen av slike reagenser i kliniske situasjoner ville imidlertid kreve utviklingen av to terapeutiske mAb for å behandle alle pasienter uavhengig av hvorvidt enhver gitt pasient uttrykte klasse 1- eller klasse 2-HLA-C-alleler. Man måtte ha på forhånd bestemt hvilken HLA-type hver pasient uttrykte før man bestemte hvilket terapeutiske antistoff som skulle anvendes, noe som følgelig ville resultere i mye høyere behandlingskostnader.
Watzl et al., Tissue Anti<g>ens. 56, s. 240 (2000) produserte kryssreagerende antistoffer som gjenkjenner flere KIR-isotyper, men disse antistoffene hadde ikke den NK-celleaktiverende effekten. G. M. Spaggiara et al., Blood. 100, side 4098-4107 (2002) utførte eksperimenter hvor et antall monoklonale antistoffer mot ulike KIR ble utnyttet. Ett av disse antistoffene, NKVSF1, ble sagt å gjenkjenne en kjent epitope i CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) og p50.3 (KIR2DS4). Det er ikke foreslått at NKVSF1 kan øke NK-celleaktivitetseffekten og det er ikke foreslått at det kan anvendes som et terapeutisk middel. Praktiske og effektive tilnærminger i moduleringen av NK-celleaktivitet har følgelig ikke så langt blitt gjort tilgjengelig, og det er fortsatt et behov for HLA-all el spesifikke intervensjoner ved anvendelse av spesifikke reagenser.
Sammendrag av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nå nye antistoffer, preparater og fremgangsmåter som løser de for tiden eksisterende vanskelighetene ved NK-celleaktivering og tilveiebringer ytterligere fordelaktige trekk og fordeler. I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen ett enkelt antistoff som letter aktiveringen av humane NK-celler i så å si alle mennesker. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen nye spesifikke antistoffer som kryssreagerer med ulike inhibitoriske KIR-grupper og som nøytraliserer deres inhibitoriske signaler og følgelig resulterer i forsterkning av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker slike inhibitoriske KIR-reseptorer. Denne evnen til å kryssreagere med flere KIR-genprodukter tillater at antistoffene ifølge oppfinnelsen effektivt kan anvendes for å øke NK-celleaktivitet i de fleste mennesker uten den byrde eller kostnad som finnes ved å på forhånd måtte bestemme HLA-type til individet.
I et første aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med idet et minste to inhibitoriske KIR-reseptorer på overflaten til NK-celler, nøytraliserer de inhibitoriske signalene til NK-cellene og forsterker NK-celleaktivitet Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant av humant KIR2DL-reseptorer. Nærmere bestemt binder antistoffene ifølge denne oppfinnelsen til i det minste KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorer. For formålet ved denne oppfinnelsen viser betegnelsen "KIR2DL2/3" til enten den ene eller begge av KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorene. Disse to reseptorene har en svært høy homologi, er antagelig alleliske former av det samme genet, og betraktes innen fagområdet som å være forvekslbare. KIR2DL2/3 betraktes følgelig som ett enkelt inhibitorisk KIR-molekyl for formålet ved denne oppfinnelsen og et antistoff som kryssreagerer med kun KIR2DL2 og KIR2DL3 og ikke andre inhibitoriske KIR-reseptorer er følgelig ikke innenfor rammen av denne oppfinnelsen.
Antistoffet ifølge denne oppfinnelsen inhiberer spesifikt bindingen av MHC- eller HLA-molekyler til i det minte to inhibitoriske KIR-reseptorer og fasiliterer NK-celleaktivitet. Begge aktiviteter omfattes av betegnelsen "nøytralisere den inhibitoriske aktiviteten til KIR" som anvendt heri. Evnen til antistoffene ifølge oppfinnelsen til å "fasilitere NK-celleaktivitet", "fasilitere NK-cellecytotoksisitet", "fasilitere NK-celler", " forsterke NK-celleaktivitet", " forsterke NK-cellecytotoksisitet" eller "forsterke NK-celler i denne oppfinnelsen betyr at antistoffene tillater at NK-celler uttrykker en inhibitorisk KIR-reseptor på overflaten er i stand til å lysere celler som uttrykker på deres overflate en korresponderende ligand for den spesifikke inhibitoriske KIR-reseptor (f.eks. et spesifikt HLA-antigen). I ett spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som spesifikt hemmer bindingen av HLA-C-molekyler til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptorer. I et annet spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som fasiliterer MK-celleaktivitet in vivo.
Fordi i det minste én av KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 er tilstede i det minste omtrent 90 % av den humane populasjon er de mer foretrukne antistoffer ifølge denne oppfinnelsen i stand til å fasilitere NK-celleaktivitet mot de fleste HLA-C-allotypeassosierte celler, henholdsvis gruppe 1 HLA-C-allotyper og gruppe 2 HLA-C-allotyper. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan følgelig anvendes for effektivt å aktivere eller å forsterke NK-celleeffekten i de fleste humane individer, vanligvis i omtrent 90 % av de humane individene eller mer. Ett enkelt antistoffpreparat ifølge den foreliggende oppfinnelse kan følgelig anvendes for å behandle de fleste mennesker og det er sjelden et behov for å bestemme allelegrupper eller å anvende antistoffcocktailer.
Oppfinnelsen viser, for første gang, at kryssreaktive og nøytraliserende antistoffer mot inhibitoriske KIR kan dannes, og at slike antistoffer tillater effektiv aktivering av NK-celler i et bredt spekter av humane grupper.
Et spesifikt formål ved den foreliggende oppfinnelse er derfor et antistoff, hvor nevnte antistoff spesifikt binder både til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer og reverserer inhibering av NK-cellecytotoksisitet mediert gjennom disse KIR. I én utførelsesform konkurrerer antistoffet med monoklonalt antistoff DF200 fremstilt av hybridom DF200. Eventuelt er nevnte antistoff som konkurrerer med antistoff DF200 ikke antistoff DF200.
I en annen utførelsesform konkurrerer antistoffet med det monoklonale antistoffet NKVSF1, eventuelt hvori antistoffet som konkurrerer med antistoff NKVSF1 ikke er antistoffet NKVSF1.
I en annen utførelsesform konkurrerer antistoffet med antistoff 1-7F9.
Fortrinnsvis er nevnte antistoffer kimere antistoffer, humaniserte antistoffer eller humane antistoffer.
Betegnelsen "konkurrerer med", med henvisning til et spesifikt monoklonalt antistoff (f.eks. DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183), betyr at antistoffet konkurrerer med det monoklonale antistoffet (f.eks. DF200, NKSVF1, 1-7F9, EB6, GLI83) i en bindingsanalyse som anvender enten rekombinante KIR-molekyler eller overflateuttrykte KIR-molekyler. Dersom et antistoff reduserer bindingen av DF200 til et KIR-molekyl i en bindingsanalyse konkurrerer f.eks. antistoffet med DF200. Et antistoff som "konkurrerer" med DF200 kan konkurrere med DF200 for binding til KIR2DLl-human reseptor, KIR2DL2/3-human reseptor eller både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer.
I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3-humane reseptorer, reverserer inhiberingen av NK-celletoksisitet mediert gjennom disse KIR og konkurrerer med DF200, 1-7F9 eller NKVSF1 for bindingen til KIR2DL1-human reseptor, KIR2DL2/3-humane reseptor eller både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer. Eventuelt er nevnte antistoff ikke NKVSF1. Eventuelt er antistoffet et kimert, humant eller humanisert antistoff.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3-humane reseptorer, reverserer inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet mediert gjennom disse KIR og konkurrerer med EB6 for bindingen til KIR2DL1-human reseptor, konkurrerer med GL 183 for bindingen til KIR2DL2/3-human reseptor eller konkurrerer med både EB6 for bindingen til KIR2DL1-human reseptor og GL 183 for bindingen til KIR2DL2/3-human reseptor. Eventuelt er nevnte antistoff ikke NKVSF1; eventuelt er nevnte antistoff ikke DF200. Eventuelt er nevnte antistoff et kimert, humant eller humanisert antistoff.
I et fordelaktig aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som konkurrerer med DF200 og gjenkjenner, binder til eller har immunspesifisitet for vesentlig eller essensielt den samme, eller den samme epitop, eller "epitopsete" på et KIR-molekyl som det monoklonale antistoffet DF200. Fortrinnsvis er KIR-molekyklet en KIR2DL1-human reseptor eller en KIR2DL2/3-human reseptor.
Et bestemt formål ved denne oppfinnelsen angår et antistoff, hvori nevnte antistoff binder en kjent determinant tilstede i både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer og som reverserer inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet mediert gjennom disse KIR. Antistoffet binder nærmere bestemt til vesentlig den samme epitopen på KIR som det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridom DF200 eller antistoff NKVSF1 fremstilt av hybridomen NKVSF1, hvori antistoffet ikke er NKVSF1.
I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ifølge denne oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Det mest foretrukne antistoffet ifølge denne oppfinnelsen er det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridom DF200.
Hybridomen som fremstiller antistoffet DF200 er deponert ved CNCM culture collection, som identifiseringsnummer "DF200", registreringsnummer CNCM 1-3224, registrert 10. juni 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Frankrike. Antistoffet NKVSF1 er tilgjengelig fra Serotec (Cergy Sainte-Christope, Frankrike), katalogreferansenummer MCA2243. NKVSF1 er også kalt pan2D mAb heri.
Oppfinnelsen tilveiebringer også funksjonelle fragmenter og derivater av antistoffene beskrevet heri, med vesentlig tilsvarende antigenspesifisitet og aktivitet (f.eks. som kan kryssbinde med foreldreantistoffet og som forsterker den cytotoksiske aktivitetseffekten av NK-celler som uttrykker inhibitoriske KIR-reseptorer), inkludert, uten begrensning, et Fab-fragment, et Fab'2-fragment, et immunadhesin, et diastoff (diabody), en CDR, en ScFv. Videre kan antistoffene ifølge oppfinnelsen være humaniserte, humane eller kimere.
Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffderivater som omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, et radionuklid, en detekterbar enhet (f.eks. fluor) eller en fast støtte.
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff som beskrevet ovenfor, et fragment derav eller et derivat av disse. Følgelig angår oppfinnelsen også anvendelsen av et antistoff som beskrevet heri i en fremgangsmåte for fremstillingen av et medikament. I en foretrukket utførelsesform er medikamentet eller det farmasøytiske preparatet for behandlingen av en kreft eller andre prolifererende sykdommer, en infeksjon eller for anvendelse i transplantasjon.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et preparat som omfatter et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på NK-celler som uttrykker i det minste én av de nevnte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorene, hvori nevnte antistoff er inkorporert i et liposom. Eventuelt omfatter nevnte preparat en ytterligere forbindelse valgt fra et nukleinsyremolekyl for å levere gener for genterapi; et nukleinsyremolekyl for levering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for å undertrykke et gen i en NK-celle; eller et toksin eller et medikament for målrettet dreping av NK-celler ytterligere inkorporert i nevnte liposom.
Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å regulere human NK-celleaktivitet in vitro, ex vivo eller in vivo, som omfatter å bringe humane NK-celler i kontakt med en effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen, et fragment av et slikt antistoff, et derivat derav, eller et farmasøytisk derivat som omfatter i det minste ett av disse. Foretrukne fremgangsmåter omfatter administrering av en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat ifølge denne oppfinnelsen og er rettet mot å øke den cytotoksiske aktiviteten til humane NK-celler, mest foretrukket ex vivo eller in vivo, i et individ med en kreft, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en hybridom som omfatter: (a) en B-celle fra en pattedyrvert (typisk en ikke-human pattedyrvert) som er immunisert med et antigen som omfatter en epitop som er tilstede på et inhibitorisk KIR-polypeptid fusert til (b) en udødeliggjort celle (f.eks. en myelomcelle), hvori nevnte hybridom fremstiller et monoklonalt antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorer og som er i stand til i det minste vesentlig å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorer. Eventuelt fremstiller ikke nevnte hybridom det monoklonale antistoffet NKVSF1. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff KIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptorer. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Fortrinnsvis fremstiller nevnte hybridom et antistoff som hemmer bindingen av et F£LA-c-allelmolekyl med en Lyr-rest i posisjon 80 i en humant KIR2DL1-reseptor og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 i human KIR2DL2/3-reseptorer. Fortrinnsvis fremstiller nevnte hybridom et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridomen DF200 på enten KIR2DL1 eller KR2DL2/3 eller både KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Et eksempel på en slik hybridom er DF200.
Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille et antistoff som kryssbinder med flere KIR2DL-genprodukter og som nøytraliserer den inhibitoriske aktiviteten til slike KIR, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: (a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et KIR2DL-polypeptid; (b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr, hvori nevnte antistoffer binder til nevnte KIR2DL-polypeptid; (c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssbinder med i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter; og (d) å velge ut antistoffer fra (c) som forsterker NK-celleaktiviteten. I én utførelsesform er det nevnte ikke-humane pattedyret et transgent dyr som er
fremstilt for å kunne uttrykke et humant antistoffrepertoar (f.eks. et ikke-humant pattedyr som omfatter et humant immunoglobulinloki og native immunoglobulin gendel esj oner, slik som en Xenomouse™ (Abgenix - Fremont, CA, USA) eller ikke-humant pattedyr som omfatter et minilokus av humane Ig-kodende gener, slik som HuMab-mus™ (Medarex - Princeton, NJ, USA). Eventuelt omfatter fremgangsmåten ytterligere utvelgelse av et antistoff som binder et primat, fortrinnsvis et cynomologusape, NK-celle- eller KIR-polypeptid. Eventuelt omfatter oppfinnelsen ytterligere en fremgangsmåte for å vurdere et antistoff, hvori et antistoff fremstilt ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåten administreres til en primat, fortrinnsvis en cynomologusape, fortrinnsvis hvori apen observeres for nærværet eller fraværet av en indikasjon på toksisitet av antistoffet.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene: a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et inhibitorisk KIR-polypeptid; b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoff binder til nevnte KIR-polypeptid; c) velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter og velge ut antistoffer fra (c) som
er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori rekkefølgen på trinn (c) og (d) er likegyldige og ethvert antall trinn eventuelt kan repeteres én eller flere ganger. Fortrinnsvis er det inhibitoriske KIR-polypeptidet som er anvendt for immunisering et KIR2DL-polypeptid og antistoffet som er utvalgt i trinn (c) kryssreagerer med i det minste KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Fortrinnsvis gjenkjenner nevnte antistoff en kjent determinant som er tilstede på i det minste to ulike KIR-reseptorgenprodukter; mest foretrukket er nevnte KIR KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Eventuelt omfatter nevnte fremgangsmåte ytterligere utvelgelse av et antistoff som binder en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Eventuelt omfatter oppfinnelsen ytterligere en fremgangsmåte for å evaluere et antistoff, hvori et antistoff fremstilt ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåte administreres til en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, fortrinnsvis hvor apen observeres for nærværet eller fraværet av en indikasjon på toksisitet av antistoffet.
I de ovenfor beskrevne fremgangsmåter er antistoffet utvalgt i trinn c) eller d) eventuelt ikke NKVSF1. Antistoffet fremstilt i trinn (b) i de ovenfor angitte fremgangsmåter er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff. Fortrinnsvis hemmer antistoffet utvalgt i trinn (c) i de ovenfor angitte fremgangsmåter bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL-reseptor, og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humant KIR2DL2/3-reseptorer. Antistoffene utvalgt i trinn (d) i de ovenfor angitte fremgangsmåter forårsaker fortrinnsvis en økning i NK-cytotoksisitetseffekt, f.eks. enhver vesentlig økning, eller i det minste 5 %, 10 %, 20 %, 30 % eller større økning i NK-cytotoksisitetseffekt, f.eks. i det minste omtrent 50 % økning i mål-NK-cytotoksisitet (f.eks. i det minste 60 %, i det minste omtrent 70 %, i det minste omtrent 80 %, i det minste omtrent 85 %, i det minste omtrent 90 %, eller i det minste omtrent 95 % (slik som f.eks. omtrent 65-100 %) økning i NK-cellecytotoksisitetseffekt). Antistoffet binder fortrinnsvis til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Eventuelt eller alternativt omfatter nevnte fremgangsmåter også det ytterligere trinnet å fremstille fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffene, danne derivater av de utvalgte monoklonale antistoffene (f.eks. gjennom konjugering med et radionuklid, cytotoksisk middel, markørmolekyl eller lignende), eller å danne derivater av antistoffragmenter fremstilt fra eller som omfatter sekvenser som korresponderer til sekvensene i slike monoklonale antistoffer.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon av NK-celler som uttrykker det nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: (a) å velge, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff eller et antistoffragment som kryssreagerer med i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter, og (b) å velge et antistoff fra (a) som er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter. Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Eventuelt er nevnte antistoff utvalgt i trinn (b) ikke NKVSF1. Antistoffet utvalgt i trinn (b) hemmer fortrinnsvis bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1-reseptor og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humant KIR2DL2/3-reseptorer. Fortrinnsvis forårsaker antistoffet utvalgt i trinn (b) en forsterkning av NK-cytotoksisitet, f.eks. enhver vesentlig forsterkning, eller i det minste 5 %, 10 %, 20 %, 30 % eller større forsterkningi NK-cytotoksisit eks. en i det minste omtrent 50 % forsterkning av mål-NK-cytotoksisit(f.eks. i det minste omtrent 60 %, i det minst 70 %, i det minste 80 %, i det minste 90 %, eller i det minste 95 % (slik som f.eks. omtrent 65-100 %) forsterkning av NK- cellecytotoksisitet). Fortrinnsvis binder antistoffet til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Eventuelt omfatter fremgangsmåten det ytterligere trinn å danne fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffer, fremstille derivater av de utvalgte monoklonale antistoffer, eller å danne derivater av utvalgte monoklonale antistoffragmenter.
I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) å dyrke en hybridom ifølge oppfinnelsen under betingelser som tillater fremstillingen av nevnte monoklonale antistoff; og
b) separere nevnte monoklonale antistoff fra nevnte hybridom.
Eventuelt omfatter fremgangsmåten det ytterligere trinn å danne fragmenter av
nevnte monoklonale antistoff, danne derivater av nevnte monoklonale antistoff eller danne derivater av slike monoklonale antistoffragmenter. Fortrinnsvis binder antistoffet en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) å isolere fra en hybridom ifølge oppfinnelsen en nukleinsyre som koder for nevnte monoklonale antistoff; b) eventuelt modifisere nevnte nukleinsyre for på den måten å oppnå en modifisert nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder for et modifisert eller derivatisert antistoff som omfatter en aminosyresekvens som svarer til en funksjonell sekvens i det monoklonale antistoffet eller er vesentlig tilsvarende til dette (f.eks., er i det minste 65 %, i det minste omtrent 75 %, i det minte omtrent 85 %, i det minste omtrent 90 %, i det minste omtrent 95 % (slik som omtrent 70-99 %) identisk til en slik sekvens) utvalgt fra et humanisert antistoff, et kimert antistoff, et enkeltkjedeantistoff, et immunreaktivt fragment av et antistoff, eller et fusjonsprotein som omfatter et slikt immunreaktivt fragment; c) sette nevnte nukleinsyre eller modifiserte nukleinsyre (eller beslektede nukleinsyrer som koder for den samme aminosyresekvensen) inn i en ekspresjonsvektor, hvori nevnte kodede antistoff eller antistoffragment kan uttrykkes når nevnte ekspresjonsvektor er tilstede i en vertscelle som dyrkes under passende betingelser; d) transfektere en vertscelle med nevnte ekspresjonsvektor, hvori nevnte vertscelle ikke ellers produserer immunglobulinprotein; e) dyrke nevnte transfekterte vertscelle under betingelser som forårsaker ekspresjon av nevnte antistoff eller antistoffragment; og f) isolere antistoffet eller antistoffragmentet fremstilt av nevnte transfekterte evertscelle. Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant som er tilstede på
KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Det skal forstås at oppfinnelsen også tilveiebringer et preparat som omfatter et antistoff som binder til i det minte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff kan nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker i det minste én av de nevnte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorene, hvor nevnte antistoff er tilstede i en mengde som effektivt og detekterbart forsterker NK-cellecytotoksisitet en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler; og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient. Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Nevnte preparat kan eventuelt ytterligere omfatte et andre terapeutisk middel valgt fra f.eks. et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som binder til og hemmer en inhibitorisk KIR-reseptor, et antiinfeksjonsmiddel, et målbindende middel eller en adjunktforbindelse. Fordelaktige immunmodulerende midler kan velges fra IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-32, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa,
TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF,
IFN-alfa, IFN-beta eller IFN-gamma. Eksempler på nevnte kjemoterapeutiske middel inkluderer alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, daunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksotere, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin, kombretastatin(er) andre vinkaalkyloider og derivater eller forløpermedikamenter derav. Eksempler på hormonelle midler inkluderer leuprorelin, goserelin, triptorelin, buserelin, tamoksifen, toremifen, flutamid, nilutamid, cyprosteron bikalutamidanastrozol, eksemestan, letrozol, fadrozol medroksy, klormadinon, megestrol, andre LHRH-agonister, andre anti-østrogener, andre anti-androgener, andre aromataseinhibitorer og andre progestagener. Fortrinnsvis er nevnte andre antistoff som binder til en epitop på en inhibitorisk KIR-reseptor som er forskjellig fra epitopen som binder til nevnte antistoff som binder til en kjent determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å påvise forsterkning av NK-celleaktivitet i en pasient med behov for slik økning, omfattende trinnene å administrere til nevnte pasient et preparat ifølge oppfinnelsen. En pasient med behov for NK-celleaktivitetseffektforsterkning kan være enhver pasient som har en sykdom eller lidelse hvor slik økning kan promotere, forsterke og/eller indusere en terapeutisk effekt (eller promotere, forsterke og/eller indusere en slik effekt i det minste i en vesentlig andel av pasientene med sykdommen eller lidelsen og vesentlig lignende egenskaper som pasienten - som kan bestemmes gjennom f.eks. kliniske forsøk). En pasient med behov for slik behandling kan lide av f.eks. kreft, andre proliferative sykdommer, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom. Fortrinnsvis omfatter nevnte fremgangsmåte det ytterligere trinn å administrere til nevnte pasient et ytterligere passende terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som binder til og hemmer en inhibitorisk KIR-reseptor, et antiinfeksjonsmiddel, et målbindende middel eller en adjunktforbindelse hvor nevnte ytterligere terapeutiske middel administreres til pasienten som én enkelt doseringsform sammen med nevnte antistoff, eller som separate doseringsformer. Doseringen av antistoffet (eller antistoffragmentet/-derivåtet) og doseringen av det ytterligere terapeutiske midlet samlet er tilstrekkelig for å påviselig indusere, promotere og/eller forsterke en terapeutisk respons i pasienten som omfatter økningen av NK-celleaktivitetseffekt. Når de administreres separat er det ønskelig at antistoffet, fragmentet eller derivatet og det ytterligere terapeutiske midlet administreres under betingelser (f.eks. med hensyn på timing, antall doser, osv.) som resulterer i en påviselig kombinert terapeutisk fordel for pasienten.
Ytterligere omfattet av den foreliggende oppfinnelse er antistoffer ifølge oppfinnelsen som er i stand til å spesifikt binde ikke-human primat, fortrinnsvis ape, NK-celler og/eller ape-KIR-reseptorer. Fremgangsmåter for å evaluere toksisitet, dosering og/eller aktivitet eller effektivitet av antistoffer ifølge oppfinnelsen som er kandidatmedikamenter er også omfattet av oppfinnelsen. I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise en dose av et antistoff som er toksisk for et dyr eller målvev ved å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til et ikke-humant mottakerprimatdyr med NK-celler og vurdere enhver toksisk eller skadelig eller bivirkning av midlet på dyret eller fortrinnsvis på målvevet. I et annet aspekt er oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er toksisk for et dyr eller målvev ved å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til en ikke-human mottakerprimatdyr med NK-celler og vurdere enhver toksisk eller skadelig eller bivirkninger av midlet på dyret, eller fortrinnsvis på et målvev. I et annet aspekt er oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er effektivt i behandling av en infeksjon, sykdom eller tumor ved å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til en ikke-humant primatmodell for infeksjon, sykdom eller kreft, å identifisere antistoffet som lindrer infeksjonen, sykdommen eller kreften eller et symptom derav. Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen et antistoff som (a) kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer på overflaten til humane NK-celler, og (b) kryssreagerer med NK-celler eller en KIR-reseptor på en ikke-human primat.
Ytterligere omfatter den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å påvise nærværet av NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på deres celleoverflate i en biologisk prøve eller i en levende organisme, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) å bringe nevnte biologiske prøve eller levende organisme i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen, hvori nevnte antistoff er konjugert eller kovalent
bundet til en påviselig enhet; og
b) påvise nærværet av nevnte antistoff i nevnte biologiske prøve eller levende organisme.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å rense fra en prøve av NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på deres celleoverflate, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene: a) å bringe nevnte prøve i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen under betingelser som tillater at nevnte NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på deres celleoverflate binder til nevnte antistoff, hvori nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet til en fast støtte (f.eks. en kule, en matriks, osv.); og b) eluere nevnte bundede NK-celler fra nevnte antistoff konjugert eller kovalent bundet til en fast støtte.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av dette som omfatte den lette variable regionen eller én eller flere lette variable regioner CDR av antistoff DF200 eller antistoff Pan2D som illustrert i fig. 12.1 enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av slike som omfatter en sekvens som er svært lik til hele eller vesentlig hele den lette variable regionsekvensen til DF200 eller Pan2D eller én eller flere av de lette variable regioner CDR til én eller begge av disse antistoffene.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antitoffragment eller derivat av disse som omfatter den tunge variable regionen eller én eller flere lette variable regioner, CDR, til antistoff DF200 som illustrert i fig. 13.1 enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av slike som omfatter en sekvens som er svært lik til hele eller vesentlig hele den tunge variable regionsekvensen til DF200.
Disse og ytterligere fordeler og trekk ved oppfinnelsen er ytterligere beskrevet andre steder heri.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 viser monoklonalt antistoff DF200 som binder til en kjent determinant på ulike humane KIR2DL-reseptorer. Fig. 2 viser monoklonalt antistoff DF200 som nøytraliserer KIR2DL-mediert hemming av KIR2DL1 -positive NK-cellecytotoksisitet på Cw4-positive målceller. Fig. 3 viser monoklonalt antistoff DF200, et Fab-fragment av DF200 og KIR2DL1-eller KIR2DL2/3-spesifikke, konvensjonelle antistoffer som nøytraliserer den KIR2DL-medierte hemmingen av KIR2DL1 -positive NK-cellecytotoksisitet på Cw4-positive målceller og den KIR2DL-medierte hemmingen av KIR2DL2/3-positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw3-positive målceller. Fig. 4 viser rekonstitusjon av cellelysis av NK-kloner av HLA Cw4-positive målceller i nærværet av F(ab')2-fragmenter av DF200 og EB6-antistoffer. Fig. 5 og 6 viser monoklonale antistoffer DF200, NKVSF1 (pan2D), humane antistoffer 1-7F9, 1-6F5 og 1-6F1 og KIR2DL1- eller KIR2DL2/3-spesifikke konvensjonelle antistoffer som nøytraliserer KIR2DL-mediert hemming av KIR2DL1-positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw4-positive målceller (Cw4-transfekterte celler i fig. 5 og EBV-celler i fig. 6). Fig. 7 viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd gjennom overflateplasmonresonans (BIAcore<®>)-analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL1, hvor overlappende sirkler angir overlapp i binding til KIR2DL1. Resultater viser at 1-7F9 er kompetitiv med EB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200 på KIR2DL1. Antistoff 1-4F1 er på sin side kompetitiv med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7F9. Antistoff NK V SF 1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1. DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1. Fig. 8 viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd ved hjelp av BIAcore<®->analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL3, hvor overlappende sirkler angir overlapp i binding til KIR2DL3. Resultatene viser at 1-4F1 er komeptitiv med NKVSF1, DF200, gl 183 og 1-7F9 på KIR2DL3. 1-7F9 er kompetitiv med DF200, gl 183, og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 på KIR2DL3. NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GLI83, men ikke med 1-7F9, på KIR2DL3. DF200 konkurrer med NKVSF1, 1-4F1, og 1-7F9, men ikke med GLI83, på KIR2DL3. Fig. 9 viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd ved hjelp av BIAcore<®->analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DS1, hvor overlappende sirkler angir overlapp i binding til KIR2DS1. Resultatene viser at antistoff 1-4F1 er kompetitivt med NKVSF1, DF200 og 1-7F9 på KIR2DS1. Antistoff 1-7F9 er kompetitivt med 1-4F1 men ikke kompetitivt med DF200 og NKVSF1 på KIR2DS1. NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1. DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1 men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1. Fig. 10 viser NKVSF1 (pan2D) mAb-titrering som demonstrerer bindingen av mAb til cynomolgus NK-celler. Cynomolgus NK-celler (NK bulk dag 16) ble inkubert med ulike mengder Pan2D mAb etterfulgt av PE-konjugert geite F(ab')2-fragmenter av anti-mus IgG (H+L)-antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt med en isotypisk kontroll (renset muse IgGl). Prøvene ble utført i duplikat. Gjennomsnittelig fluorescensintensitet = MFL Fig. 12 tilveiebringer en komparativ sammenstilling av aminosyresekvensene til de lette variable regionene og lette variable regionene CDR til antistoffene DF200 og Pan2D mAb.
Fig. 13 tilveiebringer den tunge variable regionen til antistoff DF200.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Antistoffer
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye antistoffer og fragmenter eller derivater derav som binder kjente determinanter av humane inhibitoriske KIR-reseptorer, fortrinnsvis en determinant som er tilstede på i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter og forårsaker økning av NK-celleekspresjonseffekt av i det minste én av de to KIR-reseptorene. Oppfinnelsen beskriver for første gang at slike kryssreagerende og nøytraliserende antistoffer kan fremstilles, noe som representerer et uventet resultat og åpner mange veier mot nye og effektive NK-baserte terapier, spesielt for humane individer. I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ikke monoklonalt antistoff NKVSF1.
Innenfor betydningen av denne oppfinnelsen er en "kjent determinant" en determinant eller en epitop som deles av flere genprodukter av de humane inhibitoriske KIR-reseptorer. Den felles determinant deles fortrinnsvis av i det minste to medlemmer av KIR2DL-reseptorgruppen. Mer foretrukket deles determinanten av i det minste KIR2DL1 og KIR2DL/3. Visse antistoffer ifølge oppfinnelsen kan i tillegg til å gjenkjenne flere KIR2DL-genprodukter også gjenkjenne determinanter som er tilstede på andre inhibitoriske KIR, slik som genproduktet av KIR3DL-reseptorgruppen. Determinanten eller epitopen kan representere et peptidfragment eller en konformasj onsepitop som deles av nevnte medlemmer. I en mer bestemt utførelsesform binder antistoffet ifølge oppfinnelsen spesifikt til vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av det monoklonale antistoffet DF200. Denne determinanten er tilstede på både KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Innenfor rammen av oppfinnelsen betyr betegnelsen antistoff som "binder" en felles determinant et antistoff som binder nevnte determinant med spesifisitet og/eller affinitet.
Uttrykket "antistoff som anvendt heri viser til polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter eller derivater av nevnte polyklonale og monoklonale antistoffer om ikke annet er klart og utvetydig angitt. Avhengig av typen konstant domene i de tung kjedene fordeles fullengde antistoffer vanligvis til én av fem hovedklasser: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Flere av disse deles ytterligere i underklasser eller isotyper, slik som IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 og lignende. Det konstante tunge kjededomenet som svarer til de ulike klassene av immunglobuliner kalles henholdsvis "alfa", "delta", "epsilon", "gamma" og "mu". Underenhetstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene av de ulike immunglobulinklassene er velkjent. IgG og/eller IgM er de foretrukne antistoffklassene som anvendes i denne oppfinnelsen fordi de er de mest vanlige antistoffene i den fysiologiske situasjonen og fordi de er de enkleste å lage i et laboratorium. Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Fordi ett av målene ved oppfinnelsen er å blokkere interaksjonen av en inhibitorisk KIR og dets tilsvarende HLA-ligand in vivo uten å avvike fra NK-cellene, isotypene svarende til Fc-reseptorene som medierer lav effektorfunksjon, slik som IgG4, typisk foretrukket.
Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av flere teknikker som er kjent for fagmannen. Vanligvis fremstilles de ved immunisering av et ikke-humant dyr, fortrinnsvis en mus, med et immunogen som omfatter et inhibitorisk KIR-polypeptid, fortrinnsvis et KIR2DL-polypeptid, mer foretrukket et humant KIR2DL-polypeptid. Det inhibitoriske KIR-polypeptidet kan omfatte fullengdesekvensen til et humant inhibitorisk KIR-polypeptid eller et fragment eller derivat derav, vanligvis et immunogent fragment, dvs. en del av polypeptidet som omfatter en epitop eksponert på overflaten av cellene som uttrykker en inhibitorisk KIR-reseptor. Slike fragmenter inneholder vanligvis i det minste 7 konsekutive aminosyrer fra den modne polypeptidsekvensen, enda mer foretrukket i det minste 10 konsekutive aminosyrer derav. Fragmenter utledes vanligvis fra det ekstracellulære domenet til reseptoren. Enda mer foretrukket er et humant KIR2DL-polypeptid som inkluderer i det minste én, mer foretrukket begge de ekstracellulære Ig-domenene til fullengde KIRDL-polypeptidet og som er i stand til å etterligne i det minste én konformasjonsepitop tilstede i en KIR2DL-reseptor. I andre utførelsesform er omfatter nevnte polypeptid i det minste omtrent 8 konsekutive aminosyrer fra et ekstracellulært Ig-domene fra aminosyreposisj onene 1-224 til KIR2DL1 -polypeptidet (aminosyrenummerering i henhold til PROW-hjemmesiden som beskriver KIR-genfamilien,
http:// www. ncbi. nlm. nih. eov/ prow/ euidel326018082. htmy
I en mest foretrukket utførelsesform omfatter immunogenet et villtypehumant KIR2DL-polypeptid i en lipidmembran, vanligvis på overflaten av en celle. I en spesifikk utførelsesform omfatter immunogenet intakte NK-celler, spesielt intakte humane NK-celler, eventuelt behandlet eller lysert.
Immuniseringstrinnet av et ikke-humant dyr med et antigen kan utføres på en hvilken som helst kjent måte for å stimulere fremstillingen av antistoffer i en mus
(se f.eks. E. Harlow og D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Immunogenet suspenderes eller løses deretter i en buffer, eventuelt med en adjuvans, slik som fullstendig Freunds adjuvans. Fremgangsmåter for å påvise mengden immunogen, type buffere og mengde adjuvans er velkjent for fagmannen på området og er ikke begrenset på noen måte ifølge oppfinnelsen. Disse parameterne kan være forskjellige for ulike immunogener men kan lett kartlegges.
Tilsvarende er immuniseringsstedet og -frekvensen som er tilstrekkelig for å stimulere produksjonen av antistoffer velkjent for fagmannen på området. I en typisk immuniseringsprotokoll injiseres de ikke-humane dyrene intraperitonealt med et antigen på dag 1 og igjen omtrent 1 uke senere. Dette etterfølges av gjentatte injeksjoner av antigenene rundt dag 20, eventuelt med adjuvans slik som ufullstendig Freunds adjuvans. Gjentagelsesinjeksjonene utføres intravenøst og kan repeteres flere påfølgende dager. Dette etterfølges av en stor injeksjon på dag 40 (boosterinjeksjon), enten intravenøst eller intraperitonealt, vanligvis uten adjuvans. Denne protokollen resulterer i produksjonen av antigenspesifikke antistoffproduserende B-celler etter omtrent 40 dager. Andre protokoller kan også utnyttes så lenge de resulterer i produksjonen av B-celler som uttrykker et antistoff rettet mot antigenet anvendt i immunisering.
For polyklonal antistoffremstilling oppnås serum fra et immunisert ikke-humant dyr og antistoffene som er tilstede deri isoleres ved hjelp av velkjente teknikker. Serumet kan affinitetsrenses ved å anvende et hvilket som helst av immunogenene beskrevet ovenfor bundet til en fast støtte for slik å oppnå antistoffer som reagerer med inhibitoriske KIR-reseptorer.
I en alternativ utførelsesform isoleres lymfocytter fra et ikke-immunisert, ikke-humant pattedyr, dyrkes in vitro og som deretter eksponeres for immunogenet i cellekultur. Lymfocyttene høstes deretter og fusjonstrinnet beskrevet ovenfor utføres.
For monoklonale antistoffer er det neste trinnet isoleringen av splenocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret og påfølgende fusjon av disse splenocyttene med en udødeliggjort celle for å danne en antistoffproduserende hybridom. Isoleringen av splenocyttene fra et ikke-humant pattedyr er velkjent for fagmannen på området og omfatter vanligvis fjerning av milten fra et bedøvet ikke-humant pattedyr, å dele dette mindre deler og presse splenocyttene fra miltkapselen og gjennom et nylonnett i et cellefiltreringsapparat over i en passende buffer for slik å produsere en enkeltcellesuspensjon. Cellene ble vasket, sentrifugert og igjen suspendert i en buffer som lyserer alle røde blodceller. Løsningen sentrifugeres igjen og de gjenværende lymfocyttene i pelleten suspenderes igjen i fersk buffer.
Når lymfocyttene er isolert og presentert i enkeltcellesuspensjon kan lymfocyttene fuseres til en udødeliggjort cellelinje. Dette er vanligvis en musemyelomcellelinje selv om mange andre udødeliggjorte cellelinjer er anvendelig for å danne hybridomer også er kjente. Foretrukne musemyelomlinjer inkluderer men er ikke begrenset til de utledet fra MOPC-22- og MPC-11-musetumorer tilgjengelig fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, X63 Ag8653 og SP-2-celler tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Fusjonen gjennomføres ved å anvende polyetylenglykol eller lignende. De resulterende hybridomene styrkes deretter i selektivt medium som inneholder én eller flere substanser som hemmer veksten eller overlevelsen av de ikke-fuserte, foreldremyelomcellene. Dersom foreldremyelomcellene mangler enzymet hypoksyxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT) vil f.eks. cellekulturmediet for hybridomene vanligvis inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) som vesentlig forhindrer veksten av HGPRT-manglende celler.
Hybridomer dyrkes vanligvis på et forlag av makrofager. Makrofagene er fortrinnsvis fra avfall fra det ikke-humane pattedyret anvendt for å isolere splenocytter og er vanligvis behandlet med ufullstendig Freunds adjuvans eller lignende flere dager før utsåing av hybridomene. Fusjonsmetoder er beskrevet i Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", sider 59-103 (Academic Press, 1986), hvis beskrivelse er inkorporert heri ved referanse.
Cellene tillates å dyrkes i seleksjonsmediet i et tilstrekkelig tidsrom for kol omdannelse og antistoffproduksjon. Dette tar vanligvis mellom omtrent 7 og omtrent 14 dager. Hybridomkoloniene analyseres deretter for produksjon av antistoffer som kryssreagerer med flere inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter. Denne analysen er vanligvis en kolorimetrisk ELISA-type analyse selv om enhver analyse kan anvendes som kan tilpasses til brønnene som hybridomene dyrkes i. Andre analyser inkluderer immunpresipitering og radioimmunanalyse. De positive brønnene for den ønskede antistoffproduksjonen undersøkes for å bestemme om én eller flere ulike kolonier er tilstede. Dersom mer enn én koloni er tilstede kan cellene klones igjen og dyrkes for å sikre at kun én enkelt celle har gitt opphav til kolonien som produserer det ønskede antistoffet. Positive brønner med en enkel tydelig koloni klones vanligvis igjen og analyseres igjen for å sikre at kun ett monoklonalt antistoff påvises og produseres. Antistoffer som også produseres ved seleksjon av kombinatoriske biblioteker av immunglobuliner som beskrevet f.eks. i Ward et al., Nature. 341 (1989), side 544).
Antistoffene ifølge denne oppfinnelsen er i stand til å nøytralisere den KIR-medierte inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet; spesielt inhiberingen mediert gjennom KIR2DL-reseptorer og nærmere bestemt i det minste både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inhibering. Disse antistoffene er følgelig "nøytraliserende" eller "inhibitoriske" antistoffer i betydningen av at de blokkerer, i det minste delvis og påviselig, hemmingen av signalreaksjonsveien mediert av KIR-reseptorer når de reagerer med MHC klasse I-molekyler. Enda mer viktig vises denne inhibitoriske aktiviteten med hensyn til flere typer inhibitoriske KIR-reseptorer, fortrinnsvis flere KIR2DL-reseptorgenprodukter, og mer foretrukket i det minste både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 slik at disse antistoffene kan anvendes i ulike individer med høy effektivitet. Hemmingen av KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet kan vurderes gjennom ulike analyser eller tester, slik som bindings- eller cellulære analyser.
Med én gang antistoffet som kryssreagerer med multiple inhibitor-KIR-reseptorer er identifisert kan det testes dets evne til å nøytralisere hemmingseffekten av disse KIR-reseptorene i intakte NK-celler. I en spesifikk variant kan den nøytraliserende aktiviteten illustreres gjennom den kapasitet nevnte antistoff har for å rekonstituere lysis av KIR2DL-positive NK-kloner av HLA-C-positive mål. I en annen spesifikk utførelsesform definerer den nøytraliserende aktiviteten til antistoffet gjennom antistoffets evne til å hemme bindingen av HLA-C-molekylet til KIR2DL1 og KIR2DL3 (eller den nært beslektede KIR2DL2)-reseptorer, ytterligere foretrukket ettersom det er antistoffets kapasitet til å endre: - bindingen av et HLA-C-molekyl valgt fra Cwl, Cw3, Cw7 og Cw8 (eller et HLA-C-molekyl med en Asn-rest i posisjon 80) til KIR2DL2/3; og - bindingen av et HLA-C-molekyl valgt fra Cw2, Cw4, Cw5 og Cw6 (eller et HLA-C-molekyl med en Lys-rest i posisjon 80) til KIR2DL1.
I en annen variant kan den inhibitoriske aktiviteten til et antistoff ifølge denne oppfinnelsen vurderes i en cellebasert cytotoksisitetsanalyse som beskrevet i eksemplene tilveiebrakt heri.
I en annen variant kan den inhibitoriske aktiviteten til et antistoff ifølge oppfinnelsen vurderes i en cytokinfrigjøringsanalyse, hvori NK-celler inkuberes med testantistoffet og en målcellelinje som uttrykke et HLA-C-allel gjenkjent av et KIR-molekyl i NK-populasjonen, for å stimulere NK-cellecytokinproduksjon (f.eks. IFN-y og/eller GM-CSF-produksjon). I en eksempelprotokoll vurderes IFN-y-produksjon fra PBMC ved hjelp av celleoverflate- og intracytoplasmatisk farging og analyse av flow cytometri etter omtrent 4 dager i kultur. Kort fortalt kan Brefeldin A (Sigma Aldrich) tilsettes til en endelig konsentrasjon av omtrent 5 u.g/ml i det minste i omtrent 4 timer av dyrkningen. Cellene kan deretter inkuberes med anti-CD3- og anti-CD56-mAb forut for permeabilisering (IntraPrep™; Beckman Coulter) og farges med PE-anti-IFN-y eller PE-IgGl (Pharmingen). GM-CSF og IFN-y-produksjon fra polyklonale aktiverte NK-celler kan måles i supernatanter ved å anvende ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-y: OptElA-sett, Pharmingen).
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan delvis eller fullstendig nøytralisere den KIR-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet. Betegnelsen "nøytralisere KIR-mediert hemming av NL-cellecytotoksisitet" som anvendt heri betyr evnen til å øke til i det minste omtrent 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, i det minste omtrent 40 %, i det minste omtrent 50 % eller mer (f.eks. 25-100 %) spesifikk lysis oppnådd ved de samme forhold med NK-celler eller NK-cellelinjer som ikke er blokkert gjennom deres KIR, som målt ved hjelp av en klassisk kromfrigjøringstest for cytotoksisitet, sammenlignet med det nivået av spesifikk lysis som oppnås uten antistoff når en NK-cellepopulasjon som uttrykker en gitt KIR settes i kontakt med en målcelle som uttrykker egen MHC klasse I-molekyl (gjenkjent av KIR uttrykt på NK-celler). Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen er f.eks. i stand til å indusere lysis i tilpassede eller HLA-kompatible eller autologe målcellepopulasjoner, dvs. cellepopulasjoner som ikke ville effektivt ly seres av MK-celler i fraværet av nevnte antistoff. Antistoffene ifølge denne oppfinnelsen kan følgelig også defineres som fasiliterende for NK-celleaktivitet in vivo.
Alternativt betyr betegnelsen "nøytralisere KIR-mediert hemming" at det i en kromanalyse ved å anvende en NK-celleklon eller transfektant som uttrykker én eller flere inhibitoriske KIR og en målcelle som uttrykker kun ett HLA-allel som gjenkjennes av én av KIR'ene på NK-cellen, bør det oppnådde cytotoksisitetsnivået med antistoffet være i det minste omtrent 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, i det minste omtrent 40 %, i det minste omtrent 50 % (f.eks. omtrent 25-100 %) eller mer av den oppnådde cytotoksisiteten med et kjent blokkerende anti-MHC klasse I-molekyl, slik som W6/32 anti-MHC klasse I-antistoff.
I en spesifikk utførelsesform binder antistoffet vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet DF200 (fremstilt ved hjelp av hybridom DF200). Slike antistoffer kalles heri "DF200-lignende antistoffer". I en ytterligere foretrukket utførelsesform er antistoffet et monoklonalt antistoff. Mer foretrukket er "DF200-lignende antistoffer" ifølge oppfinnelsen antistoffer andre enn det monoklonale antistoffet NKVSF1. Mest foretrukket er monoklonalt antistoff DF200 (fremstilt av hybridom DF200).
Betegnelsen "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse. Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet DF200 betyr at et antistoff "konkurrerer" med DF200. Vanligvis betyr et antistoff som "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet av interesse (f.eks. DF200, NKVSF1, 17F9) at antistoffet "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for hvilke som helst av KIR-molekylene, fortrinnsvis et KIR-molekyl utvalgt fra gruppen bestående av KIR2DL1 og KIR2DL2/3. I andre eksempler konkurrerer et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL1-molekyl som antistoffet av interesse med antistoffet av interesse for binding til KIR2DL1. Et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL2/3-molekyl som antistoffet av interesse "konkurrerer" med antistoffet av interesse for binding til KIR2DL2/3.
Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for hvilket som helst og alle KIR-molekyler som nevnte antistoff av interesse spesifikt binder til. Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet DF200 betyr at et antistoff "konkurrerer" med DF200 for hvilke som helst og alle KIR-molekyler som DF200 spesifikt binder til. Et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som det monoklonale antistoffet DF200 eller NKVSF1 "konkurrerer" f.eks. med nevnte DF200 eller NKVFS1 for binding til KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 og KIR2DS2.
Identifiseringen av ett eller flere antistoffer som binder til vesentlig eller essensielt den samme epitopen som de monoklonale antistoffene beskrevet heri kan lett bestemmes ved å anvende hvilke som helst av de mange immunologiske screeningsanalysene hvor antistoffkonkurrering kan vurderes. Et antall slike analyser anvendes rutinemessig og er kjent for fagmannen på området (se f.eks. US patent nr. 5 660 827 meddelt 26. august 1997, som spesifikt er inkorporert ved referanse heri). Det skal forstås at det å faktisk bestemme epitopen som et antistoff beskrevet heri binder til ikke på noen måte krever å identifisere et antistoff som binder til den samme eller vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet beskrevet heri.
Når testantistoffene som skal undersøkes er oppnådd fra ulike dyrekilder, eller til og med fra en ulik Ig-isotyp, kan f.eks. en enkel konkurranseanalyse anvendes hvor kontrollen (f.eks. DF200) og testantistoffene blandes (eller adsorberes på forhånd) og påføres til en prøve som inneholder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3, hvor hver er kjent for å kunne binde DF200. Protokoller basert på ELISA, radioimmunanalyser, Western blotting og anvendelse av BIACORE-analyse (som f.eks. vist i eksempeldelen) er egnet for anvendelse i slike enkle kompetitive studier.
I visse utførelsesformer ville man på forhånd blande kontroll antistoffene (f.eks. DF200) med ulike mengder testantistoffer (f.eks. 1:10 eller omtrent 1:100) i et tidsrom forut for påføring av den inhibitoriske KIR-antigenprøven. I andre utførelsesformer kan kontrollen og de ulike mengdene testantistoffer enkelt blandes gjennom eksponeringen til KIR-antigenprøven. Så lenge som man kan skille bundet fra frie antistoffer (f.eks. ved å anvende separerings- eller vasketeknikker for å eliminere ubundne antistoffer) og DF200 fra testantistoffene (f.eks. ved å anvende artsspesifikke eller isotypspesifikke sekundære antistoffer eller gjennom spesifikk merking av DF200 med et detekterbart merke) vil man være i stand til å bestemme om testantistoffene reduserer bindingen av DF200 til de to ulike KIR2DL-antigenene, noe som ville indikere at testantistoffet gjenkjenner vesentlig den samme epitopen som DF200. Bindingen av (merkede) kontrollantistoffer i fraværet av et fullstendig irrelevant antistoff kan tjene som høyverdikontroll. Lavverdikontrollen kan oppnås ved å inkubere de merkede (DF200) antistoffene med ikke-merkede antistoffer av den eksakt samme typen (DF200), hvor konkurranse ville opptre og redusere bindingen av de merkede antistoffene. I en testanalyse er det en signifikant reduksjon i merket antistoffreaktivitet i nærværet av et testantistoff indikasjon på et testantistoff som gjenkjenner vesentlig den samme epitopen, dvs. et som "kryssreagerer" med det merkede (DF200)-antistoffet. Ethvert testantistoff som reduserer bindingen av DF200 til hver av KIR2DL1- og KIR2DL2/3-antigener med i det minste omtrent 50 %, slik som i det minste omtrent 60 % eller mer foretrukket i det minste 70 % (f.eks. omtrent 65-100 %) ved ethvert DF200:testantistoff-forhold mellom omtrent 1:10 og omtrent 1:100 betraktes å være et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200. Fortrinnsvis vil testanti stoffet redusere bindingen av DF200 til hver av KIR2DL-antigenene med i det minste omtrent 90 % (f.eks. omtrent 95 %).
Konkurranse kan vurderes ved hjelp av f.eks. en flowcytometritest. I en slik test kan celler som bærer en gitt KIR inkuberes først med DF200 f.eks. og deretter med testanti stoffet merket med et fluorkrom eller biotin. Antistoffet sies å konkurrere med DF200 dersom bindingen som oppnås ved preinkubering med mettende mengder av DF200 er omtrent 80 %, fortrinnsvis omtrent 50 %, omtrent 40 % eller mindre (f.eks. omtrent 30 %) av bindingen (som målt ved hjelp av fluorescensgjennomsnitt) oppnådd med antistoffet uten preinkubering med DF200. Alternativt sies et antistoff å konkurrere med DF200 dersom bindingen som oppnås med et merket DF200 (ved hjelp av et fluorkrom eller biotin) på celler som på forhånd er inkubert med mettende mengder av testantistoff er omtrent 80 %, fortrinnsvis omtrent 50 %, omtrent 40 % eller mindre (f.eks. omtrent 30 %) av bindingen som oppnås uten på forhånd å inkubere med antistoffet.
En enkel kompetitiv analyse hvor et testantistoff på forhånd absorberes og påføres ved mettende konsentrasjoner på en overflate hvorpå både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 er immobilisert kan også fordelaktig anvendes. Overflaten i denne enkle kompetitive analysen er fortrinnsvis en BIACORE-chip (eller et annet medium egnet for overflateplasmonresonansanalyse). Kontrollantistoffet (f.eks. DF200) bringes deretter i kontakt med overflaten ved KIR2DL1- og KIR2DL2/3-mettende konsentrasjoner og KIR2DL1- og KIR2DL2/3-overflatebinding av kontrollantistoffet måles. Denne bindingen av kontrollantistoffet sammenlignes med bindingen av kontrollantistoffet til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflate i fraværet av testantistoff. I en testanalyse indikerer en signifikant reduksjon i bindingen av KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflate til kontrollantistoffet i nærværet av et testantistoff at testanti stoffet gjenkjenner vesentlig den samme epitopen som kontrollantistoffet slik at testanti stoffet "kryssreagerer" med kontrollantistoffet. Ethvert testantistoff som reduserer bindingen av kontrollantistoff (slik som DF200) til hver av KIR2DL1- og KIR2DL2/3-antigener med i det minste omtrent 30 % eller mer foretrukket omtrent 40 % kan betraktes å være et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som en kontroll (f.eks. DF200). Slike testantistoff vil fortrinnsvis redusere bindingen av kontrollantistoffet (f.eks. DF200) til hver av KIR2DL-antigenene med i det minste omtrent 50 % (f.eks. i det minste omtrent 60 %, i det minste omtrent 70 % eller mer). Det skal forstås at rekkefølgen av kontroll-og testantistoffer kan reverseres: det vil si at kontrollantistoffet først kan bindes til overflaten og testanti stoffet bringes i kontakt med overflaten deretter i en kompetitiv analyse. Antistoffet med høyere affinitet for KIR2DL1- og KIR2DL2/3-antigener bindes fortrinnsvis til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflate først, ettersom det vil forventes at reduksjonen i bindingen ses for det andre antistoffet (ved å anta at antistoffene er kryssreagerende) vil være større. Ytterligere eksempler på slike analyser er tilveiebrakt i eksemplene og f.eks. i Saunal og Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, hvis beskrivelse er inkorporert heri ved referanse.
Det skal forstås at de ovenfor beskrevne immunologiske screeningsanalysene, i betydningen av DF200 for eksemplifiserende formål, også kan anvendes for å identifisere antistoffer som konkurrerer med NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183 og andre antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Ved immunisering og produksjon av antistoffer i en vertebrat eller celle, kan spesielt utvalgte trinn utføres for å isolere antistoffer som krevet. I en spesifikk utførelsesform, angår oppfinnelsen følgelig også fremgangsmåter for å fremstille slike antistoffer, omfattende: (a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen omfattende et inhibitorisk KIR-polypeptid; (b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoffer binder nevnte KIR-polypeptid, (c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste to ulike inhibitoriske KIR-genprodukter, og (d) velge ut antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet på en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter.
Seleksjonen av et antistoff som kryssreagerer med i det minste to ulike inhibitoriske KIR-genprodukter kan oppnås ved å analysere antistoffer mot to eller flere ulike inhibitoriske KIR-antigener, f.eks. som beskrevet ovenfor.
I en mer foretrukket utførelsesform er antistoffene som fremstilles i trinn (b) monoklonale antistoffer. Betegnelsen "fremstilling av antistoffer fra nevnte immuniserte dyr" som anvendt heri inkluderer følgelig oppnåelsen av B-celler fra et immunisert dyr og anvendelse av disse B-cellene for å fremstille en hybridom som uttrykker antistoffer, så vel som å oppnå antistoffer direkte fra serumet til et immunisert dyr. I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffene utvalgt i trinn (c) de som kryssreagerer med i et minste KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
I enda en annen foretrukket utførelsesform for årsaker antistoffene utvalgt i trinn (d) i det minste omtrent 10 % spesifikk lysis mediert gjennom NK-celler som har i det minste én KIR gjenkjent av antistoffet og fortrinnsvis i det minste omtrent 40 % spesifikk lysis, i det minst omtrent 50 % spesifikk lysis eller mer foretrukket i det minste omtrent 70 % spesifikk lysis (f.eks. omtrent 60-100 % spesifikk lysis) som målt i en standard kromfrigjøringsanalyse mot en målcelle som uttrykker eget HLA klasse I-molekyl, sammenlignet med lysis eller cytotoksisiteten oppnådd ved samme effektor/mål-forhold med NK-celler som ikke er blokkert gjennom deres KIR. Alternativt bør cytotoksisitetsnivået oppnådd med antistoffet være i det minste 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, eller mer av den oppnådde cytotoksisiteten med et blokkerende anti-MHC-klasse I-mAb slik som W6/32 anti-MHC klasse I-antistoff når antistoffer utvalgt i trinn (d), når anvenet i en kromanalyse som anvender en NK-celleklon som uttrykker én eller flere inhibitoriske KIR og en målcelle som uttrykker kun ett HLA-allel som gjenkjennes av én av KIR'ene på NK-klonen anvendes.
Rekkefølgen av trinnene (c) og (d) i den rett ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan endres. Eventuelt kan metoden også eller alternativt ytterligere omfatte flere trinn for dannelse av fragmenter av det monoklonale antistoffet eller derivatet av det monoklonale antistoffet eller slike fragmenter, f.eks. som beskrevet andre steder heri.
I en foretrukket utførelsesform er det ikke-humane dyret som anvendes for å fremstille antistoffer ifølge den anvendelige fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen et pattedyr, slik som en gnager (f.eks. mus, rotte, osv.), kveg, gris, hest, kanin, geit, sau osv. Det ikke-humane dyret kan også være genetisk modifisert eller konstruert for å fremstille "humane" antistoffer, slik som Xenomouse™ (Abgenix) eller HuMAb-mus™ (Medarex).
I en annen variant tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å oppnå et antistoff som omfatter: (a) å velge, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff, et fragment av et monolonalt antistoff eller et derivat derav som kryssreagerer med i et minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter, og (b) velge ut et antistoff, fragment eller derivat av (a) som kan nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter.
Repertoaret kan være et hvilket som helst (rekombinant) repertoar av antistoffer eller fragmenter derav, eventuelt vist gjennom en annen egnet struktur (f.eks. fag, bakterie, syntetisk kompleks, osv.). Utvelgelsen av inhibitoriske antistoffer kan utføres som beskrevet ovenfor og som ytterligere illustrert i eksemplene.
Ifølge en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en hybridom som omfatter en B-celle fra en ikke-human vert, hvori nevnte B-celle fremstiller et antistoff som binder en determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter og hvori nevnte antistoff kan nøytralisere den inhibitoriske aktiviteten til nevnte reseptorer. Hybridomen ifølge dette aspektet av oppfinnelsen er mer foretrukket ikke en hybridom som fremstiller det monoklonale antistoffet NKVSF1. Hyrbidomen ifølge dette aspektet av oppfinnelsen kan dannes som beskrevet ovenfor ved fusjon av splenocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret med en udødeliggjort cellelinje. Hybridomer fremstilt ved denne fusjonen kan analyseres for nærværet av et slikt kryssreagerende antistoff som beskrevet andre steder heri. Hybridomen fremstiller fortrinnsvis et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstede på i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter, og forårsaker økning av NK-celleekspresjonseffekt i det minste av én av disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket produserer hybridomen et antistoff som binder tilvesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200 og som forsterker NK-celleaktivitet. Mer foretrukket er hybridomen hybridom DF200 som produserer det monoklonale antistoffet DF200.
Hybridomer som bekreftes å produsere et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen kan dyrkes i større mengder i et passende medium slik som DMEM eller RPMI-1640. Alternativt kan hybridomene dyrkes in vivo som ascitestumorer i et dyr.
Etter tilstrekkelig vekst for å produsere det ønskede monoklonale antistoffet separeres dyrkningsmediet som inneholder monoklonalt antistoff (eller ascitesvæsken) bort fra cellene og det monoklonale antistoffet tilstede i mediet renses. Rensing oppnås vanligvis ved hjelp av gelelektroforese, dialyse, kromatografi ved anvendelse av protein A- eller protein G-sefarose eller et anti-muse-Ig bundet til en fast støtte slik som agarose- eller sefarose-kuler (alle beskrevet f.eks. i Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publikasjon nr. 18-1037-46, utgave AC, hvis beskrivelse herved er inkorporert ved referanse). Det bundne antistoff elueres vanligvis fra protein A/protein G-kolonner ved å anvende buffere med lav pH (glysin- eller acetatbuffere med pH 3,0 eller mindre) med umiddelbar nøytralisering av antistoffinneholdende fraksjoner. Disse fraksjonene samles, dialyseres og konsentreres etter behov.
Ifølge en alternativ utførelsesform isoleres DNA som koder for et antistoff som binder en determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter fra hybridomen ifølge oppfinnelsen og plasseres i en passende ekspresjonsvektor for transfeksjon i en passende vert. Verten anvendes deretter for den rekombinante produksjon av antistoffet eller varianter derav, slik som en humanisert versjon av det monoklonale antistoffet, aktive fragmenter av antistoffet eller kimere antistoffer som omfatter den antigengjenkjennende delen av antistoffet. DNA som anvendes i denne utførelsesform en koder fortrinnsvis for et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstede på i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter og forårsaker økning av NK-celleekspresjonseffekt ved i det minste én av disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket koder DNA'et for et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200 og som forsterker NK-celleaktivitet. Mest foretrukket koder DNA for det monoklonale antistoffet DF200.
DNA som koder for det moniklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen isoleres lett og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer (f.eks. ved å anvende oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjeder av museantistoffer). Med én gang DNA er isolert kan det plasseres i ekspresjonsvektorer som deretter transfekteres inn i vertsceller slik som E- coli-celler, simian COS-celler, kinesiske hamstereggstoffceller (CHO) eller myelomceller som ikke på annen måte produserer immunoglobulinprotein for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i den rekombinante vertscelle. Rekombinant ekspresjon i bakterier av DNA som koder for antistoffet er velkjent for fagmannen (se f.eks. Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol.. 5, side 256
(1993); ogPluckthun, Immunol. Revs.. 130, side 151 (1992).
Fragmenter oe derivater av et monoklonalt antistoff
Fragmenter og derivater av antistoffer ifølge oppfinnelsen (som er omfattet av betegnelsen "antistoff eller "antistoffer" som anvendt i denne søknaden, om ikke annet uttrykkelig er angitt), fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, kan fremstilles ved hjelp av teknikker som er velkjent for fagmannen på området. "Immunreaktive fragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, vanligvis det antigenbindende setet eller variable region. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2og Fv-fragmenter; diastoffer; ethvert antistoffragment som er et polypeptid med en primærstruktur som består av en ikke-avbrutt sekvens av kontinuerlige aminosyrerester (kalt heri som "enkeltkjede-antistoffragment" eller "enkeltkjede-polypeptid"), som inkluderer uten begrensning (1) enkeltkjede Fv (scFV)-molekyler, (2) enkeltkjede-polypeptider som inneholder kun et lett kjedevariabelt domene, eller et fragment derav som inneholder de tre CDR til det letkjedevariable domenet, uten en binding til tungkjedeenhet og (3) enkeltkjede-polypeptider som inneholder kun en tungkjedevariabel region, eller et fragment derav som inneholder de tre CDR for den tunge kjedevariable regionen, uten en bundet lettkjedeenhet; og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoffragm enter. F.eks. kan Fab eller F(ab')2-fragmenter produseres ved hjelp av proteasefordøying av de isolerte antistoffene ifølge konvensjonelle teknikker. Det skal forstås at immunreaktive fragmenter kan modifiseres ved å anvende kjente fremgangsmåter, f.eks. for å redusere "clearance" in vivo og oppnå en mer ønsket farmakokinetisk profil kan profilet modifiseres med polyetylenglykol (PEG). Fremgangsmåte for å kople en setespesifikk konjugerende PEG til et Fab'-fragment er beskrevet i f.eks. Leong et al., Cvtokine 16(3): 106-119 (2001) og Delgado et al., Br. J. Cancer 73(2): 175-182 (1996), hvis beskrivelse er inkorporert heri ved referanse.
I et spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater som omfatter lettkjedevariabel regionsekvens av DF200 som vist i fig. 12.1 et annet spesielt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderi vater som omfatter den lette kjedevariable regionsekvensen til Pan2D som vist i fig. 12.1 et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere av de lette variable regionene CDR til DF200 som vist i fig. 12. I enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere lette variable CDR-regioner av Pan2D som vist i fig. 12. Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan dannes ved å lage egnede substitusjoner, addisjoner og/eller delesjoner i disse beskrevne aminosyresekvensene ved å anvende standardteknikker med hjelp fra sammenligning av sekvensene. F.eks. kan CDR-rester som er konserverte mellom Pan2D og DF200 være egnede mål for modifikasjon så lenge slike rester ikke bidrar til de ulike profiler i konkurransen disse antistoffene har med hensyn til andre antistoffer som beskrevet heri (selv om Pan2D og DF200 ikke konkurrerer), og følgelig ikke kan bidra til spesifisiteten til disse antistoffene for deres spesifikke respektive epitoper. I et annet aspekt kan posisjoner hvor én rest er tilstede i én sekvens i ett av disse antistoffene, men ikke i det andre, være egnet for delesjon, substitusjon og/eller innskudd.
I et spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderi vater som omfatter den tunge kjedevariable regionsekvensen til DF200 som vist i fig. 13. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere av de tunge variable CDR-regionene til DF200 som vist i fig. 13. Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan dannes ved å lage egnede substitusjoner, addisjoner og/eller delesjoner i disse beskrevne aminosyresekvensene ved å anvende standardteknikker med hjelp fra sammenligning av sekvensene. I et annet aspekt, når en rest er tilstede i én sekvens i én av disse antistoffene men ikke i en annen, kan denne være egnet for delesjon, substitusjon og/eller innskudd.
Alternativt kan DNA fra en hybridom som fremstiller et antistoff ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, modifiseres for slik å kode for et fragment ifølge denne oppfinnelsen. Det modifiserte DNA settes deretter inn i en ekspresjonsvektor og anvendes for å transformere eller transfektere en passende celle som deretter uttrykker det ønskede fragmentet.
I en alternativ utførelsesform kan DNA fra en hybridom som produserer et antistoff ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, modifiseres forut for innsetting i en ekspresjonsvektor, f.eks. ved å substituere den kodende sekvensen for humane tunge og lette kjedekonstante domener istedenfor de homologe ikke-humane sekvensene (f.eks. Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81, side 6851 (1984)), eller ved kovalent å binde den immunglobulinkodende sekvensen helt eller delvis til den kodende sekvensen til et ikke-immunglobulinpolypeptid. På denne måten fremstilles "kimere" eller "hybride" antistoffer som har bindingsspesifisiteten til det opprinnelige antistoffet. Vanligvis substitueres slike ikke-immunglobulinpolypeptider med de konstante domener til et antistoff ifølge oppfinnelsen.
Ifølge en annen utførelsesform er følgelig antistoffet ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, humanisert. "Humaniserte" former av antistoffer ifølge denne oppfinnelsen er spesifikke kimere immunglobuliner, immunglobulinkjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab, Fab', F(ab')2, eller andre antigenbindende sekvenser av antistoffer) som inneholder minimumsekvenser utledet fra museimmunglobulinet. For det meste er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottakerantistoff) hvor rester fra en komplementær bestemmende region (complementary-determining region, CDR) fra mottakeren erstattet med rester fra en CDR fra det opprinnelige antistoffet (donorantistoff) mens den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten til det opprinnelige antistoffet opprettholdes. I enkelte tilfeller kan Fv-rammeverksrester fra det humane immunoglobulinet erstattes med tilsvarende ikke-humane rester. Humaniserte antistoffer kan videre omfatte rester som ikke finnes i verken mottakeranti stoffet eller i det importerte CDR- eller rammeverksekvensene. Disse modifikasjonene gjøres for ytterligere å forbedre og optimalisere antistoffytelsen. Generelt vil humaniserte antistoffer omfatte vesentlig alle eller i det minste én eller typisk to, variable domener, hvori alle eller vesentlig alle av CDR-regionene som svarer til de fra det opprinnelige antistoffet og alle eller vesentlig alle FR-regioner fra et humant immunglobulin consensussekvens. Det humaniserte antistoffet vil optimalt også omfatte i det minste én del av en immunglobulinkonstant region (Fc), vanligvis den til et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature. 321, side 522 (1986); Reichmann et al., Nature. 332, side 323 (1988); og Presta, Curr. Qp. Struct. Biol.. 2, side 593 (1992).
Fremgangsmåter for å humanisere antistoffene ifølge oppfinnelsen er velkjent for fagmannen på området. Vanligvis har et humanisert antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse én eller flere aminosyrerester som er introdusert inn i antistoffet fra det opprinnelige antistoff. Disse muse- eller andre ikke-humane aminosyrerestene kalles ofte "importerte" rester, som vanligvis er tatt fra et "importert" variabelt domene. Humanisering kan vesentlig utføres ved å følge fremgangsmåten til Winter og medarbeidere (Jones et al., Nature. 321, side 522
(1986); Riechman et al., Nature. 332, side 323 (1988); Verhoeyen et al., Science. 239, side 1534 (1988)). Slike "humaniserte" antistoffer er følgelig kimere antistoffer (Cabilly et al., US patent nr. 4 816 567), hvor vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt domene er substituert med den korresponderende sekvensen fra det opprinnelige antistoff. I praksis er humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen vanligvis humane antistoffer hvor enkelte CDR-rester og muligens noen FR-rester er substituert med rester fra analoge seter i det opprinnelige antistoff.
Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal anvendes i fremstillingen av humaniserte antistoffer er svært viktig for å redusere antigenisiteten. Ifølge den såkalte "beste tilpasnings"-metoden, analyseres sekvensen til det variable domenet til et antistoff ifølge oppfinnelsen mot hele biblioteket til kjente humane variable domenesekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest til musesekvensen aksepteres deretter som det humane rammeverk (FR) for det humaniserte antistoff (Sims et al., J. Immunol.. 151, side 2296 (1993), Chothia og Lesk, J. Mol. Biol.. 196, side 901 (1987)). En annen fremgangsmåte anvender et spesifikt rammeverk for consensussekvensen for alle humane antistoffer av en spesifikk undergruppe av lette eller tunge kjeder. Det samme rammeverket kan anvendes for flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 89, side 4285 (1992), Presta et al. J. Immunol.. 51, side 1993)).
Det er ytterligere viktig at antistoffene humaniseres med bibeholdelse av høy affinitet for flere inhibitoriske KIR-reseptorer og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet, ifølge en foretrukket fremgangsmåte, fremstilles humaniserte antistoffer ved hjelp av en analyseprosess der foreldresekvenser og ulike viktige humaniserte produkter ved anvendelse av tredimensjonale modeller av foreldre- og humaniserte sekvenser. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er allem ent tilgjengelige og er kjent for fagmannen på området. Dataprogrammer er tilgjengelig som illustrerer og viser mulig tredimensjonale konformasjonsstrukturer og utvalgte kandidatimmunoglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse bildene tillater analyse av den sannsynlige rollen til restene i kandidatimmunglobulinsekvensens funksjon, dvs. analyse av restene som influerer kandidatimmunglobulinets evne til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-rester velges og kombineres fra consensus- og importerte sekvenser slik at det ønskede antistoffets egenskaper, slik som økt affinitet for målantigenet/antigenene oppnås. Generelt er CDR-restene direkte og mest vesentlig involvert i påvirkningen av antigenbinding.
En annen fremgangsmåte for å danne "humaniserte" monoklonale antistoffer er å anvende en XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA) som musen anvendt for immunisering. En XenoMouse er en musevert i henhold til oppfinnelsen hvor dets immunglobulingener er erstattet med funksjonelle humane immunglobulingener. Antistoffene som fremstilles av denne musen eller i hybridomer dannet fra B-celler fra denne musen er følgelig allerede humanisert. XenoMousen er beskrevet i US patent nr. 6 162 963 som herved er inkorporert ved referanse i sin helhet. En analog metode kan oppnås ved å anvende en HuMAb-Mouse™ (Medarex).
Humane antistoffer kan også fremstilles ifølge ulike andre teknikker slik som ved å anvende for immunisering, andre transgene dyr som er konstruert for å uttrykke et humant antistoffrepertoar (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), eller ved å velge ut antistoffrepertoarer ved å anvende fagdisplay-metoder. Slike teknikker er kjent for fagmannen på området og kan implementeres ved å starte fra monoklonale antistoffer som beskrevet i den foreliggende oppfinnelse.
Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, kan også derivatisert til "kimere" antistoffer (immunglobuliner) der en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i det opprinnelige antistoffet, mens resten av kjeden/kjedene er identiske med eller homologe til tilsvarende sekvenser i antistoffet utledet fra en annen art eller tilhørende til en annen antistoffklasse eller underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge som de har den ønskede biologiske aktivitet (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 81, side 6851 (1984)).
Andre derivater som er innenfor rammen av denne oppfinnelsen inkluderer funksjonaliserte antistoffer, dvs. antistoffer som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, slik risin, difteritoksin, abrin og Pseudomonas- eksotoksin; til en detekterbar enhet, slik som en fluorescensenhet, en radioisotop eller et avbildningsmiddel; eller til en fast støtte, slik som agarosekuler eller lignende. Fremgangsmåter for å konjugere eller kovalent binde disse andre midlene til antistoffer er velkjent for fagmannen på området.
Konjugering til et toksin er anvendelig for å målrette dreping av NK-celler som har én av de kryssreagerende KIR-reseptorene på sin celleoverflate. Med én gang antistoffet ifølge oppfinnelsen binder til celleoverflaten av slike celler internaliseres antistoffet og toksinet frigjøres på innsiden av cellen, dreper selektivt den cellen. Slik anvendelse er en alternativ utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse.
Konjugering til en detekterbar enhet er anvendelig når antistoffet ifølge oppfinnelsen anvendes for diagnostiske formål. Slike formål inkluderer men er ikke begrenset til analyser av biologiske prøver for nærværet av NK-celler som bærer de kryssreagerende KIR på sin celleoverflate og påviser nærværet av NK-celler som bærer de kryssreagerende KIR i en levende organisme. Slike analyse- og deteksjonsmetoder er også alternative utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse.
Konjugering av et antistoff ifølge oppfinnelsen til en fast støtte er anvendelig som et verktøy for affinitetsrensing av NK-celler som bærer kryssreagerende KIR på sin celleoverflate fra en kilde, slik som en biologisk væske. Denne rensemetoden er en annen alternativ utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, ettersom den resulterer i rensede populasjoner av NK-celler.
I en alternativ utførelsesform kan et antistoff som binder en felles determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff kan nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK- cellecytotoksisitet på NK-celler som uttrykker i det minste én av nevnte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorer ifølge oppfinnelsen, inkludert NKVSF1, inkorporeres i liposomer ("immunliposomer"), alene eller sammen med andre forbindelser for målrettet levering til et dyr. Slike andre forbindelser inkluderer nukleinsyrer for levering av gener for genterapi eller for levering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for undertrykking av et gen i en NK-celle, eller toksiner eller medikamenter for den målrettede drepingen av NK-celler.
Datamodulering av de ekstracellulære domenene til KIR2DL1, -2 og -3 (KIR2DL1-3), basert på deres publiserte kry stall strukturer (Maenaka et al. (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al., (2000)), viste involveringen av visse regioner eller KIR2DL1, -2 og -3 i interaksjonen mellom KIR2DL1 og KIR2DL1-3-kryssreaktive musemonoklonale antistoffer DF200 og NKVSF1. I én utførelsesform tilveiebringer følgelig den foreliggende oppfinnelse antistoffer som eksklusivt binder KIR2DL1 med en region som er definert gjennom aminosyrerestene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152,153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 uten å reagere med aminosyrerester på utsiden av regionen som er definert ved restene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192).
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R131 er Ala.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R157 er Ala.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R158 er Ala.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DLl-rester(131, 157, 158).
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DS3 (RI 31 W), men ikke til villtype KIR2DS3.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR2DS4.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder til både KIR2DL1 og KIR2DL2/3, men ikke til KIR2DS4.
Kartlegging av hvorvidt et antistoff binder innen én av epitopregionene definert ovenfor kan utføres på måter som er kjent for fagmannen på området. Som et eksempel på slike kartleggings/karakteriseringsmetoder kan en epitopregion for et anti-KIR-antistoff bestemmes gjennom epitop "fingeravtrykk" ved å anvende kjemisk modifisering av eksponerte aminer/karboksyler i KIR2DL1- eller KIR2DL2/3-proteinet. Et spesifikt eksempel på en slik fingeravtrykkteknikk er anvendelsen av HXMS (hydrogen-deuterium utbyttingsdeteksjon ved hjelp av massespektrometri) hvor en hydrogen/deuterium-utbytting av reseptor og ligandproteinamidprotoner, binding og tilbakebytting skjer, hvor ryggradsamidgruppene som deltar i proteinbinding er beskyttet fra tilbakebytting og derfor forblir deutererte. Relevante regioner kan identifiseres på dette punkt ved hjelp av peptidproteolyse, hurtigmikrobor høytrykks væskekromatografiseparering og/eller elektrosprayioniseringsmassespektrometri. Se f.eks. Ehring H, Analytical Biochemistry, vol. 267 (2) sider 252-259 (1999) og/eller Engen, J.R. og Smith, D L.
(2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Et annet eksempel på en egnet epitopidentifiseringsteknikk er nukleær magnetisk resonansepitopkartlegging (NMR), hvor vanligvis posisjonen til signalene i todimensjonale NMR-spektre av det frie antigenet og antigenkompleksbundet med antigenbindende peptid, slik som et antistoff, sammenlignes. Antigenet blir vanligvis selektivt isotypisk meret med<15>N slik at kun signaler som svarer til antigenet og ingen signaler fra antigenbindende peptid ses i NMR-spekteret. Antigensignaler som har sin opprinnelse fra aminosyrer involvert i interaksjonen med antigenbindende peptid vil vanligvis skifte posisjon i spekteret til komplekset sammenlignet med spektrene til det frie antigenet, og aminosyrene som er involvert i bindingen kan identifiseres på denne måten. Se f.eks. Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, vol. 281 (1) sider 61-67 (1998); og Saito og Patterson, Methods. 1996 jun; 9(3):516-24.
Epitopkartlegging/karakterisering kan også utføres ved å anvende massespektrometrimetoder. Se f.eks. Downward, J Mass Spectrom. 2000 apr; 35(4): 493-503 og Kiselar og Downard, Anal Chem. 1999 mai 1; 71(9): 1792-801.
Proteasefordøyingsteknikker kan også være anvendelige i betydningen av epitopkartlegging og identifisering. Antigene determinantrelevante regioner/sekvenser kan bestemmes ved proteasefordøying, f.eks. ved å anvende trypsin i et forhold på omtrent 1:50 til KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 ved fordøying ved 37°C og pH 7-8, etterfulgt av massespektrometri (MS)-analyse for peptididentifisering. Peptidene som er beskyttet fra trypsinkløyving gjennom anti-KIR-binding kan deretter identifiseres ved å sammenligne prøver utsatt for trypsinfordøying og prøver inkubert med antistoff og deretter utsatt for fordøying med f.eks. trypsin (for derved å avsløre et fingeravtrykk for binding). Andre enzymer slik som chymotrypsin, pepsin, osv. eller andre kan alternativt anvendes i en lignende epitopkarakteriseringsmetode. Videre kan enzymatisk fordøying tilveiebringe en rask metode for å analysere hvorvidt en mulig antigen determinantsekvens er innenfor en region i KIR2DL1 i betydningen av et anti-KIR-polypeptid som ikke er eksponert på overflaten og, følgelig, mest sannsynlig ikke er relevant i betydningen av immunogenisitet/antigenisitet. Se f.eks. Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1): 15-9 for en diskusjon om lignende teknikker.
Kry ssreaktivitet med cynomolgusaper
Det er funnet at antistoff NKVSF1 også binder til NK-celler fra cynomolgusaper, se eksempel 7. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor også et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer ved overflaten av humane NK-celler, og som ytterligere binder til NK-celler fra cynomolgusaper. I én utførelsesform er antistoffet ikke antistoff NKVSF1. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å teste toksisiteten til et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer ved overflaten til humane NK-celler, hvori fremgangsmåten omfatter å teste antistoffet i en cynomolgusape.
Preparater oe administrering
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragmenter eller derivater kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske KIR-reseptorer ved overflaten til NK-celler, nøytraliserer deres inhibitoriske signaler og forsterker aktiviteten til disse cellene, i enhver egnet vesikkel i en mengde som effektivt og detekterbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler. Preparatene omfatter ytterligere en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike preparater kalles også "antistoffpreparater ifølge denne oppfinnelsen". I én utførelsesform omfatter antistoffpreparatet ifølge oppfinnelsen et antistoff beskrevet i antistoffutførelsesformene ovenfor. Antistoffet NKVSF1 er inkludert innenfor rammen av antistoffer som kan være tilstede i antistoffpreparatene ifølge oppfinnelsen.
Betegnelsen "biologisk prøve" som anvendt heri inkluderer men er ikke begrenste til, et biologisk fluid (f.eks. serum, lymfe, blod), celleprøver og vevsprøver (f.eks. benmarg).
Farmasøytisk akseptable bærere kan anvendes i disse preparatene og inkluderer men er ikke begrenset til, ionebyttere, aluminium, aluminiumstearat, lecitin, serumproteiner slik som humant serumalbumin, bufferforbindelser slik som fosfat, glysin, sorbinsyre, kaliumsorbat, delvis glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, slik som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidalt silisiumdioksid, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte forbindelser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, polyakrylater, voks, polyetylenpolyoksypropylen blokkpolymerer, polyetylenglykol og lanolin.
Preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for å forsterke aktivitet til NK-celler i en pasient eller i en biologisk prøve. Denne fremgangsmåten omfatter trinnene å bringe nevnte preparat i kontakt med nevnte pasient eller biologiske prøve Slik metode kan være anvendelig for både diagnostiske og terapeutiske formål.
For anvendelse i forbindelse med en biologisk prøve kan antistoffpreparatet administreres ved enkelt å blande eller påføre denne direkte på prøven avhengig av prøvens natur (fluid eller fast). Den biologiske prøven kan bringes i kontakt direkte med antistoffet i enhver egnet anordning (plate, lomme, flaske, osv.). For anvendelse i forbindelse med en pasient må preparatet formuleres for administrering til pasienten.
Preparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, parenteralt, ved inhaleringsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Begrepet "parenteral" som anvendt heri inkluderer subkutane, intravenøse, intramuskulære, intraartikulær, intrasynovial, intrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesjonal og intrakranisk injeksjon eller infusjonsteknikker. Fortrinnsvis administreres preparatene oralt, intraperitonealt eller intravenøst.
Sterile injiserbare former av preparatene ifølge oppfinnelsen kan være vandige eller en oljeaktig suspensjon. Disse suspensjonene kan formuleres ifølge teknikker som er kjent for fagmannen på området ved å anvende egnede dispergerings- eller fuktemidler og suspensjonsmidler. Det sterile injiserbare preparatet kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i en ikke-toksisk parenteral akseptabel oppløsningsvæske eller et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt løsningsmiddel, f.eks. som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vesikler og løsningsmidler som kan anvendes er vann, Ringers løsning og isoton natriumkloridløsning. I tillegg kan sterile, fikserte oljer anvende vanligvis sterile, fikserte oljer som et løsningsmiddel eller suspensjonsmedium. For dette formål kan enhver blandet fiksert olje anvendes, inkludert syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer som oleinsyre og dets glyseridderivater er anvendelige i fremstillingen av injiserbare medier, som naturlig farmasøytisk akseptable oljer, slik som olivenolje eller lakserolje, spesielt i deres polyetylerte versjoner. Disse oljeløsningene eller -suspensjonene kan også inneholde en langkjede alkoholoppløsningsvæske eller dispergeringsmiddel, slik som karboksymetylcellulose eller lignende dispergeringsmidler som er kommersielt anvendelige i formuleringen av farmasøytisk akseptable doseringsformer inkludert emulsjoner og suspensjoner. Andre vanlig anvendte overflateaktive midler, slik som Tweens, Spans og andre emulgeringsmidler eller biotilgjengelighetsforsterkere som vanligvis anvendes i fremstillingen av farmasøytisk akseptable faste, flytende eller andre doseringsformer kan også anvendes til formuleringsformål.
Preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doseringsform inkludert men ikke begrenset til kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. I tilfelle av tabletter for oral anvendelse inkluderer vanlig anvendte bærere laktose og maisstivelse. Smøremidler, slik som magnesiumstearat, tilføres også vanligvis. For oral administrering i en kapselform inkluderer anvendelige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner kreves for oral anvendelse kombineres den aktive ingrediensen med emulgerings- og suspensjonsmidler. Om ønskelig kan også visse søtningsstoffer, smaksstoffer eller fargemidler også tilsettes.
Alternativt kan preparatene ifølge denne oppfinnelsen administreres i form av
stikkpiller for rektal administrering. Disse kan fremstilles ved å blande midlet med en egnet ikke-irriterende eksipient som er fast ved romtemperatur men flytende ved rektal temperatur og som derfor vil smelte i rektum og frigjøre medikamentet. Slike medikamenter inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler.
Preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan også administreres topisk, spesielt når målet for behandlingen inkluderer områder eller organer som er lett tilgjengelig ved topisk påføring, inkludert sykdommer i øyet, huden eller de lavere mage-tarmkanaler. Egnede topiske formuleringer fremstilles enkelt for hver av disse områdene eller organer.
Topisk påføring ved de lavere mage-tarmkanaler kan utføres i en rektal stikkpilleformulering (ovenfor) eller i en egnet enemaformulering. Topisk transdermale plastre kan også anvendes.
For topiske påføringer kan preparatet formuleres i en egnet salve inneholdende den aktive komponenten suspendert eller oppløst i én eller flere bærere. Bærere for topisk administrering av forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til mineralolje, flytende petrolatum, hvit petrolatum, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelse, emulgeringsvoks og vann. Alternativt kan preparatene formuleres i en egnet krem eller lotion som inneholder de aktive komponentene suspendert eller oppløst i én eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere inkluderer men er ikke begrenset til mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestervoks, cetylarylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.
For optalmisk anvendelse kan preparatet formuleres som mikroniserte suspensjoner i isotont, pH-justert, sterilt saltvann, eller fortrinnsvis som en løsning i isotont, pH-justert sterilt saltvann, enten med eller uten et konserveringsmiddel slik som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for optalmisk anvendelse, kan preparatet formuleres i en salve slik som petrolatum.
Preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan også administreres gjennom nasal aerosol eller inhalering. Slike preparater fremstilles ifølge velkjente teknikker innenfor området farmasøytisk formulering og kan fremstilles som løsninger i saltvann, ved å anvende benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsfremmere for å forsterke biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre konvensjonelle oppløsnings- eller dispergeringsmidler.
Flere monoklonale antistoffer er vist å være effektive i kliniske situasjoner, slik som Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) eller Xolair (Omalizumab), og lignende administreringsregimer (dvs. formuleringer og/eller doserings- og/eller administreringsprotokoller) kan anvendes med antistoffene ifølge denne oppfinnelsen. Skjemaer og doseringer for administrering av antistoffet i de farmasøytiske preparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bestemmes i henhold til kjente fremgangsmåter for disse produktene, f.eks. ved å anvende forhandlerens instruksjoner. F.eks. kan et antistoff tilstede i et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen tilføres ved en konsentrasjon på 10 mg/ml i enten 100 mg (10 ml) eller 500 mg (50 ml) separate anvendelsesrør. Produktet formuleres for IV-administrering i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumsitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og sterilt vann for injeksjon. pH justeres til 6,5. Et eksempel på egnet doseringsområde for et antistoff eller et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen kan være mellom omtrent 10 mg/m<2>og 500 mg/m<2>. Imidlertid skal det forstås at disse skjemaene er eksempler og at et optimalt skjema og regime kan tilpasses ved å ta hensyn til affiniteten og tolererbarheten til det spesifikke antistoffet i det farmasøytiske preparatet som må bestemmes i kliniske forsøk. Mengder og skjemaer for injeksjon av et antistoff i et farmasøytisk preparat ifølge denne oppfinnelsen som metter NK-celler i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller en uke eller måned vil bestemmes ved å ta i betraktning affiniteten til antistoffet og dets farmakokinetiske parametere.
Ifølge en annen utførelsesform kan antistoffpreparatet ifølge denne oppfinnelsen ytterligere omfatte andre terapeutiske midler, inkludert midler som normalt anvendes for det spesifikke terapeutiske formål som antistoffene administreres for. Det ytterligere terapeutiske middel vil normalt være tilstede i preparatet i mengder som vanligvis anvendes for det midlet i ne monoterapi for den spesifikke sykdom eller tilstand som behandles. Slike terapeutiske midler inkluderer men er ikke begrenset til terapeutiske midler anvendt i behandlingen av kreft, terapeutiske midler anvendt for å behandle infeksjonssykdom, terapeutiske midler anvendt i andre immunterapier, cytokiner (slik som IL-2 eller IL-15), andre antistoffer og fragmenter av andre antistoffer.
F.eks. er et antall terapeutiske midler tilgjengelig for behandlingen av kreft. Antistoffpreparatene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan
kombineres med alle andre fremgangsmåter som vanligvis anvendes i behandlingen av den spesifikke sykdom, spesielt en tumor, kreftsykdom eller annen sykdom eller lidelse som pasienten har. Så lenge en spesifikk terapeutisk tilnærming ikke er kjent å være skadelig for pasientens tilstand, og ikke signifikant motvirker aktiviteten til antistoffet i et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen og dets kombinasjon er omfattet av oppfinnelsen.
I forbindelse med behandling av fast tumor kan de foreliggende preparater ifølge
oppfinnelsen anvendes i kombinasjon med klassiske tilnærminger, slik som kirurgi, radioterapi, kjemoterapi og lignende. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor kombinerte terapier hvor et farmasøytisk preparat ifølge denne oppfinnelsen anvendes samtidig med, før eller etter kirurgi eller strålingsbehandling; eller administreres til pasienten med, før eller etter konvensjonelle kjemoterapeutika, radioterapeutika eller antiangiogene midler, eller målrettede immuntoksiner eller koagualigander.
Når ett eller flere midler anvendes i kombinasjon med et antistoffinneholdende preparat ifølge denne oppfinnelsen i et terapeutisk regime er det ikke noe krav at de kombinerte resultatene skal være additive for de observerte effekter når hver behandling utføres separat. Selv om i det minste additive effekter vanligvis er ønskelig vil enhver økt antikrefteffekt over det som oppnås av den enkelte terapi være fordelaktig. Det er ei heller et spesifikt krav at den kombinerte behandlingen har synergistiske virkninger, selv om dette selvfølgelig er mulig og fordelaktig.
For å utøve kombinert antikreftterapi vil man enkelt administrere til et dyr et antistoffpreparat ifølge denne oppfinnelsen i kombinasjon med et annet antikreftmiddel på en måte som effektivt resulterer i deres kombinerte antikreftvirkninger i dyret. Midlene vil derfor tilveiebringes i mengder og tidsrom som effektivt resulterer i deres kombinerte nærvær med tumorvaskulaturen og deres kombinerte virkninger i tumormiljøet. For å oppnå dette målet kan et antistoffpreparat ifølge denne oppfinnelsen og antikreftmidler administreres til dyret samtidig, enten i ett enkelt kombinert preparat eller som to adskilte preparater ved å anvende ulike administreringsruter.
Alternativt kan administreringen av et antistoffpreparat ifølge oppfinnelsen gå forut for eller etter antikreftmiddelbehandlingen gjennom f.eks. intervaller som strekker seg fra minutter til uker og måneder. Man vil sikre at antikreftmidlet og antistoffet i antistoffpreparatet ifølge oppfinnelsen har en fordelaktig kombinert effekt på kreften.
De fleste antikreftmidler vil bli gitt forut for et inhibitorisk KIR-antistoffpreparat ifølge oppfinnelsen i en antiangiogen terapi. Når immunkonjugater av et antistoff anvendes i antistoffpreparatet ifølge oppfinnelsen kan imidlertid ulike antikreftmidler administreres samtidig eller påfølgende.
I enkelte situasjoner kan det være ønskelig å utvide behandlingstidsrommet signifikant, hvor flere dager (2, 3, 4, 5, 6 eller 7), flere uker (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) eller til og med flere måneder (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) går mellom den respektive administreringen av antikreftmidlet eller antikreftbehandlingen og administreringen av et antistoffpreparat ifølge oppfinnelsen. Dette vil være fordelaktig i tilfeller hvor antikreftbehandlingen er ment å vesentlig ødelegge tumoren, slik som ved kirurgi eller kjemoterapi, og administreringen av et antistoffpreparat ifølge oppfinnelsen er ment å forhindre mikrometastaser eller tumorgjenvekst.
Det er også omfattet av oppfinnelsen at mer enn én administrering av enten et inhibitorisk KIR-antistoffbasert preparat ifølge oppfinnelsen eller antikreftmidlet kan utnyttes.
Disse midlene kan administreres om hverandre, annenhver dag eller annenhver uke; eller en behandlingssyklus med et inhibitorisk KIR-antistoffpreparat ifølge oppfinnelsen, etterfulgt av en syklus av antikreftmiddelterapi. I ethvert tilfelle, for å oppnå tumorregresjon ved å anvende en kombinasjonsterapi, er alt som trengs å levere begge midler i en kombinert mengde som effektivt har en antitumoreffekt, uavhengig av administreringstiden.
Ved kirurgi kan enhver kirurgisk intervensjon praktiseres i kombinasjon med den foreliggende oppfinnelse. I forbindelse med stråleterapi er alle mekanismer for å indusere DNA-skade lokalt i kreftcellene omfattet, slik som gammastråling, røntgen-, UV-stråling, mikrobølger og til og med elektroniske emisjoner og lignende. Den direkte leveringen av radioisotoper til kreftceller er også omfattet, og dette kan anvendes sammen med et målrettet antistoff eller andre målrettede midler.
I andre aspekter kan immunmodulerende forbindelser eller regimer administreres i kombinasjon med eller som en del av antistoffpreparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse. Foretrukne eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer cytokioner. Ulike cytokiner kan anvendes i slike kombinerte tilnærminger. Eksempler på cytokiner som er anvendelige i kombinasjoner som er omfattet av denne oppfinnelsen inkluderer IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGR, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Cytokiner anvendt i kombinasjonsbehandlingen eller preparater ifølge denne oppfinnelsen administreres i henhold til standardregimer, i samsvar med kliniske indikasjoner slik som tilstanden til pasienten og den relative toksisiteten til cytokinet.
I visse utførelsesformer kan det kryssreagerende inhibitoriske KIR-antistoffinneholdende terapeutiske preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse administreres i kombinasjon med eller kan ytterligere omfatte et kjemoterapeutisk eller hormonelt terapimiddel. Ulike hormonelle terapier og kjemoterapeutiske midler kan anvendes i kombinasjonsbehandlingsmetoder beskrevet heri. Eksempler på kjemoterapeutiske midler som er omfattet av oppfinnelsen, men som ikke er begrenset til disse, er alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, vinsaalkaloider, f.eks. adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, deunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksoter, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etpoposid (VP-16), 5-fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin-C, cisplatin (CDDP), aminopterin, kompretastatin(er) og derivater og forløpermedikamenter derav.
Hormonelle midler inkluderer men er ikke begrenset til f.eks. LHRH-agonister slik som leuprorelin, goserelin, triptorelin og buserelin; anti-østrogener slik som tamoksifen og toremifen; anti-androgener slik som flutamid, nilutamid, cyproteron og bikalutamid; aromataseinhibitorer slik som anastrozol, eksemestan, letrozol og fadrozol; og progestagener slik som medroksy, klormadinon og megestrol.
Fagmannen vil forstå at passende doser av kjemoterapeutiske midler vil ligge nært opp mot de som allerede anvendes i kliniske terapier, hvor de kjemoterapeutiske midler administreres alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler. F.eks. kan midler sliks om cisplatin eller andre DNA-alkylerende midler anvendes. Cisplatin er ofte anvendt for å behandle kreft, med effektive doser anvendt i kliniske anvendelser på 20 mg/m<2>for 5 dager hver tredje uke i totalt 3 runder. Cisplatin adsorberes ikke oralt og må derfor leveres via injeksjon intravenøst, subkutant, intratumoralt eller intraperitonealt.
Ytterligere anvendelige kjemoterapeutiske midler inkluderer forbindelser som påvirker DNA-replikasjon, mitose og kromosomal segregering, og midler som ødelegger syntesen og trofastheten til polynukleotidforløpere. Et antall eksempler på kjemoterapeutiske midler for kombinert terapi er angitt i tabell C i US patent nr. 6 524 583, hvis beskrivelse av midler og indikasjoner er spesifikt inkorporert heri ved referanse. Hver av midlene som er angitt er kun eksempler og ikke begrensende. Fagmannen på området vises til "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. utgave, kapittel 33, spesielt sidene 624-652). Variasjoner i dose vil sannsynligvis opptre avhengig av tilstanden som behandles. Legen som foreskriver behandling vil være i stand til å bestemme den passende dosen for den individuelle pasient.
De foreliggende kryssreagerende, inhibitoriske KIR-antistoffpreparater ifølge oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjon med hvilken som helst eller flere andre antiangiogene terapier og kan ytterligere omfatte antiangiogene midler. Eksempler på slike midler inkluderer nøytraliserende antistoffer, antisens-RNA, siRNA, RNAi, RNA-aptamerer og ribozymer som hver er rettet mot VEGF eller VEGF-reseptorer (US patent nr. 6 524 583, hvilken beskrivelse er inkorporert heri ved referanse). VEGF-varianter med antagonistiske egenskaper kan også anvendes som beskrevet i WO 98/16551, som spesielt er inkorporert heri ved referanse. Ytterligere eksempler på antiangiogene midler som er anvendelige i forbindelse med kombinasjonsterapi er angitt i tabell D i US patent nr. 6 524 583, hvis beskrivelse av midler og indikasjoner er spesifikt inkorporert heri ved referanse.
De inhibitoriske KIR-antistoffpreparatene ifølge denne oppfinnelsen kan også være fordelaktig å anvende i kombinasjon med fremgangsmåter for å indusere apoptose eller kan omfatte apoptotiske midler. F.eks. har et antall onkogener blitt identifisert som inhibitorer av apoptose, eller programmert celledød. Eksempler på onkogener i denne kategorien inkluderer men er ikke begrenset til bcr-abl, bcl-2 (forskjellig fra bcl-1, syklin Dl; GenBank aksesjonsnummer M14745, X06487; US patenter nr. 5 650 491 og 5 539 094; som hver er inkorporert heri ved referanse) og familiemedlemmer som inkluderer Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al og A20. Overekspresjon av bcl-2 ble først oppdaget i T-cellelymfom. Onkogene bcl-2 fungerer ved å binde og inaktivere Bax, et protein i den apoptotiske reaksjonsvei. Inhibering av bcl-2-funksjon forhindrer inaktivering av Bax og tillater fortsettelsen av den apoptotiske reaksjonsvei. Inhibering av denne onkogenklassen, f.eks. ved å anvende antisensnukleotidsekvenser, RNAi, siRNA eller små kjemiske molekylforbindelser er omfattet av anvendelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse for å gi forsterket apoptose (US patent nr. 5 650 491; 5 539 094 og 5 583 034, hver inkorporert heri ved referanse).
De inhibitoriske KIR-antistoffpreparatene ifølge denne oppfinnelsen kan også omfatte eller anvendes i kombinasjon med molekyler som omfatter en målrettet del, f.eks. antistoff, ligand eller konjugat derav, rettet mot en spesifikk markør eller målcelle ("målrettet middel"), f.eks. mot en tumorcelle. Generelt vil målrettede midler for anvendelse i disse ytterligere aspektene ved oppfinnelsen fortrinnsvis gjenkjenne mottakelige tumorantigener som fortrinnsvis eller spesifikt uttrykkes i tumorsetet. De målrettede midlene vil generelt binde til en overflateuttrykt, overflatetilgjengelig eller overflatelokalisert komponent på en tumorcelle. De målrettede midlene vil også fortrinnsvis ha høye affinitetsegenskaper; og vil ikke ha signifikante in vivo-bivirkninger mot livsopprettholdende, normalt vev, slik som ett eller flere vev valgt fra hjerte, nyre, hjerne, lever, benmarg, tarm, bryst, prostata, tyroid, galleblære, lunge, binyrer, muskler, nervefibre, pankreas, hud eller andre livsopprettholdende organer i det menneskelige legeme. Betegnelsen "ikke har signifikante bivirkninger" som anvendt heri viser til det faktum at et målrettet middel, når det administreres in vivo, vil produsere kun neglisjerbare eller klinisk håndterbare bivirkninger, slik som de som normalt forekommer ved kjemoterapi.
I behandlingen av tumorer kan et antistoffpreparat ifølge denne oppfinnelsen ytterligere omfatte eller kan anvendes i kombinasjon med adjunktforbindelser. Adjunktforbindelser kan inkludere f.eks. antibrekkmidler slik som serotoninantagonister og terapier slik som fenotiaciner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyrofenoner, kortikosteroider, benzodiazepiner og kanabinoider; bisfosfonater slik som soledronsyre og pamidronsyre; og hematopoetiske vekstfaktorer slik som erytropoetin og G-CSF, f.eks. filgrastim, lenograstim og darbepoietin.
I en annen utførelsesform kan to eller flere antistoffer ifølge denne oppfinnelsen med ulike kryssreaktiviteter, inkludert NKVSF1 kombineres i et enkelt preparat for slik å nøytralisere den inhibitoriske effekten av så mange inhibitoriske KIR-genprodukter som mulig. Preparater som omfatter kombinasjoner av kryssreagerende inhibitoriske KIR-antistoffer ifølge denne oppfinnelsen, eller fragmenter eller derivater derav, vil tillate en enda videre anvendelse fordi det sannsynligvis eksisterer en liten prosent av den humane populasjon som mangler hver av de inhibitoriske KIR-genproduktene som gjenkjennes av et enkelt kryssreagerende antistoff. Tilsvarende kan et antistoffpreparat ifølge denne oppfinnelsen ytterligere omfatte ett eller flere antistoffer som gjenkjenner enkelte inhibitoriske KIR-undertyper. Slike kombinasjoner vil igjen tilveiebringe videre anvendelse i en terapeutisk setting.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å forsterke NK-celleaktivitetseffekt i en pasient med behov for slik behandling, omfattende trinnene å administrere et preparat ifølge denne oppfinnelsen til nevnte pasient. Fremgangsmåten er nærmere spesifikt rettet på økningen av NK-celleaktivitet i pasienter med en sykdom hvor økning av NK-celleaktivitet er fordelaktig, som involverer, påvirker eller er forårsaket av celler som er mottakelig for lysis av NK-celler, eller som er forårsaket eller kjennetegnet ved manglende NK-celleaktivitet, slik som i en kreft, andre proliferative sykdommer, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom. Nærmere bestemt utnyttes fremgangsmåtene ved foreliggende oppfinnelse for behandlingen av mange krefttyper og andre proliferative sykdommer som inkluderer men ikke er begrenset til karsinoma, inkludert karsinom i blæren, bryst, tarm, nyre, lever, lunge, eggstokk, prostata, pankreas, mage, livmorhals, tyroid og hud, inkluder skvamøs cellekarsinom, hematopoetiske tumorer i lymfesystemet, inkludert leukemi, akutt lymfocyttleukemi, akutt lymfoblastleukemi, B-cellelymfom, T-cellelymfom, Hodgkins lymfom, ikke-Hodgkins lymfom, hårcellelymfom eller Burketts lymfom; hematopoetiske tumorer i myeloidsystemet, inkludert akutt eller kronisk myelogenøs leukemi og promyelocyttisk leukemi; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkludert fibrosarkom og rabdomyosarkom; andre tumorer, inkludert melanom, seminoma, teratokarsinom, nevroblastom og gliom; tumorer i det sentrale og perifere nervesystem, inkludert astrocytom, nevroblastom, gliom og schwannoma; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkludert fibrosarkom, rabdomyosarkom og osteosarkom; og andre tumorer, inkludert melanom xeroderm pigmentosum, keratoacantom, seminom, tyrpid follikulær kreft og teratokarsinom.
Foretrukne sykdommer som kan behandles ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer hematopoetiske tumorer i lymfesystemet, f.eks. T-celle- og B-celletumorer, inkludert men ikke begrenset til T-cellesykdommer slik som T-prolymfocyttisk leukemi (T-PLL), inkludert små celle og cerebriform celletype; større granulær lymfocyttleukemi (LGL), fortrinnsvis av T-celletype; Sezary syndrom (SS); voksen T-celle-leukemilymfom (ATLL); a/d T-NHL hepatospen lymfom; perifer/post-tymus T-cellelymfom (pleomorf og immunblastiske undertyper); angioimmunoblastisk T-cellelymfom; angiosentrisk (nasal) T-cellelymfom, anaplastisk (Ki 1+) større cellelymfom; T-celletarmlymfom; T-lumfoblastisk; og lymfom/leukemi (T-Lbly/T-ALL).
Andre prolifererende sykdommer kan også behandles i henhold til oppfinnelsen, inkludert f.eks. hyperblasias, fibrosis (spesielt pulmonær, men også andre typer fibrose, slik som renal fibrose), angiogenese, psoriasis, aterosklerose og glatt muskelproliferering i blodårer; slik som stenose eller restenose etterfulgt av angioplasti. Det kryssreagerende inhibitoriske KIR-antistoffet ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes for å behandle eller forebygge infeksiøse sykdommer, inkludert fortrinnsvis hvilken som helst infeksjoner forårsaket av virus, bakterier, protosoa, mugg eller sopp. Slike virale infeksiøse organismer inkluderer men er ikke begrenset til hepatitt type A, hepatitt type B, hepatitt type C, influensa, varicella, adenovirus, herpes simplex type I (HSV-1), herpes simplex type 2 (HSV-2), kvegpest, rinovirus, ekkovirus, rotavirus, respiratorisk syncytialvirus, papillomaviris, cytomegalovirus, ekinovirus, arbovirus, huntavirus koxasikivirus, kusmavirus, meslingvirus, røde hunder virus, poliovirus og human immunsviktvirus type I eller type 2 (HIV-1, HIV-2).
Bakterieinfeksjoner som kan behandles ifølge denne oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til infeksjoner forårsaket av følgende: Staphylococcus; Streptococcus, inkludert S. pyogenes; Enterococcl; Bacillus, inkludert Bacillus anthracis, og Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphteriae; Gardnerella inkludert G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas inkludert Raeruginose; Legionella; Neisseria inkludert N.gonorrhoeae og N.meningitides; Flavobaterium inkludert F. meningosepticum og F. odoraturn; Burcella; Bordetella inkludert B. pertussis og B. bronchiseptica; Escherichia inkludert E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia inkludert S. marcescens og S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus inkludert P. mirabilis og P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiacea inkludert R. fickettsfi, Chlamydia inkludert C. psittaci og C. trachornatis; Mycobacterium inkludert M. tuberculosis, M. intracellular, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansaii, M. intracellulare og M. lepraernorium; og Nocardia.
Protozoainfeksj oner som kan behandles ifølge denne oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til, infeksjoner forårsaket av leishmania, kokzidioa og trypanosoma. En fullstendig liste over infeksjonssykdommer finnes på hjemmesiden til the National Center for Infectious Disease (NCID) ved senter for sykdomskontroll (CDC) ( http:// www. cdc. gov/ ncidod/ diseasesA). og hvor denne listen er inkorporert heri ved referanse. Alle nevnte sykdommer er kandidater for behandling ved anvendelse av de kryssreagerende inhibitoriske KIR-anti stoffene ifølge oppfinnelsen.
Slike fremgangsmåter for å behandle ulike infeksjonssykdommer kan utnytte antistoffpreparater ifølge denne oppfinnelsen, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlings- og/eller terapeutiske midler som er kjent for behandling av slike sykdommer, inkludert antivirale midler, antisoppmidler, antibakterielle midler, antibiotika, antiparasittmidler og anti-protozoamidler. Når disse fremgangsmåtene involverer ytterligere behandlinger med ytterligere terapeutiske midler kan disse midlene administreres sammen med antistoffene ifølge oppfinnelsen som enten en enkel doseringsform eller som separate, multiple doseringsformer. Når de administreres som en separat doseringsform kan de ytterligere midlene administreres forut for, samtidig med eller etter administreringen av antistoffet ifølge denne oppfinnelsen.
Ytterligere aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil bli beskrevet i den følgende eksperimentelle delen, som bør betraktes som illustrerende og ikke begrensende for rammen av denne oppfinnelsen.
Eksempel 1
Rensing av PBL' er oe dannelse av polyklonale eller klonale NK- cellelinier PBL'er ble utledet fra friske donorer ved hjelp av Ficoll Hupaque-gradienter og uttømming av plastiske adherentceller. For å oppnå berikede NK-celler ble PBL'er inkubert med anti-CD3-, anti-CD4- og anti-HLA-DR mAb'er (30 min. ved 4°C), etterfulgt av geite anti mus magnetiske kuler (Dynal) (30 min ved 4°C) og immunmagnetisk seleksjon ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen (Pende et al., 1999). CD3 -, CD4 -, CDR"-celler ble dyrket på bestrålte forceller og 100 U/ml interleukin 2 (proleukin, Chiron Corporation) og 1,5 ng/ml fytohemagglutinin A (Gibco BRL) for å oppnå polyklonale NK-cellepopulasjoner. NK-celler ble klonet ved hjelp av begrenset fortynning og kloner av NK-celler blekarakterisert vedflow cytometri for ekspresjon av celleoverflatereseptorer.
De anvendte mAb'er var JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 og GL183 (IgGl anti KIR2DL1 og KIR2DL3), XA-141 IgM (anti KIR2DL1 med den samme spesifisiteten som EB6), anti CD4 (HP2.6) og anti DR (Dl. 12, IgG2a). Istedenfor JT3A, HP2.6 og DR1.12, som ble fremstilt av søkerne, kan kommersielt tilgjengelig mAb med de samme spesifisiteter anvendes (Beckman Coutler Inc., Fullerton, CA). EB6 og GL 183 er kommersielt tilgjengelig (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141 er ikke kommersielt tilgjengelig, men EB6 kan anvendes for lysisrekonstitusjonskontroll som beskrevet i Moretta et al., 1993.
Celler ble farget med de passende antistoffer (30 mns ved 4°C) etterfulgt av PE eller FITC-konjugert polyklonalt antimuseantistoffer (Southern Biotechnology Associates Inc.). Prøver ble analysert ved hjelp av cytofluormetrisk analyse på et FACSAN-apparat (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
De følgende klonene ble anvendt i denne studien. CPU, CN5 og CN505 er KIR2DL1-positive kloner og ble farget ved hjelp av EB6 (IgGl og KIR2DL1) eller XA-141 (IgM-anti KIR2DL1, med samme spesifisitet sammenlignet med EB6-antistoffer). CN12 og CP502 er KIR2DL3-positive kloner og ble farget med GL183-antistoff (IgGl-anti-KIR2DL3).
Den cytolytiske aktiviteten til NK-klonene ble vurdert ved hjelp av en standard 4 timers<51>Cr-frigjøringsanalyse hvor effektor NK-celler ble testet på Cw3- eller Cw4-positive cellelinjer som er kjent for deres sensitivitet for NK-cellelysis. Alle målene ble anvendt ved 5000 celler pr. brønn i mikrotiterplater og effektonmål-forhold er angitt i figurene (vanligvis 4 effektorceller pr. målceller). Den cytolytiske analysen ble utført med eller uten supernatant med de angitte monoklonale antistoffer ved V2-fortynning. Prosedyren var vesentlig den samme som beskrevet i Moretta et al., 1993.
Eksempel 2
Dannelse av nve mAb
mAb ble dannet ved å immunisere 5 uker gamle Balb C-mus med aktivert polyklonalt eller monoklonale NK-cellelinjer som beskrevet i Moretta et al., 1990. Etter ulike cellefusjoner ble mAb først utvalgt for deres evne til å kryssreagere med EB6 og GLI83-positive NK-cellelinjer og -kloner. Positive monoklonale antistoffer ble ytterligere analysert for deres evne til å rekonstituere lysis ved hjelp av EB6-positive eller GL 183-positive NK-kloner av henholdsvis Cw4- eller Cw3-positive målceller.
Cellefarging ble utført som følger. Celler ble farget med et antistoffpanel (1 u.g/ml eller 50 ul supernatant, 30 mns ved 4°C) etterfulgt av PE-konjugert geite-F(ab')2-fragment-anti-muse IgG (H+L) eller PE-konjugert geite-F(ab')2-fragment antihumant IgG (Fc-gamma)-antistoffer (Beckman Coulter). Cytofluorometrisk analyse ble utført på et Epics XL.MCL-apparat (Beckman Coulter).
Ett av de monoklonale antistoffene, DF200 mAb, ble funnet å reagere med ulike medlemmer av KIR-familien, inkludert KIR2DL1, KIR2DL2/3. Begge KIR2DL1+-og KIR2DL2/3+-NK-cellene ble farget klart med DF200mAb (fig. 1).
NK-kloner som uttrykker én eller en annen (eller begge) av disse HLA klasse I-spesifikke inhibitoriske reseptorer ble anvendt som effektorceller mot målceller som uttrykker én eller flere HLA-C-alleler. Cytotoksisitetsanalyser ble utført som følger. Den cytolytiske aktiviteten til YTS-KIR2DL1 eller YTS-Eco-cellelinjene ble vurdert ved hjelp av en standard 4 timers 51Cr-frigjøringsanalyse. Effektorcellene ble testet på HLA-Cw4-positive eller -negative EBV-cellelinjer og HLA-Cw4-transfekterte 721.221-celler. Alle målcellene ble anvendt ved 3000 celler/brønn i mikrotitreringsplate. Effektor/målratio er angitt i figurene. Den cytolytiske analysen ble utført med eller uten den angitte fullengde- eller F(ab')2-fragmentene av monoklonale muse antistoffer eller humane antistoffer. Som forventet viste KIR2DL1+ NK-kloner liten om noen cytolytisk aktivitet mot målceller som uttrykker HLA-Cw4 og KIR2DL3+-NK-kloner viste ingen eller liten aktivitet på Cw3-positive målceller. Imidlertid, i nærvær av DF200mAb (anvendt for å maskere deres KIR2DL-reseptorer) ble NK-klonene ikke i stand til å gjenkjenne deres HLA-C-ligander og viste sterk cytolytisk aktivitet på Cw3- eller Cw4-mål.
F.eks. ble CIR-cellelinjen (CW4<+>EBV-cellelinjen, ATCC n°CRL 1993) ikke drept av KIR2DL1<+>NK-kloner (CN5/CN505), men inhiberingen kunne effektivt reverseres ved å anvende enten DF200 eller et konvensjonelt anti-KIR2DLl-mAb. På den annen side drepte NK-kloner som uttrykte KIR2DL2/3<+>KIR2DLl"-fenotyp (CN12) effektivt CIR-celler og denne drepingen ble ikke påvirket av DF200mAb (fig. 2). Tilsvarende resultater ble oppnådd med KIR2DL2- eller KIR2DL3-positive NK-kloner på Cw3-positive målceller.
Tilsvarende ble Cw4+ 221 EBV-cellelinjen ikke drept av KIR2DLl<+->transfekterte NK-celler, men inhiberingen kunne effektivt reverseres ved anvendelsen av enten DF200, et DF200 Fab-fragment, eller et konvensjonelt anti-KIR2DLl mAb EB 6 eller XA141. En Cw3+ 221 EBV-cellelinje ble heller ikke drept av KIR2DL2<+>NK-celler, men denne inhiberingen kunne reverseres ved anvendelsen av enten DF200 eller et DF200-Fab-fragment. Endelig ble sistnevnte Cw3+ 221 EBV-cellelinje ikke drept av KIR2DL3<+->NK-celler, men denne inhiberingen kunne reverseres ved anvendelsen av enten et DF200 Fab-fragment eller et konvensjonelt anti-KIR2DL3-mAb GL 183 eller Y249. Resultatene er vist i fig. 3.
F(ab')2-fragmenter ble også testet for deres evne til å rekonstituere lysis av Cw4-positive målceller. F(ab')2-fragmenter av DF200 og EB6 Ab'er var begge i stand til å reversere inhiberingen av lysis ved hjelp av KIR2DL1-transfekterte NK-celler av Cw4-transfektert 221-cellelinje og Cw4+ TUBO EBV-cellelinje. Resultatene er vist i fig- 4.
Eksempel 4
Dannelse av nve humane mAb' er
Humane monoklonale anti-KIR Ab'er ble dannet ved å immunisere transgene mus fremstilt for å uttrykke et humant antistoffrepertoar med rekombinant KIR-protein. Etter ulike cellefusjoner ble mAb'ene først utvalgt for deres evne til å kryssreagere med immobisert KIR2DL1- og KIR2DL2-protein. Flere monoklonale antistoffer, inkludert 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 ble funnet å reagere med KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Positive monoklonale antistoffer ble ytterligere analysert for deres evne til å rekonstituere lysis ved hjelp av EB6-positive NK-transfektante celler som uttrykker KIR2DL1 av Cw4-positive målceller. NK-cellene som uttrykker HLA klasse I-spesifikke inhibitoriske reseptorer ble anvendt som effektorceller mot målceller som uttrykker én eller flere HLA-C-alleler (fig. 5 og 6). Cytotoksisitetsanalyser ble utført som beskrevet ovenfor. Effektor/målcelleforhold er angitt i figurene og antistoffer ble anvendt ved enten 10 u.g/ml eller 30 u.g/ml.
Som forventet viste KIR2DL1<+>NK-celler liten om noen cytolytisk aktivitet mot målceller som uttrykker HLA-Cw4. I nærværet av 1-7F9 mAb ble NK-cellene imidlertid ikke i stand til å gjenkjenne deres HLA-C-ligander og viste sterk cytolytisk aktivitet på Cw4-målceller. F.eks. ble de to cellelinjene som var testet
(HLA-Cw4 transfektert 721.221- og Cw4<+>EBV-cellelinjer) ikke drept av
KIR2DL1<+>NK-celler, men hemmingen kunne effektivt reverseres ved anvendelsen av enten Mab 1-7F9 eller et konvensjonelt anti-KIR2DL1 -mAb-EB6. Ab DF200 og panKIR (også kaltNKVSF19 ble sammenlignet med 1-7F9. Antistoffene 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 var på den annen side ikke i stand til å rekonstituere cellelysis gjennom NK-celler på Cw4-positive målceller.
Eksempel 5
Biacore- analvse av DF200 mAb/ KIR2DLl og DF200 mAb/ KIR2DL3- interaksjoner Produksjonen og rensingen av rekombinante proteiner
KIR2DL1- og KIR2DL3-rekombinante proteiner ble fremstilt i E. coli. cDNA som koder for hele det ekstracellulære domenet av KIR2DL1 og KIR2DL3 ble amplifisert ved hjelp av PCR fra pCDM8-klon 47.11-vektor (Biassoni et al., 1993) og RSVS(gpt)183-klon-6-vektor (Wagtman et al., 1995) ved å anvende de følgende primere
De ble klonet i pMLl-ekspresjonsvektor i ramme med en sekvens som koder for et biotinyleringssignal (Saulquin et al., 2003).
Proteinekspresjon ble utført i BL21(DE3)-bakteriestamme (Invitrogen). Transfekterte bakterier ble dyrket til OD6oo=0,6 ved 37°C i mediet supplementert med ampicillin (100 u.g/ml) og ekspresjon ble indusert med 1 mM IPTG.
Proteiner ble gjenvunnet fra inklusjonslegemer og denaturerende betingelser (8 M urea). Tilbakefolding av de rekombinante proteiner ble utført i 20 mM Tris, pH 7,8, NaCl 150 mM buffer som inneholdt L-arginin (400 mM, Sigma) og P-merkaptoetanol (1 mM), ved romtemperatur, ved å redusere ureakonsentrasjonen i en sekstrinns dialyse (henholdsvis 4, 3, 2, 1, 0,5 og 0 M urea). Redusert og oksidert glutation (5 mM og 0,5 mM, Sigma) ble tilsatt i løpet av 0,5- og 0 M ureadialysetrinnene. Endelig ble proteinene dialysert grundig mot 10 mM Tris, pH 7,5 NaCl 150 mM-buffer. Løselige, tilbakefoldede proteiner ble konsentrert og deretter renset på en Superdex 200 størrelseseksklusjonskolonne (Pharmacia; AKTA-system).
Overflate plasmonresonansmålinger ble utført på et Biacore-apparat (Biacore). I alle Biacore-eksperimentene ble HBS-buffer tilført 0,05 % overflateaktivt P20-middel brukt som kjørebuffer.
Proteinimmobilisering
Rekombinant KIR2DL1- og KIR2DL3-proteiner fremstilt som beskrevet ovenfor ble immobilisert kovalent på karboksylgrupper i dekstranlaget på en sensor chip CM5 (Biacore). Sensorchipoverflaten ble aktivert med EDC/NHC (N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid og N-hydroksysuksinimid, Biacore). Proteiner, i koplingsbuffer (10 mM acetat, pH 4,5) ble injisert. Deaktivering av de gjenværende aktiverte gruppene ble utført ved å anvende 100 mM etanolamin, pH 8 (Biacore).
Affinitetsmålinger
For kinetiske målinger ble ulike konsentrasjoner av det løselige antistoff (1 x IO"7 til 4 x 10"<10>M) påført på den immobiliserte prøven. Målinger ble utført ved en 20 ul/min. kontinuerlig gjennomstrømningshastighet. For hver syklus ble overflaten til sensorchipen regenerert med 5 ul injeksjon av 10 mM NaOH pH 11. BIAlogg kinetikk-evalueringsprogramet (BIAevaluation 3.1, Biacore) ble anvendt for å analysere data. Den løselige analytten (40 ul ved ulike konsentrasjoner) ble injisert med en gjennomstrømningshastighet på 20 ul/min. i HBS-buffer, på dekstranlag inneholdende 500 eller 540 reflektansenheter (RU), og 1000 eller 700 RU av henholdsvis KIR2DL1 og KIR2DL3. Data er representative for 6 uavhengige eksperimenter. Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.
Tabell 1. BIAcore-analyse av DF200 mAb som binder til immobilisert KIR2DL1 og KIR2DL3.
Eksempel 6
Biacore kompetitiv bindingsanalyse av anti- KIR- antistoffer fra mus og menneske Epitopkartleggingsanalyse ble utført på immobilisert KIR2DL1 (900 RU), KIR2D13 (2000 RU) og KIR2DS1 (1000 RU) med muse anti-KIR2D-antistoffer DF200, Pan2D, gl 183 og EB6, og humane anti-KIR2D-antistoffer 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 og 1-7F9 som beskrevet tidligere (Gauthier et al., 1999, Suanal og van Regenmortel 1995).
Alle eksperimentene ble utført ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ul/min. i HBS-buffer med 2 min. injeksjon av de ulike antistoffer ved 15 u.g/ml. For hvert antistoffpar ble kompetitiv bindingsanalyse utført i to trinn. I det første trinnet ble det første monoklonale antistoffet (mAb) injiesrt på KIR2D-målprotein etterfulgt av det andre mAb (uten å fjerne det første mAb) og det andre mAb RU-verdi (RU2) ble monitorert. I det andre trinnet ble det andre mAb injisert først, direkte på nakent KIR2D-protein og mAb RU-verdien (RUI) ble monitorert. Prosentvis hemming av den andre mAb binding til KIR2D-protein gjennom første mab ble beregnet: 100<*>(1-RU2/RU1).
Resultatene er vist i tabellene 2, 3 og 4 hvor antistoffene angitt "første antistoff er angitt i den vertikale kolonnen og det "andre antistoff er angitt i den horisontale kolonnen. For hver testet antistoffkombinasjon er verdiene for direkte bindingsnivå
(RU) for antistoffene til chipen angitt i tabellen hvor direkte binding av det andre antistoffet til KIR2D-chipen er angitt i den øvre delen av feltet og verdien for binding til det andre antistoffet til KIR2D-chipen når det første antistoffet er tilstede er angitt i den lavere delen av feltet. Angitt til høyre i hvert felt er prosent inhibering for andre antistoffbinding. Tabell 2 viser bindingen på en KIR2DL1-chip, tabell 3 viser bindingen av antistoffer til en KIR2DL3-chip og tabell 4 viser bindingen av antistoffer til en KIR2DSl-chip.
Kompetitiv binding av museantistoffer DF200, NKVSF1 og EB6 og humane antistoffer 1-4F1, 1-7F9 og 1-6F1 til immobilisert KIR2DL1, KIR2DL2/3 og KIR2DLS1 ble vurdert. Epitopkartlegging (fig. 7) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som bindert il KIR2DL1 viser at (a) antistoff 1-7F9 er kompetitiv med EB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200; (b) antistoff 1-4F1 på sin side er kompetitiv med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7F9; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6 mne ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9. Epitopkartlegging (fig. 8) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder til KIR2DL3 viste at (a) 1-4F1 er kompetitiv med NKVSF1, DF200, gl 183 og 1-7F9; (b) 1-7F9 er kompetitiv med DF200, gl 183 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GL183, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og 1-7F9, men ikke med GL 183. Epitopkartlegging (fig. 9) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder til KIR2DS1 viste at (a) 1-4F1 er kompetitiv med NKVSF1, DF200 og 1-7F9; (b) 1-7F9 er kompetitiv med 1-4F1 men ikke kompetitiv med DF200 og NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1 men ikke med 1-7F9.
Eksempel 7
Anti- KIR mAb- titrerine med cvnomoleus- NK- celler
Anti-KIR-antistoff NKVSF1 ble testet for dets evne til å binde NK-celler fra cynomolugsaper. Bindingen av antistoffet til ape-NK-celler er vist i fig. 10.
Rensins av ape PBMC os dannelse av pol<y>klonale NK - cellemateriale
Cynomolgus Macaque PBMC ble fremstilt fra natriumsitrat CPT-rør (Becton Dickinson). NK-cellerensing ble utfør tved hjelp av negativ uttømming (Macaque NK-celleanrikningskit, Stem Cell Technology). NK-celler ble dyrket på bestrålte humane forceller, 300 U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1 ng/ml fytohemagglutinin A (Invitrogen, Gibco) for å oppnå polyklonale NK-cellepopulasj oner.
Pan2D mAb titr er ing med cynomolgus- NK- celler.
Cynomolgus-NK-celler (NK-materiale dag 16) ble inkubert med ulike mengder Pan2D mAb etterfulgt av PE-konjugerte geite F(ab')2-fragmenter-anti-muse-IgG
(H+L)-antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt med en isotypisk kontroll (renset muse IgGl). Prøver ble utført i duplikat. Gjennomsnittelig fluorescensintensitet = MFL
Eksempel 8
Epitop-kartlegging av DF200- og pan2D-binding til KIR2DL1
Datamodellering av de ekstracellulære domenene til KIR2DL1, -2 og -3 (KIR2DL1-3), basert på deres publiserte kry stall strukturer (Maenaka et al. (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al. (2000)), antydte involveringen av aminpsurene R131<1>i interaksjon mellom KIR2DL1 og KIR2DL1-3-kryssreagerende musemonoklonale antistoffer (mAb'er) DF200 og pan2D. For å verifisere dette ble fusjonsproteiner fremstilt som bestod av det fullstendige ekstracellulære domenet til KIR2DL1 (aminosyrene H1-H224), enten villtype eller punktmutert (f.eks. R131W<2>), fusert til humant Fc (hFc). Materialet og metodene som ble anvendt for å fremstille og evaluere de ulike KIR2DLl-hFc fusjonsproteinene er beskrevet (Winter og Long (2000)). Kort fortalt ble KIR2DL1 (R13 lW)-hFc-kodende cDNA-vektorer dannet ved hjelp av PCR-basert mutagenese (Quickchange II, Promega) av CL42-Ig, en publisert cDNA-vektor for fremstillingen av villtype KIR2DLl-hFc (Wagtmann et al., (1995)). KIR2DLl-hFc og KIR2DL1 (R131W)-hFc ble fremstilt COS7-celler og isolert fra vevskulturmediet, vesentlig som beskrevet av Wagtmann et al., 1995. For å teste den korrekte foldingen ble KIR2DLl-hFc og KIR2DL1 (R131W)-hFc inkubert med LCL721.221-celler som uttrykker enten HLC-Cw3 (ingen KIR2DL1-ligand) eller HLA-Cw4 (KIR2DL1-ligand) og interaksjonen mellom KIR-Fc-fusjonsproteiner og celler ble analysert ved hjelp av FACS, en standardteknikk for å studere proteininteraksjoner på celleoverflate. Et eksempel på uavhengige eksperimenter er gitt i fig. 11, panel A. Som forutsatt fra literaturen bandt ingen av KIR2DLl-hFc-fusjonsproteinene til HLA-Cw3 uttrykt av LCL271.221 -celler. I kontrast til dette bandt både KIR2DLl-hFc og KIR2DL1 (R131W)-hFc til HLA-Cw4-uttrykkende LCL721.221 -celler hvilket derved bekreftet deres korrekte folding.
Bindingen av KIR2DL1 (R131W)-hFc og KIR2DLl-hFc til KIR-spesifikke mAb (DF200, pan2D, EB6 og GL 183) ble studert ved å anvende ELISA, en standardteknikk for å undersøke proteininteraksjoner. Kort fortalt ble KIR2DL1 (R131W)-hFc og KIR2DLl-hFC bundet til 96-brønns plater via geite anti-humane antistoffer, hvoretter KIR-spesifikke mAb ble tilsatt i ulike konsentrasjoner (0-1 u.g/ml i PBS). Interaksjonene mellom KIR2DL1-hFc-varianter og mAb'er ble visualisert ved hjelp av spektrofotometri (450 nm) ved å anvende peroksidasekoplede sekundære antistoffer spesifikke for museantistoffer for å konvertere TMB-substrat. Et ekempel på uavhengige eksperimenter er gitt i fig. 11, panel B. Mens KIR2DL2-3-spesifikke mAb GL 183 ikke var i stand til å binde noen av KIR2DLl-hFc-fusjonsproteinene bandt KIR2DL1-spesifikke mAb EB6, DF200 og pan2D til KIR2DLl-hFc-varianter på en doseavhengig måte. Enkeltpunktmutasjonen (RI31 W) påvirket bindingen av DF200 og pan2D med en reduksjon i binding sammenlignet med villtype på~10 % ved høyeste konsentrasjon av mAb (1 u.g/ml), hvilket bekreftet at R131 er del av bindingssetet til DF200 og
pan2D i ekstracellulært domene 2 i KIR2DL1.
1 Enkeltbokstavamino sy rekode
<2>Substitusjon av R for W ved aminosyreposisjon 131 (fra N-terminale ende) i KIR2DL1
REFERANSER
Moretta, A-, Bottino, C, Pende, D., Tripodi, G., Tambussi, G., Viale, O., Orengo, A., Barbaresi, M., Merli, A., Ciccone, E., and et al. (1990). Identification of fom subsete of human CD3- CD16+ natural killer (NK) cells by the expression of clonally distributed functional surface molecules: correlation between subset assignment of NK. clones and abilitytomediatespecificaUoantigenreæ J Exp Med 1 72, 1589-1 598.
Moretta, A-, Vitale, M., Bottino, C, Orengo, A. ML, Morelli, L, Augugliaro, R-, Barbaresi, M., Ciccone, E., and Moretta, L. (1993). P58 molecules as putaiive receptors for major histocomparibility complex (MHC) class I molecules in human natural killer (NK) cells. Anti-p58 antibodies reconstitute lysis of MHC class L-piotected cells in NK
. clones displaying different specificities. J Exp Med 178,597-604.
Pende, D., Parolini, S., Pessino, A., Sivori, S., Augugliaro, R., Morelli, L., Marcenaro, E-, Accame, L., Malaspina, A, Biassoni, R., et al (1999). Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Med 190,1505-1516.
Ruggen, L., Capanni, M., Urbani, E., Perruccio, K-, Shlomchik, W. D., Tosti, A., Posati, S., Rogaia, D., Frassoni, F., Aversa, F, et al (2002). ESectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 295, 2097-2100.
Wagtmann N, Biassoni R, Canloni C, Verdiani S, Malnati MS, Vitale M, Bottino C, Moretta L, Moretta A, Long ECMolecnlar clones of the p58 NK cell receptor reveal imrnunoglobulin-related molecules with diversity in botn the extra- and inrxacellular domamsJmmnnity. 1995 May2(5):439-49.
Biassoni R, Verdiani S, Cambiaggi A, Romeo PH, Ferrini S, Moretta LHuman CD3-
CD16-J- natural killer cells express the hGATA-3 T cell transcription fector and an unrearranged 2.3-kb TcR delta transcript Eur J ImmunoL 1993 May,23(5):1083-7.
Saulquin X, Gastinel LN, Vivier E.Crystal strucrure of the human natural killer cell activating receptor KIR2DS2 (CD158j) J Exp Med. 2003 Apr 7;197(7):933-8.
Gauthier, L., Lemmers, B., Guelpa-Fonlupt, V., Fougereau, M., and Schiff, C.
H-SLC physico-chemical interactions of the human preB cell recepton implications for
VH repertoire selection and cell signaling at the preB cell stage. Journal of Immunology, 162., 41-50. (1999).
Saiinal, H. and Van RegenmorteL, MH.V., Mapping of viral conformation epitopes
using biosensor measurements. Journal of Immunology, 183:33-41 (1995).
Bo yinptonJC: MotvkaSA: SchuckP: Brooks AG>. Sun PD. Nature, VoL 405 (6786) pp.
537-543 (2000)
Fan OR: Lone EO: WilevDC. Nature immunology, VoL 2 (5) pp. 452-460 (2001)
Mat-naVa nr- Jufj T: Stuart DL Jones EY. Structure with Folding and design, VoL 7 (4)
pp. 391-398 (1999)
Wa<g>tmann N: Raia<g>opalan S: Winter CC: Pwnroi Mr Lone EO. Immunity, VoL 3 (6) pp. 801-809 (1995)
Winter CC; Long EO. Natural Killer Cells Protocols (edited by Campbell KS and Colorma M). Human Press. pp. 219-238 (2000)
Alle referanser, inkludert publikasjoner, patentsøknader og patenter som er sitert heri er herved inkorporert ved referanse i den grad som om hver referanse var individuelt og spesifikt angitt og skulle være inkorporert ved referanse i sin helhet heri.
Alle overskrifter og underoverskrifter er anvendt heri av bekvemmelighetshensyn og skal ikke tolkes begrensende for oppfinnelsen på noen måte.
Enhver kombinasjon av de ovenfor beskrevne elementer i alle mulige variasjoner er derfor omfattet av oppfinnelsen om ikke annet er angitt heri, eller på annen måte kontradiktert av konteksten.
Uttrykkene "en" og "den" og lignende referanser som anvendt i forhold til å beskrive oppfinnelsen skal tolkes å dekke både entall og flertall om ikke annet er angitt heri eller klart kontradiktert av konteksten.
Angivelse av verdiområder heri er kun ment som en stenografisk metode for å referere individuelt til hver separat verdi som faller innenfor dette området om ikke annet er angitt heri, og hver separate verdi er inkorporert i beskrivelsen som om den var individuelt angitt. Om ikke annet er angitt er alle eksakte verdier angitt heri representative for tilsvarende aproksimative verdier (f.eks. alle eksakte eksempelvis angitte verdier som er tilveiebrakt med hensyn til en spesifikk faktor eller et mål kan betraktes og også tilveiebringe en tilhørende aproksimativ verdi, modifisert gjennom "omtrent" om passende).
Alle beskrevne fremgangsmåter kan utøves på en egnet måte om ikke annet er angitt heri eller på annen måte klart kontradiktert av konteksten.
Anvendelsen av enhver og alle eksempler, eller eksempel språkbruk (f.eks. "som") tilveiebrakt heri er kun ment for å bedre illustrere oppfinnelsen og medfører ingen begrensning av rammen av oppfinnelsen om ikke annet er angitt. Ingen språkbruk i beskrivelsen bør tolkes som en indikasjon for at et element er vesentlig for å praktisere oppfinnelsen om ikke dette eksplisitt er angitt.
Sitering og inkorporering av patentdokumenter heri er gjort av bekvemmelighetshensyn og reflekterer ikke en oppfatning av gyldighet, patenterbarhet og/eller håndhevbarheten av slike patentdokumenter.
Beskrivelsen heri av ethvert aspekt eller utførelsesform av oppfinnelsen ved å anvende betegnelser slik som "omfatter", "har", "inkluderer" eller "inneholder" med hensyn til et element eller elementer er ment å tilveiebringe støtte for et lignende aspekt eller utførelsesform av oppfinnelsen som "består av" , "består vesentlig av", eller "vesentlig omfatter" det spesifikke elementet eller elementer om ikke annet er angitt og klart kontradiktert av konteksten (f.eks. et preparat beskrevet heri og omfatte et spesifikt element bør forstås som også å beskrive et preparat som består av det elementet om ikke annet er angitt eller klart kontradiktert av konteksten).
Oppfinnelsen inkluderer alle modifikasjoner og ekvivalenter av oppfinnelsen angitt i beskrivelsen eller krav presentert heri i den grad som er lovlig.

Claims (28)

1. Isolert antistoff eller antistoffragment, karakterisert vedat det (a) kryssreagerer med minst to ulike humane KIR2DL polypeptider som hver gjenkjenner en ulik gruppe av HLA-C-klasse I-allotyper, og (b) nøytraliserer den inhibitoriske aktivitet av slike peptider.
2. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1,karakterisertv e d at antistoffet binder til i det vesentlige den samme epitop som antistoff DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) eller konkurrerer med antistoff DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) for binding til nevnte KIR2DL polypeptider.
3. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1 eller 2, karakter isert ved at nevnte antistoff konkurrerer med DF-200 (deponert som CNCM I-3224) for binding til nevnte KIR2DL polypeptider.
4. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1 eller 2, karakter isert ved at nevnte antistoff binder til samme epitop som antistoff DF-200 (deponert som CNCM 1-3224).
5. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisertvedatdet omfatter lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3 til DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 12.
6. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisertvedatdet omfatter lettkjedevariabelregionen til DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 12.
7. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisertvedatdet omfatter tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 til DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 13.
8. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisertvedatdet omfatter tungkjede til DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 13.
9. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisertvedat nevnte minst to ulike humane KIR2DL polypeptider omfatter KIR2DL1 og KIR2DL2/KIR2DL3.
10. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat det spesifikt binder til KIR2DL1 innenfor et område definert av aminosyrerestene 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129,
130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, og 192.
11. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisertvedatdet binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/KIR2DL3 uten å interagere med aminosyrerester utenfor regionen definert av aminosyrerestene 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131,
132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, og 192.
12. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisertvedat det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor RI31 er mutert til Ala.
13. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisertvedat det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor RI 57 er mutert til Ala.
14. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisertvedat det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R158 er mutert til Ala.
15. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat det binder til KIR2DL1 restene 131, 157 og 158.
16. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat det binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R131 er mutert til Trp, men binder ikke til villtype KIR2DS3.
17. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat det binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR2DS4.
18. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-9,karakterisert vedat det binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3, men binder ikke til KIR2DS4.
19. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-18,karakterisert vedat antistoffet eller antistoffragmentet er et monoklonalt antistoff.
20. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-19,karakterisert vedat antistoffet eller antistoffragmentet er et humant antistoff, humanisert antistoff eller et kimært antistoff.
21. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-20,karakterisert vedat antistoffragmentet er et Fab, et Fab', et Fab'-SH, et F(ab')2, et Fv, et diastoff, et enkeltkjedet antistoffragment, eller et multi-spesifikt antistoff som omfatter en rekke ulike antistoffragmenter.
22. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-21,karakterisert vedat det forårsaker en minst 50% potensiering i NK cytotoksisitet som målt ved kromfrigivningstest av cytotoksisitet.
23. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-22,karakterisert vedat det inhiberer binding av (i) et HLA-C allel molekyl som har en Lys rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1 reseptor, og (ii) et HLA-C allel molekyl som har en Asn rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3 reseptorer.
24. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-23,karakterisert vedat det fremmer ly sering av matchede eller HL A kompatible målceller ved NK celler som utrykker KIR2DL1 og KIR2DL2, hvori nevnte målceller ikke effektivt lyseres av NK celler i fravær av nevnte antistoff eller antistoffragment.
25. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-24,karakterisert vedat det omfatter en Fc region som medierer lav effektor funksjon.
26. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-25,karakterisert vedat det har en Fc region til human IgG4 isotype.
27. Sammensetning egnet for human administrering,karakterisert vedat den omfatter en farmasøytisk akseptabel eksipient og et antistoff eller antistoffragment som (a) kryssreagerer med minst to ulike humane KIR2DL polypeptider som hver gjenkjenner en ulik gruppe av HLA-C-klasse I-allotyper, og (b) nøytraliserer den inhibitoriske aktivitet av slike peptider.
28. Sammensetning ifølge krav 27,karakterisert vedat den omfatter minst et isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-26.
NO20160264A 2003-07-02 2016-02-16 Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav. NO342318B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48389403P 2003-07-02 2003-07-02
US54547104P 2004-02-19 2004-02-19
PCT/DK2004/000470 WO2005003168A2 (en) 2003-07-02 2004-07-01 Methods for the production and cytotoxicity evaluation of kir2dl nk-receptor antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20160264A1 true NO20160264A1 (no) 2016-02-16
NO342318B1 NO342318B1 (no) 2018-05-07

Family

ID=33567703

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20056048A NO338818B1 (no) 2003-07-02 2005-12-19 Sammensetninger og fremgangsmåter for regulering av aktiviteten til naturlige drepeceller
NO20060528A NO338255B1 (no) 2003-07-02 2006-02-01 Preparater og fremgangsmåter for å regulere NK-celleaktivitet.
NO20160264A NO342318B1 (no) 2003-07-02 2016-02-16 Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav.
NO20160411A NO343342B1 (no) 2003-07-02 2016-03-10 PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20056048A NO338818B1 (no) 2003-07-02 2005-12-19 Sammensetninger og fremgangsmåter for regulering av aktiviteten til naturlige drepeceller
NO20060528A NO338255B1 (no) 2003-07-02 2006-02-01 Preparater og fremgangsmåter for å regulere NK-celleaktivitet.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20160411A NO343342B1 (no) 2003-07-02 2016-03-10 PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme

Country Status (22)

Country Link
US (2) US9902936B2 (no)
EP (3) EP1673397B1 (no)
JP (5) JP5015592B2 (no)
KR (5) KR101325023B1 (no)
CN (2) CN103588880B (no)
AT (1) ATE490984T1 (no)
AU (2) AU2004253630B2 (no)
BR (2) BRPI0412138B8 (no)
CA (2) CA2530591A1 (no)
CY (1) CY1113394T1 (no)
DE (1) DE602004030464D1 (no)
DK (2) DK1673397T3 (no)
ES (2) ES2725526T3 (no)
HK (1) HK1091662A1 (no)
HR (1) HRP20120845T1 (no)
IL (3) IL172613A (no)
MX (1) MXPA05013923A (no)
NO (4) NO338818B1 (no)
PL (1) PL1639013T3 (no)
PT (1) PT1639013E (no)
RU (2) RU2376315C2 (no)
WO (2) WO2005003168A2 (no)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090191213A9 (en) * 2003-07-02 2009-07-30 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for regulating NK cell activity
HUE033129T2 (en) 2003-07-24 2017-11-28 Innate Pharma Sa Methods and compositions for increasing the efficacy of therapeutic antibodies using compounds that potentiate NK cells
EP1740619A1 (en) * 2004-04-30 2007-01-10 Innate Pharma Compositions and methods for treating proliferative disorders such as nk-type ldgl
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
TWI472338B (zh) * 2004-07-01 2015-02-11 Novo Nordisk As 人類抗ｋｉｒ抗體
DK2921500T3 (da) 2004-07-10 2023-09-18 The Institute For Cancer Res Genetisk modificerede, humane, naturlige dræbercellelinjer
JP5525689B2 (ja) * 2004-11-02 2014-06-18 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法
EP1835937B1 (en) 2005-01-06 2012-04-11 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for treating viral infection
US8222376B2 (en) 2005-01-06 2012-07-17 Novo Nordisk A/S KIR-binding agents and methods of use thereof
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
CN101300272B (zh) * 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
EP2109460B1 (en) * 2007-01-11 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Anti-kir antibodies, formulations, and uses thereof
US8709411B2 (en) * 2008-12-05 2014-04-29 Novo Nordisk A/S Combination therapy to enhance NK cell mediated cytotoxicity
US20120009148A1 (en) * 2008-12-29 2012-01-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Methods of predicting responsiveness to interferon treatment and treating hepatitis c infection
US20120308986A1 (en) * 2010-02-08 2012-12-06 Biotherapy Institute Of Japan Method for producing nk cell-enriched blood product
BR112013012138B1 (pt) 2010-11-22 2022-02-22 Innate Pharma Sa Uso de um composto que inibe um receptor inibidor de célula natural killer (nkcir)
TWI560200B (en) 2011-05-25 2016-12-01 Innate Pharma Sa Anti-kir antibodies for the treatment of inflammatory and autoimmune disorders
EP2723362A1 (en) 2011-06-21 2014-04-30 Innate Pharma NKp46-MEDIATED NK CELL TUNING
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
WO2013076139A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd40l expressing mammalian cells and their use
JP6507097B2 (ja) * 2012-09-19 2019-04-24 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． Ｋｉｒ３ｄｌ２結合剤
NZ631405A (en) 2012-10-02 2017-01-27 Bristol Myers Squibb Co Combination of anti-kir antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat cancer
WO2015069785A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-cs1 antibodies to treat multiple myeloma
JP6654781B2 (ja) * 2014-08-29 2020-02-26 国立大学法人北海道大学 Ｋｉｒ２ｄｓ１に対するモノクローナル抗体
ES2772307T3 (es) 2014-10-28 2020-07-07 Childrens Univ Hospital Tuebingen Tratamiento de pacientes pediátricos con LLA-PCB con un anticuerpo anti-kir
CN115029362A (zh) 2015-02-06 2022-09-09 新加坡国立大学 核酸、包含其的工程免疫细胞及其生产方法和用途
BR112017021688A2 (pt) 2015-04-17 2018-08-14 Bristol-Myers Squibb Company composições compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-pd-1 e outro anticorpo
EP3461337A1 (en) 2015-05-06 2019-04-03 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
EP3943098A3 (en) 2015-07-16 2022-05-11 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
AU2016348391A1 (en) * 2015-11-03 2018-05-17 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding TIM-3 and their uses
CA3004530A1 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
IL292302B2 (en) 2016-05-20 2023-10-01 Biohaven Pharm Holding Co Ltd Use of glutamate modulating factors in cancer immunotherapy
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
JP2019532017A (ja) 2016-07-14 2019-11-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんを治療するための異なるエピトープ結合を示す複数の二重特異性結合ドメイン構築物
GB201616365D0 (en) * 2016-09-27 2016-11-09 Helsingin Yliopisto Non-genetic modification of enveloped viruses
US11395838B2 (en) 2016-09-27 2022-07-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for enhancing immune checkpoint blockade therapy by modulating the microbiome
BR112019007365A2 (pt) 2016-10-12 2019-07-09 Univ Texas métodos e composições para imunoterapia com tusc2
KR20190068602A (ko) 2016-10-21 2019-06-18 이나뜨 파르마 항-kir3dl2 작용제에 의한 치료
EP3551226A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 MultiVir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
JP7458188B2 (ja) 2017-03-31 2024-03-29 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 腫瘍を処置する方法
CN110573529A (zh) 2017-04-05 2019-12-13 韩国生命工学研究院 激活nk细胞的融合蛋白、nk细胞和包含其的药物组合物
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
CN107261304A (zh) * 2017-06-05 2017-10-20 中国兽医药品监察所 一种奶牛的布鲁氏菌病免疫试剂盒及其应用
US20190038733A1 (en) 2017-08-10 2019-02-07 National University Of Singapore T cell receptor-deficient chimeric antigen receptor t-cells and methods of use thereof
BR112020007249B1 (pt) 2017-10-13 2022-11-22 Harpoon Therapeutics, Inc Roteína de ligação a antígeno de maturação de célula b, proteína de ligação multiespecífica e uso das referidas proteínas
JP2020536894A (ja) 2017-10-15 2020-12-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍処置法
CN108060137B (zh) * 2017-12-26 2021-07-02 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Il7和il21修饰的nk92细胞、制备方法及其应用
KR20200135986A (ko) 2018-03-19 2020-12-04 멀티비르 인코포레이티드 종양 억제인자 유전자 치료 및 cd122/cd132 작용제를 포함하는 암 치료를 위한 방법 및 조성물
AU2019236865A1 (en) 2018-03-23 2020-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
CN112292145A (zh) 2018-03-25 2021-01-29 斯尼普生物群系有限公司 治疗和预防微生物感染
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
EP4268831A3 (en) 2018-09-12 2024-05-22 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
US20220054524A1 (en) 2018-12-21 2022-02-24 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
CN111424012A (zh) * 2020-03-30 2020-07-17 威海市中心医院 一种nk细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法
TW202214857A (zh) 2020-06-19 2022-04-16 法商昂席歐公司 新型結合核酸分子及其用途
MX2023000197A (es) 2020-07-07 2023-02-22 BioNTech SE Arn terapeutico para el cancer positivo para vph.
BR112023003553A2 (pt) 2020-08-31 2023-04-04 Bristol Myers Squibb Co Assinatura de localização celular e imunoterapia
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
US20240000837A1 (en) * 2020-12-23 2024-01-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Inhibition of kir2dl2 for the enhancement of adoptive immunotherapies
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
AU2021411486A1 (en) 2020-12-28 2023-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
CN118055840A (zh) 2021-10-08 2024-05-17 3M创新有限公司 具有调节的刚度、减小的拉延区和力预算的狭缝模组件
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023110937A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Depletion of nk cells for the treatment of adverse post-ischemic cardiac remodeling
WO2023111203A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024026385A1 (en) * 2022-07-28 2024-02-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Inhibition of kir2dl2 and/or kir2dl3 for the enhancement of adoptive immunotherapies
WO2024090458A1 (ja) * 2022-10-25 2024-05-02 第一三共株式会社 抑制型ｋｉｒに対するアゴニストを用いた免疫拒絶の回避方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5539094A (en) 1993-11-12 1996-07-23 La Jolla Cancer Research Foundation DNA encoding Bcl-2-associated proteins
US5583034A (en) 1994-02-22 1996-12-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Enhancement of adoptosis using antisense oligonucleotides
US5808028A (en) 1994-05-24 1998-09-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular clone of a P58 receptor protein and uses thereof
NZ298145A (en) 1994-12-29 1998-08-26 Yamanouchi Pharma Co Ltd Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
US6750044B1 (en) 1996-10-17 2004-06-15 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having antagonistic properties, nucleic acids encoding the same and host cells comprising those nucleic acids
EP1125130B1 (de) * 1998-10-29 2006-07-26 DakoCytomation Denmark A/S Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl
NZ514918A (en) 1999-04-28 2003-11-28 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting VEGF
KR100419555B1 (ko) 2000-05-29 2004-02-19 주식회사유한양행 비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
HUE033129T2 (en) * 2003-07-24 2017-11-28 Innate Pharma Sa Methods and compositions for increasing the efficacy of therapeutic antibodies using compounds that potentiate NK cells
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
KR101564713B1 (ko) 2004-12-28 2015-11-06 이나뜨 파르마 Ｎｋｇ2ａ에 대한 단클론 항체
EP1835937B1 (en) * 2005-01-06 2012-04-11 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for treating viral infection
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
US8222376B2 (en) 2005-01-06 2012-07-17 Novo Nordisk A/S KIR-binding agents and methods of use thereof
CN101300272B (zh) 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
EP2109460B1 (en) 2007-01-11 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Anti-kir antibodies, formulations, and uses thereof
TWI560200B (en) * 2011-05-25 2016-12-01 Innate Pharma Sa Anti-kir antibodies for the treatment of inflammatory and autoimmune disorders
EP2912063A1 (en) * 2012-10-23 2015-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
WO2015069785A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-cs1 antibodies to treat multiple myeloma
US9884593B2 (en) * 2015-02-12 2018-02-06 Pro-Gard Products, Llc Weapon mounting system

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIN JEON-SOO ET AL., "Monoclonal antibodies with various reactivity to p58 killer inhibitory receptors", Hybridoma, vol. 18, no. 6, 1999, side 521-527 , Dated: 01.01.0001 *
WARREN H.S. ET AL., "Functional analysis of CD158b monoclonal antibodies recognizing the killer Ig-like receptors KIR2DS2, KIR2DL2 and KIR2DL3", Tissue Antigens, vol. 55, no. Supplement 1, 2000, side 80-81, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018153185A (ja) 2018-10-04
ATE490984T1 (de) 2010-12-15
CA2530272C (en) 2018-05-01
IL172700A (en) 2015-05-31
CN103588880B (zh) 2019-09-17
AU2004253770A1 (en) 2005-01-13
NO342318B1 (no) 2018-05-07
MXPA05013923A (es) 2006-08-11
ES2393485T3 (es) 2012-12-21
DE602004030464D1 (de) 2011-01-20
KR101444717B1 (ko) 2014-09-26
KR20060111440A (ko) 2006-10-27
BRPI0412138B1 (pt) 2021-01-26
JP6556465B2 (ja) 2019-08-07
CY1113394T1 (el) 2016-06-22
PT1639013E (pt) 2012-12-03
IL172613A (en) 2010-12-30
KR20130062379A (ko) 2013-06-12
EP2289939A2 (en) 2011-03-02
JP2015163068A (ja) 2015-09-10
CN103588880A (zh) 2014-02-19
CA2530591A1 (en) 2005-01-13
BRPI0412138B8 (pt) 2021-05-25
US11365393B2 (en) 2022-06-21
US20180216069A1 (en) 2018-08-02
NO20056048L (no) 2006-04-03
EP2289939A3 (en) 2013-12-04
RU2005140152A (ru) 2007-08-27
EP2289939B1 (en) 2019-03-27
AU2004253630B2 (en) 2010-11-25
DK1673397T3 (da) 2011-03-07
PL1639013T3 (pl) 2013-02-28
KR20060079180A (ko) 2006-07-05
JP5015592B2 (ja) 2012-08-29
KR20120059659A (ko) 2012-06-08
EP1639013A2 (en) 2006-03-29
NO338818B1 (no) 2016-10-24
JP2008500947A (ja) 2008-01-17
BRPI0412153A (pt) 2006-08-22
CA2530272A1 (en) 2005-01-13
KR101325023B1 (ko) 2013-11-04
US20060263361A1 (en) 2006-11-23
HRP20120845T1 (hr) 2012-11-30
EP1673397A2 (en) 2006-06-28
WO2005003168A3 (en) 2005-05-06
BRPI0412153B8 (pt) 2021-05-25
KR101420344B1 (ko) 2014-07-16
JP4871125B2 (ja) 2012-02-08
JP2007524612A (ja) 2007-08-30
KR101375153B1 (ko) 2014-03-18
US9902936B2 (en) 2018-02-27
KR20120024998A (ko) 2012-03-14
IL172700A0 (en) 2006-04-10
RU2006102960A (ru) 2006-06-27
EP1639013B1 (en) 2012-09-12
BRPI0412153B1 (pt) 2019-07-30
RU2404993C2 (ru) 2010-11-27
AU2004253770B2 (en) 2009-10-29
WO2005003172A3 (en) 2005-03-10
NO343342B1 (no) 2019-02-04
BRPI0412138A (pt) 2006-08-15
JP5826697B2 (ja) 2015-12-02
NO20160411A1 (no) 2016-03-10
RU2376315C2 (ru) 2009-12-20
EP1673397B1 (en) 2010-12-08
DK1639013T3 (da) 2013-01-07
IL172613A0 (en) 2006-04-10
AU2004253770C1 (en) 2010-04-15
HK1091662A1 (en) 2007-01-26
WO2005003172A2 (en) 2005-01-13
JP2012176953A (ja) 2012-09-13
WO2005003168A2 (en) 2005-01-13
NO20060528L (no) 2006-02-01
AU2004253630A1 (en) 2005-01-13
NO338255B1 (no) 2016-08-08
IL238490A0 (en) 2015-06-30
CN103467602A (zh) 2013-12-25
CN103467602B (zh) 2018-04-10
ES2725526T3 (es) 2019-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11365393B2 (en) Compositions and methods for regulating NK cell activity
US8637258B2 (en) Compositions and methods for regulating NK cell activity
ZA200600792B (en) Methods for the production and cytotocity evaluation of KIR2DL NK-receptor antibodies
MXPA05014074A (en) Methods for the production and cytotoxicity evaluation of kir2dl nk-receptor antibodies