BRPI0412138B1 - método de selecionar um anticorpo monoclonal, método de selecionar um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação em antígeno, método de detectar a presença de células nk, e, método de purificar de uma amostra células nk - Google Patents

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BRPI0412138-4A
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Allessandro Moretta
Mariella Della Chiesa
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Innate Pharma
Universita Di Genova
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Abstract

ANTICORPO, HIBRIDOMA, MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS DE POTENCIALIZAR A ATIVIDADE DE CÉLULA, DE DETECTAR A PRESENÇA DE CÉLULAS NK E DE PURIFICAR DE UMA AMOSTRA CÉLULAS NK, E, COMPOSIÇÃO A presente invenção refere-se às composições novas e aos métodos novos para regular uma resposta imune em um indivíduo. Mais particularmente, a invenção refere-se aos anticorpos específicos que regulam a atividade de células NK e permitem a potenciali-zação de citotoxicidade de célula NK em indivíduos mamíferos. A invenção também se refere aos fragmentos e aos derivados de tais anticorpos, bem como às composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e aos seus usos, particularmente em terapia, para aumentar a citotoxicidade ou atividade de célula NK em indivíduos.

Description

[0001] A presente invenção refere-se aos anticorpos, aos fragmentos de anticorpo, e aos seus derivados que reagem cruzadamente com dois ou mais receptores inibitórios presentes sobre a superfície celular de células NK e potencializam a citotoxicidade de célula NK em indivíduos mamíferos ou em uma amostra biológica. A invenção também se refere aos métodos de preparar tais anticorpos, fragmentos, variantes, e derivados; às composições farmacêuticas compreendendo os mesmos; e ao uso de tais moléculas e composições, particularmente em terapia, para aumentar a atividade ou a citotoxicidade de célula NK em indivíduos.
FUNDAMENTOS
[0002] Células matadoras naturais (NK) são uma subpopulação de linfócitos, envolvidos em imunidade não convencional. Células NK podem ser obtidas por várias técnicas conhecidas na arte, tais como de amostras sanguíneas, citaferese, coleções, etc.
[0003] Características e propriedades biológicas de células NK incluem a expressão de antígenos de superfície incluindo CD16, CD56, e/ou CD57; a ausência de complexo TCR alfa/beta ou gama/delta sobre a superfície celular; a capacidade de se ligar em e de destruir células que falham em expressar "auto"-antígenos MHC/HLA pela ativação de enzimas citolíticas específicas; a capacidade de destruir células tumorais ou outras células doentias que expressam um ligante de receptor ativador de NK; a capacidade de liberar citocinas que estimulam ou inibem a resposta imune; e a capacidade de sofrer rodadas múltiplas de divisão celular e de produzir células filhas com propriedades biológicas semelhantes às da célula parental. Dentro do contexto desta invenção "ativar" células NK designa ativar biologicamente células NK, mais particularmente células NK possuindo a capacidade de lisar células alvo. Por exemplo, uma célula NK "ativa" é capaz de destruir células que expressam um ligante de receptor ativador de NK e falham em expressar "auto"-antígenos MHC/HLA (células incompatíveis com KIR).
[0004] Baseado em suas propriedades biológicas, estratégias de vacina e terapêuticas têm sido propostas na arte que se baseiam em uma modulação de células NK. Contudo, a atividade de célula NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve sinais tanto estimulantes quanto inibitórios. Consequentemente, a terapia mediada por célula NK pode requerer tanto uma estimulação destas células quanto uma neutralização de sinais inibitórios.
[0005] Células NK são negativamente reguladas por receptores inibitórios específicos de classe I de complexo de histocompatibilidade maior (MHC) (Karre et al.; Ohlén et al., 1989). Estes receptores específicos se ligam em determinantes polimórficos de moléculas de classe I de MHC ou HLA presentes sobre outras células e inibem a lise de célula NK. Em humanos, certos membros de uma família de receptores chamados de receptores matadores Ig-semelhantes (KIRs) reconhecem grupos de alelos de classe I de HLA.
[0006] KIRs são uma família grande de receptores presentes sobre certos subconjuntos de linfócitos, incluindo células NK. A nomenclatura para KIRs baseia-se no número de domínios extracelulares (KIR2D ou KIR3D) e seja a causa citoplásmica quer longa (KIR2DL ou KIR3DL) quer curta (KIR2DS ou KIR3DS). Dentro de humanos, a presença ou ausência de um dado KIR é variável de uma célula NK para outra dentro da população NK presente em um único indivíduo. Certos produtos de gene de KIR causam estimulação de atividade de linfócito quando ligados em um ligante apropriado. Todos os KIRs estimulantes confirmados possuem uma cauda citoplásmica curta com um resíduo de transmembrana modificado que se associa com uma molécula adaptadora possuindo um motivo imunoestimulante (ITAM). Outros produtos de gene de KIR são de natureza inibitória. Todos os KIRs inibitórios confirmados possuem uma cauda citoplásmica longa e parecem interagir com subconjuntos diferentes de antígenos HLA dependendo do subtipo de KIR. KIRs inibitórios mostram em sua porção intracitoplásmica um ou mais motivos inibitórios que recrutam fosfatases. Os receptores KIR inibitórios conhecidos incluem membros de subfamílias KIR2DL e KIR3DL. Receptores KIR possuindo dois domínios de Ig (KIR2D) identificam alótipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente chamado de p58.2) ou o produto de gene proximamente relacionado KIR2DL3 reconhece um epítopo compartilhado pelo grupo de alótipos HLA-C 2 (Cw1, 3, 7, e 8), enquanto que KIR2DL1 (p58.1) reconhece um epítopo compartilhado pelo grupo recíproco de alótipos HLA-C 1 (Cw2, 4, 5, e 6). O reconhecimento por KIR2DL é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 de alelos HLA-C.
[0007] Reconhecimento de KIR2DL2 e KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. O importante é que a grande maioria de alelos HAL-C possui um resíduo quer de Asn quer de Lys na posição 80. Um KIR com três domínios de Ig, KIR3DL1 (p70), reconhece um epítopo compartilhado pelos alelos HLA-Bw4. Finalmente, um homodímero de moléculas com três domínios de Ig KIR3DL2 (p140) reconhece HLA-A3 e -A11.
[0008] Embora KIRs inibitórios e outros receptores inibitórios de classe I (Moretta et al., 1977; Valiante et al., 1997a; Lanier, 1988) possam ser co-expressados por células NK, em qualquer dado repertório de NK de indivíduo há células que expressam um KIR único e portanto, as células NK correspondentes são bloqueadas apenas por células expressando um grupo de alelos de classe I específica.
[0009] Tem sido mostrado que população de células NK ou clones que são KIR mal combinados, i.e., população de células NK que expressam KIR que não são compatíveis com uma moléculas HLA de um hospedeiro, são mais provavelmente mediadores do efeito de anti-leucemia de enxerto visto em transplante alogênico (Ruggeri et al., 2002). Um modo de reproduzir este efeito em um dado indivíduo seria o uso de reagentes que bloqueiam a interação de KIR/HLA.
[0010] Tem sido mostrado que anticorpos monoclonais específicos para KIR2DL1 bloqueiam a interação de KIR2DL1 com alelos Cw4 (ou semelhante) (Moretta et al., 1993). Também tem sido descrito que anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 bloqueiam a interação de KIR2DL2/3 com alelos HLACw3 (ou semelhante) (Moretta et al., 1993). Contudo, o uso de tais reagentes em situações clínicas requereria o desenvolvimento de dois mAbs terapêuticos para tratar todos os pacientes, independente de se qualquer dado paciente estava expressando alelos HLA-C de classe 1 ou de classe 2. Ainda mais, ter-se-ia que predeterminar qual tipo de HLA cada paciente estaria expressando antes de se decidir qual anticorpo terapêutico se usaria, resultando assim em custo de tratamento muito maior.
[0011] Watzl et al., Tissue Antigens, 56, p. 240 (2000) produziram anticorpos de reação cruzada reconhecedores de múltiplos isótipos de KIRs, mas aqueles anticorpos não exibiram potencialização de atividade de célula NK. G. M. Spaggiara et al., Blood, 100, pp. 4098-4107 (2002) realizaram experimentos utilizando numerosos anticorpos monoclonais contra vários KIRs. Foi citado que um daqueles anticorpos, NKVSF1, reconhece um epítopo comum de CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) e p50.3 (KIR2DS4). Não é sugerido que NKVSF1 pode potencializar a atividade de célula NK e não há sugestão de que poderia ser usado como um agente terapêutico. Consequentemente, abordagens práticas e efetivas na modulação de atividade de célula NK não têm sido tornadas disponíveis até agora na arte e ainda requerem intervenção específica para alelo de HLA usando reagente específicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção agora proporciona anticorpos novos, composições novas, e métodos novos que suplantam as dificuldades correntes em ativação de célula NK e proporcionam benefícios e características vantajosas adicionais. Em um aspecto exemplar, a invenção proporciona um único anticorpo que facilita a ativação de células NK de humano em virtualmente todos os humanos. Mais particularmente, a invenção proporciona anticorpos específicos novos que reagem cruzadamente com vários grupos de KIR inibitório e neutralizam seus sinais inibitórios, resultando em potencialização de citotoxicidade de célula NK expressando tais receptores KIR inibitórios. Esta capacidade de reagir cruzadamente com múltiplos produtos de gene de KIR permite que os anticorpos da invenção sejam efetivamente usados para aumentar a atividade de célula NK na maioria de indivíduos humanos, sem a carga ou o custo da predeterminação do tipo de HLA do indivíduo.
[0013] Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de qualquer um dos mesmos, na qual o citado anticorpo, fragmento ou derivado reage cruzadamente com pelo menos dois receptores KIR inibitórios na superfície de células NK, neutraliza os sinais inibitórios das células NK, e potencializa a atividade de células NK. Mais preferivelmente, o anticorpo se liga em um determinante comum de receptores KIR2DL de humano. Ainda mais especificamente, o anticorpo da invenção se liga em pelo menos nos receptores KIR2D1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Para os propósitos desta invenção, o termo KIR2DL2/3" refere-se a qualquer um ou a ambos os receptores KIR2DL2 e KIR2DL3. Estes dois receptores possuem uma homologia muito alta, são presumivelmente formas alélicas do mesmo gene, e são considerados pela arte como sendo intercambiáveis. Consequentemente, KIR2DL2/3 é considerado uma molécula KIR inibitória única para os propósitos desta invenção e portanto um anticorpo que reage cruzadamente com apenas KIR2DL2 e KIR2DL3 e não outros receptores KIR não está dentro do escopo desta invenção.
[0014] O anticorpo desta invenção inibe especificamente a ligação de moléculas MHC ou HLA em pelo menos dois receptores KIR inibitórios e facilita a atividade de célula NK. Ambas as atividades são inferidas pelo termo "neutralizam a atividade inibitória de KIR", como aqui usado. A capacidade dos anticorpos desta invenção de "facilitar a atividade de célula NK", "facilitar a citotoxicidade de célula NK", de "facilitar célula NK", "potencializar a atividade de célula NK", ou "potencializar célula NK" no contexto desta invenção significa que o anticorpo permite que as células NK expressando um receptor KIR inibitório sobre sua superfície seja capaz de lisar as células que expressam sobre sua superfície um ligante correspondente para aquele receptor KIT inibitório específico (por exemplo, um antígeno HLA). Em um aspecto particular, a invenção proporciona um anticorpo que especificamente inibe a ligação de moléculas JLA-C em receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em outro aspecto particular, a invenção proporciona um anticorpo que facilita a atividade de célula NK in vivo.
[0015] Devido ao fato de pelo menos um KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 estar presente em pelo menos 90% da população humana, os anticorpos mais preferidos desta invenção são capazes de facilitar a atividade de célula NK contra a maioria das células associadas ao alótipo HLA-C, respectivamente alótipos HLA-C de grupo 2 e alótipos HLA-C de grupo 1. Assim, as composições desta invenção podem ser usadas para efetivamente ativar ou potencializar as células NK em indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90% dos indivíduos humanos ou mais. Consequentemente, uma composição de único anticorpo de acordo com a invenção pode ser usada para tratar a maioria dos indivíduos humanos, e há rara necessidade de determinar os grupos alélicos ou de usar coquetéis de anticorpo.
[0016] A invenção demonstra, pela primeira vez, que anticorpos cruzadamente reativos e neutralizadores contra KIRs inibitórios podem ser gerados, e que tais anticorpos permitem a ativação efetiva de células NK em uma ampla variedade de grupos humanos.
[0017] Um objetivo específico desta invenção portanto reside em um anticorpo, no qual o citado anticorpo se liga especificamente em ambos os receptores de humano KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e reverte a inibição da citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIRs. Em uma modalidade, o anticorpo compete com anticorpo monoclonal DF200 produzido por hibridoma DF200. Opcionalmente o citado anticorpo que compete com o anticorpo DF200 não é o próprio anticorpo DF200.
[0018] Em outra modalidade, o anticorpo compete com anticorpo monoclonal NKVSF1, opcionalmente no qual o anticorpo que compete com o anticorpo NKVSF1 não é o anticorpo NKVSF1.
[0019] Em outra modalidade, o anticorpo compete com o anticorpo 1-7F9.
[0020] Preferivelmente os citados anticorpos não anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, ou anticorpos de humano.
[0021] O termo "compete com" quando se refere a um anticorpo monoclonal específico (por exemplo DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183) significa que um anticorpo compete com o anticorpo monoclonal (por exemplo, DF200, NKVSF1, 1- 7F9, EB6, GL183) em um ensaio de ligação usando quer moléculas de KIR recombinantes quer moléculas de KIR expressadas em superfície. Por exemplo, se um anticorpo reduz a ligação de DF200 em uma molécula de KIR em um ensaio de ligação, o anticorpo "compete" com DF200. Um anticorpo quantidade efetiva "compete" com DF200 pode competir com DF200 pela ligação em receptor humano KIR2DL1, em receptor humano KIR2DL2/3, ou em ambos os receptores humanos KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0022] Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um anticorpo que se liga em ambos os receptores humanos KIR2DL1 e KIR2DL2/3, reverte a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIRs, e compete com DF200, 1- 7F9, ou NKVSF1 pela ligação em receptor humano KIR2DL1, em receptor humano KIR2DL2/3, ou em ambos os receptores humanos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o citado anticorpo não é NKVSF1. Opcionalmente, o citado anticorpo é um anticorpo quimérico, humano, ou humanizado.
[0023] Em outra modalidade, a invenção proporciona um anticorpo que se liga em ambos os receptores humanos KIR2DL1 e KIR2DL2/3, reverte a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIRs, e compete com EB6 pela ligação em receptor humano KIR2DL1, compete com GL183 pela ligação no receptor humano KIR2DL2/3, ou compete tanto com EB6 pela ligação no receptor humano KIR2DL1 quanto com GL183 pela ligação no receptor humano KIR2DL2/3. Opcionalmente, o citado anticorpo não é NKVSF1; opcionalmente o citado anticorpo não é DF200. Opcionalmente, o citado anticorpo é um anticorpo quimérico, humano, ou humanizado.
[0024] Em um aspecto vantajoso, a invenção proporciona um anticorpo que compete com DF200 e reconhece, se liga em, ou possui imunoespecificidade para epítopo ou "sítio epitópico" sobre uma molécula de KIR substancial ou essencialmente igual, ou igual, ao do anticorpo monoclonal DF200. Preferivelmente, a citada molécula de KIR é um receptor humano KIR2DL1 ou um receptor humano KIR2DL2/3.
[0025] Um objetivo específico desta invenção reside em um anticorpo, no qual o citado anticorpo se liga em um determinante comum presente em ambos os receptores humanos KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 e reverte a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por estes KIRs. O anticorpo mais especificamente se liga substancialmente no mesmo epítopo sobre KIRs como anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 ou anticorpo NKVSF1 produzido pelo hibridoma NKVSF1, no qual o anticorpo não é NKVSF1.
[0026] Em uma modalidade preferida, o anticorpo desta invenção é um anticorpo monoclonal. O anticorpo mais preferido desta invenção é anticorpo monoclonal DF200 produzido por hibridoma DF200.
[0027] O hibridoma produtor de anticorpo DF200 tem sido depositado na coleção de cultura CNCM, como Número de Identificação "DF200", Número de Registro CNCM I-3224, registrado aos 10 de junho de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, França. O anticorpo NKVSF1 está disponível na Serotec (Cergy Sainte- Christophe, França), Número de Referência de Catálogo MCA2243. NKVSF1 também é aqui referido como pan2D mAB.
[0028] A invenção também proporciona fragmentos e derivados funcionais dos anticorpos aqui descritos, possuindo atividade e especificidade para antígeno substancialmente semelhantes (por exemplo, que podem reagir cruzadamente com anticorpo parental e que potencializam a atividade citotóxica de células NK expressando receptores KIR inibitórios), incluindo, sem limitação, um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma imunoadesina, um diacorpo, uma CDR, e uma ScFv. Ainda mais, os anticorpos desta invenção podem se humanizados, humanos, ou quiméricos.
[0029] A invenção também proporciona derivados de anticorpo compreendendo um anticorpo da invenção conjugado ou covalentemente ligado em uma toxina, um radionuclídeo, um grupo detectável (por exemplo, um flúor), ou um suporte sólido.
[0030] A invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo como descrito acima, um seu fragmento, ou um derivado de qualquer um dos mesmos. Consequentemente, a invenção também se refere ao uso de um anticorpo como aqui descrito em um método para a manufatura de um medicamento. Em modalidades preferidas, o citado medicamento ou composição farmaceuticamente aceitável é para o tratamento de um câncer ou de outro distúrbio proliferativo, uma infecção, ou para uso em transplante.
[0031] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma composição compreendendo um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK sobre células NK expressando pelo menos um dos citados dois receptores KIR inibitórios humanos diferentes, no qual o citado anticorpo é incorporado em um lipossomo. Opcionalmente a citada composição compreende uma substância adicional selecionada de uma molécula de ácido nucleico para a liberação de genes para terapia genética; uma molécula de ácido nucleico para a liberação de RNA de anti-senso, RNAi, ou siRNA para suprimir um gene em uma célula NK; ou uma toxina ou uma droga para destruição selecionada de células NK adicionalmente incorporada no citado lipossomo.
[0032] A invenção também proporciona métodos de regular a atividade de célula NK de humano in vitro, ex vivo, ou in vivo, compreendendo contatar as células NK de humano com uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, um fragmento de um tal anticorpo, um derivado de qualquer um dos mesmos, ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um de qualquer um dos mesmos. Métodos preferidos compreendem a administração de uma quantidade efetiva de composições farmacêuticas desta invenção e são direcionadas para aumentar a atividade citotóxica de células NK de humano, mais preferivelmente ex vivo ou in vivo, em um indivíduo possuindo um câncer, uma doença infecciosa, ou uma doença imune.
[0033] Em outros aspectos, a invenção proporciona um hibridoma compreendendo: (a) uma célula B de um hospedeiro mamífero (tipicamente um hospedeiro mamífero não-humano) que tem sido imunizado com um antígeno que compreende um epítopo presente sobre um polipeptídeo KIR inibitório, fusionado em (b) uma célula imortalizada (por exemplo, uma célula de mieloma), no qual a o citado hibridoma produz um anticorpo monoclonal que se liga em pelo menos dois receptores KIR inibitórios humanos diferentes e é capaz de pelo menos substancialmente neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando os citados pelo menos dois receptores KIR inibitórios humanos diferentes. Opcionalmente, o citado hibridoma não produz anticorpo monoclonal NKVSF1. Preferivelmente o citado anticorpo se liga em receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente o citado anticorpo se liga em um determinante comum presente sobre KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente o citado hibridoma produz um anticorpo que inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA- c possuindo um resíduo de Lys na posição 80 em um receptor KIR2DL1 de humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Asn na posição 80 em receptores KIR2DL2/3. Preferivelmente o citado hibridoma produz um anticorpo que se liga substancialmente em epítopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 sobre qualquer um de KID2DL1 ou DIR2DL2/3 ou em ambos KID2DL1 e DIR2DL2/3. Um exemplo de um tal hibridoma é DF200.
[0034] A invenção também proporciona métodos de produzir um anticorpo que reage cruzadamente com múltiplos produtos de gene KIR2DL e que neutraliza a atividade inibitória de tais KIRs, o citado método compreendendo as etapas de: (a) imunizar um mamífero não-humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR2DL; (b) preparar anticorpos do citado mamífero imunizado, no qual os citados anticorpos se ligam em citado polipeptídeo KIR2DL; (c) selecionar anticorpos de (b) que reagem cruzadamente com pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR2DL; e (d) selecionar anticorpos de (c) que potencializam células NK. Em uma modalidade, o citado mamífero não-humano é um animal transgênico engenhado para expressar um repertório de anticorpos de humano (por exemplo, um mamífero não- humano compreendendo loci de imunoglobulina e deleções de gene de imunoglobulina nativa, tal como XenomouseTM (Abgenix - Fremont, CA, USA) ou mamífero não-humano compreendendo um minilocus de genes codificadores de Ig humana, tal como o HuMab-mouseTM (Medarex - Princeton, NJ, USA)). Opcionalmente, o método compreende adicionalmente selecionar um anticorpo que se liga em um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, uma célula NK ou um polipeptídeo KIR. Opcionalmente, a invenção compreende adicionalmente um método de avaliar um anticorpo, no qual um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, preferivelmente no qual o macaco é observado para a presença ou a ausência de uma indicação de citotoxicidade do anticorpo.
[0035] Os inventores também proporcionam um método de produzir um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando os citados pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório humano, o citado método compreendendo as etapas de: (a) imunizar um mamífero não-humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR inibitório; (b) preparar anticorpos do citado mamífero imunizado, no qual os citados anticorpos se ligam em citado polipeptídeo KIR; (c) selecionar anticorpos de (b) que reagem cruzadamente com pelo menos dois produtos de gene de receptor KIR inibitório humano; e (d) selecionar anticorpos de (c) que neutralizam a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando os citados pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório humano, no qual a ordem das etapas (c) e (d) é opcionalmente invertida e qualquer número de etapas é opcionalmente repetido 1 ou mais vezes. Preferivelmente, o polipeptídeo KIR inibitório usado para imunização é um polipeptídeo KIR2DL e os anticorpos selecionados na etapa (c) reagem cruzadamente com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente o citado anticorpo reconhece um determinante comum presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR; mais preferivelmente os citados KIR são KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o citado método compreende adicionalmente selecionar um anticorpo que se liga em um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, uma célula NK ou um polipeptídeo KIR. Opcionalmente, a invenção compreende adicionalmente um método de avaliar um anticorpo, no qual um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, preferivelmente no qual o macaco é observado para a presença ou a ausência de uma indicação de citotoxicidade do anticorpo.
[0036] Opcionalmente, nos métodos descritos acima, o anticorpo selecionada na etapa c) ou d) não é NKVSF1. Preferivelmente, o anticorpo preparado na etapa (b) nos métodos acima é um anticorpo monoclonal. Preferivelmente o anticorpo selecionado na etapa (c) nos métodos acima inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Lys na posição 80 em um receptor KIR2DL1 de humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Asn na posição 80 em um receptor KIR2DL2/3 de humano. Preferivelmente, os anticorpos selecionados em (d) nos métodos acima causam uma potencialização na citotoxicidade de NK, por exemplo qualquer potencialização substancial, ou potencialização de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou maior na citotoxicidade de NK, por exemplo potencialização de pelo menos cerca de 50% de citotoxicidade de NK alvo (por exemplo, potencialização de pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% (tal como, por exemplo cerca de 65-100%) de citotoxicidade de célula NK). Preferivelmente, o anticorpo se liga substancialmente em epítopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 sobre KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Opcionalmente os citados métodos também ou alternativamente compreendem a etapa adicional de preparar fragmentos dos anticorpos monoclonais selecionados, preparar derivados dos anticorpos monoclonais selecionados (por exemplo, por conjugação com um radionuclídeo, agente citotóxico, molécula repórter, ou semelhante), ou preparar derivados de fragmentos de anticorpo produzidos das ou que compreendem as sequências que correspondem às sequências de tais anticorpos monoclonais.
[0037] A invenção proporciona adicionalmente um método para produzir um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando pelo menos um dos citados dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, o citado método compreendendo as etapas de: (a) selecionar de uma biblioteca ou de um repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo que reage cruzadamente com pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR2DL inibitório humano, e (b) selecionar um anticorpo de (a) que é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando pelo menos um dos citados dois receptores KIR2DL inibitórios humanos diferentes. Preferivelmente o anticorpo se liga em um determinante comum presente sobre KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o citado anticorpo selecionado na etapa (b) não é NKVSF1. Preferivelmente, o anticorpo selecionado na etapa (b) inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-c possuindo um resíduo de Lys na posição 80 em um receptor KIR2DL1 de humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Asn na posição 80 em um receptor KIR2DL2/3 de humano. Preferivelmente, o anticorpo selecionado na etapa (b) causa uma potencialização na citotoxicidade de NK, por exemplo qualquer potencialização substancial, ou potencialização de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou maior na citotoxicidade de NK, por exemplo potencialização de pelo menos cerca de 50% de citotoxicidade de NK alvo (por exemplo, potencialização de pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% (tal como, por exemplo cerca de 65100%) de citotoxicidade de célula NK). Preferivelmente, o anticorpo se liga substancialmente em epítopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 sobre KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Opcionalmente método compreende a etapa adicional de preparar fragmentos dos anticorpos monoclonais selecionados, preparar derivados dos anticorpos monoclonais selecionados, ou preparar derivados de fragmentos de anticorpo monoclonal selecionado.
[0038] Adicionalmente, a invenção proporciona um método para produzir um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando pelo menos um dos citados dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, o citado método compreendendo as etapas de: a) cultivar um hibridoma da invenção sob condições permissivas para a produção de citado anticorpo monoclonal; e b) separar o citado anticorpo monoclonal do citado hibridoma. Opcionalmente o método compreende a etapa adicional de preparar fragmentos de citado anticorpo monoclonal, preparar derivados de anticorpo monoclonal, ou preparar derivados de tais fragmentos de anticorpo monoclonal. Preferivelmente o anticorpo se liga em um determinante comum presente sobre KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0039] Também é proporcionado pela presente invenção um método de produzir um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando os citados pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, o citado método compreendendo as etapas de: a) isolar de um hibridoma da invenção um ácido nucleico codificador de citado anticorpo monoclonal; b) opcionalmente modificar o citado ácido nucleico de modo a obter um ácido nucleico modificado que compreende uma sequência que codifica um anticorpo modificado ou derivado compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma sequência funcional do anticorpo monoclonal ou é substancialmente semelhante à mesma (por exemplo, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% (tal como cerca de 70-99%) idêntica a uma tal sequência) selecionado de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um fragmento imunorreativo de um anticorpo ou uma proteína de fusão compreendendo um fragmento imunorreativo; c) inserir o citado ácido nucleico ou ácido nucleico modificado (ou ácido nucleico relacionado codificador de mesma sequência de aminoácidos) em um vetor de expressão, no qual o citado anticorpo ou fragmento de anticorpo codificado é capaz de ser expressado quando o citado vetor de expressão está presente em uma célula hospedeira crescendo sob condições apropriadas; d) transfectar uma célula hospedeira com o citado vetor de expressão, no qual a citada célula hospedeira não produz de outro modo proteína imunoglobulina; e) cultivar a citada célula hospedeira transfectada sob condições que causam a expressão de citado anticorpo ou fragmento de anticorpo; e f) isolar o anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido da citada célula hospedeira transfectada. Preferivelmente o anticorpo se liga em um determinante comum presente sobre KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0040] Será reconhecido que a invenção também proporciona uma composição compreendendo um anticorpo que se liga em pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando pelo menos um dos citados dois receptores KIR inibitórios humanos diferentes, o citado anticorpo estando presente em uma quantidade efetiva para detectavelmente potencializar a citotoxicidade de célula NK em um paciente ou em uma amostra biológica compreendendo células NK; e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente o anticorpo se liga em um determinante comum presente sobre KIR2DL1 e KIR2DL2/3. A citada composição pode opcionalmente adicionalmente compreender um segundo agente terapêutico selecionado de, por exemplo, um agente imunomodulatório, um agente hormonal, um agente quimioterápico, um agente anti-angiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga em e inibe um receptor KIR inibitório, um agente anti- infectivo, um agente alvejador, ou um composto adjunto. Agentes imunomodulatórios vantajosos podem ser selecionados de IL-1-alfa, IL-1-beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G- CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, ou IFN-gama. Exemplos de citados agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotere, vincristina, vimblastina, vinorelbina, etoposida (VP-16), 5-fluoro-uracila (5FU), citosina arabinosídeo, ciclo-fosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s), outros alquilóides de vinca e derivados ou pró- drogas dos mesmos. Exemplos de agentes hormonais incluem leuprorelina, gosorelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifeno, flutamida, nilutamida, ciproterona, biculatamida anastrozol, exemestano, letrozol, fadrozol medróxi, clormadinona, megestrol, outros antagonistas de LHRH, outros anti-estrógenos, outros anti-andrógenos, outros inibidores de aromatase, e outros progestágenos. Preferivelmente, o citado segundo anticorpo que se liga em e inibe um receptor KIR inibitório é um anticorpo ou um derivado ou fragmento do mesmo que se liga em um epítopo de um receptor KIR inibitório que difere do epítopo ligado pelo citado anticorpo que se liga em um determinante comum presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano.
[0041] A invenção proporciona adicionalmente um método de detectavelmente potencializar atividade de célula NK em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao citado paciente uma composição de acordo com a invenção. Um paciente em necessidade de potencialização de atividade de célula NK pode ser qualquer paciente possuindo uma doença ou um distúrbio no qual tal potencialização pode promover, intensificar, e/ou induzir um efeito terapêutico (ou promove, intensifica, e/ou induz um tal efeito em pelo menos uma proporção substancial de pacientes com a doença ou o distúrbio e características substancialmente semelhantes como as do paciente - como pode ser determinado por, por exemplo, testes clínicos). Um paciente em necessidade de tal tratamento pode sofrer de, por exemplo, câncer, outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune. Preferivelmente o citado método compreende a etapa adicional de administrar ao citado paciente um agente terapêutico adicional apropriado selecionado de um agente imunomodulatório, um agente hormonal, um agente quimioterápico, um agente anti-angiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga em e inibe um receptor KIR inibitório, um agente anti- infectivo, um agente alvejador, ou um composto adjunto no qual o citado agente terapêutico é administrado ao citado paciente como uma forma de dose única juntamente com o citado anticorpo, ou como forma de dosagem separada. A dosagem do anticorpo (ou do fragmento/derivado de anticorpo) e a dosagem do agente terapêutico adicional coletivamente são suficientes para detectavelmente induzir, promover, e/ou intensificar uma resposta terapêutica no paciente que compreende a potencialização de atividade de célula NK. Onde administrado separadamente, o anticorpo, fragmento, ou derivado e o agente terapêutico adicional são desejavelmente administrados sob condições (por exemplo, com respeito ao tempo, ao número de doses, etc.) que resultam em um benefício terapêutico combinado detectável para o paciente.
[0042] Adicionalmente incluídos na presente invenção são anticorpos da invenção que são capazes de especificamente se ligar em primata não-humano, preferivelmente macaco, células NK e/ou receptores KIR de macaco. Também são incluídos métodos para avaliar a toxicidade, a dosagem e/ou a atividade ou a eficácia dos anticorpos da invenção que são medicamentos candidatos. Em um aspecto, a invenção inclui um método para determinar uma dose de um anticorpo que é tóxico para um animal ou tecido alvo por administração de um anticorpo da invenção a um recipiente primata não-humano possuindo células NK, e avaliar quaisquer efeitos adversos ou deletérios ou tóxicos do agente sobre o animal, ou preferivelmente sobre um tecido alvo. Em outro aspecto, a invenção é um método para identificar um anticorpo que é tóxico para um animal ou tecido alvo por administração de um anticorpo da invenção a um recipiente primata não-humano possuindo células NK, e avaliar quaisquer efeitos adversos ou deletérios ou tóxicos do agente sobre o animal, ou preferivelmente sobre um tecido alvo. Em outro aspecto, a invenção é um método para identificar um anticorpo que é eficaz no tratamento de uma infecção, doença ou tumor pela administração de um anticorpo da invenção a um modelo de infecção, doença ou câncer em primata não-humano, e identificar o anticorpo que melhora a infecção, a doença ou o câncer, ou um seu sintoma. Preferivelmente o citado anticorpo da invenção é um anticorpo que (a) reage cruzadamente com pelo menos dois receptores KIR de humano inibitórios na superfície de células NK de humano, e (b) cruzadamente reagir com células NK ou um receptor KIR do primata não-humano.
[0043] Adicionalmente incluído na presente invenção é um método de detectar a presença de células NK possuindo um KIR inibitório sobre sua superfície celular em uma amostra biológica ou um organismo vivo, o citado método compreendendo as etapas de: a) contatar a citada amostra biológica ou organismo vivo com um anticorpo da invenção, no qual o citado anticorpo está conjugado ou covalentemente ligado em um grupo detectável; e b) detectar a presença de citado anticorpo na citada amostra biológica ou organismo vivo.
[0044] A invenção também proporciona um método de purificar de uma amostra células NK possuindo um KIR inibitório sobre sua superfície celular compreendendo as etapas de: a) contatar a citada amostra com um anticorpo da invenção sob condições que permitem que as citadas células NK possuindo KIR inibitório sobre sua superfície celular se liguem no citado anticorpo, no qual o citado anticorpo está conjugado ou covalentemente ligado em um suporte sólido (por exemplo, um glóbulo, uma matriz, etc.); e b) eluir as citadas células NK ligadas do citado anticorpo conjugado ou covalentemente ligado em um suporte sólido.
[0045] Em um outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreende a região variável de cadeia leve ou uma ou mais CDRs de região variável de cadeia leve de anticorpo DF200 ou de anticorpo Pan2D como ilustrado na Fig. 12. Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreende uma sequência que é elevadamente semelhante a toda ou essencialmente a toda a sequência de região variável de cadeia leve de DF200 ou Pan2D ou uma ou mais CDRs de região variável de cadeia leve de um ou ambos destes anticorpos.
[0046] Em um outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreende a região variável de cadeia pesada ou uma ou mais CDRs de região variável de cadeia leve de anticorpo DF200 ou de anticorpo Pan2D como ilustrado na Fig. 13. Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado de qualquer um dos mesmos, que compreende uma sequência que é elevadamente semelhante a toda ou essencialmente a toda a sequência de região variável de cadeia pesada de DF200.
[0047] Estes e outros aspectos e características vantajosos adicionais da invenção podem ser aqui adicionalmente descritos alhures.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0048] Figura 1 mostra ligação de anticorpo monoclonal DF200 em um determinante comum de vários receptores KIR2DL de humano.
[0049] Figura 2 mostra anticorpo monoclonal DF200 neutralizando a inibição mediada por KIR2DL de citotoxicidade de célula NK positiva para KIR2DL1 sobre cepas alvo positivas para Cw4.
[0050] Figura 3 mostra anticorpo monoclonal DF200, um fragmento Fab de DF200 e anticorpos monoclonais convencionais específicos para KIR2DL1 e KIR2DL2/3 neutralizando a inibição mediada por KIR2DL de citotoxicidade de célula NK positiva para KIR2DL1 sobre células alvo positivas para Cw4 e a inibição mediada por KIR2DL de citotoxicidade de célula NK positiva para KIR2DL2/3 sobre células alvo positivas para Cw3.
[0051] Figura 4 mostra a reconstituição de lise secular por clones NK de células alvo positivas para HLA Cw4 na presença de fragmentos F(ab')2 de anticorpos DF200 e EB6.
[0052] Figuras 5 e 6 mostram anticorpos monoclonais DF200, NKVSF1 (pan2D), anticorpos de humano 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1, e anticorpos convencionais específicos para KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 neutralizando a inibição mediada por KIR2DL de citotoxicidade de célula NK positiva para KIR2DL1 sobre células alvo positivas para Cw4 (células transfectadas com Cw4 na Figura 5 e células EBV na Figura 6).
[0053] Figura 7 mostra um mapa de epítopo mostrando resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos por análise de ressonância de plasmon de superfície (BIAcore®) com anticorpos anti-KIR para KIR2DL1, onde os círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação em KIR2DL1. Os resultados mostram que 1-7F9 é competitivo com EB6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 e DF200, sobre KIR2DL1. Anticorpo 1-4F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1, e 1-7B9. Anticorpo NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1, e EB6, mas não com 1-7F9, sobre KIR2DL1. DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1, e EB6, mas não com 1-7F9, sobre KIR2DL1.
[0054] Figura 8 mostra um mapa de epítopo mostrando resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos por BIAcore® com anticorpos anti-KIR para KIR2DL3, onde os círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação em KIR2DL3. Os resultados mostram que 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, gl183, e 1-7F9 ou KIR2DL3. 1-7F9 é com DF200, gl183, e 1-4F1, mas não com NKVSF1, sobre KIR2DL3. NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1, e GL183, mas não com 1-7F9, sobre KIR2DL3. DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1, e 1-7F9, mas não com GL183, sobre KIR2DL3.
[0055] Figura 9 mostra um mapa de epítopo mostrando resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos por BIAcore® com anticorpos anti-KIR para KIR2DS1, onde os círculos sobrepostos designam a sobreposição na ligação em KIR2DS1. Resultados mostram que anticorpo 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, e 1-7F9, sobre KIR2DS1. Anticorpo 1-7F9 é competitivo com 1-4F1, mas não é competitivo com DF200 e NKVSF1 sobre KIR2DS1. NKVSF1 compete com DF200 e 1-4F1, mas não com 1-7F9, sobre KIR2DS1. DF200 compete com NKVSF1 e 1-4F1, mas não com 1-7G9, sobre KIR2DS1.
[0056] Figura 10 mostra titulação de NKVSF1 (pan2D) mAb demonstrando ligação de mAb em células NK de cinomolgo. Células NK de cinomolgo (massa NK de dia 16) foram incubadas com quantidade diferente de Pan2D mAb seguido por anticorpos IgG (H+L) anti-camundongo fragmentos F(ab)'2 de cabra conjugados com PE. A percentagem de células positivas foi determinada com um controle isotípico (IgG1 de camundongo purificada). Amostras foram feitas em duplicata. Intensidade de fluorescência média = MFI.
[0057] Figura 12 proporciona um alinhamento comparativo das sequências de aminoácidos de regiões variáveis leves (DF200, SEQ ID NO:1; Pan2D, SEQ ID NO:2) e de CDRs de região variável leve de anticorpos DF200 (CDR-L1, SEQ ID NO:3; CDR- L2, SEQ ID NO:5; e CDR-L3, SEQ ID NO:7) e Pan2D mAb (CDR-L1, SEQ ID NO:4; CDR-L2, SEQ ID NO:6; e CDR-L3, SEQ ID NO:8).
[0058] Figura 13 proporciona a região de cadeia pesada de anticorpo DF200 (SEQ ID NO:9) e a região variável de cadeia pesada CDRs do anticorpo DF200 (CDR-H1, SEQ ID NO: 10; CDR-H2, SEQ ID NO:11; e CDR-H3, SEQ ID NO:12).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO ANTICORPOS
[0059] A presente invenção proporciona novos anticorpos e seus fragmentos ou derivados que se ligam em determinantes comuns de receptores KIR inibitórios humanos, preferivelmente um determinante presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene KIR2DL, e causam potencialização de células NK expressando pelo menos um daqueles receptores KIR. A invenção descreve, pela primeira vez, que podem ser produzidos anticorpos cruzadamente reativos e neutralizadores, o que representa um resultado surpreendente e abre uma nova avenida na direção de novas terapias efetivas baseadas em NK, particularmente em indivíduos humanos. Em uma modalidade preferida, o anticorpo não é anticorpo monoclonal NKVSF1.
[0060] Dentro do contexto desta invenção um "determinante comum" designa um determinante ou epítopo que é compartilhado por vários produtos de gene dos receptores KIR inibitórios humanos. Preferivelmente, o determinante comum é compartilhado por pelo menos dois membros do grupo de receptores KIR2DL. Mais preferivelmente, o determinante é compartilhado por pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Certos anticorpos desta invenção podem, em adição ao reconhecimento de múltiplos produtos de gene de KIR2DL, também reconhecem determinantes presentes sobre outros KIRs inibitórios, tais como produto de gene do grupo de receptores KIR3DL. O determinante ou epítopo pode representar um fragmento de peptídeo ou um epítopo conformacional compartilhado pelos citados membros. Em uma modalidade mais específica, o anticorpo desta invenção especificamente se liga em substancialmente o mesmo epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal DF200. Este determinante está presente sobre ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0061] Dentro do contexto desta invenção, o termo anticorpo que "se liga em" um determinante comum designa um anticorpo que se liga em citado determinante com especificidade e/ou afinidade.
[0062] O termo "anticorpo", como aqui usado, refere-se aos anticorpos monoclonais e policlonais, bem como aos fragmentos e derivados de citados anticorpos monoclonais e policlonais a não ser que seja enunciado de outro modo ou claramente contradito pelo contexto. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, anticorpos de comprimento total tipicamente são alocados em uma de cinco classes maiores: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Várias destas são adicionalmente divididas em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e semelhantes. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados de "alfa", "delta", "epsilon", "gama" e "mu", respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos empregados nesta invenção porque são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque são mais facilmente preparados em um ambiente de laboratório. Preferivelmente o anticorpo desta invenção é um anticorpo monoclonal. Devido ao fato de um dos objetivos da invenção ser o bloqueio da interação de um KIR inibitório e seu correspondente ligante HLA in vivo sem reduzir o número de células NK, os isótipos correspondendo aos receptores Fc que medeiam função efetora baixa, tal como IgG4, tipicamente são preferidos.
[0063] Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na arte. Tipicamente, são produzidos por imunização de um animal não-humano, preferivelmente um camundongo, com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR inibitório, preferivelmente um polipeptídeo KIR2DL, com maior preferência um polipeptídeo KIR2DL de humano. O poliolefina KIR inibitório pode compreender a sequência de comprimento total de um polipeptídeo KIR inibitório humano, ou um seu fragmento ou derivado, tipicamente um fragmento imunogênico, i.e., uma porção do polipeptídeo compreendendo um epítopo exposto sobre a superfície da célula expressando um receptor KIR inibitório. Tais fragmentos tipicamente contêm pelo menos cerca de 7 aminoácidos consecutivos da sequência de polipeptídeo madura, ainda com maior preferência pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos da mesma. Fragmentos tipicamente são essencialmente derivados de domínio extracelular do receptor. Ainda com maior preferência é um polipeptídeo KIR2DL de humano que inclui pelo menos um, com maior preferência ambos, os domínios de Ig extracelulares, do polipeptídeo KIRDL de comprimento total e é capaz de imitar pelo menos um epítopo conformacional presente em um receptor KIR2DL. Em outras modalidades, o citado polipeptídeo compreende pelo menos cerca de 8 aminoácidos consecutivos de um domínio de IgG extracelular de posições de aminoácido 1-224 do polipeptídeo KIR2DL1 (numeração de aminoácido de acordo com p site da Internet PROW descrevendo a família de genes KIR, http://www.ncbi.nlm.nig.gov/prow/guide/1326018082.htm).
[0064] Em uma modalidade mais preferida, o imunógeno compreende um polipeptídeo KIR2DL de humano de tipo selvagem em uma membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Em uma modalidade específica, o imunógeno compreende células NK intactas, particularmente células NK de humano intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas.
[0065] A etapa de imunizar um mamífero não-humano com um antígeno pode ser realizada em qualquer maneira bem conhecida na arte para estimular a produção de anticorpos em um camundongo (veja, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). O imunógeno é então suspenso ou dissolvido em um tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo. Métodos para determinar a quantidade de imunógeno, tipos ou tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte e não são limitantes em nenhuma maneira da presente invenção. Estes parâmetros podem ser diferentes para imunógenos diferentes, mas são facilmente elucidados.
[0066] Semelhantemente, a localização e a frequência de imunização suficiente para estimular a produção de anticorpos também são bem conhecidas na arte. Em um protocolo de imunização típico, os animais não-humanos são injetados intraperitonealmente com antígeno no dia 1 e novamente a cerca de uma semana mais tarde. Isto é seguido por injeções de recordação do antígeno à cerca do dia 20, opcionalmente com adjuvante tal como adjuvante de Freund incompleto. As injeções de recordação são realizadas intravenosamente e podem ser repetidas por vários dias consecutivos. Isto é seguido por uma injeção de reforço no dia 40, quer intravenosa quer intraperitonealmente, tipicamente sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B produtoras de anticorpo específico para antígeno após cerca de 40 dias. Outros protocolos também podem ser utilizados desde que resultem na produção de células B expressando um anticorpo direcionado para o antígeno usando em imunização.
[0067] Para a preparação de anticorpos policlonais, soro é obtido de um animal não-humano imunizado e os anticorpos presentes no mesmo são isolados por técnicas bem conhecidas. O soro pode ser purificado por afinidade usando qualquer um dos imunógenos descritos acima ligados em um suporte sólido de modo a obter anticorpos que reagem com os receptores KIR inibitórios.
[0068] Em uma modalidade alternativa, linfócitos de um animal não-humano não- imunizado são isolados, crescidos in vitro, e então expostos ao imunógeno em cultura de células. Os linfócitos são então colhidos e a etapa de fusão descrita abaixo é realizada.
[0069] Para anticorpos monoclonais, a etapa seguinte é o isolamento de esplenócitos do mamífero não-humano imunizado e a subsequente fusão daqueles esplenócitos com uma célula imortalizada com o objetivo de formar um hibridoma produtor de anticorpo. O isolamento de esplenócitos de um mamífero não-humano é bem conhecido na arte e tipicamente envolve a remoção do baço de um mamífero não-humano anestesiado, o seu corte em pedaços pequenos e a compressão dos esplenócitos da cápsula esplênica e através de uma malha de náilon de um filtro de células para dentro de um tampão apropriado de modo a produzir uma suspensão de células únicas. As células são lavadas, centrifugadas e ressuspensas em um tampão que lisa quaisquer células vermelhas do sangue. A solução é novamente centrifugada e os linfócitos restantes na pelota são finalmente ressuspensos em tampão fresco.
[0070] Uma vez isolados e presentes em suspensão de células únicas, os linfócitos podem ser fusionados em uma linhagem de células imortais. Esta é tipicamente uma linhagem de células de mieloma de camundongo, embora muitas outras linhagens de células imortais para formar hibridomas sejam conhecidas na arte. Linhagens de mieloma murino preferidas incluem, mas não são limitadas a, àquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis na Salk Institute Cell Division Center, San Diego, Calif. U.S.A., células X63, Ag865 e SP-2 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. A fusão é efetuada usando poli(etileno-glicol) ou semelhante. Os hibridomas resultantes são então crescidos em meio seletivo que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência de células de mieloma parentais, não-fusionadas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais forem faltantes da enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopectina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimentos de células deficientes em HGPRT.
[0071] Hibridomas são tipicamente crescidos sobre uma camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos são preferivelmente de múltiplas gerações do mamífero não-humano usado para isolar os esplenócitos e são tipicamente vacinados com adjuvante de Freund incompleto ou semelhante por vários dias antes do plaqueamento dos hibridomas. Métodos de fusão são descritos em Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic Press, 1986), cuja descrição é aqui incorporada como referência.
[0072] As células são permitidas crescer no meio de seleção por tempo suficiente para a formação de colônias e a produção de anticorpos. Isto é normalmente entre cerca de 7 dias e cerca de 44 dias. As colônias de hibridoma são então ensaiadas para a produção de anticorpos que reagem cruzadamente com múltiplos produtos de gene de receptor KIR inibitório. O ensaio é tipicamente um ensaio do tipo ELISA colorimétrico, embora possa ser empregado qualquer ensaio que possa ser adaptado às cavidades na quais os hibridomas estão crescendo. Outros ensaios incluem imunoprecipitação e radioimunoensaio. As cavidades positivas para a produção de anticorpo desejado são examinadas para determinar se uma ou mais colônias distintas estão presentes. Se mais do que uma colônia estiver presente, as células podem ser reclonadas e crescidas para garantir que apenas uma célula única ocasione a colônia produtora de anticorpo desejado. Cavidades positivas com uma única colônia parental são tipicamente reclonadas e reensaiadas para garantir que apenas um anticorpo monoclonal seja detectado e produzido. Anticorpos também podem ser produzidos pela seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como descrito por exemplo em Ward et al., Nature, 341 (1989), p. 544).
[0073] Os anticorpos desta invenção são capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK; particularmente a inibição mediada por receptores KIR2DL e mais particularmente pelo menos a inibição mediada por ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Estes anticorpos são então anticorpos "neutralizadores" ou "inibitórios", no sentido de que bloqueiam, pelo menos parcial e detectavelmente, a rota de sinalização inibitória mediada pelos receptores KIR quando interagem com moléculas MHC de classe I. Mais importante, esta atividade inibitória é mostrada com respeito a vários tipos de receptores KIR inibitórios, preferivelmente vários produtos de gene de receptor KIR2DL, e com maior preferência pelo menos ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 de modo que estes anticorpos podem ser usados em vários indivíduos com eficácia alta. Inibição de inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK pode ser avaliada por vários ensaios ou testes, tais como ensaios celulares ou de ligação.
[0074] Uma vez identificado o anticorpo que reage cruzadamente com múltiplos receptores KIR inibitórios, ele pode ser testado para sua capacidade de neutralizar o efeito inibitório daqueles receptores KIR em células NK intactas. Em uma variante específica, a atividade de neutralização pode ser ilustrada pela capacidade de o citado anticorpo reconstituir a lise por clones NK positivos para KIR2DL de alvos positivos para HLA-C. Em outra modalidade específica, a atividade de neutralização do anticorpo é definida pela capacidade do anticorpo de inibir a ligação de moléculas HLA-C em receptores KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou KIR2DL2 proximamente relacionados), adicionalmente preferivelmente como a capacidade do anticorpo para alterar: - a ligação de uma molécula HLA-C selecionada de Cw1, Cw3, Cw7, e Cw8 (ou de uma molécula HL-A possuindo uma resíduo de Asn na posição 80) em KIR2DL2/3; e - a ligação de uma molécula HLA-C selecionada de Cw2, Cw4, Cw5, e Cw6 (ou de uma molécula HL-A possuindo uma resíduo de Lys na posição 80) em KIR2DL1.
[0075] Em outra variante, a atividade inibitória de um anticorpo nesta invenção pode ser avaliada em um ensaio de citotoxicidade baseado em célula, como descrito nos Exemplos aqui proporcionados.
[0076] Em outra variante, a atividade inibitória de um anticorpo desta invenção pode ser avaliada em um ensaio de liberação de citocina, no qual células NK são incubadas com o anticorpo de teste e uma linhagem de célula alvo expressando um alelo de HLA-C reconhecido por uma molécula de KIR da população NK, para estimular a produção de citocina de célula NK (por exemplo produção de IFN-Y e/ou GM-CSF). Em um protocolo exemplar, a produção de IFN-Y de PBMC é avaliada por coração intracitoplásmica e de superfície celular e por análise por citometria de fluxo após cerca de 4 dias em cultura. Em resumo, Brefeldin A (Sigma Aldrich) pode ser adicionado em uma concentração final de cerca de 5 μ g/mL por pelo menos cerca de 4 horas de cultura. As células podem ser então incubadas com mAb anti-CD3 e anti- CD56 antes da permeabilização (IntraPrepTM; Beckman Coulter) e coração com PE- anti-IFN-Y ou PE-IgG1 (Pharmigen). A produção de GM-CSF e de IFN-Y de células NK ativadas policlonais pode ser medida em sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-Y: OptEIA set, Pharmigen).
[0077] Anticorpos desta invenção podem neutralizar parcial ou totalmente a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK. O termo "neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK", como aqui usado significa a capacidade para aumentar pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou mais (por exemplo cerca de 25-100%) de lise específica obtida na mesma razão com células NK ou linhagens de célula NK que não estão bloqueadas por seu KIR, medida por um teste clássico de citotoxicidade de liberação de cromo, comparado com o nível de lise específica obtida sem anticorpo quando uma população de células NK expressando um dado KIR é posta em contato uma célula alvo expressando a molécula cognata de MHC de classe I (reconhecida por KIR expressado sobre célula NK). Por exemplo, anticorpos preferidos desta invenção são capazes de induzir a lise de populações de célula alvo autóloga ou compatível com HLA ou combinada, i.e., populações de células que não seriam efetivamente lisadas por células NK na ausência de citado anticorpo. Consequentemente, os anticorpos desta invenção também podem ser definidos como facilitadores de atividade de célula NK in vivo.
[0078] Alternativamente, o termo "neutralizar a inibição mediada por KIR" significa que em um ensaio de cromo usando um clone ou transfectante de célula NK expressando um ou vários KIRs inibitórios e uma célula alvo expressando apenas um alelo de HLA que é reconhecido por um dos KIRs sobre a célula NK, o nível de citotoxicidade obtido com o anticorpo deve ser pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% (por exemplo, cerca de 25-100%), ou mais da citotoxicidade obtida com uma molécula bloqueadora anti-MHC de classe I, tal como anticorpo W6/32 anti-MHC de classe I.
[0079] Em uma modalidade específica, o anticorpo se liga substancialmente em epítopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 (produzido pelo hibridoma DF200). Tais anticorpos são aqui referidos como "anticorpos DF200-semelhantes". Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. "Anticorpos DF200-semelhantes" mais preferidos desta invenção são anticorpos diferentes do anticorpo monoclonal NKVSF1. Mais preferido é o anticorpo monoclonal DF200 (produzido pelo hibridoma DF200).
[0080] O termo "se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao" do anticorpo de interesse significa que um anticorpo "compete" com o citado anticorpo de interesse. O termo "se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao" do anticorpo monoclonal DF200 significa que um anticorpo "compete" com DF200. Em geral, um anticorpo que "se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao" anticorpo monoclonal de interesse (por exemplo DF200, NKVSF1, 17F9) significa que o anticorpo "compete" com o citado anticorpo de interesse por qualquer uma de mais moléculas de KIR, preferivelmente uma molécula de KIR selecionada do grupo consistindo de KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em outros exemplos, um anticorpo que se liga em epítopo ou determinante sobre uma molécula KIR2DL1 substancialmente igual ao do anticorpo de interesse "compete" com o anticorpo de interesse pela ligação em KIR2DL1. Um anticorpo que se liga em epítopo ou determinante sobre uma molécula KIR2DL2/3 substancialmente igual ao do anticorpo de interesse "compete" com o anticorpo de interesse pela ligação em KIR2DL2/3.
[0081] O termo "se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao" do anticorpo de interesse significa que um anticorpo "compete" com o citado anticorpo de interesse por qualquer uma de ou todas as moléculas de KIR nas quais o citado anticorpo de interesse especificamente se liga. O termo "se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao" do anticorpo monoclonal DF200 significa que um anticorpo "compete" com DF200 por qualquer uma de ou todas as moléculas de KIR nas quais DF200 especificamente se liga. Por exemplo, um anticorpo que se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao dos anticorpos monoclonais DF200 ou NKVSF1 "compete" com o citado DF200 ou NKVSF1 pela ligação em KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 e KIR2DS2.
[0082] A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam em epítopo substancialmente ou essencialmente igual ao dos anticorpos monoclonais aqui descritos pode ser prontamente determinada usando qualquer um de uma variedade de ensaios de triagem imunológica nos quais a competição de anticorpo pode ser avaliada. Numerosos tais ensaios são rotineiramente praticados e são bem conhecidos na arte (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.660.827, publicada aos 26 de agosto de 1997, que é especificamente aqui incorporada como referência). Será entendido que a determinação real do epítopo no qual um anticorpo aqui descrito se liga não é de nenhuma maneira requerida para identificar um anticorpo que se liga no epítopo igual ou substancialmente igual ao do anticorpo monoclonal aqui descrito.
[0083] Por exemplo, onde os anticorpos de teste a serem examinados são obtidos de animais fonte diferentes, ou são até mesmo de um isótipo de IgG diferente, um ensaio de competição simples pode ser empregado no qual o anticorpo de controle (DF200, por exemplo) e anticorpos de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados em uma amostra contendo ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3, cada um dos quais, como sabido, é ligado por DF200. Protocolos baseados em ELISAs, radioimunoensaios, Western blotting, e o uso de análise BIACORE (descrita, por exemplo, na seção de exemplos são adequados para uso em tais estudos de competição simples.
[0084] Em certas modalidades, poder-se-ia pré-misturar os anticorpos de controle (DF200, por exemplo) com quantidades variadas de anticorpos de teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1:100) por um período de tempo antes de aplicar a amostra de antígeno KIR inibitório. Em outras modalidades, as quantidades de controle e variadas de anticorpos de teste podem simplesmente ser misturadas durante a exposição à amostra de antígeno KIR. Desde que possam ser distinguidos os anticorpos ligados dos livres (por exemplo, pelo uso de técnicas de separação e de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados) e DF200 dos anticorpos de teste (por exemplo, pelo emprego de anticorpos secundários espécie-específicos ou isótipo- específicos ou por marcação específica de DF200 com um marcador detectável) haverá a capacidade para determinar se os anticorpos de teste reduzem a ligação de DF200 nos antígenos KIR2DL diferentes, indicando que o anticorpo de teste reconhece o epítopo substancialmente igual ao de DF200. A ligação dos anticorpos de controle (marcados) na ausência de um anticorpos completamente irrelevante pode servir como o valor alto de controle. O valor baixo de controle pode ser obtido pela incubação de anticorpos marcados (DF200) com anticorpos não marcados de tipo exatamente igual (DF200), onde a competição ocorreria e reduziria a ligação dos anticorpos marcados. Em um ensaio de teste, uma redução significativa em reatividade de anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativo de um anticorpo de teste que reconhece o epítopo substancialmente igual, i.e., um que "reage cruzadamente" com o anticorpo marcado (DF200). Qualquer anticorpo de teste que reduz a ligação de DF200 em cada um dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% (por exemplo, cerca de 65-100%), em qualquer razão de DF200 : anticorpo de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 é considerado como sendo um anticorpo que se liga no epítopo ou determinante substancialmente igual ao de DF200. Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação de DF200 em cada um dos antígenos KIR2DL em pelo menos cerca de 90% (por exemplo, cerca de 95%).
[0085] Competição pode ser avaliada por, por exemplo, um teste de citometria de fluxo. Em um tal teste, células possuindo um dado KIR podem ser incubadas primeiro com DF200, por exemplo, e então com o anticorpo de teste marcado com um fluorocromo ou uma biotina. É citado que o anticorpo compete com DF200 se a ligação obtida sob pré-incubação com quantidade de saturação de DF200 é cerca de 80%, preferivelmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação (medida por meio de fluorescência) obtida pelo anticorpo sem pré- incubação com DF200. Alternativamente, é citado que um anticorpo compete com DF200 se a ligação obtida com DF200 marcado (por um fluorocromo ou biotina) sobre células pré-incubadas com quantidade de saturação é cerca de 80%, preferivelmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação obtida pelo anticorpo sem pré-incubação com o anticorpo.
[0086] Um ensaio de competição simples no qual um anticorpo de teste é pré- adsorvido e aplicado na concentração de saturação em uma superfície sobre a qual ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 estão imobilizados também pode ser vantajosamente empregado. A superfície no ensaio de competição simples é preferivelmente uma pastilha BIACORE (ou outro meio adequado para análise de ressonância de plasmon de superfície). O anticorpo de controle (por exemplo, DF200) é então contatado com a superfície na concentração de saturação de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e a ligação de superfície de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 do anticorpo de controle é medida. Esta ligação do anticorpo de controle é comparada com a ligação do anticorpo de controle em superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 na ausência do anticorpo de teste. Em um ensaio de teste, uma redução significativa na ligação da superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 pelo anticorpo de controle na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste reconhece o epítopo substancialmente igual ao do anticorpo de controle de tal modo que o anticorpo de teste "reage cruzadamente" com o anticorpo de controle. Qualquer anticorpo de controle que reduz a ligação de anticorpo de controle (tal como DF200) em cada um dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em pelo menos cerca de 30%, ou com maior preferência cerca de 40% pode ser considerado um anticorpo que se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao de um controle (por exemplo DF200). Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação do anticorpo de controle (por exemplo DF200) em cada um dos antígenos KIR2DL em pelo menos cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, ou mais). Será reconhecido que a ordem de anticorpos de controle e de teste pode ser invertida: isto é o anticorpo de controle pode ser primeiro ligado na superfície e o anticorpo de teste é contatado depois com a superfície em um ensaio de competição. Preferivelmente, o anticorpo possuindo afinidade maior pelos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 é ligado primeiro na superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3, como será esperado a diminuição na ligação vista para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos reagem cruzadamente) será de magnitude maior. Outros exemplos de tais ensaios são proporcionados nos Exemplos e, por exemplo, em Saunal e Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, cuja descrição é aqui incorporada como referência.
[0087] Embora descrito no contexto de DF200 para os propósitos de exemplificação, será reconhecido que os ensaios de triagem imunológica acima descritos também podem ser usados para identificar os anticorpos que competem com NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183, e outros anticorpos de acordo com a invenção.
[0088] Sob imunização e produção de anticorpos em um vertebrado ou em uma célula, etapas de seleção específicas podem ser realizadas para isolar anticorpos como reivindicado. Em relação a isto, em uma modalidade específica, a invenção também se refere aos métodos de produzir tais anticorpos, compreendendo: (a) imunizar um mamífero não-humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR inibitório; (b) preparar anticorpos do animal imunizado, no qual os citados anticorpos se ligam em citado polipeptídeo KIR; (c) selecionar anticorpos de (b) que reagem cruzadamente com pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR inibitório, e (d) selecionar anticorpos de (c) que são capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando citados pelo menos dois produtos de gene de receptor KIR inibitório humano. A seleção de um anticorpo que reage cruzadamente com pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório pode ser realizada por triagem de anticorpo contra dois ou mais antígenos KIR inibitórios diferentes, por exemplo como descrito acima.
[0089] Em uma modalidade mais preferida, os anticorpos preparados na etapa (b) são anticorpos monoclonais. Assim, o termo "preparar anticorpos de citado animal imunizado", como aqui usado, inclui obter células B de um animal imunizado e usar aquelas células B para produzir um hibridoma que expressa anticorpos, bem como obter anticorpos diretamente do soro de um animal imunizado. Em outra modalidade preferida, os anticorpos selecionados na etapa (c) são aqueles que reagem cruzadamente com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0090] Em ainda outra modalidade preferida, os anticorpos selecionados na etapa (d) causam pelo menos cerca de 10% de lise específica mediada por células NK exibindo pelo menos um KIR reconhecido pelo anticorpo, e preferivelmente pelo menos cerca de 40% de lise específica, pelo menos cerca de 50% de lise específica, ou com maior preferência pelo menos cerca de 70% de lise específica (por exemplo, cerca de 60-100% de lise específica), medida em um ensaio de liberação de cromo padrão, na direção de uma célula alvo expressando molécula de HLA cognata de classe I, comparado com a lise ou citotoxicidade obtida na mesma razão de efetor/alvo com células NK que não estão bloqueadas por seu KIR. Alternativamente, os anticorpos selecionados na etapa (d) quando usados em um ensaio de cromo empregando um clone de célula NK expressando um ou vários KIRs inibitórios e uma célula alvo expressando apenas um alelo de HLA que é reconhecido por um dos KIRs sobre o clone NK, o nível de citotoxicidade obtido com o anticorpo deve ser pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos cerca de 30%, ou mais da citotoxicidade obtida com um mAb anti MHC de classe I bloqueador tal como anticorpo W6/32 anti MHC de classe I.
[0091] A ordem das etapas (c) e (d) do método descrito imediatamente acima pode ser mudada. Opcionalmente, o método também ou alternativamente pode compreender adicionalmente etapas adicionais de preparar fragmentos do anticorpo monoclonal ou derivados do anticorpo monoclonal ou tais fragmentos, por exemplo, como descritos aqui alhures.
[0092] Em uma modalidade preferida, o animal não-humano usado para produzir anticorpos de acordo com métodos aplicáveis da invenção é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, etc.), bovino, porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha, etc. Também, o mamífero não-humano pode ser geneticamente modificado ou engenhado para produzir anticorpos "humanos", tais como XenomouseTM (Abgenix) ou HuMab-mouseTM (Medarex).
[0093] Em outra variante, a invenção proporciona um método para obter um anticorpo que compreende: (a) selecionar, de uma biblioteca ou de um repertório, um anticorpo monoclonal, um fragmento de um anticorpo monoclonal, ou um derivado de qualquer um dos mesmos que reage cruzadamente com pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR2DL inibitório humano, e (b) selecionar um anticorpo, fragmento, ou derivado de (a) que é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando os citados pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR2DL inibitório humano.
[0094] O repertório pode ser qualquer repertório (recombinante) de anticorpos ou de seus fragmentos, opcionalmente exibidos por qualquer estrutura adequada (por exemplo, fago, bactérias, complexo sintético, etc.). Seleção de anticorpos inibitórios pode ser realizada como discutido acima e adicionalmente discutido nos exemplos.
[0095] De acordo com outra modalidade, a invenção proporciona um hibridoma compreendendo uma célula B de um hospedeiro não-humano, no qual a citada célula B produz um anticorpo que se liga em um determinante presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano e o citado anticorpo é capaz de neutralizar a atividade inibitório de citados receptores. Mais preferivelmente, o hibridoma desta aspecto da invenção não é um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal NKVSF1. O hibridoma de acordo com este aspecto da invenção pode ser formado como descrito acima por fusão de esplenócitos do mamífero não-humano imunizado com uma linhagem de células imortalizadas. Hibridomas produzidos por esta fusão pode ser triado para a presença de um tal anticorpo cruzadamente reativo como aqui descrito alhures. Preferivelmente, o hibridoma produz um anticorpo que reconhece um determinante presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR2DL, e causa potencialização de células NK expressando pelo menos um daqueles receptores KIR. De preferência ainda maior, o hibridoma produz um anticorpo que se liga no epítopo ou determinante substancialmente igual ao de DF200 e que potencializa a atividade de célula NK. Mais preferivelmente, aquele hibridoma é hibridoma DF200 que produz anticorpo monoclonal DF200.
[0096] Hibridomas que confirmadamente produzem um anticorpo monoclonal desta invenção podem crescer em quantidades grandes em um meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem crescer in vivo como tumores de ascite em um animal.
[0097] Após crescimento suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, o meio de crescimento contendo o anticorpo monoclonal (ou o fluido de ascite) é separado das células e o anticorpo monoclonal presente no mesmo é purificado. Purificação é tipicamente realizada por eletroforese em gel, diálise, cromatografia usando Sepharose-proteína A ou -proteína G, ou uma Ig anti- camundongo ligada em um suporte sólido tal como glóbulos de agarose ou Sepharose (todos descritos, por exemplo, em Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publicação No. 18-1037-46, Edição AC, cuja descrição é aqui incorporada como referência). O anticorpo ligado é tipicamente eluído das colunas de proteína A / proteína G pelo uso de tampões de pH baixo (tampões de glicina ou acetato de pH 3,0 ou menor) com neutralização imediata de frações contendo anticorpo. Estas frações são reunidas, dialisadas, e concentradas conforme a necessidade.
[0098] De acordo com uma modalidade alternativa, o DNA codificador de um anticorpo que se liga em um determinante presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano, é isolado do hibridoma desta invenção e aplicado em um vetor de expressão apropriado para transfecção em um hospedeiro adequado. O hospedeiro é então usado para a produção recombinante do anticorpo, ou de suas variantes, tal como uma versão humanizada daquele anticorpo monoclonal, fragmentos ativos do anticorpo, ou anticorpos quiméricos compreendendo a porção de reconhecimento de antígeno do anticorpo. Preferivelmente, o DNA utilizado nesta modalidade codifica um anticorpo que reconhece um determinante presente sobre pelo menos dois produtos diferentes de gene de KIR2DL, e causa potencialização de células NK expressando pelo menos um daqueles receptores KIR. De preferência ainda maior, o DNA codifica um anticorpo que se liga em epítopo ou determinante substancialmente igual ao de DF200 e que potencializa a atividade de célula NK. Mais preferivelmente, o DNA codifica anticorpo monoclonal DF200.
[0099] DNA codificador de anticorpos monoclonais da invenção é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo emprego de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente em genes codificadores de cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). Uma vez isolado, o DNA pode ser aplicado em vetores de expressão, que são então transferidos para células hospedeiras tais como células de E. coli, células de COS simiano, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Expressão recombinante em bactérias de DNA codificador de anticorpo é bem conhecida na arte (veja, por exemplo, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); e Pluckthun, Immunol. Revs., 130, pp. 151 (1992).
FRAGMENTOS E DERIVADOS DE UM ANTICORPO MONOCLONAL
[0100] Fragmentos e derivados de anticorpos desta invenção (que são incluídos pelo termo "anticorpo" ou "anticorpos" como usados neste pedido, a não ser diferentemente enunciado ou claramente contradito pelo contexto), preferivelmente um anticorpo DF200-semelhante, podem ser produzidos por técnicas que são conhecidas na arte. "Fragmentos imunorreativos" compreendem uma porção de anticorpo intacto, geralmente o sítio de ligação de antígeno ou a região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que é um polipeptídeo possuindo uma estrutura primária consistindo de uma sequência ininterrupta de resíduos de aminoácido contíguos (aqui referidos como um "fragmento de anticorpo de cadeia única" ou "polipeptídeo de cadeia única"), incluindo sem limitação (1) moléculas Fv de cadeia única (scFV), (2) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, ou um seu fragmento que contém as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem um grupo de cadeia pesada associado e (3) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada, ou um seu fragmento contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem um grupo de cadeia leve associado; e anticorpos multiespecíficos formados dos fragmentos de anticorpo. Por exemplo, fragmentos Fab ou F(ab')2 podem ser produzidos por digestão por protease dos anticorpos isolados, de acordo com técnicas convencionais. Será reconhecido que os fragmentos imunorreativos podem ser modificados usando métodos conhecidos, por exemplo para tornar lenta a eliminação in vivo e para obter um perfil farmacocinético mais desejável o fragmento pode ser modificado com poli(etileno-glicol) (PEG). Métodos para copulação e conjugação sítio-específica de PEG em um fragmento Fab' são descritos em, por exemplo, Leong et al., Cytokine 16(3): 106-119 (2001) e Delgado et al., Br. J. Cancer 73(2): 175-182 (1996), cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[0101] Em um aspecto particular, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo compreendendo a sequência de região variável de cadeia leve de DF200 como mostrado na Figura 12. Em outro aspecto específico, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo que compreendem a sequência de região variável de cadeia leve de Pan2D como mostrado na Figura 12. Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo que compreendem uma ou mais CDRs de região variável de cadeia leve de DF200 como mostrado na Figura 12. Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo que compreendem uma ou mais CDRs de região variável de cadeia leve de Pan2D como mostrado na Figura 12. Análogos/variantes funcionais de tais sequências podem ser gerados pela realização de substituições, adições e/ou deleções adequadas nestas sequências de aminoácidos usando técnicas padrão, que podem ser auxiliadas por comparação das sequências. Assim, por exemplo, resíduos de CDR que são convertidos entre Pan2D e DF200 podem ser alvos adequados para modificação na medida em que tais resíduos possam não contribuir para os perfis diferentes em competição que estes anticorpos possuem com respeito aos outros anticorpos aqui descritos (embora Pan2D e DF-200 realizem competição) e assim podem não contribuir para a especificidade destes anticorpos para seus epítopos respectivos específicos. Em outro aspecto, posições onde um resíduo está presente em uma sequência de um destes anticorpos, mas não no outro, podem ser adequadas para deleções, substituições, e/ou inserções.
[0102] Em um aspecto específico, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo compreendendo a sequência de região variável de cadeia pesada de DF200 como mostrado na Figura 13. Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpo que compreendem uma ou mais CDRs de região variável pesada de DF200 como mostrado na Figura 13. Análogos/variantes funcionais de tais sequências podem ser gerados pela realização de substituições, adições e/ou deleções adequadas nestas sequências de aminoácidos usando técnicas padrão, que podem ser auxiliadas por comparação das sequências. Em outro aspecto, posições onde um resíduo está presente em uma sequência de um destes anticorpos, mas não no outro, podem ser adequadas para deleções, substituições, e/ou inserções.
[0103] Alternativamente, o DNA de um hibridoma produzindo um anticorpo desta invenção, preferivelmente um anticorpo DF200-semelhante, pode ser modificado de modo a codificar um fragmento desta invenção. O DNA modificado é então inserido em um vetor de expressão e usado para transformar ou transfectar uma célula apropriada, que então expressa o fragmento desejado.
[0104] Em uma modalidade alternativa, o DNA de um hibridoma produzindo um anticorpo desta invenção, preferivelmente um anticorpo DF200-semelhante, pode ser modificado antes da inserção em um vetor de expressão, por exemplo por substituição dos domínios constantes de cadeias leve e pesada humanos pela sequência codificadora no lugar das sequências homólogas não-humanas (por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)), ou por junção covalente em sequência codificadora de imunoglobulina de parte de ou de toda a sequência codificadora de um polipeptídeo de não-imunoglobulina. Nesta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados os quais possuem a especificidade de ligação do anticorpo original. Tipicamente, tais polipeptídeos de não- imunoglobulina são substituintes dos domínios constantes de um anticorpo da invenção.
[0105] Assim, de acordo com outra modalidade, o anticorpo desta invenção, preferivelmente um anticorpo DF200-semelhante, é humanizado. Formas "humanizadas" de anticorpos de acordo com esta invenção são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, ou outras subsequências de ligação em antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina murina. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de anticorpo original (anticorpo doador) ao mesmo tempo mantendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas do anticorpo original. Em alguns casos, os resíduos de molde Fv da imunoglobulina humana podem ser substituídos pelos resíduos não-humanos correspondentes. Ainda mais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados quer no anticorpo recipiente quer na CDR importada ou nas sequências de molde. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas do anticorpo original e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes veja Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992).
[0106] Métodos para humanizar os anticorpos desta invenção são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção possui um ou mais resíduos de aminoácido do anticorpo original introduzidos nele. Estes resíduos de aminoácido de murino ou outros resíduos de aminoácido de não-humano são muitas vezes referidos como resíduos "importados", que são tipicamente obtidos de um domínio variável "importado". Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)). Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., Patente U.S. 4.816.567), nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto tem sido substituído pela sequência correspondente do anticorpo original. Na prática, anticorpos humanizados de acordo com esta invenção são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos no anticorpo original.
[0107] A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesado, para serem usados na preparação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o denominado método de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo desta invenção é triada contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humano. A sequência humana que está mais próxima daquela do camundongo é então aceita como o molde humano (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp.901 (1987)). Outro método usa um molde específico da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. O mesmo molde pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, pp. 4185 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51, pp. 1993)).
[0108] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade alta por múltiplos receptores KIR inibitórios ou outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiares para aquelas pessoas experientes na arte. Programas de computador estão disponíveis os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. Inspeção desta exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar em seu antígeno. Neste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados das sequências de consenso e importantes de modo que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(a) alvo(s), seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação no antígeno.
[0109] Outro método de preparar anticorpos monoclonais "humanizados" é o uso de um XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como o camundongo utilizado para imunização. Um XenoMouse é um hospedeiro murino de acordo com esta invenção que teve seus genes de imunoglobulina substituídos por genes de imunoglobulina humana. Assim, os anticorpos produzidos por este camundongo ou em hibridomas preparados das células B deste camundongo, já estão humanizados. O XenoMouse é descrito na Patente dos Estados Unidos 6.612.963, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência. Um método análogo pode ser realizado usando um HuMAb-MouseTM (Medarex).
[0110] Anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como pelo uso, de imunização, outros animais transgênicos que têm sido engenhados para expressar um repertório de anticorpos humanos (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), ou pela seleção de repertórios de anticorpos usando métodos de exibição de fago. Tais técnicas são conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e podem ser implementadas partindo de anticorpos monoclonais como descritos no presente pedido.
[0111] Os anticorpos da presente invenção, preferivelmente um anticorpo DF200- semelhante, também podem ser derivados de anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes no anticorpo original, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade bilógica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81. pp. 6851 (1984)).
[0112] Outros derivados dentro do escopo desta invenção incluem anticorpos funcionalizados, i.e., anticorpos que estão conjugados ou covalentemente ligados em uma toxina, tal como ricina, toxina de difteria, abrina e exotoxina de Pseudomonas; em um grupo detectável, tal como um grupo fluorescente, um radioisótopo ou um agente formador de imagem; ou em um suporte sólido, tal como glóbulos de agarose ou semelhantes. Métodos para conjugação ou ligação covalente destes outros agentes em anticorpos são bem conhecidos na arte.
[0113] Conjugação em uma toxina é útil para seletivamente destruir células NK exibindo um dos receptores KIR de reação cruzada sobre sua superfície celular. Uma vez se ligando o anticorpo da invenção na superfície celular de tais células, ele é internalizado e a toxina é liberada dentro da célula, seletivamente destruindo aquela célula. Tal uso é uma modalidade alternativa da presente invenção.
[0114] Conjugação em um grupo detectável é útil quando o anticorpo desta invenção é usado para propósitos de diagnóstico. Tais propósitos incluem, mas não são limitados a, ensaio de amostras biológicas para a presença de células NK possuindo o KIR de reação cruzada sobre sua superfície celular e detecção da presença de células NK possuindo o KIR de reação cruzada em um organismo vivo. Tais métodos de ensaio e de detecção também são modalidades alternativas da presente invenção.
[0115] Conjugação de um anticorpo desta invenção em um suporte sólido é útil como uma ferramenta para purificação por afinidade de células NK possuindo o KIR de reação cruzada sobre sua superfície celular a partir de uma fonte, tal como um fluido biológico. Este método de purificação é outra modalidade alternativa da presente invenção, visto que é a população purificada resultante de células NK.
[0116] Em uma modalidade alternativa, um anticorpo que se liga em um determinante comum presente em pelo menos dois produtos diferentes de gene de receptor de KIR inibitório humano, no qual o citado anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de célula NK sobre célula NK expressando pelo menos um dos citados dois produtos diferentes de gene de receptor KIR inibitório humano desta invenção, incluindo NKVSF1, pode ser incorporado em lipossomos ("imunolipossomos"), sozinhos ou juntos com outra substância para liberação em alvo em um animal. Tais outras substâncias incluem ácidos nucleicos para a liberação de genes para terapia genética ou para a liberação de RNA de anti-senso, RNAi ou siRNA para suprimir um gene em uma célula NK, ou toxinas ou drogas para destruir seletivamente as células NK.
[0117] Modelagem em computador dos domínios celulares extras de KIR2DL1, - 2 e -3 (KIR2DL1-3), baseada em suas estruturas cristalinas publicadas (Maenaka et al., (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al. (2000)), previu o envolvimento de certas regiões ou de KIR2DL1, -2 e -3 nas interações entre anticorpos monoclonais de camundongo DF200 e NKVSF1 que reagem cruzadamente com KIR2DL1, -2 e -3. Assim, em uma modalidade, a presente invenção proporciona anticorpos que exclusivamente se ligam em KIR2DL1 dentro de uma região definida pelos resíduos de aminoácido (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). Em outra modalidade a invenção proporciona anticorpos que se ligam em KIR2DL1 e KIR 2DL2/3 sem interação com resíduos de aminoácido fora da região definida pelos resíduos (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192).
[0118] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em KIR2DL1 e que não se ligam em um mutante de KIR2DL1 no qual R131 é Ala.
[0119] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em KIR2DL1 e que não se ligam em um mutante de KIR2DL1 no qual R157 é Ala.
[0120] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em KIR2DL1 e que não se ligam em um mutante de KIR2DL1 no qual R158 é Ala.
[0121] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em resíduos de KIR2DL1 (131, 157, 158).
[0122] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em KIR2DS3 (R131W), mas não em KIR2DS3 de tipo selvagem.
[0123] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 bem como em KIR2DS4.
[0124] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam em ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3, mas não em KIR2DS4.
[0125] Determinação de se um anticorpo se liga dentro de uma das regiões de epítopo definidas acima pode ser realizada em modos conhecidos pela pessoa experiente na arte. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti-KIR pode ser determinada pela "impressão de pegada" de epítopo usando modificação química das carboxilas/aminas expostas na proteína KIR2DL1 ou KIR2DL2/3. Um exemplo específico de uma tal técnica de impressão digital é o uso de HXMS (troca de hidrogênio-deutério detectada por espectrometria de massa) na qual ocorrem uma troca de hidrogênio / deutério dos prótons de amida da proteína ligante e receptora, ligação, e retro-troca, na qual os grupos amida do esqueleto participantes na ligação de proteína são protegidos da retro-troca e portanto permanecerão deuterados. Regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto por proteólise péptica, separação por cromatografia líquida de desempenho alto em microcapilar, e/ou espectrometria de massa com ionização por electrospray. Veja, por exemplo, Ehring H., Analitycal Biochemistry, Vol. 267(2) pp. 252-259 (1999) e/ou Ehring, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é mapeamento de epítopo por ressonância nuclear magnética (NMR), na qual tipicamente são comparadas as posições dos sinais em espectros de NMR bidimensionais do antígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo ligante de antígeno, tal como um anticorpo. O antígeno é tipicamente seletivamente isotopicamente marcado com 15N de modo que apenas sinais correspondendo ao antígeno e nenhuns sinais do peptídeo ligante de antígeno sejam vistos no espectro de NMR. Sinais de antígeno originários dos aminoácidos envolvidos na interação como peptídeo ligante de antígeno tipicamente deslocarão a posição nos espectros do complexo comparados com os espectros do antígeno livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo. Veja, por exemplo, Ernt Schering Res. Found Workshop. 2004; (44):149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods 1996 Jun; 9(3):516-24. Caracterização/mapeamento de epítopo também pode ser realizado usando métodos de espectroscopia de massa. Veja, por exemplo, Downward, J. Mass Spectrom. 2000 Apr.; 35(4)493-503 e Kiselar e Downard, Anal. Chem. 1999 May 1; 71(9):1792-801.
[0126] Técnicas de digestão com protease também podem ser úteis no contexto de identificação e mapeamento de epítopo. Sequências / regiões relevantes de determinante antigênico podem ser determinadas por digestão com protease, por exemplo pelo uso de tripsina em uma razão de cerca de 1:50 para KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 em digestão a 37oC e pH 7-8, seguida por análise de espectrometria de massa (MS) para identificação de peptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem por tripsina pelo ligante anti-KIR podem ser subsequentemente identificados por comparação de amostras submetidas à digestão com tripsina e amostras incubadas com anticorpo e então submetidas à digestão por exemplo por tripsina (revelando deste modo uma impressão de pegada para o ligante). Outras enzimas como quimiotripsina, pepsina etc. também ou alternativamente podem ser usadas em métodos semelhantes de caracterização de epítopo. Ainda mais, a digestão enzimática pode proporcionar um método rápido para analisar se uma sequência de determinante antigênico potencial está dentro de uma região de KIR2DL1 no contexto de um polipeptídeo anti-KIR que não está exposto na superfície e, consequentemente, mais provavelmente não é relevante em termos de imunogenicidade / antigenicidade. Veja, por exemplo Manca, Ann. Ist. Super Sanita 1991; 27(1):15-9 para uma discussão de técnicas semelhantes.
REATIVIDADE CRUZADA COM MACACOS CINOMOLGO
[0127] Tem sido verificado que o anticorpo NKVSF1 também se liga em células NK de macacos cinomolgo, veja o exemplo 7. A invenção portanto proporciona um anticorpo, bem como seus fragmentos e derivados, na qual o citado anticorpo, fragmento ou derivado reage cruzadamente com pelo menos dois receptores KIR humanos inibitórios na superfície de células NK de humano, e que adicionalmente se liga em células NK de macacos cinomolgo. Em uma sua modalidade, o anticorpo não é o anticorpo NKVSF1. A invenção também proporciona um método de testar a toxicidade de um anticorpo, bem como de fragmentos e derivados do mesmo, no qual o citado anticorpo, fragmento ou derivado reage cruzadamente com pelo menos dois receptores KIR humanos inibitórios na superfície de células NK de humano, no qual o método compreende testar o anticorpo em um macaco cinomolgo.
COMPOSIÇÕES E ADMINISTRAÇÃO
[0128] A invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo, bem como seus fragmentos e derivados, nas quais o citado anticorpo, fragmento ou derivado reage cruzadamente com pelo menos dois receptores KIR inibitórios na superfície de células NK, neutraliza seus sinais inibitórios e potencializa a atividade daquelas células, em qualquer veículo adequado em uma quantidade efetiva para detectavelmente potencializar a citotoxicidade de célula NK em um paciente ou em uma amostra biológica compreendendo células NK. A composição compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições também são referidas como "composições de anticorpo desta invenção". Em uma modalidade, as composições de anticorpo desta invenção compreendem um anticorpo descrito nas modalidades de anticorpo acima. O anticorpo NKVSF1 está incluído dentro do escopo de anticorpos que podem estar presentes nas composições de anticorpo da invenção.
[0129] O termo "amostra biológica" como aqui usado inclui mas não se limita a um fluido biológico (por exemplo soro, linfa, sangue), amostra de célula ou amostra de tecido (por exemplo medula óssea).
[0130] Veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem, mas não são limitados a, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina de soro de humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parcial de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno-fosfato de dissódio, hidrogeno- fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, poli(vinil-pirrolidona), substâncias baseadas em celulose, poli(etileno- glicol), sódio-carbóxi-metil-celulose, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polipropileno, poli(etileno-glicol) e gordura de lã.
[0131] As composições desta invenção podem ser empregadas em um método de potencialização da atividade de células NK em um paciente ou uma amostra biológica. Este método compreende a etapa de contatar a citada composição com o citado paciente ou a citada amostra biológica. Tal método será útil para ambos os propósitos diagnóstico e terapêutico.
[0132] Para uso conjuntamente com uma amostra biológica, a composição de anticorpo pode ser administrada por simples misturação com ou aplicação direta na amostra, dependendo da natureza da amostra (fluida ou sólida). A amostra biológica pode ser contatada diretamente com o anticorpo em qualquer dispositivo adequado (placa, bolsa, frasco etc.). Para uso conjuntamente com um paciente, a composição tem que ser formulada para administração ao paciente.
[0133] As composições da presente invenção podem ser administradas oral, parenteral, por borrifo de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginalmente ou via um reservatório implantado. O termo "parenteral" como aqui usado inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracranial ou técnicas de infusão. Preferivelmente, as composições são administradas oral, intraperitoneal ou intravenosamente.
[0134] Formas injetáveis estéreis das composições desta invenção podem ser aquosas ou uma suspensão oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na arte usando agentes de suspensão e agentes umectantes ou dispersantes adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma suspensão ou solução injetável estéril em um solvente ou diluente parenteralmente aceitável não-tóxico, por exemplo como uma solução em 1,3- butanodiol. Dentre os solventes e veículos aceitáveis que podem ser empregados encontram-se água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Em adição, óleos estéreis, fixos são convencionalmente empregados como um solvente ou um meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácido oléico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, como o são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como azeite de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas suspensões ou soluções oleosas também podem conter um dispersante ou diluente álcool de cadeia longa, tal como carbóxi-metil-celulose ou agentes dispersantes semelhantes que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificadores ou intensificadores de biodisponibilidade que são comumente empregados na manufatura de formas de dosagem líquidas, sólidas ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser empregados para os propósitos de formulação.
[0135] As composições desta invenção podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitadas a, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. No caso de tabletes para uso oral, veículos comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tal como estearato de magnésio, também podem ser tipicamente adicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes de suspensão ou de emulsificação. Se desejados, certos agentes edulcorantes, aromatizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[0136] Alternativamente, as composições desta invenção podem ser administradas na forma de supositórios para administração retal. Estas podem ser preparadas por misturação do agente com um excipiente não irritante adequado que é sólido na temperatura ambiente mas liquido na temperatura retal e portanto se fundirá no reto para liberar a droga. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e poli(etileno-glicóis0.
[0137] As composições desta invenção também podem ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos prontamente acessíveis por aplicação tópica, incluindo doenças de olho, de pele, ou do trato intestinal inferior. Formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos.
[0138] Aplicação tópica para o trato intestinal inferior podem ser efetuadas em uma formulação de supositório retal (veja acima) ou em uma formulação de enema adequada. Remendos topicamente-transdermais também podem ser usados.
[0139] Para aplicações tópicas, as composições podem ser formuladas em uma pomada adequada contendo o componente ativo suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Veículos para administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno-glicol, composto de polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificadora e água. Alternativamente, as composições podem ser formuladas em uma loção adequada ou em um creme apropriado contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos apropriados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitana, polissorbato 60, cera de cetil-ésteres, cetearil-álcool, 2-octil-dodecanol, benzil-álcool e água.
[0140] Para uso oftálmico, as composições podem ser formuladas como suspensões micronizadas em solução salina estéreis de pH ajustado, isotônicas, quer com quer sem um conservante tal como cloreto de benzalcônio. Alternativamente, para usos oftálmicos, as composições podem ser formuladas em uma pomada tal como petrolato.
[0141] As composições desta invenção também podem ser administradas por aerossol ou inalação nasal. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na arte de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em meio salino, empregando benzil-álcool ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para intensificar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos, e/ou outros agentes de dispersão ou de solubilização convencionais.
[0142] Tem sido mostrado que vários anticorpos monoclonais são eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) ou Xolair (Omalizumab), e regimes de administração semelhante (i.e., protocolos de formulações e/ou doses e/ou administração) podem ser usados com os anticorpos desta invenção. Planejamentos e dosagens para a administração do anticorpo nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser determinados de acordo com métodos conhecidos para estes produtos, por exemplo usando as instruções do fabricante. Por exemplo, um anticorpo presente em uma composição farmacêutica desta invenção pode ser fornecido em uma concentração de 10 mg/mL em frascos de uso único quer de 100 mg (10 mL) quer de 500 mg (50 mL). O produto é formulado para administração IV em cloreto de sódio 9,0 mg/mL, citrato de sódio di- hidratado 7,35 mg/mL, polissorbato 80 0,7 mg/mL, e Água Estéril para injeção. O pH é ajustado para 6,5. Uma faixa de dosagem adequada exemplar para um anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção pode estar entre cerca de 10 mg/m2 e 500 mg/m2. Contudo, será reconhecido que estes planejamentos são exemplares e que um planejamento e regime opcionais podem ser adaptados considerando a afinidade e a tolerância do anticorpo específico na composição farmacêutica que têm que ser determinadas em testes clínicos. Quantidades e planejamento de injeção de um anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção que saturam células NK por 24 horas, 48 horas, 72 horas ou uma semana ou um mês serão determinados considerando a afinidade do anticorpo e seus parâmetros farmacocinéticos.
[0143] De acordo com outra modalidade, as composições de anticorpo desta invenção podem compreender adicionalmente outro agente terapêutico, incluindo agentes normalmente utilizados para o propósito terapêutico específico para o qual o anticorpo está sendo administrado. O agente terapêutico adicional normalmente estará presente na composição em quantidades tipicamente usadas para aquele agente em uma monoterapia para a doença ou a condição específica sendo tratada. Tais agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, agentes terapêuticos usados no tratamento de cânceres, agentes terapêuticos usados para tratar doença infecciosa, agentes terapêuticos usados em outras imunoterapias, citocinas (tais como IL-2 ou IL-15), outros anticorpos e fragmentos de outros anticorpos.
[0144] Por exemplo, numerosos agentes terapêuticos estão disponíveis para o tratamento de cânceres. As composições de anticorpo e os métodos da presente invenção podem ser combinados com quaisquer outros métodos geralmente empregados no tratamento de doença específica, particularmente um tumor, doença de câncer, ou outra doença ou outro distúrbio que o paciente exibe. Desde que a abordagem terapêutica específica não seja em si mesma, como sabido, prejudicial para a condição do paciente, e não contra-ataque significativamente a atividade do anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção, sua combinação com a presente invenção é contemplada.
[0145] Em conexão com o tratamento de tumor sólido, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas em combinação com abordagens clássicas, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia, e semelhantes. A invenção portanto proporciona terapias combinadas nas quais uma composição farmacêutica desta invenção é usada simultaneamente com, antes, ou após tratamento de cirurgia ou de radiação; ou são administradas aos pacientes com, antes, ou após agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos ou antiangiogênicos, ou imunotoxinas selecionadas ou coaguligantes.
[0146] Quando um ou mais agentes forem usados em combinação com uma composição contendo anticorpo desta invenção em um regime terapêutico, não haverá o requerimento de que os resultados combinados sejam aditivos dos efeitos observados quando cada tratamento for conduzido separadamente. Embora efeitos pelo menos aditivos sejam em geral desejáveis, qualquer efeito de anti-câncer aumentado acima de uma das terapias individuais seria benéfico. Também, não há requerimento específico de que o tratamento combinado exiba efeitos sinérgicos, embora isto seja certamente possível e vantajoso.
[0147] Para praticar terapia de anti-câncer combinada, simplesmente administrar- se-ia a um animal uma composição de anticorpo desta invenção em combinação com outro agente de anti-câncer em uma maneira efetiva para resultar em suas ações de anti-câncer combinadas dentro do animal. Os agentes seriam portanto proporcionados em quantidades efetivas e por períodos de tempo efetivos para resultar em sua presença combinada dentro da vasculatura do tumor e suas ações combinadas no ambiente do tumor. Para se alcançar este objetivo, uma composição de anticorpo desta invenção e agentes de anti-câncer podem ser administrados ao animal simultaneamente, quer em uma composição combinada única, quer como duas composições distintas usando rotas de administração diferentes.
[0148] Alternativamente, a administração de uma composição de anticorpo desta invenção pode preceder, ou ser posterior ao, o tratamento de agente de anti-câncer, por exemplo, em intervalos variando de minutos a semanas e meses. Garantir-se-ia que o agente de anti-câncer e um anticorpo na composição de anticorpo desta invenção exercessem um efeito vantajosamente combinado sobre o câncer.
[0149] Muitos agentes de anti-câncer seriam dados antes de uma composição de anticorpo para KIR inibitório desta invenção em uma terapia anti-angiogênica. Contudo, quando imunoconjugados de um anticorpo são usados na composição de anticorpo desta invenção, vários agentes de anti-câncer podem ser simultânea ou subsequentemente administrados.
[0150] Em algumas situações, pode ser até mesmo desejável prolongar o período de tempo para tratamento de modo significativo, no qual vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8) ou até mesmo vários meses 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8) passam entre a administração respectiva de agente de anti-câncer ou o tratamento de anti-câncer e a administração de uma composição de anticorpo desta invenção. Isto seria vantajoso em circunstâncias nas quais o tratamento de anti-câncer fosse intencionado para substancialmente destruir o tumor, tal como cirurgia ou quimioterapia, e administração de uma composição de anticorpo desta invenção fosse intencionada para prevenir micrometástase ou recrescimento de tumor.
[0151] Também é previsto que será utilizada mais do uma administração de quer uma composição baseada em anticorpo para KIR inibitório desta invenção quer o agente de anti-câncer. Estes agentes podem ser administrados intercambiavelmente, em dias ou semanas alternados; ou um ciclo de tratamento com uma composição baseada em anticorpo para KIR inibitório desta invenção, seguido por um ciclo de terapia com agente de anti-câncer. Em qualquer caso, para se alcançar a regressão de tumor usando uma terapia combinada, tudo o que é requerido é liberar ambos os agentes em uma quantidade combinada efetiva para exercer um efeito de anti-tumor, irrespectivamente número de vezes de administração.
[0152] Em termos de cirurgia, qualquer intervenção cirúrgica pode ser praticada em combinação com a presente invenção. Em conexão com radioterapia, é contemplado qualquer mecanismo para induzir dano em DNA localmente dentro de células de câncer, tal como irradiação gama, raios-X, irradiação-UV, microondas e até mesmo emissões eletrônicas e semelhantes. O fornecimento direcionado de radioisótipos às células de câncer também é contemplado, e isto pode ser usado em conexão com um anticorpo alvejador ou outro meio de seleção.
[0153] Em outros aspectos, regimes ou compostos imunomodulatórios podem ser administrados em combinação com ou como parte das composições de anticorpo da presente invenção. Exemplos preferidos de compostos imunomodulatórios incluem citocinas. Várias citocinas podem ser empregadas em tais abordagens combinadas. Exemplos de citocinas úteis em combinações contempladas por esta invenção incluem IL-1-alfa, IL-1-beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13 IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN- gama. Citocinas usadas no tratamento de combinação ou em composições desta invenção são administradas de acordo com regimes padrão, consistentes com indicações clínicas tais como a condição do paciente e a toxicidade relativa da citocina.
[0154] Em certas modalidades, as composições terapêuticas compreendendo anticorpo para KIR inibitório cruzadamente reativo da presente invenção podem ser administradas em combinação com ou podem compreender adicionalmente um agente de terapia hormonal ou um agente quimioterapêutico. Uma variedade de agentes de terapia hormonal ou quimioterapêuticos pode ser utilizada nos métodos de tratamento combinado aqui descritos. Agentes quimioterapêuticos contemplados como exemplares incluem, mas não são limitados a, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, alcalóides de vinca, por exemplo adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotere, vincristina, vimblastina, vinorelbina, etoposida (VP-16), 5-fluoro-uracila (5FU), citosina arabinosídeo, ciclo-fosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s) e derivados e pró-drogas dos mesmos.
[0155] Agentes hormonais incluem, mas não são limitados a, por exemplo leuprorelina, gosorelina, triptorelina, e buserelina, anti-estrogênios tais como tamoxifeno e toremifeno, anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, ciproterona e biculatamida; inibidores de aromatase tais como anastrozol, exemestano, letrozol e fadrozol; e progestágenos tais como medróxi, clormadinona e megestrol.
[0156] Como será discutido por aquelas pessoas experientes na arte, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos se aproximarão daquelas já empregadas em terapias clínicas nas quais os agentes quimioterapêuticos são administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes quimioterapêuticos. Apenas por meio de exemplo, agentes tais como cisplatina, e outros agentes alquilantes de DNA podem ser usados. Cisplatina tem sido amplamente usada para tratar câncer, com doses eficazes utilizadas em aplicações clínicas de 20 mg/m2 por 5 dias a cada três semanas por um total de três cursos. Cisplatina não é absorvida oralmente e tem que ser portanto fornecida via injeção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperitoneal.
[0157] Outros agentes quimioterapêuticos úteis incluem compostos que interferem com a replicação de DNA, mitose e segregação cromossômica, e agentes que interrompem a síntese e a fidelidade de precursores de polinucleotídeo. Numerosos agentes quimioterapêuticos exemplares para terapia de combinação são listados na Tabela C da Patente U.S. 6.524.583, cuja descrição de agentes e indicações são especificamente aqui incorporada como referência. Cada um dos agentes listados são exemplares e não limitantes. O técnico experiente é direcionado a "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15th Edition, capítulo 33, em particular páginas 624-652. Variação em dosagem provavelmente ocorrerá dependendo da condição sendo tratada. O médico administrando tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual.
[0158] As composições de anticorpo para KIR inibitório cruzadamente reativo desta invenção podem ser usadas em combinação com qualquer uma ou mais outras terapias anti-angiogênicas ou podem compreender adicionalmente agentes anti- angiogênicos. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos neutralizadores, RNA de anti-senso, siRNA, RNAi, aptâmeros de RNA e ribozimas cada um direcionado contra VEGF ou receptores de VEGF (Patente U.S. 6.524.583, cuja descrição é aqui incorporada como referência). Variantes de VEGF com propriedades antagonísticas também podem ser empregadas, como as descritas em WO 98/16551, especificamente aqui incorporada como referência. Outros agentes anti-angiogênicos exemplares que são úteis em conexão com a terapia combinada são listados na Tabela D de Patente U.S. 6.524.583, cuja descrição de agentes e indicações são especificamente aqui incorporada como referência.
[0159] As composições de anticorpo para KIR inibitório desta invenção também podem ser vantajosamente usadas em combinação com métodos para induzir apoptose ou podem compreender agentes apoptóticos. Por exemplo, numerosos oncogenes têm sido identificados os quais inibem a apoptose, ou a morte celular programada. Oncogenes exemplares nesta categoria incluem, mas não são limitados a, bcr-abl, bcl-2 (distinto de bcl-1, cyclin D1, Números de acesso de GenBank M14745, X06487; Patentes U.S. 5.650.491; e 5.539.094; cada uma das quais é aqui incorporada como referência) e membros de família incluídos Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1, e A20. Superexpressão de bcl-2 foi primeiro descoberta em linfomas de célula T. As funções de oncogene bcl-2 pela ligação e inativação de Bax, uma proteína na rota apoptótica. Inibição de função de bcl-2 previna a inativação de Bax, e permite que a rota apoptótica prossiga. Inibição desta classe de oncogenes, por exemplo, usando sequências de nucleotídeos de anti-senso, RNAi, siRNA ou compostos químicos de molécula pequena, é contemplada para uso na presente invenção para dar intensificação de apoptose (Patentes U.S. 5.650.491; 5.539.094; e 5.583.034; cada uma aqui incorporada como referência).
[0160] As composições de anticorpo para KIR inibitório desta invenção também podem compreender ou serem usadas em combinação com moléculas que compreendem uma porção de triagem, por exemplo, anticorpo, ligante, ou seu conjugado, direcionada para um marcador específico de uma célula alvo ("agente alvejador"), por exemplo uma célula de tumor alvo. Falando em termos gerais, os agentes alvejadores para uso nestes aspectos adicionais da presente invenção reconhecerão preferivelmente antígenos de tumor acessíveis que são preferivelmente, ou especificamente, expressados no sítio de tumor. Os agentes alvejadores se ligarão em geral em um componente superfície-expressado, superfície- acessível ou superfície-localizado de uma célula de tumor. Os agentes alvejadores também exibirão preferivelmente propriedades de afinidade alta; e não exercerão efeitos colaterais significativos in vivo contra os tecidos normais mantenedores da vida, tais como um ou mais tecidos selecionados de coração, rins, cérebro, fígado, medula óssea, cólon, mama, próstata, tireóide, vesícula biliar, pulmões, glândulas supra-renais, músculo, fibras nervosas, pâncreas, pele, ou outro tecido ou órgão mantenedor da vida no corpo humano. O termo "não exercerão efeitos colaterais significativos", como aqui usado, refere-se ao fato de que um agente alvejador, quando administrado in vivo, produzirá efeitos colaterais apenas desprezíveis ou clinicamente manejáveis, tais como aqueles normalmente encontrados durante a quimioterapia.
[0161] No tratamento de tumores, uma composição de anticorpo desta invenção adicionalmente pode compreender ou pode ser usada em combinação com compostos adjuntos. Compostos adjuntos podem incluir por meio de exemplo anti- eméticos tais como antagonistas de serotonina e terapias tais como fenotiazinas, benzamidas substituídas, anti-histaminas, butirofenonas, corticosteróides, benzodiazepinas e canabinóides; bifosfonatos tais como ácido zoledrônico e ácido pamidrônico; e fatores de crescimento hematopoiéticos tais como eritropoietina e G- CSF, por exemplo filgrastim, lenograstim e darbepoietina.
[0162] Em outra modalidade, dois ou mais anticorpos desta invenção possuindo reatividades cruzadas diferentes, incluindo NKVSF1, podem ser combinados em uma única composição de modo a neutralizar os efeitos inibitórios de tantos quanto possíveis produtos de gene de KIR inibitório. Composições compreendendo combinações de anticorpos para KIR inibitórios cruzadamente reativos desta invenção, ou seus fragmentos ou derivados, proporcionarão utilidade até mesmo mais ampla porque possivelmente há uma percentagem pequena da população humana que pode ser faltante de cada um dos produtos de gene de KIR inibitório reconhecidos por um anticorpo cruzadamente reativo único. Semelhantemente, uma composição de anticorpo desta invenção pode compreender adicionalmente um ou mais anticorpos que reconhecem subtipos de KIR inibitório individuais. Tais combinações novamente proporcionariam utilidade mais ampla em ambiente terapêutico.
[0163] A invenção também proporciona um método de potencializar a atividade de célula NK em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar uma composição de acordo com esta invenção ao citado paciente. O método é mais especificamente direcionado para aumentar a atividade de célula NK em pacientes possuindo uma doença na qual a atividade aumentada de célula NK é benéfica, que envolve, afeta ou é causada por células suscetíveis à lise por células NK, ou que é causada ou caracterizada por atividade de célula NK insuficiente, tal como câncer, outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune. Mais especificamente, os métodos da presente invenção são utilizados para o tratamento de uma variedade de cânceres e de outras doenças proliferativas incluindo, mas não limitadas a, carcinoma, incluindo aquele de bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, cérvix, tireóide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem de linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkins, linfoma de não- Hodgkins, linfoma de célula ciliada e linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fribossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular de tireóide e teratocarcinoma.
[0164] Distúrbios preferidos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem tumores hematopoiéticos de linhagem, linfóide, por exemplo tumores de célula B e de célula T, incluindo mas não limitados a distúrbios de célula T tais como leucemia prolinfocítica T (T-PLL), incluindo os tipos de célula cerebriforme e de célula pequena; leucemia linfocítica granular grande (LGL) preferivelmente do tipo de célula T; síndrome de Sezary (SS); linfoma de leucemia de célula T de adulto (ATLL); linfoma hepatosplênico T-NHL a/d; linfoma de célula-T periférico/pós-tímico (subtipos imunoblástico e pelomórfico); linfoma de célula T angioimunoblástico; linfoma de célula T angiocêntrico (nasal); linfoma de célula grande anaplásico (Ki 1 +); linfoma de célula T intestinal; leucemia T-linfoblástica; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL).
[0165] Outros distúrbios proliferativos também podem ser tratados de acordo com a invenção, incluindo por exemplo hiperplasias, fibrose (especialmente pulmonar, mas também outros tipos de fibrose, tal como fibrose renal), angiogênese, psoríase, aterosclerose e proliferação de músculo liso em vasos sanguíneos, tais como estenose ou restenose após angioplastia.
[0166] Anticorpo para KIR inibitório cruzadamente reativo desta invenção pode ser usado para tratar ou prevenir doenças infecciosas, incluindo preferivelmente quaisquer infecções causadas por vírus, bactérias, protozoários, bolores ou fungos. Tais organismos infecciosos virais incluem, mas não são limitados a, hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, hepatite do tipo C, influenza, varicela, adenovírus, herpes simples do tipo I (HSV-1), herpes simples do tipo 2 (HSV-2), gafeira, rinovírus, ecovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papiloma vírus, papiloma vírus, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus de Coxsackie, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, poliovírus e vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 ou do tipo 2 (HIV-1, HIV-2).
[0167] Infecções bacterianas que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem, mas não são limitadas às, infecções causadas pelos seguintes: Staphylococcus; Streptococcus, incluindo S. pyogenes; Enterococci; Bacillus, incluindo Bacillus anthracis, e Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella incluindo G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas incluindo Raeruginosa; Legionella; Neisseria incluindo N.gonorrhoeae and N.meningitides; Flavobacterium incluindo F. meningosepticum e F. odoraturn; Brucella; Bordetella incluindo B. pertussis e B. bronchiseptica; Escherichia incluindo E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia incluindo S. marcescens e S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiaceae incluindo R. fickettsfi, Chlamydia incluindo C. psittaci e C. trachornatis; Mycobacterium incluindo M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare, e M. lepraernurium; e Nocardia.
[0168] Infecções de protozoários que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem, mas não são limitadas às, infecções causadas por leishmania, coccidia, e tripanosoma. Uma lista completa de doenças infecciosas pode ser encontrada no site da Internet do National Center for Infectious Disease (NCID) no Center for Disease Control (CDC) (http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/), cuja lista é aqui incorporada como referência. Todas as citadas doenças são candidatas para tratamento usando os anticorpos para KIR inibitório cruzadamente reativos da invenção.
[0169] Tais métodos de tratar várias doenças infecciosas podem empregar a composição de anticorpo desta invenção, quer sozinha quer em combinação com outros tratamentos e/ou agentes terapêuticos conhecidos para tratamento de tais doenças, incluindo agentes antivirais, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, antibióticos, agentes antiparasíticos e agentes antiprotozoário. Quando estes métodos envolvem tratamentos adicionais com agentes terapêuticos adicionais, aqueles agentes podem ser administrados juntos com os anticorpos desta invenção quer como uma forma de dosagem unitária quer como formas de dosagem múltiplas, separadas. Quando administrado como uma forma de dosagem separada, o agente adicional pode ser administrado antes da, simultaneamente com, da administração seguinte de anticorpo desta invenção.
[0170] Outros aspectos e outras vantagens desta invenção serão descritos na seguinte seção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitante do escopo deste pedido.
EXEMPLO 1 PURIFICAÇÃO DE PBLS E GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULA NK CLONAL OU POLICLONAL
[0171] PBLs foram derivados de doadores saudáveis por gradientes de Ficol Hypaque e depleção de células aderentes em plástico. Para se obterem células NK, PBLs foram incubados com mAbs anti-CD3, anti-CD4 e anti-HLA-DR (30 minutos a 4oC) e seleção imunomagnética por métodos conhecidos na arte (Pende et al., 1999). Células CD3-, CD4-, DR- foram cultivadas sobre células alimentadoras irradiadas e 100 U/mL de Interleucina 2 (Proleucina, Chiron Corporation) e 1,5 ng/mL de Fitoemaglutinina A (Gibco BRL) para se obterem populações de célula NK policlonais. Células NK foram clonadas por diluição limitante e clones de células NK foram caracterizados por citometria de fluxo para expressão de receptores de superfície celular.
[0172] Os mAbs usados foram JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 e GL183 (IgG1 anti KIR2DL1 e KIR2DL2/3 respectivamente), XA-141 igM (anti KIR2DL1 com especificidade igual à de EB6), anti CD4 (HP2.6), e anti DR (D1.12, IgG2a). No lugar de JY3A, HP2.6, e DR1.12 que foram produzidos pelos requerentes, mAbs comercialmente disponíveis de mesmas especificidades podem ser usados (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). EB6 e GL183 estão comercialmente disponíveis (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141 não está comercialmente disponível, mas EB6 pode ser usado para reconstituição de controle de lise como descrito em (Moretta et al., 1993).
[0173] Células foram coradas com os anticorpos apropriados (30 mns a 4oC) seguido por anticorpos de anti-camundongo policlonais conjugados em PE ou FITC (Southern Biotechnoloby Associates Inc.). Amostras foram analisadas por análise citofluorométrica em uma aparelhagem FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
[0174] Os seguintes clones foram usados neste estudo. CP11, CN5 e CN505 são clones positivos para KIR2DL1 e corados por EB6 ((IgG1 anti KIR2DL1) ou XA-141 (IgM anti KIR2DL1 com a mesma especificidade em comparação com os anticorpos EB6). CN12 e CP502 são clones positivos para KIR2DL3 e são corados pelo anticorpo GL183 (IgG1 anti KIR2DL3).
[0175] A atividade citolítica de clones NK foi avaliada por um ensaio padrão de liberação de 51Cr de 4 horas no qual células NK efetoras foram testadas sobre linhagens celulares positivas para Cw3 e Cw4 conhecidas por sua sensibilidade à lise de célula NK. Todos os alvos foram usados em 5.000 células por cavidade em placa de microtitulação e a razão de efetor: alvo é indicada nas Figuras (normalmente 4 efetores por células alvo). O ensaio citolítico foi realizado com ou sem sobrenadante dos anticorpos monoclonais indicados em uma diluição de 1/2. O procedimento foi essencialmente igual ao descrito em (Moretta et al., 1993).
EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE MABS NOVOS
[0176] mAbs foram gerados por imunização de camundongos Balb C de 5 semanas de idade com linhagens de célula NK monoclonal ou policlonal como descrito em (Moretta et al., 1990). Após fusões de células diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados por sua capacidade para reagir cruzadamente com clones e linhagens de célula NK positivos para EB6 e para GL183. Anticorpos monoclonais positivos foram adicionalmente triados para sua capacidade de reconstituir lise por clones NK positivos para EB6 ou positivos para GL183 de alvos positivos para Cw4 ou Cw3 respectivamente.
[0177] Coração celular foi realizada como segue. Células foram coradas com um painel de anticorpos (1 μ g/mL ou 50 μ L de sobrenadante, 30mms a 4oC) seguido por fragmentos F(ab')2 conjugados com PE de anticorpos IgG (H+L) de cabra anti- camundongo ou por fragmento F(ab')2 conjugado com PE de IgG (Fc gama) de cabra anti-humano (Beckman Coulter). Análise citofluorométrica foi realiza em uma aparelhagem Epics XL.MCL (Beckman Coulter).
[0178] Foi verificado que um dos anticorpos monoclonais, o DF200 mAb, reage com vários membros da família KIR incluindo KIR2DL1, KIR2DL2/3. Ambas as células NK KIR2DL1+ e KIR2DL2/3+ foram coradas brilhantemente com DF200mAb (Figura 1).
[0179] Clones NK expressando um ou outro (ou até ambos) destes receptores inibitórios específicos para HLA de classe I foram usados como células efetoras contra células alvo expressando um ou mais alelos HLA-C. Ensaios de citotoxicidade foram realizados como segue. A atividade citolítica de linhagens de célula YTS-KIR2DL1 ou de célula YTS-Eco foram avaliados por um ensaio padrão de liberação de 51Cr de 4 horas. As células efetoras foram testadas sobre linhagens de célula EBV negativas ou positivas para HLA-Cw4 e células 721.221 transfectadas com HLA-Cw4. Todos os alvos foram usados em 3.000 células por cavidade em placa de microtitulação. A razão de efetor / alvo é indicada nas figuras. O ensaio citolítico foi realizado com ou sem fragmentos indicados F(ab')2 ou de comprimento total de anticorpos de humano ou de camundongo monoclonais. Como esperado, clones KIR2DL1+ NK mostraram pouca se alguma atividade citolítica contra as células alvo expressando HLA-Cw4 e clones KIR2DL3+ NK mostraram pouca ou nenhuma atividade sobre alvos positivos para Cw3. Contudo, na presença de clones DF200mAb NK (usados para mascarar seus receptores KIR2DL) tornou-se incapaz de reconhecer seus ligantes HLA-C e mostrou uma atividade citolítica forte sobre alvos Cw3 ou Cw4.
[0180] Por exemplo, a linhagem celular C1R (linhagem celular CW4+ EBV, ATCC no. CRL 1993) não foi morta pelos clones KIR2DL1+ NK (CN5/CN505), mas a inibição pôde ser eficientemente revertida pelo uso quer de DF200 quer der um mAb anti KIR2DL convencional. Por outro lado clones NK expressando o fenótipo KIR2DL2/3+ KIR2DL1-1 (CN2) distruiram eficientemente células C1R e esta destruição não foi afetada por DF200 mAb (Figura 2). Resultados semelhantes são obtidos com clones NK positivos para KIR2DL2 ou KIR2DL3 sobre alvos positivos para Cw3.
[0181] Semelhantemente, a linhagem celular Cw4+ 221 EBV não destruiu as células NK transfectadas com KIR2DL1+, mas a inibição pôde ser eficientemente revertida pelo uso quer de DF200, um fragmento DF200 Fab, quer um XA141 ou EB6 mAb anti KIR2DL1. Também, uma linhagem celular Cw3+ 21 EBV não foi morta por células KIR2DL+ NK, mas esta inibição pôde ser revertida pelo uso quer de DF200 quer de um fragmento DF200 Fab. Finalmente, a última linhagem celular Cw3+ 221 EBV não foi morta por células KIR2DL3+ NK, mas esta inibição pôde ser revertida pelo uso quer de um fragmento DF200 Fab quer de um Y249 ou GL183 mAb anti KIR2DL3. Os resultados são mostrados na Figura 3.
[0182] Fragmentos F(ab')2 também foram testados para sua capacidade de reconstituir lise de alvos positivos para Cw4. Fragmentos F(ab')2 de Abs de DF200 e EB6 foram ambos capazes de reverter a inibição de lise por células NK transfectadas com KIR2DL1 da linhagem celular 221 transfectada com Cw4 e da linhagem celular Cw4+ TUBO EBV. Os resultados são mostrados na Figura 4.
EXEMPLO 4 GERAÇÃO DE MABS HUMANOS NOVOS
[0183] Abs anti-KIR monoclonais humanos foram gerados por imunização de camundongos transgênicos engenhados para expressarem um repertório de anticorpos humanos com proteína KIR recombinante. Após fusões de células diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados para sua capacidade de reagir cruzadamente com proteína KIR2DL1 e KIR2DL2. Foi verificado que vários anticorpos monoclonais, incluindo 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1, reagem com KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[0184] Anticorpos monoclonais positivos foram adicionalmente triados para sua capacidade de reconstituir lise por transfectantes NK positivos para Eb6 expressando KIR2DL1 de células alvo positivas para Cw4. As células NK expressando os receptores inibitórios específicos para HLA de classe I foram usados como células efetoras contra células alvo expressando um ou mais alelos GLA-C (Figuras 5 e 6). Ensaios de citotoxicidade foram realizados como descrito acima. A razão de efetor / alvo é indicada nas Figuras, e os anticorpos foram usados quer a 10 μ g/mL quer a 30 μ g/mL.
[0185] Como esperado, células KIR2DL1+ NK mostraram pouca se alguma atividade citolítica contra células alvo expressando HLA-Cw4. Contudo, na presença de 1-7F9 mAb, as células NK se tornaram incapazes de reconhecer seus ligantes HLA-C e mostraram atividade citolítica forte sobre os alvos Cw4. Por exemplo, as duas linhagens celulares testadas (as linhagens celulares CW4+ EBV e 721.221 transfectada com HLA-Cw4) não foram mortas pelas células KIR2DL1+ NK, mas a inibição pôde ser revertida pelo uso quer de Mab 1-7F9 quer de um mAb Eb6 anti KIR2DL1 convencional. Abs DF200 e panKIR (também referido como NKVSF1) foram comparados com 1-7F9. Os anticorpos 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1 por outro lado não foram capazes de reconstituir lise celular por células NK sobre alvos positivos para Cw4. EXEMPLO 5 ANÁLISE POR BIACORE DAS INTERAÇÕES DE DF200 MAB/KIR2DL1 E DF200 MAB/KIR2DL3 PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
[0186] As proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 foram produzidas em E. coli. cDNAs codificadores de domínio extracelular inteiro de KIR2DL1 e de KIR2DL3 foram amplificados por PCR a partir de vetor pCDM8 clone 47.11 (Biassoni et al., 1993) e de vetor RSVS(gpt)183 clone 6 (Wagtman et al., 1995) respectivamente, usando os seguintes iniciadores: Senso: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCA CAG-3' Anti-senso: 5'-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3'
[0187] Foram clonados em vetor de expressão pML1 em matriz com uma sequência codificadora de sinal de biotinilação (Saulquin et al., 2003).
[0188] Expressão de proteína foi realizada em cepa bacteriana BL21(DE3) (Invitrogen). As bactérias transfectadas foram crescida para OD600=0,6 a 37oC em meio suplementado com ampicilina (100 μ g/mL) e expressão foi induzida por IPTG 1 mM.
[0189] Proteínas foram recuperadas dos corpos de inclusão sob condições desnaturantes (uréia 8 M). Redobramento das proteínas recombinantes foi realizado em tampão Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM contendo L-arginina (400 mM, Sigma) e β-mercapto-etanol (1 mM) na temperatura ambiente, por diminuição da concentração de uréia em uma diálise de seis etapas (uréia 4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M, respectivamente). Glutationa reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM, respectivamente, Sigma) foram adicionadas durante as etapas de diálise com uréia 0,5 M e 0 M. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra tampão Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Proteínas, redobradas, solúveis foram concentradas e então purificadas em uma coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 (Pharmacia; AKTA system).
[0190] Medições de ressonância de plasmon de superfície foram realizadas em uma aparelhagem Biacore (Biacore). Em todos os experimentos de Biacore tampão HBS suplementado com 0,05% de tensoativo P20 serviu como tampão de corrida. IMOBILIZAÇÃO DE PROTEÍNA
[0191] Proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 produzidas como descrito acima foram imobilizadas covalentemente em grupos carboxila na camada de dextrana sobre um Sensor Chip CM4 (Biacore). A superfície do Sensor Chip foi ativada com EDC/NHS (cloridrato de (N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida e N-hidróxi-succinimida, Biacore). Proteínas, em tampão de copulação (acetato 10 mM, pH 4,5) foram injetadas. Desativação dos grupos ativados restantes foi realizada usando etanol-amina 100 mM pH 8 (Biacore).
MEDIÇÕES DE AFINIDADE
[0192] Para medições cinéticas, várias concentrações de anticorpo solúvel (1 x 10-7 a 4 x 10-10 M) foram aplicadas na amostra imobilizada. Medições foram realizadas em uma vazão de fluxo contínuo de 20 μ L/min. Para cada ciclo, a superfície do Sensor Chip foi regenerada por injeção de 5 μ L de NaOH 10 mM, pH 11. O programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) foi usado para análise dos dados. O analito solúvel (40 μ L em concentrações variadas) foi injetado em uma vazão de fluxo de 20 μ L/min em tampão HBS, sobre camadas de dextrana contendo 500 ou 540 unidades de refletância (RU), e 1.000 ou 700 RU KIR2DL1 e KIR2DL3, respectivamente. Dados são representativos de 6 experimentos independentes. Os resultados são mostrados na Tabela 1, abaixo. TABELA 1. ANÁLISE POR BIACORE DE LIGAÇÃO DE DF200 MAB EM KIR2DL1 E EM KIR2DL3 IMOBILIZADAS.
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EXEMPLO 6
ANÁLISE DE LIGAÇÃO COMPETITIVA POR BIACORE DE ANTICORPOS DE MURINO E DE HUMANO ANTI-KIR
[0193] Análise de mapeamento de epítopo foi realizada com anticorpos DF200, Pan2D, gl183 e EB6 de camundongo anti-KIR2D, e com anticorpos 1-4F1, 1-6F1, 1- 6F5 e 1-7F9 de humano anti-KIR2D sobre KIR2DL1 (900 RU), KIR2DL3 (2.000 RU) e KIR2DS1 (1.000 RU) imobilizadas como previamente descrito (Gauthier et al. 1999, Saunal e van Regenmortel 1995).
[0194] Todos os experimentos foram feitos em uma vazão de fluxo de 5 μ L/min em tampão HBS com injeção de 2 min de anticorpos diferentes a 15 μ g/mL. Para cada par de anticorpos análise de ligação competitiva foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa o primeiro anticorpo monoclonal (mAb) foi injetado em proteína alvo KIR2D seguido pelo segundo mAb (sem remover o primeiro mAb) e o valor de RU do segundo mAb (RU2) foi monitorado. Na segunda etapa o segundo mAb foi injetado primeiro, diretamente em proteína KIR2D nua, e o valor de RU de mAb (RU1) foi monitorado. A inibição percentual de segundo mAb ligando em proteína KIR2D pelo primeiro mAb foi calculada por: 100*(1-RU2/RU1).
[0195] Os resultados são mostrados nas Tabelas 2, 3 e 4, nas quais os anticorpos chamados de 'primeiro anticorpo' estão listados na coluna vertical e de 'segundo anticorpo' estão listados na coluna horizontal. Para cada combinação de anticorpo testada, os valores para o nível de ligação direta (RU) dos anticorpos no chip estão listados na tabela, na qual a ligação direta do segundo anticorpo em chip KIR2D está listada na porção superior do campo e o valor para a ligação do segundo anticorpo em chip KIR2D quando o primeiro anticorpo estiver presente está listado na porção inferior do campo. É listada à direita de cada campo a inibição percentual de segunda ligação de anticorpo. Tabela 2 mostra a ligação em um chip KIR2DL1, Tabela 3 mostra a ligação de anticorpos em um chip KIR2DL3, e Tabela 4 mostra a ligação de anticorpos em um chip KIR2DS1. Ligação competitiva de anticorpos de murino DF200, NKVSF1 e EB6, de anticorpos de humano 1- 4F1, 1-7F9 e 1-6F1 em KIR2DL1, KIR2DL2/3 e KIR2DS1 imobilizadas foi avaliada. O mapeamento de epítopo (Figura 7) dos experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR em KIR2DL1 mostrou que (a) o anticorpo 1-7F9 é competitivo com EB6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 e DF200; (b) o anticorpo 1-4F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1 e 1-7F9; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e Eb6, mas não com 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e EB6, mas não com 1-7F9. Mapeamento de epítopo (Figura 8) dos experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR em KIR2DL3 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, gl183 e 1-7F9; 1-7F9 é competitivo com DF200, gl183 e 1-4F1, mas não com NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e gl183, mas não com 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e 1-7F9, mas não com GL183. Mapeamento de epítopo (Figura 9) dos experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR em KIR2DS1 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200 e 1-7F9; (b) 1-7F9 é competitivo com 1-4F1 mas não é competitivo com DF200 e NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200 e 1-4F1, mas não com 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1 e 1-4F1, mas não com 1-7F9.
EXEMPLO 7 TITULAÇÃO DE MAB ANTI-KIR COM CÉLULAS NK DE MACACO CINOMOLGO
[0196] Anticorpo NKVSF1 anti-KIR foi testado para sua capacidade de ligar em células NK de macacos cinomolgo. Ligação do anticorpo em células NK de macaco cinomolgo é mostrada na Figura 10. PURIFICAÇÃO DE PBMC DE MACACO E GERAÇÃO DE MASSA DE CÉLULA NK POLICLONAL
[0197] PBMC de macaco cinomolgo foi preparado em tubo de CPT citrato de sódio (Becton Dickinson). Purificação de células NK foi realizada por depleção negativa (kit de enriquecimento em células KK de macaco, Stem Cell Tecnonology). Células NK foram cultivadas sobre células alimentadoras de humano irradiadas, 300 U/mL de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1 ng/mL de Fitoemaglutinina A (Invitrogen, Gibco) para obter populações de células NK policlonais. Células NK (massa NK dia 16) foram incubadas com quantidades diferentes de Pan2D mAb seguido por fragmentos F(ab')2 conjugados com PE de anticorpos IgG (H+L) de cabra anti-camundongo. A percentagem de células positivas foi determinada com um controle isotípico (IgG1 de camundongo purificada). Amostras foram feitas em duplicata. Intensidade de fluorescência média = MFI.
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EXEMPLO 8 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE LIGAÇÃO DE DF200 E DE PAN2D EM KIR2DL1
[0198] Modelagem em computador dos domínios extra-celulares de KIR2DL1, -2, e -3 (KIR2DL1-3), baseado em suas estruturas de cristal publicadas (Maenaka et al. (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al. (2000)), previu o envolvimento de aminoácidos R1311 na interação entre KIR2DL1 e os anticorpos monoclonais (mAb's) DF200 e pan2D de camundongo cruzadamente reativos com KIR2DL1 e com KIR2DL1-3. Para verificar isto, proteínas de fusão foram preparadas consistindo do domínio extra-celular completo de KIR2DL1 (aminoácidos H1-H224), quer de tipo selvagem quer pontualmente-mutada (por exemplo R131W2), fusionada em Fc humano (hFc). O material e os métodos usados para produzir e avaliar as várias proteínas de fusão KIR2DL1-hFc tem sido descritos (Winter e Long (2000)). Em resumo, vetores de cDNA codificadores de KIR2DL1(R131W)-hFc foram gerados, por mutagênese baseada em PCR (Quickchange II, Promega) de CL42-Ig, um vetor de cDNA publicado para a produção de KIR2DL1-hFc de tipo selvagem (Wagtman et al. (1995)). KIR2DL1-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc foram produzidas em células COS7 e isoladas de meio de cultura de tecido, essencialmente como descrito (Wagtman et al. (1995)). Para testar seu dobramento correto, KIR2DL1-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc foram incubadas com células LCL721.221 que expressam quer HLA-Cw3 (não ligante de KIR2DL1) quer HLA-Cw4 (ligante de KIR2DL1), e a interação entre proteínas de fusão KIR-Fc e as células foi analisada por FACS, uma técnica padrão para o estudo de interações de proteína em superfície celular. Um exemplo de experimentos independentes é dado na figura 11, painel A. Como predito da literatura, nenhumas das proteínas de fusão KIR2DL1-hFc ligaram-se em células LCL721.221 expressando HLA-Cw3. Em contraste, ambas KIR2DL1-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc ligaram-se em células LCL721.221 expressando HLA-Cw4, confirmando deste modo seu dobramento correto. 1 - Código de aminoácido de letra única 2 - Substituição de W por R na posição 131 de aminoácido (da terminação N) em KIR2DL1
[0199] A ligação de KIR2DL1-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc em mAb's (DF200, pan2D, EB6 e GL183) específicos para KIR foi estudada usando ELISA, uma técnica padrão para estudar interações de proteína. Em resumo, KIR2DL1-hFc e KIR2DL1(R131W)-hFc foram ligadas em placas de 96 cavidades via anticorpos de cabra anti-humano, após o qual os mAb's específicos para KIR foram adicionados em várias concentrações (0-1 μ g/mL em PBS). As interações entre variantes de KIR2DL1- hFc e mAb's foram visualizadas por espectrofotometria (450 nm), usando anticorpos secundários copulados em peroxidase específicos para anticorpos de camundongo para converter o substrato TMB. Um exemplo de experimentos independentes é dado na Figura 11, painel B. Enquanto que mAb GL183 específico para KIR2DL2-3 não foi capaz de se ligar em quaisquer proteínas de fusão KIR2DL1-hFc, os mAb EB6, DF200 e pan2D específicos para KIR2DL1 ligaram em variantes KIR2DL1-hFc em um modo dependente da dosagem. A única mutação pontual (R131W) afetou a ligação de DF200 e pan2D com uma redução na ligação comparada com o tipo selvagem de ~10% em concentração maiores de mAb (1 μ g/mL), confirmando que R131 é parte do sítio de ligação de DF200 e pan2D é domínio extra-celular 2 de KIR2DL1.
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[0212] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, aqui citadas são por meio desta incorporadas como referências na mesma extensão se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada como referência e se estivesse aqui descrita em sua totalidade.
[0213] Todos os cabeçalhos e sub-cabeçalhos são aqui usados apenas por conveniência e não devem ser entendidos em nenhuma maneira como limitando a invenção.
[0214] Qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas possíveis variações está incluída na invenção a não ser que seja aqui indicado de outra maneira ou claramente diferentemente contradito pelo contexto.
[0215] Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referências semelhantes como aqui usados no contexto da descrição da invenção são para serem entendidos como cobrindo tanto o singular quanto o plural a não ser que seja aqui diferentemente indicado ou claramente contradito pelo contexto.
[0216] Recitação de faixas de valores aqui é meramente intencionada para servir como um método estenográfico de referência individual a cada valor separado caindo dentro da faixa, a não ser que seja aqui diferentemente indicado, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse aqui individualmente recitado. A não ser que seja indicado de outro modo, todos os valores exatos aqui proporcionados são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exatos exemplares proporcionados com respeito a um fator ou a uma medida particular podem ser considerados também proporcionando uma medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de", onde apropriado).
[0217] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que seja indicado de outra maneira ou diferentemente claramente contradito pelo contexto.
[0218] O uso de qualquer um dos ou de todos os exemplos, ou de linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui proporcionados, é intencionado meramente para iluminar melhor a invenção e não põe uma limitação sobre o escopo da invenção a não ser que seja indicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendida como indicando que qualquer elemento é essencial para a prática da invenção a não ser que na mesma medida seja explicitamente enunciado.
[0219] A citação e a incorporação de documentos de patente aqui são feitas apenas por conveniência e não refletem qualquer visão de validade, patenteabilidade e/ou executoriedade de tais documentos de patente.
[0220] A descrição aqui de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usado termos tais como "compreendendo", "possuindo", "incluindo" ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos é intencionada para proporcionar suporte para um aspecto ou uma modalidade semelhante da invenção que "consiste de", "consiste essencialmente de", ou "substancialmente compreende" aquele elemento particular ou aqueles elementos particulares, a não ser que seja enunciado de outro modo ou seja claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo daquele elemento, a não ser que seja enunciado de outro modo ou seja claramente contradito pelo contexto).
[0221] Esta invenção inclui todas as modificações e todos os equivalentes do tema recitado nos aspectos ou nas reivindicações aqui apresentados(as) na extensão máxima permitida pela lei aplicável.

Claims (10)

1. Método de selecionar um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que citado anticorpo monoclonal se liga à KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e o citado anticorpo monoclonal é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR2DL1- e/ou KIR2DL2/3- de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3, em que o método compreende as etapas de: (a) fornecer um agregado de anticorpos monoclonais produzidos por células B expostas a um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR inibitório selecionado de KIR2DL1 ou KIR2DL2/3; (b) selecionar anticorpos de (a) que se ligam ao citado polipeptídeo KIR inibitório; (c) selecionar anticorpos monoclonais de (b) que reagem cruzadamente com KIR2DL1 e KIR2DL2/3; e (d) selecionar anticorpos monoclonais de (c) que são capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR2DL1- e/ou KIR2DL2/3- de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3; no qual a ordem das etapas (c) e (d) é opcionalmente invertida.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o citado anticorpo selecionado na etapa (c) ou (d) não é NKVSF1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o citado método compreende uma etapa adicional (e) de selecionar anticorpos monoclonais de (d) que compete com anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, número de registro CNCM I-3224, para se ligar a KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3, em que as etapas (c), (d), e (e) podem ser realizadas em qualquer ordem.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de preparar fragmentos de ligação em antígeno dos anticorpos monoclonais selecionados.
5. Método de selecionar um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação em antígeno, caracterizado pelo fato de que o citado anticorpo ou seu fragmento de ligação em antígeno se liga a KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e o citado anticorpo ou seu fragmento de ligação em antígeno é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR2DL1- e/ou KIR2DL2/3 de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3, em que o método compreende as etapas de: (a) selecionar, de uma biblioteca ou de um repertório, um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação em antígeno que reage cruzadamente com KIR2DL1 E KIR2DL2/3; e (b) selecionar um anticorpo ou um seu fragmento de ligação em antígeno de (a) que é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR2DL1- e/ou KIR2DL2/3- de citotoxicidade de célula NK em uma população de células NK expressando KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o citado anticorpo selecionado na etapa (b) não é NKVSF1.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o citado método compreende uma etapa adicional (c) de selecionar um anticorpo ou seu fragmento de ligação em antígeno de (b) que compete com anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, número de registro CNCM I-3224, para se ligar a KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3, em que as etapas (a), (b), e (c) podem ser realizadas em qualquer ordem.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de preparar fragmentos de ligação em antígenos dos anticorpos monoclonais selecionados.
9. Método de detectar a presença de células NK possuindo KIR2DL1 e/ou KIRDL2/3 sobre sua superfície celular em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) contatar a citada amostra com um anticorpo monoclonal, compreendendo a CDRs de região variável leve DF-200 descrita na SEQ ID NOS: 3, 5, e 7, e a CDRs de região variável pesada DF-200 descrita na SEQ ID NOS: 10, 11, e 12, in vitro, no qual o citado anticorpo está conjugado ou covalentemente ligado em um grupo detectável; e b) detectar a presença de citado anticorpo na citada amostra.
10. Método de purificar de uma amostra células NK possuindo KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3 sobre sua superfície celular, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) contatar a citada amostra com um anticorpo monoclonal compreendendo a CDRs de região variável leve DF-200 descrita na SEQ ID NOS: 3, 5, e 7, e a CDRs de região variável pesada DF-200 descrita em SEQ ID NOS: 10, 11, e 12, sob condições que permitem que as citadas células NK possuindo KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3 sobre sua superfície celular se liguem no citado anticorpo, no qual o citado anticorpo está conjugado ou covalentemente ligado em um suporte sólido; e b) eluir as citadas células NK ligadas do citado anticorpo conjugado ou covalentemente ligado em um suporte sólido.
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