CN105283543A - 使用绵羊b细胞产生抗体的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文报道了用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养绵羊B细胞的合并物或单一沉积的绵羊B细胞的培养系统。

Description

使用绵羊B细胞产生抗体的方法及其用途
本专利申请在B细胞培养领域中。本文报道了这样的培养系统，其用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate)存在的情况下刺激和扩增绵羊来源的分泌抗体的细胞，诸如活化的B细胞、成浆细胞以及分离自免疫的绵羊的B细胞。
发明背景
已经报道，来自不同物种的分离的B细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实践中，这通常通过将原代B细胞与杂交瘤伴侣融合生成永生的B细胞系或永生化来克服。对于兔，还开发了浆细胞瘤融合伴侣(Spieker-Polet, H., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 9348-9352)，但杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于绵羊，也已经描述了杂交瘤技术(参见例如Osborne, J.,等人, Hybridoma 18 (1999) 183 -191)，但这些杂交瘤倾向于不稳定且具有不良产率。对于B细胞在体外的持续存活，必需提供必要的活化刺激和存活因子。已经描述了多种化合物，诸如IL-2、IL-4、IL-10和其他(参见例如Zubler, R.,等人, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363, 和J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183)。
在生理学上，B细胞在遇到特异性抗原加上额外活化之后，例如经由CD40/CD40L途径(综述于Néron, S.,等人, Arch. Immunol. Ther. Exp. 59 (2011) 25-40)和/或经由源自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树突状细胞或T 细胞辅助之后被活化。
在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定化的抗CD40抗体或CD40L来模拟CD40/CD40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并且仅描述了与使用不同饲养混合物(例如Zubler混合物; IL-4, IL-10,等) (Zubler, R., 上文)或胸腺细胞上清液(TSN)的进一步所需刺激剂的组合。
Weitkamp, J-H.,等人, (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237)报道了从用荧光病毒样颗粒选择的单抗原特异性B细胞生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。产生针对多种同源抗原的多种分离抗体的方法报道于US 2006/0051348中。用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法报道于US 2007/0269868中。用于制备免疫球蛋白文库的方法报道于WO 2007/031550中。
Griebel, P.J.,等人报道了克隆未转化的绵羊B细胞(J. Immunol. Meth. 237 (2000) 19-28)。Griebel, P.,等人报道了CD40信号传导诱导了对γ链-常见的细胞因子家族的多个成员的B细胞响应性(Int. Immunol. 11 (1999) 1139-1147)。Miyasaka, M.和Dudler, L.报道了绵羊未成熟的B细胞在暴露于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯之后的分化(Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 74 (1984) 281-283)。Miyasaka, M.,等人报道了绵羊中B淋巴细胞的分化：I. 回肠淋巴集结细胞的表型分析和回肠淋巴集结中的sIg+细胞的前体群体的证明(Immunol. 53 (1984) 515-523)。Sedgmen, B.J.,等人报道了优化分泌绵羊抗体的细胞测定用于检测外周血白细胞中的抗原特异性免疫球蛋白产生(Immunol. Cell Biol. 81 (2003) 305-310)。
发明概述
本文报道了用于从绵羊B细胞开始快速、有效且可重复地生成绵羊抗体且包括至少一个培养步骤的新方法。
本文进一步报道了佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)作为添加剂用于培养绵羊B细胞以提供高效的绵羊B细胞刺激和培养系统的用途。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养绵羊B细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞一起培养绵羊B细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起共培养绵羊B细胞和饲养细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于产生绵羊抗体的方法，其包括在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的绵羊B细胞和从培养上清液回收所述抗体、从而产生绵羊抗体的步骤。
在一个实施方案中，所述绵羊B细胞是幼稚绵羊B细胞或未成熟绵羊B细胞。
在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性的B细胞(IgG+)。IgG 阳性的B细胞递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性和CD45R阳性的B细胞(IgG+CD45R+)。IgG 阳性的B细胞递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性和CD21阳性的B细胞(IgG+CD21+)。IgG 阳性的B细胞递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。
如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合至抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的绵羊B细胞的合并物或单一沉积的分泌抗体的绵羊B细胞，
b) 分离编码抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸且分离编码抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，所述抗体特异性结合至抗原，
c) 培养细胞，所述细胞包含b)中分离的核酸或其变体，其编码在一个或多个表达盒内的轻和/或重链可变结构域的人源化版本，
d) 从细胞或培养基回收抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a) 提供分泌抗体的(成熟的)B细胞的群体(获得自绵羊的血液)，
b) 用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料)染色B细胞群体的细胞，
c) 在单个容器(在一个实施方案中容器是多孔板的孔)中沉积染色的B细胞群体的单一细胞或来自染色的B细胞群体的细胞合并物，
d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养沉积的单个B细胞，
e) 测定单个B细胞或B细胞合并物的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸，
g) 将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体，
h) 将所述核酸引入细胞中，
i) 培养所述细胞，且从所述细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a) 提供分泌抗体的(成熟的)绵羊B细胞的群体，
b) 用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料)染色绵羊B细胞群体的细胞，
c) 在单个容器(在一个实施方案中容器是多孔板的孔)中沉积染色的绵羊B细胞群体的单一细胞或来自染色的绵羊B细胞群体的细胞合并物，
d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养沉积的绵羊B细胞，
e) 测定绵羊B细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸，
g) 将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体，
h) 将所述核酸引入细胞中，
i) 培养所述细胞，且从所述细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
在一个实施方案中，细胞合并物包含约10个B细胞至约1,000,000个 B细胞。在一个实施方案中，所述合并物包含约500个B细胞至约100,000 个B细胞。在一个实施方案中，所述合并物包含约500个B细胞。
如本文报道的一个方面是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养分泌抗体的绵羊B细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是用于培养绵羊B细胞的方法，其包括与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养单一沉积的绵羊B细胞或绵羊B细胞的合并物的步骤。
如本文报道的一个方面是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养绵羊B细胞中用于改善细胞生长的用途。
如本文报道的一个方面是用于改善绵羊B细胞的细胞生长的方法，其包括与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养单一沉积的绵羊B细胞或绵羊B细胞的合并物的步骤。
发明详述
本文报道的主题提供了用于从绵羊B细胞开始快速、有效且可重复生成绵羊、嵌合(即绵羊-非绵羊物种嵌合)或人源化抗体且包括至少一个培养步骤的普遍适用的方法。已经发现，与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)不存在的情况下相比，将佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)添加至培养基可以改善绵羊B细胞(即绵羊B细胞，单一沉积的细胞(a single deposited cell)或作为细胞的合并物)的生长特征，可以更迅速地生长至高细胞密度。因此，短时间内在培养上清液中获得高绵羊B细胞密度和相应地高IgG浓度是可能的。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养绵羊B细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞一起培养绵羊B细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起共培养绵羊B细胞和饲养细胞的方法。
如本文报道的一个方面是用于产生绵羊抗体的方法，其包括在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的绵羊B细胞和从培养上清液回收所述抗体、从而产生绵羊抗体的步骤。
如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合至抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
a) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的绵羊B细胞的合并物或单一沉积的分泌抗体的绵羊B细胞，
b) 分离编码抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸且分离编码抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，所述抗体特异性结合至抗原，
c) 培养细胞，所述细胞包含b)中分离的核酸或其变体，其编码在一个或多个表达盒内的轻和/或重链可变结构域的人源化版本，
d) 从所述细胞或培养基回收抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
如本文报道的一个方面是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养分泌抗体的绵羊B细胞中的用途。
如本文报道的一个方面是用于培养绵羊B细胞的方法，其包括与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养单一沉积的绵羊B细胞或绵羊B细胞的合并物的步骤。
如本文报道的一个方面是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养绵羊B细胞中用于改善细胞生长的用途。
如本文报道的一个方面是用于改善绵羊B细胞的细胞生长的方法，其包括与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养单一沉积的绵羊B细胞或绵羊B细胞的合并物的步骤。
本领域技术人员已知的方法和技术(其用于实施本发明)描述于例如Ausubel, F.M.,编, Current Protocols in Molecular Biology, 第I至III卷 (1997), Wiley and Sons; Sambrook, 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)。
定义
出于本文的目的，“受体人构架”是包含源自人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架，如下文所定义。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
如本申请内所使用的术语“氨基酸”表示羧基α-氨基酸的组，其可以直接或以前体形式由核酸编码。单个氨基酸可以通过由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每个氨基酸由至少一个密码子编码。不同密码子对相同氨基酸的编码被称为“遗传密码的简并性”。如本申请内所使用的术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸且包含丙氨酸(三字母密码：ala，一字母密码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
术语“绵羊-非绵羊物种嵌合抗体”是指包含亲本绵羊抗体的可变结构域和来自不同物种的抗体(诸如例如来自人抗体、鼠抗体或兔抗体)的恒定区的抗体。术语“绵羊-非绵羊物种嵌合抗体”表示包含亲本绵羊抗体的可变区和不同物种的恒定区的抗体。
抗体的“类型”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“克隆”表示产生自/源自单一B细胞的分裂(dividing)且分泌抗体的B细胞群体。因此，B细胞克隆产生单克隆抗体。
如本文所使用，术语“表达”是指细胞内发生的转录和/或翻译过程。可基于细胞中存在的相应mRNA的量来测定细胞中目的核酸序列的转录水平。例如，可通过RT-PCR或Northern杂交对从目的序列转录的 mRNA进行定量(参见 Sambrook, 等人, 1989, 上文)。可通过多种方法，例如通过ELISA，通过测定多肽的生物活性，或通过使用不依赖此活性的测定，诸如Western印迹或放射免疫测定，使用识别且结合至多肽的免疫球蛋白定量目的核酸编码的多肽(参见Sambrook, 等人, 1989, 上文)。
“表达盒”是指含有对于细胞中至少所含核酸的表达必需的调节元件(诸如启动子和多腺苷酸化位点)的构建体。
作为瞬时表达或持久表达进行基因的表达。目的多肽通常是分泌的多肽，且因此含有N-末端延伸(也称为信号序列)，其对于多肽通过细胞壁转运/分泌至细胞外介质中是必需的。通常，信号序列可源自编码分泌的多肽的任何基因。如果使用异源信号序列，则其优选为被宿主细胞识别和加工的(即通过信号肽酶切割的)序列。对于酵母中的分泌，例如，待表达的异源基因的天然信号序列可以被源自分泌基因的同源酵母信号序列取代，所述同源酵母信号序列诸如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属 (Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (Pichia)和汉森氏酵母属(Hansenula)α-因子前导序列，US 5,010,182中描述的第二种)、酸性磷酸酶信号序列，或白色念珠菌(C. albicans)葡萄糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞表达中，目的蛋白的天然信号序列是令人满意的，尽管其他哺乳动物信号序列也可以是合适的，诸如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列（例如用于人或鼠来源的免疫球蛋白），以及病毒分泌信号序列，例如单纯疱疹糖蛋白D信号序列。编码此前区段的DNA片段框内连接，即可操作连接，至编码目的多肽的 DNA片段。
术语“实验动物”表示非人动物。在一个实施方案中，所述实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、美洲鸵、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、 两栖动物、鲨鱼和爬行类动物。在一个实施方案中，所述实验动物是绵羊。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其含有恒定区的至少一部分。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸的编号根据EU编号系统，也称为EU 索引，如描述于Kabat, E.A., 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, 第1-3卷。
术语“饲养混合物(feeder mix)”表示不同添加剂，诸如生长因子、细胞因子和/或促进B细胞的活化和/或存活和/或抗体分泌的其他蛋白的组合。饲养混合物可以是例如从胸腺细胞的培养上清液(TSN)获得的天然的饲养混合物(其是细胞因子的非限定组合)，或饲养混合物可以是合成的饲养混合物，例如包含IL-21和/或IL-2和/或IL-6的混合物。
“构架”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的 FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“细胞”或“宿主细胞”是指其中可以转染或转染例如编码异源多肽的核酸的细胞。术语“细胞”包括用于扩增质粒的原核细胞和用于表达核酸且产生编码的多肽的真核细胞两者。在一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。在一个实施方案中，CHO细胞是CHO K1细胞(ATCC CCL-61或DSM ACC 110)或CHO DG44细胞(也称为CHO-DHFR[-]、DSM ACC 126)或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan, D., 等人, Biochemistry 26 (1987) 2959-2963)，或CHO-S细胞、或Super-CHO细胞(Pak, S.C.O., 等人 Cytotechnol. 22 (1996) 139-146)。在一个实施方案中，HEK细胞是HEK293细胞。如果这些细胞不适合于在无血清培养基或悬浮液中生长，则应当在目前方法中使用之前进行适应。如本文所使用，表述“细胞”包括主体细胞及其后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代主体细胞和源自其中的培养物，而不考虑转移或亚培养的次数。还理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量中不必精确相同。包括与在最初转化的细胞中筛选的具有相同的功能或生物活性的变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的或源自利用人抗体所有组成成分或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat, E.A., 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, 第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL， 亚组是如Kabat等人, 上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于 VH，亚组是如Kabat等人, 上文中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域中的基本上所有，其中HVR(例如，CDR)中的所有或基本上所有对应于非人抗体的那些，且FR的所有或基本上所有对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
如本文所使用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列 (“互补决定区”或“CDR”) 上是高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1、H2、H3)，和VL中的三个(L1、L2、L3)。
本文的HVR包括
(a) 存在于氨基酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)的高变环(Chothia, C.和Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 存在于氨基酸残基24-34 ( L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)的CDR (Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 存在于氨基酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)和93-101 (H3)的抗原接触 (MacCallum等人 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；和
(d) (a)、(b)和/或(c)的组合、包括HVR氨基酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)和94-102 (H3)。
除非另有指明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人, 上文编号。
术语“标记”表示表面标志物的存在或不存在，其可以通过添加特异性结合和标记的抗表面标志物抗体来确定。因此，在与各自的特异性结合和标记的抗表面标志物抗体孵育后，表面标志物的存在，例如在荧光标记的情况下通过荧光的出现来确定，而表面标志物的不存在通过荧光的不存在来确定。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的各抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的产生过程中产生的可能的变体抗体以外，此类变体通常以小量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术制备待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链构成。从N至C末端，各重链具有可变区(VH)，又称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C末端，各轻链具有可变区(VL)，又称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体轻链可指定为两种类型(称作kappa (κ)和lambda (λ))之一。
“核酸”或“核酸序列”(所述术语在本申请中可互换使用)是指由各核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或RNA中的ｕ)组成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修饰。该多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。该定义中也涵盖天然存在的多核苷酸分子，其中一个或多个核苷酸改变(例如通过诱变)、缺失或添加。核酸可以是分离的或整合在另一核酸中，例如在表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列。
本领域技术人员众所周知将例如多肽的氨基酸序列转化成编码该氨基酸序列的对应核酸序列的程序和方法。因此，核酸的特征在于其由各核苷酸组成的核酸序列，同样在于由其编码的多肽的氨基酸序列。
术语“特异性结合”及其语法等效术语表示，抗体以10-7 M或更小、在一个实施方案中以10-8 M -10-13 M、在进一步实施方案中以10-9 M -10-13 M的解离常数(Kd)结合其目标。所述术语进一步用于表示，所述抗体不特异性结合至存在的其他生物分子，即其以10-6 M或更大、在一个实施方案中以10-6 M -1M的解离常数(Kd)结合至其他生物分子。
“转染载体”是提供在宿主细胞中表达转染载体中所包含的编码核酸/结构基因的所有所需元件的核酸(也表示为核酸分子)。转染载体包含原核质粒增殖单位，例如对于大肠杆菌，进而包含原核复制起点，和赋予对原核选择剂抗性的核酸，转染载体进一步包含，赋予对真核选择剂抗性的一种或多种核酸和编码目的多肽的一种或多种核酸。优选的是各自位于表达盒内的赋予对选择剂抗性的核酸和编码目的多肽的核酸，由此各表达盒包含启动子、编码核酸和转录终止子，其包括多腺苷酸化信号。基因表达通常置于启动子控制下，并且此结构基因被称为“可操作连接至”所述启动子。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子可操作连接。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重或轻链中参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中各结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区 (HVR)。(参见例如Kindt, T.J.,等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 第91页)。单一VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域以筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如，Portolano, S.,等人, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T.,等人, Nature 352 (1991) 624-628)。
如本文所使用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“年轻动物”表示在性成熟发生之前的动物。年轻仓鼠，例如，为小于6周龄，特别是小于4周龄。年轻小鼠，例如，为小于8周龄， 特别是小于5周龄。
免疫
在如本文报道的方法中，使用/处理从绵羊获得的B细胞。
在一个实施方案中，B细胞是绵羊B细胞。在一个实施方案中，从免疫绵羊或针对具体抗原接种后的绵羊获得绵羊B细胞。
B 细胞的来源和分离
免疫实验动物的血液提供了高度多样性的产生抗体的B细胞。由其获得的B细胞通常分泌抗体，其在CDR内几乎没有相同的或重叠的氨基酸序列，因此显示了高度多样性。
在一个实施方案中，从免疫后4天直至免疫后15天或直至最近加强获得例如从实验动物的血液获得的实验动物的B细胞。
在一个实施方案中，从免疫或最近加强后4天直至至多9天后获得 B - 细胞。
该时间跨度允许如本文报道的方法的高度灵活性。在该时间跨度内，可能提供最亲和(affine)抗体的B细胞从脾迁移至血液(参见例如Paus, D.,等人, JEM 203 (2006) 1081–1091; Smith, K.G.S.,等人, The EMBO J. 16 (1997) 2996–3006; Wrammert, J.,等人, Nature 453 (2008) 667-672)。
共培养前的选择步骤
可从外周血单核细胞(PBMC)富集产生特异性结合抗原的抗体的 B细胞。因此，在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)获得B细胞或从外周血单核细胞(PBMC)富集B细胞的合并物。
可以通过使用淘选方法分别减少或富集不产生结合目的抗原的抗体的细胞，或同样地减少或富集产生结合至目的抗原的抗体的细胞。其中结合伴侣呈现为结合至表面且在进一步处理结合的细胞的情况下，在细胞群体中选择性富集与结合伴侣结合的细胞，或者在进一步处理溶液中剩余的细胞的情况下，在细胞群体中减少与结合伴侣结合的细胞。
如本文报道的方法在一个实施方案中包括选择步骤，其中基于细胞表面标志物和荧光活化的细胞分选/门控选择产生特异性抗体的B细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B细胞。对于从不同实验动物物种选择B细胞，可以使用不同的细胞表面标志物。
通过标记非目标细胞群体和非特异性结合的淋巴细胞，可能选择性耗竭这些细胞。在该耗竭步骤中，通常可实现非完全的耗竭。虽然耗竭不是定量的，但其提供了成功荧光标记剩余细胞的优势，因为可减少或甚至尽可能减少干扰细胞的数目。
可以使用不同的表面标志物标记不同的细胞群体，诸如CD3+-细胞(T-细胞)、CD19+-细胞(通常是B细胞)、IgM+-细胞(成熟的幼稚B细胞)、IgG+-细胞(成熟的B细胞)、CD38+-细胞(例如成浆细胞)和IgG+CD38+-细胞(前浆细胞)。
在一个实施方案中，标记/选择IgG阳性且CD45R阳性(IgG+CD45R+)的绵羊B细胞。
在一个实施方案中，标记/选择IgG阳性且CD21阳性(IgG+CD21+)的绵羊B细胞。
用于选择成熟的IgG+-B细胞，诸如记忆B细胞、成浆细胞和浆细胞的免疫荧光标记可以用于如本文报道的方法中。
对于B细胞的选择或富集，单标记或双标记或三标记细胞。
单细胞沉积 (depositing)
如本文报道的方法在一个实施方案中包括将B细胞群体的B细胞沉积为单细胞的步骤。
在一个实施方案中，通过荧光活化的细胞分选(FACS)沉积为单细胞。
在一个实施方案中，特异性标记的B细胞沉积为单细胞。在一个实施方案中，标记是用荧光标记的抗体标记细胞表面标志物。
在一个实施方案中，如本文报道的方法提供了单克隆抗体。
在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞且成熟的B细胞沉积为单细胞。
用于从实验动物的血液获得的B细胞的免疫荧光标记也可以用于标记从实验动物的脾和其他免疫器官中获得的B细胞。
多细胞沉积
如本文报道的方法在一个实施方案中包括沉积B细胞合并物的步骤。在该B细胞合并物中，从外周血进行磁力亲和珠或FACS分离后，每孔沉积总数目的B细胞。
在一个实施方案中，沉积约50个B细胞。
在一个实施方案中，沉积约500个B细胞。
在一个实施方案中，沉积约2,500个B细胞。
在单一实验中，沉积的B细胞的总数，例如对于绵羊B细胞，可以增加直至90,000个B细胞或更多。
培养
本文报道了与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养产生抗体的B细胞。
因此，在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，B细胞，作为B细胞的合并物或作为单一沉积的B细胞，与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和饲养细胞一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和饲养细胞存在的情况下进行培养。
已经培养约3、4、5、6、7、8、10、15或21天后，在上清液中获得足够量/和数目的抗体分子。用由此提供量的抗体，可以进行不同分析，以便更详细地表征抗体，例如关于结合特异性。用在筛选/选择过程中的该早期阶段的对抗体的改善表征，可能减少所需的必须进行的核酸分离和测序反应的数目。
在一个实施方案中，培养时间为约5 至10 天。在一个特定实施方案中，培养时间为约7 天。
如本文报道的所有方法的一个实施方案是在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、饲养细胞和饲养混合物存在的情况下培养产生抗体的B细胞。
所述饲养混合物可以是天然的饲养混合物或合成的饲养混合物。
天然的饲养混合物是例如胸腺细胞上清液(TSN)。其含有适当的可溶因子，但该试剂是异质的，成分描述并不充分并且在动物之间不同。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，饲养混合物是绵羊胸腺细胞培养上清液。在一个实施方案中，B细胞是绵羊B细胞。
在一个实施方案中，从各年轻动物胸腺的胸腺细胞的培养中获得胸腺细胞培养上清液。与从成体动物血液中分离胸腺细胞相比，尤其适合使用年轻动物的胸腺。
通常，如本文报道的方法中的与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养绵羊B细胞的步骤可以在许多额外步骤之前，且也可以在许多额外步骤之后。
在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，所述产生抗体的B细胞和饲养细胞的共培养是在绵羊胸腺细胞上清液(绵羊TSN)和/或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和/或福尔马林固定的葡萄球菌菌株A Cowan 1颗粒(SAC)存在的情况下。在一个实施方案中，所述B细胞是绵羊B细胞，且所述饲养细胞是鼠EL4B5细胞。在一个实施方案中，在与培养基一起培养开始时添加PMA和SAC。
在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，产生抗体的绵羊B细胞和饲养细胞的培养是在PMA和SAC存在的情况下，由此在与培养基一起培养开始时添加PMA和SAC。
已经发现，使用包含B细胞和PMA的培养基系统导致B细胞的改善增殖，即与不包含PMA的系统相比， 所述B细胞更快速地分裂并且在更短的时间内在培养上清液中分别可以获得更高的细胞密度和抗体滴度。
已经进一步发现，对于绵羊B细胞，包含PMA、绵羊TSN和SAC的共培养系统尤其适合。
通过 IgG 产生表征共培养的细胞
对于共培养后分泌的IgG的(定性和定量)测定，通常可以使用本领域技术人员已知的所有方法，诸如ELISA。在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，使用EILSA。
根据表征结果，可以获得，即选择，B细胞克隆。
通过扩增和增殖表征共培养的细胞
对于细胞扩增的(定性和定量)测定，可以使用不同的读出系统(商品化的细胞活性测试“细胞滴度发光”(Promega)、CFSE稀释方法、3HThymidin掺入或细胞培养图像)评价共培养的B细胞的增殖或活力。
mRNA 的分离、克隆与测序
产生高抗体滴度的B细胞克隆提供了一些量的允许使用简并PCR 引物的编码(同源)单克隆轻链和重链可变区的mRNA，且避免了对高度特异性引物的需要。也减少了所需要的PCR循环数。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR使用针对轻链和重链可变结构域的简并PCR引物。
从B细胞，可以分离总mRNA且逆转录为cDNA。使用各引物，可以扩增编码同源VH和VL区的核酸。
在如本文报道的所有方法的一个实施方案中，所述氨基酸序列源自扩增的编码可变结构域的核酸。编码可变结构域的核酸的确切的起点和终点通过将例如QVQL/QVRL的氨基酸序列定位至VSS/VSK (VH-区域)，例如将QAVLT定位至VLGQP (VL λ-区域)，例如DVVL/ DIQV定位至VEIKRSD (VL κ区域)来鉴定。
合并物分析
为了例举本发明，PBMC分离自用KLH-缀合的半抗原免疫的绵羊，且经历使用生物素化的半抗原和磁性链霉抗生物素珠粒的阳性淘选以富集抗原特异性的B细胞。随后，针对表面IgG (sIgG) 和B细胞标志物CD45R或CD21染色B细胞。使用BD FACS Aria细胞分选仪将50个细胞(sIgG+CD45R+或sIgG+CD21+)的合并物分选至96孔板中。将细胞在补充不同因子的培养基中培养，以便鉴定促进B细胞的增殖以及分化为IgG分泌细胞(即浆细胞)的培养基组合物。
在所有实验中，用10％FCS、SAC和绵羊TSN补充基础培养基。在EL4B5饲养细胞存在的情况下培养细胞。
通过体外培养的 sIgG+CD45R+ B 细胞的 IgG 分泌。
在EL4B5饲养细胞存在的情况下，将抗原特异性的sIgG+CD45R+ B细胞的50个细胞/孔的合并物在96孔板中的不同培养基中进行培养。培养一周之后，使用绵羊IgG ELISA分析上清液的绵羊IgG浓度。IMDM作为基础培养基的结果呈现于图1中，DMEM和IMDM作为基础培养基的结果呈现于下表中。
IMDM = Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基
IL-6 =人白介素6
IL-4 =人白介素4
LPS = 脂多糖
PMA = 佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯
DMEM – Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基。
可以看到，基础培养基本身(补充10％ FCS、SAC和绵羊TSN的DMEM或IMDM)没有有效地促进绵羊B细胞的增殖/分化，因为仅分别5 %或18%的孔含有显著浓度的绵羊IgG(> 50 ng/ml)。当用IL-4和/或IL-6或LPS补充基础培养基时，注意到含有IgG的孔的数目的增加。令人惊讶地，当将PMA添加至基本培养基时，发现分别64％或100％的孔含有显著浓度的IgG(> 50 ng/ml)。
对于更详细的分析，定义了4类孔：无产生IgG的细胞(低于检测限值的IgG浓度，即< 10 ng/ml)的孔，具有低IgG浓度(10 - 50 ng/ml)的孔，具有平均IgG浓度(50 -200 ng/ml)的孔和具有高IgG浓度(200-400 ng/ml)的孔。结果呈现于下表中。
IMDM = Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基
IL-6 =人白介素6
IL-4 =人白介素4
LPS = 脂多糖
PMA = 佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯
DMEM – Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基。
可以看到，例如，对于作为基础培养基的IMDM，用IL-6和/或IL-4补充培养基具有相当的效果，导致产生近似60 – 70%的具有平均IgG浓度的孔和一些具有高IgG浓度的孔(近似5 – 9 %的孔)。对于细胞的LPS刺激，获得了类似的结果。用PMA刺激导致产生100％的具有50 – 200 ng/ml范围内的平均IgG浓度的孔。
通过体外培养的 sIgG+CD21+ B 细胞的 IgG 分泌。
在EL4B5饲养细胞存在的情况下，将抗原富集的sIgG+CD21+ B细胞的50个细胞/孔的合并物在96孔板中的所示培养基中进行培养。培养一周之后，使用绵羊IgG ELISA分析上清液的绵羊IgG浓度。IMDM作为基础培养基的结果呈现于图2中，DMEM和IMDM作为基础培养基的结果呈现于下表中。
IMDM = Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基
IL-6 =人白介素6
IL-4 =人白介素4
LPS = 脂多糖
PMA = 佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯
DMEM – Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基。
可以看到，基础培养基(补充10％ FCS、SAC和绵羊TSN的DMEM或IMDM)促进sIgG+CD21+绵羊B细胞的增殖/分化。对于作为培养基的IMDM，近似60％的孔含有显著浓度的绵羊IgG(> 50 ng/ml)。当用IL-4或LPS补充基础培养基时，注意到含有IgG的孔的数目的增加。同样，将PMA添加至培养基增加了含有显著水平的IgG的孔的数目(近似90％)。
对于更详细的分析，定义了4类孔：无产生IgG的细胞(低于检测限值的IgG浓度，即< 10 ng/ml)的孔，具有低IgG浓度(10-50 ng/ml)的孔，具有平均IgG浓度(50-200 ng/ml)的孔和具有高IgG浓度(200-400 ng/ml)的孔。结果呈现于下表中。
IMDM = Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基
IL-6 =人白介素6
IL-4 =人白介素4
LPS = 脂多糖
PMA = 佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯
DMEM – Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基。
可以看到，例如，对于作为基础培养基的IMDM，用IL-4或LPS补充培养基具有相当的效果，导致产生近似70 – 90%的具有平均IgG浓度的孔和一些具有高IgG浓度的孔(近似5 – 10 %的孔)。相反，用PMA刺激导致约50％的孔具有高IgG浓度和约40％的孔具有平均IgG浓度。
单细胞分析
单一 sIgG+CD21+ B 细胞的分选和培养
PBMC分离自用KLH-缀合的半抗原免疫的绵羊，经历阳性淘选用于富集抗原特异性的B细胞，且针对绵羊sIgG和CD21两者进行染色。使用BD FACS Aria细胞分选仪将单细胞分选于96孔板中。在用10％FCS、SAC、绵羊TSN和PMA补充的IMDM中培养细胞。在EL4B5饲养细胞存在的情况下培养细胞。培养一周之后，通过ELISA分析细胞的上清液的IgG浓度。结果显示于图3中。
培养一周之后，总共33％孔含有分泌IgG的B细胞克隆(图3中的左侧柱)。进而，62％的这些具有分泌IgG的克隆的孔含有低IgG浓度(10 - 50 ng/ml，图3中的左侧第二个柱)，24％含有平均IgG浓度(50 - 200 ng/ml，图3中的右侧第二个柱)，且14％含有高IgG浓度(200 - 400 ng/ml，图3中的右侧柱)。
使用抗原特异性ELISA分析分泌的抗体的特异性(数据未显示)。这些ELISA表明，总IgG分泌克隆的38％产生抗原特异性的抗体。
再次进行该实验。PBMC分离自用另一种KLH-缀合的半抗原免疫的绵羊，经历阳性淘选用于富集抗原特异性的B细胞，且针对绵羊sIgG和CD21两者进行染色。使用BD FACS Aria细胞分选仪将双阳性细胞分选于96孔板中。在EL4B5饲养细胞存在的情况下在用10％FCS、SAC、绵羊TSN和PMA补充的IMDM中培养细胞。在对照实验中，在PMA不存在的情况下，使用相同的培养条件培养单细胞。培养一周之后，通过ELISA分析细胞上清液的IgG浓度。在PMA存在的情况下培养一周之后，总共全部孔的约16％含有分泌IgG的B细胞克隆。进而，35％的具有分泌IgG的克隆的孔含有低IgG浓度，35％含有平均IgG浓度且30％含有高IgG浓度。在PMA不存在的情况下，无孔含有分泌IgG的B细胞克隆。
此外，使用抗原特异性ELISA分析分泌的抗体的特异性(数据未显示)。这些ELISA表明，分泌IgG的克隆的29％产生抗原特异性的抗体。
实验结果概述于下表中。
具体实施方案
1. 用于培养B细胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养B细胞。
2. 用于产生绵羊抗体的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的B细胞，和
从培养上清液回收所述抗体，从而产生所述抗体。
3. 佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养分泌抗体的B细胞中的用途。
4. 用于改善B细胞的细胞生长的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养B细胞。
5. 根据实施方案1至4中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是绵羊B细胞。
6. 根据实施方案1至5中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是单一沉积的B细胞或沉积的B细胞的合并物。
7. 根据实施方案6的方法，其特征在于所述淀积的B细胞的合并物包含约10个B细胞至约1,000,000个B细胞。
8. 根据实施方案6至7中任一项的方法，其特征在于所述淀积的B细胞的合并物包含约25个B细胞至约100,000个B细胞。
9. 根据实施方案6至8中任一项的方法，其特征在于所述淀积的B细胞的合并物包含约50个B细胞。
10. 根据实施方案1至9中任一项的方法，其特征在于所述培养是额外在饲养细胞存在的情况下/与饲养细胞一起。
11. 根据实施方案10的方法，其特征在于所述饲养细胞是EL4B5细胞。
12. 根据实施方案1至11中任一项的方法，其特征在于所述培养是额外在胸腺细胞上清液(TSN)存在的情况下/与胸腺细胞上清液(TSN)一起。
13. 根据实施方案12的方法，其特征在于所述TSN是绵羊TSN。
14. 根据实施方案1至13中任一项的方法，其特征在于所述培养是额外在福尔马林固定的葡萄球菌菌株A Cowan 1颗粒(SAC)存在的情况下。
15. 根据实施方案1至14中任一项的方法，其特征在于所述培养是在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN、SAC和饲养细胞存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN、SAC和饲养细胞一起。
16. 根据实施方案1至15中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性B细胞(IgG+)。
17. 根据实施方案1至16中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是幼稚B细胞或未成熟B细胞。
18. 根据实施方案1至17中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性且CD45R阳性的B细胞(IgG+CD45R+)。
19. 根据实施方案1至16中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是成熟B细胞。
20. 根据实施方案1至16和19中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性且CD21阳性的B细胞(IgG+CD21+)。
21. 根据实施方案1至20中任一项的方法，其特征在于所述方法用于产生特异性结合抗原的抗体。
22. 根据实施方案1至21中任一项的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养沉积的分泌抗体的B细胞，
b) 分离编码抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸且分离编码抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，所述抗体特异性结合至抗原，
c) 培养细胞，所述细胞包含b)中分离的核酸或其变体，其编码在一个或多个表达盒内的轻和/或重链可变结构域的人源化版本，
d) 从细胞或培养基回收抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
23. 根据实施方案1至22中任一项的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a) 提供分泌抗体的B细胞的群体，
b) 用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料)染色B细胞群体的细胞，
c) 在单个容器(在一个实施方案中容器是多孔板的孔)中沉积染色的B细胞群体的单一细胞或来自染色的B细胞群体的细胞合并物，
d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养沉积的单个B细胞，
e) 测定单个B细胞或B细胞合并物的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸，
g) 将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体，
h) 将所述核酸引入细胞中，
i) 培养所述细胞，且从所述细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
24. 根据实施方案1至23中任一项的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a) 提供分泌抗体的B细胞的群体，
b) 用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料)染色B细胞群体的细胞，
c) 在单个容器(在一个实施方案中容器是多孔板的孔)中沉积染色的B细胞群体的单一细胞或来自染色的B细胞群体的细胞合并物，
d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养沉积的绵羊B细胞，
e) 测定绵羊B细胞的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸，
g) 将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体，
h) 将所述核酸引入细胞中，
i) 培养所述细胞，且从细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。
25. 根据实施方案2和5至24中任一项的方法，其特征在于所述抗体是人源化抗体。
26. 根据实施方案2和5至24中任一项的方法，其特征在于所述抗体是嵌合抗体。
27. 根据实施方案26的方法，其特征在于所述嵌合抗体是绵羊-鼠嵌合抗体或绵羊-兔嵌合抗体或绵羊-人嵌合抗体。
28. 用根据实施方案1至27中任一项的方法获得的抗体。
提供以下实施例、图和序列，以帮助理解本发明，本发明的真正范围记载于所附权利要求中。应当理解，可以在不背离本发明的精神的情况下对所记载的程序进行修改。
附图说明
图1　　通过体外培养的sIgG+CD45R+ B细胞的IgG分泌。
图2　　通过体外培养的sIgG+CD21+ B细胞的IgG分泌。
图3　　单一沉积的特异性sIgG+CD21+ B细胞的分选和培养；最左侧柱：总体IgG阳性孔；中间柱和右侧柱：具有比生产率的总百分数的相对百分数。
实施例
材料和方法
绵羊TSN​​的制备(胸腺细胞上清液)
绵羊胸腺细胞的制备：
胸腺取自Suffolk-Merino绵羊，切成片，且通过细胞滤网捣碎。将胸腺细胞收集RPMI培养基(Gibco, Paisley, UK)中，所述RPMI培养基补充有10 % FCS (Hyclone, Logan, UT, USA)、L-青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1x) (Gibco)、10 mM HEPES (Gibco)、2 mM丙酮酸钠(Gibco)和55 µM 2-巯基乙醇(Gibco)。将细胞以800 x g离心10 min，且再悬浮于培养基中。计数活细胞之后，将细胞悬浮液再次离心，且将细胞沉淀以1x108个细胞/ml再悬浮于冷冻培养基(含有20％FCS和10％DMSO的RPMI培养基)中。将细胞的等分试样使用填充有异丙醇的细胞冷冻容器(Nalgene Mr. Frosty, Thermo Fisher Scientific)冷冻在-80℃，随后在液氮中储存。
绵羊巨噬细胞的制备：
近似50 ml EDTA-血液取自Suffolk-Merino绵羊，且与等体积的PBS(磷酸盐缓冲盐水)混合。将15ml稀释血液的等分试样在12.5 ml Lympholyte®-Mammal (Cedarlane, Ontario, Canada)上分层，且以800 x g离心30分钟。离心之后，收集PBMC(外周血单核细胞)，用PBS洗涤，且使用计数室计数。将细胞以1x106个细胞/ml接种于T175细胞培养烧瓶(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中的RPMI培养基(Gibco)中，所述RPMI培养基补充有10 % FCS (Hyclone)、L-青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1x) (Gibco)、10 mM HEPES (Gibco)、2 mM丙酮酸钠(Gibco)和55 µM 2-巯基乙醇(Gibco)。将细胞在37℃/5 % CO2下在潮湿气氛中孵育48小时。随后通过用培养基轻轻洗涤细胞而去除非粘附细胞，而粘附细胞(巨噬细胞富集的群体)用于通过如后所述与胸腺细胞共培养而制备TSN。
绵羊胸腺细胞和巨噬细胞的共培养
将冷冻胸腺细胞解冻，且以5x105个细胞/ml接种于T175细胞培养烧瓶(Greiner Bio-One)中的RPMI培养基(Gibco)中，所述RPMI培养基补充有10 % FCS (Hyclone)、L-青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1x) (Gibco)、10 mM HEPES (Gibco)、2 mM丙酮酸钠(Gibco)和55 µM 2-巯基乙醇(Gibco)。将胸腺细胞在37℃/5 % CO2下在潮湿气氛中孵育48小时。随后收获细胞，通过离心收集且再悬浮于新鲜培养基中。计数胸腺细胞，且通过添加5 µg/ml植物凝集素M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和10 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(Sigma-Aldrich)来刺激。
以近似2:1的比率(胸腺细胞：巨噬细胞)将刺激的胸腺细胞添加至巨噬细胞。共培养36小时之后，收获细胞的上清液(TSN)，通过0.2 µM过滤器过滤，且在-80℃以等分试样储存。
抗原特异性的绵羊B细胞合并物的分离和培养
Suffolk-Merino绵羊使用作为免疫原的KLH-偶联的半抗原(在佐剂中配制的500 µg剂量)免疫几次。分离B细胞之前五天，通过皮下应用免疫原(每只动物在佐剂中配制的500 µg剂量)加强绵羊。对于B细胞的分离，近似150 ml EDTA-血液取自动物，且与等体积的PBS混合。将稀释血液上样于Leucosep™管(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) (每管20 ml)上，且在室温以800 x g离心15分钟。离心之后，收集PBMC(外周血单核细胞)，用PBS洗涤，且使用计数室计数。
用PBS洗涤之后，将PBMC以5x107个细胞/ml再悬浮于FACS缓冲液(PBS/1 % BSA)中。对于抗原特异性的B细胞的阳性淘选，通过与生物素化的半抗原(500 ng/ml)在4℃在轻轻旋转下孵育30分钟而标记细胞。随后，细胞用PBS洗涤，且以1x107个细胞/90 µl再悬浮于标记缓冲液(PBS/2 mM EDTA)中。将细胞与磁性链霉抗生物素微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)在4℃在轻轻旋转(使用10 µl珠粒/90 µl细胞悬浮液)下孵育30分钟。用PBS洗涤之后，将细胞以2x108个细胞/ml再悬浮于MACS缓冲液(PBS/1 % BSA/2 mM EDTA)中，且上样于用MACS缓冲液平衡的MACS柱(Miltenyi Biotec)上。用MACS缓冲液洗涤之后，将磁铁从柱去除且标记，将抗原特异性的细胞洗脱于MACS缓冲液中。
对于B细胞的染色，将洗脱的细胞级分用PBS洗涤，且以2x107个细胞/ml再悬浮于FACS缓冲液中。使用1:50稀释的FITC标记的抗绵羊IgG单克隆抗体(克隆GT-34) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)组合1:10稀释的RPE标记的抗绵羊CD45R mAb (克隆20.96, AbD Serotec, Düsseldorf, Germany)或RPE标记的抗绵羊CD21 mAb (克隆CC21, AbD Serotec)染色细胞。将细胞与mAb在4℃在轻轻旋转下孵育45分钟。在对照实验中，细胞的等分试样用单独的个别mAb染色(单一染色)。未染色的细胞充当阴性对照。
用PBS洗涤之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，且进行使用FACS Aria I细胞分选仪(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)的细胞分选。鉴定表面IgG (sIgG)+CD21+或sIgG+CD45R+双阳性B细胞，且分选至含有280 µl培养基和γ照射的鼠胸腺瘤EL4B5饲养细胞(细胞分选至板中之前24小时接种的近似5x104个饲养细胞/孔)的96孔板(50个细胞/孔)。
基础培养基是DMEM (Gibco, Paisley, UK)或IMDM (Gibco)，其补充有10 % FCS (Hyclone, Logan, UT, USA)、L-青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1x) (Gibco)、55 µM 2-巯基乙醇(Gibco)、绵羊TSN (1:20稀释)和热灭活、福尔马林固定的金黄色葡萄球菌细胞(SAC; 1:10,000稀释) (Pansorbin®, Calbiochem, Darmstadt, Germany)。除了上述补充剂以外，基础IMDM含有0.025 % Pluronic F-68 (Gibco)。
为了评估不同刺激对绵羊B细胞的增殖和分化的影响，添加单独或与如图中所示的基础培养基组合的以下化合物：10 ng/ml人IL-4 (Peprotech, Hamburg, Germany)、50 ng/ml人IL-6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)、1 µg/ml大肠杆菌衍生的脂多糖(LPS) (Sigma-Aldrich)或1 µg/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA) (Sigma-Aldrich)。
将B细胞在培养基中在37℃/5 % CO2在潮湿气氛中孵育7至10天。随后，收获细胞的上清液，且如下所述通过ELISA测定IgG浓度。
单一抗原特异性的B细胞的分离和培养
如上所述从免疫的动物分离绵羊PBMC。如上所述通过使用生物素化的抗原和磁性链霉抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)的阳性淘选富集抗原特异性B细胞。使用1:50稀释的FITC标记的抗绵羊IgG单克隆抗体(克隆GT-34) (Sigma-Aldrich)组合1:10稀释的RPE标记的抗绵羊CD21 mAb (AbD Serotec)染色细胞。将细胞与mAb在4℃在轻轻旋转下孵育45分钟。在对照实验中，细胞的等分试样用单独的个别mAb染色(单一染色)。未染色的细胞充当阴性对照。
用PBS洗涤之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，且进行使用FACS Aria I细胞分选仪(BD Biosciences)的细胞分选。鉴定单一sIgG+CD21+双阳性B细胞，且分选至含有280 µl培养基和γ照射的鼠EL4B5饲养细胞(细胞分选至板中之前24小时接种的近似5x104个饲养细胞/孔)的96孔板(一个细胞/孔)。
用于培养单一绵羊B细胞的培养基是IMDM (Gibco)，其补充有10 % FCS (Hyclone)、L-青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1x) (Gibco)、55 µM 2-巯基乙醇(Gibco)、0.025 % Pluronic F-68 (Gibco)、绵羊TSN (1:20稀释)、SAC (1:10,000稀释) (Calbiochem)和1 µg/ml PMA (Sigma-Aldrich)。
将B细胞在培养基中在37℃/5 % CO2在潮湿气氛中孵育7至10天。随后，收获细胞的上清液，且如下所述通过ELISA测定IgG浓度。
通过ELISA测定绵羊IgG浓度
将生物素缀合的单克隆抗绵羊IgG抗体(目录号213-062-177, Dianova, Hamburg, Germany)固定在链霉抗生物素包被的96孔板(MicroCoat, Bernried, Germany)上。以PBS/1 % RPLA4 (牛血浆白蛋白) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)中300 ng/ml的浓度使用mAb (100 µl/孔)，且将孔与稀释的mAb 在室温(RT)孵育1小时。用洗涤缓冲液(0.9% NaCl / 0.05% Tween)洗涤之后，将体外培养的B细胞的上清液或纯化的多克隆绵羊IgG (Roche)的连续稀释液添加至板，且在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤之后，将孔与用辣根过氧化物酶(Dianova, 目录号713-035-147)标记的驴抗绵羊IgG (H+L)抗体(PBS / 1% RPLA4中1:15,000稀释)孵育。在室温孵育1小时之后，将板用洗涤缓冲液洗涤，且使用ABTS溶液(Roche)作为底物检测信号。将各板在读板器中以405 nm(参考波长492 nm)进行读取。纯化的绵羊IgG的连续稀释液(0 – 200 ng/ml)充当标准品，且用于计算B细胞上清液的IgG浓度。
通过ELISA测定绵羊IgG的抗原特异性
将生物素缀合的抗原固定在链霉抗生物素包被的96孔板(MicroCoat, Bernried, Germany)上。以PBS/1% RPLA4 (牛血浆白蛋白) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)中100 - 300 ng/ml的浓度使用生物素化的抗原(100 µl/孔)，且将孔与稀释的抗原在室温(RT)孵育1小时。用洗涤缓冲液(0.9 % NaCl / 0.05 % Tween)洗涤之后，将体外培养的B细胞的上清液或纯化的多克隆绵羊IgG (Roche)的连续稀释液添加至板，且在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤之后，将孔与用辣根过氧化物酶(Dianova, 目录号713-035-147)标记的驴抗绵羊IgG (H+L)抗体(PBS / 1 % RPLA4中1:15,000稀释)孵育。在室温孵育1小时之后，将板用洗涤缓冲液洗涤，且使用ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)作为底物检测信号。

Claims (11)

1.用于培养绵羊B细胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养绵羊B细胞。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述培养是在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞存在的情况下。
3.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养分泌抗体的绵羊B细胞，和
从培养上清液回收所述抗体，从而产生所述抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述绵羊B细胞是幼稚绵羊B细胞或未成熟绵羊B细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性的B细胞(IgG+)。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性且CD45R阳性的B细胞(IgG+CD45R+)。
7.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述B细胞是IgG阳性且CD21阳性的B细胞(IgG+CD21+)。
8.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养分泌抗体的绵羊B细胞的合并物或单一沉积的分泌抗体的绵羊B细胞，
b) 分离编码抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸且分离编码抗体的可变重链结构域的氨基酸序列的核酸，所述抗体特异性结合至抗原，
c) 培养细胞，所述细胞包含b)中分离的核酸或其变体，所述核酸或其变体编码在一个或多个表达盒内的轻和/或重链可变结构域的人源化版本，
d) 从所述细胞或培养基回收所述抗体，和从而产生抗体。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a) 提供分泌抗体的(成熟的)B细胞的群体(获得自绵羊的血液)，
b) 用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料)染色B细胞群体的细胞，
c) 在单个容器(在一个实施方案中容器是多孔板的孔)中沉积染色的B细胞群体的单一细胞或来自染色的B细胞群体的细胞合并物，
d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养沉积的单个B细胞，
e) 测定单个B细胞或B细胞合并物的培养中分泌的抗体的结合特异性，
f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸，
g) 将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体，
h) 将所述核酸引入细胞中，
i) 培养所述细胞，且从细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生抗体。
10.佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)在培养分泌抗体的绵羊B细胞中的用途。
11.用于改善绵羊B细胞的细胞生长的方法，其包括与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起/在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养单一沉积的绵羊B细胞或绵羊B细胞的合并物的步骤。
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