NO342318B1

NO342318B1 - Anti-KIR2DL antistoffer og sammensetninger derav.

Info

Publication number: NO342318B1
Application number: NO20160264A
Authority: NO
Inventors: Søren Berg Padkjaer; Alessandro Moretta; Mariella Della Chiesa; Pascale Andre; Laurent Gauthier; Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Original assignee: Univ Of Genoa; Innate Pharma Sas; Novo Nordisk As
Priority date: 2003-07-02
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2018-05-07
Also published as: JP2018153185A; ATE490984T1; CA2530272C; IL172700A; CN103588880B; AU2004253770A1; MXPA05013923A; ES2393485T3; DE602004030464D1; KR101444717B1; KR20060111440A; BRPI0412138B1; JP6556465B2; CY1113394T1; PT1639013E; IL172613A; KR20130062379A; EP2289939A2; JP2015163068A; CN103588880A

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse angår nye preparater og fremgangsmåter for å regulere en immunrespons i et individ. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen spesifikke antistoffer som regulerer aktiviteten til NK-celler og tillater en økning av effektiviteten til NK cellecytotoksisitet i pattedyrindivider. Oppfinnelsen angår også fragmenter og derivater av slike antistoffer så vel som farmasøytiske preparater som omfatter tilsvarende og deres anvendelser, spesielt i terapi, for å forsterke NK-cellers aktivitet eller cytotoksisitet i individer.

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse angår antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som kryssreagerer med to eller flere inhibitoriske reseptorer som er tilstede på celleoverflaten til NK-celler og som forsterker NK-cellers cytotoksisitet ipattedyrindivider eller i en biologisk prøve. Oppfinnelsen angår også sammensetninger som er egnet for human administrasjon. Oppfinnelsen er angitt i patentkravene.

Bakgrunn

Naturlige dreper (NK)-celler er en underpopulasjon av lymfocytter, som er involverti ikke-konvensjonell immunitet. NK-celler kan oppnås ved hjelp av ulike teknikkersom er kjent for fagmannen, slik som fra blodprøver, cytaferesis, innsamlinger, osv.

Karakteristika og biologiske egenskaper til NK-celler inkluderer ekspresjonen avoverflateantigener, inkludert CD16, CD56 og/eller CD57; fraværet av alfa/betaeller gamma/delta TCR-komplekset på celleoverflaten; evnen til å binde til og drepeceller som ikke uttrykker "egne" MHC/HLA-antigener gjennom aktiveringen avspesifikke cytolytiske enzymer; evnen til å drepe tumorceller eller andre syke celler som uttrykker en NK-aktiverende reseptorligand; evnen til å frigjøre cytokiner somstimulerer eller hemmer immunresponsen; og evnen til å gjennomgå flere runder celledeling og fremstille datterceller med lignende biologiske egenskaper som foreldrecellen. I denne betydning av oppfinnelsen betyr "aktive" NK-cellerbiologiske aktive NK-celler, nærmere bestemt NK-celler som har evnen til å lyseremålceller. F.eks. er en "aktiv" NK-celle i stand til å drepe celler som uttrykker enNK-aktiverende reseptorligand og som ikke uttrykker "egne" MHC/HLA-antigener(KIR-uforenelige celler).

Basert på deres biologiske egenskaper har det blitt foreslått ulike terapeutiske strategier og vaksinestrategier som er avhengig av en modulering av NK-celler.Imidlertid er NK-celleaktivitet regulert gjennom en kompleks mekanisme sominvolverer både stimulerende og inhibitoriske signaler. Effektiv NK-cellemediertterapi kan følgelig kreve både en stimulering av disse cellene og en nøytralisering av inhibitoriske signaler.

NK-celler er negativt regulert av det store histokompatibilitetskomplekset (majorhistocompatibility complex, MHC) klasse I-spesifikke inhibitoriske reseptorer(Kårre et a., 1986; Ohlén et al., 1989). Disse spesifikke reseptorene binder til polymorfe determinanter av MHC klasse I-molekyler eller HLA tilstede på andreceller og hemmer NK-cellelysis. I mennesker gjenkjenner visse medlemmer av enfamilie av reseptorer kalt dreper-Ig-lignende reseptorer ("Killer lg-likereceptors";KIR) grupper av HLA-klasse I-alleler.

KIR er en større reseptorfamilie som er tilstede på visse undergrupper av lymfocytter, inkludert NK-celler. Nomenklaturen for KIR er basert på antallet

ekstracellulære domener (KIR2D eller KIR3D) og hvorvidt den cytoplasmatiske halen enten er lang (KIR2DL eller KIR3DL) eller kort (KIR2DS eller KIR3DS). Innenfor mennesker er nærværet eller fraværet av en gitt KIR variabel fra én NKcelle til en annen innenfor den NK-populasjonen som er tilstede i ett enkelt individ.Innenfor den humane populasjon er det også et relativt høyt nivå av KIRmolekylpolymorfisme, hvor visse KIR-molekyler er tilstede i enkelte men ikke i alleindivider. Visse KIR-genprodukter forårsaker stimulering av lymfocyttaktivitet nårde bindes til en passende ligand. De bekreftede stimulerende KIR har alle en kort cytoplasmatisk hale med en ladet transmembranrest som er forbundet med et adaptermolekyl som har et immunstimulerende motiv (ITAM). Andre KIRgenprodukter er av natur inhibitoriske. Alle bekreftede inhibitoriske KIR har en lang cytoplasmatisk hale og synes å reagere med ulike undersett av HLA-antigeneravhengig av KIR-undertypen. Inhibitoriske KIR har i deres intracytoplasmatiske delén eller flere inhibitoriske motiv som rekrutterer fosfataser. De kjente inhibitoriske KIR-reseptorer inkluderer medlemmer av KIR2DL- og KIR3DL-underfamiliene.KIR-reseptorer med to Ig-domener (KIR2D) identifiserer HLA-C-allotyper:KIR2DL2 (tidligere kalt p58.2) eller det nært beslektede genproduktet KIR2DL3 gjenkjenner en epitop som deles av gruppe 2 HLA-C-allotyper (Cwl, 3, 7 og 8),mens KIR2DL1 (p58.1) gjenkjenner en epitop som deles av de tilsvarende gruppe 1 HLA-C-allotyper (Cw2, 4, 5 og 6). Gjenkjennelsen av KIR2DL1 dikteres avnærværet av en Lys-rest i posisjon 80 i HLA-C-alleler.

KIR2DL2- og KIR2DL3-gjenkjenning dikteres av nærværet av en Asn-rest iposisjon 80. Hovedsakelig har hovedandelen av HLA-C-alleler enten en Asn- elleren Lys-rest i posisjon 80. En KIR med tre Ig-domener, KIR3DL1 (p70) gjenkjenneren epitop som deles av HLA-Bw4-alleler. Endelig gjenkjenner en homodimer avmolekyler med tre Ig-domener KIR3DL2 (p 140) HLA-A3 og -All.

Selv om inhibitoriske KIR og andre klasse I-inhibitoriske reseptorer (Moretta et al.,1997; Valiante et al., 1997a; Lanier, 1998) kan uttrykkes sammen i NK-celler er deti ethvert individs NK-repertoar celler som uttrykker én enkelt KIR og følgeligtilsvarende NK-celler som kun blokkeres av celler som uttrykker én bestemt klasseI-spesifikk allelgruppe.

NK-cellepopulasjonen eller kloner som er KIR-feiltilpasset (mismatched), dvs. hvorNK-cellepopulasjonen som uttrykker KIR ikke er kompatibel med et HLA-molekyl ien vert, er vist å være den mest sannsynlige mediator til antileukemitransplantateffekten som ses i allogene transplantasjoner (Ruggeri et al., 2002). En måte å reprodusere denne virkningen i et gitt individ vil være å anvende reagenser som blokkerer KIR/HLA-interaksjonen.

Monoklonale antistoffer som er spesifikke for KIR2DL1 er vist seg å blokkere interaksjonen til KIR2DL1 med Cw4 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al.,

1993). Monoklonale antistoffer mot KIR2DL2/3 er også blitt beskrevet å blokkere interaksjonen av KIR2DL2/3 med HLACw3 (eller tilsvarende) alleler (Moretta et al., 1993). Anvendelsen av slike reagenser i kliniske situasjoner ville imidlertid kreve utviklingen av to terapeutiske mAb for å behandle alle pasienter uavhengig av hvorvidt enhver gitt pasient uttrykte klasse 1- eller klasse 2-HLA-C-alleler. Manmåtte ha på forhånd bestemt hvilken HLA-type hver pasient uttrykte før manbestemte hvilket terapeutiske antistoff som skulle anvendes, noe som følgelig ville resultere i mye høyere behandlingskostnader.

Watzl et al., Tissue Antigens, 56, s. 240 (2000) produserte kryssreagerende antistoffer som gjenkjenner flere KIR-isotyper, men disse antistoffene hadde ikkeden NK-celleaktiverende effekten. G. M. Spaggiara et al., Blood, 100, side4098-4107 (2002) utførte eksperimenter hvor et antall monoklonale antistoffer motulike KIR ble utnyttet. Ett av disse antistoffene, NKVSF1, ble sagt å gjenkjenne en kjent epitope i CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) og p50.3 (KIR2DS4). Det er ikke foreslått at NKVSF1 kan øke NK-celleaktivitetseffekten og det er ikkeforeslått at det kan anvendes som et terapeutisk middel. Warren H. S. et al., Tissue Antigens, vol. 55, no. Supplement 1, 2000, side 80-81 beskriver tre antistoffer sombinder til KIR2DS2, KIR2DL2 og KIR2DL3. Shin Jeon-Soo et al., Hybridoma, vol. 18, no.6, 1999, side 521-527 beskriver to reseptorer på NK-celler, p58 og p50, som bindestil HEA-C. P58 tilhører KIR (killer inhibitory receptor) mens p50 kategoriseres somKAR (killer activatory receptor). Det ble fremstilt og karakterisert syv monoklonale antistoffer mot p58 KIR og p50 KAR proteinene. Det er også tidligere fremstilt tre rekombinante p58 eller p50 KAR proteiner, KAR-K1 (KIR2DS4), KIR-K6(KIR2DL1) og KIR-K7 (KIR2DL3). De monoklonale antistoffene reaktive medKIR-K7 ble bundet til y3 domenet. Praktiske og effektive tilnærminger imoduleringen av NK-celleaktivitet har følgelig ikke så langt blitt gjort tilgjengelig,og det er fortsatt et behov for HLA-allelspesifikke intervensjoner ved anvendelse avspesifikke reagenser.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen er angitt i patentkravene og omfatter isolert antistoff eller antistoffragment, som er kjennetegnet ved at det (a) kryssreagerer med minst to ulike humane KIR2DL polypeptider som hver gjenkjenner en ulik gruppe av HLA-C-klasse I-allotyper, og (b) nøytraliserer den inhibitoriske aktivitet av slikepeptider, hvori nevnte antistoff eller antistoffragment binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Oppfinnelsen omfatter også sammensetninger egnet for human administrasjon som omfatter slike antistoff eller antistoffragment.

Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer nå nye antistoffer, preparater og fremgangsmåter som løser de for tiden eksisterende vanskelighetene ved NKcelleaktivering og tilveiebringer ytterligere fordelaktige trekk og fordeler. Beskrivelsen tilveiebringer for eksempel ett enkelt antistoff som letter aktiveringen

av humane NK-celler i så å si alle mennesker. Nærmere bestemt tilveiebringerbeskrivelsen nye spesifikke antistoffer som kryssreagerer med ulike inhibitoriske KIR-grupper og som nøytraliserer deres inhibitoriske signaler og følgelig resultereri forsterkning av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker slikeinhibitoriske KIR-reseptorer. Denne evnen til å kryssreagere med flere KIRgenprodukter tillater at antistoffene beskrevet heri effektivt kan anvendes for å øke NK-celleaktivitet i de fleste mennesker uten den byrde eller kostnad som finnes vedå på forhånd måtte bestemme HLA-type til individet.

I et første aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med idet et minste to inhibitoriske KIR-reseptorer på overflaten til NK-celler, nøytralisererde inhibitoriske signalene til NK-cellene og forsterker NK-celleaktivitetFortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant av humant KIR2DLreseptorer. Nærmere bestemt binder antistoffene ifølge denne beskrivelsen til i det minste KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorer. For formålet ved dennebeskrivelsen viser betegnelsen "KIR2DL2/3" til enten den ene eller begge av KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorene. Disse to reseptorene har en svært høyhomologi, er antagelig alleliske former av det samme genet, og betraktes innen fagområdet som å være forvekslingsbare. KIR2DL2/3 betraktes følgelig som ett enkelt inhibitorisk KIR-molekyl for formålet ved denne oppfinnelsen og et antistoffsom kryssreagerer med kun KIR2DL2 og KIR2DL3 og ikke andre inhibitoriske KIR-reseptorer er følgelig ikke innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

Antistoffet inhiberer spesifikt bindingen av MHC- eller HLA-molekyler til i detminte to inhibitoriske KIR-reseptorer og fasiliterer NK-celleaktivitet. Beggeaktiviteter omfattes av betegnelsen "nøytralisere den inhibitoriske aktiviteten til KIR" som anvendt heri. Evnen til antistoffene ifølge oppfinnelsen til å "fasilitere NK-celleaktivitet", "fasilitere NK-cellecytotoksisitet", "fasilitere NK-celler", "forsterke NK-celleaktivitet", " forsterke NK-cellecytotoksisitet" eller "forsterkeNK-celler i denne oppfinnelsen betyr at antistoffene tillater at NK-celler uttrykkeren inhibitorisk KIR-reseptor på overflaten er i stand til å lysere celler som uttrykkerpå deres overflate en korresponderende ligand for den spesifikke inhibitoriske KIRreseptor (f.eks. et spesifikt HLA-antigen). I ett spesifikt aspekt tilveiebringeroppfinnelsen et antistoff som spesifikt hemmer bindingen av HLA-C-molekyler tilKIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptorer. Beskrivelsen tilveiebringer også et antistoffsom fasiliterer MK-celleaktivitet in vivo.

Fordi i det minste én av KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 er tilstede i det minste omtrent 90 % av den humane populasjon er de mer foretrukne antistoffer beskrevet heri i stand til å fasilitere NK-celleaktivitet mot de fleste HLA-C-allotypeassosierte celler,henholdsvis gruppe 1 HLA-C-allotyper og gruppe 2 HLA-C-allotyper. Preparateneifølge beskrivelsen kan følgelig anvendes for effektivt å aktivere eller å forsterke

NK-celleeffekten i de fleste humane individer, vanligvis i omtrent 90 % av dehumane individene eller mer. Ett enkelt antistoffpreparat som beskrevet heri kan følgelig anvendes for å behandle de fleste mennesker og det er sjelden et behov for å bestemme allelegrupper eller å anvende antistoffcocktailer.

Beskrivelsen viser, for første gang, at kryssreaktive og nøytraliserende antistoffer mot inhibitoriske KIR kan dannes, og at slike antistoffer tillater effektiv aktivering av NK-celler i et bredt spekter av humane grupper.

Et spesifikt formål ved den foreliggende beskrivelsen er derfor et antistoff, hvor nevnte antistoff spesifikt binder både til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humanereseptorer og reverserer inhibering av NK-cellecytotoksisitet mediert gjennom disseKIR. I én utførelsesform konkurrerer antistoffet med monoklonalt antistoff DF200 fremstilt av hybridom DF200. Eventuelt er nevnte antistoff som konkurrerer med antistoff DF200 ikke antistoff DF200.

Antistoffet kan også konkurrere med det monoklonale antistoffet NKVSF1, eventuelt hvori antistoffet som konkurrerer med antistoff NKVSF1 ikke er antistoffet NKVSF1.

Antistoffet kan også konkurrerer med antistoff 1-7F9.

Fortrinnsvis er nevnte antistoffer kimere antistoffer, humaniserte antistoffer eller humane antistoffer.

Betegnelsen "konkurrerer med", med henvisning til et spesifikt monoklonalt antistoff (f.eks. DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183), betyr at antistoffetkonkurrerer med det monoklonale antistoffet (f.eks. DF200, NKSVF1, 1-7F9, EB6,GLI83) i en bindingsanalyse som anvender enten rekombinante KIR-molekylereller overflateuttrykte KIR-molekyler. Dersom et antistoff reduserer bindingen avDF200 til et KIR-molekyl i en bindingsanalyse konkurrerer f.eks. antistoffet medDF200. Et antistoff som "konkurrerer" med DF200 kan konkurrere med DF200 for binding til KIR2DL1-human reseptor, KIR2DL2/3-human reseptor eller bådeKIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer.

Beskrivelsen tilveiebringer et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3humane reseptorer, reverserer inhiberingen av NK-celletoksisitet mediert gjennomdisse KIR og konkurrerer med DF200, 1-7F9 eller NKVSF1 for bindingen tilKIR2DLl-human reseptor, KIR2DL2/3-humane reseptor eller både KIR2DL1- ogKIR2DL2/3-humane reseptorer. Eventuelt er nevnte antistoff ikke NKVSF1.Eventuelt er antistoffet et kimert, humant eller humanisert antistoff.

Beskrivelsen tilveiebringer et antistoff som binder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3humane reseptorer, reverserer inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet mediertgjennom disse KIR og konkurrerer med EB6 for bindingen til KIR2DL1-humanreseptor, konkurrerer med GLI83 for bindingen til KIR2DL2/3-human reseptor eller

konkurrerer med både EB6 for bindingen til KIR2DL1-human reseptor og GLI83for bindingen til KIR2DL2/3-human reseptor. Eventuelt er nevnte antistoff ikkeNKVSF1; eventuelt er nevnte antistoff ikke DF200. Eventuelt er nevnte antistoff et kimert, humant eller humanisert antistoff.

I et fordelaktig aspekt tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som konkurrerer med DF200 og gjenkjenner, binder til eller har immunspesifisitet for vesentlig eller essensielt den samme, eller den samme epitop, eller "epitopsete" på et KIR-molekylsom det monoklonale antistoffet DF200. Fortrinnsvis er KIR-molekylet enKIR2DL1-human reseptor eller en KIR2DL2/3-human reseptor.

Et bestemt formål ved denne beskrivelsen angår et antistoff, hvori nevnte antistoff binder en kjent determinant tilstede i både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humanereseptorer og som reverserer inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet mediertgjennom disse KIR. Antistoffet binder nærmere bestemt til vesentlig den samme epitopen på KIR som det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridom DF200 eller antistoff NKVSF1 fremstilt av hybridomen NKVSF1, hvori antistoffet ikke er NKVSF1.

I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ifølge denne beskrivelsen et monoklonalt antistoff. Det mest foretrukne antistoffet ifølge denne beskrivelsen er det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridom DF200.

Hybridomen som fremstiller antistoffet DF200 er deponert ved CNCM culture collection, som identifiseringsnummer "DF200", registreringsnummer CNCM 1-3224, registrert 10. juni 2004, Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex15, Frankrike. Antistoffet NKVSF1 er tilgjengelig fra Serotec (Cergy SainteChristope, Frankrike), katalogreferansenummer MCA2243. NKVSF1 er også kalt pan2D mAb heri.

Beskrivelsen tilveiebringer også funksjonelle fragmenter og derivater av antistoffene beskrevet heri, med vesentlig tilsvarende antigenspesifisitet og aktivitet (f.eks. som kan kryssbinde med foreldreantistoffet og som forsterker den cytotoksiske aktivitetseffekten av NK-celler som uttrykker inhibitoriske KIRreseptorer), inkludert, uten begrensning, et Fab-fragment, et Fab’2-fragment, etimmunadhesin, et diastoff (diabody), en CDR, en ScFv. Videre kan antistoffene ifølge beskrivelsen være humaniserte, humane eller kimere.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffderivater som omfatter et antistoff som beskrevet heri som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, et radionuklid, en detekterbar enhet (f.eks. fluor) eller en fast støtte.

Beskrivelsen tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff som beskrevet ovenfor, et fragment derav eller et derivat av disse. Følgelig angår

beskrivelsen også anvendelsen av et antistoff som beskrevet heri i en fremgangsmåte for fremstillingen av et medikament. Nevnte medikament eller det farmasøytiske preparat for behandlingen av en kreft eller andre prolifererende sykdommer, en infeksjon eller for anvendelse i transplantasjon.

Beskrivelsen tilveiebringer et preparat som omfatter et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnteantistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NKcellecytotoksisitet på NK-celler som uttrykker i det minste én av de nevnte to ulikehumane inhibitoriske KIR-reseptorene, hvori nevnte antistoff er inkorporert i etliposom. Eventuelt omfatter nevnte preparat en ytterligere forbindelse valgt fra et nukleinsyremolekyl for å levere gener for genterapi; et nukleinsyremolekyl for levering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for å undertrykke et gen i en NKcelle; eller et toksin eller et medikament for målrettet dreping av NK-cellerytterligere inkorporert i nevnte liposom.

Beskrivelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å regulere human NKcelleaktivitet in vitro, ex vivo eller in vivo, som omfatter å bringe humane NKceller i kontakt med en effektiv mengde av et antistoff som beskrevet heri, et fragment av et slikt antistoff, et derivat derav, eller et farmasøytisk derivat som omfatter i det minste ett av disse. Foretrukne fremgangsmåter omfatter administrering av en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat som beskrevet heri og er rettet mot å øke den cytotoksiske aktiviteten til humane NK-celler, mestforetrukket ex vivo eller in vivo, i et individ med en kreft, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer beskrivelsen en hybridom som omfatter: (a) en B-celle fra en pattedyrvert (typisk en ikke-human pattedyrvert) som er immunisertmed et antigen som omfatter en epitop som er tilstede på et inhibitorisk KIRpolypeptid fusert til (b) en udødeliggjort celle (f.eks. en myelomcelle), hvori nevnte hybridom fremstiller et monoklonalt antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorer og som er i stand til i det minste vesentlig ånøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon avNK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIRreseptorer. Eventuelt fremstiller ikke nevnte hybridom det monoklonale antistoffet NKVSF1. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff KIR2DE1- og KIR2DE2/3reseptorer. Fortrinnsvis binder nevnte antistoff en kjent determinant tilstede på KIR2DE1 og KIR2DE2/3. Fortrinnsvis fremstiller nevnte hybridom et antistoff som hemmer bindingen av et HEA-c-allelmolekyl med en Eyr-rest i posisjon 80 i enhumant KIR2DEl-reseptor og bindingen av et HEA-C-allelmolekyl med en Asn-resti posisjon 80 i human KIR2DE2/3-reseptorer. Fortrinnsvis fremstiller nevntehybridom et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet DF200 fremstilt av hybridomen DF200 på enten KIR2DE1

eller KR2DL2/3 eller både KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Et eksempel på en slik hybridom er DF200.

Beskrivelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille et antistoff som kryssbinder med flere KIR2DL-genprodukter og som nøytraliserer den inhibitoriskeaktiviteten til slike KIR, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene:

(a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter etKIR2DL-polypeptid;

(b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr, hvori nevnte antistoffer binder til nevnte KIR2DL-polypeptid;

(c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssbinder med i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter; og

(d) å velge ut antistoffer fra (c) som forsterker NK-celleaktiviteten. I énutførelsesform er det nevnte ikke-humane pattedyret et transgent dyr som erfremstilt for å kunne uttrykke et humant antistoffrepertoar (f.eks. et ikke-humantpattedyr som omfatter et humant immunoglobulinloki og native immunoglobulin gendelesjoner, slik som en Xenomouse™ (Abgenix - Fremont, CA, USA) ellerikke-humant pattedyr som omfatter et minilokus av humane Ig-kodende gener, sliksom HuMab-mus™ (Medarex - Princeton, NJ, USA). Eventuelt omfatterfremgangsmåten ytterligere utvelgelse av et antistoff som binder et primat, fortrinnsvis et cynomologusape, NK-celle- eller KIR-polypeptid. Beskrivelsenomfatter ytterligere en fremgangsmåte for å vurdere et antistoff, hvori et antistoff fremstilt ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåten administreres til en primat, fortrinnsvis en cynomologusape, fortrinnsvis hvori apen observeres for nærværet eller fraværet av en indikasjon på toksisitet av antistoffet.

Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter,hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NKcellecytotoksisitet på en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minsteto ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori fremgangsmåtenomfatter trinnene:

a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter etinhibitorisk KIR-polypeptid;

b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoff binder til nevnte KIR-polypeptid;

c) velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter og velge ut antistoffer fra (c) somer i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet i enpopulasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to ulike humaneinhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori rekkefølgen på trinn (c) og (d) erlikegyldige og ethvert antall trinn eventuelt kan repeteres én eller flere ganger.

Fortrinnsvis er det inhibitoriske KIR-polypeptidet som er anvendt for immuniseringet KIR2DL-polypeptid og antistoffet som er utvalgt i trinn (c) kryssreagerer med idet minste KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Fortrinnsvis gjenkjenner nevnte antistoff en kjent determinant som er tilstede på i det minste to ulike KIR-reseptorgenprodukter;mest foretrukket er nevnte KIR KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Eventuelt omfatter nevnte fremgangsmåte ytterligere utvelgelse av et antistoff som binder en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Eventuelt omfatterden angitte fremgangsmåten ytterligere en fremgangsmåte for å evaluere et antistoff, hvori et antistoff fremstilt ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåte administreres til en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, fortrinnsvis hvor apen observeres for nærværet eller fraværet av en indikasjon på toksisitet av antistoffet.

I de ovenfor beskrevne fremgangsmåter er antistoffet utvalgt i trinn c) eller d) eventuelt ikke NKVSF1. Antistoffet fremstilt i trinn (b) i de ovenfor angitte fremgangsmåter er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff. Fortrinnsvis hemmer antistoffet utvalgt i trinn (c) i de ovenfor angitte fremgangsmåter bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL-reseptor,og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humantKIR2DL2/3-reseptorer. Antistoffene utvalgt i trinn (d) i de ovenfor angittefremgangsmåter forårsaker fortrinnsvis en økning i NK-cytotoksisitetseffekt, f.eks.enhver vesentlig økning, eller i det minste 5 %, 10%, 20%,30% eller større økning i NK-cytotoksisitetseffekt, f.eks. i det minste omtrent 50 % økning i målNK-cytotoksisitet (f.eks. i det minste 60 %, i det minste omtrent 70 %, i det minsteomtrent 80 %, i det minste omtrent 85 %, i det minste omtrent 90 %, eller i det minste omtrent 95 % (slik som f.eks. omtrent 65-100 %) økning i NKcellecytotoksisitetseffekt). Antistoffet binder fortrinnsvis til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Eventuelt eller alternativt omfatter nevnte fremgangsmåter også det ytterligere trinnet å fremstille fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffene, danne derivater av de utvalgte monoklonale antistoffene (f.eks. gjennom konjugering med et radionuklid, cytotoksisk middel, markørmolekyl eller lignende), eller å danne derivater av antistoffragmenter fremstilt fra eller som omfatter sekvenser som korresponderer til sekvensene i slike monoklonale antistoffer.

Beskrivelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter,hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NKcellecytotoksisitet på en populasjon av NK-celler som uttrykker det nevnte i detminste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevntefremgangsmåte omfatter trinnene:

(a) å velge, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff eller et antistoffragment som kryssreagerer med i det minste to ulike humane inhibitoriske

KIR2DL-reseptorgenprodukter, og

(b) å velge et antistoff fra (a) som er i stand til å nøytralisere KIR-mediertinhibering av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykkernevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter.Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Eventuelt er nevnte antistoff utvalgt i trinn (b) ikke NKVSF1. Antistoffet utvalgt i trinn (b) hemmer fortrinnsvis bindingen av et HLA-Callelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DLl-reseptor ogbindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humantKIR2DL2/3-reseptorer. Fortrinnsvis forårsaker antistoffet utvalgt i trinn (b) enforsterkning av NK-cytotoksisitet, f.eks. enhver vesentlig forsterkning, eller i detminste 5 %, 10 %, 20 %, 30 % eller større forsterkningi NK-cytotoksisit eks. en idet minste omtrent 50 % forsterkning av mål-NK-cytotoksisit(f.eks. i det minsteomtrent 60 %, i det minst 70 %, i det minste 80 %, i det minste 90 %, eller i det minste 95 % (slik som f.eks. omtrent 65-100 %) forsterkning av NKcellecytotoksisitet). Fortrinnsvis binder antistoffet til vesentlig den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Eventuelt omfatter fremgangsmåten det ytterligere trinn å danne fragmenter av de utvalgte monoklonale antistoffer, fremstille derivater av de utvalgte monoklonale antistoffer, eller å danne derivater av utvalgte monoklonale antistoffragmenter.

I tillegg tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å fremstille et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter,hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert inhibering av NKcellecytotoksisitet i en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevnte i det minste toulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte fremgangsmåteomfatter trinnene:

a) å dyrke en hybridom ifølge beskrivelsen under betingelser som tillater fremstillingen av nevnte monoklonale antistoff; og

b) separere nevnte monoklonale antistoff fra nevnte hybridom. Eventuelt omfatter fremgangsmåten det ytterligere trinn å danne fragmenter av nevnte monoklonale antistoff, danne derivater av nevnte monoklonale antistoff eller danne derivater av slike monoklonale antistoffragmenter. Fortrinnsvis binder antistoffet en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.

Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder til i det minste to ulike humane inhibitoriske KIRreseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediertinhibering av NK-cellecytotoksisitet i en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevntei det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvor nevntefremgangsmåte omfatter trinnene:

a) å isolere fra en hybridom ifølge beskrivelsen en nukleinsyre som koder for

nevnte monoklonale antistoff;

b) eventuelt modifisere nevnte nukleinsyre for på den måten å oppnå en modifisert nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder for et modifisert eller derivatisert antistoff som omfatter en aminosyresekvens som svarer til en funksjonell sekvens i det monoklonale antistoffet eller er vesentlig tilsvarende til dette (f.eks., er i det minste 65 %, i det minste omtrent 75 %, i det minte omtrent 85 %, i det minste omtrent 90 %, i det minste omtrent 95 % (slik som omtrent 70-99 %)identisk til en slik sekvens) utvalgt fra et humanisert antistoff, et kimert antistoff, et enkeltkjedeantistoff, et immunreaktivt fragment av et antistoff, eller et fusjonsprotein som omfatter et slikt immunreaktivt fragment;

c) sette nevnte nukleinsyre eller modifiserte nukleinsyre (eller beslektede nukleinsyrer som koder for den samme aminosyresekvensen) inn i en ekspresjons vektor, hvori nevnte kodede antistoff eller antistoffragment kan uttrykkes når nevnte ekspresjons vektor er tilstede i en vertscelle som dyrkes under passende betingelser;

d) transfektere en vertscelle med nevnte ekspresjons vektor, hvori nevnte vertscelle ikke ellers produserer immunglobulinprotein;

e) dyrke nevnte transfekterte vertscelle under betingelser som forårsaker ekspresjon av nevnte antistoff eller antistoffragment; og

f) isolere antistoffet eller antistoffragmentet fremstilt av nevnte transfekterte evertscelle. Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant som er tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.

Det skal forstås at beskrivelsen også tilveiebringer et preparat som omfatter et antistoff som binder til i det minte to ulike humane inhibitoriske KIRreseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff kan nøytralisere KIR-mediertinhibering av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker i det minste én av denevnte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorene, hvor nevnte antistoff ertilstede i en mengde som effektivt og detekterbart forsterker NK-cellecytotoksisiteten pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler; og en farmasøytiskakseptabel bærer eller eksipient. Fortrinnsvis binder antistoffet til en kjent determinant tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Nevnte preparat kan eventuelt ytterligere omfatte et andre terapeutisk middel valgt fra f.eks. et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som binder til og hemmer en inhibitorisk KIR-reseptor, et antiinfeksjonsmiddel, et målbindendemiddel eller en adjunktforbindelse. Fordelaktige immunmodulerende midler kan velges fra IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-32, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa,TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF,IFN-alfa, IFN-beta eller IFN-gamma. Eksempler på nevnte kjemoterapeutiske

middel inkluderer alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, daunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksotere, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin,kombretastatin(er) andre vinkaalkyloider og derivater eller forløpermedikamenter derav. Eksempler på hormonelle midler inkluderer leuprorelin, goserelin, triptorelin, buserelin, tamoksifen, toremifen, flutamid, nilutamid, cyprosteron bikalutamidanastrozol, eksemestan, letrozol, fadrozol medroksy, klormadinon, megestrol, andre LHRH-agonister, andre anti-østrogener, andre anti-androgener,andre aromataseinhibitorer og andre progestagener. Fortrinnsvis er nevnte andre antistoff som binder til en epitop på en inhibitorisk KIR-reseptor som er forskjelligfra epitopen som binder til nevnte antistoff som binder til en kjent determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter.

Beskrivelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å påvise forsterkning av NK-celleaktivitet i en pasient med behov for slik økning, omfattende trinnene åadministrere til nevnte pasient et preparat ifølge beskrivelsen. En pasient med behov for NK-celleaktivitetseffektforsterkning kan være enhver pasient som har ensykdom eller lidelse hvor slik økning kan promotere, forsterke og/eller indusere en terapeutisk effekt (eller promotere, forsterke og/eller indusere en slik effekt i det minste i en vesentlig andel av pasientene med sykdommen eller lidelsen og vesentlig lignende egenskaper som pasienten - som kan bestemmes gjennom f.eks.kliniske forsøk). En pasient med behov for slik behandling kan lide av f.eks. kreft, andre proliferative sykdommer, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom. Fortrinnsvis omfatter nevnte fremgangsmåte det ytterligere trinn å administrere til nevnte pasient et ytterligere passende terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonmiddel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som binder til og hemmer en inhibitorisk KIR-reseptor, et antiinfeksjonsmiddel, et målbindendemiddel eller en adjunktforbindelse hvor nevnte ytterligere terapeutiske middel administreres til pasienten som én enkelt doseringsform sammen med nevnte antistoff, eller som separate doseringsformer. Doseringen av antistoffet (eller antistoffragmentetZ-derivatet) og doseringen av det ytterligere terapeutiske midletsamlet er tilstrekkelig for å påviselig indusere, promotere og/eller forsterke en terapeutisk respons i pasienten som omfatter økningen av NK-celleaktivitetseffekt.Når de administreres separat er det ønskelig at antistoffet, fragmentet eller derivatet og det ytterligere terapeutiske midlet administreres under betingelser (f.eks. med hensyn på timing, antall doser, osv.) som resulterer i en påviselig kombinert terapeutisk fordel for pasienten.

Ytterligere omfattet av den foreliggende beskrivelse er antistoffer som beskrevet heri som er i stand til å spesifikt binde ikke-human primat, fortrinnsvis ape, NKceller og/eller ape-KIR-reseptorer. Fremgangsmåter for å evaluere toksisitet,dosering og/eller aktivitet eller effektivitet av antistoffer ifølge oppfinnelsen som er kandidatmedikamenter er også omfattet av beskrivelsen. Beskrivelsen omfatter en fremgangsmåte for å påvise en dose av et antistoff som er toksisk for et dyr eller målvev ved å administrere et antistoff som beskrevet heri til et ikke-humantmottakerprimatdyr med NK-celler og vurdere enhver toksisk eller skadelig ellerbivirkning av midlet på dyret eller fortrinnsvis på målvevet. Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er toksisk for et dyr eller målvev ved å administrere et antistoff som beskrevet heri til en ikke-humanmottakerprimatdyr med NK-celler og vurdere enhver toksisk eller skadelig ellerbivirkninger av midlet på dyret, eller fortrinnsvis på et målvev. Også beskrevet heri er en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er effektivt i behandling av en infeksjon, sykdom eller tumor ved å administrere et antistoff beskrevet heri til en ikke-humant primatmodell for infeksjon, sykdom eller kreft, å identifisereantistoffet som lindrer infeksjonen, sykdommen eller kreften eller et symptom derav. Fortrinnsvis er antistoffet beskrevet heri et antistoff som (a) kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer på overflaten til humaneNK-celler, og (b) kryssreagerer med NK-celler eller en KIR-reseptor på en ikkehuman primat.

Ytterligere omfatter den foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for å påvise nærværet av NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på deres celleoverflate i enbiologisk prøve eller i en levende organisme, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene:

a) å bringe nevnte biologiske prøve eller levende organisme i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen, hvori nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet til en påviselig enhet; og

b) påvise nærværet av nevnte antistoff i nevnte biologiske prøve eller levende organisme.

Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å rense fra en prøve av NKceller som bærer en inhibitorisk KIR på deres celleoverflate, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene:

a) å bringe nevnte prøve i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen under betingelser som tillater at nevnte NK-celler som bærer en inhibitorisk KIR på derescelleoverflate binder til nevnte antistoff, hvori nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet til en fast støtte (f.eks. en kule, en matriks, osv.); og

b) eluere nevnte bundede NK-celler fra nevnte antistoff konjugert ellerkovalent bundet til en fast støtte.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer beskrivelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av dette som omfatte den lette variable regionen eller én eller flere lette variable regioner CDR av antistoff DF200 eller antistoff Pan2D som illustrert i fig. 12. I enda et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av slike som omfatter en sekvens som er svært lik til hele eller vesentlig hele den lette variable regionsekvensen til DF200 eller Pan2D eller én eller flere av de lette variable regioner CDR til én eller begge av disse antistoffene.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer beskrivelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av disse som omfatter den tunge variable regionen eller én eller flere lette variable regioner, CDR, til antistoff DF200 som illustrert i fig. 13. I enda et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av slike som omfatter en sekvens som er svært lik til hele eller vesentlig hele den tunge variable regionsekvensen til DF200.

Disse og ytterligere fordeler og trekk ved oppfinnelsen er ytterligere beskrevet andre steder heri.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1viser monoklonalt antistoff DF200 som binder til en kjent determinant på ulike humane KIR2DL-reseptorer.

Fig. 2viser monoklonalt antistoff DF200 som nøytraliserer KIR2DL-medierthemming av KIR2DL1-positive NK-cellecytotoksisitet på Cw4-positive målceller.

Fig. 3viser monoklonalt antistoff DF200, et Fab-fragment av DF200 og KIR2DL1eller KIR2DL2/3-spesifikke, konvensjonelle antistoffer som nøytraliserer denKIR2DL-medierte hemmingen av KIR2DL1-positive NK-cellecytotoksisitet påCw4-positive målceller og den KIR2DL-medierte hemmingen av KIR2DL2/3positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw3-positive målceller.

Fig. 4viser rekonstitusjon av cellelysis av NK-kloner av HLA Cw4-positivemålceller i nærværet av F(ab’)2-fragmenter av DF200 og EB6-antistoffer.

Fig. 5og 6 viser monoklonale antistoffer DF200, NKVSF1 (pan2D), humane antistoffer 1-7F9, 1-6F5 og 1-6F1 og KIR2DL1- eller KIR2DL2/3-spesifikkekonvensjonelle antistoffer som nøytraliserer KIR2DL-mediert hemming avKIR2DL1-positiv NK-cellecytotoksisitet på Cw4-positive målceller (Cw4transfekterte celler i fig. 5 og EBV-celler i fig. 6).

Fig. 7 viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd gjennom overflateplasmonresonans (BIAcore®)analyse med anti-KIR-antistoffer mot KIR2DL1, hvor overlappende sirkler angiroverlapp i binding til KIR2DL1. Resultater viser at 1-7F9 er kompetitiv med EB6og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200 på KIR2DL1. Antistoff 1-4F1 er på sinside kompetitiv med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7F9. Antistoff NKVSF1

konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1. DF200konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1.

Fig. 8viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd ved hjelp av BIAcore®-analyse med anti-KIRantistoffer mot KIR2DL3, hvor overlappende sirkler angir overlapp i binding til KIR2DL3. Resultatene viser at 1-4F1 er kompetitiv med NKVSF1, DF200, gil83 og1-7F9 på KIR2DL3. 1-7F9 er kompetitiv med DF200, gll83, og 1-4F1, men ikkemed NKVSF1 på KIR2DL3. NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GL183,men ikke med 1-7F9, på KIR2DL3. DF200 konkurrer med NKVSF1, 1-4F1, og1-7F9, men ikke med GL183, på KIR2DL3.

Fig. 9viser et epitopkart som viser resultatene av kompetitive bindingseksperimenter oppnådd ved hjelp av BIAcore®-analyse med anti-KIRantistoffer mot KIR2DS1, hvor overlappende sirkler angir overlapp i binding til KIR2DS1. Resultatene viser at antistoff 1-4F1 er kompetitivt med NKVSF1, DF200og 1-7F9 på KIR2DS1. Antistoff 1-7F9 er kompetitivt med 1-4F1 men ikkekompetitivt med DF200 og NKVSF1 på KIR2DS1. NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1. DF200 konkurrerer medNKVSF1 og 1-4F1 men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1.

Fig. 10viser NKVSF1 (pan2D) mAb-titrering som demonstrerer bindingen av mAbtil cynomolgus NK-celler. Cynomolgus NK-celler (NK bulk dag 16) ble inkubertmed ulike mengder Pan2D mAb etterfulgt av PE-konjugert geite F(ab’)2-fragmenterav anti-mus IgG (H+L)-antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt med enisotypisk kontroll (renset muse IgGl). Prøvene ble utført i duplikat. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet = MEI.

Fig. 12 tilveiebringer en komparativ sammenstilling av aminosyresekvensene til de lette variable regionene og lette variable regionene CDR til antistoffene DF200 og Pan2D mAb.

Fig. 13 tilveiebringer den tunge variable regionen til antistoff DF200.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Antistoffer

Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer nye antistoffer og fragmenter eller derivater derav som binder kjente determinanter av humane inhibitoriske KIRreseptorer, fortrinnsvis en determinant som er tilstede på i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter og forårsaker økning av NK-celleekspresjonseffekt av i detminste én av de to KIR-reseptorene. Oppfinnelsen beskriver for første gang at slikekryssreagerende og nøytraliserende antistoffer kan fremstilles, noe som representerer et uventet resultat og åpner mange veier mot nye og effektive NK

baserte terapier, spesielt for humane individer. I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ikke monoklonalt antistoff NKVSF 1.

Innenfor betydningen av denne oppfinnelsen er en "kjent determinant" en determinant eller en epitop som deles av flere genprodukter av de humane inhibitoriske KIR-reseptorer. Den felles determinant deles fortrinnsvis av i detminste to medlemmer av KIR2DL-reseptorgruppen. Mer foretrukket delesdeterminanten av i det minste KIR2DL1 og KIR2DL/3. Visse antistoffer som beskrevet heri kan i tillegg til å gjenkjenne flere KIR2DL-genprodukter ogsågjenkjenne determinanter som er tilstede på andre inhibitoriske KIR, slik som genproduktet av KIR3DL-reseptorgruppen. Determinanten eller epitopen kanrepresentere et peptidfragment eller en konformasjonsepitop som deles av nevnte medlemmer. Antistoffet som beskrevet heri binder spesifikt til vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av det monoklonale antistoffet DF200. Denne determinanten er tilstede på både KIR2DL1 og KIR2DL2/3.

Innenfor rammen av oppfinnelsen betyr betegnelsen antistoff som "binder" en felles determinant et antistoff som binder nevnte determinant med spesifisitet og/eller affinitet.

Uttrykket "antistoff’ som anvendt heri viser til polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter eller derivater av nevnte polyklonale og monoklonale antistoffer om ikke annet er klart og utvetydig angitt. Avhengig av typen konstant domene i de tung kjedene fordeles fullengde antistoffer vanligvis til én av fem hovedklasser: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Flere av disse deles ytterligere i underklasser eller isotyper, slik som IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 og lignende. Det konstante tunge kjededomenet som svarer til de ulike klassene av immunglobuliner kalles henholdsvis "alfa", "delta", "epsilon", "gamma" og "mu". Underenhetsstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene av de ulike immunglobulinklassene er velkjent. IgG og/eller IgM er de foretrukne antistoffklassene som anvendes heri fordi de er de mest vanlige antistoffene i den fysiologiske situasjonen og fordi de er de enkleste å lage i et laboratorium.

Fortrinnsvis er antistoffet som beskrevet heri et monoklonalt antistoff. Fordi ett av målene ved beskrivelsen er å blokkere interaksjonen av en inhibitorisk KIR og dets tilsvarende HLA-ligand in vivo uten å avvike fra NK-cellene, isotypene svarende tilFc-reseptorene som medierer lav effektorfunksjon, slik som IgG4, typiskforetrukket.

Antistoffene beskrevet heri kan fremstilles ved hjelp av flere teknikker som er kjent for fagmannen. Vanligvis fremstilles de ved immunisering av et ikke-humant dyr,fortrinnsvis en mus, med et immunogen som omfatter et inhibitorisk KIRpolypeptid, fortrinnsvis et KIR2DL-polypeptid, mer foretrukket et humant KIR2DLpolypeptid. Det inhibitoriske KIR-polypeptidet kan omfatte fullengdesekvensen til

et humant inhibitorisk KIR-polypeptid eller et fragment eller derivat derav,vanligvis et immunogent fragment, dvs. en del av polypeptidet som omfatter en epitop eksponert på overflaten av cellene som uttrykker en inhibitorisk KIRreseptor. Slike fragmenter inneholder vanligvis i det minste 7 konsekutive aminosyrer fra den modne polypeptidsekvensen, enda mer foretrukket i det minste 10 konsekutive aminosyrer derav. Fragmenter utledes vanligvis fra det ekstracellulære domenet til reseptoren. Enda mer foretrukket er et humant KIR2DLpolypeptid som inkluderer i det minste én, mer foretrukket begge de ekstracellulære Ig-domenene til fullengde KIRDL-polypeptidet og som er i stand til å etterligne idet minste én konformasjonsepitop tilstede i en KIR2DL-reseptor. I andreutførelsesformer omfatter nevnte polypeptid i det minste omtrent 8 konsekutive aminosyrer fra et ekstracellulært Ig-domene fra aminosyreposisjonene 1-224 tilKIR2DL1-polypeptidet (aminosyrenummerering i henhold til PROW-hjemmesidensom beskriver KIR-genfamilien,

.nchi.nh-n.mh.go^ /prov3260 i 3082,him ).

I en mest foretrukket utførelsesform omfatter immunogenet et villtypehumant KIR2DL-polypeptid i en lipidmembran, vanligvis på overflaten av en celle. I enspesifikk utførelsesform omfatter immunogenet intakte NK-celler, spesielt intaktehumane NK-celler, eventuelt behandlet eller lysert.

Immuniseringstrinnet av et ikke-humant dyr med et antigen kan utføres på enhvilken som helst kjent måte for å stimulere fremstillingen av antistoffer i en mus (se f.eks. E. Harlow og D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Immunogenet suspenderes eller løses deretter i en buffer, eventuelt med en adjuvans, slik som fullstendig Freunds adjuvans. Fremgangsmåter for å påvise mengden immunogen, type buffere og mengde adjuvans er velkjent for fagmannen på området og er ikke begrenset på noen måte ifølge oppfinnelsen. Disse parameterne kan være forskjellige for ulike immunogener men kan lett kartlegges.

Tilsvarende er immuniseringsstedet og -frekvensen som er tilstrekkelig for åstimulere produksjonen av antistoffer velkjent for fagmannen på området. I en typisk immuniseringsprotokoll injiseres de ikke-humane dyrene intraperitonealt medet antigen på dag 1 og igjen omtrent 1 uke senere. Dette etterfølges av gjentatte injeksjoner av antigenene rundt dag 20, eventuelt med adjuvans slik som ufullstendig Freunds adjuvans. Gjentagelsesinjeksjonene utføres intravenøst og kan repeteres flere påfølgende dager. Dette etterfølges av en stor injeksjon på dag 40 (boosterinjeksjon), enten intravenøst eller intraperitonealt, vanligvis uten adjuvans. Denne protokollen resulterer i produksjonen av antigenspesifikke antistoffproduserende B-celler etter omtrent 40 dager. Andre protokoller kan ogsåutnyttes så lenge de resulterer i produksjonen av B-celler som uttrykker et antistoffrettet mot antigenet anvendt i immunisering.

For polyklonal antistoffremstilling oppnås serum fra et immunisert ikke-humant dyrog antistoffene som er tilstede deri isoleres ved hjelp av velkjente teknikker. Serumet kan affinitetsrenses ved å anvende et hvilket som helst av immunogenene beskrevet ovenfor bundet til en fast støtte for slik å oppnå antistoffer som reagerer med inhibitoriske KIR-reseptorer.

I en alternativ utførelsesform isoleres lymfocytter fra et ikke-immunisert, ikkehumant pattedyr, dyrkes in vitro og som deretter eksponeres for immunogenet i cellekultur. Lymfocyttene høstes deretter og fusjonstrinnet beskrevet ovenfor utføres.

For monoklonale antistoffer er det neste trinnet isoleringen av splenocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret og påfølgende fusjon av disse splenocyttenemed en udødeliggjort celle for å danne en antistoffproduserende hybridom. Isoleringen av splenocyttene fra et ikke-humant pattedyr er velkjent for fagmannenpå området og omfatter vanligvis fjerning av milten fra et bedøvet ikke-humantpattedyr, å dele dette mindre deler og presse splenocyttene fra miltkapselen og gjennom et nylonnett i et cellefiltreringsapparat over i en passende buffer for slik å produsere en enkeltcellesuspensjon. Cellene ble vasket, sentrifugert og igjen suspendert i en buffer som lyserer alle røde blodceller. Løsningen sentrifugeres igjen og de gjenværende lymfocyttene i pelleten suspenderes igjen i fersk buffer.

Når lymfocyttene er isolert og presentert i enkeltcellesuspensjon kan lymfocyttene fuseres til en udødeliggjort cellelinje. Dette er vanligvis en musemyelomcellelinje selv om mange andre udødeliggjorte cellelinjer er anvendelig for å danne hybridomer også er kjente. Foretrukne musemyelomlinjer inkluderer men er ikke begrenset til de utledet fra MOPC-22- og MPC-11-musetumorer tilgjengelig fraSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, X63 Ag8653 og SP-2-celler tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville,Maryland, USA. Fusjonen gjennomføres ved å anvende polyetylenglykol eller lignende. De resulterende hybridomene styrkes deretter i selektivt medium som inneholder én eller flere substanser som hemmer veksten eller overlevelsen av de ikke-fuserte, foreldremyelomcellene. Dersom foreldremyelomcellene manglerenzymet hypoksyxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT) vil f.eks. cellekulturmediet for hybridomene vanligvis inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) som vesentlig forhindrer veksten avHGPRT-manglende celler.

Hybridomer dyrkes vanligvis på et forlag av makrofager. Makrofagene er fortrinnsvis fra avfall fra det ikke-humane pattedyret anvendt for å isoleresplenocytter og er vanligvis behandlet med ufullstendig Freunds adjuvans eller lignende flere dager før utsåing av hybridomene. Fusjonsmetoder er beskrevet i

Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", sider 59-103 (AcademicPress, 1986).

Cellene tillates å dyrkes i seleksjonsmediet i et tilstrekkelig tidsrom for kolonidannelse og antistoffproduksjon. Dette tar vanligvis mellom omtrent 7 og omtrent 14 dager. Hybridomkoloniene analyseres deretter for produksjon av antistoffer som kryssreagerer med flere inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter.Denne analysen er vanligvis en kolorimetrisk ELISA-type analyse selv om enhveranalyse kan anvendes som kan tilpasses til brønnene som hybridomene dyrkes i. Andre analyser inkluderer immunpresipitering og radioimmunanalyse. De positive brønnene for den ønskede antistoffpreduksjonen undersøkes for å bestemme om én eller flere ulike kolonier er tilstede. Dersom mer enn én koloni er tilstede kan cellene klones igjen og dyrkes for å sikre at kun én enkelt celle har gitt opphav til kolonien som produserer det ønskede antistoffet. Positive brønner med en enkel tydelig koloni klones vanligvis igjen og analyseres igjen for å sikre at kun ett monoklonalt antistoff påvises og produseres. Antistoffer som også produseres ved seleksjon av kombinatoriske biblioteker av immunglobuliner som beskrevet f.eks. i Ward et al., Nature, 341 (1989), side 544).

Antistoffene som beskrevet heri er i stand til å nøytralisere den KIR-medierteinhiberingen av NK-cellecytotoksisitet; spesielt inhiberingen mediert gjennomKIR2DL-reseptorer og nærmere bestemt i det minste både KIR2DL1- ogKIR2DL2/3-inhibering. Disse antistoffene er følgelig "nøytraliserende" eller"inhibitoriske" antistoffer i betydningen av at de blokkerer, i det minste delvis og påviselig, hemmingen av signalreaksjonsveien mediert av KIR-reseptorer når dereagerer med MHC klasse I-molekyler. Enda mer viktig vises denne inhibitoriskeaktiviteten med hensyn til flere typer inhibitoriske KIR-reseptorer, fortrinnsvis flereKIR2DL-reseptorgenprodukter, og mer foretrukket i det minste både KIR2DL1 ogKIR2DL2/3 slik at disse antistoffene kan anvendes i ulike individer med høy effektivitet. Hemmingen av KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet kanvurderes gjennom ulike analyser eller tester, slik som bindings- eller cellulæreanalyser.

Med én gang antistoffet som kryssreagerer med multiple inhibitor-KIR-reseptorer eridentifisert kan det testes dets evne til å nøytralisere hemmingseffekten av disse KIR-reseptorene i intakte NK-celler. I en spesifikk variant kan den nøytraliserendeaktiviteten illustreres gjennom den kapasitet nevnte antistoff har for å rekonstituere lysis av KIR2DL-positive NK-kloner av HLA-C-positive mål. I en annen spesifikkutførelsesform definerer den nøytraliserende aktiviteten til antistoffet gjennom antistoffets evne til å hemme bindingen av HLA-C-molekylet til KIR2DL1 ogKIR2DL3 (eller den nært beslektede KIR2DL2)-reseptorer, ytterligere foretrukketettersom det er antistoffets kapasitet til å endre:

- bindingen av et HLA-C-molekyl valgt fra Cwl, Cw3, Cw7 og Cw8 (eller et

HLA-C-molekyl med en Asn-rest i posisjon 80) til KIR2DL2/3; og

- bindingen av et HLA-C-molekyl valgt fra Cw2, Cw4, Cw5 og Cw6 (eller etHLA-C-molekyl med en Lys-rest i posisjon 80) til KIR2DL1.

I en annen variant kan den inhibitoriske aktiviteten til et antistoff som beskrevet heri vurderes i en cellebasert cytotoksisitetsanalyse som beskrevet i eksemplene tilveiebrakt heri.

I en annen variant kan den inhibitoriske aktiviteten til et antistoff som beskrevet heri vurderes i en cytokinfrigjøringsanalyse, hvori NK-celler inkuberes medtestantistoffet og en målcellelinje som uttrykke et HLA-C-allel gjenkjent av et KIRmolekyl i NK-populasjonen, for å stimulere NK-cellecytokinproduksjon (f.eks. IFNy og/eller GM-CSF-produksjon). I en eksempelprotokoll vurderes IFN-y-produksjonfra PBMC ved hjelp av celleoverflate- og intracytoplasmatisk farging og analyse avflow cytometri etter omtrent 4 dager i kultur. Kort fortalt kan Brefeldin A (Sigma Aldrich) tilsettes til en endelig konsentrasjon av omtrent 5 pg/ml i det minste i omtrent 4 timer av dyrkningen. Cellene kan deretter inkuberes med anti-CD3- oganti-CD56-mAb forut for permeabilisering (IntraPrep™; Beckman Coulter) ogfarges med PE-anti-IFN-y eller PE-IgGl (Pharmingen). GM-CSF og IFN-yproduksjon fra polyklonale aktiverte NK-celler kan måles i supernatanter ved åanvende ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-y:OptElA-sett, Pharmingen).

Antistoffer som beskrevet heri kan delvis eller fullstendig nøytralisere den KIRmedierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet. Betegnelsen "nøytralisere KIRmediert hemming av NL-cellecytotoksisitet" som anvendt heri betyr evnen til å øketil i det minste omtrent 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, i det minste omtrent 40 %, i det minste omtrent 50 % eller mer (f.eks. 25-100 %) spesifikk lysisoppnådd ved de samme forhold med NK-celler eller NK-cellelinjer som ikke erblokkert gjennom deres KIR, som målt ved hjelp av en klassisk kromfrigjøringstest for cytotoksisitet, sammenlignet med det nivået av spesifikk lysis som oppnås uten antistoff når en NK-cellepopulasjon som uttrykker en gitt KIR settes i kontakt meden målcelle som uttrykker egen MHC klasse I-molekyl (gjenkjent av KIR uttrykt påNK-celler). Foretrukne antistoffer er f.eks. i stand til å indusere lysis i tilpassedeeller HLA-kompatible eller autologe målcellepopulasjoner, dvs. cellepopulasjonersom ikke ville effektivt lyseres av MK-celler i fraværet av nevnte antistoff.Antistoffene kan følgelig også defineres som fasiliterende for NK-celleaktivitet invivo.

Alternativt betyr betegnelsen "nøytralisere KIR-mediert hemming" at det i enkromanalyse ved å anvende en NK-celleklon eller transfektant som uttrykker éneller flere inhibitoriske KIR og en målcelle som uttrykker kun ett HLA-allel somgjenkjennes av én av KIR’ene på NK-cellen, bør det oppnådde cytotoksisitetsnivået

med antistoffet være i det minste omtrent 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, i det minste omtrent 40 %, i det minste omtrent 50 % (f.eks. omtrent 25-100 %)eller mer av den oppnådde cytotoksisiteten med et kjent blokkerende anti-MHCklasse I-molekyl, slik som W6/32 anti-MHC klasse I-antistoff.

I en spesifikk utførelsesform binder antistoffet vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet DF200 (fremstilt ved hjelp av hybridom DF200). Slike antistoffer kalles heri "DF200-lignende antistoffer". I en ytterligere foretrukketutførelsesform er antistoffet et monoklonalt antistoff. Mer foretrukket er "DF200lignende antistoffer" beskrevet heri antistoffer andre enn det monoklonale antistoffet NKVSF1. Mest foretrukket er monoklonalt antistoff DF200 (fremstilt av hybridom DF200).

Betegnelsen "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse. Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet DF200 betyr at et antistoff "konkurrerer" med DF200. Vanligvis betyr et antistoff som "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet av interesse (f.eks. DF200, NKVSF1, 17F9) at antistoffet "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for hvilke som helst av KIR-molekylene, fortrinnsvis et KIR-molekyl utvalgt fragruppen bestående av KIR2DL1 og KIR2DL2/3. I andre eksempler konkurrerer et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL1-molekyl som antistoffet av interesse med antistoffet av interesse forbinding til KIR2DL1. Et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL2/3-molekyl som antistoffet av interesse "konkurrerer"med antistoffet av interesse for binding til KIR2DL2/3.

Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for hvilket som helst og alle KIR-molekyler som nevnte antistoff avinteresse spesifikt binder til. Uttrykket "binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet DF200 betyr at et antistoff "konkurrerer" med DF200 for hvilke som helst og alle KIR-molekyler som DF200spesifikt binder til. Et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som det monoklonale antistoffet DF200 eller NKVSF1 "konkurrerer" f.eks. med nevnte DF200 eller NKVFS1 for binding til KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 og KIR2DS2.

Identifiseringen av ett eller flere antistoffer som binder til vesentlig eller essensielt den samme epitopen som de monoklonale antistoffene beskrevet heri kan lett bestemmes ved å anvende hvilke som helst av de mange immunologiske screeningsanalysene hvor antistoffkonkurrering kan vurderes. Et antall slike

analyser anvendes rutinemessig og er kjent for fagmannen på området (se f.eks. US patent nr. 5 660 827 meddelt 26. august 1997). Det skal forstås at det å faktisk bestemme epitopen som et antistoff beskrevet heri binder til ikke på noen måte krever å identifisere et antistoff som binder til den samme eller vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet beskrevet heri.

Når testantistoffene som skal undersøkes er oppnådd fra ulike dyrekilder, eller til og med fra en ulik Ig-isotyp, kan f.eks. en enkel konkurranseanalyse anvendes hvorkontrollen (f.eks. DF200) og testantistoffene blandes (eller adsorberes på forhånd) og påføres til en prøve som inneholder både KIR2DL1 og KIR2DL2/3, hvor hver er kjent for å kunne binde DF200. Protokoller basert på ELISA, radioimmunanalyser, Western blotting og anvendelse av BIACORE-analyse (som f.eks. vist ieksempeldelen) er egnet for anvendelse i slike enkle kompetitive studier.

I visse utførelsesformer ville man på forhånd blande kontrollantistoffene (f.eks. DF200) med ulike mengder testantistoffer (f.eks. 1:10 eller omtrent 1:100) i et tidsrom forut for påføring av den inhibitoriske KIR-antigenprøven. I andreutførelsesformer kan kontrollen og de ulike mengdene testantistoffer enkelt blandes gjennom eksponeringen til KIR-antigenprøven. Så lenge som man kan skille bundetfra frie antistoffer (f.eks. ved å anvende separerings- eller vasketeknikker for åeliminere ubundne antistoffer) og DF200 fra testantistoffene (f.eks. ved å anvende arts spesifikke eller isotyp spesifikke sekundære antistoffer eller gjennom spesifikk merking av DF200 med et detekterbart merke) vil man være i stand til å bestemme om testantistoffene reduserer bindingen av DF200 til de to ulike KIR2DLantigenene, noe som ville indikere at testantistoffet gjenkjenner vesentlig den samme epitopen som DF200. Bindingen av (merkede) kontrollantistoffer i fraværet av et fullstendig irrelevant antistoff kan tjene som høyverdikontroll.

Lavverdikontrollen kan oppnås ved å inkubere de merkede (DF200) antistoffene med ikke-merkede antistoffer av den eksakt samme typen (DF200), hvorkonkurranse ville opptre og redusere bindingen av de merkede antistoffene. I en testanalyse er det en signifikant reduksjon i merket antistoffreaktivitet i nærværet av et testantistoff indikasjon på et testantistoff som gjenkjenner vesentlig den samme epitopen, dvs. et som "kryssreagerer" med det merkede (DF200)-antistoffet. Ethverttestantistoff som reduserer bindingen av DF200 til hver av KIR2DL1- ogKIR2DL2/3-antigener med i det minste omtrent 50 %, slik som i det minste omtrent60 % eller mer foretrukket i det minste 70 % (f.eks. omtrent 65-100 %) ved ethvertDF200:testantistoff-forhold mellom omtrent 1:10 og omtrent 1:100 betraktes å væreet antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200. Fortrinnsvis vil testantistoffet redusere bindingen av DF200 til hver av KIR2DL-antigenene med i det minste omtrent 90 % (f.eks. omtrent 95 %).

Konkurranse kan vurderes ved hjelp av f.eks. en flowcytometritest. I en slik test kan celler som bærer en gitt KIR inkuberes først med DF200 f.eks. og deretter med

testantistoffet merket med et fluorkrom eller biotin. Antistoffet sies å konkurrere med DF200 dersom bindingen som oppnås ved preinkubering med mettende mengder av DF200 er omtrent 80 %, fortrinnsvis omtrent 50 %, omtrent 40 % eller mindre (f.eks. omtrent 30 %) av bindingen (som målt ved hjelp av fluorescensgjennomsnitt) oppnådd med antistoffet uten preinkubering med DF200. Alternativt sies et antistoff å konkurrere med DF200 dersom bindingen som oppnås med et merket DF200 (ved hjelp av et fluorkrom eller biotin) på celler som på forhånd er inkubert med mettende mengder av testantistoff er omtrent 80 %, fortrinnsvis omtrent 50 %, omtrent 40 % eller mindre (f.eks. omtrent 30 %) av bindingen som oppnås uten på forhånd å inkubere med antistoffet.

En enkel kompetitiv analyse hvor et testantistoff på forhånd absorberes og påføres ved mettende konsentrasjoner på en overflate hvorpå både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 er immobilisert kan også fordelaktig anvendes. Overflaten i denne enkle kompetitive analysen er fortrinnsvis en BIACORE-chip (eller et annet mediumegnet for overflateplasmonresonansanalyse). Kontrollantistoffet (f.eks. DF200) bringes deretter i kontakt med overflaten ved KIR2DL1- og KIR2DL2/3-mettendekonsentrasjoner og KIR2DL1- og KIR2DL2/3-overflatebinding avkontrollantistoffet måles. Denne bindingen av kontrollantistoffet sammenlignes med bindingen av kontrollantistoffet til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdendeoverflate i fraværet av testantistoff. I en testanalyse indikerer en signifikant reduksjon i bindingen av KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflate tilkontrollantistoffet i nærværet av et testantistoff at testantistoffet gjenkjenner vesentlig den samme epitopen som kontrollantistoffet slik at testantistoffet "kryssreagerer" med kontrollantistoffet. Ethvert testantistoff som reduserer bindingen av kontrollantistoff (slik som DF200) til hver av KIR2DL1- ogKIR2DL2/3-antigener med i det minste omtrent 30 % eller mer foretrukket omtrent40 % kan betraktes å være et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som en kontroll (f.eks. DF200). Slike testantistoff vil fortrinnsvis redusere bindingen av kontrollantistoffet (f.eks. DF200) til hver av KIR2DL-antigenene med i det minste omtrent 50 % (f.eks. i det minste omtrent 60%, i det minste omtrent 70 % eller mer). Det skal forstås at rekkefølgen av kontrollog testantistoffer kan reverseres: det vil si at kontrollantistoffet først kan bindes til overflaten og testantistoffet bringes i kontakt med overflaten deretter i en kompetitiv analyse. Antistoffet med høyere affinitet for KIR2DL1- og KIR2DL2/3antigener bindes fortrinnsvis til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-inneholdende overflateførst, ettersom det vil forventes at reduksjonen i bindingen ses for det andre antistoffet (ved å anta at antistoffene er kryssreagerende) vil være større. Ytterligere eksempler på slike analyser er tilveiebrakt i eksemplene og f.eks. i Saunal og Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41.

Det skal forstås at de ovenfor beskrevne immunologiske screeningsanalysene, i betydningen av DF200 for eksemplifiserende formål, også kan anvendes for å identifisere antistoffer som konkurrerer med NKVSF1, 1-7F9, EB6, GLI83 ogandre antistoffer ifølge denne beskrivelsen.

Ved immunisering og produksjon av antistoffer i en vertebrat eller celle, kan spesielt utvalgte trinn utføres for å isolere antistoffer som krevet. I en spesifikk utførelsesform, angår beskrivelsen følgelig også fremgangsmåter for å fremstille slike antistoffer, omfattende:

(a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen omfattende etinhibitorisk KIR-polypeptid;

(b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte antistoffer binder nevnte KIR-polypeptid,

(c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste to ulike inhibitoriske KIR-genprodukter, og

(d) velge ut antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere KIR-medierthemming av NK-cellecytotoksisitet på en NK-cellepopulasjon som uttrykker nevntei det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter.

Seleksjonen av et antistoff som kryssreagerer med i det minste to ulike inhibitoriske KIR-genprodukter kan oppnås ved å analysere antistoffer mot to eller flere ulikeinhibitoriske KIR-antigener, f.eks. som beskrevet ovenfor.

I en mer foretrukket utførelsesform er antistoffene som fremstilles i trinn (b) monoklonale antistoffer. Betegnelsen "fremstilling av antistoffer fra nevnte immuniserte dyr" som anvendt heri inkluderer følgelig oppnåelsen av B-celler fra etimmunisert dyr og anvendelse av disse B-cellene for å fremstille en hybridom somuttrykker antistoffer, så vel som å oppnå antistoffer direkte fra serumet til et immunisert dyr. I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffene utvalgt i trinn (c) de som kryssreagerer med i et minste KIR2DL1 og KIR2DL2/3.

I enda en annen foretrukket utførelsesform for årsaker antistoffene utvalgt i trinn (d) i det minste omtrent 10 % spesifikk lysis mediert gjennom NK-celler som har i detminste én KIR gjenkjent av antistoffet og fortrinnsvis i det minste omtrent 40 % spesifikk lysis, i det minst omtrent 50 % spesifikk lysis eller mer foretrukket i det minste omtrent 70 % spesifikk lysis (f.eks. omtrent 60-100 % spesifikk lysis) sommålt i en standard kromfrigjøringsanalyse mot en målcelle som uttrykker eget HLA klasse I-molekyl, sammenlignet med lysis eller cytotoksisiteten oppnådd ved sammeeffektor/mål-forhold med NK-celler som ikke er blokkert gjennom deres KIR.Alternativt bør cytotoksisitetsnivået oppnådd med antistoffet være i det minste 20 %, fortrinnsvis i det minste omtrent 30 %, eller mer av den oppnådde cytotoksisiteten med et blokkerende anti-MHC-klasse I-mAb slik som W6/32 antiMHC klasse I-antistoff når antistoffer utvalgt i trinn (d), når anvendt i en

kromanalyse som anvender en NK-celleklon som uttrykker én eller flereinhibitoriske KIR og en målcelle som uttrykker kun ett HLA-allel som gjenkjennesav én av KIR’ene på NK-klonen anvendes.

Rekkefølgen av trinnene (c) og (d) i den rett ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan endres. Eventuelt kan metoden også eller alternativt ytterligere omfatte flere trinn for dannelse av fragmenter av det monoklonale antistoffet eller derivatet av det monoklonale antistoffet eller slike fragmenter, f.eks. som beskrevet andre steder heri.

I en foretrukket utførelsesform er det ikke-humane dyret som anvendes for åfremstille antistoffer ifølge den anvendelige fremgangsmåten ifølge beskrivelsen et pattedyr, slik som en gnager (f.eks. mus, rotte, osv.), kveg, gris, hest, kanin, geit, sau osv. Det ikke-humane dyret kan også være genetisk modifisert eller konstruertfor å fremstille "humane" antistoffer, slik som Xenomouse™ (Abgenix) eller HuMAb-mus™ (Medarex).

I en annen variant tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å oppnå et antistoff som omfatter:

(a) å velge, fra et bibliotek eller repertoar, et monoklonalt antistoff, et fragment av et monolonalt antistoff eller et derivat derav som kryssreagerer med i et minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DL-reseptorgenprodukter, og

(b) velge ut et antistoff, fragment eller derivat av (a) som kan nøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på en NK-cellepopulasjon somuttrykker nevnte i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR2DLreseptorgenprodukter.

Repertoaret kan være et hvilket som helst (rekombinant) repertoar av antistoffer eller fragmenter derav, eventuelt vist gjennom en annen egnet struktur (f.eks. fag, bakterie, syntetisk kompleks, osv.). Utvelgelsen av inhibitoriske antistoffer kan utføres som beskrevet ovenfor og som ytterligere illustrert i eksemplene.

Ifølge en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en hybridom som omfatter en B-celle fra en ikke-human vert, hvori nevnte B-celle fremstiller etantistoff som binder en determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter og hvori nevnte antistoff kan nøytralisereden inhibitoriske aktiviteten til nevnte reseptorer. Hybridomen ifølge dette aspektet av beskrivelsen er mer foretrukket ikke en hybridom som fremstiller det monoklonale antistoffet NKVSF1. Hyrbidomen ifølge dette aspektet av beskrivelsen kan dannes som beskrevet ovenfor ved fusjon av splenocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret med en udødeliggjort cellelinje. Hybridomer fremstilt veddenne fusjonen kan analyseres for nærværet av et slikt kryssreagerende antistoff som beskrevet andre steder heri. Hybridomen fremstiller fortrinnsvis et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstede på i det minste to ulike KIR2DL

genprodukter, og forårsaker økning av NK-celleekspresjonseffekt i det minste av énav disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket produserer hybridomen et antistoffsom binder tilvesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200 og som forsterker NK-celleaktivitet. Mer foretrukket er hybridomen hybridom DF200 somproduserer det monoklonale antistoffet DF200.

Hybridomer som bekreftes å produsere et monoklonalt antistoff som beskrevet heri kan dyrkes i større mengder i et passende medium slik som DMEM eller RPMI1640. Alternativt kan hybridomene dyrkes in vivo som ascitestumorer i et dyr.

Etter tilstrekkelig vekst for å produsere det ønskede monoklonale antistoffet separeres dyrkningsmediet som inneholder monoklonalt antistoff (eller ascitesvæsken) bort fra cellene og det monoklonale antistoffet tilstede i mediet renses. Rensing oppnås vanligvis ved hjelp av gelelektroforese, dialyse, kromatografi ved anvendelse av protein A- eller protein G-sefarose eller et antimuse-Ig bundet til en fast støtte slik som agarose- eller sefarose-kuler (allebeskrevet f.eks. i Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publikasjon nr. 18-1037-46, utgave AC). Det bundne antistoff elueres vanligvis fraprotein A/protein G-kolonner ved å anvende buffere med lav pH (glysin- elleracetatbuffere med pH 3,0 eller mindre) med umiddelbar nøytralisering av antistoffinneholdende fraksjoner. Disse fraksjonene samles, dialyseres og konsentreres etter behov.

DNA som koder for et antistoff som binder en determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter kan isoleres fra hybridomenbeskrevet heri og plasseres i en passende ekspresjons vektor for transfeksjon i en passende vert. Verten anvendes deretter for den rekombinante produksjon av antistoffet eller varianter derav, slik som en humanisert versjon av det monoklonale antistoffet, aktive fragmenter av antistoffet eller kimere antistoffer som omfatter den antigengjenkjennende delen av antistoffet. DNA som anvendes i denne utførelsesformen koder fortrinnsvis for et antistoff som gjenkjenner en determinant tilstede på i det minste to ulike KIR2DL-genprodukter og forårsaker økning av NKcelleekspresjonseffekt ved i det minste én av disse KIR-reseptorene. Enda merforetrukket koder DNA’et for et antistoff som binder til vesentlig den samme epitopen eller determinanten som DF200 og som forsterker NK-celleaktivitet. Mestforetrukket koder DNA for det monoklonale antistoffet DF200.

DNA som koder for det monoklonale antistoffet beskrevet heri isoleres lett og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer (f.eks. ved å anvende oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjeder av museantistoffer). Med én gang DNA er isolert kan det plasseres i ekspresjons vektorer som deretter transfekteres inn i vertsceller slik som E- coli-celler, simian COS-celler, kinesiske hamstereggstoffceller (CHO) eller

myelomceller som ikke på annen måte produserer immunoglobulinprotein for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i den rekombinante vertscelle. Rekombinant ekspresjon i bakterier av DNA som koder for antistoffet er velkjent for fagmannen (se f.eks. Skerra et al., Curr. Opinion in Immunok, 5, side 256 (1993); og Pluckthun, Immunok Revs., 130, side 151 (1992).

Fragmenter og derivater av et monoklonalt antistoff

Fragmenter og derivater av antistoffer som beskrevet heri (som er omfattet av betegnelsen "antistoff" eller "antistoffer" som anvendt i denne søknaden, om ikke annet uttrykkelig er angitt), fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, kan fremstillesved hjelp av teknikker som er velkjent for fagmannen på området. "Immunrcaktive fragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, vanligvis det antigenbindende setet eller variable region. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 og Fv-fragmenter; diastoffer; ethvert antistoffragment som er etpolypeptid med en primærstruktur som består av en ikke-avbrutt sekvens avkontinuerlige aminosyrerester (kalt heri som "enkeltkjede-antistoffragment" eller"enkeltkjede-polypeptid"), som inkluderer uten begrensning (1) enkeltkjede Fv(scFV)-molekyler, (2) enkeltkjede-polypeptider som inneholder kun et lettkjede variabelt domene, eller et fragment derav som inneholder de tre CDR til det letkjedevariable domenet, uten en binding til tungkjedeenhet og (3) enkeltkjedepolypeptider som inneholder kun en tungkjedevariabel region, eller et fragment derav som inneholder de tre CDR for den tunge kjedevariable regionen, uten en bundet lettkjedeenhet; og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoffragmenter. F.eks. kan Fab eller F(ab’)2-fragmenter produseres ved hjelp av proteasefordøyingav de isolerte antistoffene ifølge konvensjonelle teknikker. Det skal forstås at immunreaktive fragmenter kan modifiseres ved å anvende kjente fremgangsmåter, f.eks. for å redusere "clearance" in vivo og oppnå en mer ønsket farmakokinetisk profil kan profilet modifiseres med polyetylenglykol (PEG). Fremgangsmåte for å kople en setespesifikk konjugerende PEG til et Fab’-fragment er beskrevet i f.eks.Leong et al., Cytokine 16(3): 106-119 (2001) og Delgado et al., Br. J. Cancer 73(2):175-182 (1996).

I et spesifikt aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater som omfatter lettkjedevariabel regionsekvens av DF200 som vist i fig. 12. I et annet spesielt aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater som omfatter den lette kjedevariable regionsekvensen til Pan2D som vist i fig. 12. I et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere av de lette variable regionene CDR til DF200 som vist i fig. 12. I enda et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere lette variable CDR-regioner av Pan2D som vist i fig. 12.Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan dannes ved å lage egnede

substitusjoner, addisjoner og/eller delesjoner i disse beskrevne aminosyresekvensene ved å anvende standardteknikker med hjelp fra sammenligning av sekvensene. F.eks. kan CDR-rester som er konserverte mellomPan2D og DF200 være egnede mål for modifikasjon så lenge slike rester ikke bidrar til de ulike profiler i konkurransen disse antistoffene har med hensyn til andre antistoffer som beskrevet heri (selv om Pan2D og DF200 ikke konkurrerer), og følgelig ikke kan bidra til spesifisiteten til disse antistoffene for deres spesifikke respektive epitoper. I et annet aspekt kan posisjoner hvor én rest er tilstede i én sekvens i ett av disse antistoffene, men ikke i det andre, være egnet for delesjon, substitusjon og/eller innskudd.

I et spesifikt aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater som omfatter den tunge kjedevariable regionsekvensen til DF200 som vist i fig. 13. I et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater derav som omfatter én eller flere av de tunge variable CDR-regionene til DF200 som vist i fig. 13. Funksjonellevarianter/analoger av slike sekvenser kan dannes ved å lage egnede substitusjoner, addisjoner og/eller delesjoner i disse beskrevne aminosyresekvensene ved å anvende standardteknikker med hjelp fra sammenligning av sekvensene. I et annet aspekt, når en rest er tilstede i én sekvens i én av disse antistoffene men ikke i en annen, kan denne være egnet for delesjon, substitusjon og/eller innskudd.

Alternativt kan DNA fra en hybridom som fremstiller et antistoff som beskrevet heri, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, modifiseres for slik å kode for etfragment. Det modifiserte DNA settes deretter inn i en ekspresjonsvektor og anvendes for å transformere eller transfektere en passende celle som deretter uttrykker det ønskede fragmentet.

I en alternativ utførelsesform kan DNA fra en hybridom som produserer et antistoff som beskrevet heri, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, modifiseres forut forinnsetting i en ekspresjonsvektor, f.eks. ved å substituere den kodende sekvensen for humane tunge og lette kjedekonstante domener istedenfor de homologe ikkehumane sekvensene (f.eks. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, side 6851 (1984)), eller ved kovalent å binde den immunglobulinkodende sekvensen helt eller delvis til den kodende sekvensen til et ikke-immunglobulinpolypeptid. Pådenne måten fremstilles "kimere" eller "hybride" antistoffer som har bindingsspesifisiteten til det opprinnelige antistoffet. Vanligvis substitueres slike ikke-immunglobulinpolypeptider med de konstante domener til et antistoff sombeskrevet heri.

Antistoffet som beskrevet heri, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff,humanisert. "Humaniserte" former av antistoffer beskrevet heri er spesifikke kimere immunglobuliner, immunglobulinkjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab,

Fab’, F(ab’)2, eller andre antigenbindende sekvenser av antistoffer) som inneholder minimumsekvenser utledet fra museimmunglobulinet. For det meste er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottakerantistoff) hvor rester fra en komplementær bestemmende region (complementary-determining region, CDR) framottakeren erstattet med rester fra en CDR fra det opprinnelige antistoffet (donorantistoff) mens den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten til det opprinnelige antistoffet opprettholdes. I enkelte tilfeller kan Fv-rammeverksresterfra det humane immunoglobulinet erstattes med tilsvarende ikke-humane rester.Humaniserte antistoffer kan videre omfatte rester som ikke finnes i verken mottakerantistoffet eller i det importerte CDR- eller rammeverksekvensene. Dissemodifikasjonene gjøres for ytterligere å forbedre og optimalisere antistoffytelsen. Generelt vil humaniserte antistoffer omfatte vesentlig alle eller i det minste én eller typisk to, variable domener, hvori alle eller vesentlig alle av CDR-regionene somsvarer til de fra det opprinnelige antistoffet og alle eller vesentlig alle FR-regionerfra et humant immunglobulin consensus sekvens. Det humaniserte antistoffet vil optimalt også omfatte i det minste én del av en immunglobulinkonstant region (Fc), vanligvis den til et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature, 321, side 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, side 323 (1988); og Fresta, Curr.Op.Struct.Biol., 2, side 593 (1992).

Fremgangsmåter for å humanisere antistoffene beskrevet heri er velkjent for fagmannen på området. Vanligvis har et humanisert antistoff beskrevet herién eller flere aminosyrerester som er introdusert inn i antistoffet fra det opprinnelige antistoff. Disse muse- eller andre ikke-humane aminosyrerestene kalles ofte"importerte" rester, som vanligvis er tatt fra et "importert" variabelt domene. Humanisering kan vesentlig utføres ved å følge fremgangsmåten til Winter og medarbeidere (Jones et al., Nature, 321, side 522 (1986); Riechman et al., Nature, 332, side 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, side 1534 (1988)). Slike "humaniserte" antistoffer er følgelig kimere antistoffer (Cabilly et al., US patent nr. 4 816 567), hvor vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt domene er substituert med den korresponderende sekvensen fra det opprinnelige antistoff. I praksis er humaniserte antistoffer vanligvis humane antistoffer hvor enkelte CDRrester og muligens noen FR-rester er substituert med rester fra analoge seter i detopprinnelige antistoff.

Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal anvendes i fremstillingen av humaniserte antistoffer er svært viktig for å redusere antigenisiteten. Ifølge den såkalte "beste tilpasnings"-metoden, analyseressekvensen til det variable domenet til et antistoff ifølge oppfinnelsen mot hele biblioteket til kjente humane variable domenesekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest til musesekvensen aksepteres deretter som det humane rammeverk (FR) for det humaniserte antistoff (Sims et al., J. Immunok, 151, side 2296 (1993),

Chothia og Lesk, J. Mol. Biol., 196, side 901 (1987)). En annen fremgangsmåte anvender et spesifikt rammeverk for consensussekvensen for alle humane antistoffer av en spesifikk undergruppe av lette eller tunge kjeder. Det samme rammeverket kan anvendes for flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, side 4285 (1992), Presta et al. J. Immunok, 51, side 1993)).

Det er ytterligere viktig at antistoffene humaniseres med bibeholdelse av høy affinitet for flere inhibitoriske KIR-reseptorer og andre fordelaktige biologiskeegenskaper. For å oppnå dette målet, ifølge en foretrukket fremgangsmåte, fremstilles humaniserte antistoffer ved hjelp av en analyseprosess der foreldresekvenser og ulike viktige humaniserte produkter ved anvendelse av tredimensjonale modeller av foreldre- og humaniserte sekvenser. Tredimensjonaleimmunglobulinmodeller er allement tilgjengelige og er kjent for fagmannen på området. Dataprogrammer er tilgjengelig som illustrerer og viser mulig tredimensjonale konformasjonsstrukturer og utvalgte kandidatimmunoglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse bildene tillater analyse av den sannsynlige rollen til restene i kandidatimmunglobulinsekvensens funksjon, dvs. analyse av restene som influerer kandidatimmunglobulinets evne til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-rester velges og kombineres fra consensus- ogimporterte sekvenser slik at det ønskede antistoffets egenskaper, slik som økt affinitet for målantigenet/antigenene oppnås. Generelt er CDR-restene direkte ogmest vesentlig involvert i påvirkningen av antigenbinding.

En annen fremgangsmåte for å danne "humaniserte" monoklonale antistoffer er å anvende en XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) som musen anvendt for immunisering. En XenoMouse er en musevert i henhold til oppfinnelsen hvor dets immunglobulingener er erstattet med funksjonelle humane immunglobulingener. Antistoffene som fremstilles av denne musen eller i hybridomer dannet fra B-cellerfra denne musen er følgelig allerede humanisert. XenoMousen er beskrevet i US patent nr. 6 162 963. En analog metode kan oppnås ved å anvende en HuMAbMouse™ (Medarex).

Humane antistoffer kan også fremstilles ifølge ulike andre teknikker slik som ved å anvende for immunisering, andre transgene dyr som er konstruert for å uttrykke et humant antistoffrepertoar (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), eller ved å velge ut antistoffrepertoarer ved å anvende fagdisplay-metoder. Slike teknikker erkjent for fagmannen på området og kan implementeres ved å starte fra monoklonale antistoffer som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Antistoffene beskrevet heri, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, kan ogsåderivatisert til "kimere" antistoffer (immunglobuliner) der en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i det opprinnelige antistoffet, mens resten av kjeden/kjedene er identiske med eller

homologe til tilsvarende sekvenser i antistoffet utledet fra en annen art eller tilhørende til en annen antistoffklasse eller underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge som de har den ønskede biologiske aktivitet (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81, side 6851 (1984)).

Andre derivater inkluderer funksjonaliserte antistoffer, dvs. antistoffer som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, slik risin, difteritoksin, abrin og Pseudomonas-eksotoksin; til en detekterbar enhet, slik som en fluorescensenhet, enradioisotop eller et avbildningsmiddel; eller til en fast støtte, slik som agarosekuler eller lignende. Fremgangsmåter for å konjugere eller kovalent binde disse andre midlene til antistoffer er velkjent for fagmannen på området.

Konjugering til et toksin er anvendelig for å målrette dreping av NK-celler som harén av de kryssreagerende KIR-reseptorene på sin celleoverflate. Med én gangantistoffet beskrevet heri binder til celleoverflaten av slike celler intern alis ere s antistoffet og toksinet frigjøres på innsiden av cellen, dreper selektivt den cellen.

Konjugering til en detekterbar enhet er anvendelig når antistoffet beskrevet heri anvendes for diagnostiske formål. Slike formål inkluderer men er ikke begrenset til analyser av biologiske prøver for nærværet av NK-celler som bærer dekryssreagerende KIR på sin celleoverflate og påviser nærværet av NK-celler sombærer de kryssreagerende KIR i en levende organisme.

Konjugering av et antistoff beskrevet heri til en fast støtte er anvendelig som et verktøy for affinitetsrensing av NK-celler som bærer kryssreagerende KIR på sincelleoverflate fra en kilde, slik som en biologisk væske.

Et antistoff som binder en felles determinant tilstede på i det minste to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorgenprodukter, hvori nevnte antistoff kannøytralisere KIR-mediert inhibering av NK-cellecytotoksisitet på NK-celler somuttrykker i det minste én av nevnte to ulike humane inhibitoriske KIR-reseptorerifølge oppfinnelsen, inkludert NKVSF1, inkorporeres i liposomer ("immunliposomer"), alene eller sammen med andre forbindelser for målrettet levering til et dyr. Slike andre forbindelser inkluderer nukleinsyrer for levering av gener for genterapi eller for levering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for undertrykking av et gen i en NK-celle, eller toksiner eller medikamenter for denmålrettede drepingen av NK-celler.

Datamodulering av de ekstracellulære domenene til KIR2DL1, -2 og -3(KIR2DL1-3), basert på deres publiserte krystallstrukturer (Maenaka et al. (1999),Fan et al. (2001), Boyington et al., (2000)), viste involveringen av visse regioner eller KIR2DL1, -2 og -3 i interaksjonen mellom KIR2DL1 og KIR2DL1-3kryssreaktive musemonoklonale antistoffer DF200 og NKVSF1. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer antistoffer som eksklusivt binder KIR2DL1 med en

region som er definert gjennom aminosyrerestene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152,153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 uten å reagere med aminosyrerester på utsiden av regionen som er definert ved restene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192).

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R131 er Ala.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R157 er Ala.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 der R158 er Ala.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1-rester (131,157, 158).

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DS3 (R131W), men ikke til villtype KIR2DS3.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR2DS4.

Beskrivelsen tilveiebringer også antistoffer som binder til både KIR2DL1 og KIR2DL2/3, men ikke til KIR2DS4.

Kartlegging av hvorvidt et antistoff binder innen én av epitopregionene definert ovenfor kan utføres på måter som er kjent for fagmannen på området. Som et eksempel på slike kartleggings/karakteriseringsmetoder kan en epitopregion for et anti-KIR-antistoff bestemmes gjennom epitop "fingeravtrykk" ved å anvendekjemisk modifisering av eksponerte aminer/karboksyler i KIR2DL1- ellerKIR2DL2/3-proteinet. Et spesifikt eksempel på en slik fingeravtrykkteknikk eranvendelsen av HXMS (hydrogen-deuterium utbyttingsdeteksjon ved hjelp avmassespektrometri) hvor en hydrogen/deuterium-utbytting av reseptor ogligandproteinamidprotoner, binding og tilbakebytting skjer, hvor ryggradsamidgruppene som deltar i proteinbinding er beskyttet fra tilbakebytting og derfor forblir deutererte. Relevante regioner kan identifiseres på dette punkt ved hjelp av peptidproteolyse, hurtigmikrobor høytrykks væskekromatografiseparering og/eller elektrosprayioniseringsmassespektrometri. Se f.eks. Ehring H, Analytical Biochemistry, vol. 267 (2) sider 252-259 (1999) og/eller Engen, J.R. og Smith, D.L.(2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Et annet eksempel på en egnetepitopidentifiseringsteknikk er nukleær magnetisk resonansepitopkartlegging (NMR), hvor vanligvis posisjonen til signalene i todimensjonale NMR-spektre av

det frie antigenet og antigenkompleksbundet med antigenbindende peptid, slik som et antistoff, sammenlignes. Antigenet blir vanligvis selektivt isotypisk meret med 15N slik at kun signaler som svarer til antigenet og ingen signaler fra antigenbindende peptid ses i NMR-spekteret. Antigensignaler som har sinopprinnelse fra aminosyrer involvert i interaksjonen med antigenbindende peptid vil vanligvis skifte posisjon i spekteret til komplekset sammenlignet med spektrene til det frie antigenet, og aminosyrene som er involvert i bindingen kan identifiseres på denne måten. Se f.eks. Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44): 149-67;Huang et al., Journal of Molecular Biology, vol. 281 (1) sider 61-67 (1998); ogSaito og Patterson, Methods. 1996 jun; 9(3):516-24.

Epitopkartlegging/karakterisering kan også utføres ved å anvende massespektrometrimetoder. Se f.eks. Downward, J Mass Spectrom. 2000 apr; 35(4): 493-503 og Kiselar og Downard, Anal Chem. 1999 mai 1; 71(9): 1792-801.

Proteasefordøyingsteknikker kan også være anvendelige i betydningen av epitopkartlegging og identifisering. Antigene determinantrelevante regioner/sekvenser kan bestemmes ved proteasefordøying, f.eks. ved å anvende trypsin i et forhold på omtrent 1:50 til KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 ved fordøying ved 37°C og pH 7-8, etterfulgt av massespektrometri (MS)-analyse forpeptididentifisering. Peptidene som er beskyttet fra trypsinkløyving gjennom antiKIR-binding kan deretter identifiseres ved å sammenligne prøver utsatt fortrypsinfordøying og prøver inkubert med antistoff og deretter utsatt for fordøying med f.eks. trypsin (for derved å avsløre et fingeravtrykk for binding). Andre enzymer slik som chymotrypsin, pepsin, osv. eller andre kan alternativt anvendes i en lignende epitopkarakteriseringsmetode. Videre kan enzymatisk fordøying tilveiebringe en rask metode for å analysere hvorvidt en mulig antigen determinantsekvens er innenfor en region i KIR2DL1 i betydningen av et anti-KIRpolypeptid som ikke er eksponert på overflaten og, følgelig, mest sannsynlig ikke er relevant i betydningen av immunogenisitet/antigenisitet. Se f.eks. Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1): 15-9 for en diskusjon om lignende teknikker.

Kryssreaktivitet med cynomolgusaper

Det er funnet at antistoff NKVSF1 også binder til NK-celler fra cynomolgusaper, seeksempel 7. Beskrivelsen tilveiebringer derfor også et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer vedoverflaten av humane NK-celler, og som ytterligere binder til NK-celler fracynomolgusaper. I én utførelsesform er antistoffet ikke antistoff NKVSF1. Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å teste toksisiteten til et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske humane KIR-reseptorer

ved overflaten til humane NK-celler, hvori fremgangsmåten omfatter å testeantistoffet i en cynomolgusape.

Preparater og administrering

Beskrivelsen tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragmenter eller derivater kryssreagerer med i det minste to inhibitoriske KIR-reseptorer vedoverflaten til NK-celler, nøytraliserer deres inhibitoriske signaler og forsterkeraktiviteten til disse cellene, i enhver egnet vesikkel i en mengde som effektivt og detekterbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøvesom omfatter NK-celler. Preparatene omfatter ytterligere en farmasøytiskakseptabel bærer. Slike preparater kalles også "antistoffpreparater ifølge denne beskrivelsen". Antistoffpreparatet beskrevet heri kan omfatte et antistoff beskrevet i antistoffutførelsesformene ovenfor. Antistoffet NKVSF1 er inkludert innenfor rammen av antistoffer som kan være tilstede i antistoffpreparatene som beskrevet heri.

Betegnelsen "biologisk prøve" som anvendt heri inkluderer men er ikke begrenset til, et biologisk fluid (f.eks. serum, lymfe, blod), celleprøver og vevsprøver (f.eks. benmarg).

Farmasøytisk akseptable bærere kan anvendes i disse preparatene og inkluderer men er ikke begrenset til, ionebyttere, aluminium, aluminiumstearat, lecitin, serumproteiner slik som humant serumalbumin, bufferforbindelser slik som fosfat, glysin, sorbinsyre, kaliumsorbat, delvis glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, slik som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidalt silisiumdioksid, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte forbindelser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, polyakrylater, voks, polyetylenpolyoksypropylen blokkpolymerer, polyetylenglykol og lanolin.

Preparatene beskrevet heri kan anvendes i en fremgangsmåte for å forsterke aktivitet til NK-celler i en pasient eller i en biologisk prøve. Denne fremgangsmåtenomfatter trinnene å bringe nevnte preparat i kontakt med nevnte pasient eller biologiske prøve Slik metode kan være anvendelig for både diagnostiske og terapeutiske formål.

For anvendelse i forbindelse med en biologisk prøve kan antistoffpreparatet administreres ved enkelt å blande eller påføre denne direkte på prøven avhengig av prøvens natur (fluid eller fast). Den biologiske prøven kan bringes i kontakt direkte med antistoffet i enhver egnet anordning (plate, lomme, flaske, osv.). For anvendelse i forbindelse med en pasient må preparatet formuleres for administrering til pasienten.

Preparatene beskrevet heri kan administreres oralt, parenteralt, ved inhaleringsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Begrepet "parenteral" som anvendt heri inkluderer subkutane, intravenøse, intramuskulære, intraartikulær, intrasynovial, intrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesjonal og intrakranisk injeksjon eller infusjonsteknikker. Fortrinnsvis administreres preparatene oralt, intraperitonealt eller intravenøst.

Sterile injiserbare former av preparatene beskrevet heri kan være vandige eller en oljeaktig suspensjon. Disse suspensjonene kan formuleres ifølge teknikker som er kjent for fagmannen på området ved å anvende egnede dispergerings- ellerfuktemidler og suspensjonsmidler. Det sterile injiserbare preparatet kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i en ikke-toksisk parenteral akseptabeloppløsningsvæske eller et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt løsningsmiddel, f.eks.som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vesikler og løsningsmidler somkan anvendes er vann, Ringers løsning og isoton natriumkloridløsning. I tillegg kan sterile, fikserte oljer anvende vanligvis sterile, fikserte oljer som et løsningsmiddel eller suspensjonsmedium. For dette formål kan enhver blandet fiksert olje anvendes, inkludert syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer som oleinsyre og detsglyseridderivater er anvendelige i fremstillingen av injiserbare medier, som naturlig farmasøytisk akseptable oljer, slik som olivenolje eller lakserolje, spesielt i deres polyetylerte versjoner. Disse oljeløsningene eller -suspensjonene kan ogsåinneholde en langkjede alkoholoppløsningsvæske eller dispergeringsmiddel, slik som karboksymetylcellulose eller lignende dispergeringsmidler som er kommersielt anvendelige i formuleringen av farmasøytisk akseptable doseringsformer inkludert emulsjoner og suspensjoner. Andre vanlig anvendte overflateaktive midler, slik som Tweens, Spans og andre emulgeringsmidler eller biotilgjengelighetsforsterkere som vanligvis anvendes i fremstillingen av farmasøytisk akseptable faste, flytende eller andre doseringsformer kan også anvendes til formuleringsformål.

Preparatene kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doseringsform inkludert men ikke begrenset til kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. I tilfelle av tabletter for oral anvendelse inkluderer vanlig anvendte bærere laktose og maisstivelse. Smøremidler, slik som magnesiumstearat, tilføres også vanligvis. For oral administrering i en kapselform inkluderer anvendelige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner kreves for oral anvendelse kombineres den aktive ingrediensen med emulgerings- ogsuspensjonsmidler. Om ønskelig kan også visse søtningsstoffer, smaksstoffer eller fargemidler også tilsettes.

Alternativt kan preparatene administreres i form av stikkpiller for rektal administrering. Disse kan fremstilles ved å blande midlet med en egnet ikkeirriterende eksipient som er fast ved romtemperatur men flytende ved rektal

temperatur og som derfor vil smelte i rektum og frigjøre medikamentet. Slike medikamenter inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler.

Preparatene kan også administreres topisk, spesielt når målet for behandlingen inkluderer områder eller organer som er lett tilgjengelig ved topisk påføring, inkludert sykdommer i øyet, huden eller de lavere mage-tarmkanaler. Egnedetopiske formuleringer fremstilles enkelt for hver av disse områdene eller organer.

Topisk påføring ved de lavere mage-tarmkanaler kan utføres i en rektalstikkpilleformulering (ovenfor) eller i en egnet enemaformulering. Topisk transdermale plastre kan også anvendes.

For topiske påføringer kan preparatet formuleres i en egnet salve inneholdende den aktive komponenten suspendert eller oppløst i én eller flere bærere. Bærere for topisk administrering av forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til mineralolje, flytende petrolatum, hvit petrolatum, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelse, emulgeringsvoks og vann. Alternativt kan preparatene formuleres i en egnet krem eller lotion som inneholder de aktive komponentene suspendert eller oppløst i én eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere inkluderer men er ikke begrenset til mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestervoks, cetylarylalkohol, 2oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

For optalmisk anvendelse kan preparatet formuleres som mikroniserte suspensjoner i isotont, pH-justert, sterilt saltvann, eller fortrinnsvis som en løsning i isotont, pHjustert sterilt saltvann, enten med eller uten et konserveringsmiddel slik som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for optalmisk anvendelse, kan preparatet formuleres i en salve slik som petrolatum.

Preparatene kan også administreres gjennom nasal aerosol eller inhalering. Slike preparater fremstilles ifølge velkjente teknikker innenfor området farmasøytisk formulering og kan fremstilles som løsninger i saltvann, ved å anvende benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsfremmere for å forsterke biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre konvensjonelle oppløsnings- eller dispergeringsmidler.

Flere monoklonale antistoffer er vist å være effektive i kliniske situasjoner, slik som Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) eller Xolair (Omalizumab), og lignende administreringsregimer (dvs. formuleringer og/eller doserings- og/elleradministreringsprotokoller) kan anvendes med antistoffene beskrevet heri. Skjemaer og doseringer for administrering av antistoffet i de farmasøytiske preparatene kan bestemmes i henhold til kjente fremgangsmåter for disse produktene, f.eks. ved å anvende forhandlerens instruksjoner. F.eks. kan et antistoff tilstede i et farmasøytisk preparat beskrevet heritilføres ved en konsentrasjon på 10 mg/ml i

enten 100 mg (10 ml) eller 500 mg (50 ml) separate anvendelsesrør. Produktet formuleres for IV-administrering i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/mlnatriumsitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og sterilt vann for injeksjon. pH justeres til 6,5. Et eksempel på egnet doseringsområde for et antistoff eller et farmasøytisk preparat som beskrevet heri kan være mellom omtrent 10 mg/m2 og 500 mg/m2. Imidlertid skal det forstås at disse skjemaene er eksempler og at et optimalt skjema og regime kan tilpasses ved å ta hensyn til affiniteten og tolererbarheten til det spesifikke antistoffet i det farmasøytiske preparatet som må bestemmes i kliniske forsøk. Mengder og skjemaer for injeksjon av et antistoff i et farmasøytisk preparat beskrevet heri som metter NK-celler i 24 timer, 48 timer, 72timer eller en uke eller måned vil bestemmes ved å ta i betraktning affiniteten til antistoffet og dets farmakokinetiske parametere.

Antistoffpreparatet beskrevet heri kan ytterligere omfatte andre terapeutiske midler, inkludert midler som normalt anvendes for det spesifikke terapeutiske formål som antistoffene administreres for. Det ytterligere terapeutiske middel vil normalt være tilstede i preparatet i mengder som vanligvis anvendes for det midlet i ne monoterapi for den spesifikke sykdom eller tilstand som behandles. Slike terapeutiske midler inkluderer men er ikke begrenset til terapeutiske midler anvendt i behandlingen av kreft, terapeutiske midler anvendt for å behandle infeksjons sykdom, terapeutiske midler anvendt i andre immunterapier, cytokiner (slik som IL-2 eller IL-15), andre antistoffer og fragmenter av andre antistoffer.

F.eks. er et antall terapeutiske midler tilgjengelig for behandlingen av kreft. Antistoffpreparatene og fremgangsmåtene beskrevet heri kan kombineres med alle andre fremgangsmåter som vanligvis anvendes i behandlingen av den spesifikke sykdom, spesielt en tumor, kreftsykdom eller annen sykdom eller lidelse som pasienten har. Så lenge en spesifikk terapeutisk tilnærming ikke er kjent å være skadelig for pasientens tilstand, og ikke signifikant motvirker aktiviteten til antistoffet i et farmasøytisk preparat som beskrevet heri er dets kombinasjon omfattet.

I forbindelse med behandling av fast tumor kan de foreliggende preparater beskrevet herianvendes i kombinasjon med klassiske tilnærminger, slik som kirurgi, radioterapi, kjemoterapi og lignende. Beskrivelsen tilveiebringer derfor kombinerte terapier hvor et farmasøytisk preparat beskrevet heri anvendes samtidig med, før eller etter kirurgi eller strålingsbehandling; eller administreres til pasienten med, før eller etter konvensjonelle kjemoterapeutika, radioterapeutika eller antiangiogene midler, eller målrettede immuntoksiner eller koagualigander.

Når ett eller flere midler anvendes i kombinasjon med et antistoffinneholdende preparat som beskrevet heri i et terapeutisk regime er det ikke noe krav at de kombinerte resultatene skal være additive for de observerte effekter når hver

behandling utføres separat. Selv om i det minste additive effekter vanligvis er ønskelig vil enhver økt antikrefteffekt over det som oppnås av den enkelte terapi være fordelaktig. Det er ei heller et spesifikt krav at den kombinerte behandlingen har synergistiske virkninger, selv om dette selvfølgelig er mulig og fordelaktig.

For å utøve kombinert antikreftterapi vil man enkelt administrere til et dyr et antistoffpreparat som beskrevet her i kombinasjon med et annet antikreftmiddel på en måte som effektivt resulterer i deres kombinerte antikreftvirkninger i dyret. Midlene vil derfor tilveiebringes i mengder og tidsrom som effektivt resulterer i deres kombinerte nærvær med tumorvaskulaturen og deres kombinerte virkninger i tumormiljøet. For å oppnå dette målet kan et antistoffpreparat beskrevet heri og antikreftmidler administreres til dyret samtidig, enten i ett enkelt kombinert preparat eller som to adskilte preparater ved å anvende ulike administreringsruter.

Alternativt kan administreringen av et antistoffpreparat beskrevet heri gå forut for eller etter antikreftmiddelbehandlingen gjennom f.eks. intervaller som strekker seg fra minutter til uker og måneder. Man vil sikre at antikreftmidlet og antistoffet i antistoffpreparatet beskrevet heri har en fordelaktig kombinert effekt på kreften.

De fleste antikreftmidler vil bli gitt forut for et inhibitorisk KIR-antistoffpreparatbeskrevet heri i en antiangiogen terapi. Når immunkonjugater av et antistoff anvendes i antistoffpreparatet beskrevet heri kan imidlertid ulike antikreftmidler administreres samtidig eller påfølgende.

I enkelte situasjoner kan det være ønskelig å utvide behandlingstidsrommet signifikant, hvor flere dager (2, 3, 4, 5, 6 eller 7), flere uker (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) eller til og med flere måneder (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) går mellom den respektive administreringen av antikreftmidlet eller antikreftbehandlingen og administreringen av et antistoffpreparat ifølge beskrivelsen. Dette vil være fordelaktig i tilfeller hvor antikreftbehandlingen er ment å vesentlig ødelegge tumoren, slik som ved kirurgi eller kjemoterapi, og administreringen av et antistoffpreparat ifølge beskrivelsen er ment å forhindre mikrometastaser eller tumorgjenvekst.

Det er også omfattet av beskrivelsen at mer enn én administrering av enten et inhibitorisk KIR-antistoffbasert preparat ifølge denne beskrivelsen ellerantikreftmidlet kan utnyttes.

Disse midlene kan administreres om hverandre, annenhver dag eller annenhver uke; eller en behandlingssyklus med et inhibitorisk KIR-antistoffpreparat ifølgebeskrivelsen, etterfulgt av en syklus av antikreftmiddelterapi. I ethvert tilfelle, for å oppnå tumorregresjon ved å anvende en kombinasjonsterapi, er alt som trengs å levere begge midler i en kombinert mengde som effektivt har en antitumoreffekt, uavhengig av administreringstiden.

Ved kirurgi kan enhver kirurgisk intervensjon praktiseres i kombinasjon med den foreliggende beskrivelse. I forbindelse med stråleterapi er alle mekanismer for å indusere DNA-skade lokalt i kreftcellene omfattet, slik som gammastråling,røntgen-, UV-stråling, mikrobølger og til og med elektroniske emisjoner oglignende. Den direkte leveringen av radioisotoper til kreftceller er også omfattet, og dette kan anvendes sammen med et målrettet antistoff eller andre målrettede midler.

I andre aspekter kan immunmodulerende forbindelser eller regimer administreres i kombinasjon med eller som en del av antistoffpreparatet beskrevet heri. Foretrukne eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer cytokioner. Ulike cytokiner kan anvendes i slike kombinerte tilnærminger. Eksempler på cytokiner som er anvendelige i kombinasjoner som er omfattet av denne beskrivelsen inkluderer IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa,TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGR,IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Cytokiner anvendt i kombinasjonsbehandlingeneller preparater ifølge denne beskrivelsen administreres i henhold til standardregimer, i samsvar med kliniske indikasjoner slik som tilstanden til pasienten og den relative toksisiteten til cytokinet.

I visse utførelsesformer kan det kryssreagerende inhibitoriske KIRantistoffinneholdende terapeutiske preparatet beskrevet heri administreres i kombinasjon med eller kan ytterligere omfatte et kjemoterapeutisk eller hormonelt terapimiddel. Ulike hormonelle terapier og kjemoterapeutiske midler kan anvendes i kombinasjonsbehandlingsmetoder beskrevet heri. Eksempler på kjemoterapeutiske midler er alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, vinsaalkaloider, f.eks. adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, deunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksoter, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etpoposid (VP-16), 5-fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid,syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin-C,cisplatin (CDDP), aminopterin, kompretastatin(er) og derivater og forløpermedikamenter derav.

Hormonelle midler inkluderer men er ikke begrenset til f.eks. LHRH-agonister sliksom leuprorelin, goserelin, triptorelin og buserelin; anti-østrogener slik somtamoksifen og toremifen; anti-andro gener slik som flutamid, nilutamid, cyproteronog bikalutamid; aromataseinhibitorer slik som anastrozol, eksemestan, letrozol og fadrozol; og progestagener slik som medroksy, klormadinon og megestrol.

Fagmannen vil forstå at passende doser av kjemoterapeutiske midler vil ligge nært opp mot de som allerede anvendes i kliniske terapier, hvor de kjemoterapeutiske midler administreres alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler. F.eks. kan midler sliks om cisplatin eller andre DNA-alkylerende midler anvendes.

Cisplatin er ofte anvendt for å behandle kreft, med effektive doser anvendt i kliniske anvendelser på 20 mg/m2 for 5 dager hver tredje uke i totalt 3 runder. Cisplatin adsorberes ikke oralt og må derfor leveres via injeksjon intravenøst, subkutant, intratumoralt eller intraperitonealt.

Ytterligere anvendelige kjemoterapeutiske midler inkluderer forbindelser som påvirker DNA-replikasjon, mitose og kromosomal segregering, og midler somødelegger syntesen og trofastheten til polynukleotidforløpere. Et antall eksempler på kjemoterapeutiske midler for kombinert terapi er angitt i tabell C i US patent nr. 6 524 583. Hver av midlene som er angitt er kun eksempler og ikke begrensende. Fagmannen på området vises til "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 15. utgave, kapittel 33, spesielt sidene 624-652). Variasjoner i dose vil sannsynligvisopptre avhengig av tilstanden som behandles. Legen som foreskriver behandling vil være i stand til å bestemme den passende dosen for den individuelle pasient.

De foreliggende kryssreagerende, inhibitoriske KIR-antistoffpreparater ifølgebeskrivelsen kan anvendes i kombinasjon med hvilken som helst eller flere andre antiangiogene terapier og kan ytterligere omfatte antiangiogene midler. Eksempler på slike midler inkluderer nøytraliserende antistoffer, antisens-RNA, siRNA, RNAi,RNA-aptamerer og ribozymer som hver er rettet mot VEGE eller VEGF-reseptorer(US patent nr. 6 524 583). VEGF-varianter med antagonistiske egenskaper kan ogsåanvendes som beskrevet i WO 98/16551. Ytterligere eksempler på antiangiogene midler som er anvendelige i forbindelse med kombinasjonsterapi er angitt i tabell D i US patent nr. 6 524 583.

De inhibitoriske KIR-antistoffpreparatene beskrevet heri kan også være fordelaktigå anvende i kombinasjon med fremgangsmåter for å indusere apoptose eller kan omfatte apoptotiske midler. F.eks. har et antall onkogener blitt identifisert som inhibitorer av apoptose, eller programmert celledød. Eksempler på onkogener i denne kategorien inkluderer men er ikke begrenset til bcr-abl, bcl-2 (forskjellig frabcl-1, syklin Dl; GenBank aksesjonsnummer M14745, X06487; US patenter nr.

5 650 491 og 5 539 094) og familiemedlemmer som inkluderer Bcl-xl, Mcl-1, Bak,Al og A20. Overekspresjon av bcl-2 ble først oppdaget i T-cellelymfom. Onkogenebcl-2 fungerer ved å binde og inaktivere Bax, et protein i den apoptotiskereaksjonsvei. Inhibering av bcl-2-funksjon forhindrer inaktivering av Bax og tillaterfortsettelsen av den apoptotiske reaksjonsvei. Inhibering av denne onkogenklassen, f.eks. ved å anvende antisensnukleotidsekvenser, RNAi, siRNA eller små kjemiske molekylforbindelser er omfattet av anvendelsen ifølge den foreliggende beskrivelse for å gi forsterket apoptose (US patent nr. 5 650 491; 5 539 094 og 5 583 034).

De inhibitoriske KIR-antistoffpreparatene beskrevet heri kan også omfatte elleranvendes i kombinasjon med molekyler som omfatter en målrettet del, f.eks. antistoff, ligand eller konjugat derav, rettet mot en spesifikk markør eller målcelle

("målrettet middel"), f.eks. mot en tumorcelle. Generelt vil målrettede midler for anvendelse i disse ytterligere aspektene ved beskrivelsen fortrinnsvis gjenkjenne mottakelige tumorantigener som fortrinnsvis eller spesifikt uttrykkes i tumorsetet. De målrettede midlene vil generelt binde til en overflateuttrykt, overflatetilgjengelig eller overflatelokalisert komponent på en tumorcelle. De målrettede midlene vil også fortrinnsvis ha høye affinitetsegenskaper; og vil ikke ha signifikante in vivobivirkninger mot livsopprettholdende, normalt vev, slik som ett eller flere vev valgt fra hjerte, nyre, hjerne, lever, benmarg, tarm, bryst, prostata, tyroid, galleblære, lunge, binyrer, muskler, nervefibre, pankreas, hud eller andre livsopprettholdende organer i det menneskelige legeme. Betegnelsen "ikke har signifikante bivirkninger" som anvendt heri viser til det faktum at et målrettet middel, når det administreres in vivo, vil produsere kun neglisjerbare eller klinisk håndterbare bivirkninger, slik som de som normalt forekommer ved kjemoterapi.

I behandlingen av tumorer kan et antistoffpreparat som beskrevet heri ytterligere omfatte eller kan anvendes i kombinasjon med adjunktforbindelser. Adjunktforbindelser kan inkludere f.eks. antibrekkmidler slik som serotoninantagonister og terapier slik som fenotiaciner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyrofenoner, kortikosteroider, benzodiazepiner og kanabinoider; bisfosfonater slik som soledronsyre og pamidronsyre; og hematopoetiske vekstfaktorer slik som erytropoetin og G-CSF, f.eks. filgrastim, lenograstim ogdarbepoietin.

I en annen utførelsesform kan to eller flere antistoffer beskrevet heri med ulike kryssreakti vite ter, inkludert NKVSF1 kombineres i et enkelt preparat for slik å nøytralisere den inhibitoriske effekten av så mange inhibitoriske KIR-genproduktersom mulig. Preparater som omfatter kombinasjoner av kryssreagerende inhibitoriske KIR-antistoffer ifølge denne oppfinnelsen, eller fragmenter eller derivater derav, viltillate en enda videre anvendelse fordi det sannsynligvis eksisterer en liten prosent av den humane populasjon som mangler hver av de inhibitoriske KIRgenproduktene som gjenkjennes av et enkelt kryssreagerende antistoff. Tilsvarende kan et antistoffpreparat beskrevet heri ytterligere omfatte ett eller flere antistoffer som gjenkjenner enkelte inhibitoriske KIR-undertyper. Slike kombinasjoner viligjen tilveiebringe videre anvendelse i en terapeutisk setting.

Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å forsterke NKcelleaktivitetseffekt i en pasient med behov for slik behandling, omfattende trinnene å administrere et preparat som beskrevet heri til nevnte pasient. Fremgangsmåten er nærmere spesifikt rettet på økningen av NK-celleaktivitet i pasienter med ensykdom hvor økning av NK-celleaktivitet er fordelaktig, som involverer, påvirkereller er forårsaket av celler som er mottakelig for lysis av NK-celler, eller som erforårsaket eller kjennetegnet ved manglende NK-celleaktivitet, slik som i en kreft,andre proliferative sykdommer, en infeksiøs sykdom eller en immunsykdom.

Nærmere bestemt utnyttes fremgangsmåtene ved foreliggende beskrivelse for behandlingen av mange krefttyper og andre proliferative sykdommer som inkluderer men ikke er begrenset til karsinoma, inkludert karsinom i blæren, bryst, tarm, nyre, lever, lunge, eggstokk, prostata, pankreas, mage, livmorhals, tyroid og hud, inkluder skvamøs cellekarsinom, hematopoetiske tumorer i lymfesystemet, inkludert leukemi, akutt lymfocyttleukemi, akutt lymfoblastleukemi, B-cellelymfom, Tcellelymfom, Hodgkins lymfom, ikke-Hodgkins lymfom, hårcellelymfom ellerBurketts lymfom; hematopoetiske tumorer i myeloidsystemet, inkludert akutt eller kronisk myelogenøs leukemi og promyelocyttisk leukemi; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkludert fibrosarkom og rabdomyosarkom; andre tumorer, inkludert melanom, seminoma, teratokarsinom, nevroblastom og gliom; tumorer i det sentrale og perifere nervesystem, inkludert astrocytom, nevroblastom, gliom og schwannoma; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkludert fibrosarkom, rabdomyosarkom og osteosarkom; og andre tumorer, inkludert melanom xeroderm pigmentosum, keratoacantom, seminom, tyrpid follikulær kreft og teratokarsinom.

Foretrukne sykdommer som kan behandles ifølge foreliggende beskrivelse inkluderer hematopoetiske tumorer i lymfesystemet, f.eks. T-celle- og Bcelletumorer, inkludert men ikke begrenset til T-cellesykdommer slik som Tprolymfocyttisk leukemi (T-PLL), inkludert små celle og cerebriform celletype;større granulær lymfocyttleukemi (LGL), fortrinnsvis av T-celletype; Sezarysyndrom (SS); voksen T-celle-leukemilymfom (ATLL); a/d T-NHL hepatospenlymfom; perifer/post-tymus T-cellelymfom (pleomorf og immunblastiskeundertyper); angioimmunoblastisk T-cellelymfom; angiosentrisk (nasal) Tcellelymfom, anaplastisk (Ki 1+) større cellelymfom; T-celletarmlymfom; Tlumfoblastisk; og lymfom/leukemi (T-Lbly/T-ALL).

Andre prolifererende sykdommer kan også behandles i henhold til beskrivelsen, inkludert f.eks. hyperblasias, fibrosis (spesielt pulmonær, men også andre typer fibrose, slik som renal fibrose), angiogenese, psoriasis, aterosklerose og glatt muskelproliferering i blodårer; slik som stenose eller restenose etterfulgt av angioplasti. Det kryssreagerende inhibitoriske KIR-antistoffet ifølge dennebeskrivelsen kan anvendes for å behandle eller forebygge infeksiøse sykdommer, inkludert fortrinnsvis hvilken som helst infeksjoner forårsaket av virus, bakterier, protosoa, mugg eller sopp. Slike virale infeksiøse organismer inkluderer men er ikke begrenset til hepatitt type A, hepatitt type B, hepatitt type C, influensa, varicella, adenovirus, herpes simplex type I (HSV-1), herpes simplex type 2 (HSV2), kvegpest, rinovirus, ekkovirus, rotavirus, respiratorisk syncytialvirus, papillomaviris, cytomegalovirus, ekinovirus, arbovirus, huntavirus koxasikivirus, kusmavirus, meslingvirus, røde hunder virus, poliovirus og human immunsviktvirus type I eller type 2 (HIV-1, HIV-2).

Bakterieinfeksjoner som kan behandles ifølge denne beskrivelsen inkluderer men er ikke begrenset til infeksjoner forårsaket av følgende: Staphylococcus;

Streptococcus, inkludert S. pyogenes; Enterococcl; Bacillus, inkludert Bacillus anthracis, og Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphteriae; Gardnerella inkludert G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas inkludert Raeruginose; Legionella; Neisseria inkludert N.gonorrhoeae og N.meningitides; Flavobaterium inkludert F. meningosepticum og F. odoraturn; Burcella; Bordetella inkludert B. pertussis og B. bronchiseptica; Escherichia inkludert E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia inkludert S. marcescens og S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus inkludert P. mirabilis og P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiacea inkludert R. fickettsfi, Chlamydia inkludert C. psittaci og C. trachornatis; Mycobacterium inkludert M. tuberculosis, M. intracellular, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bo vis, M. africanum, M. kansaii, M. intracellulare og M. lepraernorium; og Nocardia.

Protozoainfeksjoner som kan behandles ifølge denne beskrivelsen inkluderer men er ikke begrenset til, infeksjoner forårsaket av leishmania, kokzidioa og trypanosoma. En fullstendig liste over infeksjonssykdommer finnes på hjemmesiden til the National Center for Infectious Disease (NCID) ved senter for sykdomskontroll (CDC) (http; //w w w. cde, goy/ncidod/di s e a se s/). Alle nevnte sykdommer er kandidater for behandling ved anvendelse av de kryssreagerende inhibitoriske KIRantistoffene ifølge beskrivelsen.

Slike fremgangsmåter for å behandle ulike infeksjonssykdommer kan utnytte antistoffpreparater ifølge denne beskrivelsen, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlings- og/eller terapeutiske midler som er kjent for behandling av slikesykdommer, inkludert antivirale midler, antisoppmidler, antibakterielle midler, antibiotika, antiparasittmidler og anti-protozoamidler. Når disse fremgangsmåteneinvolverer ytterligere behandlinger med ytterligere terapeutiske midler kan disse midlene administreres sammen med antistoffene beskrevet heri som enten en enkel doseringsform eller som separate, multiple doseringsformer. Når de administreres som en separat doseringsform kan de ytterligere midlene administreres forut for, samtidig med eller etter administreringen av antistoffet beskrevet heri.

Ytterligere aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil bli beskrevet i den følgende eksperimentelle delen, som bør betraktes som illustrerende og ikke begrensende for rammen av denne oppfinnelsen.

Eksempel 1

Rensing av PBL’er og dannelse av polyklonale eller klonale NK-cellelinjerPBL’ er ble utledet fra friske donorer ved hjelp av Ficoll Hupaque-gradienter oguttømming av plastiske adherentceller. For å oppnå berikede NK-celler ble PBL’erinkubert med anti-CD3-, anti-CD4- og anti-HLA-DR mAb’er (30 min. ved 4°C),

etterfulgt av geite anti mus magnetiske kuler (Dynal) (30 min ved 4°C) og immunmagnetisk seleksjon ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen (Pende et al., 1999). CD3 -, CD4 -, CDR -celler ble dyrket på bestrålteforceller og 100 U/ml interleukin 2 (proleukin, Chiron Corporation) og 1,5 ng/ml fytohemagglutinin A (Gibco BRL) for å oppnå polyklonale NK-cellepopulasjoner.NK-celler ble klonet ved hjelp av begrenset fortynning og kloner av NK-celler blekarakterisert ved flow cytometri for ekspresjon av celleoverflatereseptorer.

De anvendte mAb’er var JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 og GL183 (IgGl anti KIR2DL1 og KIR2DL3), XA-141 IgM (anti KIR2DL1 med den sammespesifisiteten som EB6), anti CD4 (HP2.6) og anti DR (Dl.12, IgG2a). Istedenfor JT3A, HP2.6 og DR1.12, som ble fremstilt av søkerne, kan kommersielt tilgjengelig mAb med de samme spesifisiteter anvendes (Beckman Coutler Inc., Fullerton, CA). EB6 og GL183 er kommersielt tilgjengelig (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141 er ikke kommersielt tilgjengelig, men EB6 kan anvendes forlysisrekonstitusjonskontroll som beskrevet i Moretta et al., 1993.

Celler ble farget med de passende antistoffer (30 mns ved 4°C) etterfulgt av PE eller FITC-konjugert polyklonalt antimuseantistoffer (Southern BiotechnologyAssociates Inc.). Prøver ble analysert ved hjelp av cytofluormetrisk analyse på et FACSAN-apparat (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

De følgende klonene ble anvendt i denne studien. CP11, CN5 og CN505 er KIR2DL1-positive kloner og ble farget ved hjelp av EB6 (IgGl og KIR2DL1) ellerXA-141 (IgM-anti KIR2DL1, med samme spesifisitet sammenlignet med EB6antistoffer). CN12 og CP502 er KIR2DL3-positive kloner og ble farget med GL183antistoff (IgGl-anti-KIR2DL3).

Den cytolytiske aktiviteten til NK-klonene ble vurdert ved hjelp av en standard 4timers 51Cr-frigjøringsanalyse hvor effektor NK-celler ble testet på Cw3- eller Cw4positive cellelinjer som er kjent for deres sensitivitet for NK-cellelysis. Alle måleneble anvendt ved 5000 celler pr. brønn i mikrotiterplater og effektor:mål-forhold erangitt i figurene (vanligvis 4 effektorceller pr. målceller). Den cytolytiske analysen ble utført med eller uten supernatant med de angitte monoklonale antistoffer ved !/2fortynning. Prosedyren var vesentlig den samme som beskrevet i Moretta et al., 1993.

Eksempel 2

Dannelse av nye mAb

mAb ble dannet ved å immunisere 5 uker gamle Balb C-mus med aktivertpolyklonalt eller monoklonale NK-cellelinjer som beskrevet i Moretta et al., 1990.Etter ulike cellefusjoner ble mAb først utvalgt for deres evne til å kryssreagere med EB6 og GL183-positive NK-cellelinjer og -kloner. Positive monoklonale antistofferble ytterligere analysert for deres evne til å rekonstituere lysis ved hjelp av EB6

positive eller GL183-positive NK-kloner av henholdsvis Cw4- eller Cw3-positivemålceller.

Cellefarging ble utført som følger. Celler ble farget med et antistoffpanel (1 pg/ml eller 50 pl supernatant, 30 mns ved 4°C) etterfulgt av PE-konjugert geite-F(ab’)2fragment-anti-muse IgG (H+L) eller PE-konjugert geite-F(ab’)2-fragmentantihumant IgG (Fc-gamma)-antistoffer (Beckman Coulter). Cytofluorometriskanalyse ble utført på et Epics XL.MCL-apparat (Beckman Coulter).

Ett av de monoklonale antistoffene, DF200 mAb, ble funnet å reagere med ulike medlemmer av KIR-familien, inkludert KIR2DL1, KIR2DL2/3. Begge KIR2DL1+og KIR2DL2/3+-NK-cellene ble farget klart med DF200mAb (fig. 1).

NK-kloner som uttrykker én eller en annen (eller begge) av disse HLA klasse Ispesifikke inhibitoriske reseptorer ble anvendt som effektorceller mot målceller som uttrykker én eller flere HLA-C-alleler. Cytotoksisitetsanalyser ble utført som følger.Den cytolytiske aktiviteten til YTS-KIR2DL1 eller YTS-Eco-cellelinjene blevurdert ved hjelp av en standard 4 timers 51Cr-frigjøringsanalyse. Effektorcelleneble testet på HLA-Cw4-positive eller -negative EBV-cellelinjer og HLA-Cw4transfekterte 721.221-celler. Alle målcellene ble anvendt ved 3000 celler/brønn imikrotitreringsplate. Effektor/målratio er angitt i figurene. Den cytolytiske analysen ble utført med eller uten den angitte fullengde- eller F(ab’)2-fragmentene avmonoklonale muse antistoffer eller humane antistoffer. Som forventet viste KIR2DL1+ NK-kloner liten om noen cytolytisk aktivitet mot målceller somuttrykker HLA-Cw4 og KIR2DL3+-NK-kloner viste ingen eller liten aktivitet påCw3-positive målceller. Imidlertid, i nærvær av DF200mAb (anvendt for å maskerederes KIR2DL-reseptorer) ble NK-klonene ikke i stand til å gjenkjenne deres HLAC-ligander og viste sterk cytolytisk aktivitet på Cw3- eller Cw4-mål.

F.eks. ble CIR-cellelinjen (CW4+EBV-cellelinjen, ATCC n°CRL 1993) ikke dreptav KIR2DL1+ NK-kloner (CN5/CN505), men inhiberingen kunne effektivtreverseres ved å anvende enten DF200 eller et konvensjonelt anti-KIR2DLl-mAb.På den annen side drepte NK-kloner som uttrykte KIR2DL2/3+ KIR2DLl -fenotyp(CN12) effektivt CIR-celler og denne drepingen ble ikke påvirket av DF200mAb(fig. 2). Tilsvarende resultater ble oppnådd med KIR2DL2- eller KIR2DL3-positiveNK-kloner på Cw3-positive målceller.

Tilsvarende ble Cw4+ 221 EBV-cellelinjen ikke drept av KIR2DLl+-transfekterteNK-celler, men inhiberingen kunne effektivt reverseres ved anvendelsen av entenDF200, et DF200 Fab-fragment, eller et konvensjonelt anti-KIR2DLl mAb EB 6eller XA141. En Cw3+ 221 EBV-cellelinje ble heller ikke drept av KIR2DL2+ NKceller, men denne inhiberingen kunne reverseres ved anvendelsen av enten DF200 eller et DF200-Fab-fragment. Endelig ble sistnevnte Cw3+ 221 EBV-cellelinje ikkedrept av KIR2DL3+-NK-celler, men denne inhiberingen kunne reverseres ved

anvendelsen av enten et DF200 Fab-fragment eller et konvensjonelt anti-KIR2DL3mAb GLI83 eller ¥249. Resultatene er vist i fig. 3.

F(ab’)2-fragmenter ble også testet for deres evne til å rekonstituere lysis av Cw4positive målceller. F(ab’)2-fragmenter av DF200 og EB6 Ab’er var begge i stand tilå reversere inhiberingen av lysis ved hjelp av KIR2DLl-transfekterte NK-celler avCw4-transfektert 221-cellelinje og Cw4+ TUBO EBV-cellelinje. Resultatene er visti fig- 4.

Eksempel 4

Dannelse av nye humane mAb’er

Humane monoklonale anti-KIR Ab’er ble dannet ved å immunisere transgene musfremstilt for å uttrykke et humant antistoffrepertoar med rekombinant KIR-protein.Etter ulike cellefusjoner ble mAb’ene først utvalgt for deres evne til å kryssreagere med immobisert KIR2DL1- og KIR2DL2-protein. Flere monoklonale antistoffer,inkludert 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 ble funnet å reagere med KIR2DL1 ogKIR2DL2/3.

Positive monoklonale antistoffer ble ytterligere analysert for deres evne til å rekonstituere lysis ved hjelp av EB6-positive NK-transfektante celler som uttrykkerKIR2DL1 av Cw4-positive målceller. NK-cellene som uttrykker HLA klasse Ispesifikke inhibitoriske reseptorer ble anvendt som effektorceller mot målceller som uttrykker én eller flere HLA-C-alleler (fig. 5 og 6). Cytotoksisitetsanalyser bleutført som beskrevet ovenfor. Effektor/målcelleforhold er angitt i figurene og antistoffer ble anvendt ved enten 10 jig/ml eller 30 pg/ml.

Som forventet viste KIR2DL1+ NK-celler liten om noen cytolytisk aktivitet motmålceller som uttrykker HLA-Cw4. I nærværet av 1-7F9 mAb ble NK-celleneimidlertid ikke i stand til å gjenkjenne deres HLA-C-ligander og viste sterkcytolytisk aktivitet på Cw4-målceller. F.eks. ble de to cellelinjene som var testet(HLA-Cw4 transfektert 721.221- og Cw4+ EBV-cellelinjer) ikke drept avKIR2DL1+ NK-celler, men hemmingen kunne effektivt reverseres ved anvendelsenav enten Mab 1-7F9 eller et konvensjonelt anti-KIR2DLl-mAb-EB6. Ab DF200 ogpanKIR (også kalt NKVSF19 ble sammenlignet med 1-7F9. Antistoffene 1-4F1, 16F5 og 1-6F1 var på den annen side ikke i stand til å rekonstituere cellelysisgjennom NK-celler på Cw4-positive målceller.

Eksempel 5

Biacore-analyse av DF200 mAb/KIR2DLl og DF200 mAb/KIR2DL3-interaksjonerProduksjonen og rensingen av rekombinante proteiner

KIR2DL1- og KIR2DL3-rekombinante proteiner ble fremstilt i E. coli. cDNA somkoder for hele det ekstracellulære domenet av KIR2DL1 og KIR2DL3 ble amplifisert ved hjelp av PCR fra pCDM8-klon 47.11-vektor (Biassoni et al., 1993)

og RSVS(gpt)183-klon-6-vektor (Wagtman et al., 1995) ved å anvende de følgendeprimere

Sens: 5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3’Anti-sens: 5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’

De ble klonet i pMLl-ekspresjonsvektor i ramme med en sekvens som koder for etbiotinyleringssignal (Saulquin et al., 2003).

Proteinekspresjon ble utført i BL21(DE3)-bakteriestamme (Invitrogen).Transfekterte bakterier ble dyrket til OD6oo=0,6 ved 37°C i mediet supplementert med ampicillin (100 pg/ml) og ekspresjon ble indusert med 1 mM IPTG.

Proteiner ble gjenvunnet fra inklusjonslegemer og denaturerende betingelser (8 M urea). Tilbakefolding av de rekombinante proteiner ble utført i 20 mM Tris, pH 7,8, NaCl 150 mM buffer som inneholdt L-arginin (400 mM, Sigma) og 0merkaptoetanol (1 mM), ved romtemperatur, ved å redusere ureakonsentrasjonen i en sekstrinns dialyse (henholdsvis 4, 3, 2, 1, 0,5 og 0 M urea). Redusert og oksidert glutation (5 mM og 0,5 mM, Sigma) ble tilsatt i løpet av 0,5- og 0 Mureadialysetrinnene. Endelig ble proteinene dialysert grundig mot 10 mM Tris, pH 7,5 NaCl 150 mM-buffer. Løselige, tilbakefoldede proteiner ble konsentrert ogderetter renset på en Superdex 200 størrelseseksklusjonskolonne (Pharmacia; AKTA-system).

Overflate plasmonresonansmålinger ble utført på et Biacore-apparat (Biacore). I alleBiacore-eksperimentene ble HBS-buffer tilført 0,05 % overflateaktivt P20-middelbrukt som kjørebuffer.

Proteinimmobilisering

Rekombinant KIR2DL1- og KIR2DL3-proteiner fremstilt som beskrevet ovenforble immobilisert kovalent på karboksylgrupper i dekstranlaget på en sensor chip CM5 (Biacore). Sensorchipoverflaten ble aktivert med EDC/NHC (N-etyl-N’-(3dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid og N-hydroksysuksinimid, Biacore).Proteiner, i koplingsbuffer (10 mM acetat, pH 4,5) ble injisert. Deaktivering av de gjenværende aktiverte gruppene ble utført ved å anvende 100 mM etanolamin, pH 8 (Biacore).

Affinitetsmålinger

For kinetiske målinger ble ulike konsentrasjoner av det løselige antistoff (1 x 10 7 til 4 x 10’10M) påført på den immobiliserte prøven. Målinger ble utført ved en 20 pl/min. kontinuerlig gjennomstrømningshastighet. For hver syklus ble overflaten til sensorchipen regenerert med 5 pl injeksjon av 10 mM NaOH pH 11. BIAlogg kinetikk-evalueringsprogramet (BIAevaluation 3.1, Biacore) ble anvendt for åanalysere data. Den løselige analytten (40 pl ved ulike konsentrasjoner) ble injisert med en gjennomstrømningshastighet på 20 pl/min. i HBS-buffer, på dekstranlag

inneholdende 500 eller 540 reflektansenheter (RU), og 1000 eller 700 RU av henholdsvis KIR2DL1 og KIR2DL3. Data er representative for 6 uavhengige eksperimenter. Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.

Tabell 1. BIAcore-analyse av DF200 mAb som binder til immobilisert KIR2DL1 ogKIR2DL3.

Protein

Kd (10’9 M)

KIR2DE1

10,9 +/- 3,8

KIR2DE3

2,0 +/- 1,9

Kd: dissosiasjonskonstant.

Eksempel 6

Biacore kompetitiv bindingsanalyse av anti-KIR-antistoffer fra mus og menneskeEpitopkartleggingsanalyse ble utført på immobilisert KIR2DL1 (900 RU), KIR2D13 (2000 RU) og KIR2DS1 (1000 RU) med muse anti-KIR2D-antistoffer DF200,Pan2D, gll83 og EB6, og humane anti-KIR2D-antistoffer 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 og 17F9 som beskrevet tidligere (Gauthier et al., 1999, Suanal og van Regenmortel 1995).

Alle eksperimentene ble utført ved en gjennomstrømningshastighet på 5 pl/min. i HBS-buffer med 2 min. injeksjon av de ulike antistoffer ved 15 pg/ml. For hvertantistoffpar ble kompetitiv bindingsanalyse utført i to trinn. I det første trinnet ble det første monoklonale antistoffet (mAb) injiesrt på KIR2D-målprotein etterfulgt avdet andre mAb (uten å fjerne det første mAb) og det andre mAb RU-verdi (RU2) blemonitorert. I det andre trinnet ble det andre mAb injisert først, direkte på nakent KIR2D-protein og mAb RU-verdien (RU1) ble monitorert. Prosentvis hemming avden andre mAb binding til KIR2D-protein gjennom første mab ble beregnet:100*(l-RU2/RUl).

Resultatene er vist i tabellene 2, 3 og 4 hvor antistoffene angitt "første antistoff’ er angitt i den vertikale kolonnen og det "andre antistoff’ er angitt i den horisontale kolonnen. For hver testet antistoffkombinasjon er verdiene for direkte bindingsnivå (RU) for antistoffene til chipen angitt i tabellen hvor direkte binding av det andre antistoffet til KIR2D-chipen er angitt i den øvre delen av feltet og verdien forbinding til det andre antistoffet til KIR2D-chipen når det første antistoffet er tilstedeer angitt i den lavere delen av feltet. Angitt til høyre i hvert felt er prosent inhibering for andre antistoffbinding. Tabell 2 viser bindingen på en KIR2DE1chip, tabell 3 viser bindingen av antistoffer til en KIR2DE3-chip og tabell 4 viserbindingen av antistoffer til en KIR2DSl-chip.

Kompetitiv binding av museantistoffer DF200, NKVSF1 og EB6 og humane antistoffer 1-4F1, 1-7F9 og 1-6F1 til immobilisert KIR2DE1, KIR2DE2/3 og

KIR2DLS1 ble vurdert. Epitopkartlegging (fig. 7) fra eksperimenter med anti-KIRantistoffer som bindert il KIR2DL1 viser at (a) antistoff 1-7F9 er kompetitiv medEB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200; (b) antistoff 1-4F1 på sin side erkompetitiv med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7F9; (c) NKVSF1 konkurrerer medDF200, 1-4F1 og EB6 mne ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer medNKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9. Epitopkartlegging (fig. 8) fraeksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder til KIR2DL3 viste at (a) 1-4F1er kompetitiv med NKVSF1, DF200, gil83 og 1-7F9; (b) 1-7F9 er kompetitiv medDF200, gli83 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer medDF200, 1-4F1 og GL183, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer medNKVSF1, 1-4F1 og 1-7F9, men ikke med GL183. Epitopkartlegging (fig. 9) fraeksperimenter med anti-KIR-antistoffer som binder til KIR2DS1 viste at (a) 1-4F1er kompetitiv med NKVSF1, DF200 og 1-7F9; (b) 1-7F9 er kompetitiv med 1-4F1men ikke kompetitiv med DF200 og NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1 og1-4F1 men ikke med 1-7F9.

Eksempel 7

Anti-KIR mAb-titrering med cynomolgus-NK-celler

Anti-KIR-antistoff NKVSF1 ble testet for dets evne til å binde NK-celler fracynomolugsaper. Bindingen av antistoffet til ape-NK-celler er vist i fig. 10.

Rensing av ape PBMC og dannelse av polyklonale NK-cellematerialeCynomolgus Macaque PBMC ble fremstilt fra natriumsitrat CPT-rør (BectonDickinson). NK-cellerensing ble utfør tved hjelp av negativ uttømming (MacaqueNK-celleanrikningskit, Stem Geil Technology). NK-celler ble dyrket på bestråltehumane forceller, 300 U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1 ng/ml fytohemagglutinin A (Invitrogen, Gibco) for å oppnå polyklonale NKcellepopulasj oner.

Pan2D mAb titrering med cynomolgus-NK-celler.

Cynomolgus-NK-celler (NK-materiale dag 16) ble inkubert med ulike mengderPan2D mAb etterfulgt av PE-konjugerte geite F(ab’)2-fragmenter-anti-muse-IgG(H+L)-antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt med en isotypiskkontroll (renset muse IgGl). Prøver ble utført i duplikat. Gjennomsnittelig fluorescensintensitet = MEI.

: O O : o j 'f*

J o o i \ø O * 03 oi

k

' t2

J l

Tabell 2: K1R2DL1 -epitopekardegging

e^

SC rr

• v®

* &■’■

i æ

«sS

o xr

o 5C

: x? O

O Vi

O

<n

o o *n cv en 03

i

I

> N?

>

i

9^

'Fabell 3: KIR.2DL3~epit:opckartieggin i Andre Ab

; O

» tA O : 04 <** : 0*

«-< øi

j

eS V*

’ «5

' "sF * 04

a’' «3

$ Q

‘5

§ « $

J *

> tn

i

} JS*'

§ 05

<3 s**

tn

"s?' €>■

O o

w

1 abcH 4: KIRSDSI-épiuipekartleggi

* o

Eksempel 8

Epitop-kartlegging av DF200- og pan2D-binding til KIR2DL1

Datamodellering av de ekstracellulære domenene til KIR2DL1, -2 og -3(KIR2DL1-3), basert på deres publiserte krystallstrukturer (Maenaka et al. (1999),Fan et al. (2001), Boyington et al. (2000)), antydte involveringen av aminpsurene R1311 i interaksjon mellom KIR2DL1 og KIR2DLl-3-kryssreagerendemusemonoklonale antistoffer (mAb’er) DF200 og pan2D. For å verifisere dette ble fusjonsproteiner fremstilt som bestod av det fullstendige ekstracellulære domenet til KIR2DL1 (aminosyrene H1-H224), enten villtype eller punktmutert (f.eks.

R131W2), fusert til humant Fc (hFc). Materialet og metodene som ble anvendt for å fremstille og evaluere de ulike KIR2DEl-hFc fusjonsproteinene er beskrevet(Winter og Eong (2000)). Kort fortalt ble KIR2DE1 (R131W)-hFc-kodende cDNAvektorer dannet ved hjelp av PCR-basert mutagenese (Quickchange II, Promega) avCE42-Ig, en publisert cDNA-vektor for fremstillingen av villtype KIR2DEl-hFc(Wagtmann et al., (1995)). KIR2DEl-hFc og KIR2DE1 (R131W)-hFc ble fremstiltCOS7-celler og isolert fra vevskulturmediet, vesentlig som beskrevet av Wagtmannet al., 1995. For å teste den korrekte foldingen ble KIR2DEl-hFc og KIR2DE1(R131W)-hFc inkubert med ECE721.221-celler som uttrykker enten HEC-Cw3(ingen KIR2DEl-ligand) eller HEA-Cw4 (KIR2DEl-ligand) og interaksjonenmellom KIR-Fc-fusjonsproteiner og celler ble analysert ved hjelp av FACS, enstandardteknikk for å studere proteininteraksjoner på celleoverflate. Et eksempel på uavhengige eksperimenter er gitt i fig. 11, panel A. Som forutsatt fra literaturen bandt ingen av KIR2DEl-hFc-fusjonsproteinene til HEA-Cw3 uttrykt avECE271.221-celler. I kontrast til dette bandt både KIR2DEl-hFc og KIR2DE1(R131W)-hFc til HEA-Cw4-uttrykkende ECE721.221-celler hvilket dervedbekreftet deres korrekte folding.

Bindingen av KIR2DE1 (R131W)-hFc og KIR2DEl-hFc til KIR-spesifikke mAb(DF200, pan2D, EB6 og GE183) ble studert ved å anvende EEISA, en standardteknikk for å undersøke proteininteraksjoner. Kort fortalt ble KIR2DE1 (R131W)-hFc og KIR2DEl-hFC bundet til 96-brønns plater via geite anti-humaneantistoffer, hvoretter KIR-spesifikke mAb ble tilsatt i ulike konsentrasjoner (0-1pg/ml i PBS). Interaksjonene mellom KIR2DEl-hFc-varianter og mAb’er blevisualisert ved hjelp av spektrofotometri (450 nm) ved å anvende peroksidasekoplede sekundære antistoffer spesifikke for museantistoffer for å konvertere TMB-substrat. Et ekempel på uavhengige eksperimenter er gitt i fig. 11,panel B. Mens KIR2DE2-3-spesifikke mAb GE183 ikke var i stand til å binde noenav KIR2DEl-hFc-fusjonsproteinene bandt KIR2DE1-spesifikke mAb EB6, DF200og pan2D til KIR2DEl-hFc-varianter på en doseavhengig måte.

Enkeltpunktmutasjonen (R131W) påvirket bindingen av DF200 og pan2D med en reduksjon i binding sammenlignet med villtype på ~10 % ved høyeste konsentrasjon

av mAb (1 jig/ml), hvilket bekreftet at R131 er del av bindingssetet til DF200 og pan2D i ekstracellulært domene 2 i KIR2DL1.

Enkeltbokstavaniinosyrekode

5 2Substitusjon av R for W ved aminosyreposisjon 131 (fra N-terminale ende) i KIR2DL1

REFERANSER

Moretta, A.; Bottbo, C.» Pende, D.f Tripadi, G., Tambussi, G., Viale. 0,3 Oreago, A., Barbsresi, M., Merii. A.s Ciccone. E., and et al. (1990). Identification of four snbsets of human CD3-CD16+ narural Idlfer (NK) cells by the sxpression of donally distribntedfimctional surface molecules: correlation between subset assignment of NK clones and ability to mediate specific alloaiitigeiirecogBition.. J Exp Med 172,1589-1598.

Moretta. A., Vitale, M, Bottiuo, C.5 Orengo, A. M., Morelli, L., Augugliaio, IL, Barbaresi, M.s Ciceone, E., and Moretta, L. (1993). P58 molecules as putafive receptois for major histocoæpatibility complex (MHC) class I molecules in human namral killer (NK) cells. Anti-p58 antibodies reconstitute lysis of MHC dass I-protected cells m NK. clones displaying different specmcities. I Exp Med 178, 597-604. ’

Pende, D., Parolini, S.» Pessino, A., Sivori, S.. Augugllaro, JL, Moielli, L.,. Marcensro, E., Accame, L., Malaspina. A., Biassoni, R., et al (1999). Identification and molecdar characterization of NKp30, a novel triggermg receptor involved in natnral cytotoxicity mediated byhuman natura! kfllereells. J Exp Medl 90,1505-1516. '

Ruggen, L., Capanni, M., Urbani, E.. Pemiccio, K, ShlomcKk, W. D., Tosti, A^ Posati. S., Rogaia, D., Frassoni, F., Aversa, F, et al (2002). Effeotiveness of donor natura! killer cell alloieactivity in mismatched hematopoietic transplanta. Science 295, 20972100. "

Wagtmann N, Biassoni R, Cantoni C, Verdiani S, Malnafi MS, Vitale M, Bot&io C, Moretta L, Moretta A, Long EO.Molecular clones of the p58 NK cell receptor reveal

hnniunoglobulm-rdated mokcules with diveråty in both. the extra- and intracsUulardoæaius.hnmimiiy. 1995 May;2(5):439-49.

Biassom R. Verdiaai S, Cambiaggi A, Romeo PH, Feirmi S, Mbretta L.Human CD3CD164- nafural killer cebs express the hGATA-3 T cell iranscription fector and anunrearranged 2.3-kb TcR delta transcript. Eur J toUBimot 19.93 May523(5): 1083-7,Saulquin X, Gastiael LN, Viker E.Crystal stiucture of the human, naturai killer cell activating receptorKIR2DS2 (CDISSj) J Exp Med, 2003 Apr 7:197(7):933-8, .

Gauthiep L., Lemmer», B,s Guelpa-Fonlupt. V.. Fougereau, M., and Schixf, C.

u-SLC physico-chemicai interactions of the human preB cell receptor: Implications forVH repertoire selection and cell signaling at the preB cell stage, Journal of Immunology.

16.2., 41-50. (1999).

Sauna], H. and Van RegénmortéL M.H.V., Mapping of viral conformation epiiopes usingbiosensor measuremems. Journal ofTmrmmoloeyy 183: 33-41 (1995).

Bovington. JC: Motyka SA; Schuck P; Brooks AG; Sua PD. Naiure, Vol. 405 (6786) pp.

537-543 (2000)

FanQR; Long EO; WilevDC. Nature immuriology. Vol. 2 (5) pp. 452-460 (2001)

Maenaka K: Juii T; Smart DI; Jones EY. Structure wifa Folding and design. Vol. 7 (4) pp. 391-398 (1999)

Wagtmanii N: Rajagopalan S: Wimsr CC; Perorzi M; Long EO. Immnnity. Vol. 3 (6)

pp. 801-809 (1995)

Winter CC; Long EO. Natura] Killer Cells Protocols (edited by Campbell KS and

Colønna M). Human Press, pp. 219-238 (2000)

Enhver kombinasjon av de ovenfor beskrevne elementer i alle mulige variasjoner er derfor omfattet av beskrivelsen om ikke annet er angitt heri, eller på annen måte kontradiktert av konteksten.

5 Uttrykkene "en" og "den" og lignende referanser som anvendt i forhold til å beskrive oppfinnelsen skal tolkes å dekke både entall og flertall om ikke annet er angitt heri eller klart kontradiktert av konteksten.

Angivelse av verdiområder heri er kun ment som en stenografisk metode for å referere individuelt til hver separat verdi som faller innenfor dette området om ikke 10 annet er angitt heri, og hver separate verdi er inkorporert i beskrivelsen som om den var individuelt angitt. Om ikke annet er angitt er alle eksakte verdier angitt heri representative for tilsvarende aproksimative verdier (f.eks. alle eksakte eksempelvis angitte verdier som er tilveiebrakt med hensyn til en spesifikk faktor eller et mål kan betraktes og også tilveiebringe en tilhørende aproksimativ verdi, modifisert 15 gjennom "omtrent" om passende).

Alle beskrevne fremgangsmåter kan utøves på en egnet måte om ikke annet er angitt heri eller på annen måte klart kontradiktert av konteksten.

Anvendelsen av enhver og alle eksempler, eller eksempelspråkbruk (f. eks. "som") tilveiebrakt heri er kun ment for å bedre illustrere oppfinnelsen og medfører ingen

5 begrensning av rammen av oppfinnelsen om ikke annet er angitt. Ingen språkbruk i beskrivelsen bør tolkes som en indikasjon for at et element er vesentlig for å praktisere oppfinnelsen om ikke dette eksplisitt er angitt.

Claims

PATENTKRAV

1. Isolert antistoff eller antistoffragment,

karakterisert ved at det (a) kryssreagerer med minst to ulike humane KIR2DL polypeptider som hver gjenkjenner en ulik gruppe av HLA-C-klasse Iallotyper, og (b) nøytraliserer den inhibitoriske aktivitet av slike peptider, hvori nevnte antistoff eller antistoffragment binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3.

2. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet binder i det vesentlige til den samme epitop som antistoff DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) eller konkurrerer medantistoff DF-200 for binding til nevnte KIR2DE polypeptider.

3. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte antistoff konkurrerer med DF -200 (deponertsom CNCM 1-3224) for binding til nevnte KIR2DE polypeptider.

4. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte antistoff binder til samme epitop som antistoff DF-200 (deponert som CNCM 1-3224).

5. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 3,

karakterisert ved at det omfatter lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3 til DF200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 12.

6. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

5,

karakterisert ved at det omfatter lettkjedevariabelregionen til DF -200(deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 12.

7. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

6,

karakterisert ved at det omfatter tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 til DF-200 (deponert som CNCM 1-3224) som vist i figur 13.

8. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

7,

karakterisert ved at det omfatter tungkjede til DF-200 (deponert somCNCM 1-3224) som vist i figur 13.

9. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

8,

karakterisert ved at det spesifikt binder til KIR2DL1 innenfor et område definert av aminosyrerestene 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, og 192.

10. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 18,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/KIR2DL3 uten å interagere med aminosyrerester utenfor regionen definert av aminosyrerestene 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, og 192.

11. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R131 er mutert til Ala.

12. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R157 er mutert til Ala.

13. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og som ikke binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R158 er mutert til Ala.

14. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 restene 131, 157 og 158.

15. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til en mutant av KIR2DL1 hvor R131 er

mutert til Trp, men binder ikke til villtype KIR2DS3.

16. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 8,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR2DS4.

17. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 18,

karakterisert ved at det binder til KIR2DL1 og KIR2DL2/3, men binder ikke til KIR2DS4.

18. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

17,

karakterisert ved at antistoffet eller antistoffragmentet er et monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

19. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

18,

karakterisert ved at antistoffet eller antistoffragmentet er et humant antistoff eller et fragment derav, humanisert antistoff eller et fragment derav, eller et kimært antistoff eller et fragment derav.

20. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 119,

karakterisert ved at antistoffragmentet er et Fab, et Fab’, et Fab’-SH, etF(ab’)2, et Fv, et diastoff, et enkeltkjedet antistoffragment, eller et multi-spesifiktantistoff som omfatter en rekke ulike antistoffragmenter.

21. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1 20,

karakterisert ved at det forårsaker en minst 50% potensiering i NK cytotoksisitet som målt ved kromfrigivningstest av cytotoksisitet.

22. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

21,

karakterisert ved at det inhiberer binding av (i) et HLA-C allel molekylsom har en Lys rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1 reseptor, og (ii) et HLA-Callel molekyl som har en Asn rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3 reseptorer.

23. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

22,

karakterisert ved at det fremmer lysering av matchede eller HLA kompatible målceller ved NK celler som utrykker KIR2DL1 og KIR2DL2, hvori nevnte målceller ikke effektivt lyseres av NK celler i fravær av nevnte antistoff eller antistoffragment.

24. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1

23,

karakterisert ved at det omfatter en Fc region som medierer lav effektor funksjon.

25. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 124,

karakterisert ved at det har en Fc region til human IgG4 isotype.

26. Sammensetning egnet for human administrering, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk akseptabel eksipient og et antistoff eller antistoffragment som (a) kryssreagerer med minst to ulike humane KIR2DL polypeptider som hver gjenkjenner en ulik gruppe av HLA-C-klasse Iallotyper, og (b) nøytraliserer den inhibitoriske aktivitet av slike peptider, hvori nevnte antistoff eller antistoffragment binder KIR2DL1 og KIR2DK2/3.

27. Sammensetning ifølge krav 26,

karakterisert ved at den omfatter minst et isolert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-25.