CN110121554A - B细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本文报道了在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、IL‑1β、TNFα、IL‑2、IL‑10和IL‑6存在下共培养B细胞的方法。
Description
本文报道了将B细胞与饲养细胞共培养的方法，其中应用了限定的合成饲养混合物。该方法可用于例如获得由共培养的B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序列，以及用于产生抗体。
背景技术
为了获得分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein发展的杂交瘤技术。但在杂交瘤技术中，只有一部分从所免疫的实验动物获得的B细胞可以融合和繁殖。B细胞的来源通常是所免疫的实验动物的器官，如脾脏。
Zubler等在1984年开始发展用于获得分泌单克隆抗体的细胞的不同方法(参见例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-63，J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中，从所免疫的实验动物的血液获得B细胞，并在包含细胞因子的饲养混合物存在下与鼠EL-4B5饲养细胞共培养。借助这种方法，在共培养10-12天后可以获得至多50ng/ml抗体。
Kwekkeboom，J.，等人(J.Immunol.Meth.160(1993)117-127)报道了基于鼠胸腺瘤细胞系激活人B淋巴细胞产生人单克隆抗体的有效方法。他们报道，对于人B细胞，培养条件应该是在PMA(5ng/ml)加5％T细胞上清液存在下用辐射的EL4B5。
Weitkamp，J-H.等，(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了从用荧光病毒样颗粒选择的单抗原特异性B细胞产生抗轮状病毒的重组人单克隆抗体。
Weber，M.，等人(J.Immunol.Meth.278(2003)249-259)报道了将基于EL4-B5的B细胞刺激和噬菌体展示技术组合用于成功分离人抗Scl-70自身抗体片段。将细胞混合物在37℃下在补充有10％FCS、3％巨噬细胞/T细胞培养上清液、非必需氨基酸和3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯的RPMI 1640培养基中温育。
US 2006/0051348中报道了产生抗多个关连抗原的多个分离的抗体的方法。
在WO 2008/144763和WO 2008/045140中，分别报道了抗IL-6抗体及其用途和用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法。
在US 2007/0269868中报道了用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法。
Masri等(Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报道了在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达从抗炭疽毒素的单人淋巴细胞获得的功能性Fab片段。
WO 2007/031550中报道了用于制备免疫球蛋白文库的方法。
WO 2011/147903中报道了单B细胞培养方法，其中共培养在合成饲养混合物存在下，所述混合饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
WO 2013/076139中报道了表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途。
WO 2013/092716中报道了用于克隆和表达关连抗体可变区基因区段的快速方法。
US 7,807,415中报道了用于产生稳定永生化B淋巴细胞的方法。EP 0 488 470中报道了用于产生抗体的方法。
在WO 2015/000624中报道了绵羊B细胞和佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbolmyristate acetate，PMA)的共培养。
在US2013/177987中，报道了用于开发抗原特异性抗体生成细胞系和单克隆抗体的方法。
由Tucci，A.，等，J.Immunol.148(1992)2778-2784知道由IL-1β(白细胞介素-1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-2(白细胞介素-2)和IL-10(白细胞介素-10)组成的合成饲养混合物。
Bovia，F.等人报道了其他合成细胞因子混合物(Blood 101(2003)1727-1733)和Werner-Favre(Eur.J.Immunol.31(2001)243-249)。
发明概述
本文报道了一种用于共培养单个沉积的B细胞的方法，所述B细胞可以是任何来源，其中饲养细胞在合适的共培养培养基中，其中所有细胞生长刺激添加剂被定义，例如，合成来源。在一个实施方案中，将胸腺细胞培养上清液、巨噬细胞培养上清液或T细胞培养上清液均未加入培养物中。
本发明至少部分基于以下发现：单独的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)与限定的(合成的)细胞因子和限定的(合成的)白细胞介素的组合可以代替常用的，未限定的用于共培养B细胞和饲养细胞(例如鼠EL4-B5饲养细胞)的巨噬细胞/T细胞培养上清液。
本发明进一步至少部分地基于以下发现：当使用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯与限定的(合成的)细胞因子和限定的(合成的)白细胞介素组合时，这些组分中的每一种的浓度必须在一定范围内以确保积极作用。
本文报道的单个方面是用于以下的方法：
i)从B细胞群体分离B细胞或B细胞克隆，由此该分离的B细胞或B细胞克隆产生特异性结合靶标(抗原)的抗体；
ii)共培养单个沉积B细胞；和
iii)产生抗体。
与该方法并行，还涵盖和公开相应的用途。
本文报道的一个方面是共培养一种或多种B细胞(用于产生免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤：
-在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在下将一种或多种B细胞与饲养细胞共培养(从而产生免疫球蛋白)。
在一个实施方案中，共培养在1.5-7.25ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯存在下。
在一个实施方案中，共培养在不存在胸腺细胞(TSN)的培养上清液的情况下。在一个实施方案中，该方法不添加胸腺细胞(TSN)的培养上清液。
在一个实施方案中，共培养进一步存在金黄色葡萄球菌菌株Cowans细胞(SAC)。
本文报道的一个方面是共培养一种或多种B细胞(用于产生免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤：
-在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)，IL-1β，TNFα，IL-2，IL-10和IL-6的存在下，将一种或多种B细胞与饲养细胞共培养(从而产生免疫球蛋白)。
所有实施方案是本文报道的所有方面的实施方案。
在一个实施方案中，共培养中使用的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)，IL-1β，TNFα，IL-2，IL-10和IL-6的量以重量计。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约5ng/ml(鼠的)IL-2，
约1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，用于共培养中的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)的量以重量给出，且共培养中使用的IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的量以(具体的)活性给出。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养在不存在胸腺细胞(TSN)的培养上清液的情况下。在一个实施方案中，该方法不添加胸腺细胞的培养上清液(TSN)。
在一个实施方案中，饲养细胞是(鼠)EL4-B5细胞。
在一个实施方案中，共培养进一步存在金黄色葡萄球菌菌株Cowans细胞(SAC)。
在一个实施方案中，该方法用于共培养一个B细胞。在一个优选的实施方案中，一个B细胞是单个沉积的B细胞。
在一个实施方案中，该培育持续5至14天。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括本文报道的共培养方法。
共培养的结果是B细胞克隆，即B细胞群体，其是单个B细胞的后代。
在一个实施方案中，本文报道的方法在共培养步骤之前包括以下步骤：
-将B细胞群体的(带有1至3个)荧光染料/荧光团标记的那些B细胞沉积为单个细胞。
在一个实施方案中，本文报道的方法在共培养步骤之前包括以下步骤：
-将B细胞群体的已与(2至4种)各特异性结合不同B细胞表面抗原的抗体接触的那些B细胞沉积为单个细胞，由此各抗体与不同荧光染料缀合，(但仅用1至3种荧光染料标记)。
在一个实施方案中，通过使B细胞群体(顺次或同时)与(2至4种)荧光标记抗体接触来进行标记。由此获得标记B细胞制备物。每种荧光标记抗体结合不同的B细胞表面标志/靶标。
通过将标记B细胞制备物引入流式细胞仪并使带有(1至3个)荧光标记的那些细胞沉积为单个细胞来进行沉积。由于可能使细胞与如用于在细胞分选仪中选择细胞的那些荧光染料的更多荧光染料培育，可以针对存在特异性表面标志且(可选地)同时缺乏其他表面标志来选择细胞。
进行标记和单细胞沉积，以通过排除不可能产生具有预期特征的抗体的那些B细胞来降低B细胞群体的复杂性。标记抗体结合展示在B细胞表面的特异性多肽，因此提供正选择标记。同样，还可能选择这样的细胞，该细胞仅带有与B细胞与之培育的标记抗体的数目相比数目减少的荧光染料标记，例如具有两种荧光标记中的一种(即进行了与两种荧光标记抗体的培育，但只有其中之一结合B细胞)的细胞。基于荧光标记抗体与B细胞群体的单个B细胞的结合/不结合，可能用微流分选仪鉴定和分离靶标B细胞。还可以在选择的同时测定标记的量。
在一个实施方案中，本文报道的方法包括在单细胞沉积之前在共培养培养基中培育B细胞群体的步骤。在一个实施方案中，该培育在约37℃进行。在一个实施方案中，该培育进行0.5至2小时。在一个实施方案中，该培育进行约1小时。在一个优选实施方案中，该培育在约37℃进行约1小时。
在一个实施方案中，本文报道的方法在沉积步骤之后和共培养步骤之前包括离心单细胞沉积B细胞的步骤。在一个实施方案中，该离心进行约1分钟至约30分钟。在一个实施方案中，该离心进行约5分钟。在一个实施方案中，该离心在约100x g至约1,000x g。在一个实施方案中，该离心在约300x g。在一个优选实施方案中，该离心在约300x g进行约5分钟。
在一个实施方案中，用于选择/获得B细胞(克隆)的方法包括以下步骤：
a)用(1至3种)荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育)；
b)可选地在共培养培养基中培育细胞；
c)使B细胞群体的(带有1至3种荧光染料)标记的(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积；
d)可选地离心单个沉积B细胞；
e)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中(分别)共培养；
f)选择在步骤e)中增殖并分泌抗体的B细胞克隆。
在一个实施方案中，用于产生特异性结合靶标的抗体的方法包括以下步骤：
a)用(1至3种)荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育)；
b)可选地在共培养培养基中培育细胞；
c)使B细胞群体的(带有1至3种荧光染料)标记(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积；
d)可选地离心单个沉积B细胞；
e)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中(分别)共培养；
f)选择步骤e)的分泌抗体的B细胞克隆；
g)i)从步骤f)中选择的B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸；
ii)如果B细胞克隆不是人B细胞克隆，则人源化可变结构域并提供各自的编码核酸；和
iii)将该一个或多个核酸引入一个或多个表达载体；
h)培养用步骤g)的一个或多个表达载体转染的细胞，从细胞或培养上清回收抗体，从而产生抗体。
在一个实施方案中，用于产生抗体的方法包括以下步骤：
a)用(1至3种)荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育)；
b)可选地在共培养培养基中培育细胞；
c)使B细胞群体的(带有1至3种荧光染料)标记(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积；
d)可选地离心单个沉积B细胞；
e)(分别)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中共培养；
f)测定单个B细胞培养基中分泌的抗体的结合特异性；
g)通过反转录酶PCR和核苷酸测序从B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸(从而获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域编码核酸)；
h)如果B细胞是非人B细胞，则人源化可变轻链和重链结构域并提供编码人源化可变结构域的核酸；
i)将单克隆抗体可变轻链和重链可变结构域编码核酸引入一个或多个用于表达(人或人源化)抗体的表达载体；
j)将该一个或多个表达载体引入细胞；
k)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清回收抗体，从而产生抗体。
在一个实施方案中，从B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸包括以下步骤：
-从产生抗体的B细胞克隆提取总RNA；
-进行所提取的polyA+mRNA的单链cDNA合成/反转录；
-用一组物种特异性引物进行PCR；
-可选地去除PCR引物/纯化PCR产物；
-可选地测序PCR产物。
在一个实施方案中，将单克隆抗体可变轻链和/或重链可变结构域编码核酸引入用于表达(人或人源化)抗体的表达载体包括以下步骤：
-可变轻链和重链可变结构域的T4聚合酶培育；
-表达载体的线性化和扩增；
-所扩增的表达载体的T4聚合酶培育；
-可变结构域编码核酸的序列和连接依赖性克隆入所扩增的表达载体；和
-从载体转化的大肠杆菌细胞混合物制备一个或多个载体。
在所有方面的一个实施方案中，该方法在紧靠标记步骤之前包括以下步骤：
-使B细胞群体与固定在固体表面的(靶)抗原培育，并(仅)回收结合于固定化抗原的B细胞。
在所有方面的一个实施方案中，该B细胞群体是非人动物B细胞群体。在一个实施方案中，该B细胞群体是小鼠B细胞群体、或仓鼠B细胞群体、或兔B细胞群体。在一个优选实施方案中，该B细胞群体是兔B细胞群体。
在所有方面的一个实施方案中，该B细胞群体获自免疫后4天的非人动物的血液。在一个实施方案中，该B细胞群体获自免疫后4天至至多9天的非人动物的血液。
在一个实施方案中，该B细胞群体是人B细胞群体。
在所有方面的一个实施方案中，该B细胞群体是通过密度梯度离心从血液获得。
在所有方面的一个实施方案中，该B细胞是成熟B细胞。
在所有方面的一个实施方案中，单细胞(单个)沉积入多孔板的孔中。
在所有方面的一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
在所有方面的一个实施方案中，该沉积细胞带有一个或三个荧光染料标记，该培育是与2至4种荧光标记抗体培育。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群体的B细胞的标记导致(总)B细胞群体中0.1％至2.5％的细胞的标记。
在所有方面的一个实施方案中，该标记是标记B细胞表面IgG。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面IgM)，该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是用荧光标记的抗-IgG抗体和荧光标记的抗-轻链抗体(标记在细胞表面IgG和细胞表面抗体轻链)，并且选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(导致IgG+LC+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面IgM)，该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积)，由此使B细胞群体与固定在固体表面的(靶)抗原培育，并(仅)回收结合于固定化抗原的B细胞，并使之与荧光标记抗体培育。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗-CD19抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面CD19)，该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面CD19也为阳性的细胞(导致IgG+CD19+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD38抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面CD38)，该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面CD38也为阳性的细胞(导致IgG+CD38+B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗-IgG抗体和荧光标记的抗-CD138抗体培育(标记为标记细胞表面IgG和细胞表面CD138)，并且该选择是选择细胞表面IgG呈阴性和细胞表面CD138为阳性的细胞(导致IgG-CD138+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗-IgG抗体和荧光标记的抗-CD268抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面CD268)，并且选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面CD269也是阳性的细胞(导致IgG+CD268+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗CD27抗体和荧光标记的抗CD138抗体培育(标记为标记细胞表面CD27和细胞表面CD138)，并且该选择是选择细胞表面CD27为阳性且细胞表面CD138也是阳性的希伯胺(导致CD27+CD138+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该培育是与荧光标记的抗CD3抗体和荧光标记的抗CD27抗体培育(标记为标记细胞表面CD3和细胞表面CD27)，并且选择是选择细胞表面CD3为阴性且细胞表面CD27也是阳性的细胞(导致CD3-CD19+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有先前实施方案的一个实施方案中，该培育另外与荧光标记的抗轻链抗体培育(除了其他两个标记之外标记为标记细胞表面抗体轻链)并且选择是选择细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(导致LC+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是兔B细胞群，并且培育是与荧光标记的抗IgG抗体培育(标记为标记细胞表面IgG)孵育，并且选择是选择细胞表面IgG阳性的细胞(导致IgG+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是兔B细胞群，并且培育是与荧光标记的抗CD138抗体培育(标记为标记细胞表面CD138)并且选择是选择细胞表面CD138阳性的细胞(导致CD138+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是兔B细胞群，并且培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD138抗体培育(标记为标记细胞表面IgG和细胞表面CD138)。并且选择是选择细胞表面IgG阳性且细胞表面CD138也是阳性的细胞(导致IgG+CD138+-B细胞单细胞沉积)。
在所有方面的一个优选实施方案中，该B细胞群体是兔B细胞群体，该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面IgM)，该选择是选择细胞表面IgG为阳性和细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积)。
在所有先前实施方案的一个实施方案中，兔B细胞的培育另外与荧光标记的抗轻链抗体培育(除了其他两个标记之外，标记为标记细胞表面抗体轻链)并且选择为选择细胞表面抗体轻链阳性的细胞(导致LC+-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是仓鼠B细胞群，并且培育与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(标记为标记细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择是选择细胞表面IgG阳性且细胞表面IgM阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是鼠B细胞群，并且培育与荧光标记的抗IgG抗体培育(标记为标记细胞表面IgG)，并且选择是选择细胞表面IgG阳性的细胞(导致IgG+B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是鼠B细胞群，并且培育与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD19抗体培育(标记为标记细胞表面IgG和细胞表面CD19)，并且选择是选择细胞表面IgG阳性且细胞表面CD19也是阳性的细胞(导致IgG+CD19+-B细胞单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞群是鼠B细胞群，并且培育与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD138抗体培育(标记为标记细胞表面IgG和细胞表面CD138)，并且选择是选择细胞表面IgG阴性且细胞表面CD138阳性的细胞(导致IgG-CD138+-B细胞单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中，该共培养是在包含补充了10％(v/v)FCS、1％(w/v)含有青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液及1％(v/v)1M2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI 1640培养基的共培养培养基中。在一个实施方案中，该共培养培养基进一步包含0.05mM β-巯基乙醇。
在一个实施方案中，该动物是实验动物。在一个实施方案中，该实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。在一个实施方案中，该实验动物是兔。
本文报道的一个方面是(限定的和/或合成的)饲养混合物，其包含佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.2ng/ml(鼠的)TNFα，
约5ng/ml(鼠的)IL-2，
约1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，用于共培养中的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)的量以重量给出，且共培养中使用的IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的量以(具体的)活性给出。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，(合成的)饲养混合物包含：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在所有方面的一个实施方案中，B细胞是兔B细胞。
定义
术语“活性”表示化合物在特定测定中的生物学效应。
在一个实施方案中，测定TNFα的活性，包括培养敏感细胞系，例如ML929，滴定测试样品，然后通过形态学检查染色细胞或通过测量[3H]胸苷从预先标记的细胞的释放来观察细胞溶解(参见例如Jensen，JB等，Infect.Immun.55(1987)1722-1724；Mannel，DN等，Infect.Immun.30(1980)523-530；Ruff，M.R和GE Gifford，Infect.Immun.31(1981)380-385)。
在一个实施方案中，使用D10.G4.1小鼠辅助性T细胞，在细胞增殖测定中测定IL-1β的活性；读数是D10.G4.1增殖(参见，例如，Symons，JA，等人(1987)，Lymphokines andInterferons，a Practical Approach.Clemens，M.J.等人(编)：IRL Press。，第272页；Orencole，SF和Dinarello，CA，Cytokine 1(1989)14-22)。
在一个实施方案中，IL-2的活性被确定为IL-2对鼠细胞毒性T细胞系CTLL-2的增殖作用；读数是增殖(参见，例如，Weston，L.，等，Immunol.Cell Biol.76(1998)190-192；Wadhwa，M.等人，J.Immunol.Meth.397(2013)1-7)。
在一个实施方案中，IL-10的活性在使用鼠MC/9细胞的与IL-4(例如5pg/ml)的共刺激生物测定中测定；读数是增殖(参见，例如，Imlach，W.，等人，J.Gen.Virol.83(2002)1049-1058；Thompson-Snipes，L.，等人，J.Exp.Med.173(1991)507-510)。
在一个实施方案中，使用鼠7TD1细胞系(来自LPS活化的B淋巴细胞和SP2/0-AG14鼠浆细胞瘤细胞系的细胞融合的杂交瘤；Van Snick，J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(1986)9679-9683)测定IL-6的活性)，其为IL-6生长和存活依赖性；读数是增殖(参见，例如，Manfredini，R.，等，Peptides 24(2003)1207-1220；Hausherr，A.，等，Oncogene 26(2000)4987-4998)。
本文中用术语“抗体”来指天然存在的抗体，包括其天然存在的结构变体。
例如，天然(人、小鼠、大鼠、兔)IgG抗体是分子量约为150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。天然IgG抗体由包含链间和链内二硫键的两条相同轻链和两条相同重链组成，使得全部四条链彼此共价连接。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，由此柔性铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。取决于其序列和结构域结构，可将抗体重链分配至称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的五种类型之一(抗体的“种类”)。这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链结构域(CL)。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体轻链分配至称为κ和λ的两种类型之一。
例如，天然(骆驼科动物，即来自胼足亚目(sub-order Tylopoda)骆驼科(Camelidae)，其包括骆驼、单峰驼和羊驼)仅含重链的抗体(VHH)不包含见于常规IgG重链中的经典CHl结构域，因此表达为直接与抗体铰链区-CH2-CH3结构域融合的VHH结构域。来自羊驼来源的VHH抗体的可变区序列例如类似于人VH3家族可变结构域中的序列(Schroeder等，Int.Immunol.2(1989)41-50)。与IgG类型抗体相比，L.Ilama VHH结构域中的CDR3结构域氨基酸序列平均比大多数含有重链和轻链的经典IgG类型抗体的CDR3结构域长。与经典IgG抗体一样，可通过本领域公知的方法(参见US 5,637,677)来确定VHH抗体中CDR的位置。残基11、37、44、45和47对链界面的形成很重要(参见例如WO 99/42077)。
“抗体片段”指除完整抗体(IgG/VHH＝四链/两链)以外的仅包含完整抗体的部分且结合该完整抗体所结合的相同抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单结构域抗体；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“细胞”包括用于繁殖质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞二者。在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是CHO细胞，可选地是CHO K1细胞(例如ATCC CCL-61或DSM ACC 110)、或CHO DG44细胞(也称为CHO-DHFR[-]，例如DSM ACC 126)、或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan，D.等，Biochemistry 26(1987)2959-2963)、或CHO-S细胞、或Super-CHO细胞(Pak，S.C.O.等Cytotechnol.22(1996)139-146)、或BHK细胞、或NS0细胞、或Sp2/0细胞、或HEK 293细胞、或HEK 293EBNA细胞、或细胞、或COS细胞。如果这些细胞不适应在无血清培养基中生长或悬浮生长，则可在用于本发明前进行修改。本文所用的表述“细胞”包括主题细胞及其后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和从其衍生的培养物，不考虑转移或传代的次数。还应理解，所有后代可由于故意或非故意的突变而在DNA含量上并非精确相同。具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代也包括在内。
术语“克隆”指产生自/源自单个B细胞的分裂且分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆是B细胞的同质群体，且产生单克隆抗体。
术语“实验动物”指非人动物。在一个实施方案中，该实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、羊驼、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、鲨鱼和爬行动物。在一个实施方案中，该实验动物是兔。
本文所用的术语“表达”指细胞内发生的转录和/或翻译和分泌过程。可以基于细胞中存在的相应mRNA的量来测定目的核酸序列在细胞中的转录水平。例如，可通过qPCR或RT-PCR或通过Northern杂交来定量从目的序列转录的mRNA(参见Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。核酸编码的多肽可通过多种方法来定量，例如，通过ELISA，通过测定多肽的生物学活性，或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫测定(参见Sambrook等，(1989)，上文)。
将例如多肽的氨基酸序列转化为编码此氨基酸序列的相应核酸序列的流程和方法为本领域技术人员公知，反之亦然。因此，核酸的特征在于其核酸序列包含单个核苷酸以及由其编码的多肽的氨基酸序列。
“表达盒”指包含在细胞中表达所包含的至少一个核酸所必需的调节元件(如启动子和聚腺苷酸化位点)的构建体。
表达可以作为瞬时表达或稳定表达进行。抗体通常由产生它的细胞分泌入培养基。因此，未成熟的抗体链包含抗体转运/分泌通过细胞壁进入胞外培养基所必需的N端延长(也称为信号序列)。通常，用于重组产生抗体的信号序列可以源自编码分泌性多肽的任意基因。如果使用异源信号序列，则它应是宿主细胞可识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于酵母中的分泌，例如，可将待表达的异源基因的天然信号序列替换为源自分泌性基因的同源酵母信号序列，如酵母转化酶信号序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)α因子前导序列，第二种描述于US 5,010,182中)、酸性磷酸酶信号序列、或白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞中，天然信号序列可满足需要，但其他哺乳动物信号序列可以是适宜的，如来自相同或相关物种的其他分泌性多肽的信号序列以及病毒分泌信号序列，例如单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列。编码这种前区段的DNA片段与编码抗体链的DNA片段符合读框地连接，即有效连接。
术语“表达机器”指细胞的酶、辅因子等的总和，其涉及以核酸或基因的转录步骤(即也称为“基因表达机器”)开始至核酸所编码的多肽的翻译后修饰的基因表达步骤。表达机器例如包含DNA转录为前mRNA、前mRNA剪接为成熟mRNA、mRNA翻译为多肽和多肽翻译后修饰的步骤。
“表达质粒”或“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒/载体包含含有复制起点的例如用于大肠杆菌的原核质粒繁殖单位，选择标记，真核选择标记，及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，该表达盒各含有启动子、结构基因、可选地转录终止子和聚腺苷酸化信号。通常将基因表达置于启动子的控制下，这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。
术语“饲养混合物”指促进B细胞的活化和/或存活和/或抗体分泌的不同添加剂(如生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的组合。饲养混合物在任何情况下在本文中都不是天然饲养混合物，即其并非获自胸腺细胞培养上清(TSN)的培养上清，所述胸腺细胞培养上清是细胞因子的非限定组合。在本文报道的方法中，饲养混合物是合成饲养混合物，合成饲养混合物是促进B细胞的活化和/或存活和/或抗体分泌的不同重组产生或化学合成添加剂(即生长因子、细胞因子、白细胞介素和PMA)的限定组合。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”或“转染体”和“转化细胞”和“转染细胞”，其包括最初转化细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。此人抗体定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“个体(individual或subject)”是脊椎动物。在一个实施方案中，该脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该个体是人。在其他实施方案中，该个体是兔。
术语“标记”指用于确定表面标志的存在或缺乏的方法，该表面标记可以通过标记的抗表面标志抗体与细胞的特异性结合的结合/非结合来测定。因此，在使细胞或细胞群体与各特异性结合和标记的抗表面标志抗体培育后，例如在荧光标记的情况下通过荧光的存在确定标明标志的存在，而通过荧光的缺乏确定标明标志的缺乏。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自由单细胞克隆产生的基本同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本同质的抗体群体的特性，而不解释为需要通过任意具体方法来产生该抗体。例如，将要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，其包括但不限于利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“PMA”表示佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，一种小化合物。其IUPAC名称为(1aR，1bS，4aR，7aS，7bS，8R，9R，9aS)-9a-(乙酰氧基)-4a，7b-二羟基-3-(羟甲基)-1，1，6，8-四甲基-5-氧代-1a，1b，4，4a，5，7a，7b，8，9，9a-十氢-H-环丙基[3，4]苯并[1，2-e]薁-9-基肉豆蔻酸酯。该化合物也表示为TPA、12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯、十四酰基佛波醇乙酸酯(tetradecanoylphorbol acetate)、十四酰基佛波醇乙酸酯(tetradecanoylphorbol acetate)，佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate)，12-O-十四酰基佛波醇13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate)，12-十四酰基佛波醇13-乙酸酯(12-tetradecanoylphorbol 13-acetate)，12-十四酰基佛波醇13-单乙酸酯(12-tetradecanoylphorbol 13-monoacetate)，13-O-乙酰基佛波醇12-肉豆蔻酸酯(13-O-acetylphorbol 12-myristate)，4β-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(4β-phorbol 12-myristate 13-acetate)，肉豆蔻酸，具1，1aα，1bβ，4，4a，7aα，7b，8，9，9a-十氢-4aβ的9酯(9-ester with 1，1aα，1bβ，4，4a，7aα，7b，8，9，9a-decahydro-4aβ)、7bα，9β，9aα-四羟基-3-(羟甲基)-1，1，6，8α-四甲基-5H-环丙烯并[3，4]苯并[1，2-e]薁-5-酮9a-乙酸酯(7bα，9β，9aα-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1，1，6，8α-tetramethyl-5H-cyclopropa[3，4]benz[1，2-e]azulen-5-one 9a-acetate)，(+)-，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol12-myristate 13-acetate)、佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-tetradecanoate 13-acetate)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate)、PMA，PMA(肿瘤启动子)、十四烷酸(tetradecanoic acid)、(1aR，1bS，4aR，7aS，7bS，8R，9R，9aS)-9a-(乙酰氧基)-1a，1b，4，4a，5，7a，7b，8，9，9a十氢基-4a，7b二羟基-3-(羟甲基)-1，1，6，8-四甲基-5-氧代-1H-环丙烯并[3，4]苯并[1，2-e]薁-9-基酯((1aR，1bS，4aR，7aS，7bS，8R，9R，9aS)-9a-(acetyloxy)-1a，1b，4，4a，5，7a，7b，8，9，9a-decahydro-4a，7bdihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1，1，6，8-tetramethyl-5-oxo-1H-cyclopropa[3，4]benz[1，2-e]azulen-9-yl ester)、十四烷酸(tetradecanoic acid)、9a-(乙酰氧基)-1a，1b，4，4a，5，7a，7b，8，9，9a-十氢基-4a，7B二羟基-3-(羟甲基)-1，1，6，8-四甲基-5-氧代-1H-环丙烯并[3，4]苯并[1，2-e]薁-9-基酯(9a-(acetyloxy)-1a，1b,4，4a，5，7a，7b，8，9，9a-decahydro-4a，7b-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1，1，6，8-tetramethyl-5-oxo-1H-cyclopropa[3，4]benz[1，2-e]azulen-9-yl ester)、[1aR(1aα，1bβ，4aβ，7aα，7bα，8α，9β，9aα)]-([1aR(1aα，1bβ，4aβ，7aα，7bα，8α，9β，9aα)]-)，TPA和TPA(佛波醇衍生物)。
“转染质粒/载体”是提供在宿主细胞中表达该转染质粒/载体中所包含的一个或多个编码核酸/结构基因所需的全部元件的核酸(也称为核酸分子)。转染质粒/载体包含转而含有复制起点的例如用于大肠杆菌的原核质粒繁殖单位，赋予对原核选择剂的抗性的核酸，转染质粒/载体进一步包含一个或多个赋予对真核选择剂的抗性的核酸，及一个或多个编码目的多肽的核酸。赋予对选择剂的抗性的核酸和编码目的多肽的一个或多个核酸各置于表达盒内，由此各表达盒包含启动子、编码核酸和转录终止子(包括聚腺苷酸化信号)。通常将基因表达置于启动子的控制下，这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及抗体与其抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt，T.J.等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以通过分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628)。
术语“幼小动物”指性成熟发生之前的动物。幼小仓鼠例如是年龄小于6周、尤其是小于4周的仓鼠。幼小小鼠例如是年龄小于8周、尤其是小于5周的小鼠。
发明详述
本发明至少部分基于以下发现：单独的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)与合成细胞因子和合成白细胞介素的组合可以代替B细胞和饲养细胞，如鼠EL4-B5饲养细胞共培养中使用的常用巨噬细胞/T细胞培养上清液。。
由于不需要在B细胞和饲养细胞的共培养中使用不限定(成分)的巨噬细胞/T细胞培养上清液，因此共培养过程更稳健，更便宜且易于适应来自不同物种的B细胞，等等。
本发明进一步至少部分基于以下发现：当使用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯与合成细胞因子和合成白细胞介素的组合时，这些组分中的每一种的浓度必须在一定范围内以确保积极效果。
免疫
为了产生治疗性抗体，或者用治疗靶标(单独或与免疫原性刺激组合)免疫非人动物以引发免疫应答，或者使用合成方法，如噬菌体展示文库。如果使用转基因动物(即具有人免疫系统)或人噬菌体展示文库，则获得人抗体。否则获得将在之后进行人源化的非人动物抗体。获得潜在治疗性抗体的罕见可能性是从已从疾病恢复的人类的血液获得。
通常用非人动物(如小鼠、兔、仓鼠和大鼠)作为动物模型来评价基于抗体的治疗。因此，通常需要提供结合非人动物抗原以及人抗原的交叉反应性抗体。
在本文报道的方法中，可以使用获自任意来源(例如人、小鼠、仓鼠或兔)的B细胞。取决于B细胞的来源，调整/选择饲养细胞和饲养混合物。
在兔B细胞的情况下，饲养细胞是EL4-B5细胞或表达兔CD40L的哺乳动物细胞，如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中，该兔选自新西兰白(NZW)兔、齐默尔曼兔(ZIKA)、艾丽西亚突变品系兔、巴西利亚突变品系兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除兔及其杂交种。
在人B细胞的情况下，饲养细胞是EL4-B5细胞或表达人CD40L的哺乳动物细胞，如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。
在鼠B细胞的情况下，饲养细胞是EL4-B5细胞或表达小鼠CD40L的哺乳动物细胞，如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中，该小鼠是NMRI小鼠或balb/c小鼠。
在仓鼠B细胞的情况下，饲养细胞是EL4-B5细胞或表达仓鼠CD40L的哺乳动物细胞，如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中，该仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(Cricetulus migratorius)、中国仓鼠(Cricetulus griseus)和叙利亚仓鼠(Mesocricetulus auratus)。在一个实施方案中，该仓鼠是亚美尼亚仓鼠。
B细胞的来源和分离
血液提供高多样性的产抗体B细胞。从其获得的B细胞克隆分泌在CDR内几乎没有相同或重叠的氨基酸序列的抗体，因此显示高多样性。
在一个实施方案中，B细胞，例如来自血液或脾的，获自免疫后4天至免疫后至多14天或最近一次加强免疫的非人动物。此时间跨度允许本文报道的方法中的高度灵活性。在此时间跨度内，提供最精炼抗体的B细胞可能从脾脏迁移至血液(参见例如Paus，D.等，JEM203(2006)1081-1091；Smith，K.G.S.等，The EMBO J.16(1997)2996-3006；Wrammert，J.等，Nature 453(2008)667-672)。
来自例如非人动物血液或来自人血液的B细胞可以用本领域已知的任意方法获得。例如，可以使用密度梯度离心(DGC)或红细胞细胞裂解(裂解)。与低渗裂解相比，密度梯度离心提供了更高的总体产率，即B细胞克隆数。此外，从通过密度梯度离心获得的细胞，更大量的细胞在共培养步骤中分裂和生长。与用不同方法获得的细胞相比，所分泌的抗体浓度也更高。因此，在一个实施方案中，通过密度梯度离心提供B细胞群体。
共培养前的选择步骤
可以从外周血单核细胞(PBMC)富集产生特异性结合抗原的抗体的B细胞。因此，在本文报道的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)富集B细胞群体。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，该PBMC排除了巨噬细胞。对共培养步骤而言，这对兔来源的B细胞有利。
可以通过黏附于细胞培养板表面来从PBMC排除巨噬细胞(参见预培育步骤)。
与从非人动物(在一个实施方案中，该非人动物是兔)的血液分离并可选地富集B细胞群体后直接沉积单细胞相比，在单细胞沉积前在共培养培养基中培育B细胞群体增加在单细胞沉积后获得的抗体分泌细胞的总数。具体而言，该培育是在EL-4B5培养基中在约37℃进行约1小时，例如使用细胞培养箱。
在本文报道的方法的一个实施方案中，该细胞来自蛋白质免疫的动物，并在标记前排除巨噬细胞。
通过使用淘选方法，可以分别减少或富集不产生结合抗原的抗体的细胞或产生结合抗原的抗体的细胞。其中各抗原附着于表面呈递，在进一步处理结合细胞的情况下选择性富集细胞群体中与之结合的细胞，或在进一步处理保留在溶液中的细胞的情况下减少细胞群体中与之结合的细胞。
在一个实施方案中，本文报道的方法在单细胞沉积前包括选择步骤，其中基于细胞表面标志和荧光激活细胞分选/门控选择产生特异性和/或非交叉反应性抗体的B细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟B细胞。为了从不同的非人动物物种选择B细胞，可以使用不同的细胞表面标志。
通过标记非靶细胞群体和非特异性结合淋巴细胞，可能选择性排除这些细胞。在此排除步骤中，仅可达到部分排除。虽然此排除不是定量的，但它在随后荧光标记剩余细胞中具有优势，例如干扰细胞的数量可以被减少或者甚至最小化。通过使用标记的荧光激活细胞分选对成熟B细胞(记忆B细胞、亲和力成熟的浆母细胞和将细胞)进行的单细胞沉积，可以在共培养步骤中获得更高数目的IgG+孔/细胞克隆。
可以通过使用不同表面标志来标记不同细胞群体，如CD3+细胞(T细胞)、CD19+细胞(B细胞)、IgM+细胞(成熟的幼稚B细胞)、IgG+细胞(成熟B细胞)、LC+-细胞、CD38+细胞(例如浆母细胞)和IgG+CD38+细胞(前浆细胞)。
可获得用于选择成熟IgG+B细胞(如记忆B细胞、浆母细胞和浆细胞)的免疫荧光标记。为了选择或富集B细胞，对细胞进行单标记、双标记或三标记。还需要这样的标记，其导致总细胞群的约0.1％至2.5％的标记细胞。
在一个实施方案中，B细胞沉积为通过标记存在于群体中B细胞0.1％至2.5％上(在另一个实施方案中，群体中B细胞的0.3％至1.5％上，在另一个实施方案中，群体中B细胞的0.5％至1％上)的表面分子而选择的单个细胞。
表：用于测定成熟小鼠-、仓鼠-和兔-B-细胞的免疫荧光标记。
| B细胞来源 | 用以下分选B细胞 | 所有活细胞的比例(％) |
| 小鼠 | IgG<sup>+</sup>CD19<sup>+</sup> | 0.5±0.2n＝14 |
| 小鼠 | IgG<sup>+</sup>CD38<sup>+</sup> | 0.8±0.5n＝9 |
| 小鼠 | IgG<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup> | 0.06±0.07n＝6 |
| 小鼠 | IgG<sup>-</sup>CD138<sup>+</sup> | 0.6±0.5n＝6 |
| 小鼠 | IgG<sup>+</sup>CD27<sup>+</sup> | 0.1±0.1n＝8 |
| 小鼠 | CD27<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup> | 1.5±0.5n＝2 |
| 小鼠 | CD27<sup>+</sup>IgG<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup> | 0.10±0.04n＝3 |
| 小鼠 | CD3<sup>-</sup>CD27<sup>+</sup> | 1.33n＝1 |
| 小鼠 | IgG<sup>+</sup>CD268<sup>+</sup> | 0.8n＝1 |
| 小鼠 | CD38<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup> | 12±7n＝2 |
| 仓鼠 | IgG<sup>+</sup>IgM<sup>-</sup> | 0.6±0.1n＝15 |
| 兔 | IgG<sup>+</sup> | 0.6±0.2，n＝5 |
| 兔 | IgG<sup>+</sup>IgM<sup>-</sup> | 0.4±0.2，n＝2 |
| 兔 | IgG<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup> | 0.3±0.1，n＝5 |
在一个实施方案中，该方法包括排除B细胞群体的巨噬细胞和富集B细胞群体的分泌特异性结合靶抗原的抗体的B细胞的步骤。
单细胞沉积
本文报道的方法包括将B细胞群体的B细胞沉积为单细胞的步骤。在本文报道的所有方法的一个实施方案中，沉积为单细胞是通过荧光激活细胞分选(FACS)。用于FACS单细胞沉积所需的标记的表面标志可以使用本文所列特异性标志组合。
单细胞沉积之后和共培养之前的附加离心步骤增加抗体分泌细胞的数目和增加所分泌的IgG的量。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，该方法在共培养之前包括离心单个沉积细胞的步骤。在一个优选实施方案中，该离心按300xg进行5分钟。
共培养
在如本文报道的合成饲养混合物存在下将单个沉积B细胞与饲养细胞共培养。
在一个实施方案中，B细胞与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞共培养。
如上文所述，通过适宜的免疫荧光标记可以达到共培养步骤中产率(IgG+孔/细胞克隆的数目以及IgG浓度)的提高以及来自PBMC的鼠IgG+B细胞的富集或分离。
IgG+IgM-细胞的单细胞沉积可用于免疫和未免疫的非人动物的B细胞。
IgG+-和/或IgG+CD138+-和/或CD138+-和/或IgG+IgM--B细胞，和/或IgG+LC+-，和/或IgG+CD138+LC+-和/或CD138+LC+-和/或IgG+IgM-LC+-B-细胞的单细胞沉积可用于兔B细胞。
用于获自实验非人动物血液的B细胞的免疫荧光标记也可以用于标记获自实验非人动物(如小鼠、仓鼠和兔)的脾脏和其他免疫器官的B细胞。对于兔血液来源的B细胞，在排除巨噬细胞后发现0.2％的IgG+细胞。在排除巨噬细胞后，来自兔的淋巴集结显示0.4％的IgG+细胞，脾脏显示0.3％的IgG+细胞。
对于本文报道的方法，在共培养约七(7)天后，即5、6、7或8天后、尤其是7或8天后，可以获得足够的抗体浓度。对于由此提供的抗体量，可以进行高数目的不同分析来例如就结合特异性更详细地表征抗体。通过在筛选/选择过程的此早期阶段改善抗体表征，可能减少必须进行的所需的核酸分离和测序反应的数目。此外，B细胞克隆提供了一定量的允许使用简并PCR引物的编码单克隆抗体轻链和重链可变区的mRNA，避免了高特异性引物的需要。所需PCR循环数也减少。因此，在一个实施方案中，反转录酶PCR是使用轻链和重链可变结构域的简并PCR引物。
与饲养细胞的共培养步骤可以提前以及后加许多附加步骤。
由于作为培养上清的饲养混合物的来源(即其产生自培养的胸腺细胞的上清(胸腺细胞培养上清-TSN))，出现显著的批次与批次的变异。
TSN需要与饲养细胞组合来刺激(单个沉积的)B细胞，从而诱导增殖和抗体分泌。
为了克服此变异性，可以利用具有相同或相当刺激性质的合成饲养混合物。
用于合成饲养混合物的B细胞物种特异性添加剂导致各B细胞克隆所分泌的抗体的量增加。同时，高产细胞包含更多mRNA，这转而便于例如用冗余、非特异性引物组反转录和测序编码核酸。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，该共培养是在具有圆底孔的聚苯乙烯多孔板中。在本文报道的所有方法的一个实施方案中，孔的工作体积为50μl至250μl。在一个实施方案中，该孔至少部分用从聚合物塑料树脂和两亲性分子的混合物制备的非纤维底材包被，其中两亲性分子包含亲水部分和疏水区，其中疏水区锚定在底材内，亲水部分暴露在底材上。在一个实施方案中，该两亲性分子选自乙氧基化烷基胺、聚(乙烯亚胺)、辛基德洒明碱(octyldecamine)或其混合物(参见例如EP 1 860 181)。
共培养细胞的表征
为了在共培养后(定性和定量)测定所分泌的IgG，通常可以使用本领域技术人员已知的所有方法，如ELISA。在本文报道的所有方法的一个实施方案中，使用ELISA。
取决于表征结果，可以获得(即选择)B细胞克隆。术语“克隆”指产生自/源自单个B细胞的分裂且分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆产生单克隆抗体。
mRNA的分离、克隆和测序
可以从B细胞分离总mRNA，并转录为cDNA。使用特异性引物，可以扩增关连VH和VL区编码核酸。几乎未获得相同的序列。该方法提供高度多样的结合相同抗原的抗体。
用于扩增VH编码核酸的引物可以用于从来自NMRI小鼠、亚美尼亚仓鼠、Balb/c小鼠以及叙利亚仓鼠和兔的细胞获得的cDNA。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中，氨基酸序列源自所扩增的VH编码核酸，通过将氨基酸序列EVQL/QVQL定位至VSS(VH区)和DIVM/DIQM定位至KLEIK(VL区)来鉴定精确的起始点和结束点。
本文还报道用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供(获自实验非人动物血液的)(成熟)B细胞群体；
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中，用1至3种或2至3种荧光染料)染色B细胞群体的细胞；
c)在单个容器(在一个实施方案中，容器是多孔板的孔)中沉积经染色的B细胞群体的单细胞；
d)在饲养细胞和饲养混合物(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是如本文报道的合成饲养混合物)的存在下培养沉积的单B细胞；
e)测定单B细胞培养中分泌的抗体的结合特异性；
f)通过反转录酶PCR和核苷酸测序及由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域编码核酸来确定特异性结合抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列；
g)将单克隆抗体轻链和重链可变结构域编码核酸引入用于表达抗体的表达盒；
h)将核酸引入细胞；
i)培养细胞，并从细胞或细胞培养物上清回收抗体，从而产生抗体。
在一个实施方案中，该非人动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
本文报道的方法
本文报道了一种用于共培养单个沉积的B细胞的方法，所述B细胞可以是任何来源，其中饲养细胞在合适的共培养培养基中，其中所有细胞生长刺激添加剂是合成来源的。
本发明至少部分基于以下发现：单独的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯或乙佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)与合成细胞因子和合成白细胞介素的组合可以代替B细胞和饲养细胞，如鼠EL4-B5饲养细胞的共培养中使用的常用巨噬细胞/T细胞培养上清液。
本发明进一步至少部分基于以下发现：当使用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯与合成细胞因子和合成白细胞介素的组合时，这些组分中的每一种的浓度必须在一定范围内以确保积极效果。
本文报道的一个方面是共培养一种或多种B细胞(用于产生免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤：
-在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在下将一种或多种B细胞与饲养细胞共培养(从而产生免疫球蛋白)。
在一个实施方案中，共培养在1.5-7.25ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯存在下。
本文报道的一个方面是共培养一种或多种B细胞(用于产生免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤：
-在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)，IL-1β，TNFα，IL-2，IL-10和IL-6的存在下，将一种或多种B细胞与饲养细胞共培养(从而产生免疫球蛋白)。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/mlIL-1β，
约0.02-0.2ng/mlTNFα，
约0.5-5ng/mlIL-2，
约0.1-1ng/mlIL-10，和
约0.1-1ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mlIL-1β，
约0.064ng/mlTNFα，
约1.6ng/mlIL-2，
约0.32ng/mlIL-10，和
约0.32ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/mlIL-1β，
约0.02-0.2ng/mlTNFα，
约0.5-5ng/mIIL-2，
约0.1-1ng/mIIL-10，和
约0.1-1ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mlIL-1β，
约0.064ng/mlTNFα，
约1.6ng/mlIL-2，
约0.32ng/mlIL-10，和
约0.32ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/mlIL-1β，
约0.02ng/mlTNFα，
约0.5ng/mlIL-2，
约0.1ng/mlIL-10，和
约0.1ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/mlIL-1β，
约0.02-0.2ng/mlTNFα，
约0.5-5ng/mlIL-2，
约0.1-1ng/mIIL-10，和
约0.1-1ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mlIL-1β，
约0.064ng/mlTNFα，
约1.6ng/mlIL-2，
约0.32ng/mlIL-10，和
约0.32ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/mlIL-1β，
约0.02-0.2ng/mITNFα，
约0.5-5ng/mIIL-2，
约0.1-1ng/mIIL-10，和
约0.1-1ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mIIL-1β，
约0.064ng/mITNFα，
约1.6ng/mIIL-2，
约0.32ng/mIIL-10，和
约0.32ng/mIIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/mlIL-1β，
约0.02-0.2ng/mlTNFα，
约0.5-5ng/mlIL-2，
约0.1-1ng/mllL-10，和
约0.1-1ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/mlIL-1β，
约0.2ng/mlTNFα，
约5ng/mlIL-2，
约1ng/mlIL-10，和
约1ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mlIL-1β，
约0.064ng/mlTNFα，
约1.6ng/mlIL-2，
约0.32ng/mlIL-10，和
约0.32ng/mlIL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/mlIL-1β，
约0.064ng/mlTNFα，
约1.6ng/mlIL-2，
约0.32ng/mlIL-10，和
约0.32ng/mlIL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/mlIL-1β，
约0.02ng/mlTNFα，
约0.5ng/mlIL-2，
约0.1ng/mlIL-10，和
约0.1ng/mlIL-6。
在一个实施方案中，用于共培养中的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)的量以重量给出，且共培养中使用的IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的量以活性给出。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.5-2.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02-0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02-0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5-5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1-1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1-1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.2ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.064ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约1.6ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.32ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.32ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个优选的实施方案中，共培养是在以下的存在中：
约0.9ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.02ng/ml的具有5.5-14＊108IU/mg的(鼠的)IL-1β，
约0.02ng/ml的具有2.3-2.9＊108U/mg的(鼠的)TNFα，
约0.5ng/ml的具有6-7(优选的6.3)＊106IU/mg的(鼠的)IL-2，
约0.1ng/ml的具有6-7.5＊105IU/mg的(鼠的)IL-10，和
约0.1ng/ml的具有9.2-16.1＊108U/mg的(鼠的)IL-6。
在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4B5细胞。
在一个实施方案中，该方法用于共培养一个B细胞。在一个优选的实施方案中，一个B细胞是单个沉积的B细胞。
在一个实施方案中，共培养进一步存在金黄色葡萄球菌菌株Cowans细胞(SAC)。
在一个实施方案中，该培育持续5至14天。
在本文报道的所有方法中，共培养是在不存在胸腺细胞培养上清液的情况下。因此，添加的饲料混合物不是培养上清液。
在一个实施方案中，将胸腺细胞培养上清液、巨噬细胞培养上清液或T细胞培养上清液都不加入培养物中。
本文报道的另一个方面是包含约2ng/ml(鼠的)IL-1β、约2ng/ml(鼠的)TNFα、约50ng/ml(鼠的)IL-2、约10ng/ml(鼠的)IL-10和约10ng/ml(鼠的)IL-6，或由所述成分组成的饲养混合物。
本文报道的另一个方面是(合成的)饲养混合物的在共培养(鼠的)EL-4B5细胞与(单个沉积的)人、小鼠或兔B细胞中的用途，其包含约2ng/ml(鼠的)IL-1β、约2ng/ml(鼠的)TNFα、约50ng/ml(鼠的)IL-2、约10ng/ml(鼠的)IL-10和约10ng/ml(鼠的)IL-6，或由所述成分组成。
当在(鼠)EL4-B5细胞与(单个沉积的)(兔)B细胞的共培养中使用包含约2ng/ml(鼠的)IL-1β、约2ng/ml(鼠的)TNFα、约50ng/ml(鼠的)IL-2、约10ng/ml(鼠的)IL-10和约10ng/ml(鼠的)IL-6的合成饲养混合物时，IgG阳性孔的频率与使用TSN时的频率相当。
表
平均生产率也与使用TSN时的平均生产率相当(见下表)。
表
当除合成饲料混合物外还添加PMA(3ng/ml)时，则结果显著不同(参见下表)。
表
已经发现，当使用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯与合成细胞因子和合成白细胞介素的组合时，这些组分中的每一种的浓度需要在一定范围内，以确保协同效应。
包含2ng/ml(鼠的)IL-1β、2ng/ml(鼠的)TNFα、50ng/ml(鼠的)IL-2、10ng/ml(鼠的)IL-10和10ng/ml(鼠的)IL-6的合成饲养混合物在下表中称为1xCM。
因此，如下表所示的0.1xCM饲养混合物对应于包含0.2ng/ml(鼠的)IL-1β、0.2ng/ml(鼠的)TNFα、5ng/ml(鼠的)IL-2、1ng/ml(鼠的)IL-10和1ng/mi(鼠的)IL-6的合成饲养混合物。
令人惊讶地发现，在PMA存在下，合成饲料混合物的浓度可以降低，而不会损害IgG阳性孔数量的增加以及生产率的提高。同时，细胞不会被过度刺激并且从而消除积极的影响。
还令人惊讶地发现，通过单独使用PMA，即在不存在细胞因子和白细胞介素的情况下，可以实现相当数量的IgG阳性孔并且甚至可以提高生产率。
IgG阳性孔数量[总数的％]：
n.d.＝未测定
平均IgG生产率[μg/ml]：
n.d.＝未测定
抗原特异性克隆的数量不受影响(对于从用人血清白蛋白(HSA)免疫的兔获得的B细胞，如下所示)。
抗-HAS抗体阳性孔的数量[总共的％]：
n.d.＝未测定
抗-HAS抗体阳性孔的数量[IgG阳性孔的％]：
n.d.＝未测定
对于0.1xCM、0.032xCM和不含CM的条件，进一步评估PMA浓度的影响(从o到+++++的相对权重)。
不受该理论的束缚，假设为了在重叠范围内具有稳健的方法值，导致IgG阳性孔的最佳总数，将使用生产力和抗原特异性孔的数量。
提供以下实施例和序列来辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中显示。应理解，可在所示流程中进行修改而不背离本发明的精神。
实施例
材料和方法
重组DNA技术
用Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中所述的标准方法来操作DNA。分子生物学试剂按厂家说明书使用。
培养基和缓冲液
用于ELISA的封闭缓冲液包含1XPBS和1％BSA。
用于ELISA的包被缓冲液包含4.29g Na2CO3＊10 H2O和2.93g NaHCO3，加水至1L终体积，用2N HCl调节pH9.6。
用于RNA分离的乙醇溶液包含70％乙醇或80％乙醇。
用于免疫荧光染色的FACS缓冲液包含1X PBS和0.1％BSA。
用于ELISA的IMDM缓冲液包含1X PBS、5％IMDM和0.5％BSA。
用于ELISA的培育缓冲液1包含1X PBS、0.5％CroteinC。
用于ELISA的培育缓冲液2包含1X PBS、0.5％CroteinC和0.02％Tween 20。
用于ELISA的培育缓冲液3包含1X PBS、0.1％BSA。
用于ELISA的培育缓冲液4包含1X PBS、0.5％BSA、0.05％Tween、PBS(10X)、0.01MKH2PO4、0.1M Na2HPO4、1.37M NaCl、0.027M KCI、pH 7.0。
用于ELISA的洗涤缓冲液1包含1X PBS、0.05％Tween 20。
用于ELISA的洗涤缓冲液2包含1X PBS、0.1％Tween 20。
用于ELISA的洗涤缓冲液3包含水、0.9％NaCI、0.05％Tween 20。
EL-4B5培养基包含补充了10％FCS、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES和0.05mM β-巯基乙醇的RPMI 1640。
动物管理和免疫
按照德国动物保护法(TierSCHG)以及按照各欧洲指南饲养实验动物。
用NZW兔(获得自Charles River Laboratories International，Inc.)进行免疫。根据AAALACi认可的动物设施中的附录A“动物住宿和护理指南”饲养动物。所有动物免疫方案和实验均经Upper Bavaria政府批准(许可证号55.2-1-54-2532-90-14)，并根据GermanAnimal Welfare Act和European Parliament and Council的2010/63号指令进行。
通常，将抗原按1mg/ml的浓度溶解在K3PO4缓冲液pH 7.0中，并与弗氏完全佐剂混合(1∶1)，直至产生稳定乳剂。兔接受2ml乳剂皮内(i.d.)注射，然后按一周间隔接受各1ml的第二次肌内(i.m.)注射和第三次皮下(s.c.)注射。两周后进行第四次1ml i.m.注射，然后按四周间隔再进行两次1ml s.c.注射。
免疫期间，用抗原特异性测定测定血清抗体效价。在IC50为1∶10000的抗体效价，取出免疫动物的血液或脾脏。为了再活化抗原特异性B细胞，在取出血液或脾脏前三天对实验动物静脉内应用30μg至50μg抗原。
更详细地，在第0天通过皮内施用，用400μg重组人血清白蛋白蛋白(HSA；CAS RN70024-90-7；Sigma)免疫12-16周龄的NZW兔，然后，在第1、2、6、10和23周，通过肌内和皮下注射交替，用完全或不完全弗氏佐剂乳化的200μgHSA免疫。
器官、血液和巨噬细胞的取出
通常，通过穿刺耳静脉或对于更大体积通过穿刺耳动脉来从兔获得血液。在第三、第四、第五和第六次免疫后4-6天从兔采集全血(10ml)，用于通过FACS进行单细胞分选。
具体地，从第3次免疫开始向前，在免疫后第4、5和6天采集血液(估计总血量的10％)。制备血清用于通过ELISA的免疫原特异性IgG滴度测定，并分离外周单核细胞，其在B细胞克隆过程中用作抗原特异性B细胞的来源。
通过附着于细胞培养塑料来从所获得的血液分离巨噬细胞。用1xPBS将含EDTA的全血稀释两倍，然后在lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories)或Ficoll PaquePlus(GE Healthcare，目录号17-1440-03)上进行密度离心，进行这来分离兔PBMC。洗涤PBMC两次，然后用抗体染色。
密度梯度离心
通过按厂家说明书A用(-mammal，Cedarlane)进行密度梯度离心来实现外周血单核细胞(PBMC)的分离。
用磷酸缓冲盐溶液(PBS)2∶1稀释所抽的血。在离心管中，提供相同体积的密度分离介质，通过管壁小心加入稀释的血液。离心管800x g无制动离心20分钟。从白色中间层获得淋巴细胞。取出的细胞补充10ml PBS，800x g离心10分钟。弃上清，将沉淀重悬、洗涤、离心。最终沉淀重悬在PBS或培养基中。
巨噬细胞的排除
用无菌6孔板(细胞培养级)来通过非特异性黏附排除巨噬细胞和单核细胞。孔是未包被的，或是用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉抗生物素蛋白包被的。每个孔装入3ml至(最多)4ml培养基和至多6x106个来自免疫的兔的外周血单核细胞，使其在培养箱中37℃结合60至90分钟。然后将含有淋巴细胞的上清转移至离心管，800x g离心10分钟。沉淀重悬在PBS或培养基中。
抗原特异性B细胞的富集
用包被缓冲液将各抗原稀释至2μg/ml终浓度。将3ml此溶液加至6孔多孔板的孔，室温过夜培育。使用前，去除上清，用PBS洗涤孔两次或3次。调节B细胞溶液至细胞密度为2x106细胞/ml，在6孔多孔板的每个孔中加入3ml(每3-4ml培养基至多6x106细胞)。37℃培育平板60至90分钟。去除上清，通过用1xPBS小心洗涤孔1-4次来去除非黏附细胞。为了回收粘性抗原特异性B细胞，向多孔板的孔中加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液，37℃培育5至15分钟。通过加入培养基终止培育，将上清转移至离心管。用PBS洗涤孔两次，将上清与其他上清组合。通过800x g离心10分钟沉淀细胞。细胞在免疫荧光染色前保持在冰上。可选地将沉淀重悬在PBS中。
T细胞的活化
从4-5周龄兔分离T细胞。离心细胞并立即培养或按3x 107细胞的整分试样冷冻。胸腺细胞按5x 105细胞/ml的最小细胞密度接种175cm2培养瓶中的EL-4 B5培养基，并在37℃培育48小时。
巨噬细胞的培养
来自兔的血液单核细胞按至少1x 105细胞/ml的细胞密度在EL-4B5培养基中在175cm2培养瓶中37℃培养1.5小时。然后去除培养基，并通过用温EL-4 B5培养基洗涤来从附着的巨噬细胞去除非附着细胞，然后在35ml培养基中培养48小时。
T细胞和巨噬细胞的共培养
将T细胞和巨噬细胞在分开的培养瓶中培养48小时。组合两种细胞群体之前，将T细胞800x g离心10分钟。弃上清，将细胞沉淀重悬在10ml培养基中。调节T细胞至最小细胞密度为5x 105细胞/ml，每毫升培养基加入10pg佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)和5ng或50ng植物凝集素M(PHA-M)。从巨噬细胞去除培养基，向含有巨噬细胞的培养瓶中加入T细胞悬液。共培养36小时后，取出培养基，并称之为TSN溶液。为了去除剩余细胞，将TSN溶液过滤通过0.22μm滤器。TSN溶液按4ml整分试样冷冻于-80℃。
免疫荧光染色
流程1：
取决于待染色细胞的数目，分别在100μl培养基(少于106细胞)或200μl培养基(多于106细胞)中提供细胞。用5％实验动物血清和FACS缓冲液将荧光标记抗体分别稀释至100μl或200μl终体积。在辊架上4℃避光培育反应混合物40分钟。培育后，按300x g 5分钟洗涤细胞两次。将沉淀重悬在400μl PBS中，过滤通过70μm滤网。将过滤的溶液转移至FACS管，在FACS实验前即刻通过加入碘化丙啶(6.25μg/ml)来染色死细胞。如果抗体缀合有生物素，则用链霉抗生物素蛋白标记的荧光团(例如Alexa Flour(R)647(抗体197))在第二步骤中检测该抗体。
流程2：
用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F，Düsseldorf，德国)。
对于表面染色，使细胞与最适稀释在PBS中的抗兔IgG FITC抗体4℃避光滚动培育30分钟。离心后，通过吸取去除上清。对PBMC进行两轮离心和冰冷PBS洗涤。最后，将PBMC重悬在冰冷PBS中，并立即进行FACS分析。在FACS分析前加入浓度5μg/ml的碘化丙啶(BDPharmingen，San Diego，CA，USA)来区分死细胞和活细胞。在其他实验中，通过FACS对染色细胞进行单细胞沉积。
用配有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria来采集和分析数据。
增殖测定
a)Cell Titer Glo(CTG)活率测定
按厂家说明书使用CTG活率测定(Promega；#G7571)。
b)3H胸苷测定
培育6天后，加入3H胸苷(0.5μCi/孔)，再培育16小时。用微孔板闪烁计数器(Wallac)测定细胞增殖期间的3H胸苷掺入。
c)显微镜分析
为了获取显微图像，使用了与高分辨率相机(Leica DFC290 HD)组合的来自Leica的相差显微镜(Leica DM IL)。
d)通过CFSE标记分析B细胞活化。
用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤分离的B细胞。将至多1x107细胞重悬在1ml无蛋白质PBS中，与终浓度2.5μM的CFSE(#C34554，Invitrogen/Molecular Probes)在37℃培育3至10分钟。通过加入过量补充FCS的培养基来终止CFSE加载。用含FCS的培养基充分洗涤后，将B细胞用于共培养实验。在所示时间点后通过流式细胞术分析(FL-1通道)来确认CFSE稀释液引起的CD19+门控(B)细胞的增殖。
IgG的定量
通常，共培养7天后将在其中进行共培养的96孔多孔板300x g离心5分钟。取出150μl上清，用PBS按2∶1的比例稀释在第二块96孔多孔板中。抗体按50ng/ml的浓度使用。如果5分钟培育时间后OD值为1或超过1，则测试0.8至108ng/ml IgG的稀释系列。
具体地，将0.5μg/ml生物素化小鼠抗兔IgG抗体(Sigma-Aldrich)和0.35μg/ml抗兔IgG HRP缀合物(Sigma-Aldrich)的混合物转移至384孔链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(MicroCoat Biotechnologie有限公司)。加入补充有0.5％BSA和0.05％-20的PBS中的B细胞上清的稀释液，并在RT下孵育90分钟。在用PBST(磷酸盐缓冲盐水，含0.2％-20)缓冲液重复洗涤(6x)后，用BMHRP底物溶液显色板，并通过370nm处的吸光度测量颜色形成。商业兔IgG(Sigma-Aldrich)用作校准标准品。
抗原特异性IgG的检测
通常，可以就特异性抗原结合来表征由单个沉积和共培养的B细胞或获自免疫的实验动物的B细胞产生的抗体。ELISA在室温进行，单个步骤之间在振荡器上20x g培育ELISA溶液。在第一步中，使抗原结合于96孔多孔板的孔。如果抗原是蛋白质，将它稀释在包被缓冲液中并直接加至平板。肽抗原通过特异性结合对生物素/链霉抗生物素蛋白结合。多孔板的孔可以已经由厂家用可溶性CroteinC(CrC)包被。如果没有，则在固定化抗原后用200μl封闭缓冲液培育孔。分别用每孔100μl抗原溶液(预包被多孔板)或200μl封闭缓冲液培育后，通过用洗涤缓冲液洗涤来去除未结合的抗原或封闭缓冲液。按每孔100μl的体积加入稀释的B细胞上清并培育。培育后，洗涤孔。然后按每孔100μl的体积加入检测抗体。抗体可以缀合辣根过氧化物酶或带有生物素标记。用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物测定检测抗体。培育后，洗涤多孔板，然后每孔加入50μl含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液，并培育表X中给出的时间。通过加入50μl硫酸终止酶促反应，用分光光度计(Rainbow Thermo ELISA Reader)和Xread plus软件在450nm和680nm测定光密度。
具体地，在室温下(RT)在具有PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液的384孔Maxisorp微量滴定板(Thermo Scientific)上进行测定，所述缓冲液补充有0.5％明胶和0.025％-20。将板用0.5μg/ml人血清白蛋白(HSA，Sigma-Aldrich)包被至少2小时至过夜。用PBST(含有0.1％-20的PBS)缓冲液洗涤(3x)后，用含有0.5％明胶和0.1％-20的PBS封闭孔。再次，将板洗涤3次，然后加入B细胞上清稀释。在用PBST温育60分钟和3个洗涤步骤后，将1∶4000稀释的HRP-缀合的抗-兔IgG抗体(Amersham)转移到孔中并温育60分钟。最后，用PBST反复洗涤板(6x)并用BMHRP底物溶液显色30分钟。在392-405nm处测量吸光度。
抗原上的淘选
a)平板包被
生物素/链霉抗生物素蛋白：用PBS中浓度为0.5-1(2)μg/ml的生物素化抗原室温培育无菌链霉抗生物素蛋白包被6孔板(细胞培养级)1小时。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
共价结合蛋白质：用含2μg/ml蛋白质的碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠，pH 9.55)4℃过夜包被无菌细胞培养6孔板。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
b)在肽上淘选B细胞
用每4ml培养基至多6x106细胞接种各抗原包被的6孔组织培养板，使其在培养箱中37℃结合1小时。通过用1x PBS小心洗涤孔1-2次来去除未黏附的细胞。通过用胰蛋白酶在培养箱中37℃处理10分钟来脱附剩余的黏性细胞，然后在培养基中洗涤两次。细胞在免疫荧光染色前保持在冰上。
实施例1
EL-4 B5细胞的培养
在37℃水浴中快速融化冷冻的EL-4B5细胞，并用10ml EL-4B5培养基稀释。300x g离心10分钟后，弃上清，将沉淀重悬在1ml培养基中。
将EL-4 B5细胞按8x 10细胞/ml的细胞密度接种在T175培养瓶中。每两天测定细胞密度，并调整至8x 104细胞/ml。细胞具有约18小时的倍增时间。
收获细胞并调整至1x106细胞/ml的细胞密度，然后按50Gy进行γ-辐射。
实施例2
B细胞和EL-4 B5细胞的共培养
在含200μl/孔EL-4 B5培养基(分别含Pansorbin Cells(SAC)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，Deutschland)、EL-4 B5细胞(5×104/孔)和兔胸腺细胞上清(TSN)或具有PMA的细胞因子混合物(CM))的96孔板中于5％CO2大气的培养箱内37℃培养单个细胞分选的B细胞7天。取出B细胞培养物上清用于筛选，立即收集细胞用于可变区基因克隆或在100μl RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冷冻于-80℃。
Claims (17)
1.一种共培养单个沉积的B细胞的方法，包括步骤
-在1.5-7.25ng/ml波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯存在下，与饲养细胞共培养B细胞，
其中，胸腺细胞培养上清液，巨噬细胞培养上清液或T细胞培养上清液均未加入培养物中。
2.一种共培养B细胞的方法，包括步骤
-在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，IL-1β，TNFα，IL-2，IL-10和IL-6存在下，共培养B细胞与饲养细胞，
其中，胸腺细胞培养上清，巨噬细胞培养上清或T细胞培养上清均不加入培养物中。
3.根据权利要求2的方法，其中共培养在以下的存在下：
0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
0.02-0.2ng/ml IL-1β，
0.02-0.2ng/ml TNFα，
0.5-5ng/ml IL-2，
0.1-1ng/ml IL-10，和
0.1-1ng/ml IL-6。
4.根据权利要求2至3中任一项的方法，其中共培养在以下的存在下：
约0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml IL-1β，
约0.2ng/ml TNFα，
约5ng/ml IL-2，
约1ng/ml IL-10，和
约1ng/ml IL-6。
5.根据权利要求2至3中任一项的方法，其中共培养在以下的存在下：
约0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml IL-1β，
约0.064ng/ml TNFα，
约1.6ng/ml IL-2，
约0.32ng/ml IL-10，和
约0.32ng/ml IL-6。
6.根据权利要求2至3中任一项的方法，其中共培养在以下的存在下：
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml IL-1β，
约0.064ng/ml TNFα，
约1.6ng/ml IL-2，
约0.32ng/ml IL-10，和
约0.32ng/ml IL-6。
7.根据权利要求3至6中任一项的方法，其中
IL-1β具有的活性为5.5-14＊108IU/mg，
TNFα具有的活性为2.3-2.9＊108U/mg，
IL-2具有的活性为6-7＊106IU/mg，
IL-10具有的活性为6-7.5＊105IU/mg，和
IL-6具有的活性为9.2-16.1＊108U/mg。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中饲养细胞是EL4-B5细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中共培养进一步在存在SAC下。
10.用于生产抗体的方法，其包括根据权利要求1至9中任一项的共培养方法。
11.饲养混合物，其包含佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6。
12.饲养混合物，其包含
0.3-3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
0.02-0.2ng/ml IL-1β，
0.02-0.2ng/ml TNFα，
0.5-5ng/ml IL-2.
0.1-1ng/ml IL-10，和
0.1-1ng/ml IL-6。
13.饲养混合物，其包含
0.05-0.7ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.2ng/ml IL-1β，
约0.2ng/ml TNFα，
约5ng/ml IL-2，
约1ng/ml IL-10，和
约1ng/ml IL-6。
14.饲养混合物，其包含
0.2-0.35ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯，
约0.064ng/ml IL-1β，
约0.064ng/ml TNFα，
约1.6ng/ml IL-2，
约0.32ng/ml IL-10，和
约0.32ng/ml IL-6。
15.饲养混合物，其包含
约1.3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯
约0.064ng/ml IL-1β，
约0.064ng/ml TNFα，
约1.6ng/ml IL-2，
约0.32ng/ml IL-10，和
约0.32ng/ml IL-6。
16.根据权利要求12至15中任一项的饲养混合物，其中
IL-1β具有的活性为5.5-14＊108IU/mg，
TNFα具有的活性为2.3-2.9＊108U/mg，
IL-2具有的活性为6-7＊106IU/mg，
IL-10具有的活性为6-7.5＊105IU/mg，和
IL-6具有的活性为9.2-16.1＊108U/mg。
17.根据权利要求11至16中任一项的饲养混合物的用途，其用于B细胞和饲养细胞的共培养中。
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