PT1639013E - Anticorpos contra receptor nk pan-kir2dl e a sua utilização em diagnóstico e terapêutica - Google Patents

Anticorpos contra receptor nk pan-kir2dl e a sua utilização em diagnóstico e terapêutica Download PDF

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PT1639013E
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kir
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human
antibodies
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PT47441159T
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Allessandro Moretta
Mariella Della Chiesa
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Innate Pharma
Univ Genova
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Description

1
DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONTRA RECEPTOR NK PAN-KIR2DL E A SUA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICA"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados dos mesmos que apresentam reacção cruzada com dois ou mais receptores inibidores presentes na superfície celular de células NK e potenciam a citotoxicidade de célula NK em indivíduos mamíferos ou numa amostra biológica. A invenção também se refere aos métodos para fabricar tais anticorpos, fragmentos, variantes e derivados; composições farmacêuticas que compreendem os mesmos; e à utilização de tais moléculas e composições, particularmente em terapêutica, para aumentar a actividade ou citotoxicidade de células NK em indivíduos.
Antecedentes
As células assassinas naturais (NK) são uma subpopulação de linfócitos envolvidos na imunidade não convencional. As células NK podem ser obtidas pelas várias técnicas conhecidas na especialidade, tais como a partir de amostras de sangue, citaférese, colecções, etc.
As características e propriedades biológicas das células NK incluem a expressão de antígenos de superfície incluindo CD 16, CD56 e/ou CD57; a ausência do complexo TCR alfa/beta ou gama/delta na superfície celular; a capacidade para se ligar a e destruir células que não expressam "auto" antígeno MHC/HLA pela activação de enzimas citolíticas específicas; a capacidade para destruir células de tumor ou outras células doentes que expressam um receptor-ligando de activação de NK; a capacidade para libertar citocinas que estimulam ou inibem a resposta imune; e a capacidade para passar por ciclos múltiplas de divisão celular e produzir células filhas com propriedades biológicas similares às da 2 célula precursora. Dentro do contexto desta invenção as células NK "activas" designam células NK biologicamente activas, mais particularmente células NK tendo a capacidade de lisar as células alvo. Por exemplo, uma célula NK "activa" é capaz de destruir células que expressam um receptor-ligando de activação de NK e falha em expressar "auto" antigenos MHC/HLA (células KIR-incompativeis).
Com base nas suas propriedades biológicas, várias estratégias terapêuticas e de vacina foram propostas na técnica que contam com uma modulação de células NK. Entretanto, a actividade de célula NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve tanto sinais estimuladores como inibidores, consequentemente, a terapêutica eficaz mediada pela célula NK pode requerer tanto um estimulo destas células como uma neutralização de sinais inibidores.
As células NK são negativamente reguladas pelos receptores inibidores específicos de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Kárre et al., 1986; Õhlén et al., 1989). Estes receptores específicos ligam-se a determinantes polimórficos de moléculas da classe I de MHC ou HLA presentes em outras células e inibem a lise da célula NK. Nos seres humanos, certos membros de uma família de receptores chamada de receptores do tipo Ig assassinos (KIR) reconhecem grupos de alelos de classe I de HLA.
Os KIR são uma família grande de receptores presentes em certos subconjuntos de linfócitos, incluindo células NK. A nomenclatura para os KIR está fundamentada no número de domínios extracelulares (KIR2D ou KIR3D) e seja a cauda citoplasmática longa (KIR2DL ou KIR3DL) ou curta (KIR2DS ou KIR3DS). Entre os seres humanos, a presença ou ausência de um dado KIR é variável de uma célula NK para outra dentro da população de NK presente num único indivíduo. Na população humana existe também um nível relativamente alto de polimorfismo das moléculas KIR, com certas moléculas KIR 3 a estar presentes em alguns, mas não todos os indivíduos. Certos produtos génicos KIR causam o estímulo de actividade linfocítica quando ligados a um ligando apropriado. Dos KIR estimuladores confirmados todos têm uma cauda citoplasmática curta com um resíduo transmembranar com carga que se associa a uma molécula adaptadora que tem um motivo imunoestimulador (ITAM). Outros produtos génicos KIR são inibidores por natureza. Todos os KIR inibidores confirmados têm uma cauda citoplasmática longa e parecem interagir com subconjuntos diferentes de antígenos HLA dependendo do subtipo de KIR. Os KIR inibidores possuem na sua porção intracitoplasmática um ou vários motivos inibidores que recrutam fosfatases. Os receptores de KIR inibidores conhecidos incluem membros das subfamílias KIR2DL e KIR3DL. Os receptores de KIR que têm dois domínios de Ig (KIR2D) identificam alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designados p58.2) ou o produto do gene bastante aparentado KIR2DL3 reconhece um epítopo partilhado pelos alotipos de HLA-C do grupo 2 (Cw 1, 3, 7 e 8), ao passo que KIR2DL1 (p58.1) reconhece um epítopo partilhado pelos alotipos de HLA-C do grupo 1 recíproco (Cw 2, 4, 5 e 6). 0 reconhecimento pelo KIR2DL1 é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 dos alelos de HLA-C. O reconhecimento de KIR2DL2 e KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. De modo importante a grande maioria de alelos de HLA-C tem um resíduo Asn ou um Lys na posição 80. Um KIR com três domínios de Ig, KIR3DL1 (p70), reconhece um epítopo partilhado pelos alelos HLA-Bw4. Finalmente, um homodímero de moléculas com três domínios de Ig KIR3DL2 (pl40) reconhece HLA-A3 e - All.
Embora os KIR inibidores e outros inibidores de receptores da classe I (Moretta et al. , 1997; Valiante et ai, 1997a; Lanier, 1998) possam ser co-expressos pelas células NK, em qualquer dado repertório de NK do indivíduo existem células que expressam um único KIR e assim, as 4 células NK correspondentes sao bloqueadas apenas pelas células que expressam um grupo de alelo de classe I específico. A população de célula NK ou clones que são desemparelhados em KIR, isto é, a população de células NK que expressam KIR que não são compatíveis com uma das moléculas de HLA de um hospedeiro, mostram ser os mediadores mais prováveis do efeito anti-leucemia de enxerto observado no transplante alogénico (Ruggeri et al., 2002). Um modo de reproduzir este efeito num dado indivíduo seria usar reagentes que bloqueiam a interacção de KIR/HLA.
Os anticorpos monoclonais específicos para KIR2DL1 mostraram bloquear a interacção de KIR2DL1 com alelos Cw4 (ou similares) (Moretta et al., 1993). Também foram descritos anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 que bloqueiam a interacção de KIR2DL2/3 com alelos HLACw3 (ou similares) (Moretta et al., 1993). Entretanto, a utilização de tais reagentes em situações clínicas requereria o desenvolvimento de dois mAbs terapêuticos para tratar todos os pacientes, independente de se qualquer dado paciente expressasse alelos de HLA-C de classe 1 ou classe 2. Além disso, teria que ser predeterminado qual tipo de HLA cada paciente estava a expressar antes de decidir qual anticorpo terapêutico usar, resultando assim num custo muito mais alto de tratamento.
Watzl et al., Tissue Antigens, 56, p. 240 (2000) produziram anticorpos que reagem de maneira cruzada que reconhecem isotipos múltiplos de KIR, mas estes anticorpos não exibem a potenciação de actividade de célula NK. G. M. Spaggiara et al., Blood, 100, pp. 4098 a 4107 (2002) levaram a cabo experiências utilizando numerosos anticorpos monoclonais contra vários KIR. Um destes anticorpos, o NKVSF1, foi dito reconhecer um epítopo comum de CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) e p50.3 (KIR2DS4). Não é sugerido que NKVSF1 possa potenciar a actividade de célula 5 NK e não existe nenhuma sugestão que ele poderia ser usado como um agente terapêutico. Consequentemente, abordagens práticas e eficazes na modulação da actividade de célula NK não foram disponibilizadas até agora na técnica e ainda se requer a intervenção especifica de alelo HLA usando reagentes específicos.
Sumário da Invenção 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja dentro das reivindicações é proporcionada para informação somente. A descrição proporciona agora novos anticorpos, composições e métodos que superam as dificuldades actuais na activação de célula NK e proporcionam características e benefícios vantajosos adicionais. Num aspecto exemplar, a descrição proporciona um anticorpo único que facilita a activação de células NK humanas virtualmente em todos os seres humanos. Mais particularmente, a descrição proporciona novos anticorpos específicos que reagem de maneira cruzada com vários grupos KIR inibidores e neutralizam seus sinais inibidores, que resultam na potenciação da citotoxicidade de célula NK em células NK que expressam tais receptores de KIR inibidores. Esta capacidade para reagir de maneira cruzada com produtos génicos de KIR múltiplos permite que os anticorpos da descrição sejam eficazmente usados para aumentar a actividade de célula NK na maior parte dos indivíduos humanos, sem a carga ou despesa de predeterminar o tipo de HLA do indivíduo.
Num primeiro aspecto, a descrição proporciona anticorpos, fragmento de anticorpo e derivados de qualquer um dos mesmos, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reage de maneira cruzada com pelo menos dois receptores de KIR inibidores na superfície das células NK, neutraliza os sinais inibidores das células NK e potência a actividade das células NK. Mais preferivelmente, o 6 anticorpo liga-se a um determinante comum de receptores KIR2DL humano. Ainda mais especificamente, o anticorpo desta descrição liga-se pelo menos aos receptores de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Para os propósitos desta invenção, o termo "KIR2DL2/3" refere-se a cada um ou a ambos dos receptores de KIR2DL2 e KIR2DL3. Estes dois receptores têm uma homologia muito alta, são presumivelmente formas alélicas do mesmo gene e são considerados pela técnica como sendo permutáveis, consequentemente, KIR2DL2/3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidora para os propósitos desta invenção e, portanto um anticorpo que reage de maneira cruzada apenas com KIR2DL2 e KIR2DL3 e nenhum outro dos receptores de KIR inibidores está dentro do âmbito desta invenção. 0 anticorpo desta descrição inibe especificamente a ligação de moléculas MHC ou HLA a pelo menos dois receptores de KIR inibidores e facilita a actividade de célula NK. Ambas as actividades são inferidas pelo termo "neutraliza a actividade inibidora de KIR," como é usado no presente documento. A capacidade dos anticorpos desta descrição para "facilitar a actividade de célula NK," "facilitar a citotoxicidade de célula NK, " "facilitar as células NK, " "potenciar a actividade de célula NK, " "potenciar a citotoxicidade de célula NK," ou "potenciar as células NK" no contexto desta descrição significa que o anticorpo permite que as células NK expressem um receptor de KIR inibidor na sua superfície para ser capaz de lisar células que expressam na sua superfície um ligando correspondente para aquele receptor de KIR inibidor particular (por exemplo, um antígeno de HLA particular). Num aspecto particular, a memória descritiva proporciona um anticorpo que inibe especificamente a ligação de moléculas HLA-C aos receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Num outro aspecto particular, a descrição proporciona um anticorpo que 7 facilita a actividade de célula NK in vivo.
Devido a que pelo menos um de KIR2DL1 ou KID2DL2/3 está presente em pelo menos cerca de 90 % da população humana, os anticorpos mais preferidos desta invenção são capazes de facilitar a actividade de célula NK contra a maioria das células associadas ao alotipo HLA-C, respectivamente alotipos de HLA-C do grupo 1 e alotipos de HLA-C do grupo 2. Assim, as composições desta descrição podem ser usadas para activar ou potenciar eficazmente células NK na maioria dos indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90 % dos indivíduos humanos ou mais.
Consequentemente, uma composição de anticorpo único de acordo com a invenção pode ser usada para tratar a maioria dos indivíduos humanos e existe a rara necessidade para determinar grupos alélicos ou para usar coquetéis de anticorpo. A descrição demonstra, pela primeira vez, que anticorpos de reacção cruzada e de neutralização contra KIR inibidores podem ser gerados e que tais anticorpos permitem a activação eficaz de células NK num intervalo amplo de grupos humanos.
Um objectivo particular desta descrição reside assim num anticorpo, em que o dito anticorpo se liga especificamente a receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL2/3 e inverte a inibição da citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIR. Num aspecto, o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Opcionalmente, o dito anticorpo que compete com o anticorpo DF200 não é o próprio anticorpo DF200.
Num outro aspecto, o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal NKVSF1, opcionalmente em que o anticorpo que compete com anticorpo NKVSF1 não é o anticorpo NKVSF1.
Num outro aspecto, o anticorpo compete com o anticorpo 1-7F9.
Preferivelmente, os ditos anticorpos são anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados ou anticorpos humanos.
0 termo "compete com" quando se refere a um anticorpo monoclonal particular (por exemplo, DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183) significa que um anticorpo compete com o anticorpo monoclonal (por exemplo, DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183) num ensaio de ligação usando moléculas KIR recombinantes ou moléculas KIR expressas na superfície. Por exemplo, se um anticorpo reduz a ligação de DF200 a uma molécula KIR num ensaio de ligação, o anticorpo "compete" com DF200. Um anticorpo que "compete" com DF200 pode competir com DF200 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL1 humano, ao receptor de KIR2DL2/3 humano ou tanto ao receptor KIR2DL1 como ao KIR2DL2/3 humanos.
Num aspecto preferido, a memória descritiva revela um anticorpo que se liga tanto ao receptor KIR2DL1 como ao KIR2DL2/3 humanos, inverte a inibição da citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIR e compete com DF200, 1-7F9 ou NKVSF1 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL1 humano, ao receptor de KIR2DL2/3 humano ou tanto ao receptor KIR2DL1 como ao KIR2DL2/3 humanos. Opcionalmente, o dito anticorpo não é NKVSF1. Opcionalmente, o dito anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
Num outro aspecto, a descrição proporciona um anticorpo que liga tanto ao receptor KIR2DL1 como aos KIR2DL2/3 humanos, inverte a inibição da citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIR e compete com EB6 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL1 humano, compete com GL183 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL2/3 humano ou compete tanto com EB6 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL1 humano quanto com GL183 quanto à ligação ao receptor de KIR2DL2/3 humano. Opcionalmente, o dito anticorpo não é NKVSF1; opcionalmente o dito anticorpo não é DF200. Opcionalmente, o dito anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
Num aspecto vantajoso, a descrição proporciona um 9 anticorpo que compete com DF200 e reconhece, se liga ou tem imunoespecificidade para substancialmente ou essencialmente o mesmo, ou o mesmo epitopo ou "local epitópico" numa molécula KIR como o anticorpo monoclonal DF200. Preferivelmente, a dita molécula KIR é um receptor de KIR2DL1 humano ou um receptor de KIR2DL2/3 humano.
Um objectivo particular desta descrição reside num anticorpo, em que o dito anticorpo se liga a um determinante comum presente em receptores tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 humanos e inverte a inibição da citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIR. 0 anticorpo liga-se mais especificamente substancialmente ao mesmo epitopo no KIR como o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 ou anticorpo NKVSFl produzido pelo hibridoma NKVSFl, em que o anticorpo não é NKVSFl.
Num aspecto preferido, o anticorpo desta descrição é um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo mais preferido desta descrição é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. 0 hibridoma que produz o anticorpo DF200 foi depositado na colecção de cultura CNCM, com a Identificação n° "DF200", registo n° CNCM 1-3224, registado em 10 de Junho de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F- 75724 Paris Cedex 15, França. O anticorpo NKVSFl está disponível de Serotec (Cergy Sainte-Christophe, França), Ref. de Catálogo n° MCA2243. O NKVSFl também é denominado como pan2D mAb no presente documento. A descrição também proporciona fragmentos e derivados funcionais dos anticorpos descritos no presente documento, tendo especificidade e actividade de antígeno substancialmente similares (por exemplo, que podem reagir de maneira cruzada com o anticorpo precursor e que potenciam a actividade citotóxica de células NK que 10 expressam receptores de KIR inibidores), incluindo, sem limitação, um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma imunoadesina, um diacorpo, uma CDR e um ScFv. Além disso, os anticorpos desta descrição podem ser humanizados, humanos ou quiméricos. A descrição também proporciona derivados de anticorpo que compreendem um anticorpo da descrição conjugado ou covalentemente ligado a uma toxina, um radionuclideo, uma fracção detectável (por exemplo, um flúor) ou um suporte sólido. A descrição também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo como revelado acima, um fragmento deste ou um derivado de qualquer um dos mesmos. Consequentemente, a descrição também se refere à utilização de um anticorpo como é revelado no presente documento num método para o fabrico de um medicamento. Em aspectos preferidos, o dito medicamento ou composição farmacêutica é para o tratamento de um cancro ou outro distúrbio proliferativo, uma infecção ou para a utilização em transplante.
Num outro aspecto, a descrição proporciona uma composição que compreende um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK nas células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é incorporado num lipossoma. Opcionalmente a dita composição compreende uma substância adicional seleccionada a partir de uma molécula de ácido nucleico para a libertação de genes para a terapêutica de gene; uma molécula de ácido nucleico para a libertação de ARN antisense, ARNi ou ARNip para a supressão de um gene numa célula NK; ou uma toxina ou um medicamento para a destruição direccionada de células NK adicionalmente 11 incorporadas no dito lipossoma. A descrição também proporciona métodos de regulação da actividade de célula NK humana in vitro, ex vivo ou in vivo, que compreende contactar células NK humanas com uma quantidade eficaz de um anticorpo da descrição, um fragmento de tal anticorpo, um derivado de qualquer um dos mesmos ou uma composição farmacêutica que compreenda pelo menos um de qualquer um dos mesmos. Os métodos preferidos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica desta descrição e são direccionados a aumentar a actividade citotóxica de células NK humanas, o mais preferivelmente ex vivo ou in vivo, num indivíduo que tem um cancro, uma doença infecciosa ou uma doença imune.
Em aspectos adicionais, a descrição proporciona um hibridoma que compreende: (a) uma célula B de um hospedeiro mamífero (tipicamente um hospedeiro mamífero não humano) que tenha sido imunizado com um antígeno que compreende um epítopo presente num polipéptido KIR inibidor, fusionado a (b) uma célula imortalizada (por exemplo, uma célula de mieloma), em que o dito hibridoma produz um anticorpo monoclonal se liga pelo menos a dois receptores humanos de KIR inibidores diferentes e é capaz de neutralizar pelo menos substancialmente a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois receptores humanos de KIR inibidores diferentes. Opcionalmente, o dito hibridoma não produz anticorpo monoclonal NKVSF1. Preferivelmente, o dito anticorpo liga-se aos receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente, o dito anticorpo liga-se a um determinante comum presente m KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente, o dito hibridoma produz um anticorpo que inibe a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Lys na posição 80 a um receptor de KIR2DL1 humano e a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Asn na posição 80 aos receptores de 12 KIR2DL2/3 humanos. Preferivelmente, o dito hibridoma produz um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 no KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 ou tanto no KIR2DL1 como no KIR2DL2/3. Um exemplo de tal hibridoma é o DF200. A descrição também proporciona métodos de produção de um anticorpo que reage de maneira cruzada com produtos génicos KIR2DL múltiplos e que neutralizam a actividade inibidora de tais KIR, compreendendo o dito método as etapas de: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunogénio que compreenda um polipéptido de KIR2DL; (b) preparar anticorpos a partir do dito mamífero imunizado, em que os ditos anticorpos se ligam ao dito polipéptido de KIR2DL, (c) seleccionar os anticorpos de (b) que reagem de maneira cruzada com pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL diferentes e (d) seleccionar os anticorpos de (c) que potenciem células NK. Num aspecto, o dito mamífero não humano é um animal transgénico modificado geneticamente para expressar um repertório de anticorpo humano (por exemplo, um mamífero não humano que compreenda locais de imunoglobulina humano e supressões de gene de imunoglobulina nativa, tal como um Xenomouse® (Abgenix-Fremont, CA, USA) ou mamífero não humano que compreendem um minilocal de genes que codificam Ig humanos, tais como o HuMab-mouse® (Medarex-Princeton, NJ, USA)). Opcionalmente, o método compreende ainda seleccionar um anticorpo que se liga a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, célula NK ou polipéptido KIR. Opcionalmente, a invenção compreende ainda um método para avaliar um anticorpo, em que um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco 13 cinomolgo, preferivelmente em que o macaco é observado quanto a presença ou ausência de uma indicação de toxicidade do anticorpo. A memória descritiva também proporciona um método de produção de um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, compreendendo o dito método as etapas de: a) imunizar um mamífero não humano com um imunogénio que compreenda um polipéptido de KIR inibidor; b) preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado, em que os ditos anticorpos se ligam ao dito polipéptido de KIR, c) seleccionar anticorpos de (b) que reagem de maneira cruzada com pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes e seleccionar anticorpos de (c) que sejam capazes de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que a ordem das etapas (c) e (d) é opcionalmente invertida e qualquer número das etapas são opcionalmente repetidas 1 ou mais vezes. Preferivelmente, o polipéptido de KIR inibidor usado para a imunização é um polipéptido de KIR2DL e os anticorpos seleccionados na etapa (c) reagem de maneira cruzada com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente, o dito anticorpo reconhece um determinante comum presente em pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR diferentes; o mais 14 preferivelmente o dito KIR é KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o dito método compreende ainda seleccionar um anticorpo que se liga a uma célula NK ou polipéptido de KIR de primata, preferivelmente um macaco cinomolgo.
Opcionalmente, a invenção compreende ainda um método de avaliação de um anticorpo, em que um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, preferivelmente em que o macaco é observado quanto a presença ou ausência de uma indicação de toxicidade do anticorpo.
Opcionalmente, nos métodos descritos acima, o anticorpo seleccionado na etapa c) ou d) não é NKVSF1. Preferivelmente, o anticorpo preparado na etapa (b) nos métodos acima é um anticorpo monoclonal. Preferivelmente, o anticorpo seleccionado na etapa (c) nos métodos acima inibe a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Lys na posição 80 a um receptor de KIR2DL1 humano e a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Asn na posição 80 aos receptores KIR2DL2/3 humanos. Preferivelmente, os anticorpos seleccionados na etapa (d) nos métodos acima causam uma potenciação na citotoxicidade de NK, por exemplo, qualquer potenciação substancial ou pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou mais de potenciação na citotoxicidade de NK, por exemplo, pelo menos cerca de 50 % de potenciação da citotoxicidade de NK alvo (por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % (tal como, por exemplo, cerca de 65 a 100 %) de potenciação da citotoxicidade de célula NK). Preferivelmente, o anticorpo liga-se substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 no KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Opcionalmente os ditos métodos também ou alternativamente compreendem a etapa adicional de fabricar fragmentos dos anticorpos 15 monoclonais seleccionados, fabricar derivados dos anticorpos monoclonais seleccionados (por exemplo, pela conjugação com um radionúclido, agente citotóxico, molécula repórter ou similares) ou fabricar derivados de fragmentos de anticorpo produzidos a partir de sequências ou que compreendem sequências que correspondam às sequências de tais anticorpos monoclonais. A descrição ainda proporciona um método de produção de um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, compreendendo o dito método as etapas de: (a) seleccionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo que reage de maneira cruzada com pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL inibidores humanos diferentes causa uma e (b) seleccionar um anticorpo de (a) que seja capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL inibidores humanos diferentes. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a um determinante comum presente no KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o dito anticorpo seleccionado na etapa (b) não é NKVSF1. Preferivelmente, o anticorpo seleccionado na etapa (b) inibe a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Lys na posição 80 a um receptor de KIR2DL1 humano e a ligação de uma molécula de alelo HLA-c que tem um resíduo de Asn na posição 80 aos receptores KIR2DL2/3 humanos. Preferivelmente, o anticorpo seleccionado na etapa (b) 16 potenciação na citotoxicidade de NK, por exemplo, qualquer potenciação substancial ou pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou mais de potenciação na citotoxicidade de NK, por exemplo, pelo menos cerca de 50 % de potenciação da citotoxicidade de NK alvo (por exemplo, pelo menos cerca de 60 % , pelo menos cerca de 70 O, o r pelo menos cerca de 80 % , pelo menos cerca de 85 o, o r pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 o, "0 (tal como, por exemplo, cerca de 65 a 100 %) de potenciação da citotoxicidade de célula NK) . Preferivelmente, o anticorpo liga-se substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 no KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Opcionalmente o método compreende a etapa adicional de fabricar fragmentos dos anticorpos monoclonais seleccionados, fabricar derivados dos anticorpos monoclonais seleccionados ou fabricar derivados dos fragmentos de anticorpo monoclonal seleccionados.
Adicionalmente, a descrição proporciona um método para produzir um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, compreendendo o dito método as etapas de: a) cultivar um hibridoma da descrição sob condições permissivas para a produção do dito anticorpo monoclonal; e b) separar o dito anticorpo monoclonal a partir do dito hibridoma. Opcionalmente o método compreende a etapa adicional de fabricar fragmentos do dito anticorpo monoclonal, fabricar derivados do anticorpo monoclonal ou fabricar derivados de tais fragmentos de 17 anticorpo monoclonal. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a um determinante comum presente no KIR2DL1 e KIR2DL2/3 .
Também se proporciona pela presente descrição um método de produção de um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, compreendendo o dito método as etapas de: a) isolar a partir de um hibridoma da descrição um ácido nucleico que codifica o dito anticorpo monoclonal; b) opcionalmente modificar o dito ácido nucleico de modo a obter-se um ácido nucleico modificado que compreenda uma sequência que codifique um anticorpo modificado ou derivatizado que compreenda uma sequência de aminoácido que corresponda a uma sequência funcional do anticorpo monoclonal ou é substancialmente similar a esta (por exemplo, é pelo menos cerca de 65 o ° r pelo menos cerca de 75 o ° r pelo menos cerca de 85 o o r pelo menos cerca de 90 o o r pelo menos cerca de 95 o o (tal como cerca de 70 a 99 %) idêntica a uma tal sequência) seleccionada a partir de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um fragmento imunorreactivo de um anticorpo ou uma proteína de fusão que compreenda um tal fragmento imunorreactivo; c) inserir o dito ácido nucleico ou ácido nucleico modificado (ou ácido nucleico relacionado que codifica a mesma sequência de aminoácido) num vector de expressão, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo codificado é capaz de ser expresso quando o 18 dito vector de expressão está presente numa célula hospedeira cultivada sob condições apropriadas; d) transfectar uma célula hospedeira com o dito vector de expressão, em que a dita célula hospedeira de outro modo não produz a proteína de imunoglobulina; e) cultivar a dita célula hospedeira transfectada sob condições que causem a expressão do dito anticorpo ou fragmento de anticorpo; e f) isolar o anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido pela dita célula hospedeira transfectada. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a um determinante comum presente no KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
Será apreciado que a descrição também proporciona uma composição que compreende um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores de KIR inibidor humano diferentes, o dito anticorpo a estar presente numa quantidade eficaz para potenciar de modo detectável a citotoxicidade de célula NK num paciente ou numa amostra biológica que compreenda as células NK; e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a um determinante comum presente no KIR2DL1 e KIR2DL2/3. A dita composição opcionalmente ainda pode compreender um segundo agente terapêutico seleccionado, por exemplo, de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a um receptor de KIR inibidor e o inibe, um agente anti-infeccioso, um agente direccionador ou um composto adjunto. Os agentes imunomoduladores vantajosos podem ser seleccionados de IL-1 alfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, 19 GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta ou IFN-gama. Os exemplos dos ditos agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorrubicina, tamoxifeno, taxol, taxotere, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo (5FU), arabinósido de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina (s), outros alcaloides da vinca e derivados ou pró-fármacos dos mesmos. Os exemplos de agentes hormonais incluem leuprorelina, goserelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifeno, flutamida, nilutamida, ciproterona bicalutamid anastrozol, exemestano, letrozol, fadrozol, medroxi, clormadinona, megestrol, outros agonistas de LHRH, outros anti-estrogénios, outros antiandrogénios, outros inibidores de aromatase e outros progestagénios. Preferivelmente, o dito segundo anticorpo gue se liga a um receptor de KIR inibidor e o inibe é um anticorpo ou um derivado ou fragmento deste gue se liga a um epítopo de um receptor de KIR inibidor que difere do epítopo ligado pelo dito anticorpo que se liga a um determinante comum presente em pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes. A descrição ainda proporciona um método de potenciação de modo detectável da actividade de célula NK num paciente em necessidade do mesmo, que compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma composição de acordo com a descrição. Um paciente em necessidade da potenciação da actividade de célula NK pode ser qualquer indivíduo que tem uma doença ou distúrbio em que tal potenciação pode promover, realçar e/ou induzir um efeito terapêutico (ou promove, realça e/ou induz um tal efeito em pelo menos uma 20 proporção substancial de pacientes com a doença ou distúrbio e caracteristicas substancialmente similares como o paciente - como pode ser determinado, por exemplo, pelos testes clínicos). Um paciente em necessidade de tal tratamento pode estar a sofrer, por exemplo, de cancro, um outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune.
Preferivelmente, o dito método compreende a etapa adicional de administrar ao dito paciente um agente terapêutico adicional apropriado seleccionado de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a um receptor de KIR inibidor e o inibe, um agente anti-infeccioso, um agente direccionador ou um composto adjunto em que o dito agente terapêutico adicional é administrado ao dito paciente como uma forma farmacêutica única junto com o dito anticorpo ou como forma farmacêutica separada. A dosagem do anticorpo (ou fragmento/derivado de anticorpo) e a dosagem do agente terapêutico adicional colectivamente são suficientes para induzir, promover e/ou realçar de modo detectável uma resposta terapêutica no paciente que compreende a potenciação da actividade de célula NK. Onde administrado separadamente, o anticorpo, fragmento ou derivado e o agente terapêutico adicional são desejavelmente administrados sob condições (por exemplo, com respeito ao controlo do tempo, número de doses, etc.) que resulta num benefício terapêutico combinado detectável para o paciente.
Ainda são abrangidos pela presente descrição anticorpos da descrição que são capazes de se ligar especificamente às células NK de primata não humano, preferivelmente de macaco, e/ou receptores de KIR de macaco. Também são abrangidos métodos para avaliar a toxicidade, dosagem e/ou actividade ou eficácia de 21 anticorpos da descrição que sejam medicamentos candidatos. Num aspecto, a descrição abrange um método para determinar uma dose de um anticorpo que seja tóxica a um animal ou tecido alvo pela administração de um anticorpo da descrição a um animal receptor primata não humano que tem células NK e avaliar quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos ou adversos do agente no animal ou preferivelmente num tecido alvo. Num outro aspecto, a descrição é um método para identificar um anticorpo que seja tóxico a um animal ou tecido alvo pela administração de um anticorpo da descrição a um animal receptor primata não humano que tem células NK e avaliar quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos ou adversos do agente no animal ou preferivelmente num tecido alvo. Num outro aspecto, a descrição é um método para identificar um anticorpo que seja eficaz no tratamento de uma infecção, doença ou tumor, pela administração de um anticorpo da descrição a um modelo primata não humano de infecção, doença ou cancro e identificar o anticorpo que melhore a infecção, doença ou cancro ou um de seus sintomas. Preferivelmente, o dito anticorpo da descrição é um anticorpo que (a) reage de maneira cruzada com pelo menos dois receptores de KIR inibidores humanos na superfície de células NK humanas e (b) reage de maneira cruzada com células NK ou um receptor de KIR do primata não humano.
Ainda é abrangido pela presente descrição um método de detectar a presença de células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície celular numa amostra biológica ou um organismo vivo, compreendendo o dito método as etapas de: a) colocar a dita amostra biológica ou organismo vivo em contacto com um anticorpo da descrição, em que o dito anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a um fracção detectável; e b) detectar a presença do dito anticorpo na dita amostra biológica ou organismo vivo. 22 A descrição também proporciona um método de purificação a partir de uma amostra células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície celular que compreende as etapas de: a) colocar a dita amostra em contacto com um anticorpo da descrição sob condições que permitam que as ditas células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície celular se liguem ao dito anticorpo, em que o dito anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido (por exemplo, uma pérola, uma matriz, etc.); e b) eluir as ditas células NK ligadas a partir do dito anticorpo conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido.
Num outro aspecto, a descrição proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreendem a região variável leve ou uma ou mais CDRs da região variável leve do anticorpo DF200 ou anticorpo Pan2D como ilustrado na Fig. 12. Ainda num outro aspecto, a descrição proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos mesmos que compreendem uma sequência que seja altamente similar a toda ou essencialmente toda a sequência da região variável leve de DF2 0 0 ou Pan2D ou uma ou mais CDRs da região variável leve de um ou ambos destes anticorpos.
Num aspecto adicional, a descrição proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreende a região variável pesada ou uma ou mais CDRs da região variável leve do anticorpo DF200 como ilustrado na Fig. 13. Ainda num outro aspecto, a descrição proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos mesmos que compreendem uma sequência que seja altamente similar a toda ou essencialmente toda da sequência da região variável pesada de DF2 0 0 . 23
Estes e aspectos vantajosos adicionais e características da descrição podem ser ainda descritos no presente documento em outro lugar.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 representa o anticorpo monoclonal DF200 que se liga a um determinante comum de vários receptores KIR2DL humano. A Figura 2 representa o anticorpo monoclonal DF200 que neutraliza a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade de célula NK positiva em KIR2DL1 nas células alvo positivas em Cw4. A Figura 3 representa o anticorpo monoclonal DF200, um fragmento Fab de DF200 e anticorpos convencionais específicos de KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 que neutralizam a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade de célula NK positiva em KIR2DL1 nas células alvo positivas em Cw4 e a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade de célula NK positiva em KIR2DL2/3 nas células alvo positivas em Cw3. A Figura 4 representa a reconstituição da lise de célula pelos clones NK de células alvo positivas em HLA Cw4 na presença de fragmentos F(ab'>2 dos anticorpos DF200 e EB6 .
As Figuras 5 e 6 representam anticorpos monoclonais DF200, NKVSF1 (pan2D), anticorpos humanos 1-7F9,1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1 e anticorpos convencionais específicos de KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 que neutralizam a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade de célula NK positiva em KIR2DL1 em células alvo positivas em Cw4 (células transfectadas com Cw4 na Figura 5 e células EBV na Figura 6). A Figura 7 representa um mapa de epítopo que mostra resultados de experiências de ligação competitiva obtidos pela análise de ressonância de plasmão de superfície (BIAcore®) com anticorpos anti-KIR para KIR2DL1, onde círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação a KIR2DL1. Os resultados mostram que 1-7F9 é competitivo com 24 ΕΒ6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 e DF200, em KIR 2DL1. 0 anticorpo 1-4 F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1 e 1-7 F9. Anticorpo NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9, em KIR2DL1. DF200 compete com NKVSF1,1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9, no KIR2DL1. A Figura 8 representa um mapa de epitopo que mostra resultados de experiências de ligação competitiva obtida pela análise BIAcore® com anticorpos anti-KIR para KIR2DL3, onde os círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação a KIR2DL3. Os resultados mostram que 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, gll83 e 1-7F9 em KIR2DL3. 1-7F9 é competitivo com DF200, gll83 e 1-4F1, mas não com NKVSF1, em KIR2DL3. NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e GL183, mas não 1-7F9, em KIR2DL3. DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e 1-7F9, mas não com GL183, em KIR2DL3. A Figura 9 representa um mapa de epitopo que mostra resultados de experiências de ligação competitiva obtidos pela análise BIAcore com anticorpos anti-KIR para KIR2DS1, onde os círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação a KIR2DS 1. Os resultados mostram que o anticorpo 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200 e 1-7F9 em KIR2DS1. 0 anticorpo 1-7F9 é competitivo com 1-4F1, mas não competitiva com DF200 e NKVSF1 em KIR2DS1. NKVSF1 compete com DF200 e 1- 4F1, mas não com 1-7F9, no KIR2DS1. DF200 compete com NKVSF1 e 1- 4F1, mas não com 1-7F9, em KIR2DS1. A Figura 10 representa a titulação de NKVSF1 (pan2D) mAb que demonstra a ligação do mAb às células NK cinomolgas. As células NK cinomolgas (volume NK dia 16) foram incubadas com quantidade diferente de Pan2D mAb seguido pelos fragmentos F(ab')2 de cabra conjugado a PE de anticorpos IgG (H+L) anti-ratinho. A percentagem de células positivas foi determinada com um controlo isotípico (IgGl de ratinho purificado). As amostras foram feitas em duplicata. A intensidade de fluorescência média = MFI. A Figura 12 proporciona um alinhamento comparativo das 25 sequências de aminoácido das regiões variáveis leves e CDRs da região variável leve de anticorpos DF200 e Pan2D mAb. A Figura 13 proporciona a região variável pesada de anticorpo DF200.
Descrição Pormenorizada Anticorpos
A presente descrição proporciona novos anticorpos e fragmentos ou derivados dos mesmos que se ligam a determinantes comuns de receptores humanos de KIR inibidores, preferivelmente um determinante presente em pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL diferentes e causam a potenciação de células NK que expressam pelo menos um daqueles receptores de KIR. A descrição divulga, pela primeira vez, que tais anticorpos que reagem de maneira cruzada e neutralizantes podem ser produzidos, o que representa um resultado inesperado e abre uma possibilidade voltada a terapêuticas com base em NK novas e eficazes, particularmente em indivíduos humanos. Num aspecto preferido, o anticorpo não é anticorpo monoclonal NKVSF1.
Este
Dentro do contexto desta descrição um "determinante comum" designa um determinante ou epítopo que seja partilhado por diversos produtos génicos dos receptores humanos de KIR inibidores. Preferivelmente, o determinante comum é partilhado por pelo menos dois membros do grupo receptor KIR2DL. Mais preferivelmente, o determinante é partilhado por pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Certos anticorpos desta descrição podem, além de reconhecer produtos génicos múltiplo de KIR2DL, também reconhecem determinantes presentes em outros KIR inibidores, tais como produto de gene do grupo receptor de KIR3DL. 0 determinante ou epítopo pode representar um fragmento de péptido ou um epítopo conformacional partilhado pelos ditos membros. Num aspecto mais específico, o anticorpo desta descrição liga-se especificamente substancialmente ao mesmo epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal DF200. 26 determinante está presente tanto em KIR2DL1 como em KIR2DL2/3.
Dentro do contexto desta descrição, o termo anticorpo que se "liga" a um determinante comum designa um anticorpo que se liga ao dito determinante com especificidade e/ou afinidade. 0 termo "anticorpo," como é usado no presente documento, refere-se aos anticorpos policlonais e monoclonais, assim como aos fragmentos e derivados dos ditos anticorpos policlonais e monoclonais a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, aos anticorpos de tamanho natural tipicamente são designados uma das cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Diversos destes são ainda divididos em subclasses ou isotipos, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e outros. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são denominados "alfa, " "delta," "épsilon," "gama" e "mu," respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos utilizadas nesta invenção porque eles são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque elas são mais facilmente fabricadas num ambiente de laboratório. Preferivelmente, o anticorpo desta descrição é um anticorpo monoclonal. Porque uma das metas da invenção é bloquear a interacção de um KIR inibidor e seu ligando HLA correspondente in vivo sem esgotar as células NK, os isotipos que correspondem aos receptores Fc que medeiam a função efectuadora baixa, tal como IgG4, tipicamente são preferidos.
Os anticorpos desta descrição podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na especialidade. Tipicamente, eles são produzidos pela imunização de um 27 animal não humano, preferivelmente um ratinho, com um imunogénio que compreende um polipéptido de KIR inibidor, preferivelmente um polipéptido de KIR2DL, mais preferivelmente um polipéptido de KIR2DL humano. 0 polipéptido de KIR inibidor pode compreender a sequência de tamanho natural de um polipéptido de KIR inibidor humano ou um fragmento ou derivado do mesmo, tipicamente um fragmento imunogénico, isto é, uma porção do polipéptido que compreende um epítopo exposto na superfície da célula que expressa um receptor de KIR inibidor. Tais fragmentos tipicamente contêm pelo menos cerca de 7 aminoácidos consecutivos da sequência de polipéptido maduro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos destes. Os fragmentos tipicamente são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor. Ainda mais preferido é um polipéptido de KIR2DL humano que inclui pelo menos um, mais preferivelmente ambos, os domínios extracelulares de Ig, do polipéptido de KIRDL de tamanho natural e é capaz de imitar pelo menos um epítopo conformacional presente num KIR2DL receptor. Em outros aspectos, o dito polipéptido compreende pelo menos cerca de 8 aminoácidos consecutivos de um domínio de Ig extracelular das posições de aminoácido de 1 a 224 do polipéptido de KIR2DL1 (numeração de aminoácido de acordo com o web site da PROW que descreve a família de gene KIR, http://www.ncbi.nhn„nih.gov/prow/guide/1326018082.htm).
Num aspecto mais preferido, o imunogénio compreende um polipéptido humano do tipo selvagem de KIR2DL numa membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Num aspecto específico, o imunogénio compreende células NK inteiras, particularmente células NK humanas inteiras, opcionalmente tratadas ou lisadas. A etapa de imunização de um mamífero não humano com um antígeno pode ser realizada de qualquer maneira bem conhecida na especialidade para estimular a produção de 28 anticorpos num ratinho (veja-se, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). 0 imunogénio é em seguida colocado em suspensão ou dissolvido num tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo. Os métodos para determinar a quantidade de imunogénio, tipos de tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos pelos peritos na especialidade e não estão a limitar de nenhum modo a presente descrição. Estes parâmetros podem ser diferentes para imunogénios diferentes, mas são facilmente elucidados.
Similarmente, a localização e a frequência de imunização suficientes para estimular a produção de anticorpos também é bem conhecida na especialidade. Num protocolo de imunização típico, os animais não humanos são injectados intraperitonealmente com antígeno no dia 1 e novamente em torno de uma semana mais tarde. Isto é seguido por injecções de reforço do antígeno em torno do dia 20, opcionalmente com adjuvante tal como adjuvante de Freund incompleto. As injecções de reforço são realizadas intravenosamente e podem ser repetidas por diversos dias consecutivos. Isto é seguido por uma injecção de reforço no dia 40, intravenosa ou intraperitonealmente, tipicamente sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B que produzem anticorpo específico de antígeno depois de cerca de 40 dias. Outros protocolos também podem ser utilizados contanto que eles resultem na produção de células B que expressam um anticorpo direccionado ao antígeno usado em imunização.
Para a preparação de anticorpo policlonal, o soro é obtido a partir de um animal não humano imunizado e os anticorpos presentes nestes isolados por técnicas bem conhecidas. 0 soro pode ser purificado por afinidade usando qualquer um dos imunogénios apresentados acima ligados a um suporte sólido de modo a obter anticorpos que reagem com 29 receptores de KIR inibidores.
Num aspecto alternativo, linfócitos de um mamífero não humano não imunizado são isolados, cultivados in vitro e depois expostos ao imunogénio em cultura de célula. Os linfócitos são depois colhidos e a etapa de fusão descrita abaixo é realizada.
Para anticorpos monoclonais, a etapa seguinte é a isolação de esplenócitos a partir do mamífero não humano imunizado e a fusão subsequente daqueles esplenócitos com uma célula imortalizada de modo a formar um hibridoma que produz anticorpo. A isolação de esplenócitos a partir de um mamífero não humano é bem conhecida na especialidade e tipicamente envolve remover o baço de um mamífero não humano anestesiado, cortando-o em pedaços pequenos e espremendo os esplenócitos da cápsula esplénica e através de uma malha de náilon de um coador de célula num tampão apropriado de modo a produzir uma suspensão de célula única. As células são lavadas, centrifugadas e recolocadas em suspensão num tampão que lisa quaisquer células sanguíneas vermelhas. A solução é mais uma vez centrifugada e os linfócitos remanescentes na pelota são finalmente recolocadas em suspensão em tampão fresco.
Uma vez isolados e presentes em suspensão de célula única, os linfócitos podem ser fusionados a uma linha de célula imortal. Isto é tipicamente uma linha de célula de mieloma de ratinho, embora muitas outras linhas de célula imortal úteis para criar hibridomas são conhecidas na especialidade. As linhas de mieloma de murino preferidas incluem, mas não são limitadas àquelas derivadas de tumores de ratinho MOPC- 21 e MPC-11 disponíveis da Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EUA., X63 Ag8653 e células SP-2 disponíveis da Colecção Americana de Culturas Tipo [American Type Culture Collection], Rockville, Maryland, EUA. A fusão é efectuada usando polietileno glicol ou similares. Os hibridomas resultantes 30 são depois cultivados em meios selectivos que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras não fusionadas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
Os hibridomas são tipicamente cultivados numa camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos são preferivelmente de ninhadas de mamífero não humano usadas para isolar esplenócitos e são tipicamente sensibilizadas com adjuvante de Freund incompleto ou similares diversos dias antes de plaquear os hibridomas. Os métodos de fusão são descritos em Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, "pp. 59 a 103 (Academic Press, 1986).
Permite-se que as células cresçam nos meios de selecção por tempo suficiente para a formação de colónia e produção de anticorpo. Isto é usualmente entre cerca de 7 e cerca de 14 dias. As colónias de hibridoma são depois ensaiadas quanto a produção de anticorpos que reagem de maneira cruzada com produtos génicos do receptor de KIR inibidor múltiplos. O ensaio é tipicamente um ensaio do tipo ELISA colorimétrico, embora qualquer ensaio possa ser utilizado que pode ser adaptado aos reservatórios nos quais os hibridomas são cultivados. Outros ensaios incluem imunoprecipitação e radioimunoensaios. Os reservatórios positivos quanto a produção de anticorpo desejado são examinados para determinar se uma ou mais colónias distintas estão presentes. Se mais do que uma colónia está presente, as células podem ser re-clonadas e cultivadas para garantir que apenas uma única célula tenha dado origem à colónia que produz o anticorpo desejado. Os reservatórios positivos com uma colónia aparente única são tipicamente 31 re-clonadas e re-ensaiadas para garantir que apenas um anticorpo monoclonal está a ser detectado e produzido. Os anticorpos também podem ser produzidos pela selecção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como revelado por exemplo, em Ward et al., Nature, 341 (1989) p. 544) .
Os anticorpos desta descrição são capazes de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK, particularmente a inibição mediada pelos receptores de KIR2DL e mais particularmente pelo menos a inibição tanto de KIR2DL1 como de KIR2DL2/3. Estes anticorpos são assim anticorpos "neutralizadores" ou "inibidores", no sentido de que eles bloqueiam, pelo menos parcial e detectavelmente, o caminho de sinalização inibidor mediado pelos receptores de KIR quando eles interagem com moléculas da classe I de MHC. De modo mais importante, esta actividade inibidora é demonstrada com respeito a diversos tipos de receptores de KIR inibidores, preferivelmente diversos produtos génicos KIR2DL receptores e mais preferivelmente pelo menos tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 de modo que estes anticorpos possam ser usados em vários pacientes com alta eficácia. A inibição da inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK pode ser avaliada pelos vários ensaios ou testes, tais como a ligação ou ensaios celulares.
Uma vez que um anticorpo que reage de maneira cruzada com receptores de KIR inibidor múltiplos é identificado, este pode ser testado quanto a sua capacidade para neutralizar o efeito inibidor destes receptores de KIR em células NK inteiras. Numa variante especifica, a actividade neutralizante pode ser ilustrada pela capacidade do dito anticorpo para reconstituir a lise pelos clones de NK positivos em KIR2DL de alvos positivos em HLA-C. Num aspecto especifico, a actividade de neutralização do anticorpo é definida pela capacidade do anticorpo para inibir a ligação de moléculas de HLA-C aos receptores 32 KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou o KIR2DL2 intimamente relacionado), mais preferivelmente como é a capacidade do anticorpo para alterar: a ligação de uma molécula de HLA-C seleccionada a partir de Cwl, Cw3, Cw7 e Cw8 (ou de uma molécula HLA-C que tem um resíduo de Asn na posição 80) ao KIR2DL2/3; e a ligação de uma molécula de HLA-C seleccionada a partir de Cw2, Cw4, Cw5 e Cw6 (ou de uma molécula HLA-C que tem um resíduo de Lys na posição 80) ao KIR2DL1. Numa outra variante, a actividade inibidora de um anticorpo desta descrição pode ser avaliada num ensaio de citotoxicidade com base em célula, como revelado nos Exemplos aqui proporcionados.
Numa outra variante, a actividade inibidora de um anticorpo desta descrição pode ser avaliada num ensaio que libera citocina, em que as células NK são incubadas com o anticorpo de teste e uma linha de célula alvo que expressa um alelo de HLA-C reconhecido por uma molécula KIR da população de NK, para estimular a produção de citocina de célula NK (por exemplo, produção de IFN-γ e/ou GM-CSF) . Num protocolo exemplar, a produção de IFN-γ a partir de PBMC é avaliada pela superfície celular e coloração intracitoplasmática e análise pela citometria de fluxo depois de cerca de 4 dias em cultura. Em resumo, Brefeldin A (Sigma Aldrich) pode ser adicionado a uma concentração final de cerca de 5 pg/ml por no mínimo cerca de 4 horas de cultura. As células podem ser depois incubadas com anti-CD3 e anti-CD56 mAb antes da permeabilização (IntraPrep®; Beckman Coulter) e coloração com PE-anti-IFN-γ ou PE-IgGl (Pharmingen) . A produção de GM- CSF e IFN-γ a partir de células NK policlonais activadas pode ser medida em sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R & D Systems, Minneapolis, MN; IFN-γ: OptElA set, Pharmingen).
Os anticorpos desta descrição podem neutralizar 33 parcial ou completamente a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK. 0 termo "neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK," como é usado no presente documento significa a capacidade para aumentar em pelo menos cerca de 20 %, preferivelmente em pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 % ou mais (por exemplo, cerca de 25 a 100 %) da lise especifica obtida na mesmo proporção com células NK ou linhas de célula NK que não são bloqueadas pela sua KIR, como medido por um teste de libertação de cromo clássico de citotoxicidade, comparado com o nivel de lise especifica obtida sem anticorpo quando uma população de célula de NK que expressa um dado KIR é colocado em contacto com uma célula alvo que expressa a molécula de classe I MHC cognato (reconhecido pelo KIR expresso em célula NK) . Por exemplo, os anticorpos preferidos desta invenção são capazes de induzir a lise de populações de célula alvo emparelhada ou HLA compatível ou autóloga, isto é, populações de célula que poderiam não ser eficazmente lisadas pelas células NK na ausência do dito anticorpo. Consequentemente, os anticorpos desta descrição também podem ser definidos como facilitadores da actividade de célula NK in vivo.
Alternativamente, o termo "neutralizar a inibição mediada por KIR" significa que num ensaio de cromo usando um clone ou transfectante de célula NK que expressam um ou vários KIR inibidores e uma célula alvo que expressa apenas um alelo de HLA que é reconhecido por um dos KIR na célula NK, o nível de citotoxicidade obtida com o anticorpo deve ser de pelo menos cerca de 20 %, preferivelmente de pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 % (por exemplo, cerca de 25 a 100 %) ou mais da citotoxicidade obtida com uma molécula bloqueadora de classe I anti-MHC conhecida, tal como anticorpo de classe I anti-MHC W6/32. 34
Num aspecto específico, o anticorpo liga-se substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 (produzido pelo hibridoma DF200). Tais anticorpos são denominados aqui como "Anticorpos iguais ao DF2 0 0". Num aspecto preferido adicional, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Os "anticorpos iguais ao DF200" mais preferidos desta invenção são anticorpos outros que não o anticorpo monoclonal NKVSF1. O mais preferido é o anticorpo monoclonal DF200 (produzido pelo hibridoma DF200). O termo "liga-se substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como" um anticorpo de interesse significa que um anticorpo "compete" com o dito anticorpo de interesse. O termo "liga-se substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como" o anticorpo monoclonal DF200 significa que um anticorpo "compete" com DF200. No geral, um anticorpo que "se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como" o anticorpo monoclonal de interesse (por exemplo, DF200, NKVSF1, 17F9) significa que o anticorpo "compete" com o dito anticorpo de interesse quanto a qualquer uma ou mais moléculas KIR, preferivelmente uma molécula KIR seleccionada do grupo que consiste em KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em outros exemplos, um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante numa molécula KIR2DL1 como o anticorpo de interesse "compete" com o anticorpo de interesse quanto à ligação ao KIR2DL1. Um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante numa molécula KIR2DL2/3 como o anticorpo de interesse "compete" com anticorpo de interesse quanto à ligação ao KIR2DL2/3. O termo "liga-se essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante como "um anticorpo de interesse significa que um anticorpo "compete" com o dito anticorpo de interesse quanto a qualquer uma e todas as moléculas KIR às quais o dito anticorpo de interesse especificamente se liga. O termo "liga-se essencialmente ao mesmo epítopo ou 35 determinante como" o anticorpo monoclonal DF200 significa que um anticorpo "compete" com DF200 quanto a qualquer uma e todas as moléculas KIR às quais DF200 especificamente se liga. Por exemplo, um anticorpo que se liga essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante como os anticorpos monoclonais DF200 ou NKVSF1 "competem" com o dito DF200 ou NKVSF1 respectivamente quanto à ligação ao KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 e KIR2DS2. A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam substancial ou essencialmente ao mesmo epítopo que os anticorpos monoclonais descritos no presente documento pode ser facilmente determinada usando qualquer um de uma variedade de ensaios de rastreio imunológico em que a competição de anticorpo possa ser avaliada. Vários de tais ensaios são rotineiramente praticados e bem conhecidos na especialidade (veja-se, por exemplo, a Pat. U.S. N° 5.660.827, concedida em 26 de Agosto de 1997). Será entendido que determinar realmente o epítopo ao qual um anticorpo descrito no presente documento se liga não é de nenhum modo requerido para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal descrito no presente documento.
Por exemplo, onde os anticorpos de teste a serem examinados são obtidos de animais fontes diferentes ou são ainda de um isotipo Ig diferente, um ensaio de competição simples pode ser utilizado em que o controlo (DF200, por exemplo) e os anticorpos de teste são misturados (ou preabsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3, cada um dos quais é conhecido estar ligado pelo DF200. Protocolos fundamentados em ELISAs, radioimunoensaios, Western blotting e na utilização de análise BIACORE (como apresentado, por exemplo, na secção Exemplos) são adequados para a utilização em tais estudos de competição simples.
Em certos aspectos, seria possível pré-misturar os 36 anticorpos de controlo (DF200, por exemplo) com quantidades variáveis dos anticorpos de teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1:100) por um período de tempo antes de aplicar à amostra de antígeno de KIR inibidor. Em outros aspectos, o controlo e as quantidades variáveis de anticorpos de teste podem ser simplesmente misturados durante a exposição à amostra de antígeno KIR. Contanto que se possa distinguir os anticorpos ligados dos livres (por exemplo, usando-se as técnicas de separação ou lavagem para eliminar anticorpos não ligados) e DF200 dos anticorpos de teste (por exemplo, usando-se anticorpos secundários espécie-específico ou isotipo-específico ou rotulando-se especificamente DF200 com um rótulo detectável) uma pessoa seria capaz de determinar se os anticorpos de teste reduzem a ligação de DF200 aos dois antígenos de KIR2DL diferentes, indicando que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo que DF200. A ligação dos anticorpos de controlo (rotulados) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante pode servir como o valor alto de controlo. O valor baixo de controlo pode ser obtido pela incubação dos anticorpos (DF200) rotulados com anticorpos não rotulados exactamente do mesmo do tipo (DF200), onde a competição ocorreria e reduziria a ligação dos anticorpos rotulados. Num ensaio de teste, uma redução significante na reactividade do anticorpo rotulado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece substancialmente o mesmo epítopo, isto é, um que "reage de maneira cruzada" com o anticorpo (DF200) rotulado. Qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação de DF200 a cada um dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em pelo menos cerca de 50 %, tal como pelo menos cerca de 60 % ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 % (por exemplo, cerca de 65 a 100 %) , em qualquer proporção de DF200:anticorpo de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 é considerado ser um anticorpo que se liga 37 substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como DF200. Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação de DF200 a cada um dos antigenos de KIR2DL em pelo menos cerca de 90 % (por exemplo, cerca de 95 %). A competição pode ser avaliada, por exemplo, por um teste de citometria de fluxo. Num tal teste, as células que possuem um dado KIR podem ser incubadas primeiro com DF200, por exemplo, e depois com o anticorpo de teste rotulado com um fluorocromo ou biotina. 0 anticorpo é o dito competir com DF200 se a ligação obtida na pré-incubação com quantidade saturante de DF200 é de cerca de 80 %, preferivelmente de cerca de 50 %, cerca de 40 % ou menos (por exemplo, cerca de 30 %) da ligação (como medido por meio da fluorescência) obtida pelo anticorpo sem pré-incubação com DF2 0 0. Alternativamente, um anticorpo é o dito competir com DF200 se a ligação obtida com um DF200 rotulado (por um fluorocromo ou biotina) nas células pré-incubadas com quantidade saturante de anticorpo de teste é de cerca de 80 %, preferivelmente de cerca de 50 %, cerca de 40 % ou menos (por exemplo, cerca de 30 %) da ligação obtida sem a pré-incubação com o anticorpo.
Um ensaio de competição simples em que um anticorpo de teste é pré-absorvido e aplicado em concentração saturante a uma superfície sobre a qual tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 são imobilizados também pode ser vantajosamente utilizado. A superfície no ensaio de competição simples é preferivelmente um chip BIACORE (ou outro meio adequado para a análise de ressonância de plasmão de superfície). O anticorpo de controlo (por exemplo, DF200) é depois levado em contacto com a superfície na concentração saturante de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e a ligação de superfície de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 do anticorpo de controlo é medida. Esta ligação do anticorpo de controlo é comparada com a ligação do anticorpo de controlo à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 na ausência de anticorpo de teste. Num ensaio de 38 teste, uma redução significante na ligação da superfície contendo o KIR2DL1 e KIR2DL2/3 pelo anticorpo de controlo na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo de controlo tal que o anticorpo de teste "reage de maneira cruzada" com o anticorpo de controlo. Qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação de anticorpo de controlo (tal como DF200) a cada um dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 por pelo menos cerca de 30 % ou mais preferivelmente cerca de 40 % pode ser considerado ser um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como um controlo (por exemplo, DF200). Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação do anticorpo de controlo (por exemplo, DF200) a cada um dos antígenos de KIR2DL em pelo menos cerca de 50 % (por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 % ou mais) . Será avaliado que a ordem dos anticorpos de controlo e de teste pode ser invertida: isto é o anticorpo de controlo pode ser primeiro ligado à superfície e o anticorpo de teste é levado em contacto com a superfície em seguida num ensaio de competição. Preferivelmente, o anticorpo tendo afinidade mais alta quanto aos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 é ligado à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 primeiro, como será esperado que a diminuição na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos são os que reagem de maneira cruzada) será a de magnitude maior. Outros exemplos de tais ensaios são proporcionados nos Exemplos e, por exemplo, em Saunal e Regenmortel, (1995) J. Imunol. Methods 183: 33 a 41.
Embora tenham sido descritos no contexto de DF200 para os propósitos de exemplificação, será apreciado que os ensaios de rastreio imunológico descritos acima também podem ser usados para identificar anticorpos que compitam com NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183 e outros anticorpos de acordo com a descrição. 39
Na imunização e produção de anticorpos num vertebrado ou célula, as etapas de selecção particulares podem ser realizadas para isolar anticorpos como reivindicados. A este respeito, num aspecto especifico, a descrição também se refere a métodos de produção de tais anticorpos, que compreendem: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunogénio que compreenda um polipéptido de KIR inibidor; (b) preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado, em que os ditos anticorpos se ligam ao dito polipéptido de KIR, (c) seleccionar anticorpos de (b) que reagem de maneira cruzada com pelo menos dois produtos génicos KIR inibidores diferentes e (d) seleccionar anticorpos de (c) que são capazes de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes. A selecção de um anticorpo que reage de maneira cruzada com pelo menos dois produtos génicos KIR inibidores diferentes pode ser obtida rastreando-se o anticorpo contra dois ou mais antígenos KIR inibidores diferentes, por exemplo, como foi descrito acima.
Num aspecto mais preferido, os anticorpos preparados na etapa (b) são anticorpos monoclonais. Assim, o termo "preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado" como é usado no presente documento, inclui obter células B a partir de um animal imunizado e usando aquelas células B para produzir um hibridoma que expresse anticorpos, assim como obter anticorpos directamente do soro de um animal imunizado. Num outro aspecto preferido, os anticorpos seleccionados na etapa (c) são aqueles que reagem de maneira cruzada com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Já num outro aspecto preferido, os anticorpos 40 seleccionados na etapa (d) produzem pelo menos cerca de 10 % de lise especifica mediada pelas células NK que demonstram pelo menos um KIR reconhecido pelo anticorpo e preferivelmente pelo menos cerca de 40 % de lise especifica, pelo menos cerca de 50 % de lise especifica ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 % de lise especifica (por exemplo, cerca de 60 a 100 % de lise especifica), como medida num ensaio de libertação de cromo padrão, contra uma célula alvo que expresse a molécula de classe I de HLA cognata, comparada com a lise ou citotoxicidade obtidas na mesma proporção efectuador/alvo com células NK que não são bloqueadas pelo seu KIR. Alternativamente, os anticorpos seleccionados na etapa (d) quando usados num ensaio de cromo que utilize um clone de célula NK que expresse um ou vários KIR inibidores e uma célula alvo que expressa apenas um alelo HLA que seja reconhecido por um dos KIR no clone NK, o nível de citotoxicidade obtida com o anticorpo deve ser de pelo menos cerca de 20 % preferivelmente de pelo menos cerca de 30 % ou mais da citotoxicidade obtida com um mAb de classe I anti-MHC bloqueador tal como anticorpo de classe I anti-MHC W6/32. A ordem das etapas (c) e (d) do método descrito imediatamente acima pode ser alterada. Opcionalmente, o método também ou alternativamente pode compreender ainda as etapas adicionais de fabricar fragmentos do anticorpo monoclonal ou derivados do anticorpo monoclonal ou fragmentos tais, por exemplo, como é descrito no presente documento em qualquer outro lugar.
Num aspecto preferido, o animal não humano usado para produzir anticorpos de acordo com os métodos aplicáveis da descrição é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, ratinho, rato, etc.), bovino, porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha, etc. Também, o mamífero não humano pode ser geneticamente modificado ou modificado para produzir 41 anticorpos "humanos", tais como o Xenomouse® (Abgenix) ou HuMAb-mouse® (Medarex).
Numa outra variante, a descrição proporciona um método para obter um anticorpo que compreende: (a) seleccionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal, um fragmento de um anticorpo monoclonal ou um derivado de qualquer um dos mesmos que reaja cruzado com pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL inibidores humanos diferentes e (b) seleccionar um anticorpo, fragmento ou derivado de (a) que seja capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressam os ditos pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL inibidores humanos diferentes. 0 repertório pode ser qualquer repertório (recombinante) de anticorpos ou fragmentos destes, opcionalmente demonstrados por qualquer estrutura adequada (por exemplo, fago, bactéria, complexo sintético, etc.). A selecção de anticorpos inibidores pode ser realizada como revelada acima e ainda ilustrada nos exemplos.
De acordo com outro aspecto, a descrição proporciona um hibridoma que compreende uma célula B de um hospedeiro não humano, em que a dita célula B produz um anticorpo que se liga a um determinante presente em pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes e o dito anticorpo é capaz de neutralizar a actividade inibidora dos ditos receptores. Mais preferivelmente, o hibridoma deste aspecto da invenção não é um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal NKVSF1. 0 hibridoma de acordo com este aspecto da invenção pode ser criado como foi descrito acima pela fusão de esplenócitos a partir do mamífero não humano imunizado com uma linha de célula imortal. 42
Os hibridomas produzidos por esta fusão podem ser rastreados quanto a presença de tal anticorpo que reage de maneira cruzada como é descrito no presente documento em algum lugar. Preferivelmente, o hibridoma produz um anticorpo que reconhece um determinante presente em pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL diferentes e causa a potenciação de células NK que expressam pelo menos um destes receptores de KIR. Ainda mais preferivelmente, o hibridoma produz um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como DF200 e que potência a actividade de célula NK. 0 mais preferivelmente, este hibridoma é o hibridoma DF200 que produz o anticorpo monoclonal DF200.
Os hibridomas que são confirmados produzir um anticorpo monoclonal desta invenção podem ser cultivados em quantidades maiores num meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI- 1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite num animal.
Depois do cultivo suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, os meios de cultivo contendo o anticorpo monoclonal (ou o fluido de ascite) é separado das células e o anticorpo monoclonal presente nesse ponto é purificado. A purificação é tipicamente obtida pela eletroforese em gel, diálise, cromatografia usando a proteína A ou proteína G- Sepharose ou um Ig anti-ratinho ligado a um suporte sólido tal como pérolas de agarose ou Sepharose (todos descritos, por exemplo, no Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publicação N° 18-1037-46, Edição AC) . O anticorpo ligado é tipicamente eluído a partir das colunas de proteína A/proteína G usando-se tampões de pH baixo (tampões de glicina ou acetato de pH 3,0 ou menor) com a neutralização imediata das fracções contendo anticorpo. Estas fracções são reunidas, dialisadas e concentradas conforme necessário.
De acordo com um aspecto alternativo, o ADN que 43 codifica um anticorpo que se liga a um determinante presente em pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, é isolado do hibridoma desta descrição e colocado num vector de expressão apropriado para transfecção num hospedeiro apropriado. 0 hospedeiro é depois usado para a produção recombinante do anticorpo ou variantes deste, tal como uma versão humanizada deste anticorpo monoclonal, fragmentos activos do anticorpo ou anticorpos quiméricos que compreendem a porção de reconhecimento de antigeno do anticorpo. Preferivelmente, o ADN usado neste aspecto codifica um anticorpo que reconhece um determinante presente em pelo menos dois produtos génicos de KIR2DL diferentes e causa a potenciação de células NK que expressam pelo menos um destes receptores de KIR. Ainda mais preferivelmente, o ADN codifica um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como DF200 e que potência a actividade de célula NK. Mais preferivelmente, este ADN codifica o anticorpo monoclonal DF200. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais da descrição é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando-se sondas de oligonucleótido que são capazes de ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino) . Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado dentro de vectores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras tais como células E. coli, células COS simias, células do ovário do hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A expressão recombinante em bactérias de ADN que codificam o anticorpo é bem conhecida na especialidade (veja-se, por exemplo, Skerra et al., Curr. Opinion in Imunol., 5, pp. 256 (1993); e Pluckthun, Imunol. Revs., 44 130, ρρ. 151 (1992).
Fragmentos e Derivados de um Anticorpo Monoclonal
Os fragmentos e derivados de anticorpos desta descrição (que são abrangidos pelos termos "anticorpo" ou "anticorpos" como usados neste pedido, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto), preferivelmente um anticorpo igual a DF-200, podem ser produzidos pelas técnicas que são conhecidas na especialidade. "Fragmentos imunorreactivos" compreendem uma porção do anticorpo inteiro, no geral o local de ligação de antigeno ou região variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que seja um polipéptido que tem uma estrutura primária que consiste em uma sequência não interrompida de residuos de aminoácido contiguos (aludidos aqui como um "fragmento de anticorpo de cadeia única" ou "polipéptido de cadeia única"), incluindo sem limitação (1) moléculas Fv(scFv) de cadeia única (2) polipéptidos de cadeia única contendo apenas um dominio variável de cadeia leve ou um fragmento deste que contenha as três CDRs do dominio variável de cadeia leve, sem uma porção de cadeia pesada associada e (3) polipéptidos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada ou um fragmento deste contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, fragmentos de Fab ou F(ab'>2 podem ser produzidos pela digestão de protease dos anticorpos isolados, de acordo com técnicas convencionais. Será avaliado que fragmentos imunorreactivos podem ser modificados usando métodos conhecidos, por exemplo, para diminuir a depuração in vivo e obter um perfil farmacocinético mais desejável, o fragmento pode ser modificado com polietileno glicol (PEG). Os métodos para ligar e conjugar de modo especifico de local PEG a um 45 fragmento Fab' sao descritos, por exemplo, em Leong et al., Cytokine 16 (3): 106 a 119 (2001) e Delgado et al., Br. j. Cancro 73 (2): 175 a 182 (1996).
Num aspecto particular, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo que compreendem a sequência da região variável de cadeia leve de DF-200 como é apresentado na Fig. 12. Num outro aspecto particular, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo que compreendem a sequência da região variável de cadeia leve de Pan2D como é apresentado na Fig. 12. Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados dos mesmos que compreendem uma ou mais CDRs da região variável leve de DF-200 como é apresentado na Fig. 12. Ainda num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados dos mesmos que compreendem uma ou mais CDRs da região variável leve de Pan2D como é apresentado na Fig. 12. Variantes/análogos funcionais de tais sequências podem ser gerados pelo fabrico de substituições, adições e/ou supressões adequadas nestas sequências de aminoácido reveladas usando técnicas padrão, que podem ser ajudadas pela comparação das sequências. Assim, por exemplo, residuos de CDR que são conservados entre Pan2D e DF-200 podem ser alvos adequados para a modificação na medida em que tais residuos não possam contribuir para os perfis diferentes na competição que estes anticorpos têm com respeito a outros anticorpos revelados no presente documento (embora Pan2D e DF-200 compitam) e assim podem não contribuir para a especificidade destes anticorpos como aos seus respectivos epítopos particulares. Num outro aspecto, as posições onde um resíduo está presente numa sequência de um destes anticorpos, mas não de um outro, podem ser adequadas para supressões, substituições, e/ou inserções. 46
Num aspecto particular, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo que compreendem a sequência da região variável de cadeia pesada de DF-200 como é apresentado na Fig. 13. Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados dos mesmos que compreendem uma ou mais das CDRs da região variável pesada de DF-200 como é apresentado na Fig. 13. As variantes/análogos funcionais de tais sequências podem ser gerados por meio do fabrico de substituições, adições e/ou supressões adequadas nestas sequências de aminoácido reveladas usando técnicas padrão, que podem ser ajudadas pela comparação das sequências. Num outro aspecto, as posições onde um resíduo está presente numa sequência de um destes anticorpos, mas não de um outro, podem ser adequadas para supressões, substituições, e/ou inserções.
Alternativamente, o ADN de um hibridoma que produz um anticorpo desta descrição, preferivelmente um anticorpo igual a DF-200, pode ser modificado de modo a codificar um fragmento desta descrição. 0 ADN modificado é depois inserido num vector de expressão e usado para transformar ou transfectar uma célula apropriada, que depois expressa o fragmento desejado.
Num aspecto alternativo, o ADN de um hibridoma que produz um anticorpo desta descrição, preferivelmente anticorpo igual a DF-200, pode ser modificado antes da inserção num vector de expressão, por exemplo, pela substituição da sequência codificadora para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das sequências não humanas homólogas (por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)) ou unindo-se covalentemente à sequência codificadora de imunoglobulina toda ou parte da sequência codificadora a um polipéptido que não de imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados que têm a especificidade de ligação do anticorpo original.
Tipicamente, tais polipéptidos que não de imunoglobulina são substituídos pelos dominios constantes de um anticorpo da descrição.
Assim, de acordo com um outro aspecto, o anticorpo desta descrição, preferivelmente um anticorpo igual ao DF-200, é humanizado. As formas "humanizadas" de anticorpos de acordo com esta invenção são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas especificas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antigeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada da imunoglobulina de murino. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinadora de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos pelos resíduos de uma CDR do anticorpo original (anticorpo dador) enquanto mantém a especificidade, afinidade e capacidade desejadas do anticorpo original. Em alguns exemplos, os resíduos da matriz Fv da imunoglobulina humana podem ser substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender os resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR ou sequências de matriz importadas. Estas modificações são feitas para refinar e optimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem àquelas do anticorpo original e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado optimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais pormenores veja-se Jones 48 et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et ai., Nature, 332, pp. 323 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992) .
Os métodos para humanizar os anticorpos desta descrição são bem conhecidos na especialidade. No geral, um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um ou mais residuos de aminoácido introduzidos nele do anticorpo original. Estes residuos de aminoácido de murino ou outros não humanos são frequentemente denominados como residuos "importados", que são tipicamente tirados de um dominio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann et ai., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et ai., Science, 239, pp. 1534 (1988)). Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Cabilly et ai., Pat. U.S. N° 4.816.567), em que substancialmente menos do que um dominio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente do anticorpo original. Na prática, os anticorpos humanizados de acordo com esta descrição são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns residuos de FR são substituídos pelos resíduos de sítios análogos no anticorpo original. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados no fabrico dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método "melhor adaptado", a sequência do domínio variável de um anticorpo desta descrição é rastreado contra a biblioteca inteira de sequências do domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que é mais próxima daquela do ratinho é depois aceita como a matriz humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai., J. Imunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901 (1987)). Um 49 outro método usa uma matriz particular da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma matriz pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51, pp. 1993)). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com a retenção de alta afinidade aos receptores de KIR inibidores múltiplos e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se alcançar esta meta, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são habitualmente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e demonstram estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas demonstrações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidate para ligar-se ao seu antígeno. Deste modo, resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências de consenso e importadas de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), seja obtida. No geral, os resíduos de CDR são directamente e mais substancialmente envolvidos na influenciação da ligação de antígeno.
Um outro método de fabricar anticorpos monoclonais "humanizados" é usar um XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como o ratinho usado para a imunização. Um XenoMouse® é um hospedeiro murino de acordo com esta descrição que teve os 50 seus genes de imunoglobulina substituídos pelos genes de imunoglobulina humanos funcionais. Assim, os anticorpos produzidos por este ratinho ou em hibridomas fabricados a partir das células B deste ratinho, já são humanizados. O XenoMouse® é descrito na Patente dos Estados Unidos N° 6.162.963. Um método análogo pode ser obtido usando um HuMAb-Mouse™ (Medarex).
Os anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como usando-se, para a imunização, outros animais transgénicos que foram modificados geneticamente para expressar um repertório de anticorpo humano (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255) ou pela selecção de repertórios de anticorpo usando métodos de demonstração de fago. Tais técnicas são conhecidas pela pessoa habilitada e podem ser implementadas partindo-se de anticorpos monoclonais como revelado no presente pedido.
Os anticorpos da presente invenção, preferivelmente um anticorpo igual a DF-200, também pode ser derivatizado a anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção das cadeias pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes no anticorpo original, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é/são idêntica(s) com ou homóloga(s) às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, de modo que eles exibam a actividade biológica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)).
Outros derivados dentro do âmbito desta descrição incluem anticorpos funcionalizados, isto é, anticorpos que são conjugados ou covalentemente ligados a uma toxina, tal como ricina, a toxina da difteria, abrina e exotoxina de Pseudomonas; a uma fraeção detectável, tal como uma porção fluorescente, um radioisótopo ou um agente de produção de imagem; ou a um suporte sólido, tal como pérolas de agarose 51 ou similares. Os métodos para a conjugação ou ligação covalente destes outros agentes aos anticorpos são bem conhecidos na especialidade. A conjugação a uma toxina é útil para a destruição direccionada de células NK gue demonstram um dos receptores de KIR que reagem de maneira cruzada na sua superfície celular. Uma vez que o anticorpo da descrição liga-se à superfície celular de tais células, ele é internalizado e a toxina é liberada dentro da célula, destruindo selectivamente esta célula. Tal utilização é um aspecto alternativo da presente descrição. A conjugação a uma fracção detectável é útil quando o anticorpo desta descrição é usado com propósitos de diagnóstico. Tais propósitos incluem, mas não são limitados a, ensaiar amostras biológicas quanto a presença das células NK que possuem o KIR que reage de maneira cruzada na sua superfície celular e detectando a presença de células NK que possuem o KIR que reage de maneira cruzada num organismo vivo. Tal ensaio e métodos de detecção também são aspectos alternativos da presente descrição. A conjugação de um anticorpo desta descrição a um suporte sólido é útil como uma ferramenta para a purificação por afinidade de células NK que possuem o KIR que reage de maneira cruzada na sua superfície celular de uma fonte, tal como um fluido biológico. Este método de purificação é um outro aspecto alternativo da presente descrição, como é a população purificada resultante de células NK.
Num aspecto alternativo, um anticorpo que se liga a um determinante comum presente em pelo menos dois produtos génicos do receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade de célula NK nas células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores de KIR inibidor humano diferentes desta invenção, incluindo 52 NKVSF1, pode ser incorporado em lipossomas ("imunolipossomas") , sozinho ou junto com uma outra substância para a libertação direccionada a um animal. Tais outras substâncias incluem ácidos nucleicos para a libertação de genes para a terapêutica de gene ou para a libertação de ARN de antisense, ARNi ou ARNip para a supressão de um gene numa célula NK ou toxinas ou medicamentos para a destruição direccionada de células NK. A modelagem por computador dos domínios extracelulares de KIR2DL1, -2 e -3 (KIR2DL1-3), com base nas suas estruturas cristalinas publicadas (Maenaka et ai. (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al. , (2000)), prognosticou o envolvimento de certas regiões ou KIR2DL1, -2 e -3 na interacção entre os anticorpos monoclonais de ratinho que reagem de maneira cruzada com KIR2DL1 e KIR2DL1-3, DF200 e NKVSF1. Assim, num aspecto, a presente descrição proporciona anticorpos que se ligam exclusivamente a KIR2DL1 dentro de uma região definida pelos resíduos de aminoácido (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). Num outro aspecto a descrição proporciona anticorpos que se ligam a KIR2DL1 e KIR 2DL2/3 sem interagir com os resíduos de aminoácido fora da região definida pelos resíduos (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,159,160, 161, 162, 163, 181,192).
Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos que se ligam a KIR2DL1 e que não se ligam a um mutante de KIR2DL1 em que RI31 é Ala.
Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos que se ligam a KIR2DL1 e que não se ligam a um mutante de KIR2DL1 em que R157 é Ala.
Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos que se ligam a KIR2DL1 e que não se ligam a um mutante de KIR2DL1 em que R158 é Ala. 53 53 proporciona anticorpos (131, 157, 158). proporciona anticorpos não ao KIR2DS3 do tipo proporciona anticorpos a KIR2DL2/3 assim como
Num outro aspecto, a descrição que se ligam aos resíduos de KIR2DL1 Num outro aspecto, a descrição que se ligam a KIR2DS3 (R131W), mas selvagem.
Num outro aspecto, a descrição que se ligam tanto a KIR2DL1 quanto a KIR2DS4.
Num outro aspecto, a descrição proporciona anticorpos que se ligam tanto a KIR2DL1 quanto a KIR2DL2/3, mas não a KIR2DS4. A determinação de se um anticorpo liga-se dentro de uma das regiões de epítopo definidas acima pode ser realizada de maneiras conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti- KIR pode ser determinada pela "pegada" do epítopo usando a modificação química das aminas/carboxilas expostas na proteína KIR2DL1 ou KIR2DL2/3. Um exemplo específico de uma tal técnica de pegada é a utilização de HXMS (permuta de hidrogénio-deutério detectada pela espectrometria de massa) em que uma permuta de hidrogénio/deutério de prótons de amida da proteína receptora e ligando, ligação e retro-permuta ocorre, em que a grupos amida da estrutura principal que participam na ligação de proteína são protegidos da retro-permuta e portanto permanecerão deuterados. As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, separação pela cromatografia líquida de alto desempenho de microfuro rápido, e/ou espectrometria de massa de ionização em eletropulverização. Veja-se, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252 a 259 (1999) e/ou Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A a 265A. Um outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é o mapeamento 54 de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), onde tipicamente a posição dos sinais em espectros de RMN bidimensionais do antigeno livre e do antigeno complexado com o péptido de ligação de antigeno, tal como um anticorpo, são comparados. 0 antigeno de modo típico é selectivo e isotopicamente marcado com 15N de modo que apenas sinais correspondentes ao antigeno e nenhum dos sinais do péptido de ligação de antigeno são observados no espectro de RMN. Os sinais de antigeno que se originam de aminoácidos envolvidos na interacção com o péptido de ligação de antigeno tipicamente mudará de posição nos espectros do complexo comparado com os espectros do antigeno livre e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo. Veja-se, por exemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149 a 167; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61 a 67 (1998); e Saito e Patterson, Methods. 9 de Junho de 1996 (3): 516-24. O mapeamento/caracterização de epítopo também pode ser realizado usando métodos de espectrometria de massa. Veja-se, por exemplo, Downward, J Mass Spectrom. Abril de 2000; 35 (4): 493 a 503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1 de Maio de 1999; 71 (9): 1792-801.
As técnicas de digestão de protease também podem ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/sequências determinantes-relevantes antigénicas podem ser determinadas pela digestão com protease, por exemplo, usando-se tripsina numa relação de cerca de 1:50 para KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 na digestão a 37 °C e pH 7 a 8, seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação de péptido. Os péptidos protegidos da clivagem com tripsina pelo ligador anti- KIR podem ser subsequentemente identificados pela comparação de amostras submetidas à digestão com tripsina e amostras incubadas com anticorpo e depois submetidas à digestão por exemplo, pela tripsina (revelando deste modo uma pegada para o ligador). 55
Outras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc., também ou alternativamente podem ser usadas num método de caracterização de epitopo similar. Além disso, a digestão enzimática pode fornecer um método rápido para analisar se uma sequência determinante antigénica potencial está dentro de uma região do KIR2DL1 no contexto de um anti-polipéptido de KIR que não é exposto à superfície e, consequentemente, mais provavelmente não relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade. Veja-se, por exemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1) : 15 a 19 para um debate de técnicas similares.
Reactividade Cruzada com Macacos Cinomolgos
Descobriu-se que o anticorpo NKVSF1 também se liga a células NK de macaco cinomolgos, veja-se o exemplo 7. A descrição, portanto proporciona um anticorpo, assim como fragmentos e derivados dos mesmos, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reagem de maneira cruzada com pelo menos dois receptores de KIR humano inibidor na superfície de células NK humanas e que além disso se ligam às células NK de macacos cinomolgos. Num aspecto deste, o anticorpo não é o anticorpo NKVSF1. A memória descritiva também revela um método de testar a toxicidade de um anticorpo, assim como fragmentos e derivados dos mesmos, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reage de maneira cruzada com pelo menos dois receptores de KIR humano inibidor na superfície de células NK humanas, em que o método compreende testar o anticorpo num macaco cinomolgo. Composições e Administração A descrição também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo, assim como fragmentos e derivados do mesmo, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reagem de maneira cruzada com pelo menos dois receptores de KIR inibidores na superfície das células NK, neutralizam seus sinais inibidores e potenciam a actividade destas células, em qualquer veículo adequado 56 numa quantidade eficaz para potenciar de modo detectável a citotoxicidade de célula NK num paciente ou numa amostra biológica que compreenda células NK, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. A composição compreende ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável. Tais composições também são denominadas como "composições de anticorpo desta descrição". Num aspecto, as composições de anticorpo desta descrição compreendem um anticorpo revelado nos aspectos de anticorpo acima. 0 anticorpo NKVSF1 é incluído dentro do âmbito de anticorpos que podem estar presentes nas composições de anticorpo desta descrição. 0 termo "amostra biológica" como é usado no presente documento inclui, mas não é limitado a um fluido biológico (por exemplo, soro, linfa, sangue), amostra de célula ou amostra de tecido (por exemplo, medula óssea).
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem, mas não são limitados a, permutadores de ião, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicérido parciais de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de dissódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina.
As composições desta descrição podem ser utilizadas num método de potenciar a actividade de células NK num paciente ou uma amostra biológica. Este método compreende a etapa de contactar a dita composição com o dito paciente ou amostra biológica. Tal método será útil tanto para propósitos de diagnóstico como terapêuticos. 57
Para a utilização em conjunção com uma amostra biológica, a composição de anticorpo pode ser administrada misturando-se simplesmente com a amostra ou aplicando-a directamente à mesma, dependendo da natureza da amostra (fluida ou sólida). A amostra biológica pode ser contactada directamente com o anticorpo em qualquer dispositivo adequado (placa, saco, frasco, etc.). Para a utilização em conjunção com um paciente, a composição deve ser formulada para a administração ao paciente.
As composições da presente descrição podem ser administradas oral, parentericamente, por pulverização de inalação, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginalmente ou via um reservatório implantado. 0 termo "parentérico" como é usado no presente documento inclui técnicas de injecção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana. Preferivelmente, as composições são administradas oral, intraperitoneal ou intravenosamente.
As formas injectáveis estéreis das composições desta descrição podem ser aquosas ou uma suspensão oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na especialidade usando agentes de dispersão ou humectação e agentes de suspensão adequados. A preparação injectável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injectáveis estéreis num diluente ou solvente não tóxicos parentericamente aceitáveis, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Os ácidos gordos, tais como ácido oleico e seus derivados de 58 glicérido são úteis na preparação de injectáveis, como o são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como o óleo de oliva ou o óleo de mamona, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante alcoólico de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agentes de dispersão similares que são habitualmente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoactivos habitualmente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificadores ou realçadores de biodisponibilidade que são habitualmente usados no fabrico de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para os propósitos de formulação.
As composições desta descrição podem ser oralmente administradas em qualquer forma farmacêutica oralmente aceitável incluindo, mas não limitado a, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. No caso de tabletes para a utilização oral, veículos habitualmente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes de lubrificação, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados.
Para a administração oral numa forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para a utilização oral, o ingrediente activo é combinado com agentes emulsificadores e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, flavorizantes ou corantes também podem ser adicionados.
Alternativamente, as composições desta descrição podem ser administradas na forma de supositórios para a administração rectal. Estes podem ser preparados misturando-se o agente com um excipiente não irritante adequado que seja sólido na temperatura ambiente mas 59 líquido na temperatura rectal e portanto fundirá no recto para libertar o medicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelhas e polietileno glicóis.
As composições desta descrição também podem ser administradas topicamente, de modo especial quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis pela aplicação tópica, incluindo as doenças do olho, da pele ou do tracto intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. A aplicação tópica ao tracto intestinal inferior pode ser efectuada numa formulação de supositório rectal (veja-se acima) ou numa formulação de enema adequada. Os emplastros topicamente transdérmicos também podem ser usados.
Para as aplicações tópicas, as composições podem ser formuladas numa pomada adequada contendo o componente activo colocado em suspensão ou dissolvido num ou mais veículos. Os veículos para a administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificadora e água.
Alternativamente, as composições podem ser formuladas numa loção ou creme adequados contendo os componentes activos colocados em suspensão ou dissolvidos num ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos adequados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
Para a utilização oftálmica, as composições podem ser formuladas como suspensões micronizadas em solução salina isotónica, ajustada no pH, estéril, ou, preferivelmente, como soluções em solução salina isotónica, ajustada no pH, 60 estéril, com ou sem um conservante tal como cloreto de benzilalcónio. Alternativamente, para as utilizações oftálmicas, as composições podem ser formuladas numa pomada tal como petrolato.
As composições desta descrição também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na especialidade da formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzílico ou outros conservantes, promotores de absorção para realçar a biodisponibilidade, fluorocarbonos e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão adequados.
Diversos anticorpos monoclonais mostraram ser eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) ou Xolair (Omalizumab) e regimes de administração similares (isto é, formulações e/ou doses e/ou protocolos de administração) podem ser usados com os anticorpos desta descrição. Os programas e dosagens para a administração do anticorpo nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser determinados de acordo com métodos conhecidos para estes produtos, por exemplo, usando as instruções do fabricante. Por exemplo, um anticorpo presente numa composição farmacêutica desta descrição pode ser proporcionado a uma concentração de 10 mg/ml em frascos de utilização única de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml). O produto é formulado para a administração IV em cloreto de sódio a 9,0 mg/ml, citrato de sódio dihidratado a 7,35 mg/ml, polissorbato 80 a 0,7 mg/ml e Água Estéril para Injecção. O pH é ajustado a 6,5. Uma faixa de dosagem adequada exemplar para um anticorpo numa composição farmacêutica desta descrição pode estar entre cerca de 10 mg/m2 e 500 mg/m2. Entretanto, será avaliado que estes programas são exemplares e que um programa e regime óptimos podem ser adaptados levando-se em conta a 61 afinidade e tolerabilidade do anticorpo particular na composição farmacêutica que devem ser determinadas em testes clínicos. Quantidades e programa de injecção de um anticorpo numa composição farmacêutica desta descrição que satura células NK por 24 horas, 48 horas, 72 horas ou uma semana ou um mês serão determinados considerando a afinidade do anticorpo e dos seus parâmetros farmacocinéticos.
De acordo com outro aspecto, as composições de anticorpo desta descrição podem compreender ainda um outro agente terapêutico, incluindo agentes normalmente utilizados para o propósito terapêutico particular para o qual o anticorpo está sendo administrado. 0 agente terapêutico adicional normalmente estará presente na composição em quantidades tipicamente usadas para aquele agente numa monoterapia para a doença ou condição particulares que são tratadas. Tais agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, agentes terapêuticos usados no tratamento de cancros, agentes terapêuticos usados para tratar doença infecciosa, agentes terapêuticos usados em outras imunoterapias, citocinas (tais como IL- 2 ou IL-15), outros anticorpos e fragmentos de outros anticorpos.
Por exemplo, vários agentes terapêuticos estão disponíveis para o tratamento de cancros. As composições de anticorpo e métodos da presente invenção podem ser combinados com qualquer outros métodos no geral utilizados no tratamento da doença particular, particularmente um tumor, doença cancerosa ou outra doença ou distúrbio que o paciente exiba. Contanto que um método terapêutico particular não seja conhecido como sendo nocivo para a condição do paciente por si só e não contra-ataque significantemente a actividade do anticorpo numa composição farmacêutica desta descrição, a sua combinação com a presente descrição é considerada. 62
Em conexão com o tratamento de tumor sólido, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas em combinação com métodos clássicos, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e outros. A invenção portanto proporciona terapêuticas combinadas em que uma composição farmacêutica desta descrição é usada simultaneamente com, antes ou depois de cirurgia ou tratamento com radiação; ou são administrados aos pacientes com, antes ou depois de agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos ou anti-angiogénicos ou imunotoxinas direccionadas ou coaguligandos convencionais.
Quando um ou mais agentes são usados em combinação com uma composição desta descrição contendo anticorpo num regime terapêutico, não existe nenhuma exigência quanto aos resultados combinados serem aditivos dos efeitos observados quando cada tratamento é conduzido separadamente. Embora pelo menos efeitos aditivos sejam no geral desejáveis, qualquer efeito anticancro aumentado acima de uma das terapêuticas isoladas seria benéfico. Também, não existe nenhuma exigência particular como ao tratamento combinado para exibir efeitos sinergisticos, embora isto seja certamente possível e vantajoso.
Para praticar á terapêutica anticancro combinada, seria possível simplesmente administrar a um animal uma composição de anticorpo desta descrição em combinação com um outro agente anticancro numa maneira eficaz para resultar em suas acções anticancro combinadas dentro do animal. Os agentes portanto seriam proporcionados em quantidades eficazes e por períodos de tempo eficazes para resultar na sua presença combinada dentro da vasculatura do tumor e suas acções combinadas no ambiente de tumor. Para obter esta meta, uma composição de anticorpo desta descrição e agentes anticancro podem ser administrados ao animal simultaneamente, numa composição combinada única ou como duas composições distintas usando vias de 63 administração diferentes.
Alternativamente, a administração de uma composição de anticorpo desta descrição pode preceder ou seguir, o tratamento com o agente anticancro, por exemplo, em intervalos variando de minutos a semanas e meses. Seria possível garantir que o agente anticancro e um anticorpo na composição de anticorpo desta descrição exerçam um efeito vantajosamente combinado sobre o cancro. A maioria dos agentes anticancro seria dada antes de uma composição de anticorpo de KIR inibidor desta descrição numa terapêutica anti-angiogénica. Entretanto, quando imunoconjugados de um anticorpo são usados na composição de anticorpo desta descrição, vários agentes anticancro podem ser simultânea ou subsequentemente administrados.
Em algumas situações, pode ser ainda desejável prolongar o período de tempo para tratamento significantemente, onde um intervalo de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3,4, 5, 6, 7 ou 8) ou ainda vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre a respectiva administração do agente anticancro ou tratamento anticancro e a administração de uma composição de anticorpo desta descrição. Isto seria vantajoso em circunstâncias onde o tratamento anticancro foi intencionado a destruir substancialmente o tumor, tal como cirurgia ou quimioterapia e a administração de uma composição de anticorpo desta descrição foi intencionada a impedir as micrometástases ou o recrescimento do tumor.
Também é considerado que mais do que uma administração de uma composição com base em anticorpo de KIR inibidor desta descrição ou do agente anticancro será utilizada.
Estes agentes podem ser administrados intercambiavelmente, em dias ou semanas alternados; ou um ciclo de tratamento com uma composição de anticorpo de KIR inibidor desta descrição, seguido por um ciclo de terapêutica com agente anticancro. Em qualquer evento, para 64 obter a regressão de tumor usando uma terapêutica combinada, tudo que é requerido é libertar ambos os agentes numa quantidade combinada eficaz para exercer um efeito anti-tumoral, independente das vezes de administração.
Em termos de cirurgia, qualquer intervenção cirúrgica pode ser praticada em combinação com a presente invenção. Em conexão com radioterapia, qualquer mecanismo para induzir dano ao ADN localmente dentro das células cancerosas é considerado, tal como irradiação gama, raios X, irradiação UV, microondas e mesmo emissões electrónicas e outros. A libertação direccionada de radioisótopos às células cancerosas também é considerado e esta pode ser usada em conexão com um anticorpo direccionador ou outro meio direccionador.
Em outros aspectos, compostos ou regimes imunomoduladores podem ser administrados em combinação com ou como parte das composições de anticorpo da presente invenção. Os exemplos preferidos de compostos imunomoduladores incluem citocinas. Várias citocinas podem ser utilizadas em tais métodos combinados. Os exemplos de citocinas úteis nas combinações consideradas por esta invenção incluem IL-1 alfa IL-1 beta, IL- 2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGFbeta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama. As citocinas usadas no tratamento de combinação ou as composições desta descrição são administradas de acordo com regimes padrão, compatíveis com as indicações clínicas tais como a condição do paciente e a toxicidade relativa da citocina.
Em certos aspectos, as composições terapêuticas que compreendem o anticorpo de KIR inibidor que reage de maneira cruzada da presente invenção podem ser administradas em combinação com ou podem ainda compreender uma terapêutica quimioterapêutica ou agente hormonal. Uma 65 variedade de terapêuticas hormonais e agentes quimioterapêuticos podem ser usados nos métodos de tratamento combinados aqui revelados. Os agentes quimioterapêuticos considerados como exemplares incluem, mas não são limitados a, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, alcaloides vinca, por exemplo, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotere, vincristina, vinblastina, vinorelbina, arabinósido de metotrexato, C, cisplatina e derivados e etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo (5FU), citosina, ciclofosfamida, tiotepa, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina (CDDP), aminopterina, combretastatina (s) pró-fármacos dos mesmos.
Os agentes hormonais incluem, mas não são limitados a, por exemplo, agonistas de LHRH tais como leuprorelina, goserelina, triptorelina e buserelina; anti-estrogénios tais como tamoxifeno e toremifeno; antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, ciproterona e bicalutamida; inibidores de aromatase tais como anastrozol, exemestano, letrozol e fadrozol; e progestagénios tais como medroxi, clormadinona e megestrol.
Como será entendido por aqueles de habilidade comum na técnica, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos aproximam-se daquelas já utilizadas em terapêuticas clinicas em que os quimioterapêuticos são administrados em separado ou em combinação com outros quimioterapêuticos. Por via de exemplo apenas, os agentes tais como cisplatina e outros alquilantes de ADN podem ser usados. Cisplatina foi amplamente usada para tratar cancro, com as doses eficazes usadas nas aplicações clinicas de 20 mg/m2 por 5 dias a cada três semanas por um total de três cursos. A cisplatina não é absorvida oralmente e portanto deve ser liberado por intermédio de injecção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperitonealmente. 66
Outros agentes quimioterapêuticos úteis incluem compostos que interferem com a replicação de ADN, mitose e segregação cromossómica e agentes que rompem a sintese e a fidelidade de precursores de polinucleótido. Vários agentes quimioterapêuticos exemplares para a terapêutica combinada são listados no Quadro C da Patente U.S. N° 6.524.583. Cada um dos agentes listados é exemplar e não limitativo. 0 perito na especialidade é direccionado a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edição, capitulo 33, em particular nas páginas 624 a 652. A variação na dosagem provavelmente ocorrerá dependendo da condição que está a ser tratada. 0 médico administrador do tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual.
As presentes composições de anticorpo KIR inibidor que reage de maneira cruzada desta descrição podem ser usados em combinação com qualquer uma ou mais outras terapêuticas anti-angiogénicas ou podem ainda compreender agentes anti-angiogénicos. Os exemplos de tais agentes incluem anticorpos neutralizantes, ARN de antisense, ARNip, ARNi, ARN aptámeros e ribozimas cada uma direccionada contra VEGF ou receptores de VEGF (Patente U.S. N° 6.524.583). As variantes de VEGF com propriedades antagonisticas também podem ser utilizadas, como descrito na WO 98/16551. Outros agentes anti-angiogénicos exemplares que são úteis em conexão com a terapêutica combinada são listados no Quadro D da Patente U.S. N° 6.524.583.
As composições de anticorpo de KIR inibidor desta descrição também podem ser vantajosamente usadas em combinação com métodos para induzir a apoptose ou podem compreender agentes apoptóticos. Por exemplo, vários oncogenes foram identificados que inibem a apoptose ou destruição celular programada. Os oncogenes exemplares nesta categoria incluem, mas não são limitados a, bcr-abl, bcl-2 (distintos de bcl-1, ciclina Dl; Números de acesso ao 67
GenBank M14745, X06487; Pat. U.S. N° 5.650.491; e 5.539.094) e membros da família incluindo Bcl-xl, Mcl-1, Bak, AI e A20. A superexpressão de bcl-2 foi primeiro descoberta em linfornas de célula T. As funções de bcl-2 oncogénicas pela ligação e inactivação Bax, uma proteína no caminho apoptótico. A inibição da função bcl-2 impede a inactivação de Bax e permite que o caminho apoptótico se processe. A inibição desta classe de oncogenes, por exemplo, usando as sequências de nucleótido de antisense, ARNi, ARNip ou compostos químicos de molécula pequena, é considerada para a utilização na presente invenção para dar realce à apoptose (Pat. U.S. N° 5.650.491, 5.539.094, e 5.583.034).
As composições de anticorpo de KIR inibidor desta descrição também podem compreender ou serem usadas em combinação com moléculas que compreendem uma porção direccionadora, por exemplo, anticorpo, ligando ou conjugado desta, direccionadas a um marcador específico de uma célula alvo ("agente direccionador"), por exemplo, uma célula tumoral alvo. Falando-se no geral, os agentes direccionadores para a utilização nestes aspectos adicionais da invenção reconhecerão, preferivelmente antígenos tumorais acessíveis que são preferível ou especificamente, expressos no local do tumor. Os agentes direccionadores, no geral, se ligarão a um componente expresso na superfície, acessível na superfície ou localizado na superfície de uma célula tumoral. Os agentes direccionadores também, preferivelmente, apresentarão propriedades de alta afinidade e não exercerão efeitos colaterais in vivo contra tecidos normais que sustentam a vida, tais como um ou mais tecidos seleccionados do coração, rim, cérebro, fígado, medula óssea, cólon, mama, próstata, tireoide, vesícula biliar, pulmão, glândulas supra-renais, músculo, fibras nervosas, pâncreas, pele ou outros tecidos ou órgãos que sustentam a vida no corpo 68 humano. 0 termo "não exerce efeitos colaterais significantes," como é usado no presente documento, refere-se ao fato de que um agente direccionador, quando administrado in vivo, produzirá apenas efeitos colaterais negligenciáveis ou clinicamente controláveis, tais como aqueles normalmente encontrados durante a quimioterapia.
No tratamento de tumores, uma composição de anticorpo desta descrição pode adicionalmente compreender ou podem ser usadas em combinação com compostos adjuntos. Os compostos adjuntos podem incluir por via de exemplo antieméticos tais como antagonistas de serotonina e terapêuticas tais como fenotiazinas, benzamidas substituídas, antiistaminas, butirofenonas, corticosteróides, benzodiazepinas e canabinóides; bisfosfonatos tais como ácido zoledrónico e ácido pamidrónico; e factores do crescimento hematopoiéticos tais como eritropoietina e G-CSF, por exemplo, filgrastim, lenograstim e darbepoietina.
Num outro aspecto, dois ou mais anticorpos desta descrição tendo reactividades cruzadas diferentes, incluindo NKVSF1, podem ser combinados numa composição única de modo a neutralizar os efeitos inibidores de tantos produtos génicos KIR inibidores quanto possível. As composições que compreendem combinações de anticorpos de KIR inibidores que reagem de maneira cruzada desta descrição ou fragmentos ou derivados dos mesmos, permitirão ainda utilidade mais ampla porque existe provavelmente uma percentagem pequena da população humana que pode carecer de cada um dos produtos génicos KIR inibidor reconhecidos por um anticorpo único que reage de maneira cruzada. Similarmente, uma composição de anticorpo desta descrição pode compreender ainda um ou mais anticorpos que reconhecem os subtipos de KIR inibidor único. Tais combinações forneceriam mais uma vez utilidade mais ampla num ambiente terapêutico. 69 A descrição também proporciona um método de potenciar a actividade de célula NK num paciente em necessidade do mesmo, que compreende a etapa de administrar uma composição de acordo com esta invenção ao dito paciente. 0 método é mais especificamente direccionado à actividade crescente de célula NK em pacientes que tem uma doença em que a actividade aumentada de célula NK é benéfica, que envolve, afecta ou é causada pelas células susceptíveis à lise pelas células NK ou que é causada ou caracterizada pela actividade de célula NK insuficiente, tal como um cancro, um outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune. Mais especificamente, os métodos da presente invenção são utilizados para o tratamento de uma variedade de cancros e outras doenças proliferativas incluindo, mas não limitado a, carcinoma, incluindo aquele da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, colo do útero, tireoide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula pilosa e linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crónicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cancro folicular da tireoide e teratocarcinoma.
Os distúrbios preferidos que podem ser tratados de 70 acordo com a invenção incluem tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, por exemplo, tumores de célula T e célula B, incluindo mas não limitado a distúrbios de célula T tais como leucemia prolinfocitica T (LPL-T), incluindo do tipo de célula cerebriforme e célula pequena; leucemia de linfócito granular grande (LLG) preferivelmente do tipo de célula T; sindrome de Sezary (SS); Linfoma de leucemia de célula T do adulto (LLTA); linfoma hepatosplénico a/d T-NHL; linfoma de célula T periférica/pós-timica (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma de célula T angio imunoblástico; linfoma de célula T angiocéntrico (nasal); linfoma de célula grande anaplástica (Ki 1 + ) ; linfoma de célula T intestinal; T-linfoblástica; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL).
Outros distúrbios proliferativos também podem ser tratados de acordo com a descrição, incluindo, por exemplo, hiperplasias, fibrose (especialmente pulmonar, mas também outros tipos de fibrose, tais como fibrose renal), angiogénese, psoriase, aterosclerose e proliferação do músculo liso nos vasos sanguíneos, tal como estenose ou restenose a seguir da angioplastia. O anticorpo de KIR inibidor que reage de maneira cruzada desta descrição pode ser usado para tratar ou prevenir doenças infecciosas, incluindo preferivelmente quaisquer infecções causadas pelos vírus, bactérias, protozoários, mofos ou fungos. Tais organismos infecciosos virais incluem, mas não são limitados a, hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, hepatite do tipo C, influenza, varicela, adenovírus, herpes simples do tipo I (HSV-1), herpes simples do tipo 2 (HSV-2), peste bovina, rinovírus, ecovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratória, papiloma vírus, papiloma vírus, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus da rubéola, poliovírus e vírus da imunodeficiência humana do tipo I ou do tipo 2 (VIH-1, VIH-2). 71
As infecções bacterianas que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem, mas não são limitados às infecções causadas pelos seguintes: Staphylococcus;
Lactobacillus; Gardnerella Streptomyces; Camplyobacter,
Streptococcus, incluindo S. pyogenes; Enterococci; Bacillus, incluindo Bacillus anthracis e Listeria; Corynebacterium diphtheriae; incluindo G. vaginalis; Nocardia;
Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna;
Pseudomonas incluindo Raeruginosa; Legionella; Neisseria incluindo N. gonorrhoeae e N. meningitides; Flavobacterium incluindo F. meningosepticum e F. odoratum; Brucella; Bordetella incluindo B. pertussis e B. bronchiseptica; Escherichia incluindo E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serraiia incluindo S. marcescens e S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiaceae incluindo R. fickettsfi, Chlamydia incluindo C. psittaci e C. trachomatis; Mycobacterium incluindo M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluitum, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare e M. lepraemurium; e Nocardia.
Infecções por protozoários que podem ser tratadas de acordo com esta descrição incluem, mas não são limitados às, infecções causadas pelo leishmania, kokzidioa e trypanosoma. Uma lista completa de doenças infecciosas pode ser encontrada no site da web do National Center for Infectious Disease (NCID) at the Center for Disease Control (CDC) (.!tptp_:__/_/www_._cci_c_^gqv/_ncidqd/dis Todas as ditas doenças são candidatas ao tratamento usando os anticorpos de KIR inibidor que reagem de maneira cruzada da descrição. agentes
Tais métodos de tratar várias doenças infecciosas podem utilizar a composição de anticorpo desta descrição, seja sozinha ou em combinação com outros agentes de tratamento e/ou terapêuticos conhecidos por tratarem tais doenças, incluindo agentes antivirais, 72 antifúngicos, agentes antibacterianos, antibióticos, agentes antiparasitários e agentes antiprotozoários. Quando estes métodos envolvem tratamentos adicionais com agentes terapêuticos adicionais, estes agentes podem ser administrados juntos com os anticorpos desta descrição como uma forma farmacêutica única ou como formas de dosagem separadas, múltiplas. Quando administrado como uma forma farmacêutica separada, o agente adicional pode ser administrado antes, simultaneamente com, a seguir da administração do anticorpo desta descrição.
Outros aspectos e vantagens desta descrição serão revelados na seguinte secção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa.
Exemplo 1
Purificação de PBLs e geração de linhas de célula NK policlonal ou clonal. PBLs foram derivados de dadores saudáveis pelos gradientes Ficoll Hypaque e depleção de células aderentes plásticas. Para obter células NK enriquecidas, PBLs foram incubados com anti CD3, anti CD4 e anti HLA-DRmAbs (30 minutos a 4 °C), seguido pelas pérolas magnéticas anti ratinho de cabra (Dynal) (30 minutos a 4 °C) e a selecção imunomagnética pelos métodos conhecidos na especialidade (Pende et al., 1999) . As células CD3, CD4, DR foram cultivadas em células alimentadoras irradiadas e 100 U/ml de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1,5 ng/ml de Fitoemaglut inina A (Gibco BRL) para obter populações de célula NK policlonal. As células NK foram clonadas pela diluição limitativa e os clones de células NK foram caracterizados pela citometria de fluxo para a expressão de receptores de superfície celular.
Os mAbs usados foram JT3A (IgG2a, anti CD3) , EB6 e GL183 (IgGl anti KIR2DL1 e KIR2DL3 respectivamente), XA-141 IgM (anti KIR2DL1 com a mesma especificidade como EB6), anti CD4 (HP2.6) e anti DR (Dl. 12, IgG2a) . Ao invés de 73 TOA, HP2.6 e DR1.12, que foram produzidos pelos requerentes, mAbs comercialmente disponíveis das mesmas especificidades podem ser usados (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) . EB6 e GL183 estão comercialmente disponíveis (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. XA-141 não é comercialmente disponível, mas EB6 pode ser usado para controlar a reconstituição de lise como descrito em (Moretta et al., 1993).
As células foram coradas com os anticorpos apropriados (30 minutos a 4 °C) seguido pelos anticorpos anti ratinho policlonal conjugado a PE ou FITC (Southern Biotechnology Associates Inc) . As amostras foram analisadas pela análise citofluorométrica num aparelho FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Os seguintes clones foram usados neste estudo. CPU, CN5 e CN505 são clones positivos em KIR2DL1 e são corados por EB6 ((IgGl anti KIR2DL1) ou XA-141 (IgM anti KIR2DL1 com a mesma especificidade quando comparado aos anticorpos EB6) . CN12 e CP502 são clones positivos em KIR2DL3 e são corados pelo anticorpo GL183 (IgGl anti KIR2DL3). A actividade citolítica dos clones de NK foi avaliada por um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas padrão em que as células NK efectuadoras foram testadas em linhas de célula positivas em Cw3 ou Cw4 conhecidas quanto a sua sensibilidade à lise da célula NK. Todos os alvos foram usados a 5000 células por reservatório na placa de microtitulação e a razão de efectuador:alvo é indicada nas Figuras (usualmente 4 efectuadores por células alvo). O ensaio citolítico foi realizado com ou sem sobrenadante dos anticorpos monoclonais indicados a uma diluição de V2. o procedimento foi essencialmente o mesmo como descrito em (Moretta et al., 1993).
Exemplo 2
Geração de novos mAbs
mAbs foram gerados pela imunização de ratinhos Balb C 74 de 5 semanas de idade com linhas de célula NK policlonal ou monoclonal activadas como descrito em (Moretta et al., 1990). Depois de fusões de célula diferentes, os mAbs foram primeiro seleccionados quanto a sua capacidade para reagir de maneira cruzada com as linhas de célula NK positivas em EB6 e GL183 e clones. Os anticorpos monoclonais positivos foram ainda rastreados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise pelos clones de NK positivos em EB6 ou GL183 de alvos positivos em Cw4 ou Cw3 respectivamente. A coloração de célula foi realizada como se segue. As células foram coradas com um painel de anticorpos (1 pg/ml ou 50 μΐ de sobrenadante, 30 minutos a 4 °C) seguido pelos anticorpos de fragmentos F(ab')2 de cabra conjugados a PE de IgG anti-ratinho (H+L) ou fragmentos F(ab')2 de cabra conjugados a PE de IgG anti-humano (Fc gama) (Beckman Coulter). A análise citofluorométrica foi realizada num aparelho Epics XL.MCL (Beckman Coulter).
Um dos anticorpos monoclonais, o DF200 mAb, descobriu-se que reage com vários membros da família KIR incluindo KIR2DL1, KIR2DL2/3. As células NK tanto de KIR2DL1+ quanto KIR2DL2/3+ foram brilhantemente coradas com DF200 mAb (Figura 1).
Os clones NK que expressam um ou outro (ou mesmo ambos) destes receptores inibidores específicos de classe I de HLA foram usados como células efectuadoras contra células alvo que expressam um ou mais alelos de HLA-C. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados como se segue. A actividade citolítica de linhas de célula YTS-KIR2DL1 ou YTS-Eco foi avaliada por um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas. As células efectuadoras foram testadas em linhas de célula EBV positivas ou negativas em HLA- Cw4 e HLA-Cw4 transfectou células 721,221. Todos os alvos foram usados a 3000 células por reservatório em placa de microtitulação. A razão efectuador/alvo está indicada nas figuras. O ensaio citolítico foi realizado com ou sem o tamanho natural 75 indicado ou fragmentos F(ab')2 de ratinho monoclonais ou anticorpos humanos. Como esperado, os clones NK KIR2DL1+ demonstraram pouca se alguma actividade citolitica contra células alvo que expressam HLA-Cw4 e os clones NK KIR2DL3+ demonstraram pouca ou nenhuma actividade nos alvos positivos em Cw3. Entretanto, na presença de clones de NK DF200mAb (usados para mascarar os seus receptores KIR2DL) tornou-se incapaz de reconhecer os seus ligandos HLA- C e demonstraram actividade citolitica forte em alvos Cw3 ou Cw4.
Por exemplo, a linha de célula C1R (linha de célula CW4+ EBV, ATCC n° CRL 1993) não foi destruída pelos clones NK KIR2DL1+ (CN5/CN505), mas a inibição poderia ser eficientemente invertida pela utilização de DF200 ou um mAb anti KIR2DL1 convencional. Por outro lado clones NK que expressam o fenótipo KIR2DL2/3+ KIR2DL1 (CN12) eficientemente destruiu as células C1R e esta destruição não foi afectada pelo mAb DF200 (Figura 2). Resultados similares são obtidos com clones de NK positivos em KIR2DL2 ou KIR2DL3 em alvos positivos em Cw3.
Similarmente, a linha de célula Cw4+ 221 EBV não foi destruída pelas células NK transfectadas com KIR2DL1+, mas a inibição poderia ser eficientemente invertida pela utilização de DF200, um fragmento Fab de DF200 ou um anti KIR2DL1 mAb EB6 ou XA141 convencionais. Também, uma linha de célula Cw3+ 221 EBV não foi destruída pelas células NK KIR2DL2+, mas esta inibição poderia ser invertida pela utilização de DF200 ou um fragmento Fab de DF200. Finalmente, a última linha de célula Cw3+ 221 EBV não foi destruída pelas células NK KIR2DL3+, mas esta inibição poderia ser invertida pela utilização de um fragmento Fab de DF200 ou um anti KIR2DL3 mAbGLl 83 ou Y249 convencional. Os resultados são mostrados na Figura 3.
Os fragmentos F(ab')2 também foram testados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise de alvos positivos 76 em Cw4. Os fragmentos F(ab')2 dos Abs DF200 e EB6 foram ambos capazes de reverter a inibição de lise pelas células NK transfectadas com KIR2DL1 da linha de célula 221 transfectada com Cw4 e a linha de célula Cw4+ TUBO EBV. Os resultados são mostrados na Figura 4.
Exemplo 4
Geração de novos mAbs humanos
Abs anti-KIR monoclonais humanos foram gerados pela imunização de ratinhos transgénicos modificados geneticamente para expressar um repertório de anticorpo humano com proteína KIR recombinantes. Depois de fusões de célula diferentes, os mAbs foram primeiro seleccionados quanto a sua capacidade para reagir de maneira cruzada com proteína KIR2DL1 e KIR2DL2 imobilizada. Diversos anticorpos monoclonais, incluindo 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1, foram descobertos reagir com KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
Os anticorpos monoclonais positivos foram ainda rastreados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise pelos transfectantes NK positivos em EB6 que expressam KIR2DL1 de células alvo positivas em Cw4. As células NK que expressam os receptores inibidores específicos da classe I HLA foram usados como células efectuadoras contra células alvo que expressam um ou mais alelos de HLA-C (Figuras 5 e 6). Os ensaios de citotoxicidade foram realizados como foi descrito acima. A relação de efectuador/alvo é indicada nas Figuras e anticorpos foram usados a 10 ug/ml ou 30 ug/ml. eficientemente
Como era esperado, as células NK KIR2DL1+ demonstraram pouca se alguma actividade citolítica contra as células alvo que expressam HLA-Cw4. Entretanto, na presença de mAb 1-7F9, as células NK tornaram-se incapazes de reconhecer seus ligandos HLA-C e demonstraram actividade citolítica forte nos alvos Cw4. Por exemplo, as duas linhas de célula (a HLA-Cw4 transfectou as linhas de célula 721,221 e a CW4+ EBV) não foram mortas pelas células NK KIR2DL1+, mas a inibição poderia ser eficientemente invertidas pela 77 utilização de Mab 1-7F9 ou um mAb EB6 anti- KIR2DL1 convencional. Abs DF200 e panKIR (também denominado como NKVSF1) foram comparados com 1-7F9. Anticorpos 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1 por outro lado não foram capazes de reconstituir a lise de célula pelas células NK em alvos positivos em Cw4. Exemplo 5
Análise Biacore de interacções DF200 mAb/KIR2DLl e DF200 mAb/KIR2DL3
Produção e purificação de proteínas recombinantes
As proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 foram produzidas na E. coli. 0 ADNc que codifica o domínio extracelular inteiro de KIR2DL1 e KIR2DL3 foram amplificados pela PCR a partir do vector 47.11 do clone pCDM8 (Biassoni et al., 1993) e RSVS (gpt) vector 6 clone 183 (Wagtman et al., 1995) respectivamente, usando os seguintes iniciadores:
Sense: 5 '-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGT CCACAG-3' Antisense: 5 '-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3'
Foram clonados no vector de expressão pMLl na matriz com uma sequência que codifica um sinal de biotinilação (Saulquin et al., 2003). A expressão de proteína foi realizada na cepa bacteriana BL21 (DE3) (Invitrogen). As bactérias transfectadas foram cultivadas a OD60o = 0,6 a 37 °C em meio suplementado com ampicilina (100 pg/ml) e a expressão foi induzida com 1 mM de IPTG.
As proteínas foram recuperadas a partir de corpos de inclusão sob condições desnaturante (8 M de ureia). A redobra das proteínas recombinantes foi realizada em 20 mM de Tris, pH 7,8, NaCl 150 mM de tampão contendo L-arginina (400 mM, Sigma) e (3-mercaptoetanol (1 mM) , na temperatura ambiente, pela diminuição a concentração de ureia numa diálise de seis etapas (4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M de ureia, respectivamente). A glutationa reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM respectivamente, Sigma) foram adicionadas durante as 78 etapas de diálise e 0,5 e 0 M de ureia. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra 10 mM de Tris, pH 7,5, NaCl 150 mM de tampão. As proteínas solúveis, redobrada foram concentradas e depois purificadas numa coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 (Pharmacia; sistema AKTA).
As medições de ressonância de plasmão de superfície foram realizadas num aparelho Biacore (Biacore). Em todas as experiências tampão HBS Biacore suplementado com 0,05 % de tensoactivo P20 serviu como tampão de condução. Imobilização de proteína
As proteínas KIR2DL1 e KIR2DL3 recombinantes produzidos como foi descrito acima foram imobilizados covalentemente aos grupos carboxilo na camada de dextrano num Sensor Chip CM5 (Biacore) . A superfície de chip do sensor foi activado com EDC/NHS cloridrato de (N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida e N-hidroxissuccinimida, Biacore).
As proteínas, em tampão de ligação (10 mM de acetato, pH 4,5) foram injectadas. A desactivação dos grupos activados remanescentes foi realizada usando 100 mM de etanolamina pH 8 (Biacore).
Medições de Afinidade
Para as medições cinéticas, várias concentrações do anticorpo solúvel (1 x 10~7 a 4 x 10-1° M) foram aplicadas sobre a amostra imobilizada. As medições foram realizadas a uma taxa de fluxo continuo de 20 μΐ/min. Para cada ciclo, a superfície do chip sensor foi regenerada pela injecção de 5 μΐ de NaOH 10 mM pH 11. O programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) foi usado para a análise de dados. O análito solúvel (40 μΐ em várias concentrações) foi injectado a uma taxa de fluxo de 20 μΐ/min em tampão HBS, em camadas de dextrano contendo 500 ou 540 unidades de reflectância (RU) e 1000 ou 700 RU de KIR2DL1 e KIR2DL3, respectivamente. Os dados são 79 representativos de 6 experiências independentes. Os resultados são mostrados no Quadro 1, abaixo.
Quadro 1. Análise BIAcore da ligação mAb DF200 a KIR2DL1 e KIR2DL3 imobilizada.
Proteína S ΟΛ 1 O \—1 Q KIR2DL1 10,9 ± 3,8 KIR2DL3 2,0 ± 1,9 KD: Constante de dissociação.
Exemplo 6
Análise de ligação competitiva Biacore de anticorpos anti-KIR de murino e humano A análise de mapeamento de epítopo foi realizada em KIR 2DL1 (900 RU), KIR 2DL3 (2000 RU) e KIR 2DS1 (1000 RU) imobilizados com anticorpos anti-KIR 2D de ratinho DF200, Pan2D, gll83 e EB6 e anticorpos anti-KIR 2D humano 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 e 1- 7F9 como anteriormente descrito (Gauthier et al 1999, Saunal e van Regenmortel 1995).
Todas as experiências foram feitas a uma taxa de fluxo de 5 μΐ/min em tampão HBS com 2 min de injecção dos anticorpos diferentes a 15 yg/ml. Para a análise de ligação competitiva de cada par de anticorpos foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa o primeiro anticorpo monoclonal (mAb) foi injectado na proteína alvo KIR 2D seguido pelo segundo mAb (sem remover o primeiro mAb) e o segundo valor RU de mAb (RU2) foi monitorado. Na segunda etapa o segundo mAb foi injectado primeiro, directamente na proteína KIR 2D nu e valor RU de mAb (RUI) foi monitorada. A inibição percentual de ligação do segundo mAb à proteína KIR 2D pelo primeiro mAb foi calculada por: 100*(1-RU2/RU1).
Os resultados são mostrados nos Quadros 2, 3 e 4, onde os anticorpos designados 'primeiro anticorpo' são listados na coluna vertical e os 'segundo anticorpo' são listados na coluna horizontal. Para cada combinação de anticorpo testada, os valores para o nível de ligação directa (RU) dos anticorpos ao chip são listados no guadro, onde a 80 ligação directa do segundo anticorpo ao chip KIR2D é listada na porção superior do campo e o valor quanto à ligação do segundo anticorpo ao chip KIR2D quando o primeiro anticorpo está presente é listado na porção inferior do campo. Listado na direita de cada campo está a inibição percentual da ligação do segundo anticorpo. O Quadro 2 mostra a ligação num chip KIR2DL1, o Quadro 3 mostra a ligação de anticorpos a um chip KIR2DL3 e o Quadro 4 mostra a ligação de anticorpos a um chip KIR2DS1. A ligação competitiva de anticorpos DF200, NKVSF1 e EB6 de murino e anticorpos 1-4F1, 1-7F9 e 1-6F1 humanos a KIR2DL1, KIR2DL2/3 e KIR2DS1 imobilizados foi avaliada. O mapeamento de epítopo (Figura 7) de experiências com ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DL1 mostrou que (a) o anticorpo 1-7F9 é competitivo com EB6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 e DF200; (b) o anticorpo 1-4F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1 e 1-7 F9; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9. O mapeamento de epítopo (Figura 8) de experiências com a ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DL3 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, gll83 e 1-7F9; (b) 1- 7F9 é competitivo com DF200, gll83 e 1-4F1, mas não com NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e GL183, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e 1-7F9, mas não com GL183. O mapeamento de epítopo (Figura 9) de experiências com a ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DS1 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200 e 1- 7F9; (b) 1- 7F9 é competitivo com 1-4F1 mas não competitiva com DF200 e NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200 e 1-4F1, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete comNKVSFl e 1-4F1, mas não com 1-7F9.
Exemplo 7
Titulação mAb Anti-KIR com células NK cinomolgas
Anticorpo NKVSF1 anti-KIR foi testado quanto a sua 81 capacidade para ligar-se às células NK de macaco cinomolgos. A ligação do anticorpo às células NK de macaco é mostrada na Figura 10.
Purificação de PBMC de macaco e geração de volume de célula NK policlonal. PBMC de simio do género Macaca Cinomolgo foram preparadas a partir de tubo CPT de citrato de sódio (Becton Dickinson). A purificação de células NK foi realizada pela depleção negativa (kit de enriquecimento de célula NK de simio do género Macaca, Stem Cell Technology). As células NK foram cultivadas em células alimentadoras humanas irradiadas, 300 U/ml de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1 ng/ml de Fitoemaglutinina A (Invitrogen, Gibco) para obter populações de célula NK policlonal. Titulação de Pan2D mAb com células NK cinomolgas. Células NK cinomolgas (volume NK dia 16) foram incubadas com quantidade diferente de Pan2D mAb seguido pelos anticorpos IgG (H+L) anti-ratinho de fragmentos de F(ab')2 de cabra conjugado com PE. A percentagem de células positivas foi determinada com um controlo isotipico (IgGl de ratinho purificada). As amostras foram feitas em duplicata. Intensidade de fluorescência média = MFI.
Quadro 2: Mapeamento de epítopo de KIR2DL1 <- Segundo Ab -> Primeiro Ab (a DF2 0 0 Pan2D EB6 1-4F1 1-7F9 1-6F1 1-6F5 seguir) DF 2 0 0 80 % 90 % 490 92 480 27 540 15 400 15 % 40 % 350 % 460 % 340 NKVSF1 90 % 90 % 900 95 860 2 % 750 12 600 13 % 50 840 % 660 % 520 E86 60 % 40 % 460 57 370 48 490 65 260 23 nd % 200 % 190 % 170 % 200 1-4 F1 1-7F9 600 10 % 545 2 % 460 60 360 95 330 9 % nd 545 534 % 180 % 16 300 82 <- Segundo Ab -> Primeiro Ab (a DF 2 0 0 Pan2D EB6 1-4F1 1-7F9 1-6F1 1-6F5 seguir) 1-6F1 350 11 % 475 7 % 260 18 360 23 490 10 nd 310 440 % 320 % 275 % 440 1-6F5 350 17 % 475 7 % nd 360 17 nd 290 40 290 440 % 300 % 170
Quadro 3: Mapeamento de epítopo de KIR2DL3 <- Segundo Ab -> Primeiro Ab DF 2 0 0 Pan2D gll83 1-4F1 1-7F9 1-6F1 1-6F5 (a seguir) DF 2 0 0 75 % 20 % 1270 75 520 62 550 16 440 4 % 320 % 200 % 460 % 420 NKVSF 95 % 85 % 2250 68 880 15 840 8 560 18 % 730 % 750 % 770 % 460 gll83 8 % 40 % 1300 75 670 76 530 18 nd % 330 % 160 % 430 1-4F1 1140 82 2400 63 1240 73 1050 87 % 210 % 890 % 330 % 140 1-7F9 770 42 % 870 5 % 800 75 % 1000 63 o, o 450 830 200 270 1-6F1 790 4 % 990 0 % 620 8 % 760 1090 570 1-6F5 800 5 % 990 4 % nd 83
Quadro 4: Mapeamento de epítopo de KIR2DS1 <- Segundo Ab -> Primeiro Ab (a DF 2 0 0 Pan2D 1-4F1 1-7F9 seguir) DF200 70 % 660 87 % 975 15 % 80 825 NKVSF1 100 % 650 100 % 920 45 %* -8 500 1-7F9 900 17 % 1350 11 % 660 96 % 1090 1200 23
Exemplo 8
Mapeamento de epítopo de ligação DF200 e pan2D a KIR2DL1 A modelagem por computador dos domínios extracelulares de KIR2DL1, -2 e -3 (KIR2DL1-3), com base nas suas estruturas cristalinas publicadas (Maenaka et al., (1999),
Fan et al., (2001), Boyington et al., (2000)), previu o envolvimento de aminoácidos R1311 na interacção entre KIR2DL1 e os anticorpos monoclonais de ratinho reactivos cruzados em KIR2DL1-3 (mAb's) DF200 e pan2D. Para verificar isto, as proteínas de fusão foram preparadas consistindo no domínio extracelular completo de KIR2DL1 (aminoácidos Hl-H224) do tipo selvagem ou mutado em ponto (por exemplo, R131W2) , fusionados a Fc humano (hFc) . O material e os métodos usados para produzir e avaliar as várias proteínas de fusão de KIR2DLl-hFc foram descritos (Winter e Long (2000)). Em resumo, vectores de ADNc que codificam KIR2DL1(R131W)-hFc foram gerados pela mutagénese com base em PCR (Quickchange II, Promega de CL42-Ig, um vector de ADNc publicado para a produção de KIR2DLl-hFc do tipo selvagem (Wagtmann et al., (1995)). KIR2DLl-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc foram produzidos em células COS7 e isoladas a partir dos meios de cultura de tecido, essencialmente como descrito (Wagtmann et al., (1995)). Para testar a sua dobra correta, KIR2DLl-hFc e 84 KIR2DL1(R131W)-hFc foram incubados com células LCL721.221 que expressam HLA-Cw3 (nenhum ligando KIR2DL1) ou HLA-Cw4 (ligando KIR2DL1) e a interacção entre as proteínas de fusão KIR-Fc e as células analisadas por FACS, uma técnica padrão para o estudo de interacções de proteína na superfície celular. Um exemplo de experiências independentes é dado na Figura 11, painel A. como previsto da literatura, nenhuma das proteínas de fusão KIR2DLl-hFc ligou as células LCL721.221 que expressam HLA-Cw3. Ao contrário tanto KIR2DLl-hFc quanto KIR2DL1(R131W)-hFc ligaram-se às células LCL721.221 que expressam HLA-Cw4, confirmando deste modo a sua dobra correcta. 1 Código de aminoácido de letra única o
Substituição de R por W na posição de aminoacido 131 (a partir do término N) em KIR2DL1 A ligação de KIR2DL1(R131W)-hFc e KIR2DLl-hFc a mAb's específicos de KIR (DF200, pan2D, EB6 e GL183) foi estudada usando ELISA, uma técnica padrão para estudar as interacções de proteína. Em resumo KIR2DL1(R131W)-hFc e KIR2DLl-hFc foram ligados às placas de 96 reservatórios via anticorpos anti-humanos de cabra, depois que mAb's específicos de KIR foram adicionados em várias concentrações (0 a 1 pg/ml em PBS). As interacções entre as variantes de KIR2DLl-hFc e mAb's foram visualizadas pela espectrofotometria (450 nm) , usando anticorpos secundários ligados a peroxidase específicos para anticorpos de ratinho para converter o substrato TMB. Um exemplo de experiências independentes é dado na figura 11, painel B. Ao passo que o mAbGL183 específico de KIR2DL2-3 não foi capaz de ligar-se a qualquer uma das proteínas de fusão de KIR2DLl-hFc, as variantes de KIR2DLl-hFc ligadas a mAb EB6, DF200 e pan2D específicas de KIR2DL1 numa maneira dependente da dose. A mutação de ponto única (R131W) afectou a ligação de DF200 e pan2D com uma redução na ligação comparada a do tipo selvagem de ~10 % nas concentrações mais altas de mAb (1 85
pg/ml), confirmando que RI 31 é parte do local de ligaçao de DF200 e pan2D no domínio extracelular 2 de KIR2DL1. REFERÊNCIAS
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Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.
Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referentes similares como usado no contexto de descrever a invenção 87 devem ser interpretados para abranger tanto o singular guanto o plural, a menos gue de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. A recitação de intervalos de valores aqui são meramente intencionadas a servir como um método abreviado de referir-se individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo aqui indicado e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui individualmente declarado. A menos que de outro modo estabelecido, todos os valores exactos aqui proporcionados são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exactos proporcionados com respeito a um factor ou medição particular podem ser considerados fornecer também uma medição aproximada correspondente, modificado por "cerca de," onde for apropriado).
Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. A utilização de qualquer e todos os exemplos ou linguagens exemplares (por exemplo, "tal como") proporcionados no presente documento, é intencionado meramente a esclarecer melhor a invenção. 88
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição US 5660827 A [0073] US 4816567 A, Cabilly [0097] US 6162963 A [0100] US 6524583 B [0142] [0143] WO 9816551 A [0143] US 5650491 A [0144] US 5539094 A [0144] US 5583034 A [0144]
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Claims (50)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor do tipo Ig de células NK (KIR, do inglês killer immunoglobulin-like receptor) humano, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores KIR inibidores humanos diferentes, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, sendo que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor, e em que o dito anticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou fragmento do mesmo. 2. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C que tem um resíduo Lys na posição 80 a um receptor KIR2DL1 humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C que tem um resíduo Asn na posição 80 a receptores KIR2DL2/3 humanos.
3. O anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito anticorpo ou fragmento compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pela célula depositada sob o número de acesso CNCM 1-3224 para a ligação a KIR2DL1 e a KIR2DL2/3.
4. Um anticorpo ou fragmento do mesmo que compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pela célula depositada sob o número de acesso CNCM 1-3224 para a ligação a KIR2DL1 e a KIR2DL2/3, e em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou fragmento do mesmo e em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de 2 célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores KIR inibidores humanos diferentes. 5. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito anticorpo compreende todas as regiões CDR de DF200 produzido pela célula depositada sob o número de acesso CNCM 1-3224, em que as CDR da cadeia pesada são como apresentadas nas SEQ ID NOS 10, 11 e 12.
6. O anticorpo de acordo com a reivindicação 5, em que o dito anticorpo compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de DF200 como apresentada na SEQ ID NO 9.
7. O anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 6, em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de um anticorpo monoclonal.
8. O anticorpo de acordo com as reivindicações 1-7, em que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo seleccionado a partir de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, diacorpos, fragmento de anticorpo de cadeia simples, ou um anticorpo multiespecifico que compreende um número de fragmentos de anticorpo diferentes. 9. 0 anticorpo de acordo com as reivindicações 1-7, em que o dito anticorpo é um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo.
10. O anticorpo de acordo com as reivindicações 1-7, em que o dito anticorpo é um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo.
11. O anticorpo de acordo com as reivindicações 1-7, em que o dito anticorpo é um anticorpo quimérico. 3
12. Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano e é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, sendo que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor e em que o dito hospedeiro mamífero não humano é geneticamente modificado ou modificado para produzir anticorpo humanos. 13. 0 hibridoma de acordo com a reivindicação 12, em que o dito hibridoma produz um anticorpo que inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-c que tem um resíduo Lys na posição 80 a um receptor KIR2DL1 humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C que tem um resíduo Asn na posição 80 a receptores KIR2DL2/3 humanos.
14. O hibridoma de acordo com a reivindicação 12, em que o dito hibridoma produz um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 depositado sob o número de acesso CNCM 1-3224.
15. Um método de produção de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, compreendendo o dito método as etapas de: a) imunizar um mamífero não humano com um imunogénio que 4 compreende um polipéptido KIR inibidor; b) preparar anticorpos ou fragmentos de anticorpo a partir do dito animal imunizado, em que os ditos anticorpos se ligam ao dito polipéptido KIR, c) seleccionar anticorpos ou fragmentos de anticorpo de (b) que apresentam uma reacção cruzada com pelo menos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e d) seleccionar anticorpos ou fragmentos de anticorpo de (c) que são capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que a ordem das etapas (c) e (d) é opcionalmente invertida e em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e em que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor. 16. 0 método de acordo com a reivindicação 15, em que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo preparados na etapa (b) é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. 17. 0 método de acordo com a reivindicação 15, em que o polipéptido KIR inibidor usado para a imunização é um polipéptido KIR2DL e os anticorpos seleccionados na etapa (c) apresentam reacção cruzada com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. 18. 0 método de acordo com a reivindicação 17, em que os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo seleccionados na etapa (c) inibem a ligação de uma molécula de alelo de HLA-c que tem um residuo Lys na posição 80 a um receptor KIR2DL1 humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C que tem um resíduo Asn na posição 80 a receptores KIR2DL2/3 humanos. 5 19. 0 método de acordo com a reivindicação 15, em que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo seleccionados na etapa (d), produzem pelo menos 50 % da lise de células alvo observada com células NK ou linhas de células NK que não são bloqueadas pelo seu KIR, como medido por um teste de citotoxicidade de libertação de crómio, numa população de células NK que expressa um dado KIR em contacto com células alvo que expressam a molécula de MHC de classe I cognata.
20. O método de acordo com a reivindicação 15, em que os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo se ligam substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pela célula depositada sob o número de acesso CNCM 1-3224.
21. O método de acordo com a reivindicação 15, que compreende a etapa adicional de produzir fragmentos dos anticorpos monoclonais seleccionados.
22. Um método de produção de um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, compreendendo o dito método as etapas de: a) seleccionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo que apresenta reação cruzada com pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR2DL humano, e b) seleccionar um anticorpo de (a) que é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do 6 gene de receptor KIR2DL humano, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e em que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor. 23. 0 método de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo seleccionado na etapa (b) inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-c que tem um resíduo Lys na posição 80 a um receptor KIR2DL1 humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C que tem um resíduo Asn na posição 80 a receptores KIR2DL2/3 humanos.
24. O método de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo seleccionado na etapa (b) produz pelo menos 50 % da lise de células alvo observada com células NK ou linhas de células NK que não são bloqueadas pelo seu KIR, como medido por um teste de citotoxicidade de libertação de crómio, numa população de células NK que expressa um dado KIR em contacto com células alvo que expressam a molécula de MHC de classe I cognata.
25. O método de acordo com a reivindicação 22, em que o dito anticorpo se liga substancialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pela célula depositada sob o número de acesso CNCM 1-3224.
26. O método de acordo com a reivindicação 22, que compreende a etapa adicional de produzir fragmentos dos anticorpos monoclonais seleccionados.
27. Um método de produção de um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os 7 ditos pelo menos dois produtos inibidores diferente do genes do receptor KIR humano, compreendendo o dito método as etapas de: a) cultivar um hibridoma de qualquer uma das reivindicações 12 a 14 sob condições que produzem a expressão do dito anticorpo monoclonal; e b) separar o dito anticorpo monoclonal do dito hibridoma. 28. 0 método de acordo com a reivindicação 27, que compreende a etapa adicional de produzir fragmentos do dito anticorpo monoclonal.
29. Um método de produção de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, compreendendo o dito método as etapas de: a) isolamento de um hibridoma do ADN que codifica o dito anticorpo monoclonal, em que o hibridoma compreende a) uma célula B de um hospedeiro mamífero não humano que foi imunizado com um antigénio que compreende um epítopo presente num polipéptido KIR inibidor, fusionado com b) uma célula imortalizada, em que o dito hibridoma produz um anticorpo monoclonal que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano e é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK numa população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, sendo que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor; 8 b) modificar opcionalmente o dito ADN de modo a codificar um anticorpo modificado ou derivatizado seleccionado a partir de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento imunorreactivo de um anticorpo; c) inserir o dito ADN ou ADN modificado num vector de expressão, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é capaz de ser expresso quando o dito vector de expressão está presente num hospedeiro crescido sob condições apropriadas; d) transfectar uma célula hospedeira com o dito vector de expressão, em que a dita célula hospedeira não produz de outra maneira a proteína imunoglobulina; e) cultivar a dita célula hospedeira transfectada sob condições que produzem a expressão do dito anticorpo ou fragmento de anticorpo; e f) isolar o anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido pela dita célula hospedeira transfectada.
30. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido por qualquer uma das reivindicações 15 a 29, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo.
31. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores KIR inibidores humanos diferentes, o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo estando presente numa quantidade eficaz para potenciar de maneira detectável a citotoxicidade de célula NK num paciente ou numa amostra biológica que compreende células NK; e um veículo ou 9 excipiente farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, sendo que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor.
32. A composição de acordo com a reivindicação 31, em que 0 anticorpo é um anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 11 ou 30.
33. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano em que o anticorpo se liga a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, sendo que KIR2DL2 e KIR2DL3 são considerados como sendo uma única molécula de KIR inibidor, e em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade de célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores KIR inibidores humanos diferentes, o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo estando presente numa quantidade eficaz para potenciar de maneira detectável a citotoxicidade de célula NK num paciente ou numa amostra biológica que compreende células NK; e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, que compreende ainda um agente terapêutico seleccionado a partir de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a e inibe um receptor KIR inibidor, um agente anti-infeccioso, um agente de direccionamento ou um composto adjuvante.
34. A composição de acordo com a reivindicação 31, que compreende ainda um agente terapêutico seleccionado a partir de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico, um 10 agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a e inibe um receptor KIR inibidor, um agente anti-infeccioso, um agente de direccionamento ou um composto adjuvante.
35. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que o dito agente imunomodulador é seleccionado a partir de IL-lalfa IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, 1-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, ou IFN-gama. antibióticos mitomicina, tamoxifeno, vinorelbina, arabinósido metotrexato, cisplatina
36. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que o dito agente quimioterapêutico é seleccionado a partir de agentes alquilantes, antimetabólitos, citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, taxol, taxotere, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo (5FU), de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, (CD-DP), aminopterina, combretastatina(s), outros alcaloides da vinca, e derivados ou pró-fármacos dos mesmos.
37. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que o dito agente hormonal é seleccionado a partir de leuprorelina, goserelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifeno, flutamida, nilutamida, ciproterona bicalutamida, anastrozol, exemestano, letrozol, fadrozol medroxi, clormadinona, megestrol, outros agonistas de LHRH, outros anti-estrogénios, outros anti-androgénios, outros inibidores de aromatase, e outros progestagénios.
38. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, 11 em que o dito composto adjuvante é seleccionado a partir de fenotiazinas, benzamidas substituídas, anti-histamínicos, butirofenonas, corticosteróides, benzodiazepinas, canabinóides, ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, eritropoietina, G-CSF, filgrastim, lenograstim, darbepoietina outros antieméticos, outros antagonistas de serotonina, outros bisfosfonatos ou outros factores de crescimento hematopoiéticos.
39. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que os ditos agentes anti-apoptóticos são uma sequência de nucleótido antisense, ARNi, ARNip ou um composto químico de molécula de baixo peso molecular que inibe a expressão de um gene seleccionado a partir de bcr-abl, bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, ou A20.
40. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que o dito agente anti-angiogénico é seleccionado a partir de anticorpos neutralizantes, ARN antisense, ARNip, ARNi, aptámeros de ARN ou ribozimas direccionadas contra um gene que codifica VEGF, um gene que codifica receptores de VEGF, VEGF, ou um receptor de VEGF; ou uma variante de VEGF que possui propriedades antagonísticas contra VEGF.
41. A composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que o dito segundo anticorpo que se liga a e inibe um receptor KIR inibidor é um anticorpo ou um derivado ou fragmento do mesmo que se liga a um epítopo de um receptor KIR inibidor que difere do epítopo ligado pelo dito anticorpo que se liga um determinante comum presente em pelo menos dois produtos inibidores diferentes do gene do receptor KIR humano.
42. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-41 para utilização para potenciar a 12 actividade de célula NK num paciente em necessidade da mesma.
43. Composição de acordo com a reivindicação 42, em que o dito paciente está a sofrer de cancro, outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune.
44. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de carcinoma de células escamosas, leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma de Burkitt, leucemias mielógenas agudas ou crónicas, leucemia promielocitica, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma; melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwannomas; fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cancro folicular da tiróide, teratocarcinoma, outros carcinomas da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, colo do útero, tiróide ou pele, outros tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, outros tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, outros tumores de origem mesenquimal, outros tumores do sistema nervoso central ou periférico, ou outros tumores de origem mesenquimal.
45. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de leucemia mieloblástica aguda (LMA).
46. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de linfoma não-Hodgkin.
47. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o 13 dito paciente está a sofrer de carcinoma da mama.
48. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de carcinoma do ovário.
49. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de um tumor hematopoiético de linhagem linfóide.
50. Composição de acordo com a reivindicação 49, em que o dito tumor é seleccionado a partir de leucemia prolinfocítica T (LPL-T) incluindo do tipo de célula cerebriforme e célula pequena; leucemia de linfócitos grandes granulares (LLG) do tipo de células T; sindrome de Sezary (SS); linfoma de leucemia de células T no adulto (LLTA); linfoma hepatosplénico a/d T-NHL; linfoma de célula T periférica/pós-timica do subtipo pleomórfico ou imunoblástico; linfoma de célula T angio imunoblástico; linfoma de célula T angiocéntrico (nasal); linfoma anaplásico de grandes células (Ki 1+); linfoma de células T intestinal; leucemia linfoblástica 1; ou linfoma/leucemia (T-Lbly/TALL).
51. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de um distúrbio proliferativo seleccionado a partir de hiperplasias, fibrose, angiogénese, psoríase, aterosclerose, estenose ou reestenose pós-angioplastia, e outras doenças, caracterizada por proliferação de músculo liso nos vasos sanguíneos.
52. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de uma doença infecciosa causada por um vírus seleccionado a partir de hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, hepatite do tipo C, influenza, 14 varicela, adenovírus, herpes simples do tipo I (HSV-1), herpes simples do tipo 2 (HSV-2), peste bovina, rinovirus, echovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papilomavírus, papilomavírus, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus da rubéola, poliovírus ou vírus da imunodeficiência humana do tipo I ou tipo 2 (VIH-1, VIH-2).
53. Composição de acordo com a reivindicação 43, em que o dito paciente está a sofrer de uma doença infecciosa causada por uma bactéria, protozoário ou parasita seleccionado a partir de Staphylococcus, S. pyogenes, Enterococci, Bacillus anthracis, Lactobacillus, Listeria, Corynebacterium diphtheriae, G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponima; Camplyobacter, P aeruginosa; Legionella; N.gonorrhoeae; N.meningitides; F. meningosepticum; F. odoratum; Brucella; B. pertussis; B. bronchiseptica; E. coli; Klebsiella; Enterobacter; S. marcescens; S. liquefaciens; Edwardsiella; P. mirabilis; P. vulgaris; Streptobacillus; R. fickettsii; C. psittaci; C. trachomatis; M. tuberculosis, M. intracellulare, M. fortuitum, M. leprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. lepraemurium; Nocardia, outros Streptococcus, outros Bacillus, outras Gardnerella, outras Pseudomonas, outras Neisseria, outros Flavobacterium, outras Bordetella, outras Escherichia, outras Serratia, outros Proteus, outros Rickettsiaceae, outras Chlamydia, outros Mycobacterium, Leishmania, ou tripanossoma.
54. Composição de acordo com a reivindicação 43, que compreende o medicamento que é usado em combinação com um agente terapêutico adicional apropriado seleccionado a partir de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico, um 15 agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a e inibe um receptor KIR inibidor, um agente anti-infeccioso, um agente de direccionamento ou um composto adjuvante em que o dito agente terapêutico adicional é administrado ao dito paciente como uma forma farmacêutica individual juntamente com o dito anticorpo, ou como forma farmacêutica separada.
55. Composição de acordo com a reivindicação 54, em que o dito paciente está a sofrer de um tumor hematopoiético de linhagem linfóide, leucemia mieloblástica aguda (LMA) ou linfoma não-Hodgkin.
56. Composição de acordo com a reivindicação 54, em que o dito paciente está a sofrer de carcinoma da mama ou do ovário. 57. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a uma toxina, um grupo detectável, ou um suporte sólido.
58. Um método in vitro de detecção da presença de células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície celular numa amostra biológica, compreendendo o dito método as etapas de: a) colocar a dita amostra biológica em contacto com um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 57, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a um grupo detectável; e b) detectar a presença do dito anticorpo na dita amostra biológica.
59. Um método de purificação a partir de uma amostra de células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície 16 celular que compreende as etapas de: a) colocar a dita amostra em contacto com um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 57 sob condições que permitem às ditas células NK que possuem um KIR inibidor na sua superfície celular ligar-se ao dito anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido; e b) eluir as ditas células NK ligadas do dito anticorpo ou fragmento de anticorpo conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido.
60. Uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo é incorporado num lipossoma.
61. A composição de acordo com a reivindicação 60, em que uma substância adicional seleccionada a partir de uma molécula de ácido nucleico para a administração de genes para terapêutica génica; uma molécula de ácido nucleico para a administração de ARN antisense, ARNi ou ARNip para suprimir um gene numa célula NK; ou uma toxina ou um fármaco para a destruição direccionada de células NK é incorporada adicionalmente no dito lipossoma.
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