NO20160411A1 - PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme - Google Patents

PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme Download PDF

Info

Publication number
NO20160411A1
NO20160411A1 NO20160411A NO20160411A NO20160411A1 NO 20160411 A1 NO20160411 A1 NO 20160411A1 NO 20160411 A NO20160411 A NO 20160411A NO 20160411 A NO20160411 A NO 20160411A NO 20160411 A1 NO20160411 A1 NO 20160411A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
cell
antibodies
cells
kir
Prior art date
Application number
NO20160411A
Other languages
English (en)
Other versions
NO343342B1 (no
Inventor
Mariella Della Chiesa
Alessandro Moretta
Original Assignee
Innate Pharma
Univ Di Genova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innate Pharma, Univ Di Genova filed Critical Innate Pharma
Publication of NO20160411A1 publication Critical patent/NO20160411A1/no
Publication of NO343342B1 publication Critical patent/NO343342B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

Oppfinnelsens fagområde
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører antistoffer, antistoff-fragmenter og derivater derav som kryssreagerer med to eller flere inhibitoriske reseptorer tilstedeværende på celleoverflaten til NK-celler ("natural killer cells"; naturlige drepeceller) som potensierer NK-cellecytotoksisitet i pattedyrsubjekter eller i en biologiske prøve. Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåter for å fremstille slike antistoffer, fragmenter, varianter og derivater; farmasøytiske sammensetninger som omfatter samme; og anvendelse av slike molekyler og sammensetninger, særdeles i terapi, for å øke NK-celleaktivitet eller cytotoksisitet i subjekter.
Oppfinnelsens bakgrunn
Naturlige drepe-(NK) celler er en underpopulasjon av lymfocytter, som er involvert i ikke-konvensjonell immunitet. NK-celler kan skaffes ved ulike teknikker kjente på fagfeltet, så som fra blodprøver, cytaferese, samlinger, osv.
Karakteristikker og biologiske egenskaper av NK-celler inkluderer uttrykking av overflateantigener inkludert CD16, CD56, og/eller CD57, fravær av alfa/beta eller gamma/delta TCR-komplekser på celleoverflaten, evnen til å binde og drepe celler som ikke uttrykker "selv" MHC/HLA-antigener ved aktivering av spesifikke cytolytiske enzymer, evnen til a drepe tumorceller eller andre syke celler som uttrykker en NK-aktiverende reseptorligand, evnen til å avgi cytokinersom stimulerer eller inhiberer immunresponsen, samt evnen til å gjennomgå et flertall celledelinger og produsere datterceller med lignende biologiske egenskaper som morcellen. Innenfor rammen til den foreliggende oppfinnelsen betyr "aktive" NK-celler biologisk aktive NK-celler, nærmere bestemt NK-celler som har evnen til å lysere målceller. En "aktiv" NK-celle er for eksempel i stand til å drepe celler som uttrykker en NK-aktiverende reseptorligand og ikke uttrykker "selv" MHC/HLA-antigener (KIR-inkompatible celler).
Basert på deres biologiske egenskaper har ulike terapeutiske- og vaksinestrategier blitt foreslått på feltet som er avhengige av en modulasjon av NK-celler. Men NK-celleaktivitet er regulert av en kompleks mekanisme som involverer både stimulerende og inhiberende signaler. Derfor kan effektiv NK-celleformidlet terapi kreve både en stimulering av disse cellene og en nøytralisering av inhiberende signaler.
NK-celler er negativt regulert ved major histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I spesifikke inhibitoriske reseptorer (Karre et al., 1986, Ohlén et al, 1989). Disse spesifikke reseptorene binder polymorfiske determinanter av MHC klasse I molekyler eller HLA tilstedeværende på andre celler, og inhiberer NK-cellelysering. Visse medlemmer av en familie reseptorer kalt drepe-lg-lignende reseptorer ("killer lg-like receptors"; Kl Rer) gjenkjenner grupper av HLA-klasse I alleler i mennesker.
Kl Rer er en storfamilie reseptorer tilstedeværende i visse undersett av lymfocytter, inkludert NK-celler. Navngivingen for KIRer er basert på antallet ekstracellulære domener (KIR2D eller KIR3D) og om den cytoplasmiske halen er enten lang (KIR2DL eller KIR3DL) eller kort (KIR2DS eller KIR3DS). I mennesker er tilstedeværelse eller fravær ev en gitt KIR-variable i fra en NK-celle til en annen innen NK populasjonen tilstedeværende i et enkelt individ. Innen den menneskelige populasjonen er der også et relativt høyt nivå polymorfismer i KIR-molekylene, der enkelte KIR-molekyler er tilstedeværende i noen av, men ikke alle individene. Enkelte KIR-genprodukter fører til stimulering av lymfocyttaktivitet når de er bundne til en passende ligand. De bekreftede stimulerende KIRene har alle en kort cytoplasmisk hale med en ladet gjennommembransk rest som er i forbindelse med et adapter-molekyl som har et immunstimulerende motiv (ITAM). Andre KIR-genprodukter er inhiberende i naturlig tillstand. Alle bekreftede inhiberende KIRer haren lang cytoplasmisk hale og ser ut til å ha interaksjon med forskjellige undergrupper av HLA-antigener, avhengig av deres KIR-undertype. Inhiberende KIRer fremviser i deres intracytoplasmiske del en eller flere inhiberende motiver som rekrutterer fosfataser. De kjente inhiberende KIR-reseptorene inkluderer medlemmer av KIR2DL og KIR3DL underfamiliene. KIR-reseptorer som har to lg domener (KIR2D) identifiserer HLA-C allotyper: KIRDL2 (før kalt p58.2) eller det nært beslektede genproduktet KIR2DL3 gjenkjenner en epitop delt med gruppe 2 HLA-C allotyper (Cw1, 3, 7, og 8), mens KIR2DL1 (p58.1) gjenkjenneren epitop delt med de resiprokale gruppe 1 HLA-C allotypene (Cw2, 4, 5, og 6). KIR2DL1 gjenkjennelse er avgjort av tilstedeværelsen av en Lys rest i posisjon 80 hos HLA-C alleler.
KIR2DL2 og KIR3DL2 gjenkjennelse er bestemt av tilstedeværelsen av en Asn-rest i posisjon 80. Det er viktig at den store majoriteten av HLA-C alleler har enten en Asn-eller en Lys-rest i posisjon 80. En KIR med tre lg domener, KIR3DL1 (p70) gjenkjenner en epitop delt med HLA-Bw4 alleler. En homodimer av molekyler med tre lg domener KIR3DL2 (p140) gjenkjenner HLA-A3 og -A11.
Selv om inhiberende KIRer og andre klasse I inhibitoriske reseptorer (Moretta et al, 1997, Valiante et al, 1997a; Lanier, 1998) kan bli uttrykt samtidig av NK-celler, er der i ethvert individs NK-repertoar celler som uttrykker en enkelt KIR, og derfor er de tilsvarende NK-cellene blokkert bare av celler som uttrykker en spesifikk klasse I allelgruppe.
NK-cellepopulasjoner eller kloner som er KIR feiltilpasset, det vil si populasjoner av NK-celler som uttrykker KIR som ikke er kompatible med HLA-molekyler til en vert, har vist seg å være de mest tenkelige formidlerne av transplantat antileukemi effekten sett i allogentransplantering (Ruggeri et al., 2002). En måte å reprodusere denne effekten på i ett gitt individ ville være å bruke reagenser som blokkerer KIR/HLA-interaksjonen.
Monoklonale antistoffer som er spesifikke for KIR2DL1 har vist seg å blokkere interaksjonen mellom KIR2DL1 og Cw4 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al., 1993). Monoklonale antistoffer mot KIR2DL2/3 har også blitt beskrevet som blokkerer interaksjonen mellom KIR2DL2/3 med HLACw3 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al., 1993). Men bruken av slike reagenser i kliniske situasjoner ville kreve utvikling av to terapeutiske mAber for å behandle alle pasienter, uavhengig av om enhver gitt pasient uttrykte klasse I eller klasse 2 HLA-C alleler. Videre ville en måtte forhåndsbestemme hvilke HLA-typer hver pasient uttrykte før man bestemte hvilket terapeutiske antistoff man skulle bruke, noe som ville resultere i en mye høyere kostnad for behandlingen.
Watzl et al., Tissue Antigens, 56, s.240 (2000) produserte kryssreagerende antistoffer som gjenkjente svært mange isotyper av KIRer, men disse antistoffene viste ikke potensering av NK-celleaktivitet. G.M. Spaggiara et al., Blood, 100, s. 4098-4107 (2002) utførte eksperimenter ved brukav flerfoldige monoklonale antistoffer mot forskjellige KIRer. Et av disse antistoffene, NKVSF1, ble sagt å kunne gjenkjenne en felles epitop av CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) og p50.3
(KIR2DS4). Det ble ikke foreslått at NKVSF1 kan potensere NK-celleaktivitet, og der var ingenting som foreslo at det kunne brukes som et terapeutisk middel. Derfor har ikke praktiske og effektive tilnærmelser i modulasjonen av NK-celleaktivitet blitt gjort
tilgjengelige så langt innen fagfeltet, og krever fortsatt HLA-allelspesifikk intervensjon ved bruk av spesifikke reagenser.
Sammendrag av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nå nye antistoffer, sammensetninger og fremgangsmåter som overvinner nåtidens vanskeligheter med NK-celleaktivering, og tilveiebringer ekstra fordelaktige trekk og fordeler. I en utførelse tilveiebringes ett enkelt antistoff som muliggjør aktivering av humane NK-celler i så og si alle mennesker. Mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen nye spesifikke antistoffer som kryssreagerer med ulike inhiberende KIR-grupper, og nøytraliserer deres inhiberende signaler, noe som resulterer i potensiering av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker slike inhiberende KIR-reseptorer. Denne evnen til å kryssreagere med mange KIR-genprodukter lar antistoffene i følge oppfinnelsen bli effektivt brukt for å øke NK-celleaktivitet i de fleste mennesker, uten byrden eller kostnaden ved forutbestemmelse av HLA-typen til subjektet.
I en første utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoff-fragmenter og derivater av disse, hvori antistoffet, fragmentet eller derivatet kryssreagerer med minst to inhiberende KIR-reseptorer på overflaten av NK-celler, nøytraliserer de inhiberende signalene til NK-cellene, og potenserer aktiviteten til NK-cellene. Mer foretrukket binder antistoffene en feles determinant av humane KIR2DL-reseptorer. Enda mer foretrukket binder antistoffene i følge oppfinnelsen i hvert fall KIR2DL1, KIR2DL2, og KIR2DL3 reseptorer. I følge formålene til den foreliggende oppfinnelsen, refererer utrykket KIR2DL2/3 til enten en eller begge av KIR2DL2 og KIR2DL3 reseptorene. Disse to reseptorene har svært høy homologi, og er antakeligvis alleler av det samme genet, og er ansett av fagfolk som forvekslbare. Derfor er KIR2DL2/3 ansett som et eneste, inhiberende KIR-molekyl i følge formålene til denne oppfinnelsen, og derfor vil et antistoff som kryssreagerer med bare KIR2DL2 og KIR2DL3 og ingen andre inhiberende KIR-reseptorer ikke falle innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.
Antistoffet i følge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer spesifikt binding av MHC-eller HLA-molekyler til minst to inhiberende KIR-reseptorer, og fremmer NK-celleaktivitet. Begge disse aktivitetene er referert til med uttrykket "nøytralisere den inhibitoriske (eller inhiberende) aktiviteten til KIR", som brukt heri. Evnen til antistoffene i følge oppfinnelsen til å "tilveiebringe NK-celleaktivitet", "tilveiebringe NK-cellecytotoksisitet", "tilveiebringe NK-celler", "potensere NK-celleaktivitet", "potensere NK-cellecytotoksisitet" eller "potensere NK-celler" i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen betyr at antistoffet lar NK-celler uttrykke en inhiberende KIR-reseptor på deres overflate, som er i stand til å lysere celler som uttrykker på deres overflate en tilsvarende ligand for den spesifikke inhiberende KIR-reseptoren (foreksempel enkelte HLA-antigener). I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som spesifikt inhiberer binding av HLA-C molekyler til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 reseptorer. I følge en annen spesifikk utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som fremmer NK-celleaktivitet in vivo.
Fordi minst en av KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 er tilstedeværende i minst 90 % av den humane populasjonen, er de mer forestrukkne antistoffene i følge den foreliggende oppfinnelsen i stand til å fremme NK-celleaktivitet mot de fleste HLA-C allotype assosierte celler, respektivt gruppe 1 HLA-C allotyper og gruppe 2 HLA-C allotyper. Sammensetninger i følge den foreliggende oppfinnelsen kan derfor anvendes for å effektivt aktivere eller potensere NK-celler i de fleste humane individer, typisk i omtrent 90 % av humane individer eller flere. Derfor kan en enkel antistoffsammensetning i følge oppfinnelsen anvendes for å behandle de fleste mennesker, og der er sjeldent bruk for å bestemme allelgrupper eller å bruke antistoffcocktailer.
Oppfinnelsen demonstrerer for første gang at kryssreaktive og nøytraliserende antistoffer mot inhiberende KIRer kan fremstilles, og at slike antistoffer tillater effektiv aktivering av NK-celler i et brett spektrum menneskegrupper.
En utførelse i følge den foreliggende oppfinnelsen er derved et antistoff, hvor antistoffet spesifikt binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer og reverserer inhibering av NK-cellecytotoksisitet formidlet av disse KIRene. I en utførelse konkurrerer antistoffene med monoklonalt antistoff DF200, produsert av hybridom DF200. Valgfritt er nevnte antistoff som konkurrerer med antistoff DF200 ikke selve antistoff DF200.
I en annen utførelse konkurrerer antistoffet med monoklonalt antistoff NKVSF1, hvor antistoffet som konkurrerer med antistoff NKVSF1 valgfritt ikke er antistoff NKVSF1.
I en annen utførelse konkurrerer antistoffet med antistoff 1-7F9.
Fortrinnsvis er nevnte antistoffer kimeriske antistoffer, humaniserte antistoffer eller humane antistoffer.
Uttrykket "konkurrerer med" betyr når det refererer til et særskilt antistoff (for eksempel DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183) at et antistoff konkurrerer med det monoklonale antistoffet (foreksempel DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183) i en bindingstest som bruker enten rekombinante KIR-molekyler eller KIR-molekyler uttrykt på overflaten. For eksempel, dersom et antistoff reduserer binding av DF200 til et KIR-molekyl i en bindingstest, så "konkurrerer" antistoffet med DF200. Et antistoff som "konkurrerer" med DF200 kan konkurrere med DF200 for binding til den humane KIR2DL1-reseptoren, den humane KIR2DL2/3-reseptoren, eller både de humane KIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptorene.
I en foretrukket utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer, reverserer inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet formidlet av disse KIRene, og konkurrerer med DF200, 1-7F9, eller NKVSF1 forbinding til den humane KIR2DL1-reseptoren, den humane KIR2DL2/3-reseptoren, eller både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer. Valgfritt er nevnte antistoff ikke NKVSF1. Valgfritt er nevnte antistoff et kimerisk, humant eller humanisert antistoff.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer, reverserer inhibering av NK-cellecytotoksisitet fremmet av disse KIRene, og konkurrerer med EB6 for binding til den humane KIR2DL1-reseptoren, konkurrerer med GL183 for binding til den humane KIR2DL2/3-reseptoren, eller konkurrerer med både EB6 for binding til den humane KIR2DL1-reseptoren og GL183 for binding til den humane KIR2DL2/3-reseptoren. Valgfritt er nevnte antistoff ikke NKVSF1, valgfritt er nevnte antistoff ikke DF200. Valgfritt er nevnte antistoff et kimerisk, humant eller humanisert antistoff.
I en fortrinnsvis utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som konkurrerer med DF200 og gjenkjenner, binder til eller har immunspesifisitet for hovedsakelig eller vesentlig det samme, eller det samme, epitop eller "epitopsted" på et KIR-molekyl som det monoklonale antistoffet DF200. Fortrinnsvis er nevnte KIR-molekyl en human KIR2DL1-reseptor eller en human KIR2DL2/3-reseptor.
En særskilt utførelse i følge oppfinnelsen er et antistoff, hvor antistoffet binder en felles determinant tilstedeværende i både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer, og reverserer inhibering av NK-cellecytotoksisitet formidlet av disse KIRene. Antistoffet binder mer spesifikt hovedsaklig den samme epitopen på KIR som monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, eller antistoff NKVSF1 produsert av hybridom NKVSF1, hvor antistoffet ikke er NKVSF1.
I følge en foretrukket utførelse, er antistoffet i følge oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Det mest forestrukkne antistoffet i følge den foreliggende oppfinnelsen er monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200.
Det hybridomproduserende antistoffet DF200 ble deponert ved CNCM kultursamling, med identifikasjonsnr. "DF200", registrering nr. CNCM I-3224, registrert 10 juni 2004, ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris Cedex 15, Frankrike Antistoffet NKVSF1 er tilgjengelig fra Serotec (Cergy Sainte-Christophe, Frankrike), katalog ref. nr. MCA2243. NKVSF1 er også referert til som pan2D mAb heri.
Oppfinnelsen tilveiebringer også funksjonelle fragmenter og derivater til antistoffene beskrevet heri, som har betydelig lignende antigen spesifisitet og aktivitet (for eksempel, de kan kryssreagere med mor-antistoffet, og de potenserer den cytotoksiske aktiviteten til NK-celler som uttrykker inhiberende KIR-reseptorer), inkludert, uten begrensninger, et Fab fragment, et Fab'2 fragment, et immunadhesiv, en diabody, en CDR, og en ScFv. Videre kan antistoffene i følge den foreliggende oppfinnelsen være humaniserte, humane, eller kimeriske.
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger omfattende et antistoff som beskrevet ovenfor, et fragment derav, eller et derivat av en eller begge av disse. Følgende vedrører den foreliggende oppfinnelsen også anvendelse av et antistoff som fremlagt heri for en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament. I forestrukkne utførelser, er nevnte medikament eller farmakologiske komposisjon for behandling av kreft eller andre proliferative tilstander, en infeksjon, eller for anvendelse ved transplantasjoner.
I en annen utførelse frembringer den foreliggende oppfinnelsen en sammensetning omfattende et antistoff som binder minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet på NK-celler som uttrykker minst en av nevnte to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorer, hvori nevnte antistoffer inkludert inn i et liposom. Valgfritt omfatter den nevnte sammensetningen en tileggssubstans valgt fra et nukleinsyremolekyl for avlevering av gener for genterapi; et nukleinsyremolekyl for avlevering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for undertrykking av et gen i en NK-celle; eller et toksin eller et medikament for målrettet dreping av NK-celler som i tillegg er inkludert i nevnte liposom.
Oppfinnelsen frembringer også fremgangsmåter for regulering av human NK-celleaktivitet in vitra, ex vivo, eller in vivo, omfattende å bringe humane NK-celler i forbindelse med en effektiv mengde av et antistoff i følge oppfinnelsen, et fragment tilhørende et slikt antistoff, et derivat av ethvert av disse, eller en farmasøytisk sammensetning omfattende minst en av disse. Forestrukkne fremgangsmåter omfatter administrering av en effektiv mengde av en farmasøytisk sammensetning i følge oppfinnelsen, og er rettet mot økning av den cytotoksiske aktiviteten til humane NK-celler, mest foretrukket ex vivo eller in vivo, i et subjekt som har kreft, en smittsom sykdom, eller en immunsykdom.
I følge en annen utførelse, frembringer oppfinnelsen et hybridom omfattende: (a) en B-celle fra en pattedyrvert (vanligvis en ikke-human pattedyrvert) som har blitt immunisert med et antigen som omfatter en epitop tilstedeværende på et inhiberende KIR-polypeptid, sammensmeltet med (b) en udødeliggjort celle (for eksempel en myelom celle), hvori nevnte hybridom produserer et monoklonalt antistoff som binder minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorer, og er i stand til å i det minste vesentlig nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane inhibitoriske KIR-reseptorer. Valgfritt produserer ikke nevnte hybridom monoklonalt antistoff NKVSF1. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff KIR2DL1 og KIR2DL2/3 reseptorer. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff en felles determinant tilstedeværende på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Fortrinnsvis produserer nevnte hybridom et antistoff som inhiberer bindingen av et HLA-C allelmolekyl som har en Lys rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1-reseptor, og bindingen av et HLA-C allelmolekyl som har en Asn-rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3 reseptorer. Fortrinnsvis produserer nevnte hybridom et antistoff som binder seg til hovedsakelig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200 på enten KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 eller både KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Et eksempel på et slikt hybridom er DF200.
Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for fremstilling av et antistoff som kryssreagerer med mange KIR2DL-genprodukter, og som nøytraliserer den inhiberende aktiviteten av slike KIRer, hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinnene: (a) immunisering av et ikke-humant pattedyr med et immunogen omfattende et
KIR2DL-polypeptid,
(b) fremstilling av antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr, hvor nevnte
antistoffer binder nevnte KIR2DL-polypeptid,
(c) valg av antistoffer fra (b) som kryssreagerer med minst to forskjellige KIR2DL-genprodukter, og
(d) valg av antistoffer fra (c) som potenserer NK-celler.
I en utførelse er nevnte ikke-humane pattedyr et transgenisk dyr fremstilt for å uttrykke et repertoar av humane antistoffer (det vil si et ikke-humant pattedyr omfattende humane immunglobulin loci og naturlig forekommende immunglobulin genslettinger, så som Xenomouse™ (Abgenix - Femont CA, USA) eller ikke-humane pattedyr som omfatter et minilocus av humane lg-kodende gener, slik som HuMab-mouse™ (Medarex- Princeton, NJ, USA)). Valgfritt omfatter metoden videre valg av et antistoff som binder en primat, fortrinnsvis langhalet makak ape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Valgfritt omfatter oppfinnelsen videre en fremgangsmåte for å evaluere et antistoff, hvori et antistoff produsert i følge den ovenfor fremgangsmåten administreres til primaten, fortrinnsvis en langhalet makak ape, fortrinnsvis hvor apen observeres for tilstedeværelse eller fravær av en indikasjon på toksisitet mot antistoffet.
Oppfinnerne tilveiebringer også en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder minst to forskjellige humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) innmumisering av et ikke-humant pattedyr med et immungen som omfatter et inhiberende KIR-polypeptid, b) fremstilling av antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoffer binder nevnte KIR-polypeptid, c) valg av antistoffer fra (b) som kryssreagerer med mist to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, og d) valg av antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere KIR-frembrakt inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon av NK-celler som uttrykker
nevnte minst to forskjellige humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori rekkefølgen av trinn (c) og (d) er valgfritt reversert og ethvert antall av trinnene er valgfritt repetert en eller flere ganger. Fortrinnsvis er det inhiberende KIR-polypeptidet anvendt for immunisering et KIR2DL polypeptid, og antistoffene valgt i trinn (c) kryssreagerer med minst KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Fortrinnsvis gjenkjenner nevnte antistoff en felles determinant tilstedeværende på minst to forskjellige KIR-reseptorgenprodukter, mest fortrinnsvis er nevnte KIR KIR2DL1og KIR2DL2/3. Valgfritt omfatter nevnte fremgangsmåte videre valg av et antistoff som binder et primat, fortrinnsvis et langhalet makakape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Valgfritt omfatter oppfinnelsen videre en fremgangsmåte for evaluering av antistoffet, hvori et antistoff produsert i følge den ovenfor nevnte fremgangsmåten administreres til en primat, fortrinnsvis en langhalet makak ape, fortrinnsvis hvori apen blir observert for tilstedeværelse eller fravær av en indikasjon på toksisitet mot antistoffet.
Valgfritt, i de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene, er antistoffet valgt i trinn c) eller
d) ikke NKVSF1. Fortrinnsvis er antistoffet fremstilt i trinn (b) i følge de ovenfor fremgangsmåtene et monoklonisk antistoff. Fortrinnsvis inhiberer antistoffet valgt i
trinn (c) i de ovenfor fremgangsmåtene binding av et HLA-C allel molekyl som har et Lys i posisjon 80 til en human KIR2DL1 reseptor, og binding av et HLA-C allelmolekyl med Asn i posisjon 80, til humane KIR2DL2/3 reseptorer. Fortrinnsvis fører antistoffene valgt i trinn (d) i de ovenfor fremgangsmåtene til en potensering av NK-cellecytotoksisitet, for eksempel enhver vesentlig potensering, eller minst 5%, 10%, 20%, 30% eller mer potensering av NK cytotoksisitet, for eksempel minst om lag 50 % potensering av mål NK cytotoksisitet (for eksempel minst omtrent 60%, minst omtrent 70%, minst omtrent 80%, minst omtrent 85%, minst omtrent 90%, eller minst omtrent 95% (slik som for eksempel omtrent 65-100%) potensering av NK-cellecytotoksisitet). Fortrinnsvis binder antistoffet seg til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Valgfritt omfatter nevnte fremgangsmåter også eller alternativt tilleggtrinnet av å lage fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffene, å lage derivater av de utvalgte monoklonale antistoffene (for eksempel ved konjugering med et radionuclid, et cytotoksisk middel, et rapportørmolekyl, ol.), eller ved å lage derivater av antistoff fragmenter produsert fra, eller som omfatter, sekvenser som korresponderer med sekvensene til slike monoklonale antistoffer.
Oppfinnelsen frembringer videre en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: (a) å velge, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff eller et antistoff fragment som kryssreagerer med minst to forskjellige humane inhiberende KIR2DL reseptorgenprodukter, og (b) å velge et antistoff fra (a) som er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som utrykker nevnte minst to forskjellige humane inhiberende KIR2DL
reseptorgenprodukter.
Fortrinnsvis binder antistoffet en felles determinant tilstedeværende på KIR2DL1 of KIR2DL2/3. Valgfritt er nevnte antistoff valgt i trinn (b) ikke NKVSF1. Fortrinnsvis inhiberer antistoffet valgt i trinn (b) binding av et HLA-c allel molekyl som inneholder Lys i posisjon 80 til en human KIR2DL1 reseptor, og binding av et HLA-C allelmolekyl som hare Asn i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3 reseptorer. Fortrinnsvis fører antistoffet valgt i trinn (b) til en potensering i NK cytotoksisiteten, for eksempel enhver potensering av betydning, eller minst 5%, 10%, 20%, 30% eller mer potensiering av NK cytotoksisitet, for eksempel minst omlag 50 % potensering av mål NK cytotoksisitet (for eksempel minst omtrent 60%, minst omtrent 70%, minst omtrent 80%, minst omtrent 85%, minst omtrent 90%, eller minst omtrent 95% (slik som foreksempel omtrent65-100%) potensering av NK-cellecytotoksisitet). Fortrinnsvis binder antistoffet seg til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Valgfritt omfatter nevnte fremgangsmåte også tilleggstrinnet av å lage fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffene, å lage derivater av de utvalgte monoklonale antistoffene, eller å lage derivater av utvalgte monoklonale antistoff-fragmentene.
I tillegg frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) dyrking av et hybridom i følge oppfinnelsen under forhold som tillater produksjon av nevnte monoklonale antistoff, og
b) separering av nevnte monoklonale antistoff fra nevnte hybridom.
Valgfritt omfatter fremgangsmåten et tilleggstrinn for å frembringe fragmenter av
nevnte monoklonale antistoff, å lage derivater av det monoklonale antistoffet, eller å lage derivater a slike monoklonale antistoff-fragmenter. Fortrinnsvis binder antistoffet en feles determinant tilstedeværende på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Også tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som binder minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en populasjon NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: a) isolering fra et hybridom i følge oppfinnelsen av en nukleinsyre som koder for nevnte monoklonale antistoff, b) valgfritt modifikasjon av nevnte nukleinsyre for å oppnå en modifisert nukleinsyre som omfatteren sekvens som koder for et modifisert eller derivert antistoff som omfatteren aminsyresekvens som korresponderer med en funksjonell sekvens til det monoklonale antistoffet, eller er hovedsakelig lignende dertil (for eksempel minst omtrent 65%, minst omtrent 75%, minst omtrent 85%, minst omtrent 90%, minst omtrent 95% (slik som for eksempel omtrent 70-99%) identisk med en slik sekvens) valgt fra et humanisert antistoff, et kimerisk antistoff, et enkelt kjedet antistoff, et immunreaktivt fragment av et antistoff, eller et fusjonsprotein omfattende et slikt immunreaktivt fragment, c) innsetting av nevnte nukleinsyre eller modifiserte nukleinsyre (eller en beslektet nukleinsyre som koder for den samme nukleinsyre sekvensen) inn i en ekspresjonsvektor, hvor nevnte kodede antistoff eller antistoffragment er i stand til å bli uttrykt når nevnte ekspresjonsvektor er tilstedeværende på en vertscelle dyrket under passende forhold, d) transfeksjon av en vertscelle med nevnte ekspresjonsvektor, hvor nevnte vertscelle ikke på andre måter produserer immunglobulinprotein, e) dyrking av nevnte transfekterte vertscelle under forhold som fører til uttrykking av nevnte antistoff eller antistoffragment, og f) isolasjon av antistoffet eller antistoff-fragmentet produsert av nevnte vertscelle.
Fortrinnsvis binder antistoffet en felles determinant tilstedeværende på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Man vil sette pris på at oppfinnelsen også frembringer en sammensetning som omfatter et antistoff som binder minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-formidlet inhibering av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker minst en av nevnte to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorer, hvor nevnte antistoff er tilstedeværende i en mengde som er effektiv i å påviselig potensere NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Fortrinnsvis binder antistoffet en felles determinant tilstedeværende på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Nevnte sammensetning kan valgfritt videre omfatte et andre terapeutisk middel valgt blant, for eksempel, et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptopisk middel, et andre antistoff som binder seg til og inhiberer en inhiberende KIR-reseptor, et anti-smittsomt middel, et målrettet middel, eller en supplerende forbindelse. Fordelaktige immunmodulerende midler kan velges fra IL-1 alfa,IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, eller IFN-gamma. Eksempler på slike kjemoterapeutiske midler inkluderer alkynerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antistoffer (adriamycin, dactinomycin, mitomycin, carminomycin, daunomycin, doxorubicin, tamoxifen, taxol, taxoter, vincristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-flourourasil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, thiotepa, metotrexat, camptothecin, actinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin, combretastatin(er), andre vinca alkaloider og derivater eller promedikamenter derav. Eksempler på hormonmidler inkluderer leuprorelin, goserelin, triptorelin, buserelin, tamoxifen, toremifen, flutamid, nilutamid, cyproteron, bicalutamidanastrozol, exemestan, letrozol, fadrozol, medroxy, klormadinon, megestrol, andre LHRH agonister, andre anti-estrogener, andre anti-androgener, andre aromatase inhibitorer, og andre progestagener. Fortrinnsvis er nevnte antistoff som binder seg til og inhiberer en inhiberende KIR-reseptor et antistoff eller et derivat eller fragment derav som binder en epitop til en inhiberende KIR-reseptor som er forskjellig fra nevnte epitop bundet av nevnte antistoff som binder en felles determinant tilstedeværende på minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter.
Oppfinnelsen frembringer videre en fremgangsmåte for å målbart potensere NK-celleaktivitet i en pasient som trenger det, omfattende et trinn for å administrere til nevnte pasient en sammensetning i følge oppfinnelsen. En pasient som trenger NK-celleaktivitet potensering kan være enhver pasient som har en sykdom eller tilstand hvori slik potensering kan promotere, forsterke og/eller indusere en terapeutisk effekt (eller promoterer, forsterker og/eller induserer en slik effekt i minst en betydelig andel av pasienter med sykdommen eller tilstanden, og betydelig lignende egenskaper som pasienten, noe som kan bestemmes ved foreksempel kliniske utprøvinger). En pasient som trenger slik behandling kan lide fra foreksempel kreft, andre prolifererende tilstander, en smittsom sykdom eller immuntilstand. Fortrinnsvis omfatter nevnte fremgangsmåte tileggstrinnet av administrering til nevnte pasient et til passende terapeutisk middel valgt fra en et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptopisk middel, et andre antistoff som binder seg til og inhiberer en inhiberende KIR-reseptor, et anti-smittsomt middel, et målrettet middel, eller en supplerende forbindelse, hvor nevnte terapeutiske tilleggmiddel administreres til nevnte pasient i en enkelt dosering i sammen med nevnte antistoff, eller som separate doseringer. Doseringen av antistoffet (eller antistoff fragment/derivat) og doseringen av det terapeutiske tileggsmiddelet er i sammen nok til å målbart indusere, promotere og/eller forsterke en terapeutisk respons i pasienten, som omfatter potensering av NK-celleaktivitet. Når administrert separat blir antistoffet, fragmentet eller derivatet og det ekstra terapeutiske midlet ønskelig administrert under forhold (foreksempel når det gjelder timing, antall doser, osv) som resulterer i en målbar kombinert terapeutisk fordel for pasienten.
Videre omfattet av den foreliggende oppfinnelsen er antistoffer i følge oppfinnelsen som er i stand til å spesifikt binde ikke-humane primat, fortrinnsvis ape, NK-celler og/eller ape KIR-reseptorer. Også omfattet er fremgangsmåter for evaluering av toksisitet, dosering og/eller aktivitet eller effektivitet av antistoffer i følge oppfinnelsen som er kandidatmedikamenter. I følge et aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bestemme en dose av et antistoff som er toksisk for et dyr eller målsvev, ved administrasjon av et antistoff i følge oppfinnelsen til en ikke-human primat mottaker som har NK-celler, og bedømming av toksiske eller skadelige eller uheldige effekter av middelet på dyret, eller fortrinnsvis på et målsvev. I et annet aspekt, er oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er toksisk for et dyr eller målsvev ved administrasjon av et antistoff i følge oppfinnelsen til et ikke-humant primat mottakerdyr som har NK-celler, og bedømming av toksiske eller skadelige eller uheldige effekter av middelet på dyret, eller fortrinnsvis på et målsvev. I følge et annet aspekt, er oppfinnelsen en fremgagnsmåte for å identifisere et antistoff som virker i behandlingen av en smittet, sykdom eller tumor, ved administrering av et antistoff i følge oppfinnelsen til en ikke-human modell av smitte, sykdom eller kreft, og identifisering av antistoffet som forbedrer infeksjonen, sykdommen eller kreften, eller et symptom derav. Fortrinnsvis er nevnte antistoff i følge oppfinnelsen et antistoff som (a) kryssreagerer med minst to inhiberende humane KIR-reseptorer på overflaten av humane NK-celler, og (b) kryssreagerer med NK-celler eller en KIR-reseptor til den ikke-humane primaten.
Videre omfattet av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å detektere tilstedeværelsen av NK-celler som har en inhiberende KIR på celleoverflaten, i en biologisk prøve eller en levende organisme, hvori nevnte metode omfatter trinnene: a) å bringe i kontakt med hverandre nevnte biologiske prøve eller levende organisme og et antistoff i følge oppfinnelsen, hvori nevnte antistoffer
konjugert eller kovalent bundet til en målbar enhet, og
b) detektering av tilstedeværelsen av nevnte antistoff i nevnte biologiske prøve eller levende organisme.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å rense fra en prøve med NK-celler som bærer en inhiberende KIR på celleoverflaten omfattende trinnene: a) å bringe i kontakt med hverandre nevnte prøve og et antistoff i følge oppfinnelsen under forhold som lar nevnte NK-celler som bærer en inhiberende KIR på celleoverflaten for å binde nevnte antistoff, hvori nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet på et fast underlag (foreksempel en perle, en matriks, osv), og b) elusjon av nevnte NK-celler fra nevnte antistoff konjugert eller kovalent bundet på et fast underlag.
I følge et ytterligere aspekt, frembringer oppfinnelsen et antistoff, antistoff fragment eller derivat av ethvert av disse, som omfatter den litt variable regionen, eller en eller flere lette variable region CDRer av antistoff DF200 eller antistoff Pan2D, som illustrert i figur 12.1 et videre aspekt, frembringer oppfinnelsen et antistoff, et antistoff fragment eller derivat av ethvert av disse, som omfatter en sekvens som er svært lignende alle eller så godt som alle av de litt variable sekvensregionene til DF200 eller Pan2D, eller en eller flere av den litt variable regionen av CDRer til en eller begge av disse antistoffene.
I et videre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, et antistoff fragement eller et derivat ev ethvert av disse, som omfatter den svært variable regionen eller en eller flere litt variable region CDRer av antistoff DF200, som illustrert i figur 13. I enda et videre aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, et antistoff fragment eller derivat av ethvert av disse, som omfatter en sekvens som er svært lignende alle eller så godt som alle av de svært variable regionsekvensene til DF200.
Disse og andre fordelaktige aspekter og egenskaper til oppfinnelsen kan videre beskrives andre steder heri.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser monoklonalt antistoff DF200 som binder seg til en felles determinant av ulike humane KIR2DL reseptorer. Figur 2 viser monoklonalt antistoff DF200 som nøytraliserer KIR2DL formidlet inhibering av KIR2DL1 positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw4 positive målceller. Figur 3 viser monoklonalt antistoff DF200, et Fab fragment av DF200, og KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 spesifikk konvensjonelle antistoffer som nøytraliserer den KIR2DL formidlede inhiberingen av KIR2DL1 positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw4 positive målceller, og KIR2DL formidlet inhibering av KIR2DL2/3 positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw3 positive målceller. Figur 4 viser rekonstruering av cellelysering av NK kloner til HLA Cw4 positive målceller med F(ab')2 fragmenter av DF200 of EB6 antistoffer tilstedeværende. Figurene 5 og 6 viser monoklonale antistoffer DF200, NKVSF1 (pan2D), humane antistoffer 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1, og KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 spesifikke konvensjonelle antistoffer som nøytraliserer KIR2DL formidlet inhibering av KIR2DL1 positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw4 positive målceller (Cw4 transfekterte celler i figur 5 og EBV celler i figur 6) Figur 7 viser et epitopkart som viser resultater av konkurrerende bindings eksperimenter frembrakt ved overflate plasmon resonans (BIAcore®) analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL1, hvor overlappende sirkler designerer overlapp i binding til KIR2DL1. Resultatene viser at 1-7F9 konturerer med EB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200, på KIR2DL1. Antistoff 1-4 F1 kronkurerer så med EB6, DF200, NKVSF1, og 1-7 F9. Antistoff NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1, og EB6, men ikke 1-7F9, på KIR2DL1. DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1, og EB6, men ikke 1-7F9, på KIR2DL1. Figur 8 viser et epitopkart som viser resultater av konkurrerende bindings eksperimenter frembrakt ved (BIAcore®) analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL3, hvor overlappende sirkler designerer overlapp i binding til KIR2DL3. Resultatene viser at 1-4F1 konturerer med NKVSF1, DF200, g1183 og 1-7F9 på KIR2DL3. 1-7F9 kronkurerer med DF200, g1183 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1, på KIR2DL3. NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1, og GL183, men ikke 1-7F9, på KIR2DL3. DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1, og 1-7F9, men ikke med GL183, på KIR2DL3. Figur 9 viser et epitopkart som viser resultater av konkurrerende bindings eksperimenter frembrakt ved (BIAcore®) analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL1, hvor overlappende sirkler designerer overlapp i binding til KIR2DS1. Resultatene viser at antistoff 1-4F1 konturerer med NKVSF1, DF200 og 1-7F9 på KIR2DS1. Antistoff 1-7F9 kronkurerer med 1-4F1, men ikke med DF200 og NKVSF1 på KIR2DS1. NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9, på KIR2DS1. DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9, på KIR2DS1. Figur 10 viser NKVSF1 (pan2D) mAb titrering som demonstrerer binding av mAb til cynomolgene NK-celler. Cynomolgene NK-celler (NK bulk dag 16) ble innkuberte med forskjellige mengder Pan2D mAb, etterfulgt av PE-konjugert geite-F(ab')2 fragmenter anti-mus IgG (H+L) antistoffer. Prosenten positive celler ble bestemt ved en isotypisk kontroll (renset muse-lgG1). Prøver ble utført i duplikat. Middels fluorescens intensitet = MFI. Figur 12 viser en sammenlignbar fremstilling av aminsyresekvensene til de litt variable regionene og litt variable region CDRene til antistoffene DF200 og Pan2D mAb.
Figur 13 viser den svært variable regionen til antistoff DF200.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Antistoffer
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nye antistoffer og fragmenter eller derivater derav som binder en felles determinant av humane inhiberende KIR-reseptorer, fortrinnsvis en determinant tilstedeværende på minst to forskjellige KIR2DL genprodukter, og fører til potensering av NK-celler som uttrykker minst en av disse KIR-reseptorene. Oppfinnelsen tilveiebringer, for første gang, at en slik kryssreaksjon og nøytralisering av antistoffer kan fremstilles, som representerer et uventet resultat, og åpner opp for ny og effektiv NK basert terapi, særlig for humane subjekter. I en foretrukket utførelse er antistoffet ikke monoklonalt antistoff NKVSF1.
Innenfor området til denne oppfinnelsen designerer en "felles determinant" en determinant eller epitopo som er delt av flere genprodukter til de humane inhiberende KIR-reseptorene. Fortrinnsvis er den felles determinanten delt av minst to medlemmer av KIR2DL reseptor gruppen. Mer fortrinnsvis er determinanten delt med minst KIR2DL1 og 2/3. Visse antistoffer i følge denne oppfinnelsen kan, i tilegg til å gjenkjenne flere genprodukter av KIR2DL, også gjenkjenne determinanter tilstedeværende på andre inhiberende KIRer, slik som genprodukter til KIR2DL reseptor gruppen. Determinanten eller epitopen kan representere et peptidfragement eller en konfirmasjonsepitop delt av nevnte medlemmer. I en mer spesifikk utførelse, binder antistoffet i følge oppfinnelsen spesifikt til hovedsakelig den samme epitopen som er gjenkjent av mononukleært antistoff DF200. Denne determinanten er tilstedeværende i både KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Innenfor området til denne oppfinnelsen, betyr utrykket antistoff som "binder" en felles determinant et antistoff som binder nevnte determinant spesifikt og/eller med affinitet.
Uttrykket "antistoff' som anvendt heri, referer til polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter og derivater av nevnte polyklonale og monoklonale antistoffer, så lenge som noe annet ikke er uttrykt eller klart vist av sammenhengen. Avhengig av typen konstant domene i de tunge kjeder, er antistoffer av full lengde typiskbestemt som en av fire klasser: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Flere av disse er videre delt inn i underklasser eller isotyper, så som lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 og så videre. De tungt kjedete konstante domenene som korresponderer med de forskjellige klassene immunglobuliner blir kalt "alfa", "delta", "epsiolon", "gamma" og "mu", respektivt. Sub-delstrukturene og tredimensjonale konfigurasjoner av forskjellige klasser immunglobuliner er velkjente. IgG og/eller IgM er de forestrukkne klassene antistoffer anvendt i denne oppfinnelsen fordi de er lettest å fremstille i et laboratorium. Fortrinnsvis er antistoffet i følge oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Fordi et av målene til oppfinnelsen er å blokkere interaksjonen til en inhiberende KIR og dets korresponderende HLA-ligand in vivo uten å redusere NK-cellene, er isotyper som korresponderer med Fc reseptorer som medierer lav effektor funksjon, så som lgG4, typisk foretrukket.
Antistoffene i følge denne oppfinnelsen kan fremstilles ved en variasjon av teknikker kjent på fagfeltet. Typisk vil de fremstilles ved immunisering av et ikke-humant dyr, fortrinnsvis en mus, med et immungen omfattende et inhiberende KIR-polypeptid, fortrinnsvis et KIR2DL polypeptid, mer foretrukket et humant KIR2DL polypeptid. De inhiberende KIR-polypeptidet kan omfatte den fulle lengden av sekvensen til et humant inhiberende KIR-polypeptid, eller et fragment eller derivat derav, typisk et immungen fragment, foreksempel en del av polypeptidet omfattende en epitop uttrykket på overflaten av cellen som uttrykker en inhiberende KIR-reseptor. Slike fragmenter inneholder typisk minst omlag 7 aminosyrer i rekkefølge tilhørende den ferdige polypeptid sekvensen, enda mer foretrukket minst 10 aminosyrer i rekkefølge derav. Fragmenter er typisk hovedsakelig tatt fra det ekstracellulære domenet til reseptoren. Enda mer foretrukket er humane KIR2DL polypeptider som inkluderer mist en, mer foretrukket begge, av de ekstracellulære lg domenene, til KIR-polypeptidet av full lengde, og er i stand til å se ut som minst en konfirmasjons epitop tilstedeværende på en KIR2DL reseptor. I andre utførelser omfatter nevnte polypeptid minst omlag 8 aminosyrer i rekkefølge til et ekstracellulært lg domene av aminosyre posisjonene 1-224 til KIR2DL1 polypeptidet (aminosyre nummerering i følge PROW nettsiden som beskriver KIR-genfamilien,
http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ prow/ guide/ 1326018082. htm'
I en mest foretrukket utførelse, omfatter immungenet et naturlig forekommende humant KIR2DL polypeptid i en lipidmembran, typisk på overflaten til en celle. I en spesifikk utførelse omfatter immunogenet intakte NK-celler, særlig intakte humane NK-celler, valgfritt behandlet eller lysert.
Trinnet der et ikke-humant pattedyr immuniseres med et antigen kan utføres på ethvert vis som er velkjent på feltet, for å stimulere fremstilling av antistoffer i en mus (se foreksempel E. Harlow og D. Lane, Antibodies: A laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1998)). Immungenet blir så suspendert eller oppløst i en buffer, valgfritt med en adjuvant, så som fullstendig Freund's adjuvant. Fremgangsmåter for å fastslå mengden immungen, typer buffere, og mengder av adjuvant er velkjente for de med kunnskaper på feltet, og er ikke begrenset på noen måte i forhold til den foreliggende oppfinnesen. Disse parametrene kan være forskjellige for forskjellige immungener, men er enkle å finne ut av.
Lignende er plasseringen og hyppigheten av immunisering tilstrekkelig for å stimulere produksjon an antistoffer også velkjent på feltet. Ved en typisk immuniseringsprotokoll blir de ikke-humane dyrene injisert intraperitonalt med antigen på dag 1, og igjen etter omlag en uke. Dette blir etterfulgt av tilbakebringende injeksjoner av antigenet ved omlag dag 20, valgfritt med en adjuvant så som ufullstendig Freund's adjuvant. De tilbakebringende injeksjonene blir utført intravenøst, og kan repeteres flere etterfølgende dager. Dette er etterfulgt av en revaksinering ved dag 40, enten intravenøst eller intraperitonalt, vanligvis uten en adjuvant. Denne protokollen resulterer i produksjon av antigenspesifikke antistoffproduserende B celler etter omlag 40 dager. Andre protokoller kan også brukes så lenge de resulterer i produksjon av B celler som uttrykker et antistoff rettet mot antigenet brukt i immuniseringen.
For polyklonisk antistoff fremstilling, blir serum fremskaffet fra et immunisert ikke-humant dyr, og antistoffene tilstedeværende deri blir isolert ved velkjente teknikker. Serumet kan renses ved affinitet ved bruk av ethvert av immungen beskrevet ovenfor linket til et fast grunnlag, for å oppnå antistoffer som reagerer med inhiberende KIR-reseptorer.
I en alternativ utførelse, blir lymfocytter fra et ikke-immunisert ikke-humant pattedyr isolert, dyrket in vitro, og så utsatt for immungenet i cellekultur. Lymfocyttene blir så høstet, og fusjonstrinnet beskrevet under blir utført.
For monoklonale antistoffer, er det neste trinnet isolering av miltocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret, og etterfølgende fusjon av disse miltocyttene med en udødeliggjort celle, for å forme et antistoffproduserende hybridom. Isoleringen av miltocytter fra et ikke-humant pattedyr er velkjent på fagfeltet, og involverer vanligvis fjerning av milten fra et bedøvd ikke-humant pattedyr, kutting av det til småstykker, og klemming av miltocyttene fra miltkapselen gjennom et nylonnett tilhørende en cellesil in i en passende buffer, for å produsere en encellet suspensjon. Cellene blir vasket, sentrifugert og gjensuspendert i en buffer som lyser alle røde blodlegemer. Denne oppløsningen glir sentrifugert igjen, og gjenværende lymfocytter i bunnavfallet blir til slutt gjensuspendert i ny buffer.
Når de er isolerte og tilstedeværende i en encellet suspensjon, kan lymfocyttene smeltes sammen med en udødeliggjort cellelinje. Dette vil typisk være en musemyelom cellelinje, selv om mange andre udødeliggjorte cellelinjer som er brukbare for å lage hybridomer er kjent på fagfeltet. Forestrukkne musemyelom linjer inkluderer, men er ikke begrenset til, de som er derivert fra MOPC-21 og MPC-11 musetumorer tilgjengelige fra the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A., X63 Ag8653 og SP-2 celler tilgjengelige fra The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. Fusjonen er bevirket ved bruk av polyetylen glykol eller lignende. De resulterende hybridomene er så dyrket i seleksjonsmedium inneholdende en eller flere substanser som inhiberer vekst eller overlevelse av de ikke-sammensmeltede delvis myelom cellene. Foreksempel, dersom de opprinnelige myelom cellene mangler enzymet hypoxanthin guanin fosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT) vill dyrkingsmediet for hybridomene vanligvis omfatte hypoxanthin, aminopterin og tymedin (HAT medium), da disse substansene forhindrer vekst av HGPRT-manglende celler.
Hybridomer er vanligvis dyrket på et materlag av makrofager. Makrofagene stammer fortrinnsvis fra samme kull som det ikke-humane pattedyret brukt for å isolere miltocyttene, og er vanligvis forberedt med Freund's adjuvant eller lignende i flere dager før hybridomene er anbrakt derpå. Fusjonsmetoder er beskrevet av Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," ss. 59-103 (Academic Press, 1986), som er inkorporert heri i sin helhet ved referanse dertil.
Cellene får vokse i utvelgingsmediet lenge nok for formasjon av kolonier og produksjon av antistoffer. Dette tar vanligvis mellom 7 og 14 dager. Hybridom koloniene blir så testet for produksjon av antistoffer som kryssreagerer med flere inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter. Testen er vanligvis en kolorimetrisk test av ELISA typen, selv om enhver test kan brukes som kan tilpasses brønnene som hybridomene vokser i. Andre tester inkluderer immunutfelling og radioimmuntesting. Brønnene som er positive for den ønskede antistoffproduksjonen blir undersøkt for å fastslå om en eller flere forskjellige kolonier foreligger. Dersom mer enn en koloni forreligger, kan cellene gjenklones og dyrkes for å forsikre at bare en enkelt celle har gitt opphav til kolonien som produserer det ønskede antistoffet. Positive celler med en enslig synlig koloni blir vanligvis gjenklonet og gjentestet for å forsikre om at bare et monoklonalt antistoff detekteres og produseres.
Antistoffer kan også produseres ved valg av kombinasjonsbibliotek av immunglobuliner, som foreksempel vist i Ward et al., Nature, 341 (1989) s. 544).
Antistoffene i følge denne oppfinnelsen kan nøytralisere den KIR-formidlede inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet; særlig inhibering formidlet av KIR2DL reseptorer og enda mer spesifikt minst både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 inhibering. Disse antistoffene er derved "nøytraliserende" eller "inhiberende" antistoffer, i det de blokkerer, i det minste delvis og påviselig, den inhiberende signalveien formidlet av KIR-reseptorer når de er i kontakt med MHC klasse 1 molekyler. Det er mer viktig at denne inhiberende aktiviteten er påvist i forhold til flere typer av inhiberende KIR-reseptorer, fortrinnsvis flere KIR2DL reseptorgenprodukter, og mer fortrinnsvis minst begge KIR2DL1 og KIR2DL2/3, slik at disse antistoffene kan anvendes i ulike subjekter med god virkning. Inhibering av KIR-fremmet inhibering av NK-cellecytotoksisitet kan påvises ved ulike prøver eller tester, så som bindings eller celletester.
Når et antistoff som kryssreagerer med flere inhiberende KIR-reseptorer er
identifisert, kan det testes for dets evne til å nøytralisere den inhiberende effekten til de KIR-reseptorene som er i kontakt med NK-celler. I en spesifikk utførelse kan den nøytraliserende aktiviteten illustreres ved kapasiteten til antistoffet til å rekonstituere lysering utført av KIR2DL positive NK kloner på HLA-C positive mål. I en annen spesifikk utførelse defineres den nøytraliserende aktiviteten til antistoffet ved evnen til antistoffet til å inhibere binding av HLA-C molekyler til KIR2DL1 og KIR2DL3 (eller det nært beslektede KIR2DL2) reseptorene, og videre er det fortrinnsvis mulig for antistoffet å endre: - binding av HLA C-molekyl valgt fra Cw1, Cw3, Cw7 og Cw8 (eller til et HLA C-molekyl som har en Asn-rest i posisjon 80) til KIR2DL2/3; og - binding av et HLA C-molekyl valgt fra Cw2, Cw4, Cw5 og Cw6 (eller av et HLA C-molekyl som har en lys rest i posisjon 8) til KIR2DL1.
I en annen variant kan den inhiberende aktiviteten til et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen vurderes i en cellebasert cytotoksisitet prøve, som fremlagt i eksemplene vist heri.
I følge en annen variasjon kan den inhiberende aktiviteten til et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen evalueres i et cytokin- frigjørelsesprøve hvori NK-celler blir dyrket med test antistoffet, og en målcellelinje som uttrykker et HLA C allel gjenkjent av et KIR-molekyl i NK populasjonen, for å stimulere NK-cellecytokinproduksjon (for eksempel IFN-y og/eller GMCSF produksjon). I følge en eksempelvis protokoll blir IFN- y produksjon fra PBMC påvist ved celleoverflate og intracytoplasmisk farging, og analyse gjennomstrømningscytometri etter om lag 4 dagers dyrking. I korthet kan Brefeldin A (Sigma Aldrich) bli tilsatt ved en endelig konsentrasjon på om lag 5u.g/ml
i de siste ca 4 timene av dyrkingen. Disse cellene kan så bli dyrket med anti CD3 og anti DC56 mAb før permeabilisering (IntraPrep™; Beckman Coulter) og farging med PE-antilFN- y eller PE-OgG1 (Pharmingen). GM-CSF og IFN- y produksjon fra polyklonale aktiverte NK-celler kan måles i væskedelen av prøven ved bruk av ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN- y: OptEIA set, Pharmingen).
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan delvis eller fullt nøytralisere den KIR-frembrakte inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet. Uttykket "nøytralisere KIR-fremmet inhibering av NK-cellecytotoksisitet, som brukt heri, betyr evnen til å øke til minst om lag 20% fortrinnsvis til minst om lag 30%, minst om lag 40%, i det minste til 50% eller mer (med andre ord omtrent 25 - 100%) den spesifikke lysering oppnådd med det samme forholdet med NK-celler eller NK-cellelinjer som ikke er blokkerte av deres KIR, som målt med en klassisk kromfrigjøringstest for cytotoksisitet, sammenlignet med nivået på spesifikk lysering oppnådd uten antistoff når en NK-celle populasjon som uttrykker en gitt KIR er satt i kontakt med en målcelle som uttrykker det beslektede MHC klasse 1 molekylet (gjenkjent av KIR'et uttrykt på NK-cellen). For eksempel er foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen i stand til å indusere lysering av tilpassede eller HLA-kompatible eller autologe målcellepopulasjoner, med andre ord celle populasjoner som ikke ville bli effektivt lyst av NK-celler i fravær av nevnte antistoff. Følgende kan antistoffene ifølge oppfinnelsen også defineres ved at de frembringer NK-celle aktivitet in vivo.
Alternativt kan uttrykket "nøytralisere KIR frembrakt inhibering" bety at i en krom-prøve som brukeren NK-celle klone eller transfektant som uttrykker en eller flere inhiberende KIR'er, og en målcelle som uttrykker bare ett HLA-allel som er gjenkjent av en av KIR'ene på NK-cellen, burde nivået på cytotoksisitet oppnådd med antistoffet være minst om lag 20%, fortrinnsvis minst om lag 30%, minst om lag 40%, i det minste om lag 50% (for eksempel om lag 25-100%), eller mer av cytotoksisiteten oppnådd med et kjent blokkerings anti-MHC klasse 1 molekyl, så som W6/32 anti-MHC klasse 1 antistoff.
I en spesifikk utførelse binder antistoffet hovedsakelig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 (produsert av hybridom DF200). Slike antistoffer er referert til heri som "DF200 lignende antistoffer". I en videre foretrukket utførelse er antistoffet et monoklonalt antistoff. Mer foretrukket "DF200 lignende antistoffer" i følge oppfinnelsen er antistoffer andre enn det monoklonale antistoffet NKVSF1. Mest foretrukket er monoklonalt antistoff DF200 (produsert av hybridom DF200).
Uttrykket "binder hovedsakelig til den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff" konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse. Uttrykket "binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet DF200 betyr at et antistoff" konkurrerer" med DF200. Et antistoff som "binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet av interesse (for eksempel DF200, NKVSF1, 17F9), betyr generelt at antistoffet "konkurrerer med nevnte antistoff av interesse for en eller flere KIR-molekyler, fortrinnsvis et KIR-molekyl valgt ut fra gruppen bestående av KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Ifølge andre eksempler "konkurrerer" et antistoff som binder seg hovedsakelig til den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL1 molekyl som antistoffet av interesse med antistoffet av interesse for binding til binding til KIR2DL1. antistoffet som binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten på en KIR2DL2/3 molekyl som antistoffet av interesse "konkurrerer" med antistoff av interesse for binding til KIR2DL2/3.
Uttrykket "Binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for et hvert og alle KIR-molekyler som nevnte antistoff av interesse spesifikt binder seg til. Uttrykket" binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoff DF200, betyr at et antistoff "konkurrerer" med DF200 for et hvert og alle KIR-molekyler som DF200 binder seg spesifikt til. For eksempel "konkurrerer" et antistoff som binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som de monoklonale antistoffene DF200 eller NKVSF1 med nevnte DF200 eller NKSVSF1, respektivt for binding til KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2Ks1 og KIR2DS2.
Identifisering av ett eller flere antistoffer som binder til hovedsakelig eller vesentlig den samme epitopen som de monoklonale antistoffene beskrevet heri kan lett bestemmes ved bruk av en av en mengde forskjellige immunologiske sorterings-tester hvori antistoffkonkurranse kan bestemmes. En mengde slike tester blir rutinelig brukt, og er kjent på feltet, (se for eksempel US Pat. nr 5.660.827 utgitt 26. august 1997, som er spesifikt inkludert heri ved referanse). Det vil bli forstått at det ikke er på noe vis krevd at man faktisk bestemmer hvilken epitop et antistoff som beskrevet heri bindes til for å identifisere et antistoff som binder det samme eller hovedsakelig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet beskrevet heri.
For eksempel, når prøve antistoffene som skal undersøkes er frembrakt fra forskjellige kildedyr eller til og med fra forskjellige IG isotyper, kan en enkelt konkurranse test bli brukt hvori kontrollen (for eksempel DF200) og prøve antistoffene blir blandet sammen (eller på forhånd absorbert) og påført en prøve inneholdende både KIR2DI1 og KIR2DL2/3, som begge er kjente for å binde DF200. Protokoller basert på ELISAer, radioimmuntester, Western blotting, og bruk av BIACORE analyse (som for eksempel vist i eksempel delen) er anvendbare for bruk i slike enkle konkurransestudier.
I følge noen utførelser vil man forhåndsblande kontrollantistoffene (for eksempel DF200) med varierende mengder testantistoffer (for eksempel om lag 1:10 eller 1:100) i et tidsrom før man påfører det på den inhiberende KIR-antigen prøven. I andre utførelser kan kontrollen og varierende mengder av testantistoffer lett bli sammenblandet i løpet av tiden de er utsatt for KIR-antigen prøven. Så lenge en kan se forskjell på bundne og frie antistoffer (for eksempel ved bruk av separasjon eller vaske teknikker for å eliminere ikke-bundne antistoffer) og DF200 fra prøve-antistoffene (for eksempel ved bruk av artsspesifikke eller isotypspesifikke sekundære antistoffer, eller ved spesifikk merking av DF200 med et detekterbart merke) kan man påvise om prøveantistoffene reduserer binding av DF200 til de to forskjellige KIR2DL antigenene, noe som indikerer at prøveantistoffet gjenkjenner hovedsakelig den samme epitopen som DF200. Bindingen av de (merkede) kontroll antistoffene i fravær av et helt irrelevant antistoff kan brukes som den høyeste kontrollverdien. Den laveste kontrollverdien kan fremskaffes ved inkubasjon av merkede (DF200) antistoffer med ikkemerkede antistoffer av akkurat den samme typen (DF200), hvori konkurransen ville foregå og redusere binding av merkede antistoffer. I en prøvetest er en signifikant reduksjon av merket antistoffreaktivitlet ved tilstedeværelse av prøveantistoff en indikasjon på et test antistoff som gjenkjenner hovedsakelig den samme epitopen, dvs. en som "kryss reagerer" med det merkede (DF200) antistoffet. Et hvert testantistoff som reduserer binding av DF200 til hver av KIR2DL1 og KIR2DL2/3 antigener ved minst om lag 50%, så som minst om lag 60%, eller mer fortrinnsvis minst om lag 70% (for eksempel om lag 65-100%), av ethvert forhold av DF200: test antistoff mellom 1:10 og om lag 1:100 er ansett for å være et antistoff som binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som DF200. Fortrinnsvis vil et slikt testantistoff redusere bindingen av DF200 til hvert av KIR2DL antigenene ved minst om lag 90% (for eksempel om lag 95%).
Konkurranse kan påvises ved for eksempel en gjennomstrømningscytomertitest. I en slik test kan cellene som bærer en gitt KIR bli innkubert først med DF200, for eksempel, og så med testantistoffet merket med fluorkrom eller biotin. Antistoffet blir regnet for å konkurrere med DF200 dersom bindingen oppnådd etter forinkubering med saturerende mengde av DF200 er om lag 80%, fortrinnsvis om lag 50%, om lag 40% eller mindre (for eksempel 30%) av bindingen (som målt ved gjennomsnittlig fluorescens) oppnådd av antistoffet uten forhåndsinnkubering med DF200. Alternativt blir antistoffet regnet for å konkurrere med DF200 dersom bindingen oppnådd med merket DF200 (med fluorkrom eller biotin) på celler forhåndsinnkubert med en saturerende mengde av testantistoff er på om lag 80%, fortrinnsvis om lag 50%, om lag 40%, eller mindre (for eksempel om lag 30%) av bindingen oppnådd uten forhåndsinnkubering med antistoffet.
En enkel konkurranse test hvori et prøveantistoff er forhånds absorbert og påført ved saturerende konsentrasjoner til en overflate hvorpå både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 er immobiliserte kan også brukes med fordel. Overflaten i den enkle konkurranse testen er fortrinnsvis en BIACORE brikke (eller andre medium passende for overflate plasmon resonansanalyse). Kontroll antistoffet (for eksempel DF200) blir så brakt i kontakt med overflaten ved KIR2DL1 og KIR2DL2/3 saturerende konsentrasjoner, og KIR2DL1 og KIR2DL2/3 overflate binding av kontrollantistoffet blir målt. Denne bindingen av kontrollantistoff er sammenlignet med bindingen av kontrollantistoff til de KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflatene i fravær av testantistoffet. I prøvetesten indikerer en signifikant reduksjon av binding til de KIR2DL1 og KIR2DL2/3-inneholdende overflatene av kontrollantistoffet i nærvær av testantistoff at testantistoffet gjenkjenner hovedsakelig den samme epitopen som kontrollantistoffet, slik at testantistoffet "kryssreagerer" med kontrollantistoffet. Et hvert testantistoff som reduserer bindingen av kontrollantistoffet (så som DF200) til hver av KIR2DL1 og KIR2DL2/3 antigenene ved minst om lag 30%, eller mer fortrinnsvis om lag 40%, kan anses å være et antistoff som binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som kontrollen (for eksempel DF200). Fortrinnsvis vil et slikt testantistoff redusere bindingen av kontrollantistoffet (for eksempel DF200) til hver av KIR2DL2 antigenene ved minst om lag 50% (for eksempel minst ca 60%, minst ca 70% eller mer). Det vil forstås at rekkefølgen på kontroll og prøveantistoffer kan reverseres: dvs at kontrollantistoffet kan bli bundet først til overflaten, og testantistoffet er så brakt i kontakt med overflaten etterpå i en konkurransetest. Fortrinnsvis blir antistoffet som haren høy affinitet for KIR2DL1 og KIR2DL2/3 antigener bundet til den KIR2DL1 og KIR2DL2/3 inneholdende overflaten først, da det vil bli forventet at senkningen i binding som sett for det andre antistoffet (når man går ut fra at antistoffer kryssreagerer) vil være av en høyere størrelsesorden. Videre eksempler på slike tester er gitt i eksemplene og i for eksempel Saunal og Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, som er heri inkludert ved referanse.
Selv om de er beskrevet i forhold til DF200 for formålet av å gi et eksempel, vil det forstås at de ovenfor beskrevne immunologiske utvelgingstestene også kan bli brukt til å identifisere antistoffer som konkurrerer med NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183, og andre antistoffer i følge oppfinnelsen.
Etter immunisering og produksjon av antistoffer i et vertebrat eller en celle kan visse utvelgings trinn utføres for å isolere antistoffer som krevd. I så måte vedrører oppfinnelsen en spesifikk utførelse også metoder for produksjon av slike antistoffer omfattende: a) immunisering av et ikke humant pattedyr med et immunogen omfattende et inhiberende KIR-polypeptid; b) preparering av antistoffet fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoffer binder til nevnte KIR-polypeptid, c) valg av antistoffer fra (b) som kryssreagerer med minst to forskjellige inhiberende KIR-genprodukter, og d) valg av antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere KIR-frembrakt inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker
nevnte i det minste to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter.
Valg av et antistoff som kryssreagerer med minst to forskjellige inhiberende KIR-genprodukter kan oppnås ved undersøkelse av antistoffet i forhold til to eller flere forskjellige inhiberende KIR-antigener, for eksempel som beskrevet ovenfor.
I følge en mer foretrukket utførelse er antistoffene preparert i trinn (b) monoklonale antistoffer. Derfor inkluderer uttrykket "preparering av antistoffet fra nevnte immuniserte dyr" som brukt heri og skaffe B-celler fra et immunisert dyr og bruke disse B-cellene for å produsere et hybridom som uttrykker antistoffet, så vel som å skaffe antistoffer direkte fra serumet til et immunisert dyr. I en annen foretrukket utførelse er antistoffene valgt i trinn (c) de som kryssreagerer med minst KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
I enda en annen foretrukket utførelse fører antistoffene som var valgt i trinn (d) til minst 10% spesifikk lysering frembrakt av NK-celler som uttrykker minst en KIR gjenkjent av antistoffet, og fortrinnsvis minst ca. 40% spesifikk lysering, minst ca. 50% spesifikk lysering, eller mer fortrinnsvis minst om lag 70% spesifikk lysering (for eksempel om lag 60-100% spesifikk lysering) som målt i en standard krom-frigjøringstest, mot en målcelle som uttrykker et beslektet HLA klasse 1 molekyl, sammenlignet med lysering eller cytotoksisitet oppnådd med det samme effektor/mål-forholdet med NK-celler som ikke er blokkerte av deres KIR. Alternativt blir antistoffene som er valgt i trinn(d) når anvendt i en kromtest som anvender en NK-celle-klon som uttrykker en eller flere inhiberende KIR'er og en målcelle som uttrykker bare ett HLA-allel som er gjenkjent av en av KIR'ene på NK klonen burde nivået på cytotoksisiteten oppnådd med antistoffet bli minst om lag 20%, fortrinnsvis minst om lag 30% eller mer av cytotoksisitet oppnådd med et blokkerende anti MHC klasse 1 mAb, så som W6/32 anti MHC klasse 1 antistoff.
Rekkefølgen på trinn (c) og (d) til den rett ovenfor beskrevne fremgagnsmåten kan forandres. Valgfritt kan fremgangsmåten også eller alternativt videre omfatte ekstra trinn for å fremstille fragmenter av det monoklonale antistoffet eller derivater av det monoklonale antistoffet eller slike fragmenter, for eksempel som beskrevet andre plasser heri.
I en foretrukket utførelse er det ikke humane dyret brukt for å produsere antistoffer ifølge anvendbare fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen et pattedyr, så som en gnager (for eksempel mus, rotte, osv), kveg, gris, hest, kanin, geit, sau osv. Det ikke humane pattedyret kan også være genetisk modifisert eller fremstilt for å produsere "humane" antistoffer så som Xenomouse™ (Abgenix) eller HuMab-Mouse™
(Medarex).
I følge en annen variant frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å oppnå et antistoff som omfatter: a) valg av, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff, et fragment av et monoklonalt antistoff eller et derivat av ethvert av disse som kryssreagerer
med minst to forskjellige humane inhiberende KIR2DL reseptorgenprodukter, og
b) valg av et antistoff, fragment eller derivat av (a) som er i stand til å nøytralisere KIR-frembrakt inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon
av NK-celler som uttrykker de minst to forskjellige humane inhiberende KIR2DL reseptorgenproduktene.
Repertoaret kan være et hvert (rekombinant) repertoar av antistoffer eller fragement derav, valgfritt fremvist på enhver passende struktur (for eksempel fag, bakterie, syntetisk kompleks, osv). Valg av inhiberende antistoffer kan utføres som beskrevet ovenfor og er videre illustrert i eksemplene.
I følge en annen utførelse frembringer oppfinnelsen et hybridom som omfatter en B-celle fra en ikke human vert, hvori nevnte B-celle produserer et antistoff som binder en determinant tilstedeværende på minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter, og nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere den inhiberende aktiviteten til nevnte reseptorer. Mer fortrinnsvis er hybridomet i følge dette aspektet av oppfinnelsen ikke et hybridom som produserer det monoklonale antistoffet NKVSF1. Hybridomet ifølge dette aspektet av oppfinnelsen kan lages som beskrevet ovenfor ved fusjon av miltocytter fra det immuniserte ikke humane pattedyret med en udødeliggjort cellelinje. Hybridomer produsert på denne måten kan testes for tilstedeværelse av slike kryssreagerende antistoffer som beskrevet andre plasser heri. Fortrinnsvis produserer hybridomet et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstedeværende på minst to forskjellige KIR2DL genprodukter, og fører til potensiering av NK-celler som uttrykker minst en av disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket er det om hybridomet produserer et antistoff som binder seg til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som DF200, og som potenserer NK-celleaktivitet. Mest fortrinnsvis er hybridomet hybridom DF200 som produserer monoklonalt antistoff DF200.
Hybridomer som det er påvist at produsere et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen kan dyrkes i store mengder i et passende medium så som DMEM eller RPMI -1640. Alternativt kan hybridomcellene dyrkes in vivo som ascites tumorer i et dyr.
Etter tilstrekkelig vekst for å produsere det ønskede monoklonale antistoffet blir vekst media inneholdende monoklonalt antistoff (eller ascites væske) separert bort fra cellene, og det monoklonale antistoffet tilstedeværende deri blir renset. Rensing blir typisk oppnådd ved gel elektroforese, dialyse, kromatografi ved bruk av protein A eller protein G, Sepharose, eller en antimus lg forbundet med et solid underlag så som agarose eller Sepharose perler ( som beskrevet for eksempel i: the Antibody Purification Handbook, Amerham Biosciences, publication NO 18-1037-46, Edition AC, som herved er inkorporert ved referanse). Det bundne antistoffet blir typisk utskilt fra protein A/protein G søyler ved bruk av en bufferoppløsning med lav pH (glysin eller acetat bufferer med pH 3,0 eller mindre) med umiddelbar nøytralisering av antistoff inneholdende fraksjoner. Disse fraksjonene blir samlet, dialysert, og konsentrert dersom nødvendig.
I følge en alternativ utførelse blir DNA'et som koder for et antistoff som binder en determinant tilstedeværende på minst to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorgenprodukter isolert fra hybridomet ifølge oppfinnelsen, og plassert i en passende ekspresjonsvektor for transfeksjon inn i en passende vert. Verten er så brukt i den rekombinante produksjonen av antistoffet, eller varianter derav, så som den humaniserte versjonen av det monoklonale antistoffet, aktive fragmenter av antistoffet, eller kimeriske antistoffer som omfatter antigen gjenkjennelsesdelen av antistoffet. Fortrinnsvis koder DNAet brukt i denne utførelsen for et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstedeværende på minst to forskjellige KIR2DL genprodukter, og fører til potensering av NK-celler som uttrykker minst en av disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket koder DNAet for et antistoff som binder til hovedsakelig den samme epitopen eller determinanten som DF200, og som potenserer NK-celle aktivitet. Mest fortrinnsvis koder DNAet for monoklonalt antistoff DF200.
DNA som koder for monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er lett å isolere og sekvensere ved bruk av konvensjonelle prosedyrer (for eksempel ved bruk av oligonukleotid prober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for tunge og lette kjeder av museantistoffer). Når det er isolert kan DNAet plasseres inn i uttrykkingsvektorer, som så blir transfektert inn i vertsceller så som E. coli celler, menneske ape COS celler, kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, eller myelomi celler som ikke på andre måter produserer immunglobulin protein, for å oppnå syntese av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Rekombinant uttrykking i bakterier av DNA som koder for antistoff er velkjent på feltet (se for eksempel: Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 2,pp.256(1993); og Pluckthum, Immunol. Revs., 130,pp151 (1992).
Fragmenter og derivater av et monoklonalt antistoff.
Fragmenter og derivater av antistoffer ifølge oppfinnelsen (som er omfattet av uttrykket "antistoff" eller "antistoffer" som brukt i denne søknaden, dersom ikke på annet vis uttrykt eller klart motsagt av innholdet), fortrinnsvis et DF200 lignende antistoff, kan produseres ved teknikker som er kjente på feltet. "Immunreaktive fragmenter" omfatter en andel av det intakte antistoffet, generelt det antigenbindende domenet eller den variable regionen. Eksempler på antistoff fragmenter inkluderer Fab, Fab', Fab'-SH, F8ab')2 og Fv fragmenter; diastoffer; ethvert antistoff fragment som er et polypeptid som har en primærstruktur som består av en uavbrutt sekvens av aminosyre rester (referert til heri som "enkelt kjede antistoff fragment" eller "enkelt kjede polypeptid"), inkludert uten begrensning 1) enkeltkjede Fv (scFv) molekyler (2) enkeltkjede polypeptider inneholdende bare ett lettkjedevariabelt domene, eller fragmenter derav som inneholder de tre CDRene til det lettkjede variable domenet, uten en assosiert tungkjedeenhet og (3) enkeltkjede polypeptider som inneholder bare en tungkjede variabel region, eller et fragment derav som inneholder de 3 CDRene til den tungekjede variable regionen, uten en assosiert lettkjedeenhet; og flere spesifikke antistoffer formet fra antistoff-fragmenter. Foreksempel kan Fab eller F(ab')2 fragmenter produseres ved proteaseoppkutting av de isolerte antistoffene, ifølge konvensjonelle teknikker. Det vil bli satt pris på at de immunreaktive fragmentene kan modifiseres ved bruk av kjente fremgangsmåter, for eksempel ved å sette ned hastigheten på klarering in vivo, og å oppnå en mer ønskelig farmako-kinetisk profil kan fragmentet modifiseres med polyetylenglykol (PEG). Fremgangsmåte for sammenkobling og plasspesifikk konjugering av PEG til et Fab' fragment er beskrevet i foreksempel Leong et al, Cytokine 16(3): 106-119 (2001) og Delgado et al, Br.J. Cancer 73(2): 175-182 (1996), hvis innhold er inkorporert heri ved referanse.
I et særskilt aspekt frembringer oppfinnesen antistoffer, antistoff fragmenter og antistoff derivater som omfatter den lettkjede variable regionsekvensen av DF200 som vist i figur 12.1 et annet særskilt aspekt frembringer oppfinnelsen antistoffer, antistoff fragmenter og antistoff derivater som omfatter den lettekjedevariable regionsekvensen av Pan2D som vist i figur 12. I et annet aspekt frembringer oppfinnelsen antistoffer, antistoff fragmenter og derivater derav som omfatter en eller flere av den lett variable regionen CDRene av DF200 som vist i figur 12. I enda et annet aspekt frembringer oppfinnelsen antistoffer, antistoff fragmenter og derivater derav som omfatter en eller flere lettekjede variable regioner CDRer av Pan2D som vist i figur 12. Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan genereres ved å lage passende substitueringer, tillegg, og/eller fjerninger i disse fremlagte aminosyrefrekvensene ved bruk av standard teknikker, som kan hjelpes ved sammenligning av sekvensene. Derved kan for eksempel CDR restene som er konservert mellom Pan2D og DF200 være passende mål for modifikasjon da slike rester kanskje ikke bidrar til forskjellige profilene i konkurranse som disse antistoffene har i henhold til andre antistoffer fremlagt heri (selv om Pan2D og DF200 konkurrerer), og kan derfor ikke bidra til spesifisiteten til disse antistoffene for deres særskilte respektive epitoper. I et annet aspekt kan posisjoner hvor en rest er tilstedeværelse i en sekvens til ett av disse antistoffene med ikke i et annet, være passende for fjerning, substitueringer og/eller innsettinger.
I en bestemt utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer, antistoff fragmenter og antistoff derivater som omfatter den tungekjede variable region sekvensen til DF200 som fremlagt i figur 13. I et annet aspekt fremlegger oppfinnelsen antistoffer, antistoff-fragmenter og derivater derav som omfatter en eller flere av tungkjede-region CDRene til DF200 som vist i figur 13. Funksjonelle varianter/ analoger av slike sekvenser kan genereres ved å lage passende substitusjoner, tillegg og/eller fjerninger i disse fremlagte aminosyresekvensene ved bruk av standard teknikker, som kan behjelpes ved sammenligning av sekvensene. I et annet aspekt kan posisjoner hvor en rest er tilstedeværende i en sekvens til ett av disse antistoffene men ikke et annet være passende for slettinger, substitusjoner og/eller innsettelser.
Alternativt kan DNAet til et hybridom som produserer antistoff ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200 lignende antistoff, bli modifisert slik at det koder for et fragment ifølge oppfinnelsen. Det modifiserte DNAet blir så satt inn i en ekspresjonsvektor og brukt for å transformere eller transfektere en passende celle som så uttrykker det ønskede fragmentet.
I en alternativ utførelse kan DNAet til et hybridom som produserer et antistoff ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200 lignende antistoff, bli modifisert før innsettelse inn i en ekspresjons vektor, for eksempel ved substituering av kode sekvensen for humant tungt og lettkjedet konstante domener istedenfor det homologe ikke-humane sekvensen (foreksempel Morrison et al., Proe. Nati. Acac. Sei. UAS., 81,pp 6851
(1984), eller ved å kovalent binde den immunglobulin kodende sekvensen helt eller delvis til den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulin polypeptid. På denne måten blir kimære eller "hybride" antistoffer fremskaffet som har den samme binde spesifisiteten som den originale antistoffet. Typisk er slike ikke-immunglobulin polypeptider substituerte inn for de konstante domenene for et antistoff ifølge oppfinnelsen.
Derved ifølge en annen utførelse blir antistoffet ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200 lignende antistoff, humanisert. "Humaniserte" former for antistoffer ifølge oppfinnelsen er spesifikke kimære immunglobuliner, immunglobulin kjeder eller fragmenter derav (så som Fv, Fab, Fab', F(ab')2, eller andre antigen bindende delsekvenser av antistoffer) som inneholder en minimal sekvens derivert fra muse-immunglobulin. For det meste blir humaniserte antistoffer som er humane-immunglobuliner (motakker antistoff) hvori rester fra en komplementæravgjørende region (CDR) av mottakeren erstattet av rester fra en CDR tilhørende det originale antistoffet (donor antistoff), mens det opprettholder den ønskede spesifisiteten, affiniteten, og kapasiteten til det originale antistoffet. I noen tilfeller kan Fv rammen av rester til det humane immunglobulinet erstattes av de korresponderende ikke-humane restene. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte rester som ikke er funnet i verken mottaker antistoffet eller i den importerte CDR eller rammen til sekvensene. Disse forandringer blir gjort for å videre definere og videre optimalisere antistoff ytelse. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte hovedsakelig alle av minst en, og typisk to variable domener, hvori alle eller så godt som alle CDR regionene korresponderer til de originale antistoffet, og alle eller så godt som alle av FR regionene er de til en human immunglobulin konsensus sekvens. Det humaniserte antistoffet vil valgfritt også omfatte minst en del av en immunglobulin konstant region (FC), som typisk er tilhørende et humant immunglobulin. Forflere detaljer se Jones et al., Nature, 321,pp 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp,323 (1988); og Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2,pp. 593 (1992).
Fremgangsmåter for å humanisere antistoffene ifølge oppfinnelsen er velkjente på fagfeltet. Generelt har et humanisert antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse en eller flere aminsyre rester som er introdusert inn i det fra det originale antistoffet. Disse mus- eller andre ikke-humane aminosyrerester er ofte referert til som "imporf-rester, og er typisk tatt fra et "import" variabelt domene. Humanisering kan hovedsakelig bli utført ved å følge fremgangsmåten til Winter og medhjelpere (Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature 332.pp323 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534(1988)). Derfor er slike "humaniserte" antistoffer kimeriske antistoffer (Cabilly et al., U.S.Pat. No 4,816,567), hvori hovedsakelig mindre enn ett intakt humant variabelt domene er blitt substituert med den korresponderende sekvensen fra det originale antistoffet. I praksis er humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen typisk humane antistoffer hvori noen CDR rester og muligens noen FR rester er substituert med rester fra analoge steder på det originale antistoffet.
Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal brukes i fremstillingen av de humaniserte antistoffene, er veldig viktig for å redusere antigenisiteten. I følge den såkalte "best- fit" fremgangsmåten blir sekvensene til den variable domenet til antistoffet ifølge oppfinnelsen undersøkt opp mot et helt bibliotek av kjente humane variabel domene sekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest den til mus blir så akseptert som den humane rammen (FR) for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol., 151, pp. 2296(1993); Chothia og Lesk, J.Moi.Biol., 196,pp.901 (1987)). En annen fremgangsmåte brukeren spesiell ramme fra konsensus sekvensen til alle humane antistoffer til en bestemt undergruppe av lette eller tunge kjeder. Den samme rammen kan anvendes for mange forskjellige humaniserte antistoffer ( Carter et al., Proe. Nati. Acac. Sei. USA., 89,pp. 4285(1992); Presta et al., J. Immunol., 51,pp. 1993)).
Det er videre viktig at antistoffer blir humaniserte og beholder høy affinitet for flere inhibitoriske KIR-reseptorer og andre foretrukne biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet ifølge en foretrukket fremgangsmåte blir de humaniserte antistoffene preparert i en prosess for analyse av de opprinnelige sekvensene og ulike tiltenkte humaniserte produkter vha tredimensjonale modeller av de opprinnelige og humaniserte sekvenser. Tredimensjonale immunglobulin modeller er vanlig tilgjengelige og er kjente for de med kunnskaper på feltet. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og viser antakelig tredimensjonale formasjonsstrukturer av utvalgte kandidat immunglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse fremvisningene tillater analyse av den sannsynlige rollen til restene i funksjonen til kandidat immunglobulin sekvensen, dvs analyse av rester som har innvirkning på evnen til kandidat immunglobulinet til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR rester velges og kombineres fra konsensusen og importerte sekvenser, slik at de ønskede antistoff karakteristikkene så som økt affinitet for målantigen(r) blir oppnådd. Generelt er CDR restene direkte og mest involvert i å påvirke antigen binding.
En annen fremgangsmåte for å fremstille "humanisert" monoklonale antistoffer er å bruke en XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) som musen brukt for immunisering. En XenoMouse® er en musevert ifølge denne oppfinnelsen som har hatt sine immunglobulin gener erstattet med funksjonelle humane immunglobulin gener. Derfor er antistoffene produsert av denne musen eller i hybridomer laget fra B cellene til denne musen allerede humaniserte. XenoMouse® en er beskrevet i US patent nr 6,162,963, som er heri inkorporert i sin helhet ved referanse. En analog fremgangsmåte kan oppnås ved bruk av HuMab-Mouse™ (Medarex).
Humane antistoffer kan også produseres ifølge en mengde andre teknikker, så som ved bruk av for immunisering andre transgeniske dyr som er fremstilt for å uttrykke et humant antistoff repertoar (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), eller ved valg av antistoff repertoarer som bruker fag-fremvisningsfremgangsmåte. Slike teknikker er kjente for de på feltet og kan implementeres med startpunkt i monoklonale antistoffer som beskrevet i den foreliggende søknaden.
Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200 lignende antistoff, kan også deriveres til "kimeriske" antistoffer (immunglobuliner) hvori en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homologen med de korresponderende sekvensene i det originale antistoffet, mens resten av kjeden(e) er identisk med eller homologe med korresponderende sekvenser i antistoffer derivert fra andre arter eller som tilhører en annen antistoff klasse eller underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer så lenge som de uttrykker den ønskede biologiske aktiviteten ( Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proe Nati. Acad. Sei. USA., 81,pp 6851 (1984)).
Andre derivater innenfor rammen for oppfinnelsen inkluderer funksjonaliserte antistoffer, med andre ord antistoffer som er konjugerte eller kovalent bundet til et toksin, så som ricin, diphteri toksin, abrin og Pseudomonas exotoxin; til en målbar enhet, så som en fluoriserende enhet, en radioisotop eller etfremstillingsmiddel; eller til en fast støtte, så som agarroseperler eller lignende. Fremgangsmåter for konjugering eller kovalent binding av disse andre midlene til antistoffer er velkjente på feltet.
Konjugering til et toksin er anvendbart til målrettet dreping av NK-celler som fremviser en av de kryssreagerende KIR-reseptorene på sin overflate. Når antistoffet ifølge oppfinnelsen binder seg til celleoverflaten til slike celler, blir det internalisert, og toksinet blir frigitt inne i cellen, noe som selektivt dreper den cellen. Slik anvendelse er en alternativ utførelse av den foreliggende oppfinnelsen.
Konjugering til en detekterbar enhet er nytting når antistoffet ifølge oppfinnelsen er brukt for diagnostiske formål. Slike formål inkluderer, men er ikke begrenset til, testing av biologiske prøver for tilstedeværelsen av NK-celler som bærer den kryssreagerende KIR på deres celle overflate, og påvising av tilstedeværelsen av NK-celler som bærer den kryssreaktive KIR i en levende organisme. Slike tester og påvisnings fremgangsmåter er også alternative fremstillinger av den foreliggende oppfinnelsen.
Konjugering av et antistoff ifølge oppfinnelsen til et fast støtte er anvendbar som et verktøy for affinitets rensing av NK-celler som bærer kryssreaktive KIR på deres overflate fra en kilde så som en biologisk væske. Denne fremgangsmåten for rensing er en annen alternativ utførelse av den foreliggende oppfinnelsen, og det er også det resulterende rensede populasjon av NK-celler.
I en alternativ utførelse kan et antistoff som binder en felles determinant tilstedeværende på minst to forskjellige inhiberende KIR-reseptorgenprodukter hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-frembrakt inhibering av NK-celle cytotoksisitet på NK-celler som uttrykker minst en av nevnte to forskjellige humane inhiberende KIR-reseptorer i følge oppfinnelsen inkludert NKVSF1 bli inkorporert inn i liposomer ("immunliposomer"), alene eller sammen med andre substanser for målrettet avlevering til et dyr. Slike andre substanser inkluderer nukleinsyre for avlevering av gener for genterapi, eller for avlevering avantisense RNA, RNAi eller siRNA for undertrykking av et gen i en NK-celle, eller toksiner eller medikamenter for målrettet dreping av NK-celler.
Data modellering av ekstracelledomenene til KIR2DL1, -2 og-3(KIR2DL1-3), basert på deres publiserte krystall strukturer (Maenaka et al. (1999), Fan et al (2001), Boyington et al. (2000)), forutsa involveringen av visse regioner eller KIR2DL1,-2 og -3 i interaksjonen mellom KIR2DL1 og KIR2DL-3 kryssreaktive musemonoklonale antistoffer DF200 og NKVSF1. Derfor frembringer i en utførelse den foreliggende oppfinnelsen antistoffer som bare binder til KIR2DL1 innenfor en region definert av aminosyrerestene(105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). I en annen utførelse av oppfinnelsen frembringes antistoffer som binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 uten interaksjon med andre aminosyre rester utenfor region definert av restene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192).
I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvori R131 er Ala. I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder en mutant av KIR2DL1 hvori R 157 er Ala.
I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvori R158 er Ala. I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DL1 rester (131,157,158).
I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til KIR2DS3(R131 W), men ikke til villtype KIR2DS3.
I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR2DS4.
I en annen utførelse frembringer oppfinnelsen antistoffer som binder til både KIR2DI1 og KIR2DL2/3 men ikke til KIR2DS4.
Bestemmelse av om et antistoff binder innenfor en av epitopområdene definert ovenfor kan utføres på måter som er kjent for personer med kunnskap på feltet. Som ett eksempel på slike kartleggings/karakteriserings fremgangsmåter, kan et epitopområde for et anti KIR-antistoff bestemmes ved epitop "footprinting" ved bruk av kjemisk modifikasjon av de utsatte aminene/ karboksylene på KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 proteinet. Et spesifikt eksempel på en slik "footprinting" teknikk er anvendelse av HXMS (hydrogen deuterium utveksling påvist ved massepektrometri) hvori en hydrogen/deuterium utveksling av reseptor og ligandprotein amidprotoner, binding, og tilbakeveksling foregår, hvori ryggraden av amidgrupper deltar i proteinbinding, og er beskyttet fra tilbakeveksling og derfor vil forbil deutalisert. Relevante regioner kan identifiseres på dette tidspunkt ved peptisk proteolyse, rask mikrobor høyutbytting flytende kromatografiseparering, og/eller elektro-spray ioniseringsmassespektrometri. Se for eksempel Ehring H, Analytical Biochemestery, Vol 267 (2)pp. 252-259 (1999) og/eller Engen, J.R. og Smith D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Et annet eksempel på en passende epitop identifikasjons teknikk er nukleær magnetisk resonans epitopkartlegging (NMR), hvori posisjonen til signalene i todimensjonale NMR spektra til det frie antigenet, og antigenet i et kompleks, med det antigenbindende peptidet, så som et antistoff, blir sammenlignet. Antigenet er vanligvis selektivt isotopisk merket med 15N slik at bare signaler som korresponderer til antigenet og ingen signaler fra det antigenbindende peptidet blir sett på NMR spektrumet. Antigensignaler som kommer fra aminosyrer involvert i interaksjon med det antigenbindende peptidet vil typisk skifte posisjon i spektrene til komplekser når sammenlignet med spektra til frie antigener, og aminsyrene involvert i bindingen kan således identifiseres. Se for eksempel Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44): 149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol 281 (1)pp.61-67 (1998); og Saito og Patterson, Methods. 1996 Jun; 9(3):516-24.
Epitop kartlegging/karakterisering kan også utføres ved bruk av massespektrometri metoder. Se for eksempel Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503 og Kiselar og Downard, Anal Chem. 1999 May 1;71 (9): 1792-801.
Proteaseoppkuttingsteknikker kan også være anvendbare i forhold til epitopkartlegging og identifisering. Antigeniske determinantrelevante regioner/sekvenser kan bestemmes ved proteaseoppkutting, for eksempel ved bruk av trypsin i et forhold på om lag 1:50 til KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 o/n oppkutting ved 37 °C og pH7-8, etterfulgt av massespektrometri (MS) analyse for peptid identifikasjon. Peptidene beskyttet fra trypsinkløyving av anti-KIR-binderen kan påfølgende identifiseres ved sammenligning av prøver utsatt for trypsinoppkutting og prøver inkuberte med antistoff og så utsatt for oppkutting med for eksempel trypsin (og derved vise "footprint" til binderen). Andre enzymer som chymotrypsin, pepsin etc kan også eller alternativt bli anvendt i lignende epitopkarakteriseringsfremgangs-måter. Videre kan enzymatisk digestion gi en rask metode for å analysere om en potensiell antigenisk determinant sekvens er innenfor en region av KIR2DL1, i sammenheng med en anti-KIR-polypeptid som ikke er uttrykt på overflaten og derfor mest sannsynlig ikke relevant når det gjelder immunogenisitet/antigenisitet. Se for eksempel Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991 ;27(1): 15-9 for en diskusjon vedrørende lignende teknikker.
Kryssreaktivitlet med cynomolgusaper-aper
Det har blitt vist at antistoff NKVFS1 også binder NK-celler fra cynomolgusaper-aper, se eks 7. Oppfinnelsen fremlegger derfor et antistoff så vel som fragmenter og derivater derav hvori nevnte antistoffragment eller derivat kryssreagerer med minst to inhiberende humane KIR-reseptorer på overflaten til humane NK-celler, og som videre binder til NK-celler fra cynomulgusapene. I en utførelse er antistoffet ikke antistoffet NKVSF1. Oppfinnelsen frembringer også en fremgangsmåte for å teste hvor toksisk et antistoff er, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff fragment eller derivat kryssreagerer med minst to inhiberende humane KIR-reseptorer på overflaten av humane NK-celler, hvori fremgangsmåten omfatter testing av antistoffet i en cynomolgusape.
Sammensetninger og administrering
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger som omfatter et antistoff så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff fragment eller derivat kryssreagerer med minst to inhiberende KIR-reseptorer på overflaten til NK-celler, nøytraliserer deres inhiberende signaler og potenserer aktiviteten til de cellene, i en hver passende formidler i en mengde som er effektiv i å målbart potensering NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller en biologisk prøve som omfatter NK-celler. Sammensetningen omfatter videre en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike sammensetninger er også referert til som "antistoff komposisjoner i følge oppfinnelsen". I en utførelse omfatter antistoff komposisjonene i følge denne oppfinnelsen et antistoff som fremlagt i antistoff beskrivelsene ovenfor. Antistoffet NKVFS1 er inkludert innenfor rammen av antistoffer som kan være tilstedeværende i antistoff komposisjonene ifølge denne oppfinnelsen. Uttrykket "en biologisk prøve" som brukt heri, inkluderer men er ikke begrenset til, en biologisk væske (for eksempel serum, lymfe, blod), celleprøve eller vevsprøve (for eksempel beinmarg).
Farmasøytisk akseptable bærere som kan brukes i disse sammensetningene inkluderer, men er ikke begrenset til, ion byttere, alumina, aluminiumstearat, lecitin, serum proteiner så som humant serum albumin, buffer substanser så som fosfater, glysin, sorbinsyre, kaliumsorbat, delvis glyserin blandinger av mettede grønnsaks-fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter så som protaminsulfat, dinatriumhydrogen-fosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sink, salter, colloidal silisium, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte substanser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, polyakrylater, vokser, polyetylen-polyoxypropylen-blokkerende polymerer, polyetylenglykol og ullfett.
Sammensetningene i følge oppfinnelsen kan brukes i en fremgangsmåte for å potensere aktiviteten til NK-celler i en pasient eller en biologisk prøve. Denne fremgangsmåten omfatter trinnene av å bringe i kontakt nevnte sammensetning med nevnte pasient eller biologiske prøve. En slik framgangsmåte vil være anvendbar for både diagnostiske og terapeutiske anvendelser.
For bruk i sammen med en biologisk prøve kan antistoff sammensetningen administreres ved å rett og slett blande med eller påføre direkte til prøven, avhengig av hva slags prøve det gjelder (væske eller fast stoff). Den biologiske prøven kan komme direkte i kontakt med antistoffet i et hvert passende anordning (fat, lomme, flaske osv). For bruk i sammen men med en pasient må sammensetningen være formulert for administrasjon til pasienten.
Sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres oralt, parentalt, ved inhalasjon spray, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Uttrykket "parentalt" som brukt heri inkluderer subkutanøs, inntrevenøst, intramuskulært, intrartikulært, intrasynovialt, intrasternalt, intrathekalt, intrahepatisk, intralesionalt og intrakranial injeksjon eller infusjonsteknikker. Fortrinnsvis blir sammensetningene administrert oralt, intraperitonalt eller intravenøst. Sterile injeksjonsformer av sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være vannløselig eller en oljeholdig suspensjon. Disse suspensjonene kan formuleres ifølge teknikker velkjente på feltet, ved bruk av passende dispergerings eller fuktingsmidler og suspensjonsmidler. Den sterile injiserbare preparatet kan også være en steril injiserbar oppløsning eller suspensjon i en ikke-toksisk parenteral akseptabel tynner eller oppløsningsmiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant akseptable bærere og oppløsningsmiddel som kan bli brukt er vann, Ringens løsning, og isotonisk natriumklorid oppløsning. I tillegg blir sterile fikserte oljer vanlig brukt som oppløsningsmiddel eller som suspensjonsmidler. Til dette formål kan enhver vanlig fiksert olje brukes, inkludert syntetiske mono- eller di-glyserider. Fettsyrer så som olesyre og dets glyserid derivater er nyttige i fremstillingen av injiserbare midler, og det er også naturlige farmasøytisk akseptable oljer så som olivenolje eller lakseolje, spesielt i deres fleroksylerte versjoner. Disse oljeoppløsningene eller suspensjonene kan også inneholde langkjedede alkohol-utblandede eller disperganter så som karboksymetylcellulose eller lignende dispersjonsmidler som er i vanlig bruk i formuleringen i farmasøytisk akseptable doseringsformer, inkludert emulsjoner og suspensjoner. Andre vanlig brukte surfaktanter så som Tweens, Spans og andre emulsjons midler eller bio-tigjengelighetsøkere som er vanlig i bruk i fremstillingen av farmasøytisk akseptable faste, væske eller andre doseringsformer kan også anvendes for formuleringsformål.
Sammensetningene i følge oppfinnelsen kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doserings form, inkludert med ikke begrenset til, kapsler, tabletter, væskesuspensjoner eller oppløsninger. I tilfelle av tabletter for oral bruk blir bærere av vanlig brukt inkludert laktose og maisstivelse. Smøremidler så som magnesium-stereat er også typisk tilsatt. For oral administrering i kapselformat inkluderer nyttige utblandingsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når væskesuspensjoner er krevd for oral bruk, blir den aktive ingrediensen kombinert med emulsjons og suspensjons midler. Dersom ønsket kan visse søtningsstoffer, smakstilsetninger eller fargemidler også tilsettes.
Alternativt kan sammensetningene ifølge oppfinnelsen også administreres i form av stikkpiller for rektal administrering. Disse kan fremstilles ved at blanding av middelet med en passende ikke irriterende eksipient som er fast ved romtemperatur men væske ved rektal temperatur, og derfor vil smelte i rektum og avgi medikamentet. Slike materialer inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylen glykol.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk, spesielt når målet for behandling inkluderer områder eller organer som er lett tilgjengelige ved topisk påføring, inkludert sykdommer i øyet, huden eller den nedre tarmsystem. Passende topiske formuleringer er lett preparert for hver av disse områdene eller organene.
Topisk påføring for det nedre tarmsystem kan gjennomføres i en rektal stikkpille-formulering (se ovenfor) eller en passende klysterformulering. Topisk gjennom-trengende plaster kan også anvendes.
For topiske påføringer kan sammensetningene formuleres til en passende salve inneholdende de aktive komponentene suspendert eller oppløst i en eller flere bærere. Bærer for topisk påføring av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, inkluderer men er ikke begrenset til, mineral olje, væske petrolatum, hvitt petrolatum, propylenglykol, polyoksetylen, polyokspropylen forbindelse, emulsifiserende voks og vann. Alternativt kan sammensetningene formuleres i en passende lotion eller krem inneholdende de aktive komponentene suspendert eller oppløst i en eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Slike bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitanmonosterarat, polysorbate 60, cetylester vokser, setearylalkohol, 2-octyldodecanol, benzylalkohol og vann.
For optimal bruk kan sammensetningene formuleres som mikrofremstilte suspensjoner i isotonisk pH justert sterilt salt vann, eller fortrinnsvis som oppløsninger i en isotonisk pH regulert sterilt saltoppløsning, enten med eller uten et holdbarhets-middel så som benzylbenkonium klorid. Alternativt kan sammensetningene for optalmiske bruksområder formuleres i en salve så som petrolatum.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved en nasal
aerosol eller inhalering. Slike sammensetninger er fremstilt ifølge teknikker velkjente på feltet for farmasøytisk formulering og kan fremstilles som oppløsninger i salt vann, ved bruk av benzylalkohol eller andre passende konserveringsmidler, absorberings-fremmere for å øke biotilgjengeligheten, fluorkarboner, og/eller andre vanlige oppløsnings eller dispergeringsmidler.
Flere monoklonale antistoffer har blitt vist å være effektive i kliniske situasjoner så som Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) eller Xolair (Omalizumab), og lignende administrerings regimer (for eksempel formuleringer og/eller doseringer og/eller administrerings protokoller) kan anvendes med antistoffene ifølge denne oppfinnelsen. Tidsplaner og doseringer for administrering av antistoffet i de farmasøytiske komposisjonene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bestemmes i tråd med kjente framgangsmåter for disse produktene, for eksempel ved bruk av produsentens instruksjoner. For eksempel kan et antistoff tilstedeværende i en farmasøytisk komposisjon ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli gitt ved en konsentrasjon på 10mg/ml i enten 100mg (10ml) eller 500mg (50ml) små medisin-flasker for engangsbruksvialer. Produktet er formulert for intravenøs administrering i 90,mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumcitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og sterilt vann for injeksjon. PH'en er justert til 6,5. En eksempelvis passende doseringsområde for et antistoff i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen kan være mellom om lag 10mg/m<2>og 500mg/m<2>. Men selv om det vil bli satt pris på at disse tidsplanene er eksempler og at en optimal tidsplan og regime kan tilpasses når en tar hensyn til affiniteten og toleransen til det særskilte antistoffet i den farmasøytiske sammensetningen som må bli fastsatt i kliniske prøver. Mengder og tidsplaner for injeksjon av et antistoff i en farmasøytisk komposisjon i følge oppfinnelsen som saturerer NK-celler i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller en uke eller en måned kan bestemmes når en tar hensyn til affiniteten til antistoffet og dets farmakokinetiske parametere.
Ifølge en annen utførelse kan antistoff sammensetningene ifølge oppfinnelsen også videre omfatte et annet terapeutisk middel inkludert midler som normalt er brukt for bestemte terapeutiske formål hvori antistoffet blir administrert. Det ekstra terapeutiske middelet vil normalt være tilstedeværende i sammensetningen i mengder som typisk er brukt for det middelet i monoterapi for den bestemte sykdommen eller tilstanden som behandles. Slike terapeutiske midler inkluderer men er ikke begrenset til terapeutiske midler anvendt i behandling av kreft typer, terapeutiske midler brukt for å behandle infeksjonssykdommer, terapeutiske midler brukt i andre immunterapier, cytokiner (så som IL-2 eller IL-15), andre antistoffer og fragmenter av andre antistoffer.
Det er for eksempel tilgjengelig et antall terapeutiske midler for behandling av ulike krefttyper. Antistoff sammensetningene og metodene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan kombineres med andre fremgangsmåter generelt brukt i behandling av den bestemte sykdommen, særdeles en tumor, kreftsykdom, eller andre sykdommer eller tilstander som pasienten har. Så lenge den bestemte terapeutiske tilnærmingsmåten ikke er kjent for å være skadelig for pasientens tilstand i seg selv og ikke betydelig motvirker aktiviteten til antistoffet i en farmasøytisk sammensetning i følge oppfinnelsen kan man forestille seg kombinasjonen derav med den foreliggende oppfinnelsen.
I forbindelse med behandling av faste tumorer kan de farmasøytiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli brukt i kombinasjon med klassiske behandlingsmåter så som operasjoner, radioterapi, kjemoterapi, og lignende. Oppfinnelsen frembringer derfor kombinerte terapier hvori en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen er brukt på samme tid som, før, eller etter operasjon eller strålebehandling: eller er administrert til pasienter med, før, eller etter kjente kjemoterapeutiske, radioterapeutiske eller antiangiogeniske midler, eller målrettet immuntoksiner eller koagulisjonsligander.
Når en eller flere midler er brukt i kombinasjon med et antistoff inneholdende sammensetning ifølge oppfinnelsen i et terapeutisk regime, er det ikke bruk for at de kombinerte resultatene skal være additive i forhold til aspektene som blir observert når hver behandlingsmåte er uført separat. Selv om man vanligvis ønsker å oppnå i det minste en additiv effekt vil enhver økt antikreft effekt ovenfor en av terapiene på egenhånd være nyttig. Det er også ingen særdeles krav for at det kombinerte behandlingen skal utvise synergistiske effekter, selv om dette selvsagt er mulig og fordelaktig.
For å utføre kombinert antikreftterapi kan man rett og slett administrer til et dyr en antistoffsammensetning i følge oppfinnelsen i kombinasjon med et annet antikreftmiddel på et vis som er effektivt for å resultere i deres kombinerte antikreftvirkninger i dyret. Midlene ville derfor tilveiebringes i mengder som er effektive og tidsrom som er effektive i å resultere i deres kombinerte tilstedeværelse inne i blodsystemet til tumoren og deres kombinerte virkning i tumormiljøet. For å nå dette målet kan en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen og antikreftmidler administreres til et dyr samtidig, enten i en enslig kombinert sammensetning eller som to forskjellige komposisjoner ved bruk av forskjellige administreringsmåter.
Alternativt kan administreringen av en antistoffsammensetning i følge oppfinnelsen komme før eller etterpå antikreftmiddel behandlingen ved for eksempel intervaller på fra minutter til uker og måneder. Man ville forsikre seg om at antikreftmiddelet og et antistoff i antistoffsammensetningen i følge oppfinnelsen viser en fordelaktig kombinert effekt på kreften.
De fleste antikreftmidlene ville bli gitt før en inhiberende KIR-antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen i anti-angiogenisk terapi. Men når immunkonjungater av et antistoff er brukt i antistoff komposisjonen ifølge oppfinnelsen, kan forskjellige antikreft midler administreres samtidig eller i rekkefølge.
I noen situasjoner kan det være ønskelig å forlenge tidsrommet for behandling betraktelig, hvor flere dager (2,3,4,5,6 eller 7), flere uker (1,2,3,4,5,6,7eller 8) eller til og med flere måneder (1,2,3,4,5,6,7 eller 8) går mellom henholdsvis administreringen av antikreftmiddelet eller antikreftbehandlingen og administreringen av antistoffsammensetningen ifølge oppfinnelsen. Dette vil være fordelaktig under forhold hvor antikreftbehandlingen var påtenkt å vesentlig ødelegge tumoren, så som operasjon eller kjemoterapi, og administrering av en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen var tiltenkt å forebygge mikrometastaser eller gjenvekst av tumoren.
Det er også tiltenkt at flere enn en administrering av enten en inhiberende KIR-antistoff basert sammensetning i følge oppfinnelsen eller antikreftmiddelet vil bli brukt. Disse midlene kan administreres om hverandre, på alternative dager eller uker; eller som en behandlingssyklus med en inhiberende KIR-antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen, etterfulgt av en syklus av antikreft middelterapi. I alle tilfelle, for å oppnå tumor minskning ved bruk av kombinert terapi, er alt som behøves å avlevere begge midlene i en kombinert mengde som er effektiv for å utøve antitumor effekt, uavhengig av tidspunktene for administrering.
Når det gjelder operasjoner kan enhver operasjonsform brukes i kombinasjon med den foreliggende oppfinnelsen. I forbindelse med radioterapi tenker man seg at enhver mekanisme for indusering av DNA skade lokalt inne i kreftcellene kan brukes, så som gammabestråling, røntgen, UV bestråling, mikrobølger og til og med elektronisk utstråling og lignende. En målrettet leveranse av radioisotoper til kreftceller er også tiltenkt, og dette kan bli brukt i forbindelse med en målrettet antistoff eller andre målretningsmetoder.
I andre utførelser kan immunmodulerende forbindelser eller regimer administreres i kombinasjon med eller som del av antistoff komposisjonene i følge den foreliggende oppfinnelsen. Foretrukne eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer cytokiner. Mange cytokiner kan bli brukt i slike kombinerte behandlingsmetoder. Eksempler på cytokiner som er nyttige i kombinasjonene tiltenkt denne oppfinnelsen inkluderer IL-alfalL-beta. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TFG- beta, GM-CFS, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG,MP,LIF, OSM, TMF,PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN- gamma. Cytokiner brukt i kombinasjons behandlingen eller sammensetninger ifølge oppfinnelsen blir administrert standard regimer, i overensstemmelse med kliniske indikasjoner så som tilstanden til pasienten og den relative toksisiteten til cytokinet.
I visse utførelser kan de kryssreagerende KIR-antistoff omfattende terapeutiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres i kombinasjon med eller kan videre omfatte et kjemoterapeutisk eller hormonterapi terapeutisk middel. En mengde hormonterapi og kjemoterapeutiske midler kan bli brukt i den kombinerte behandlingsmetodene som fremlagt heri. Kjemoterapeutiske midler tiltenkt som eksempler inkluderer men er ikke begrenset ti alkylerende midler, anti metabolitter, cytotoksiske antibiotika, vinka alkaloider som for eksempel adriamycin, dactinomycin, mitomycin, carminomycin, daunomycin, doxorubicin, tamoxifen, taxol, taxoter, vincristin,vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-fluorouracil (5FU), cytosin arabinosid, syklopfsfamid, thiotepa, metotrexat, camptothecin, actinomycin-D, mitomycin-C, cisplatin (CDDP), aminopterin, combretastatin(s) og derivater og prodrug derav.
Hormonelle midler inkluderer, men er ikke begrenset til LHRH agonister så som leuprorelin, goserelin, triptorelin og buserelin, anti- estogen så som tamoxifen og toremifen; anti-androgens så som flutamid, nilutamid, cyproteron og bicalutamid; aromatase inhibitors så som anastrozol, exemestan, letrozol og fadrozol; og progetagener så som medroksy, klolrmadinon og megestrol.
Som det vil bli forstått av de med vanlige ferdigheter på feltet vil de passende doseringene av kjemoterapeutiske midler være lignende de som allerede blir brukt i klinisk terapi hvori de kjemoterapeutiske midlene blir administrert alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapier. Bare som et eksempel kan midler så som cisplatin og andre DNA alkylerende midler anvendes. Cisplatin er blitt vidt brukt for å behandle kreft, med virkningsfulle doseringer brukt i kliniske sammenhenger på 20mg/m<2>i 5 dager hver 3. uke totalt 3 ganger. Cisplatin er ikke absorbert oralt og må derfor avleveres via injeksjon intravenøst, subkutanøst, inn i tumoren eller intraperitonalt.
Andre anvendbare kjemoterapeutiske midler inkluderer forbindelser som forstyrrer DNA replikasjon, mitose og kromosomal segregering, og midler som forstyrrer syntese og nøyaktighet av polynukleotid forgjengere. Et antall eksempler på kjemoterapeutiske midler for kombinert terapi er opplistet i tabell C av US Patent 6,524,583 og disse midlene og indikasjonene er spesifikt inkorporert heri ved referanse dertil. Hver av midlene opplistet er et eksempel og ikke begrensende. Fagfolk henvises til "Remington's Pharmasutical Sciences" 15th Edition, kapittel 33, spesielt sidene 624-652. Variasjon av doseringer vil sannsynligvis foreligge avhengig av tilstanden som behandles. Doktoren som administrerer behandlingen vil være i stand til å bestemme den passende doseringen for det individuelle subjektet.
De foreliggende kryssreagerende inhiberende KlR-antistoff sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjon med enhver eller flere andre antiangiogeniske terapier, eller kan videre omfatte antiangiogeniske midler. Eksempler på slike midler inkluderer nøytraliserende antistoffer, antisense RNA, SiRNA, RNAi, RNA aptamerer og ribosymer som hver er rettet mot VEGF eller VEGF reseptorer ( US patent nr. 6,524,583, som er inkorporert heri ved referanse dertil). Variasjoner på VEGF med antagonistiske egenskaper kan også brukes som beskrevet i W098/16551, som er inkorporert heri ved referanse dertil. Videre eksempler på antiangiogeniske midler som er brukbare i forbindelse med kombinert terapi er opplistet i tabell D i US patent nr. 6,524,583, virkemidler og indikasjoner er spesifikt inkorporert heri ved referanse dertil.
De inhiberende Kl R-antistoff sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også til fordel brukes i kombinasjon med fremgangsmåter for å indusere apoptose, eller kan omfatte apoptopiske midler. For eksempel har et antall onkogener blitt identifisert som inhiberer apoptose, eller programmert celledød. Eksempler på onkogener i denne kategorien inkluderer, men er ikke begrenset til, bcr-abl, bcl-2( ikke det samme som bcl-1, cyclinD1;GenBank nrM14745, X06487; US 'Pat nr 5,650,491 og 5,539,094; som hver inkorporert heri ved referanse), og familie medlemmer inkludert Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1 og A20. Over-ekspresjon av bcl-2 ble først oppdaget i T-celle lymfomer. Onkogen bcl-2 fungerer ved å binde og inaktivere Bax, et protein i den apoptopiske kaskaden. Inhibering av bcl-2 funksjon hindrer inaktivering av Bax og lar apoptosen fortsette. Inhibering av denne klassen av onkogener, dvs. bruk av antisense nukleotidsekvenser, RNAi, siRNA eller små molekyl kjemiske forbindelser, er tiltenkt for bruk i følge den foreliggende oppfinnelsen for å øke apoptose (US Pat nr 5,650,491; 5,539,094 og 5,583,034, som hver er inkorporert heri ved referanse).
Den inhiberende KIR-antistoff sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan også omfatte eller bli brukt i kombinasjon med molekyler som omfatter en målrettet del, for eksempel antistoff, ligand, eller konjungater derav, rettet mot en spesifikk markør i en målcelle ("målrettet middel"), for eksempel en måltumorcelle. Generelt vil målrettede midler for bruk i disse tilleggsaspektene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis gjenkjenne tilgjengelige tumor antigener som er foretrukket eller spesifikt uttrykt på tumorplassen. De målrettede midlene vil generelt binde til en overflate uttrykt, overflate tilgengelig eller overflate lokalisert komponent av tumorcellen. De målrettede midlene vil også fortrinnsvis vise egenskaper som høy affinitet: og vil ikke utvise signifikante in vivo bi-effekter mot livsnødvendige normale vever, så som en eller flere vevstyper valgt fra hjerte, nyre, hjerne, lever, beinmarg, endetarm, bryst, prostata, skjold brusk, galleblære, lunge, adrenaler, muskel, nervefiber, bukspyttkjertel, hud eller andre livsnødvendige organer eller vevstyper i den menneskelige kropp. Uttrykket "ikke føre til signifikante bi-effekter" som brukt heri refererer til at et målrettet middel, når administrert in vivo, vil føre til bare ubetydelig eller klinisk håndterbare bi-effekter, så som de normalt støtt på i løpet av kjemoterapi.
I behandlingen av tumorer kan antistoff sammensetningen i følge oppfinnelsen i tillegg omfatte eller kan bli brukt i kombinasjon med hjelpe forbindelser. Hjelpeforbindelser kan inkludere for eksempel antibrekningsmiddelet så som serotonin antagonister og terapier så som fenotiaziner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyrofenoner, corticosteorider, benzodiazepiner og cannabinoider; bisfonater så som zoledronsyre og pamidronsyrer, og hematopiske vekst faktorer så som erythropoietin og G-Cfer, for eksempel filgrastim, lenograstim og darbepoietin.
I en annen utførelse kan to eller flere antistoffer ifølge oppfinnesen som har for-skjelllige kryssreaksjoner, inkludert NKVSF1 kombineres i en eneste sammensetning for å nøytralisere de inhiberende effektene av så mange inhiberende KIR-genprodukter som mulig. Sammensetninger omfattende kombinasjoner av kryssreaktive inhiberende KIR-antistoffer ifølge oppfinnelsen eller fragmenter eller derivater derav vil tillate en enda videre bruk fordi det sannsynligvis eksisterer en liten andel av den humane populasjonen som mangler hvert av de inhiberende KIR-genproduktene gjenkjent av et kryssreagerende antistoff. På lignende vis kan en antistoff sammensetning ifølge oppfinnelsen videre omfatte en eller flere antistoffer som gjenkjenner enslige inhiberende KIR-undertyper. Slike kombinasjoner kan igjen føre til en bredere bruk i en terapeutisk sammenheng.
Oppfinnelsen bidrar også med en fremgangsmåte for å potensiere NK-celle aktivitet i en pasient som trenger det, omfattende et trinn for administrering av sammen setningen i følge oppfinnelsen til nevnte pasient. Fremgangsmåten er mer spesifikt rettet mot å øke NK-celleaktivitet i pasienter som har en sykdom hvori økt NK-celle aktivitet er ønsket, som involverer, påvirker eller er forårsaket av celler som er ømfintlige til lysering av NK-celler eller som er forårsaket eller erkarakterisert vedutilstrekkelig NK-celle aktivitet, så som en kreft, en annen proliferativ tilstand, en infeksjonssykdom eller en immuntilstand. Mer spesifikt blir fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen brukt i behandling av en mengde kreft typer og andre proliferative sykdommer inkludert men ikke begrenset til karsinom inkludert karsinom i blære, bryst, endetarm, nyre, lever, lunge, ovaria, prostata, bukspyttkjertel, mage, livmorshals, skjoldbruskkjertel og hud inkludert squamoscellesarkom, hematopiske tumorer av lymfe opprinnelse, inkludert leukemi, akutt lymfatisk leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi, B-celle lymfomi, T-celle lymfomi, Hodgkins lymfomi, ikke - Hodgkins lymfomi, hårcelle lymfomi og Burketts lymfomi; hematopiske tumorer av myloid opprinnelse, inkludert akutt og kronisk myologeniske leukemier og promyelotiske leukemier; tumorer av mesenchumal opprinnelse, inkludert fibrosarkom og rhabdomykosarkom; andre tumorer inkludert melanomi, seminom, teratocarkom, neurablatom og glikom; tumorer i det sentrale og perifirale nervesystemet, inkludert astrosytom, neuroblastom, glioma, og schwannomer; tumorer av mesenkymal opprinnelse, inkludert fibrosarkom, rhabdommyosarkom, og osteosarkom; og andre tumorer inkludert melanoma, eroderma pigmentosum, keratoachantom, seminom, follikulær kreft i bukspyttkjertelen og teratokarsinom.
Foretrukne tilstander som kan bli behandlet ifølge oppfinnelsen inkluderer hematopoetiske tumorer av lymfe opprinnelse for eksempel T-celle og B-celle tumorer, inkludert men ikke begrenset til T-celle tilstander så som T-prolymfocyttisk leukemi (T-PLL), inkludert småcelle og cerebriform celletyper; stor granulær lymfosytt leukemi (LGL) fortrinnsvis av T-celle typen ; Sezary syndrom (SS); voksen type T-celle leukemi lymfom (ATLL); a/d T-NHL hepatisk lymfomi; periferal / etter tymisk T-celle lymfomi (pleomorfisk og immunblastiske undertyper); angio immunoblastisk T-celle lymfomi; angiosentrisk (nasal) T-celle lymfomi; anaplastisk (Ki 1+) stor celle lymfomi; tarm T-celle lymfomi; T-lymfoblastik; og lymfomi/leukemi (T-Lbly/T-ALL).
Andre proliferative forstyrrelser kan også bli behandlet ifølge oppfinnelsen, inkludert for eksempel hyperplasier, fibrose (spesielt pulmonar, men også andre typer fibrose så som renal fibrose), angiogenese, psoriasis, arteriosklerose og glatt muskel prolierering i blodkar, så som stenose eller restenose etterfølgende angioplasti. Den kryssreagerende inhiberende KIR-antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for å behandle eller forebygge infeksjonssykdommer inkludert fortrinnsvis enhver infeksjon forårsaket av vimser, bakterier, proteozoer, muggsopp eller sopp. Slike virus infeksjonsorganismer inkluderer men er ikke begrenset til hepatitt type A, hepatitt type B, hepatitt type C, influensa, varicella, adenovirus, herpes simplex type 1 (HSV-1), herpes simplex type2 (HSV-2), rinderpest, rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papilloma virus, papilloma virus, cytomegalovirus, echinovirus, arbovirus, huntavirus, coxsacki virus, kusma virus, meslingvirus, røde hunder virus, polio virus, og HIV type 1 eller type2.
Bakterie infeksjoner som kan bli behandlet ifølge oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til infeksjoner forårsaket av de følgende: staffelikokker, staffelikokker inkludert S.Pyogener; Enterococcol; Bacillius, inkludert Bacillius anthracits, og Lactobacillus; Listeria; Corynebakerie difteri; Gardnerella inkludert G. Vaginalis; Nocardia; Streptomyces, Thermaoctinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas inkludert Raeruginosa; Legionella; Neisseria inkludert N. Gonorrhoeae og N. Meningitides; Flavobacterium inkludert F. Meningosepticum og F. Odoraturn; Brucella; Bordetella inkludert B pertussis og B. Bronchiseptica; Escherichia inkludert E.coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia inkludert S. Marcenscens og S. Liquefaciens;Edwardsiella; Proteus inkludert P. Mirabilis og P. Vulgaris; Streptovacillus;Rickettsiaceaea inkludert R. Fickettsfi, kalmydia inkludert C. Psittaci og C. Trachornatis; Mycobakterie inkludert M tuberkolose, M. Intracellular, M. Folluiturn, M. Laprae, M. Avium, M bovis, M africanum, M kanasii, M intracellulare og M lapraernurinum ; og Nocardia.
Protozo infeksjoner som kan behandles ifølge oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til infeksjoner forårsaket av leishmania, kokzidioa, og trypanosoma. En komplett liste av infeksjonssykdommer kan finnes på Internett siden til National Center for Infectious Disease (NCID) at the center for Disease Control (CDC) jhttp:// www. cdc. gov/ ncidod/ diseases/ l som er inkorporert heri ved referanse. Alle av de nevnte sykdommene er kandidater for behandling ved bruk av kryssreagerende inhiberende KIR-antistoffer ifølge oppfinnelsen. Slike fremgangsmåter for behandling av ulike infeksjonssykdommer kan bruke antistoff sammensetningen ifølge oppfinnelsen enten alene eller i kombinasjon av andre behandlinger og/eller terapeutiske midler kjent for behandling av slike sykdommer, inkludert antivirus midler, anti sopp midler, antibakterielle midler, antibiotika, antiparasitt midler og antiprotosoale midler. Når disse fremgangsmåtene medfører tilleggs behandlinger med ytterligere terapeutiske midler, kan midlene administreres sammen med antistoffene ifølge oppfinnelsen som enten en enslig dose eller separate, flertallige doseringsformer. Når administrert som en separat doseringsform, kan tilleggs middelet administreres før, samtidig med eller etter administrasjon av antistoffet ifølge oppfinnelsen.
Ytterligere aspekter og fordeler av den foreliggende oppfinnelsen vil vises i den følgende eksperimentelle delen, som bør bli sett på som illustrativ og ikke begrensende av omfanget av denne søknaden.
Eksempler.
Eksempel 1.
Rensing av PBLer og fremstiling av pol<y>klonale eller klonale NK- celle linjer.
PBLer ble fremskaffet fra sunne donorer av Ficoll Hypaque gradienter og utarming av celler som festet seg til plastikk. For å fremskaffe forbedrede NK-celler ble PBLene dyrket med anti CD3, anti CD4 og anti HLA-DR mAb'er (30minutter ved 4 °C), etterfulgt av geite antimus magnetiske perler (Dynal) (30 minutter ved 4 °C) og immunmagnetisk utvelging ved metoder kjent på feltet (Pende et al 1999). CD3", CD4", DR " celler ble dyrket på bestrålte mateceller og 100U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1,5 ng/ml Phytohemagglutinin A (Gibco BLR) for å oppnå polykloniske NK-cellepopulasjoner. NK-celler ble klonet ved begrenset utblanding og kloner av NK-celler blekarakterisert vedgjennomstrømnings cytometri for uttrykking av celle overflate reseptorer.
MAbs'ene anvendt var JT3A (lgG2a, anti CD3), EB6 og GL 183 (lgG1 anti KIR2DL1 og KIR2DL3 respektivt), XA-141 IgM (anti KIR2DL1 med den samme spesifisiteten som EB6), anti CD4 (HP2.6), og anti DR(d1.12, lgG2a). Istedenfor JT3A, HP2.6 og DR 1.12, som ble produsert av søkerne, kan kommersielt tilgjengelige mAbs'er med de samme spesifikasjonene anvendes (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). EB6 og GL183 er kommersielt tilgjengelig via (Becman Coulter Inc, Fullerton, CA. XA-141 er ikke kommersielt tilgjengelig, men EB6 kan brukes for kontroll rekonstituering av lysering som beskrevet i (Moretta et al 1993).
Celler ble farget med passende antistoffer (30 minutter ved 4 °C) etterfulgt av PE eller FITC konjugerte polyklonalske antimusantistoffer ( Southern Biotechnology
Associates Inc). Prøvene ble analysert ved cytofluormetrisk analyse på en FACSAN apparat (Becton Dickinson, Mountain View, CA9.
De følgende klonene ble brukt i denne studien. CP11, CN505 er KIR2DL1 positive kloner og er farget med EB6((lgG1 anti KIR2DL1) eller XA-141 (IgM anti KIR2DL1 med samme spesifisiteten som sammenlignet med EB6 antistoffer). CN12 og CP502 erl KIR2DL3 positive kloner og er farget med GL183 antistoff (lgG1 anti KIR2DL3).
Den cytotoksiske aktiviteten til NK kloner ble bestemt ved en standard 4 timers exp51 Cr frigjørings test hvori påvirkende NK-celler ble testet på Cw3 eller Cw4 positive cellelinjer kjent for deres sensitivitet til NK-celle lysering. Alle målene ble brukt ved 5000 celler pr brønn i en mikrotitrerings plate og forholdet mellom påvirkeren og målet er indikert i figurene (vanligvis 4 påvirkere pr målcelle). Det cytotoksiske testen ble utført med eller uten supernatantene til de indikerte monoklonale antistoffene 1/4 utblandet. Prosedyren var hovedsakelig som beskrevet i (Moretta et al 1993).
Eksempel 2.
Produksjon av nye mAbs.
mAbs'er ble fremstilt ved immunisering av 5 ukers gamle Balb C mus med aktivert polykloniske eller monokloniske NK-cellelinjer som beskrevet i (Moretta et al 1990). Etter forskjellige celle fusjoner ble mAbs'er først utvalgt for deres evne til å kryssreagere med EB6 og GL183 positive NK-cellelinjer og kloner. Positive monoklonale antistoffer ble videre testet for deres evne til å rekonstituere henholdsvis lysering av EB6 positive eller GL183 positive NK-celle kloner av Cw4 eller Cw3 positive mål.
Celle farging ble utført som følger. Cellene ble farget med et panel av antistoffer (1 ug/ml eller 50uJ supernatant, 30 minutter ved 4 °C), etterfulgt av PE konjugert geite F(ab')2 fragment antihumant lgG(H+L) eller PE konjugert geite F(ab')2 fragment anti-human IgG (Fc gamma) antistoffer (Beckman Coulter). Cytofluorometrisk analyse ble utført på en Epics XL.MCL apparat (Beckman Coulter).
Et av de monoklonale antistoffene, DF200 mAb'et, viste seg å reagere med ulike medlemmer av KIR-familien inkludert KIR2DL1, KIR2DL2/3. Begge KIR2DL1+ og KIR2DL2/3 ble farget skarpt med DF200mAb (figur 1).
NK kloner som uttrykker en eller annen (eller til og med begge) av disse HLA-klasse 1 spesifikke inhiberende reseptorene, ble anvendt som påvirkningsceller mot målceller som uttrykker en eller flere HLA-C alleler. Cytotoksisitet tester ble utført som følger. Den cytotoksiske aktiviteten av YTS-KIR2DL1 eller YTS-Eco celler linjer ble bestemt med en standard 4 timers 51 Cr frigivelses test. Påvirkningscellene ble utprøvd på HLA-Cw4 positive eller negative EBV celle linjer, og HLA-Cw4 transfektert 721.221 celler. Alle målene ble brukt ved 3000 pr brønn i mikrotitrerings-plater. Forholdet mellom påvirker og mål er indikert på figurene. Den cytotoksiske testen ble utført med eller uten det indikerte fullstendig lengde eller F(ab')2 fragmentene av monoklonalt muse eller humane antistoffer. Som forutsett viste KIR2DL1+NK kloner lite eller ingen cytotoksitetsaktivitet mot målceller som uttrykte HLA-Cw4 og KIR2DL3+NK kloner viste liten eller ingen aktivitet på Cw3 positive mål. Men i nærvær av DF200mAb (brukt for å skjule deres KIR2DI reseptorer) ble NK klonene ute av stand til å gjenkjenne deres HLA-C ligander og viste en sterk cytotoksisk aktivitet på Cw3 eller Cw4 mål.
For eksempel C1R celle linje (CW4+EBV celle linje, ATCCn°CRL 1993)ble ikke drept av KIR2DL1+NK kloner (CN5/CN505) men inhiberingen kunne effektivt reverseres ved bruk av enten DF200 eller en konvensjonell anti KIR2DL1mAb. På den andre siden drepte NK kloner som uttrykker KIR2DL2/3+KIR2DL1- fenotype (CN12) effektivt C1R celler og denne drepingen var ikke påvirket av DF200mAb (figur 2). Lignende resultater ble oppnådd med KIR2DL2- eller KIR2DL3- positive NK-celler på Cw3 positive mål.
På lignende vis ble Cw4+221EBV cellelinjen ikke drept av KIR2DL1+ transfekterte NK-celler, men inhiberingen kunne bli effektivt reversert ved bruk av enten DF200, et DF200Fab fragment eller konvensjonell anti KIR2DL1 mAb EB6 eller XA141. En Cw3+ 221 EBV celle linje ble også ikke drept av KIR2DL2+Nkceller, men denne inhiberingen kunne reverseres ved bruk av enten DF200 eller et DF200Fab fragment. Og til slutt ble den senere Cw3+221 EBV cellelinjen ikke drept av KIR2DL3+Nkceller, men denne inhiberingen kunne reverseres ved bruk av enten DF200 Fab fragmenter eller en konvensjonell anti KIR2DL3mAb GL183 eller Y249. Resultatene er vist i figur 3.
F(ab')2 fragmenter ble også testet for deres evne til å gjenskape lysering av Cw4 positive mål. F(ab')2 fragmenter av DF200 og EB6Abs ble begge i stand til å reversere inhibering av lysering av KIR2DL1 transfekterte NK-celler til den Cw4 transfekterte 221 cellelinjen og Cw4+ TUBO EBV celle linjen. Resultatene er vist i figur 4.
Eksempel 4
Fremstilling av nye humane mAbs' er
Humane monoklonale anti KIRAbs'er ble fremstilt ved immunisering av transgeniske mus konstruert for å uttrykke et humant antistoff repertoar med rekombinant KIR-protein. Etter forskjellige cellefunksjoner ble mAbs'ene først valgt for deres evne til å kryssreagere med immobiliserte KIR2DL og KIR2DL2 protein. Flere monoklonale antistoffer inkludert 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 ble vist å reagere med KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Positive monoklonale antistoffer ble videre utprøvd for deres evne til å rekonstituere lysering av EB6 positive NK transfektanter som uttrykker KIR2DL1 på Cw4 positive målceller. NK-cellene som uttrykker HLA klasse 1 spesifikke inhiberende reseptorer ble brukt som påvirkningsceller mot målceller som uttrykker en eller flere HLA-C alleler (figurene 5 og 6). Cytotoksisitetstester ble utført som beskrevet ovenfor. Forholdet mellom påvirker og mål er indikert i figurene og antistoffene ble brukt ved enten 10 ug/ml eller 30ug/ml.
Som forventet viste KIR2DL1+ NK-celler lite eller ingen cytotoksisk aktivitet mot målceller som uttrykker HLA-Cw4. Men i nærvær av 1-7F9mAb ble NK-cellene ute av stand til å gjenkjenne deres HLA-C ligander, og viste en sterk cytotoksisitet aktivitet på Cw4 målene. For eksempel ble de to cellelinjene som ble testet (HLA-Cw4 transfektert 721.221 og CW4+EBV cellelinjene ) ikke drept av KIR2DL1+NK-celler, men inhiberingen kunne effektivt reduseres ved bruk av enten Mab1-F9 eller en konvensjonell anti KIR2DlwmAbEB6. AbsDF200 og panKIR (også referert til som NKVSF1) ble sammenlignet med 1-7F9. Antistoffer 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 var på den andre siden ikke i stand til å gjenskape celle lysering av NK-celler på Cw4 positive mål.
Eksempel 5
Biacore analyse av DF200mAb/ KIR2DL1 og DF200mAb/ KIR2DL3 interaksjoner. Produksjon og rensing av rekombinante proteiner.
De KIR"DL1 og KIR2DL3 rekombinante proteinene ble produsert i E. Coli. cDNA som koder for hele det ekstra cellulære domenet til KIR2DL1 og KIR2 DL3 ble forsterket ved PCR fra pCDM8 klone 47.11 vektor (Biassoni et al 1993) og RSVS (gpt) 183 klone 6
Vektor (Wagtman et al 1995) respektivt, ved bruk av de følgende primerene: Sense:5'GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'
Anti-sense:5'-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3'
De ble klonet inn i pML1 uttryknings vektoren i samme leseramme som en sekvens som kodet for et biotinyliserende signal (Salquin et al 2003)
Proteinuttrykkelse ble utført i det BL21(DE3) bakterielle stammen (Invitrogen). Transfekterte bakterier ble dyrket til OD600= 0,6 ved 37 °C i medium supplementer! med ampicillin (100 u.g/ml) og uttrykking ble indusert med 1mm IPTG.
Proteinene ble gjenvunnet fra inklusjonslegemene ved denaturerings forhold (8M urea). "Refolding" av de rekombinante proteinene ble utført i 20 mm Tris, pH 7,8, NaC1150 mm buffer inneholdende L-arginine (400mm, Sigme) og (3-mercaptoethanol (1mm), ved rom temperatur, ved senking av urea konsentrasjonen i en seks trinns dialyse (henholdsvis 4, 3, 2,1, 0,5 og Om urea). Redusert og oksidert glutathion (5mm og 0,5mm henholdsvis Sigma) ble tilsatt i løpet av de 0,5 og 0 m urea dialysetrinnene. Til slutt ble proteinet dialysert uttrykkelig mot 10mm Tris, pH7,5, NaC1150 mm buffer. Oppløselige, refoldede proteiner ble konsentrert og så renset på en Superdex 200 størrelses ekskluderende søyle (Pharmacia; AKTA system).
Overflate plasmon resonans målinger ble utført på en Biacore apparatus (Biacore). I alle Biacore eksperimenter ble HBS bufferen supplementer! med 0,05% surfaktant P20 brukt som kjørings buffer.
Protein mobilisering.
Rekombinante KIR2DL1 og KIR2DL3 proteiner ble produsert som beskrevet ovenfor og ble immobilisert kovalent til karboksylgrupper i dextran laget på en Sensor Chip CM5 (Biacore). Sensor brikkeoverflaten ble aktivert med EDC/NHS (-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimiehydroklorid og N-hydroksysuccinimid, Biacore). Proteiner i sammenkoblings buffer (10mm acetat, pH4,5) ble injisert. Deaktivering av det gjenværende aktiverte gruppene ble utført ved bruk av 100mm etanolamin pH8 (Biacore).
Affinitetsmålinger.
For kinetisk målinger ble forskjellige konsentrasjoner av det løsbare antistoffet (1x10 exp-7 til 4x 10exp -10M) påført det immobiliserte prøven. Målinger ble tatt ved en 20uJ/min kontinuerlig flythastighet. For hver syklus ble overflaten til sensor brikken regenerert ved 5uJ injeksjoner av 10mm NaOH pH11. BIAIouge Kinetice Evaluation program (BIA evaluation 3.1, Biacore) ble brukt til data analyse. Den oppløselige analyten (40uJ ved forskjellige konsentrasjoner) ble injisert ved en flythastighet 20uJ/min i HBS buffer, på dekstran lag inneholdende 500 eller 540 reflekterende enheter (RU), og henholdsvis 1000 eller 700 RU av KIR2DL1 og KIR2DL3. Dataene representerer 6 uavhengige eksperimenter. Resultatene er vist i tabell 1 under.
Eksempel 6
Biavcore konkurransebindings analyse av mus og humane anti- KIR- antistoffer.
Epitopkartleggingsanalyse ble utført på immobilisert KIR2DL1 (900RU), KIR2DL3 (2000RU) og KIR2DS1(1000RU) med muse anti-KIR2D antistoff DF200, Oan2D, gl183 og EB6 og humant anti-KIR2D antistoff 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 og 1-7F9 som beskrevet tidligere i (Gauthier et al1999, Saunal and van Regenmortel 1995).
Alle eksperimentene ble utført med en flytshastighet på 5ul/min i HBS buffer med 2 min injeksjon av de forskjellige antistoffene ved 15ug/ml. For hvert par av antistoffer ble konkurransebindings analyse utført i to trinn. I det første trinnet ble det første monoklonale antistoffet (mAb) injisert på KIR" målproteinet, etterfulgt av den andre mAb (uten å fjerne den første mAb) og den andre mAb RU verdien (RU2) ble overvåket. I det andre trinnet ble den første mAb'en injisert først direkte på nakent KIR2D protein, og mAb'er RU verdien (RU1) ble overvåket. Prosent inhibering av det andre mAb bindingen til KIR2D protein av det første mAb ble beregnet ved 100<*>(1-RU2/RU1).
Resultatene er vist i tabellene 2, 3 og 4, hvor antistoffene designert som "første antistoff" er opplistet i den vertikale kolonnen, og den "andre antistoff' er opplistet i den horisontale kolonnen. For hver antistoff sammensetning som ble utprøvd er verdiene for det direkte bindingsnivået (RU) til antistoffene til brikken opplistet i tabellen, hvor direkte binding av det andre antistoffet til KIR2D brikken er opplistet i den øvre delen av feltet og verdien for bindig av det andre antistoffet til KIR2D brikken når det andre antistoffet er tilstedeværende er opplistet i den nedre delen av feltet. Opplistet til høyre i hvert felt er prosent inhiberingen av binding av det andre antistoffet. Tabell 2 viser binding på en KIR2DL1 brikke, tabell 3 viser binding av antistoffer til en KIR2DL3 brikke, og tabell 4 viser binding av antistoffer til en KIR2DS1 brikke. Konkurrerende binding av museantistoffene DF200, NKVSF1 og EB6, og humane antistoffer 1-F1, 1-7F9 og 1-6F1 til immobilisert KIR2DL1, KIR2DL2/3, og KIR2DS1 ble bestemt. Epitop kartlegging (figur 7) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder til KIR2DL1 viste at (a) antistoff 1-7F9 konkurrerer med EB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200; (b) antistoff 1-4 F1 konkurrerer videre med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7F9; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6, men ikke 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke 1-7F9. Epitop kartlegging (figur 89 fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder KIR2DL3 viste at (a) 1-4F1 konkurrerer med NKVSF1, DF200, gl183 og 1-7f9; (b) 1-7F9 konkurrerer med DF200, gl183 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GL183, men ikke 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og 1-7F9 men ikke med GL183. Epitop kartlegging (figur 9) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder seg til KIR2DS1 viste at (a) 1-4F1 konkurrerer med NKVSF1, DF200 og 1-7F9; (b) 1-7F9 konkurrerer med 1-4F1 men konkurrerer ikke medDF200 og NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9.
Eksempel 7
Anti- KIR mAb titrering med cynomolgene NK- celler
Anti-KIR-antistoff NKVSF1 ble testet for dets evne til å binde NK-celler fra cynomolgene aper. Binding av antistoffet til ape NK-celler er vist i figur 10.
Rensing av ape PBMCer og fremstilling av en polyklonal NK - celle masse . Cynomolgene makak PBMCer ble fremstilt fra en natriumsitrat CPT tube (Becton Dickinson). NK-cellerensing ble utført ved negativ utarming (makak NK-celle berikelses kitt, Stem Cell Technology). NK-celler ble dyrket på bestrålte humane materceller, 300 U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiro Corporation) og 1ng/ml Phytohemagglutinin A (Invitrogen, Bibco) for å oppnå polyklonale NK-celle populasjoner.
Pan2D mAb titrering med cynomolgene NK - celler .
Cynomolgene NK-celler (NK masse ved dag 16) ble innkuberte med forskjellige mengder Pan2D mAb etterfulgt av PE-konjugerte geite F(ab')2 fragmenter av anti-mus IgG (H+L) antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt ved en isotypisk kontroll (renset muse lgG1). Prøvene ble utført i duplikater. Den gjennomsnittlige fluorescens intensiteten = MFI.
Eksempel 8
Epitop kartlegging av DF200 og pan2D binding til KIR2DL1
Datamodellering av de ekstracellulære domenene til KIR2DL1 ,-2 og -3 (KIR2DL1-3), basert på deres publiserte krystallstrukturer ( Maenaka et al. (1999), Fan et al.
(2001), Boyington et al. (2000)), forutså involveringen av aminosyrer R131<1>i interaksjonen mellom KIR2DL1 og de KIR2DL1-3 kryssreaktive muse monoklonale antistoffene (mAb'er) DF200 og pan2D. For å verifisere dette, ble fusjonsproteiner fremstilt som bestod av det komplette ekstracellulære domene til KIR2DL1 (amniosyrer H1-H224), enten villtype eller punktmuterte (for eksempel R131W<2>), fusert til humant Fc (hFc). Materialene og fremgangsmåtene anvendt for å produsere og evaluere forskjellige KIR2DL1-hFc fusjonsproteiner er beskrevet (Winter og Long
(2000)). Kortfattet blir cDNA vektorer som koder for KIR2DL1(R131W)-hFc fremstilt ved PCR-basert mutagenese (Quickchange II, Promega) av CL42-lg,en publisert cDNA-vektor for produksjon av villtype KIR2DL1-hFc (Wagtmann et al. (1995)). KIR2DL1-hFc og KIR2DL1(R131W)-hFc ble fremstilt i COS7 celler og isolert fra vevskulturmedium, hovedsakelig som beskrevet (Wagtamann et al. (1995). For å utprøve deres korrekte folding, ble KIR2DL1-hFc og KIR2DL1(F131W)-hFc innkubert med LCL712.221 celler som uttrykker enten HLA-Cw3 (ingen KIR2DL1) eller HLA-Cw4 (KIR2DL1 ligand), og interaksjonen mellom KIR-Fc fusjonsproteiner og celler analyserte av FACS, en standardteknikk for studie av proteininteraksjoner på celleoverflaten. Et eksempel på uavhengige eksperimenter er gitt i figur 11, panel A. Som forventet fra litteraturen bandt ingen av KIR2DL1-hFc fusjonsproteinene HLA-Cw3 uttrykkende LCL721.221 celler. I kontrast dertil bandt både KIR2DL1-hFc og KIR2DL1(R131W)-hFc HLA-Cw4 uttrykkende LCL721.221 celler, og bekreftet derved deres korrekte binding.
Bindingen av KIR2DL1(R131W)-hFcog KIR2DL1-hFc til KIR-spesifkke mAb'er (DF200, pan2D, EB6 og GL183 ble studert ved bruk av ELISA, en standardteknikk for å studere proteininteraksjoner. Kortfattet ble KIR2DL1(R131W)-hFc og KIR2DL1-hFc sammenkoblet med 96-brønns plater via geite-antihumane antistoffer, hvoretter KIR-spesifikke mAb'er ble tilsatt i varierende konsentrasjoner (0-1u.g/ml i PBS). Interaksjonene mellom KIR2DL1-hFc varianter og mAb'er ble visualisert ved spektrafotometri (450nm) ved bruk av peroksidase sammenkoblet sekundære antistoffer spesifikke for museantistoffer for å konvertere TMB substratet. Et eksempel på uavhengige eksperimenter er gitt i figur 11, panel B. Mens KIR2DL2-3-spesifikke mAb GL183 ikke var i stand til å binde noen av KIR2DL1-hFc fusjonsproteinene, bandt KlR2DL 1-spesifikke mAb EB6,DF200 og pan2D KIR2DL1-hFc varianter på doseringsavhengig vis. Den enslige punktmutasjonen (R131W) påvirket bindingen av DF200 og pan2D med en reduksjon i bindingen når sammenlignet med villtypen på -10% ved de høyeste konsentrasjonene av mAb (1ug/ml), noe som bekreftet at R131 tar del i bindingsområdet til DF200 og pan2D i det ekstracellulære domene 2 til KIR2DL1.
REFERANSER
Moretta, A., Bottino, C, Pende, D., Tripodi, G., Tambussi, G., Viale, 0., Orengo, A., Barbaresi, M., Merli, A., Ciccone, E., og et al. (1990). Identification of four subsets of human CD3-CD 16+ natural killer (NK) cells by the expression of clonally distributed functional surface molecules: correlation between subset assignment of NK clones and ability to mediate specific alloantigen recognition. J Exp Med 172, 1589-1598.
Moretta, A., Vitale, M., Bottino, C, Orengo, A. M., Morelli, L., Augugliaro, R., Barbaresi, M., Ciccone, E., og Moretta, L. (1993). P58 molecules as putative receptors for major histocompatibility complex (MHC) dass I molecules in human natural killer (NK) cells. Anti-p58 antibodies reconstitute lysis of MHC dass I-protected cells in NK clones displaying different specificities. J Exp Med 178,597-604.
Pende, D., Parolini, S., Pessino, A., Sivori, S., Augugliaro, R., Morelli, L., Marcenaro, E., Accame, L., Malaspina, A., Biassoni, R., et al. (1999). Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Med 190,1505-1516.
Ruggeri, L., Capanni, M., Urbani, E., Perruccio, K., Shlomchik, W. D., Tosti, A., Posati, S., Rogaia, D., Frassoni, F., Aversa, F., et al. (2002). Effectiveness of donor natural killer cell alloreadivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 295, 20972100.
Wagtmann N, Biassoni R, Cantoni C, Verdiani S, Malnati MS, Vitale M, Bottino C, Moretta L, Moretta A, Long EO. Molecular clones of the p58 NK-cell receptor reveal immunoglobulin-related molecules with diversity in both the extra- and intracellular domains. Immunity. 1995 May;2(5):439-49.
Biassoni R, Verdiani S, Cambiaggi A, Romeo PH, Ferrini S, Moretta L.Human CD3CD16+ natural killer cells express the hGATA-3 T cell transcription factor and an unrearranged 2.3-kb TcR delta transcript. Eur J Immunol. 1993 May;23(5): 1083-7. Saulquin X, Gastinel LN, Vivier E.Crystal structure of the human natural killer cell activating receptor KIR2DS2 (CD158j) J Exp Med. 2003 Apr 7;197(7):933-8.
Gauthier, L., Lemmers, B., Guelpa-Fonlupt, V., Fougereau, M., og Schiff, C.
u-SLC physico-chemical interactions of the human preB cell receptor: implications for VH repertoire selection and cell signaling at the preB cell stage. Journal of Immunology, 162.,41-50. (1999).
Saunal, H. og Van Regenmortel, M.H.V., Mapping of viral conformation epitopes using biosensor measurements. Journal of Immunology, 183: 33-41 (1995).
Boymgton JC; Motyka SA; Schuck P; Brooks AG; Sun PD. Nature, Vol. 405 (6786) ss. 537-543 (2000)
Fan QR; Long EO; Wiley DC. Nature immunology, Vo!. 2 (5) pp. 452-460 (2001)
Maenaka K; Juji T; Stuart Dl; Jones EY. Structure with Folding and design, Vo!. 7 (4) ss. 391-398(1999)
Wagtmann N; Rajagopalan S; Winter CC; Peruzzi M; Long EO. Immunity, Vol. 3 (6) ss. 801-809(1995).
Winter CC; Long EO. Natural Killer Cells Protocols (edited by Campbell K.S and Colonna M). Human Press. ss. 219-238 (2000)
Alle referanser, inkludert publikasjoner, patentsøknader og patenter, som er sitert heri er herved inkorporert ved referanse til den same rekkevidde som om hver av referansene var individuelt og spesifikt innkikert som inkorporert ved referanse, og var fremlagt i sin helhet heri.
Alle overskrifter og subboverskrifter er anvendt heri bare av bekvemmelighet og bør ikke på noe vis fremstilles som begrensninger av oppfinnelsen.
Enhver kombinasjon av de ovenfor beskrevne elementene i alle mulige variasjoner derav er omfattet av oppfinnelsen dersom det ikke er indikert annerledes heri eller på annet vis klart motbevist av innholdet.
Utrykkene "et", "en", "de" og "den" og lignende referanser som brukt i sammenheng med å beskrive oppfinnelsen skal oppfattes som å dekke både entall og flertal, dersom det ikke er indikert annerledes heri eller på annet vis klart motbevist av innholdet.
Oppramsing av områder til verdier heri er bare tiltenkt å være en kortfattet metode for å referere individuelt til hver separate verdi som faller innenfor området, så lenge det ikke er indikert annerledes heri, og hver separate verdi er inkorporert inn i beskrivelsen som om den var individuelt opplistet heri. Dersom noe annet ikke er sagt, er alle eksakte verdier gitt heri representative på korresponderende omtrente verdier (for eksempel alle eksakte eksempel verdier gitt i forbindelse med en spesifikk faktor eller måling kan betraktes som å også gi en korresponderende omtrentlig måling, modifisert ved "omlag" der det er passende).
Alle fremgangsmåter beskrevet heri kan utføres i enhver passende rekkefølge dersom det ikke er indikert annerledes heri eller på annet vis klart motbevist av innholdet.
Bruken av ethvert og alle eksempler, eller eksempelspråk, (for eksempel "så som") som er gitt heri, er bare tiltenkt å bedre belyse oppfinnelsen, og er ikke en begrensning av omfanget til oppfinnelsen dersom ikke annet er indikert. Ikke noe språk i beskrivelsen burde oppfattes som å indikere at noe element er essensielt for utøvelsen av oppfinnelsen dersom det ikke er uttrykkelig uttalt.
Sitering og inkorporering av patent dokumenter heri er utført bare for bekvemmelighet, og reflekterer ikke noe syn på gyldigheten, patenterbarheten, og/eller håndhevbarheten til slike patentdokumenter.
Beskrivelsen heri av ethvert aspekt eller utførelse av oppfinnelsen bed bruk av utrykk som (omfatter", "har", "inkluderer", eller "inneholder" med referanse til et element eller elementer, er tiltenkt å frembringe støtte for lignende aspekter eller utførelser av oppfinnelsen som "består av", "består hovedsakelig av", eller "omfatter hovedsakelig" det spesifikke elementet eller elementene, dersom det ikke er uttrykt eller klart motbevist ved innhold (for eksempel bør en sammensetning beskrevet heri som omfatter et spesifikt element forstås som å også beskrive sammensetningen som består av dette elementet, dersom det ikke er uttrykt eller klart motbevist ved innholdet).
Oppfinnelsen inkluderer alle modifikasjoner og ekvivalenter av innholdet som resitert i de aspekter eller krav presentert heri til det maksimale omfanget godtatt av de gjeldende lover.

Claims (17)

1. Et antistoff eller antistoff-fragment,karakterisert vedat det; - binder til de humane inhiberende Killer lg-lignende Receptor (KIR) reseptorgenprodukter KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 - er i stand til å nøytralisere KIR-fremmet inhibering av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker minst én av nevnte humane inhiberende KIR-reseptorer, og -ikkeerNKVSFI, hvor KIR2DL2 og KIR2DL3 vurderes til å være et enkelt inhibitorisk KIR-molekyl, og NKVSF1-antistoffet omfatter en lettkjede variabel region som har aminosyre-sekvensen angitt i SEQ ID NO 2.
2. Antistoff eller antistoff-fragment i samsvar med krav 1,karakterisertved at antistoffet eller antistoff-fragmentet ikke konkurrerer med NKVSF1 for binding til KIR2DL1 eller til KIR2DL3
3. Antistoff eller antistoff-fragment i samsvar med krav 1,karakterisertved at det er et monoklonalt antistoff eller et fragment av et monoklonalt antistoff.
4. Antistoff eller antistoff-fragment i samsvar med krav 1,karakterisertved at det er et kimerisk, humanisert eller humant antistoff eller antigenbindende fragment derav.
5. Antistoff eller antistoff-fragment i samsvar med krav 1,karakterisertved at antistoffet eller antistoffragmentet er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, en detekterbar enhet, eller en faststoffstøtte.
6. En farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter: (a) et antistoff eller antigenbindende antistoff-fragment i samsvar met ethvert av kravene 1-4, hvor antistoffet eller det antigenbindende antistoff-fragment er tilstedeværende i en mengde som er effektiv for å detekterbart potensiere NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler; og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient.
7. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med krav 6,karakterisertved at den videre omfatter et terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et anti-angiogenisk middel, et apoptopisk middel, et andre antistoff som binder seg til og inhiberer en inhiberende KIR reseptor, et anti-infeksjonsmiddel, et målrettet middel og en adjunkt forbindelse.
8. Sammensetning i samsvar med krav 7,karakterisert vedat: (i) nevnte immunmodulerende middel er valgt fra IL-1alpha IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFD-alfa, IFN-beta, eller IFN-gamma; (ii) nevnte kjemoterapeutiske middel er valgt fra alkylerende middel, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotikaer, adriamycin, dactinomycin, mitomycin, carminomycin, daunomycin, doxorubicin, tamoxifen, taxol, taxoter, vincristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-flourouracil (5FU), cytosin arabinosid, cyclofosfamid, thiotepa, methotrexat, camptothecin, actinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin, combretastatin(er), andre vinca alkyloider, og derivater eller prodrug derav, (iii) nevnte hormonmiddel er valgt fra leuprorelin, goserelin, triptorelin, buserelin, tamoxifen, toremifen, flutamid, nilutamid, cyproteron bicalutamid anastrozole, exemestan, letrozol, fadrozol, medroxy, klormadinon, megestrol, andre LHRH agonister, andre anti-estrogener, andre anti-androgener, andre aromatase inhibitorer, og andre progestagener, (iv) nevnte adjunkt forbindelse er valgt fra fenothiaziner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyrofenones, corticosterioder, benzodiazepiner, cannabinoider, zoledronsyre, pamidronsyre, erythropoietin, G-CSF, filgrastim, lenograstim, darbepoetin andre anti-brekkmiddel, andre serotonin antagonister, andre bisfosfonater eller andre hematopoietiske vekstfaktorer, (v) nevnte anti-apoptopiske middel er en antisense nukleotid sekvens, RNAi, siRNA eller en småmolekyl kjemisk forbindelse som inhiberer uttrykking av et gen valgt fra bcr-abl, bcl-2, Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1, eller A20, (vi) nevnte anti- angiogenske middel er valgt fra nøytraliserende antistoffer, antisense RNA, siRNA, RNAi, RNA aptamer eller ribosomer rettet mot et gen som koder for VEGF, et gen som koder for VEGF reseptorer, VEGF, eller en VEGF reseptor; eller en variant av VEGF som har antagonistiske egenskaper mot VEGF, og (vii) nevnte andre antistoff som binder til og inhiberer en inhiberende KIR reseptor er et antistoff eller derivat eller fragment derav som binder seg til en epitop tilhørende en inhiberende KIR reseptor som er forskjellig fra epitopen bundet av nevnte antistoff som binder en felles determinant tilstedeværende på minst to forskjellige humane inhibitoriske KIR reseptor gen produkter.
9. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 6-8 for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av en sykdom.
10. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 9, hvor nevnte sykdom er valgt blant kreft, proliferasjonssykdommer, infeksjonssykdommer og immun-sykdommer.
11. Sammensetning i samsvar med krav 10,karakterisert vedat sykdommen er valgt blant skjelettcellekarsinom, leukemi, akutt lymfocyttisk leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi, B-celle lymfom, T-celle lymfom, Hodgkins lymfom, ikke-Hodgkins lymfom, hårcelle lymfom, Burketts lymfom, akutt eller kronisk myelogene leukemier, promyelocytisk leukemi, fibrosarkom neuroblastom, gliom, astrosytom, schwannomer; fibrosarkom, rhabdomyoskarom, osteosarkoma, melanom, xeroderma pigmentosum, keratoacanthom, seminom, skjolbrukskjertel follicular cancer, teratokarsinom, andre carsinomer i blære, bryst, kolon, nyre, lever, lunge, ovaria, prostata, pankreas, mage, livmorhals, bukspyttkjertel eller hud, andre hematopoietiske tumorer av lymfeopphav, andre hematopoietiske tumorer av myeloid opphav, andre tumorer av mesenchymalt opphav, og andre tumorer av det sentrale eller perifere nervesystem.
12. Sammensetning i samsvar med krav 10,karakterisert vedat pasienten lider av en hematopoietisk tumor av lymfeopphav.
13. Sammensetning i samsvar med krav 12,karakterisert vedat nevnte hematopoietiske tumor er valgt fra T-prolymfocyttisk leukemi (T-PLL) inkludert småcelle og cerebriform celletype; stor granuler lymfocytt leukemi (LGL) av T-celle typer; Zezary syndrom (SS); voksen type T-celle leukemi lymfom (ATLL); a/d T-NHL hepatomilt lymfom; periferal/etter-thymisk T-celle lymfom av den pleomorfiske eller immunoblastiske undergruppen; angio immunoblastisk T-celle lymfom; angiosentrisk (nasal) T-celle lymfom; anaplastisk (Ki 1+) storcelle lymfom; tarm T-celle lymfom; T-lymfoblastisk leukemi; eller lymfom/leukemi (T-Lbly/T-ALL).
14. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 10, hvor nevnte sykdom er valgt: (i) fra en proliferativ tilstand valgt blant hyperplasier, fibrose, angiogenese, psoriasis, arteriesklerose, stenose eller restenose etterfølgende angioplasti, og andre sykdommer kjennetegnet ved glatt muskel proliferasjon i blodåre; (ii) fra en infeksjonssykdom forårsaket av et virus valgt fra Hepatitt type A, hepatitt type B, hepatitt type C, influensa, varicella, andenovirus, herpes simplex type I (HSV-1), herpes simples type 2 (HSV-2), rinderpest, rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papilloma virus, cytomegalovirus, echinovirus, arbovirus, huntavirus, coxsackie virus, kusma virus, meslinger virus, rødehunder virus, polio virus, eller humant immunodeficiency virus type I eller type 2 (HIV-1, HIV-2), eller (iii) fra en infeksjonssykdom forårsaket av bakterier, protozoer eller parasitter valgt fra Staphlococus, S. Pyogenes, Enterococci, Bacillus anthracis, Lactobacillus, Listeria, Corynebacterium diphtheriae, G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas aeruginosa; Legionella; N. gonorrhoeae; N. meningitides; F. meningosepticum; F. odoraturn; Brucella; B. pertusis; B. bronchiseptica; E. coli; Klebsiella; Enterobacter; S. marcescens; S. liquefaciens; Edwardsiella; P. mirabilis; P. vulgaris; Streptobacillus; R. rickettssi; C. psittaci; C. trachornatis; M. Tuberculosis, M. Intracellular, M. Folluiturn, M. Leprae, M. Avium, M. Bovis, M. Africanum, M. Kansasii, M. Lepraernurium; andre Streptococcus, andre Bacillus, andre Gardnerella, andre Pseudomonas, andre Neisseria, andre Flavobacterium, andre Bordetella, andre Escherichia, andre Serratia, andre Proteus, andre Rickettsiaceae, andre Chlamydia, andre mycobacterium, leishmania, og trypanosome.
15. Sammensetning i samsvar med krav 11,karakterisert vedat den er for anvendelse i kombinasjon med et ytterligere terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et anti-angiogenisk middel, et apoptopisk middel, et andre antistoff som binder seg til og inhiberer en inhiberende KIR reseptor, et anti-infeksjonsmiddel, et målrettet middel eller en adjunkt forbindelse, hvori nevnte tilleggs terapeutiske middel administreres til nevnte pasient som en enkelt doseringsform i sammen med nevnte antistoff, eller som separate doseringsformer.
16. En in vitro fremgangsmåte for å detektere tilstedeværelse av NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på celleoverflaten i en biologisk prøve ,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene: a) å bringe den biologiske prøven og et antistoff i samsvar med ethvert av kravene 1-4 i kontakt med hverandre, hvor antistoffet er konjugert eller kovalent bundet til en detekterbar enhet; og b) å detektere tilstedeværelsen av antistoffet i den biologiske prøven.
17. En fremgangsmåte for å rense med NK-celler som har en inhibitorisk KIR på celleoverflaten fra en prøve, karaikterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: a) å bringe i kontakt med hverandre prøven og et antistoff i samsvar ethvert av kravene 1-4 under forhold som tillater NK-cellene som haren inhibitorisk KIR på celleoverflaten å binde antistoffet, hvor antistoffet er konjugert eller kovalent bundet til en faststoffstøtte; og b) å utvinne de bundne NK-cellene fra antistoffet konjugert eller kovalent bundet til faststoffstøtten.
NO20160411A 2003-07-02 2016-03-10 PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme NO343342B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48389403P 2003-07-02 2003-07-02
US54547104P 2004-02-19 2004-02-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20160411A1 true NO20160411A1 (no) 2016-03-10
NO343342B1 NO343342B1 (no) 2019-02-04

Family

ID=33567703

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20056048A NO338818B1 (no) 2003-07-02 2005-12-19 Sammensetninger og fremgangsmåter for regulering av aktiviteten til naturlige drepeceller
NO20060528A NO338255B1 (no) 2003-07-02 2006-02-01 Preparater og fremgangsmåter for å regulere NK-celleaktivitet.
NO20160264A NO342318B1 (no) 2003-07-02 2016-02-16 Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav.
NO20160411A NO343342B1 (no) 2003-07-02 2016-03-10 PAN-KIR2DL NL-reseptorantistoff, og anvendelse av samme

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20056048A NO338818B1 (no) 2003-07-02 2005-12-19 Sammensetninger og fremgangsmåter for regulering av aktiviteten til naturlige drepeceller
NO20060528A NO338255B1 (no) 2003-07-02 2006-02-01 Preparater og fremgangsmåter for å regulere NK-celleaktivitet.
NO20160264A NO342318B1 (no) 2003-07-02 2016-02-16 Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav.

Country Status (22)

Country Link
US (2) US9902936B2 (no)
EP (3) EP1673397B1 (no)
JP (5) JP5015592B2 (no)
KR (5) KR101325023B1 (no)
CN (2) CN103588880B (no)
AT (1) ATE490984T1 (no)
AU (2) AU2004253630B2 (no)
BR (2) BRPI0412138B8 (no)
CA (2) CA2530591A1 (no)
CY (1) CY1113394T1 (no)
DE (1) DE602004030464D1 (no)
DK (2) DK1673397T3 (no)
ES (2) ES2725526T3 (no)
HK (1) HK1091662A1 (no)
HR (1) HRP20120845T1 (no)
IL (3) IL172613A (no)
MX (1) MXPA05013923A (no)
NO (4) NO338818B1 (no)
PL (1) PL1639013T3 (no)
PT (1) PT1639013E (no)
RU (2) RU2376315C2 (no)
WO (2) WO2005003168A2 (no)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090191213A9 (en) * 2003-07-02 2009-07-30 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for regulating NK cell activity
HUE033129T2 (en) 2003-07-24 2017-11-28 Innate Pharma Sa Methods and compositions for increasing the efficacy of therapeutic antibodies using compounds that potentiate NK cells
EP1740619A1 (en) * 2004-04-30 2007-01-10 Innate Pharma Compositions and methods for treating proliferative disorders such as nk-type ldgl
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
TWI472338B (zh) * 2004-07-01 2015-02-11 Novo Nordisk As 人類抗ｋｉｒ抗體
DK2921500T3 (da) 2004-07-10 2023-09-18 The Institute For Cancer Res Genetisk modificerede, humane, naturlige dræbercellelinjer
JP5525689B2 (ja) * 2004-11-02 2014-06-18 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法
EP1835937B1 (en) 2005-01-06 2012-04-11 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for treating viral infection
US8222376B2 (en) 2005-01-06 2012-07-17 Novo Nordisk A/S KIR-binding agents and methods of use thereof
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
CN101300272B (zh) * 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
EP2109460B1 (en) * 2007-01-11 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Anti-kir antibodies, formulations, and uses thereof
US8709411B2 (en) * 2008-12-05 2014-04-29 Novo Nordisk A/S Combination therapy to enhance NK cell mediated cytotoxicity
US20120009148A1 (en) * 2008-12-29 2012-01-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Methods of predicting responsiveness to interferon treatment and treating hepatitis c infection
US20120308986A1 (en) * 2010-02-08 2012-12-06 Biotherapy Institute Of Japan Method for producing nk cell-enriched blood product
BR112013012138B1 (pt) 2010-11-22 2022-02-22 Innate Pharma Sa Uso de um composto que inibe um receptor inibidor de célula natural killer (nkcir)
TWI560200B (en) 2011-05-25 2016-12-01 Innate Pharma Sa Anti-kir antibodies for the treatment of inflammatory and autoimmune disorders
EP2723362A1 (en) 2011-06-21 2014-04-30 Innate Pharma NKp46-MEDIATED NK CELL TUNING
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
WO2013076139A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd40l expressing mammalian cells and their use
JP6507097B2 (ja) * 2012-09-19 2019-04-24 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． Ｋｉｒ３ｄｌ２結合剤
NZ631405A (en) 2012-10-02 2017-01-27 Bristol Myers Squibb Co Combination of anti-kir antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat cancer
WO2015069785A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-cs1 antibodies to treat multiple myeloma
JP6654781B2 (ja) * 2014-08-29 2020-02-26 国立大学法人北海道大学 Ｋｉｒ２ｄｓ１に対するモノクローナル抗体
ES2772307T3 (es) 2014-10-28 2020-07-07 Childrens Univ Hospital Tuebingen Tratamiento de pacientes pediátricos con LLA-PCB con un anticuerpo anti-kir
CN115029362A (zh) 2015-02-06 2022-09-09 新加坡国立大学 核酸、包含其的工程免疫细胞及其生产方法和用途
BR112017021688A2 (pt) 2015-04-17 2018-08-14 Bristol-Myers Squibb Company composições compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-pd-1 e outro anticorpo
EP3461337A1 (en) 2015-05-06 2019-04-03 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
EP3943098A3 (en) 2015-07-16 2022-05-11 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
AU2016348391A1 (en) * 2015-11-03 2018-05-17 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding TIM-3 and their uses
CA3004530A1 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
IL292302B2 (en) 2016-05-20 2023-10-01 Biohaven Pharm Holding Co Ltd Use of glutamate modulating factors in cancer immunotherapy
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
JP2019532017A (ja) 2016-07-14 2019-11-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんを治療するための異なるエピトープ結合を示す複数の二重特異性結合ドメイン構築物
GB201616365D0 (en) * 2016-09-27 2016-11-09 Helsingin Yliopisto Non-genetic modification of enveloped viruses
US11395838B2 (en) 2016-09-27 2022-07-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for enhancing immune checkpoint blockade therapy by modulating the microbiome
BR112019007365A2 (pt) 2016-10-12 2019-07-09 Univ Texas métodos e composições para imunoterapia com tusc2
KR20190068602A (ko) 2016-10-21 2019-06-18 이나뜨 파르마 항-kir3dl2 작용제에 의한 치료
EP3551226A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 MultiVir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
JP7458188B2 (ja) 2017-03-31 2024-03-29 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 腫瘍を処置する方法
CN110573529A (zh) 2017-04-05 2019-12-13 韩国生命工学研究院 激活nk细胞的融合蛋白、nk细胞和包含其的药物组合物
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
CN107261304A (zh) * 2017-06-05 2017-10-20 中国兽医药品监察所 一种奶牛的布鲁氏菌病免疫试剂盒及其应用
US20190038733A1 (en) 2017-08-10 2019-02-07 National University Of Singapore T cell receptor-deficient chimeric antigen receptor t-cells and methods of use thereof
BR112020007249B1 (pt) 2017-10-13 2022-11-22 Harpoon Therapeutics, Inc Roteína de ligação a antígeno de maturação de célula b, proteína de ligação multiespecífica e uso das referidas proteínas
JP2020536894A (ja) 2017-10-15 2020-12-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍処置法
CN108060137B (zh) * 2017-12-26 2021-07-02 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Il7和il21修饰的nk92细胞、制备方法及其应用
KR20200135986A (ko) 2018-03-19 2020-12-04 멀티비르 인코포레이티드 종양 억제인자 유전자 치료 및 cd122/cd132 작용제를 포함하는 암 치료를 위한 방법 및 조성물
AU2019236865A1 (en) 2018-03-23 2020-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
CN112292145A (zh) 2018-03-25 2021-01-29 斯尼普生物群系有限公司 治疗和预防微生物感染
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
EP4268831A3 (en) 2018-09-12 2024-05-22 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
US20220054524A1 (en) 2018-12-21 2022-02-24 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
CN111424012A (zh) * 2020-03-30 2020-07-17 威海市中心医院 一种nk细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法
TW202214857A (zh) 2020-06-19 2022-04-16 法商昂席歐公司 新型結合核酸分子及其用途
MX2023000197A (es) 2020-07-07 2023-02-22 BioNTech SE Arn terapeutico para el cancer positivo para vph.
BR112023003553A2 (pt) 2020-08-31 2023-04-04 Bristol Myers Squibb Co Assinatura de localização celular e imunoterapia
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
US20240000837A1 (en) * 2020-12-23 2024-01-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Inhibition of kir2dl2 for the enhancement of adoptive immunotherapies
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
AU2021411486A1 (en) 2020-12-28 2023-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
CN118055840A (zh) 2021-10-08 2024-05-17 3M创新有限公司 具有调节的刚度、减小的拉延区和力预算的狭缝模组件
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023110937A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Depletion of nk cells for the treatment of adverse post-ischemic cardiac remodeling
WO2023111203A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024026385A1 (en) * 2022-07-28 2024-02-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Inhibition of kir2dl2 and/or kir2dl3 for the enhancement of adoptive immunotherapies
WO2024090458A1 (ja) * 2022-10-25 2024-05-02 第一三共株式会社 抑制型ｋｉｒに対するアゴニストを用いた免疫拒絶の回避方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5539094A (en) 1993-11-12 1996-07-23 La Jolla Cancer Research Foundation DNA encoding Bcl-2-associated proteins
US5583034A (en) 1994-02-22 1996-12-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Enhancement of adoptosis using antisense oligonucleotides
US5808028A (en) 1994-05-24 1998-09-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular clone of a P58 receptor protein and uses thereof
NZ298145A (en) 1994-12-29 1998-08-26 Yamanouchi Pharma Co Ltd Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
US6750044B1 (en) 1996-10-17 2004-06-15 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having antagonistic properties, nucleic acids encoding the same and host cells comprising those nucleic acids
EP1125130B1 (de) * 1998-10-29 2006-07-26 DakoCytomation Denmark A/S Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl
NZ514918A (en) 1999-04-28 2003-11-28 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting VEGF
KR100419555B1 (ko) 2000-05-29 2004-02-19 주식회사유한양행 비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
HUE033129T2 (en) * 2003-07-24 2017-11-28 Innate Pharma Sa Methods and compositions for increasing the efficacy of therapeutic antibodies using compounds that potentiate NK cells
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
KR101564713B1 (ko) 2004-12-28 2015-11-06 이나뜨 파르마 Ｎｋｇ2ａ에 대한 단클론 항체
EP1835937B1 (en) * 2005-01-06 2012-04-11 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for treating viral infection
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
US8222376B2 (en) 2005-01-06 2012-07-17 Novo Nordisk A/S KIR-binding agents and methods of use thereof
CN101300272B (zh) 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
EP2109460B1 (en) 2007-01-11 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Anti-kir antibodies, formulations, and uses thereof
TWI560200B (en) * 2011-05-25 2016-12-01 Innate Pharma Sa Anti-kir antibodies for the treatment of inflammatory and autoimmune disorders
EP2912063A1 (en) * 2012-10-23 2015-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
WO2015069785A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-cs1 antibodies to treat multiple myeloma
US9884593B2 (en) * 2015-02-12 2018-02-06 Pro-Gard Products, Llc Weapon mounting system

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018153185A (ja) 2018-10-04
ATE490984T1 (de) 2010-12-15
CA2530272C (en) 2018-05-01
IL172700A (en) 2015-05-31
CN103588880B (zh) 2019-09-17
AU2004253770A1 (en) 2005-01-13
NO342318B1 (no) 2018-05-07
MXPA05013923A (es) 2006-08-11
ES2393485T3 (es) 2012-12-21
DE602004030464D1 (de) 2011-01-20
KR101444717B1 (ko) 2014-09-26
KR20060111440A (ko) 2006-10-27
BRPI0412138B1 (pt) 2021-01-26
JP6556465B2 (ja) 2019-08-07
CY1113394T1 (el) 2016-06-22
PT1639013E (pt) 2012-12-03
IL172613A (en) 2010-12-30
KR20130062379A (ko) 2013-06-12
EP2289939A2 (en) 2011-03-02
JP2015163068A (ja) 2015-09-10
CN103588880A (zh) 2014-02-19
CA2530591A1 (en) 2005-01-13
BRPI0412138B8 (pt) 2021-05-25
US11365393B2 (en) 2022-06-21
US20180216069A1 (en) 2018-08-02
NO20056048L (no) 2006-04-03
EP2289939A3 (en) 2013-12-04
RU2005140152A (ru) 2007-08-27
EP2289939B1 (en) 2019-03-27
AU2004253630B2 (en) 2010-11-25
DK1673397T3 (da) 2011-03-07
PL1639013T3 (pl) 2013-02-28
KR20060079180A (ko) 2006-07-05
JP5015592B2 (ja) 2012-08-29
KR20120059659A (ko) 2012-06-08
EP1639013A2 (en) 2006-03-29
NO338818B1 (no) 2016-10-24
JP2008500947A (ja) 2008-01-17
BRPI0412153A (pt) 2006-08-22
CA2530272A1 (en) 2005-01-13
KR101325023B1 (ko) 2013-11-04
US20060263361A1 (en) 2006-11-23
NO20160264A1 (no) 2016-02-16
HRP20120845T1 (hr) 2012-11-30
EP1673397A2 (en) 2006-06-28
WO2005003168A3 (en) 2005-05-06
BRPI0412153B8 (pt) 2021-05-25
KR101420344B1 (ko) 2014-07-16
JP4871125B2 (ja) 2012-02-08
JP2007524612A (ja) 2007-08-30
KR101375153B1 (ko) 2014-03-18
US9902936B2 (en) 2018-02-27
KR20120024998A (ko) 2012-03-14
IL172700A0 (en) 2006-04-10
RU2006102960A (ru) 2006-06-27
EP1639013B1 (en) 2012-09-12
BRPI0412153B1 (pt) 2019-07-30
RU2404993C2 (ru) 2010-11-27
AU2004253770B2 (en) 2009-10-29
WO2005003172A3 (en) 2005-03-10
NO343342B1 (no) 2019-02-04
BRPI0412138A (pt) 2006-08-15
JP5826697B2 (ja) 2015-12-02
RU2376315C2 (ru) 2009-12-20
EP1673397B1 (en) 2010-12-08
DK1639013T3 (da) 2013-01-07
IL172613A0 (en) 2006-04-10
AU2004253770C1 (en) 2010-04-15
HK1091662A1 (en) 2007-01-26
WO2005003172A2 (en) 2005-01-13
JP2012176953A (ja) 2012-09-13
WO2005003168A2 (en) 2005-01-13
NO20060528L (no) 2006-02-01
AU2004253630A1 (en) 2005-01-13
NO338255B1 (no) 2016-08-08
IL238490A0 (en) 2015-06-30
CN103467602A (zh) 2013-12-25
CN103467602B (zh) 2018-04-10
ES2725526T3 (es) 2019-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11365393B2 (en) Compositions and methods for regulating NK cell activity
US8637258B2 (en) Compositions and methods for regulating NK cell activity
ZA200600842B (en) Pan-KIR2DL NK-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
MXPA05014074A (en) Methods for the production and cytotoxicity evaluation of kir2dl nk-receptor antibodies