CN108060137B

CN108060137B - Il7和il21修饰的nk92细胞、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN108060137B
Application number: CN201711436816.9A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 张平
Original assignee: Perongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Current assignee: Perongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108060137A

Abstract

本发明提供一种IL7和IL21修饰的NK92细胞、制备方法及其应用。具体地，本发明提供的NK细胞可有效杀伤肿瘤细胞，其体外增殖能力明显增强，体外易于扩增，可高密度培养，杀伤能力很强，生产成本低，副作用小，没有移植物抗宿主反应的危险。并且，所述NK细胞能显著刺激T细胞的活化和增殖，相互协作共同杀伤肿瘤细胞，有效增强机体的免疫应答反应。同时所述NK细胞与T细胞相互之间无细胞毒性，也不影响各自对靶细胞的杀伤效果。

Description

IL7和IL21修饰的NK92细胞、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及IL7和IL21修饰的NK92细胞、制备方法及其应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

近年来，NK细胞在过继性细胞免疫治疗中表现出极大的应用前景。相关临床试验表明，对于癌症晚期的病人注射具有较小的副作用。NK-92细胞系衍生自一位非霍奇金性淋巴瘤患者的外周血单核细胞，具有很强的细胞毒性能力。NK92MI是通过转染得到的源自NK-92的IL-2非依赖的NK细胞株，即在体外培养时不需要添加IL-2。NK92MI细胞作为一株肿瘤细胞，和其他肿瘤细胞一样可以在体外可无限增殖且不依赖IL2，但在NK92MI细胞的体外培养过程中仍存在一些问题，NK92MI细胞在体外的增殖能力不如其他悬浮生长的肿瘤细胞，且不可高密度培养。NK92MI细胞在正常生长状态下是抱团悬浮生长，但是密度不可高，一旦密度过高，细胞团就会散开。细胞团散开后细胞状态会越来越差，并且不可恢复。

因此，本领域迫切需要开发一种增值能力强、可高密度培养、并能更有效杀伤肿瘤细胞的工程化的NK细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种增值能力强、可高密度培养、并能更有效杀伤肿瘤细胞的工程化的NK细胞。

本发明的另一目的是提供一种可在细胞膜上表达IL7和/或IL21的工程化NK细胞。

本发明的第一方面，提供了一种工程化的NK细胞，所述的NK细胞具有以下特征：

(1)含有外源的第一表达盒和/或第二表达盒，其中所述第一表达盒用于表达包含IL7的第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达包含IL21的第二融合蛋白；和

(2)所述第一融合蛋白和第二融合蛋白定位于所述NK细胞的细胞膜上，并且所述第一融合蛋白的IL7区段(IL7元件)和第二融合蛋白的IL21区段(IL21元件)暴露在细胞膜外。

在另一优选例中，所述NK细胞具有以下特征：

(1)含有外源的第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒用于表达包含IL7的第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达包含IL21的第二融合蛋白；和

在另一优选例中，所述第一融合蛋白的结构如下式I所示：

L1-I1-H1-F1-TM1-C1 (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键

L1为无或信号肽序列；

I1为IL7；

H1为任选的铰链区；

F1为任选的Fc段；

TM1为跨膜结构域；

C1为无或胞内结构域。

在另一优选例中，所述第二融合蛋白的结构如下式II所示：

L2-I2-H2-F2-TM2-C2 (II)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键

L2为无或信号肽序列；

I2为IL21；

H2为任选的铰链区；

F2为任选的Fc段；

TM2为跨膜结构域；

C2为无或胞内结构域。

在另一优选例中，所述信号肽为选自下组的蛋白的信号肽：GM-CSF、CD4、CD8、或其组合。

在另一优选例中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述IL7的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述铰链区为选自下组的蛋白的铰链区：IgG4、CD8、CD28、或其组合。优选地，所述铰链区为IgG4铰链区的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。在另一优选例中，所述铰链区的氨基酸序列还包括如SEQ ID NO.:4所示的序列，并且SEQ ID NO.:4中第10位的脯氨酸(P)替换为丝氨酸(S)。

在另一优选例中，所述Fc段为哺乳动物免疫球蛋白的Fc段(或CH2和CH3结构域)，优选为人的免疫球蛋白的Fc段，更优选地为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc段。

在另一优选例中，所述Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述跨膜结构域为选自下组的蛋白的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、或其组合。

在另一优选例中，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述第一融合蛋白的核酸编码序列如SEQ ID NO.:9所示。

在另一优选例中，所述第二融合蛋白的核酸编码序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述第一表达盒含有编码所述第一融合蛋白的核酸序列。

在另一优选例中，所述第二表达盒含有编码所述第二融合蛋白的核酸序列。

在另一优选例中，所述第一表达盒和第二表达盒分别还包含启动子和/或终止子。

在另一优选例中，所述启动子为哺乳动物启动子，优选地为hEF1alpha。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于载体上或整合在所述工程化的NK细胞的染色体中。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒是独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为Hulk载体。

在另一优选例中，所述NK细胞是离体。

在另一优选例中，所述NK细胞是自体或异体的。

在另一优选例中，所述NK细胞来自灵长目动物(优选为人)。

在另一优选例中，所述NK细胞是NK92细胞。

在另一优选例中，所述NK细胞是NK92MI细胞。

本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的NK细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的NK细胞；和

(B)将第一表达盒和/或第二表达盒导入到所述待改造的NK细胞，其中所述第一表达盒用于表达第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达第二融合蛋白，从而获得本发明第一方面所述的工程化的NK细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述第一融合蛋白的第一表达盒导入所述NK细胞；和(B2)将表达所述第二融合蛋白的第二表达盒导入所述NK细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，所述的载体为Hulk载体。

本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的NK细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中工程化的NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的工程化的NK细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、或其组合。

本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化的NK细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述第一融合蛋白的第一表达盒；和/或

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达所述第二融合蛋白的第二表达盒。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞的流式分析结果。其中，图1A为NK92MI/IL21细胞的流式分析结果；图1B为NK92MI/IL7&21细胞的流式分析结果。

图2显示了NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞较亲本细胞NK92MI的增殖活性有所提高。其中，图2A和图2B显示了NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞分别对Jurkat和K562细胞的杀伤试验结果；图2C显示了NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞的体外增殖结果。

图3显示了NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对PBMC中T细胞增殖和活化有刺激和促进作用。其中，图3A、B、C和D分别显示了PBMC中T细胞的CD25、CD69、CCR7和CD45RA分子在与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共培养的第0、3、7、10天时的流式检测结果。

图4显示了三种NK细胞与活化后T细胞相互无细胞毒性且对肿瘤细胞的毒性也不会相互干扰。图4A为活化后的T细胞对K562、NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞的细胞毒性结果(图示中每组左边的柱高表示靶细胞的自然死亡率，右边的柱高表示活化T细胞的细胞毒性)；图4B为NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞的细胞毒性；图4C为活化T细胞存在下，NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞的细胞毒性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次意外地发现一种可表达IL7和/或IL21的NK细胞。实验表明，本发明的NK细胞可有效杀伤肿瘤细胞，其体外增殖能力明显增强，体外易于扩增，并且可以高密度培养，杀伤能力很强，生产成本低，副作用小，没有移植物抗宿主反应的危险。并且，所述NK细胞能显著刺激T细胞的活化和增殖，相互协作共同杀伤肿瘤细胞，有效增强机体的免疫应答反应。同时所述NK细胞与T细胞相互之间无细胞毒性，也不影响各自对靶细胞的杀伤效果。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞侵袭。近年来，NK细胞在过继性细胞免疫治疗中表现出极大的应用前景。

NK-92细胞是从一位患有急性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性患者的外周血单核细胞衍生来的一株白细胞介素-2(IL2)依赖型NK细胞株。NK-92细胞是目前唯一被FDA批准的临床试验的NK细胞系，这株细胞的细胞毒性很强、经济、off-the-shelf、容易规模化制备，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者没有对NK-92细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险，不表达KIRs，处于组成型激活状态，到目前为止表现出很好的临床安全性。

NK92MI细胞是通过转染得到的源自NK-92细胞的IL2非依赖型的细胞株，这株细胞对很多的恶性肿瘤细胞都有细胞毒性，在临床应用中具有更大的应用前景。NK92MI细胞是一株既不依赖抗体参与，也不需要抗原刺激和致敏就能够杀伤靶细胞的淋巴细胞。它对很多恶性细胞都有细胞毒性，铬释放试验显示它能够杀死K562和Daudi细胞。NK92MI细胞已经作为一种过继性细胞免疫治疗细胞应用于临床研究中，对于癌症晚期的病人注射具有较小的副作用。

在本发明中，除另有说明外，“NK细胞”、“本发明NK细胞”或“工程化的NK细胞”均指本发明第一方面所述的NK细胞，含有外源的用于表达第一融合蛋白的第一表达盒和/或用于表达第二融合蛋白的第二表达盒。

在本发明中，“被白介素7和白介素21双修饰后的NK92MI细胞”、“NK92MI/IL7&21细胞”、“同时表达IL7和IL21分子的NK92MI细胞”或“共表达IL7和IL21分子的NK92MI细胞”均指同时表达第一融合蛋白和第二融合蛋白的NK92MI细胞。

在本发明中，“经白介素7修饰的NK92MI细胞”、“NK92MI/IL7细胞”或“表达IL7分子的NK92MI/IL7细胞”均指表达第一融合蛋白的NK92MI细胞。

在本发明中，“经白介素21修饰的NK92MI细胞”、“NK92MI/IL21细胞”或“表达IL21分子的NK92MI/IL21细胞”均指表达第二融合蛋白的NK92MI细胞。

IL7

IL7主要来自骨髓和胸腺的基质细胞，对B细胞和T细胞的发育有着非常重要的作用。小鼠的基因敲除实验显示IL7在淋巴样细胞的存活中扮演着非常重要的作用。IL7能够维持CTL和记忆T细胞的存活，能够增强淋巴细胞的浸润，从而增强抗肿瘤活性。

如本文所用，“IL7”、“IL7元件”和“IL7区段”可互换使用，NCBI ReferenceSequence:NP_000871.1。在本发明的一个优选例中，所述IL7(IL7元件或IL7区段)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，共177个AA。IL-7AA序列(177aa)：

MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCLNNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ VKGRKPAALGEAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLL QEIKTCWNKI LMGTKEH(SEQ ID NO.:2)

IL21

IL21主要是由Th细胞产生的细胞因子，是由IL21基因编码的蛋白质，在固有免疫应答和适应性免疫应答中扮演重要角色，可调节刺激巨噬细胞、NK细胞、B细胞和细胞毒T细胞的分化、增殖和活化。

如本文所用，“IL21”、“IL21元件”和“IL21区段”可互换使用，NCBI ReferenceSequence:Q9HBE4.2。在本发明的一个优选例中，所述IL21(IL21元件或IL21区段)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

MERIVICLMV IFLGTLVHKS SSQGQDRHMI RMRQLIDIVD QLKNYVNDLV PEFLPAPEDVETNCEWSAFS CFQKAQLKSA NTGNNERIIN VSIKKLKRKP PSTNAGRRQK HRLTCPSCDS YEKKPPKEFLERFKSLLQKM IHQHLSSRTH GSEDS(SEQ ID NO.:3)

融合蛋白

如本文所用，术语“第一融合蛋白”或“本发明第一融合蛋白”、“第二融合蛋白”或“本发明第二融合蛋白”分别指定位于所述NK细胞的细胞膜上，并且所述IL7区段(IL7元件)或IL21区段(IL21元件)暴露在细胞膜外的融合蛋白，具有本发明第一方面所述的结构。

本发明的所述融合蛋白表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上，形成一个将IL7或IL21元件暴露在胞外的膜蛋白。此外，本发明融合蛋白还可含有任选的信号肽、铰链区、Fc段、连接肽元件(linker)、跨膜结构域或其他元件。

在本发明的一个优选例中，所述信号肽为GM-CSF信号肽，序列如SEQ ID NO.:1所示。

MWLQSLLLLG TVACSIS(SEQ ID NO.:1)

在本发明的一个优选例中，所述铰链区的序列如SEQ ID NO.:4所示。在另一优选例中，所述铰链区的氨基酸序列还包括如SEQ ID NO.:4所示的序列，并且SEQ ID NO.:4中第10位的脯氨酸(P)替换为丝氨酸(S)。

ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO.:4)

在本发明的一个优选例中，所述Fc段的序列如SEQ ID NO.:5所示。

APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO.:5)

在本发明的一个优选例中，所述跨膜结构域为CD4跨膜区，序列如SEQ ID NO.:6所示。

MALI VLGGVAGLLL FIGLGIFF(SEQ ID NO.:6)

如本文所用，术语“第一融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:7序列的变异形式。术语“第二融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:8序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I或式II的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:7、8所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

MWLQSLLLLGTVACSISMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFF(SEQ ID NO.:7)。

其中，在SEQ ID NO.:7中第1-17位为信号肽；第18-194位为IL7；第195-206位为铰链区；第207-423位为Fc段；第424-445位为跨膜结构域。

在本发明的一个实施方式中，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

MWLQSLLLLGTVACSISMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO.:8)。

其中，在SEQ ID NO.:8中第1-17位为信号肽；第18-172位为IL21；第173-184位为铰链区；第185-401位为Fc段；第402-423位为跨膜结构域。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:7或8所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:7或8所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:9或10所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述第一融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ IDNO.:9所示。第一融合蛋白的编码多核苷酸序列(1335bp+3bp终止子)：

ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTATGTTTCACGTCAGCTTTAGGTATATCTTCGGCCTGCCCCCCCTCATCCTGGTGCTCCTCCCTGTGGCCAGCTCCGATTGCGACATTGAGGGCAAGGACGGAAAACAGTACGAGAGCGTCCTCATGGTGTCCATCGATCAACTGCTGGACTCCATGAAGGAGATTGGCAGCAACTGCCTCAATAACGAGTTCAACTTCTTTAAGAGGCACATCTGCGACGCTAACAAAGAGGGCATGTTTCTCTTCAGGGCCGCCAGAAAGCTGAGACAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGATTTCGACCTGCACCTGCTCAAGGTCAGCGAGGGAACCACAATTCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCAGAAAGCCTGCCGCTCTCGGAGAGGCCCAACCCACAAAATCCCTGGAAGAGAACAAGAGCCTGAAGGAGCAAAAGAAGCTGAACGACCTCTGCTTCCTGAAAAGGCTGCTCCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCACGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGA(SEQ ID NO.:9)。

在本发明的一个实施方式中，所述第二融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ IDNO.:10所示。第二融合蛋白的编码多核苷酸序列1269bp+3bp(终止子)：

ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGA(SEQ ID NO.:10)。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

表达盒

如本文所用，“表达盒”或“本发明表达盒”包括第一表达盒和/或第二表达盒。所述第一表达盒含有编码所述第一融合蛋白的核酸序列；所述第二表达盒含有编码所述第二融合蛋白的核酸序列。

在一个实施方式中，所述第一表达盒和第二表达盒分别还包括启动子和/或终止子。在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于载体上或整合在所述工程化的NK细胞的染色体中。在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于相同或不同的载体上。在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一载体。在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

载体

本发明还提供了含有本发明表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为Hulk载体，Hulk载体为电转载体，启动子为hEF1alpha。

制备方法

本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。本发明采用常规的重组DNA技术制备本发明工程化的NK细胞。

本发明提供了一种制备工程化的NK细胞的方法，包括将第一表达盒和/或第二表达盒导入到所述待改造的NK细胞，其中所述第一表达盒用于表达第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达第二融合蛋白，从而获得所述的工程化的NK细胞。

一般包括以下步骤：(1)用编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的工程化NK细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括含本发明表达盒的载体转导的NK细胞进行的治疗性应用。本发明转导的NK细胞可靶向肿瘤细胞，其细胞毒性和体外增殖能力明显增强，并能显著刺激T细胞的活化和增殖，同时本发明NK细胞与T细胞相互之间无细胞毒性，也不影响各自对靶细胞的杀伤效果。

在一个实施方式中，本发明提供一类细胞疗法，包括给哺乳动物施用本发明的NK细胞。不像抗体疗法，本发明NK细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将本发明表达盒引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用含本发明表达盒的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。本发明NK细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和本发明的IL7和/或IL21修饰的NK细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的IL7和IL21修饰的NK细胞。

本发明的NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如一些细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物或制剂可包括如本文所述的NK细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂组合。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。NK细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的NK细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10³个至1×10¹⁰个本发明经修饰的NK细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点

(1)本发明的NK细胞不仅不干扰体内正常T细胞，相反能显著刺激T细胞的活化和增殖，相互协作共同杀伤肿瘤细胞，有效增强机体的免疫应答反应。

(2)本发明的NK细胞可有效杀伤肿瘤细胞，其体外增殖能力明显增强，体外易于扩增，杀伤能力很强，生产成本低，副作用小，没有移植物抗宿主反应的危险。

(3)本发明NK细胞与T细胞相互之间无细胞毒性，也不影响各自对靶细胞的杀伤效果。

(4)本发明的NK细胞可进行高密度培养，克服了NK92MI细胞不可高密度培养的问题。

(5)相对于分泌性的IL7和/或IL21，本发明无需外界添加IL7和/或IL21，也无需自身刺激就可以长期存在，且效果优于分泌的或外源添加的IL7和/或IL21。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料与方法

1.细胞株、主要试剂与仪器

NK92MI、Jurkat和K562细胞株购于ATCC。MEM-α培养基(Gibco公司)，RPMI1640培养基(Thermo Scientific公司)，胎牛血清(FBS)(HyClone公司)，支原体检测试剂盒(华安生物)，CFSE探针(Invitrogen),7-AAD(7-aminoactinomycin D；BD Pharmingen)，淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque；Pharmacia,Piscataway,NJ)；CD3、CD25、CD69、CD45RA和CCR7等抗体均来自BD Bioscience公司。生物安全柜(AIRTECH公司)；FACS AriaⅢ和FACS Caliber流式细胞仪(BD Bioscience公司)；CO2细胞培养箱(Thermo公司)；凝胶成像系统(Bio-rad公司)；水平电泳槽(天能公司)；恒温摇床(培英公司)；电转仪(LONZA)。

2.细胞培养

K562细胞，Jurkat细胞使用的培养基是RPMI1640，添加10％FBS；

NK92MI，NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞使用的培养基是MEM-α培养基，添加12.5％FBS、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸和0.01mMβ-巯基乙醇；

从正常人外周血中用Ficoll法提得PBMC细胞，用IL2和2012细胞(经人工改造过的K562细胞，刺激T细胞的活化，使用前辐照，不具有增殖能力)刺激T细胞活化，PBMC细胞及活化后的T细胞使用的培养基是RPMI1640，添加10％FBS。所有的细胞培养在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。

3.细胞系的支原体检测

支原体是一种大小仅为0.2～0.3um，无细胞壁，可透过一般的滤膜的原核生物，在细胞培养过程中，细胞的支原体污染仍是一个世界性难题。对于一些细胞系来说在被支原体感染的前期并没有明显的标志，而且细胞增殖也没有多大的影响，所以一般不易察觉。然而，细胞的支原体污染的存在却有重大的潜在危害，支原体污染会影响实验结果的稳定性、可靠性和准确性。对整个实验过程中用到的细胞系进行支原体检测(支原体PCR检测试剂盒，华安生物)，确保所用细胞系为支原体阴性，排除支原体对实验结果的干扰。

4.数据分析

数据是用软件GraphPad Prism5和Flow_V10来进行处理的，每组都至少进行了三次重复试验，用Student’s t test分析，P值小于0.05被认为有统计学差异。

实施例1 NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞系的构建

第一融合蛋白的分子结构设计：GM-CSF信号肽-IL7序列-铰链区-Fc段-CD4跨膜区

第二融合蛋白的分子结构设计：GM-CSF信号肽-IL21序列-铰链区-Fc段-CD4跨膜区

通过基因合成方式合成第一融合蛋白编码序列和第二融合蛋白编码序列，本发明将基因合成的第一融合蛋白编码序列(SEQ ID NO.:9)和第二融合蛋白编码序列(SEQ IDNO.:10)分别构建到pHULK piggyBac N-Comet GFP载体(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上，成功构建了IL7-pHULK piggyBac N-Comet GFP质粒和IL21-pHULKpiggyBac N-Comet GFP质粒。首先将IL21-pHULK piggyBac N-Comet GFP质粒通过电转的方式电转NK92MI细胞，并通过流式细胞分选仪分选得到高表达IL21分子(即高表达第二融合蛋白)的NK92MI/IL21细胞。然后用IL7-pHULK piggyBac N-Comet GFP质粒电转NK92MI/IL21细胞，同样利用流式分选的方式分选得到同时高表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞。然后染上相应抗体在流式细胞分选仪(FACS Aria III)上分选，直至IL7和IL21的阳性率达80％以上。

结果如图1所示。图1A为NK92MI/IL21细胞的流式分析结果，染IL21抗体(APC荧光)后测得IL21的阳性率为95.9％；CONT表示亲本的NK92MI细胞染IL21抗体作为对照。图1B为NK92MI/IL7&21细胞的流式分析结果，分别染IL7抗体(APC荧光)和IL21抗体(APC荧光)后测得阳性率分别为79.9％，93.6％；CONT表示亲本的NK92MI细胞染IL7和IL21抗体作为对照。

实施例2 NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞的细胞毒性及体外增殖比较

体外杀伤试验中，杀伤结果检测的方法用的是CFSE/7-AAD流式检测方式，具体地，取靶细胞于15ml离心管中，PBS重悬，加微量CFSE于37℃孵育30min，取靶细胞4×10⁵个于24孔板中，再加入相应数量的效应细胞，混匀，终体系为1.5ml。效应细胞和靶细胞共培养，然后去除上清，用PBS洗一遍，再PBS重悬后每组加入2ul 7-AAD，然后在FACS Calibur机器上进行检测。CFSE阳性细胞群为靶细胞，该细胞群中7-AAD阳性的细胞群所占比例即为靶细胞的死亡率。

NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对Jurkat和K562细胞的杀伤试验和细胞增殖检测试验。NK92MI细胞是一株既不依赖抗体参与，也不需要抗原刺激和致敏就能够杀伤靶细胞的淋巴细胞。它对很多恶性细胞都有细胞毒性，铬释放试验显示它能够杀死K562和Daudi细胞。本发明选择了对NK92MI敏感的K562细胞和不敏感的Jurkat细胞作为细胞毒性试验的靶细胞，取NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞作为效应细胞，效靶比(E:T)为1：1，杀伤时间为4小时(每组平行对照3组)。给细胞计数，分别取5×10⁴个NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞(每组细胞平行对照3组)培养，每隔24小时后计数，总共计7次。

结果如图2所示。其中，NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对Jurkat和K562细胞的杀伤试验如图2A和图2B所示。结果显示，NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞和Jurkat细胞的杀伤无统计学差异，表明当NK92MI细胞表达IL21(即高表达第二融合蛋白)或共表达IL7和IL21分子(即同时表达第一融合蛋白和第二融合蛋白)时，对其细胞毒性没有统计学差异，共表达IL7和IL21分子的NK92MI细胞对Jurkat的细胞毒性略高于NK92MI和NK92MI/IL21细胞对Jurkat的细胞毒性。

NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞的体外增殖数据是用软件GraphPadPrism5处理得到图2C。如表1和图2C所示，NK92MI/IL7&21细胞数目明显高于亲本NK92MI细胞组和只表达IL21分子的NK92MI/IL21细胞组，只表达IL21分子的NK92MI/IL21细胞较亲本NK92MI细胞也有所提高。此外，按照同样实验方法对NK92MI/IL7细胞的体外增殖进行研究。

表1 NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21的体外增殖结果

培养时间	NK92MI	NK92MI/IL21	NK92MI/IL7&21
				0天	5×10<sup>4</sup>	5×10<sup>4</sup>	5×10<sup>4</sup>
1天	14.68×10<sup>4</sup>	21.6×10<sup>4</sup>	40.62×10<sup>4</sup>
				2天	30×10<sup>4</sup>	63.8×10<sup>4</sup>	65.66×10<sup>4</sup>
3天	77.01×10<sup>4</sup>	107.49×10<sup>4</sup>	128.25×10<sup>4</sup>
				4天	123.51×10<sup>4</sup>	141.99×10<sup>4</sup>	321.99×10<sup>4</sup>
5天	275.5×10<sup>4</sup>	361×10<sup>4</sup>	548×10<sup>4</sup>
				6天	412.5×10<sup>4</sup>	541.7×10<sup>4</sup>	1107.5×10<sup>4</sup>
7天	1533.3×10<sup>4</sup>	1714.2×10<sup>4</sup>	3013.8×10<sup>4</sup>

结果表明：

(1)相比亲本NK92MI细胞，经白介素7和/或白介素21修饰后的NK92MI细胞(即表达第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的NK92MI细胞)的体外增殖活性提高。

(2)共表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞能够显著提高其体外增殖能力，明显高于NK92MI、NK92MI/IL7和NK92MI/IL21。

此外，观察结果还表明，在体外增殖实验中，白介素7和/或白介素21修饰后的NK92MI细胞，与亲本NK92MI细胞相比，在相同的体外培养条件和培养体积下可正常生长更多的细胞(高密度培养)，细胞团更多，细胞的生长状态更好。其中，尤其以被白介素7和白介素21双修饰后的NK92MI细胞的生长状态最好(即同时表达第一融合蛋白和第二融合蛋白的NK92MI细胞)。

与之相对，未经修饰的亲本NK92MI细胞，在正常生长状态下是抱团悬浮生长，但是密度不可过高。一旦密度过高，细胞团就会散开，细胞团散开后细胞状态会越来越差，并且不可恢复。而本发明经IL7和/或IL21修饰后的NK92MI细胞在相同培养体积下，细胞数目明显比亲本细胞更多，并且生长状态良好。因此，本发明经IL7和/或IL21修饰后的NK92MI细胞可进行高密度培养(与未修饰的NK92MI细胞相比，培养密度或数量提高了80％-120％)。

实施例3 PBMC细胞与NK92MI、NK92MI/IL7、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共培养后的表型分析

为了了解NK92MI、NK92MI/IL7、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞进入人体后对正常人的T细胞的活化是否有影响，本发明在体外进行了模拟试验。本发明提取了三个正常人的外周血，分别提取PBMC细胞，将提得的PBMC细胞计数分成5组(放于24孔板中培养，所用的培养基为RPMI1640)。第一组放1×10⁶个PBMC细胞，不做任何处理，作为流式分析的阴性对照；第二组放1×10⁶个PBMC细胞，添加IL2和2012细胞激活和扩增T细胞，作为流式分析的阳性对照；第三组放1×10⁶个PBMC细胞，再加入1×10⁵个NK92MI细胞共培养；第四组放1×10⁶个PBMC细胞，再加入1×10⁵个NK92MI/IL21细胞共培养；第五组放1×10⁶个PBMC细胞，再加入1×10⁵个NK92MI/IL7&21细胞共培养。分别在第0、3、7、10天做流式检测，测PBMC中T细胞的表型变化情况。本发明将每组在相同的条件下染上相应的抗体，检测的抗体分别是CD3、CD25、CD69、CD45RA、CCR7。本发明先用CD3抗体圈出CD3阳性的T细胞，再检测CD25，CD69，CD45RA，CCR7分子在不同时间和组别的表达情况。

从图3A中可以看出，当PBMC细胞在体外与NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共培养时，CD25分子的表达较阴性对照PBMC和共培养NK92MI细胞组都有显著的提高。特别是与NK92MI/IL7&21细胞共培养时，CD25分子的表达较阴性对照PBMC细胞组、共培养NK92MI细胞组和共培养NK92MI/IL21细胞组都有了明显的提高。CD25分子是活化T细胞标志分子之一。图3B-D为CD69、CCR7、CD45RA分子在与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共培养的第0、3、7、10天时的流式检测结果。此外，按照同样的实验方法研究NK92MI/IL7细胞对T细胞活化和增殖的影响。

同时，在实验过程中，可以明显观察到与NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共培养组的PBMC细胞较对照组有所增殖。并且NK92MI/IL7&21细胞共培养组的PBMC细胞较其他组有显著增殖，T细胞的数目明显高于阴性对照组、NK92MI细胞组和NK92MI/IL21细胞组。

结果表明：

(1)相比亲本NK92MI细胞，经IL7和/或IL21修饰后的NK92MI细胞对正常人PBMC中的T细胞的活化和增殖具有一定的刺激和促进作用。

(2)共表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞对正常人PBMC中的T细胞的活化和增殖具有特别显著的刺激和促进作用，并且刺激和促进作用明显高于NK92MI细胞、NK92MI/IL7细胞和NK92MI/IL21细胞。

实施例4 T细胞与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共存时的细胞毒性

为了了解当NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞进入体内后，体内的正常活化T细胞与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞相互之间有无细胞毒性以及当T细胞和NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞共存时，对肿瘤细胞的杀伤又会有如何的变化，本发明进行了以下杀伤试验。

首先将正常人活化后的T细胞设为效应细胞，将K562、NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞作为靶细胞进行杀伤，效靶比为1：1，杀伤时间为12小时。然后，又将正常人活化后的T细胞作为靶细胞，用NK92MI细胞作为效应细胞，效靶比为1：1，杀伤时间为12小时。接下来进行以下杀伤试验：将K562细胞设为靶细胞，T细胞与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞设为效应细胞。第一组设NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞为效应细胞，效靶比为1：1，杀伤时间为12小时；第二组设T细胞和NK92MI、NK92MI/IL21、NK92MI/IL7&21细胞共同作为效应细胞，效靶比为1：1，杀伤时间为12小时。

结果如图4所示。从杀伤的结果来看，正常人活化后的T细胞对K562、NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞均几乎无细胞毒性(图4A，图示中每组左边的柱子是细胞的自然死亡率，右边的柱子是指细胞的杀伤结果)。NK92MI/IL7&21细胞与T细胞共培养时，NK92MI/IL7&21细胞的死亡率与自然死亡率无统计学差异，与T细胞共培养时的死亡率相比自然死亡率略有降低。

NK92MI细胞对正常人活化后的T细胞几乎没有细胞毒性，表明正常人活化后的T细胞与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞它们相互之间几乎无细胞毒性(数据未示出)。

从图4B和图4C的杀伤结果可以看出，T细胞的存在并不影响NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞的细胞毒性。

综上所述，正常人活化后的T细胞与NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞相互之间几乎无细胞毒性；正常人活化后的T细胞的存在，也不会影响NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞的细胞毒性。

讨论

本研究通过基因工程技术将外源性的IL7和IL21构建到NK92MI细胞上，成功构建了高表达IL21分子的NK92MI/IL21细胞和同时高表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞。结果表明，NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞相对于亲本细胞NK92MI细胞，在体外增殖能力有所提高。特别是同时表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞，体外增殖能力有了明显的提高。体外杀伤试验表明，NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞与亲本细胞NK92MI细胞在体外对Jurkat和K562细胞的细胞毒性没有统计学差异。共表达IL7和IL21分子的NK92MI细胞对Jurkat的细胞毒性略高于NK92MI和NK92MI/IL21细胞对Jurkat的细胞毒性。

本发明探究了NK92MI、NK92MI/IL7、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞与正常人的外周血PBMC细胞共培养时，4种NK细胞对PBMC中的T细胞的作用是否有差异。本发明选取CD3，CD25，CD69，CD45RA，CCR7分子进行不同时间(分别时0、3、7、10天)的流式检测分析。实验结果表明，作为活化T细胞标志分子之一的CD25分子，从CD25分子的表型变化来看，NK92MI/IL7、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对正常人PBMC中的T细胞的活化有一定的刺激和促进作用。特别是同时表达IL7和IL21分子的NK92MI/IL7&21细胞对PBMC中的T细胞有特别显著的刺激活化作用。同时，在试验过程中发现，NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞也可刺激T细胞的增殖，T细胞的数目明显高于阴性对照组和NK92MI细胞组，且NK92MI/IL7&21细胞的刺激效果比NK92MI/IL7和NK92MI/IL21更显著。

为了了解NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞与正常人的活化T细胞之间有无细胞毒性，以及它们共存时对肿瘤细胞的细胞毒性是否会相互干扰，本发明进行了一系列的体外杀伤试验。实验结果表明，NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞与正常人的活化T细胞相互之间无细胞毒性；而且，活化T细胞的存在，不会影响NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞对K562细胞的细胞毒性。

综上所述，本发明构建的NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞相对于亲本细胞NK92MI细胞来说，在体外的增殖能力有所增强，尤其是NK92MI/IL7&21细胞的体外增殖能力有了明显提高；同时，NK92MI/IL7、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞在体外与正常人的PBMC细胞共培养时，能够在一定程度上刺激T细胞的增殖和活化，并且NK92MI/IL7&21细胞对T细胞增殖和活化的刺激更显著；此外，本发明发现NK92MI、NK92MI/IL21和NK92MI/IL7&21细胞与正常人的活化T细胞相互之间无细胞毒性，T细胞与它们共存时，也不会影响它们对肿瘤细胞的细胞毒性。经过本发明人为改造的NK92MI/IL7&21细胞在过继性细胞免疫治疗中具有极大的应用前景。

IL7和/或IL21修饰的NK92MI细胞在体外的增殖活性明显提高，尤其是NK92MI/IL7&21细胞，并且对外周血中的T细胞的活化有明显的刺激和促进作用；T细胞和NK92MI/IL7&21细胞之间无细胞毒性；同时，活化T细胞的存在，不影响NK92MI/IL7&21细胞的细胞毒性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> IL7和IL21修饰的NK92细胞、制备方法及其应用

<130> P2017-2324

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 3

<211> 155

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu

1 5 10 15

Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met

20 25 30

Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp

35 40 45

Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys

50 55 60

Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg

100 105 110

Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu

115 120 125

Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His

130 135 140

Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser

145 150 155

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 7

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu

20 25 30

Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly

35 40 45

Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu

65 70 75 80

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met

85 90 95

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn

100 105 110

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr

115 120 125

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser

145 150 155 160

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu

165 170 175

Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys

180 185 190

Glu His Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

195 200 205

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<210> 8

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr

20 25 30

Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg

35 40 45

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Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln

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His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Glu Ser Lys Tyr

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275 280 285

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

290 295 300

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

305 310 315 320

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

325 330 335

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

340 345 350

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

355 360 365

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

370 375 380

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

385 390 395 400

Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe

405 410 415

Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe

420

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tatgtttcac 60

gtcagcttta ggtatatctt cggcctgccc cccctcatcc tggtgctcct ccctgtggcc 120

agctccgatt gcgacattga gggcaaggac ggaaaacagt acgagagcgt cctcatggtg 180

tccatcgatc aactgctgga ctccatgaag gagattggca gcaactgcct caataacgag 240

ttcaacttct ttaagaggca catctgcgac gctaacaaag agggcatgtt tctcttcagg 300

gccgccagaa agctgagaca gttcctgaag atgaactcca ccggcgattt cgacctgcac 360

ctgctcaagg tcagcgaggg aaccacaatt ctgctgaact gcaccggaca ggtgaagggc 420

agaaagcctg ccgctctcgg agaggcccaa cccacaaaat ccctggaaga gaacaagagc 480

ctgaaggagc aaaagaagct gaacgacctc tgcttcctga aaaggctgct ccaggagatc 540

aagacctgct ggaacaagat cctgatgggc accaaggagc acgagtccaa atatggtccc 600

ccatgcccac cttgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 660

ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 720

gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 780

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 840

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 900

aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 960

gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1020

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1080

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1140

ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1200

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1260

ctgggtaaaa tggccctgat tgtgctgggg ggcgtcgccg gcctcctgct tttcattggg 1320

ctaggcatct tcttctga 1338

<210> 10

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tatggagagg 60

attgtcatct gtctgatggt catcttcttg gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa 120

ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt caacttatag atattgttga tcagctgaaa 180

aattatgtga atgacttggt ccctgaattt ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac 240

tgtgagtggt cagctttttc ctgctttcag aaggcccaac taaagtcagc aaatacagga 300

aacaatgaaa ggataatcaa tgtatcaatt aaaaagctga agaggaaacc accttccaca 360

aatgcaggga gaagacagaa acacagacta acatgccctt catgtgattc ttatgagaaa 420

aaaccaccca aagaattcct agaaagattc aaatcacttc tccaaaagat gattcatcag 480

catctgtcct ctagaacaca cggaagtgaa gattccgagt ccaaatatgg tcccccatgc 540

ccaccttgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 600

cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 660

agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 720

gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 780

accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 840

ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 900

caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 960

tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1020

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1080

tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 1140

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 1200

aaaatggccc tgattgtgct ggggggcgtc gccggcctcc tgcttttcat tgggctaggc 1260

atcttcttct ga 1272

Claims

1.一种工程化的NK细胞，其特征在于，所述的NK细胞具有以下特征：

(1) 含有外源的第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒用于表达包含IL7的第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达包含IL21的第二融合蛋白；和

(2) 所述第一融合蛋白和第二融合蛋白定位于所述NK细胞的细胞膜上，并且所述第一融合蛋白的IL7区段和第二融合蛋白的IL21区段暴露在细胞膜外；

并且，所述NK细胞是NK92细胞或NK92MI细胞。

2.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第一融合蛋白的结构如下式I所示：

L1-I1-H1-F1-TM1-C1 (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键

L1为无或信号肽序列；

I1为IL7；

H1为任选的铰链区；

F1为任选的Fc段；

TM1为跨膜结构域；

C1为无或胞内结构域。

3.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第二融合蛋白的结构如下式II所示：

L2-I2-H2-F2-TM2-C2 (II)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键

L2为无或信号肽序列；

I2为IL21；

H2为任选的铰链区；

F2为任选的Fc段；

TM2为跨膜结构域；

C2为无或胞内结构域。

4.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述信号肽为选自下组的蛋白的信号肽：GM-CSF、CD4、CD8、或其组合。

5.如权利要求2所述的NK细胞，其特征在于，所述IL7的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 2所示。

6.如权利要求3所述的NK细胞，其特征在于，所述IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 3所示。

7.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述铰链区为选自下组的蛋白的铰链区：IgG4、CD8、CD28、或其组合。

8.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO.: 4所示。

9.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列还包括如SEQID NO.: 4所示的序列，并且SEQ ID NO.: 4中第10位的脯氨酸(P)替换为丝氨酸(S)。

10.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述Fc段的氨基酸序列如SEQ IDNO.: 5所示。

11.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述跨膜结构域为选自下组的蛋白的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、或其组合。

12.如权利要求2或3所述的NK细胞，其特征在于，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQID NO.: 6所示。

13.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.: 7所示。

14.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.: 8所示。

15.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第一融合蛋白的核酸编码序列如SEQID NO.: 9所示。

16.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述第二融合蛋白的核酸编码序列如SEQID NO.: 10所示。

17.如权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于载体上或整合在所述工程化的NK细胞的染色体中。

18.一种制备权利要求1所述的工程化的NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A) 提供一待改造的NK细胞；和

(B) 将第一表达盒和第二表达盒导入到所述待改造的NK细胞，其中所述第一表达盒用于表达第一融合蛋白，所述第二表达盒用于表达第二融合蛋白，从而获得权利要求1所述的工程化的NK细胞；

并且，所述NK细胞是NK92细胞或NK92MI细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在步骤(B)中，包括(B1) 将表达所述第一融合蛋白的第一表达盒导入所述NK细胞；和(B2) 将表达所述第二融合蛋白的第二表达盒导入所述NK细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

20.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的NK细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

21.如权利要求1所述的工程化的NK细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。