CN110621773A

CN110621773A - 用于产生胸腺细胞上清液的方法

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Publication number: CN110621773A
Application number: CN201880032716.6A
Authority: CN
Inventors: S·奥夫纳; M·霍瓦特; I·萨姆
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN110621773B; US20200165566A1; US20240117308A1; JP6978516B2; WO2018210896A1; EP3625332B1; JP2020520650A; EP3625332A1; US11891624B2

Abstract

本文中报道了一种用于产生胸腺细胞上清液的方法，所述方法包括步骤：将至少0.5:1.2细胞比率的胸腺细胞和单个核细胞在佛波醇‑12‑肉豆蔻酸酯‑13‑乙酸酯和植物凝集素M存在下共培养多达60小时，以及将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。

Description

用于产生胸腺细胞上清液的方法

本文中报告了用于产生胸腺细胞上清液的改良方法。这种上清液可以例如用在共培养沉淀的单一B细胞或B细胞与饲养细胞的汇集物中。

发明背景

为了获得分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，从免疫接种的实验动物获得的仅部分B细胞可以融合并增殖。B细胞的来源通常是免疫接种的实验动物的器官如脾。

在1984年Zubler等人开始开发获得分泌单克隆抗体的细胞的不同方法(参见，例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-63；J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中，B细胞从免疫接种的实验动物的血液获得并且与鼠EL-4B5饲养细胞在包含细胞因子的饲养混合物存在下共培养。

Kwekkeboom,J.等人(J.Immunol.Meth.160(1993)117-127)报告了基于用鼠胸腺瘤细胞系活化人B淋巴细胞，产生人单克隆抗体的高效方法。报告了对于人B细胞，培养条件应当是在PMA(5ng/ml)加5％T细胞上清液存在下采用照射过的EL4B5。

Weitkamp,J-H.等人(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报告了从采用荧光病毒样颗粒选择的抗原特异性单一B细胞中产生针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。

Weber,M.等人(J.Immunol.Meth.278(2003)249-259)报告了组合基于EL4-B5的B细胞刺激与噬菌体展示技术以成功分离人抗Scl-70自身抗体片段。

US 2006/0051348中报告了一种产生多种分离的针对多种相关抗原的抗体的方法。

在WO 2008/144763和WO 2008/045140中，分别报告了针对IL-6的抗体及其用途和获得抗原特异性B细胞克隆性群体的培养方法。

在US 2007/0269868中，报告了一种获得抗原特异性B细胞克隆性群体的培养方法。

Masri等人(在Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报告了大肠杆菌中克隆和表达从针对炭疽毒素的单一人淋巴细胞获得的功能性Fab片段。

WO 2007/031550中报告了一种用于制备免疫球蛋白文库的方法。

在WO 2011/147903中，报告了单一B细胞培养方法，其中在包含IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6中一者或多者的合成性饲养混合物存在下共培养。

在WO 2013/076139中，报告了表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途。

在US 7,807,415中，报告了用于产生稳定的永生化B淋巴细胞的方法。

在EP 0 488 470中，报告了用于产生抗体的方法。

在WO 2015/000624中，报告了羊B细胞和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)的共培养。

在WO 2012/178150中，报告了用于形成抗原特异性抗体生产细胞系和单克隆抗体的方法。

D.S.Verma等人(Scand.J.Haem.28(1982)254-263)报告了人体中单核细胞-巨噬细胞对T淋巴细胞衍生集落刺激活性调节的精心实验结果。

发明概述

本文中报告了用于产生胸腺细胞上清液(TSN)的改进方法。采用本发明方法获得的上清液可以作为添加物用于沉淀的单一B细胞(其可以是任何来源的)与饲养细胞在合适的共培养培养基中共培养。

采用本领域已知方法产生的TSN显示批间变异性高。因此，不得不在使用之前表征这些批次并且低性能的批次不得不丢弃(或以更高浓度使用)，导致成本增加。

本发明至少部分地基于以下发现：在制备TSN期间增加巨噬细胞浓度导致更稳健的生产工艺。另外，作为添加物在B细胞与饲养细胞共培养中使用时，采用本发明方法产生的TSN导致分泌IgG的B细胞的数目增加以及所述共培养中获得的IgG浓度更高。由于获得更高的IgG浓度，表征相应B细胞分泌的抗体的更多测定法可以根据培养进行。

如本文中报告的一个方面是一种用于产生胸腺细胞上清液的方法，所述方法包括以下步骤：

-将胸腺细胞和单个核细胞(巨噬细胞)以0.5:1.2或更大的细胞比率在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和植物凝集素M(PHA-M)存在下共培养多达60小时，并且

-将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。

在一个实施方案中，胸腺细胞/单个核细胞比率是0.5:1.2至0.5:6或0.5:1.2至0.5:4。在一个优选的实施方案中，该比率是约0.5:2。

在一个实施方案中，该比率是每ml培养基。

在一个实施方案中，胸腺细胞的细胞密度是约5 x 10⁵个细胞/ml(0.5 x 10⁶个细胞/ml)。

在一个实施方案中，从(幼年)实验动物的胸腺获得胸腺细胞。在一个实施方案中，胸腺细胞是T细胞。

在一个实施方案中，在共培养之前，将胸腺细胞在37℃在培养基中温育多达60小时。在一个实施方案中，这种温育持续约30-46小时。

在一个实施方案中，将胸腺细胞和单个核细胞共培养约30-46小时。

在一个实施方案中，从(成年)实验动物的血液分离单个核细胞。在一个实施方案中，从(成年)实验动物的PBMC分离单个核细胞。在一个实施方案中，将单个核细胞通过贴附于固体表面与(成年)实验动物的PBMC分离。在一个实施方案中，按1 x 10⁶个细胞/ml的细胞密度分离。在一个优选的实施方案中，单个核细胞是巨噬细胞。在一个实施方案中，与胸腺细胞共培养之前，将单个核细胞在培养基中培养多达60小时，在一个实施方案中培养30-48小时。

在一个实施方案中，在共培养胸腺细胞和单个核细胞之前，将胸腺细胞的培养基替换为含有10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和5μg/ml植物凝集素M(PHA-M)的新鲜培养基。

在一个实施方案中，通过从单个核细胞移除培养基并添加胸腺细胞悬液，启动共培养。

在一个实施方案中，单个核细胞的培养基是EL4-B5培养基。在一个实施方案中，培养基是罗斯维尔公园纪念学院培养基(RPMI)培养基，其补充有FCS、谷氨酰胺/青霉素/链霉素、丙酮酸钠、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和β-巯基乙醇。

在全部方面的一个实施方案中，培养和/或共培养处于这样的培养基中，所述培养基包含补充有10％(v/v)FCS、1％(w/v)包含青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI 1640培养基，还包含0.05μMβ-巯基乙醇。

如本文中报告的一个方面是一种用于共培养一种或多种B细胞的方法，所述方法包括步骤

-将一种或多种B细胞与EL4-B5细胞在采用如本文中报告的方法产生的TSN存在下共培养。

在一个实施方案中，与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株Cowan细胞(SAC)和采用如本文中报告的方法产生的胸腺细胞培养上清液共培养。

在一个实施方案中，该方法用于共培养一种B细胞。在一个优选的实施方案中，一种B细胞是沉淀的单一B细胞。

在一个实施方案中，共培养持续5至10天。

如本文中报告的一个方面是一种用于产生抗体的方法，所述方法包括步骤：将一种或多种B细胞与EL4-B5饲养细胞在采用如本文中报告的方法产生的TSN存在下共培养。

在一个实施方案中，用于共培养一种或多种B细胞或用于产生抗体的方法包括共培养步骤之前的以下步骤：

-将B细胞群体中已经用一种至四种荧光染料/荧光团标记的那些B细胞作为单一细胞沉淀，

共培养的结果是B细胞克隆，即作为单一B细胞的后代的B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞群体是非人类动物B细胞群体。在一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体、或仓鼠B细胞群体、或兔B细胞群体。在一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞群体是人B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从血液获得B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。

在全部方面的一个实施方案中，将单一细胞(各自)沉淀入多孔板的各孔中。

在一个实施方案中，动物是实验动物。在一个实施方案中，实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。在一个实施方案中，实验动物是兔。

定义

术语“抗体”在本文中用来指天然存在的抗体，包括其天然存在的结构性变体。

例如，天然(人，小鼠，大鼠，兔)IgG抗体是分子量约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。天然IgG抗体由两条相同轻链和两条相同重链组成，包含链键和链内二硫键，从而全部四条链彼此共价连接。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中柔性铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。可以将抗体重链分配入五个类型之一，取决于其序列和结构域结构，所述五个类型称作IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(抗体的“类别”)。这些类别中的几种可以进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链结构域(CL)。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。

例如，天然(驼类(camelid)，即来自胼足亚目(Tylopoda)骆驼属(Camelidae)，包括骆驼、单峰驼和羊驼)仅有重链的抗体(VHH抗体)不包含如常规IgG重链中存在的经典CH1结构域，并且因此，表达为与抗体的铰链区-CH2-CH3结构域直接融合的VHH结构域。来自羊驼衍生的VHH抗体的可变区序列例如与人可变结构域VH3家族中的序列相似(Schroeder等人,Int.Immunol.2(1989)41-50)。与IgG型抗体相比，大羊驼(L.llama)VHH结构域中的CDR3结构域氨基酸序列平均比包含重链和轻链的经典IgG型抗体的大部分CDR3结构域长。类似于经典IgG抗体，可以通过本领域熟知的方法确定VHH抗体中CDR的位置(参见，例如US 5,637,677)。残基11、37、44、45和47对形成链界面重要(参见，例如WO 99/42077)。

“抗体片段”指不是完整抗体(IgG/VHH＝四条链/两条链)的分子，所述分子仅包含完整抗体的一部分并且结合与完整抗体结合的相同抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单结构域抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞，任选地CHO K1细胞(例如ATCC CCL-61或DSM ACC 110)，或CHO DG44细胞(也称作CHO-DHFR[-]，例如DSM ACC 126)，或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan,D.等人,Biochemistry 26(1987)2959-2963)，或CHO-S细胞，或Super-CHO细胞(Pak,S.C.O.等人Cytotechnol.22(1996)139-146)，或BHK细胞，或NS0细胞，或Sp2/0细胞，或HEK 293细胞，或HEK 293 EBNA细胞，或PER.细胞，或COS细胞。如果这些细胞不适应于无血清培养基中或悬浮下生长，可以在本发明方法中使用之前进行适应。如本文所用，表述“细胞”包括主题细胞及其后代。因此，措词“转化体”和“转化的细胞”包括原代主题细胞和从其衍生的培养物，而无论转移或继代培养次数是多少。还应当理解，全部后代可以在DNA含量方面不是精确地相同，原因在于有意或不经意突变。包括具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。

术语“克隆”指产生自/源自单一B细胞的正在分裂和分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆是同质B细胞群体并且产生单克隆抗体。

术语“实验动物”指非人类动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、羊驼、非人灵长类、绵羊、犬、奶牛、鸡、两栖类、鲨鱼和爬行类。在一个实施方案中，实验动物是兔。

如本文所用的术语“表达”指细胞内部出现的转录和/或翻译和分泌过程。细胞中目的核酸序列的转录水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量来确定。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过qPCR或RT-PCR或通过RNA印迹杂交定量(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。可以通过使用识别并与多肽结合的免疫球蛋白的各种方法，例如通过ELISA、通过分析多肽的生物学活性，或通过使用与这类活性无关的测定法，如蛋白质印迹法或放射免疫测定，定量核酸编码的多肽(参见Sambrook等人(1989)，上文)。

对于本领域技术人员，熟知将氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)转换成编码这种氨基酸序列的相应核酸序列的程序和方法并且反之亦然。因此，核酸以其由各个核苷酸组成的核酸序列为特征并且同样地以其编码的多肽的氨基酸序列为特征。

“表达盒”指含有旨在至少表达细胞中所含核酸而必需的调节元件(如启动子和多聚腺苷化位点)的构建体。

表达可以作为瞬时表达或稳定表达进行。抗体通常被产生它的细胞分泌入培养基。因此，不成熟抗体链含有对抗体穿过细胞壁运输/分泌入胞外介质为必需的N末端延伸(也称作信号序列)。通常，用于抗体重组产生的信号序列可以衍生自编码分泌型多肽的任何基因。如果使用异源信号序列，它应当是一个由宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶切割)的序列。对于酵母中分泌，例如，待表达的异源基因的天然信号序列可以由衍生自分泌基因的同源酵母信号序列替换，如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)α-因子前导序列，第二者在US 5,010,182中描述)、酸性磷酸酶信号序列或白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞中，天然信号序列令人满意，但是其他哺乳动物信号序列可以是合适的，如来自相同或相关物种的其他分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌信号序列，例如，单纯疱疹糖蛋白D信号序列。编码这种前区段的DNA片段符合可读框地连接，即与编码抗体链的DNA片段有效连接。

术语“表达装置(expression machinery)”指细胞中参与基因表达步骤的酶、辅因子等的总和，所述基因表达步骤始于核酸或基因的转录步骤(即也称作“基因表达装置”)至核酸编码的多肽的翻译后修饰。表达装置例如包括以下步骤：DNA转录成前mRNA、前mRNA剪接成为成熟的mRNA、翻译成mRNA的多肽及多肽的翻译后修饰。

“表达质粒”或“表达载体”是一种核酸，其提供在宿主细胞中表达所包含结构基因所要求的全部元件。一般，表达质粒/载体包含原核质粒增殖单元，例如针对大肠杆菌的原核质粒增殖单元，包含复制起点和选择标记、真核选择标记，以及一个或多个用于表达目的结构基因的表达盒，所述表达盒各自包含启动子、结构基因，任选地转录终止子和多聚腺苷化信号。基因表达通常置于启动子的控制下，并且将这种结构基因称作“与该启动子有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。

术语“饲养混合物”指促进B细胞活化和/或存活和/或抗体分泌的不同添加物(如生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的组合。饲养混合物无论如何不是天然饲养混合物，即它不获自胸腺细胞的培养上清液(TSN)，所述胸腺细胞的培养上清液是细胞因子的不确定组合。在如本文报告的方法中，若存在，则饲养混合物是合成性饲养混合物，所述合成性饲养混合物是促进B细胞活化和/或存活和/或抗体分泌的重组产生或化学合成的不同添加物(即生长因子、细胞因子、白介素和PMA)的确定组合。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”或“转染子”和“转化的细胞”及“转染的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的细胞相同的功能或生物学活性。

“人抗体”是这样的抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“标记”指用于确定表面标志物存在或不存在的方法，其中可以通过特异结合性和标记的抗表面标志物抗体与细胞结合/不结合，确定所述表面标志物。因此，例如在荧光标记物的情况下，依据荧光出现，确定表面标志物存在，而依据细胞或细胞群体与相应的特异结合性和标记的抗表面标志物抗体温育后荧光不存在，确定表面标志物不存在。

如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从单一细胞克隆产生的基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

术语“PMA”指佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，一种小子化学化合物。其IPUAC名称是(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-4a,7b-二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基肉豆蔻酸酯。这种化合物也称为TPA、12-O-十四碳酰佛波醇-13-乙酸酯、十四碳酰佛波醇乙酸酯、十四碳酰佛波醇乙酸酯、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、12-O-十四碳酰佛波醇13-乙酸酯、12-十四碳酰佛波醇13-乙酸酯、12-十四碳酰佛波醇13-单乙酸酯、13-O-乙酰基佛波醇12-肉豆蔻酸酯、4β-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，1,1aα,1bβ,4,4a,7aα,7b,8,9,9a-十氢-4aβ,7bα,9β,9aα-四羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8α-四甲基-5H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-5-酮9a-乙酸酯的肉豆蔻酸9-酯、(+)-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、PMA、PMA(肿瘤助癌物)、十四碳酸(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-4a,7b二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基酯、十四碳酸9a-(乙酰氧基)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-4a,7b-二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基酯、[1aR(1aα,1bβ,4aβ,7aα,7bα,8α,9β,9aα)]-TPA和TPA(佛波醇衍生物)。

“转染质粒/载体”是这样的核酸(也称作核酸分子)，其提供在宿主细胞中表达转染质粒/载体中所包含的编码性核酸/结构基因所要求的全部元件。转染质粒/载体包含原核质粒增殖单位，例如对于大肠杆菌，转而包含原核复制起点；和赋予原核选择剂抗性的核酸，转染质粒/载体还包含一种或多种赋予真核选择剂抗性的核酸和一种或多种编码目的多肽的核酸。赋予选择剂抗性的核酸和编码目的多肽的核酸各自置于表达盒内部，其中每个表达盒包含启动子、编码性核酸和包含多聚腺苷化信号的转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，并且将这种结构基因称作“与该启动子有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与使抗体结合其抗原的区域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如Kindt,T.J.等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库(参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

术语“幼年动物”指性成熟出现之前的动物。幼年仓鼠例如具有小于6周，尤其小于4周的年龄。幼年小鼠例如具有小于8周，尤其小于5周的年龄。幼年兔具有小于8周，尤其约5周的年龄。

术语“罗斯维尔公园纪念学院培养基(RPMI)”指具有以下组成的培养基：

最终培养基以[mg/L]计的组分：

无机盐

其他组分

无水D(+)-葡萄糖 2000

还原型L-谷胱甘肽 1

氨基酸

维生素

在一个实施方案中，单个核细胞的培养基是改良的罗斯维尔公园纪念学院培养基(RPMI)，其中向每450ml RPMI培养基添加50ml胎牛血清(FCS)、5ml谷氨酰胺/青霉素/链霉素混合物(100x；10mM柠檬酸盐缓冲液中10.000单位青霉素、10.000μg链霉素和29.2mg/mlL-谷氨酰胺)、10ml丙酮酸钠溶液、5ml 1M HEPES缓冲液，500μl(50mM)β-巯基乙醇。

发明详述

此后，使用兔B细胞例示本发明。这是一个实例并且不得解释为限制。本发明可以用任何来源的B细胞实施。

A.在本发明之前TSN的产生

通过制备兔胸腺细胞上清液(TSN)生成兔特异性细胞因子。因此，使用兔T细胞和兔巨噬细胞(参见，例如Weber,M.等人,J.Immunol.Meth.(2003)；Steenbakkers,P.G.等人,Mol.Biol.Rep.(1994))。兔T细胞前体可以分离自4-5周龄兔的胸腺(参见，例如WO 2011/147903；参见，Seeber等人,PLoS ONE(2014)e86184)。

简而言之，将胸腺细胞按细胞密度5 x 10⁵个细胞/ml接种于细胞培养瓶中的培养基内并在37℃温育约48小时。通过在37℃在培养基中按1-3 x 10⁶个细胞/ml的细胞密度贴附，使用分离自成年兔血液的PBMC来富集单核细胞/巨噬细胞。在培养基中培养贴壁的单核细胞/巨噬细胞约48小时。在分立的瓶中保持从不同兔获得的T细胞和巨噬细胞。在混合T细胞和巨噬细胞之前，将T细胞离心并按5 x 10⁵个细胞/ml的细胞密度重悬于含有10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和5μg/ml植物凝集素M(PHA-M)的培养基中。将培养基从巨噬细胞培养物移除并且由T细胞悬液替换，以具有1 x 10⁶个细胞/ml的最终巨噬细胞浓度。在共培养48小时后，取出T细胞/巨噬细胞条件培养基并且称作(TSN)。

在下表中，显示采用如上文概述的方法产生的TSN批次的特征(也参见图1，左侧部分；使用以实施例10的方法产生的TSN，采用实施例12的方法获得)。

表

因此，采用如现有技术已知的方法产生的TSN批次显示批间变异性高。因此，不得不鉴定并且弃去低性能的TSN批次或在B细胞共培时以更高的量添加，这二者连同其他均导致成本增加。

B.采用如本文报告的新的和创造性方法产生TSN

本文中报告了用于产生胸腺细胞上清液(TSN)的改进方法。采用如本文中所报告方法产生的TSN可以作为添加物用于沉淀的单一B细胞(其可以是任何来源的)与饲养细胞在合适的共培养培养基中共培养。

本发明至少部分地基于以下发现：在制备TSN期间增加巨噬细胞/T细胞比率导致这样的TSN制备物，其中作为添加物用于B细胞和饲养细胞的共培养时，所述制备物导致更高的总体IgG浓度。这转而导致以下有益效果：可以根据培养上清液进行更多测定法。此外，这种改进降低TSN批次的排放率(discharge rate)。

-将胸腺细胞和单个核细胞按0.5:1.2或更大的细胞比率在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和植物凝集素M(PHA-M)存在下共培养多达60小时，并且

-将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。

在一个实施方案中，胸腺细胞/单个核细胞比率是0.5:1.2至0.5:4。在一个实施方案中，该比率是0.5:1.5至0.5:3。在一个优选的实施方案中，该比率是约0.5:2。

在一个实施方案中，在共培养之前，将胸腺细胞在37℃在培养基中温育多达60小时。在一个实施方案中，这种温育持续约30-46小时。在一个优选的实施方案中，持续约40小时。

在一个实施方案中，从(成年)实验动物的血液分离单个核细胞。在一个实施方案中，从(成年)实验动物的PBMC分离单个核细胞。在一个实施方案中，将单个核细胞通过贴附于固体表面与(成年)实验动物的PBMC分离。在一个实施方案中，按1-3 x 10⁶个细胞/ml的细胞密度分离，在一个优选的实施方案中，按约2 x 10⁶个细胞/ml的细胞密度分离。在一个优选的实施方案中，贴壁的单个核细胞是巨噬细胞。在一个实施方案中，与胸腺细胞共培养之前，将贴壁的单个核细胞在培养基中培养多达60小时，在一个优选的实施方案中培养约40-48小时。

在一个实施方案中，单个核细胞的培养基是EL4-B5培养基。在一个实施方案中，培养基是补充有FCS、谷氨酰胺/青霉素/链霉素、丙酮酸钠、HEPES缓冲液和β-巯基乙醇的RPMI1640培养基。

已经发现，取决于胸腺细胞(T细胞)与单个核细胞(巨噬细胞)共培养时存在的巨噬细胞的量，即取决于所述细胞的比率，产生的TSN显示不同的特性。下表中显示相应结果(总孔数＝4*84)。

表

在下表中，显示采用根据如本文报告的本发明方法产生的TSN批次的特征(也参见图1，右侧部分；使用以实施例9的方法产生的TSN，采用实施例12的沉淀的单一B细胞获得)。

表

因此，采用如本文报告的本发明方法产生的TSN批次显示批间变异性降低。另外，培养上清液中分泌型IgG浓度增加。

C.使用以如本文报告的本发明方法产生的TSN批次的B细胞克隆方法

免疫

为了产生治疗性抗体，用治疗靶(单独或与免疫原性刺激物组合)免疫接种非人类动物以激发免疫应答，或使用合成性方法，如噬菌体展示文库。如果使用转基因动物(即具有人类免疫系统)或人噬菌体展示文库，则获得人抗体。否则，获得非人类动物抗体，后续将对其进行人源化。获得潜在治疗性抗体的罕见可能性是来自从疾病恢复的人类的血液。

经常使用非人类动物，如小鼠、兔、仓鼠和大鼠作为评价基于抗体疗法的动物模型。因此，通常需要提供与非人类动物抗原以及人抗原结合的交叉反应性抗体。

在如本文报告的方法中，可以使用从任何来源获得的B细胞，例如在一个实施方案中，一种或多种人、小鼠、仓鼠或兔B细胞)。

在兔B细胞的情况下，饲养细胞可以是表达兔CD40L的鼠EL4-B5细胞或哺乳动物细胞(如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞)。在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZW)兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia突变品系兔、basilea突变品系兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除兔和其杂交种。

在人B细胞的情况下，饲养细胞可以是表达人CD40L的鼠EL4-B5细胞或哺乳动物细胞(如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞)。

在鼠B细胞的情况下，饲养细胞可以是表达小鼠CD40L的鼠EL4-B5细胞或哺乳动物细胞(如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞)。在一个实施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或balb/c-小鼠。

在仓鼠B细胞的情况下，饲养细胞可以是表达仓鼠CD40L的鼠EL4-B5细胞或哺乳动物细胞(如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞)。在一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(灰仓鼠(Cricetulus migratorius))、中国仓鼠(黑线仓鼠(Cricetulus griseus))和叙利亚仓鼠(金黄地鼠(Mesocricetulus auratus))。在一个实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。

在一个实施方案中，为免疫接种选择的非人类动物，例如小鼠、仓鼠和兔，年龄不超过12周。

B细胞的来源和分离

血液提供高度多样的产生抗体的B细胞。从其获得的B细胞克隆分泌在CDR内几乎没有相同或重叠氨基酸序列的抗体，因此，显示高度多样性。

在一个实施方案中，获得(例如从血液获得)来自免疫接种后4天直至免疫接种或非人类动物最新近强化免疫后最多9天的B细胞。这种时间跨度允许如本文报告的方法中的高度灵活性。在这个时间跨度中，可能的是提供最有亲和性的抗体的B细胞从脾脏移行至血液(参见，例如Paus,D.等人,JEM 203(2006)1081–1091；Smith,K.G.S.等人,The EMBO J.16(1997)2996–3006；Wrammert,J.等人,Nature 453(2008)667-672)。

可以用本领域已知的任何方法从例如非人类动物的血液或从人血获得B细胞。例如，可以使用密度梯度离心(DGC)或红细胞裂解(溶胞作用)。与低渗性溶胞作用相比，密度梯度离心提供更高的总产率，即B细胞克隆数目。另外，从通过密度梯度离心获得的细胞中，较大数目的细胞在共培养步骤中分裂并生长。另外，与采用不同方法获得的细胞相比，分泌型抗体的浓度更高。因此，在一个实施方案中，通过密度梯度离心提供B细胞群体。

共培养之前的选择步骤

产生特异性结合抗原的抗体的B细胞可以例如富集自外周血单个核细胞(PBMC)。因此，在全部方法的一个实施方案中，如本文报告的B细胞群体富集自外周血单个核细胞(PBMC)。

在如本文报告的全部方法的一个实施方案中，消耗PBMC的巨噬细胞。对于共培养步骤，这有利于兔源B细胞。可以通过贴附于细胞培养平板的表面，从PBMC消耗巨噬细胞。

在如本文中报告的方法的一个实施方案中，B细胞来自蛋白质免疫接种的动物并且在标记之前消耗其巨噬细胞。

可以通过使用淘洗方法，分别减少或富集不产生结合抗原的抗体的细胞或同样地，产生与抗原结合的抗体的细胞。在淘洗时，呈现与表面接合的相应抗原，并且可以在细胞群体中/从其中选择性地富集与之结合的细胞(在这种情况下，进一步加工与表面结合的抗原结合的细胞)。

在一个实施方案中，如本文所报告的方法包括在单一细胞沉淀之前的选择步骤，其中基于细胞表面标志物和荧光激活的细胞分选法/设门，选择产生特异性和/或无交叉反应性抗体的B细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B细胞。为了选择来自不同非人类动物物种的B细胞，可以使用不同的细胞表面标志物。

通过标记非目标细胞群体和非特异结合性淋巴细胞，可以选择性地消耗这些细胞。在这个消耗步骤中，仅可以实现部分消耗。尽管消耗不是定量的，但它提供了成功荧光标记剩余细胞的优势，因为干扰性细胞的数目降低。通过使用荧光激活的细胞分选法进行成熟B细胞(记忆B细胞，亲和力成熟的浆母细胞和浆细胞)的单一细胞沉淀，可以在共培养步骤中获得更高IgG⁺孔数/沉淀的单一细胞数。

可以通过使用不同的表面标志物，特异性标记不同的细胞群体，例如CD3⁺细胞(T细胞)、CD19⁺细胞(B细胞)、IgM细胞(成熟的幼稚B细胞)、IgG⁺细胞(成熟的B细胞)、CD38⁺细胞(例如，浆母细胞)和IgG⁺CD38⁺细胞(前浆细胞)。

对成熟IgG⁺B细胞如记忆B细胞，浆母细胞和浆细胞的免疫荧光标记选择是可用的。为了选择或富集B细胞，将细胞单一标记或双重标记或三重标记。另外，有利的是这样的标记，其导致相对于总细胞群体约0.1％至2.5％标记细胞的比例。

在一个实施方案中，B细胞作为单一细胞沉淀，其中通过标记群体中0.1％至2.5％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞，在另一个实施方案中，通过标记群体中0.3％至1.5％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞，在又一个实施方案中，通过标记群体中0.5％至1％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞。

在一个实施方案中，该方法的条件是若细胞为兔源，则标记不涉及IgG⁺B细胞和/或CD138⁺B细胞。

在如本文报告的全部方法的一个实施方案中，IgG⁺CD19⁺B细胞作为单一细胞沉淀，所述单一细胞来自从未免疫接种的非人类动物或从人类获得的B细胞。

表：用于确定成熟小鼠(A-J)、仓鼠(K)和兔(L-N)B细胞的免疫荧光标记。

B细胞来源	用以下分选B细胞	占全部活细胞的比例(％)
			小鼠	IgG<sup>+</sup>CD19<sup>+</sup>	0.5±0.2n＝14
小鼠	IgG<sup>+</sup>CD38<sup>+</sup>	0.8±0.5n＝9
			小鼠	IgG<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup>	0.06±0.07n＝6
小鼠	IgG<sup>-</sup>CD138<sup>+</sup>	0.6±0.5n＝6
			小鼠	IgG<sup>+</sup>CD27<sup>+</sup>	0.1±0.1n＝8
小鼠	CD27<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup>	1.5±0.5n＝2
			小鼠	CD27<sup>+</sup>IgG<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup>	0.10±0.04n＝3
小鼠	CD3<sup>-</sup>CD27<sup>+</sup>	1.33n＝1
			小鼠	IgG<sup>+</sup>CD268<sup>+</sup>	0.8n＝1
小鼠	CD38<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup>	12±7n＝2
			仓鼠	IgG<sup>+</sup>IgM<sup>-</sup>	0.6±0.1n＝15
兔	IgG<sup>+</sup>	0.6±0.2，n＝5
			兔	IgG<sup>+</sup>IgM<sup>-</sup>	0.4±0.2，n＝2
兔	IgG<sup>+</sup>CD138<sup>+</sup>	0.3±0.1，n＝5

在一个实施方案中，这些方法包括步骤：消耗B细胞群体的巨噬细胞并富集B细胞群体中分泌特异性结合靶抗原的抗体的B细胞。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是非人类动物B细胞群体。在一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体、或仓鼠B细胞群体、或兔B细胞群体。在一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞群体是人B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。

在全部方面的一个实施方案中，用一种或三种荧光染料标记沉淀的细胞并且与二至四种荧光标记的抗体温育。

在全部方面的一个实施方案中，对B细胞群体中B细胞的标记导致标记(总)B细胞群体中0.1％至2.5％的细胞。

在全部方面的一个实施方案中，标记属于B细胞表面IgG。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗轻链抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面抗体轻链)并且选择对细胞表面IgG为阳性且对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(产生IgG⁺LC⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)，从而B细胞群体已经与固定在固体表面上的(靶)抗原温育，并且(仅)与固定化抗原结合的B细胞已经回收并且经历与荧光标记的抗体温育。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD19抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面CD19)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面CD19也为阳性的细胞(产生IgG⁺CD19⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD38抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面CD38)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面CD38也为阳性的细胞(产生IgG⁺CD38⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部先前实施方案的一个实施方案中，额外与荧光标记的抗轻链抗体温育(标记是针对细胞表面抗体轻链和其他两种标记物)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(产生LC⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体温育(标记针对细胞表面IgG)并且选择对细胞表面IgG阳性的细胞(产生IgG⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部先前实施方案的一个实施方案中，兔B细胞额外地与荧光标记的抗轻链抗体温育(标记是针对细胞表面抗体轻链和其他两种标记物)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(产生LC⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是鼠B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体温育(标记针对细胞表面IgG)并且选择对细胞表面IgG阳性的细胞(产生IgG⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是鼠B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD19抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面CD19)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面CD19也为阳性的细胞(产生IgG⁺CD19⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

单一细胞沉淀

如本文所报告的方法包括步骤：将B细胞群体的B细胞作为单一细胞沉淀。在如本文报告的全部方法的一个实施方案中，通过荧光激活的细胞分选法(FACS)，作为单一细胞沉淀。用于FACS单一细胞沉淀所要求的标记的表面标志物可以具有如本文概述的具体标志物组合。

沉淀是通过将标记的B细胞制备物引入流式细胞仪并且将那些已经用一种至三种荧光标记物标记的细胞作为单一细胞沉淀。由于可以将细胞与多种荧光染料(如那些在细胞分选仪中用于选择细胞的荧光染料)温育，可以对细胞选择特定表面标志物的存在和(任选地)同时选择其他表面标志物的不存在。

进行标记和单一细胞沉淀，旨在通过消耗那些不太可能产生具有预期特征的抗体的B细胞，降低B细胞群体的复杂度。标记的抗体与B细胞表面上展示的特定多肽结合并且因此提供正向选择标记物。同样，还可能选择与相比于与B细胞温育的标记抗体的数目，仅用减少数目的荧光染料标记的细胞，例如，具有两种荧光标记物中的一种荧光标记物的细胞(即，与两种荧光标记的抗体温育，但是仅其中一种与B细胞结合)。基于荧光标记的抗体与B细胞群体的各个B细胞结合/不结合，可以使用微流体分选装置，鉴定并分离靶B细胞。同时采用选择，还可以确定标记物的量。

一个在单一细胞沉淀后和在共培养之前的额外离心步骤可以增加分泌抗体的细胞的数目和分泌型IgG的量。

在如本文报告的全部方法的一个实施方案中，该方法包括步骤：与饲养细胞共培养之前离心沉淀的单一细胞。在一个优选的实施方案中，以300x g离心5分钟。

共培养

沉淀的单一B细胞可以与饲养细胞在采用如本文中报告的方法产生的TSN作为添加物存在下共培养。在一个实施方案中，B细胞与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞共培养。

采用饲养细胞的共培养步骤可以先于并且还可以后继于众多额外的步骤。

通过共培养约七(7)天后，即在5、6、7或8天后，特别地在7或8天后使用采用如本文中报告的方法产生的TSN，可以在培养上清液中获得高抗体浓度。采用由此提供的抗体量，可以进行大量不同的分析旨在更详细地表征抗体，例如关于结合特异性方面。在筛选/选择过程中在这个早期阶段抗体表征改善时，可以减少不得不进行的所要求的核酸分离和测序反应的数目。另外，B细胞克隆提供了允许利用简并PCR引物的编码单克隆轻链和重链可变区的mRNA的量，并避免要求高度特异的引物。另外，要求的PCR循环数目减少。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR采用轻链和重链可变结构域的简并PCR引物。

在如本文报告的全部B细胞共培养方法的一个实施方案中，采用如本文中报告的方法获得胸腺细胞培养上清液。

表征共培养的细胞

为了共培养后(定性和定量)确定分泌型IgG，通常可以使用本领域技术人员已知的全部方法如ELISA。在如本文报告的全部方法的一个实施方案中，使用ELISA。

根据表征结果，可以获得，即选择B细胞克隆。术语“克隆”指产生自/源自单一B细胞的正在分裂和分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆产生单克隆抗体。

使用如本文所报告方法的其他方法：

如本文中报告的一个方面是一种用于共培养一种或多种B细胞(以产生免疫球蛋白)的方法，所述方法包括步骤：

-在采用如本文中报告的方法产生的TSN存在时，将一种或多种B细胞与饲养细胞共培养(和因而产生免疫球蛋白)。

在一个实施方案中，该方法还包括步骤

-从细胞或培养基回收免疫球蛋白并因而产生免疫球蛋白。

在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗体。

在一个实施方案中，在1.5–7.25ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯存在下进一步共培养。

在一个实施方案中，在金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)存在下进一步共培养。

在一个实施方案中，饲养细胞是(鼠)EL4-B5细胞。

在一个实施方案中，共培养持续5至14天。

在一个实施方案中，用于共培养一种或多种B细胞的方法包括共培养步骤之前的以下步骤：

-将B细胞群体中已经用一种至三种荧光染料/荧光团标记的那些B细胞作为单一细胞沉淀，

-将B细胞群体中已经与二至四种各自与不同B细胞表面抗原特异性结合的抗体接触的那些B细胞作为单一细胞沉淀，因而每种抗体缀合于不同的荧光染料，但仅用一种至三种荧光染料标记。

在一个实施方案中，通过使B细胞群体(依次或同时)与二至四种荧光标记的抗体接触，进行标记。

在一个实施方案中，用于共培养一种或多种B细胞的方法包括步骤：在单一细胞沉淀/沉淀过程之前，在共培养培养基中温育B细胞群体。在一个实施方案中，在约37℃温育。在一个实施方案中，温育持续0.5小时至两小时。在一个实施方案中，温育持续约一小时。在一个优选的实施方案中，在约37℃温育约一小时。

在一个实施方案中，用于共培养一种或多种B细胞的方法包括在沉淀步骤后和在共培养步骤之前离心沉淀的单一B细胞的步骤。在一个实施方案中，离心持续约1分钟至约30分钟。在一个实施方案中，离心持续约5分钟。在一个实施方案中，按约100x g至约1,000xg离心。在一个实施方案中，按约300x g离心。在一个优选的实施方案中，按约300x g离心约5分钟。

在一个实施方案中，用于共培养一种或多种B细胞的方法包括以下步骤作为第一步骤

a)用一种至三种荧光染料标记B细胞群体的B细胞(任选地通过将B细胞群体与二至四种荧光标记的与二至四种不同的预定B细胞表面标志物特异性结合的抗体温育)，

b)任选地在共培养培养基中温育细胞，

c)将B细胞群体中已经用一种至三种荧光染料标记(和任选地不用其他荧光染料标记)的那些B细胞作为单一细胞沉淀，

d)任选地离心沉淀的单一B细胞，

e)在已经补充有饲养混合物的共培养培养基中(各自)将每种沉淀的单一B细胞与饲养细胞共培养，

f)选择步骤e)中增殖并分泌抗体的B细胞克隆。

如本文中报告的一个方面是一种用于产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤

b)任选地在共培养培养基中温育细胞，

d)任选地离心沉淀的单一B细胞，

f)选择步骤e)的分泌抗体的B细胞克隆，

g)i)从步骤f)中选择的B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸，

ii)如果B细胞克隆不是人B细胞克隆，则使可变结构域人源化并提供相应的编码性核酸，和

iii)在一种或多种表达载体中引入一种或多种核酸，

h)培养已经用步骤g)的一种或多种表达载体转染的细胞，和从细胞或培养上清液回收抗体，并且因而产生该抗体。

在一个实施方案中，用于产生抗体的方法包括以下步骤

b)任选地在共培养培养基中温育细胞，

d)任选地离心沉淀的单一B细胞，

f)确定分泌在各自B细胞的培养基中的抗体的结合特异性，

g)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序，从B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸(并且因而获得编码单克隆抗体可变轻链和重链结构域的核酸)，

h)如果B细胞是非人类B细胞，使可变轻链和重链结构域人源化并且提供编码人源化可变结构域的核酸，

i)在一种或多种用于表达(人或人源化)抗体的表达载体中引入编码单克隆抗体可变轻链和重链可变结构域的核酸，

j)在细胞中引入表达载体，

k)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液回收抗体并且因而产生该抗体。

在一个实施方案中，从B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸包括以下步骤

-从产生抗体的B细胞克隆提取总RNA，

-进行提取的聚腺苷酸⁺mRNA的单链cDNA合成/逆转录，

-用物种特异性引物集合进行PCR，

-任选地移除PCR引物/纯化PCR产物，

-任选地对PCR产物测序。

在一个实施方案中，在用于表达(人或人源化)抗体的表达载体中引入编码单克隆抗体可变轻链和/或重链可变结构域的核酸包括以下步骤

-可变轻链和重链可变结构域的T4聚合酶温育，

-表达载体的线性化和扩增，

-扩增的表达载体的T4聚合酶温育，

-将编码可变结构域的核酸不依赖序列和连接克隆入扩增的表达载体，并且

-从载体汇集物转化的大肠杆菌细胞制备载体。

在一个实施方案中，上述方法包含括紧邻标记步骤之前的以下步骤

-将B细胞群体与固体表面上固定的(靶)抗原温育并且(仅)回收与固定化抗原结合的B细胞。

在一个实施方案中，从免疫接种后4天的非人类动物的血液获得B细胞群体。在一个实施方案中，从免疫接种后4天直至最多9天的非人类动物的血液获得B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞群体是人B细胞群体。

在一个实施方案中，通过密度梯度离心从血液获得B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。

在一个实施方案中，将单一细胞(各自)沉淀入多孔板的各孔中。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，用一种或三种荧光染料标记沉淀的细胞并且与二至四种荧光标记的抗体温育。

在一个实施方案中，对B细胞群体中B细胞的标记导致标记(总)B细胞群体中0.1％至2.5％的细胞。

在一个实施方案中，标记是B细胞表面IgG。

在一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)，从而B细胞群体已经与固定在固体表面上的(靶)抗原温育，并且(仅)与固定化抗原结合的B细胞已经回收并且经历与荧光标记的抗体温育。

在一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD19抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面CD19)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面CD19也为阳性的细胞(产生IgG⁺CD19⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个实施方案中，额外与荧光标记的抗轻链抗体温育(标记是针对细胞表面抗体轻链和其他两种标记物)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(产生LC⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体温育(标记针对细胞表面IgG)并且选择对细胞表面IgG阳性的细胞(产生IgG⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体温育(标记针对细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(产生IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个实施方案中，兔B细胞额外地与荧光标记的抗轻链抗体温育(标记是针对细胞表面抗体轻链和其他两种标记物)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(产生LC⁺B细胞的单一细胞沉淀)。

在一个实施方案中，共培养处于这样的共培养培养基中，所述共培养培养基包含补充有10％(v/v)FCS、1％(w/v)包含青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI(1640)培养基。在一个实施方案中，共培养培养基还包含0.05mMβ-巯基乙醇。

提供以下附图和实施例以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。

附图简述

该图显示采用从现有技术已知的方法产生(左侧部分)和采用如本文报告的本发明方法产生(右侧部分)的TSN批次的批间变异性。实心正方形：相应TSN批次的IgG阳性孔数与采用参比TSN批次获得的IgG阳性孔数比率；虚点-虚线：IgG阳性孔数的比率平均数；实心三角形：孔中采用相应TSN批次获得的平均IgG浓度与孔中采用参比TSN批次获得的平均IgG浓度的比率；短划线：IgG浓度比率的平均数。

实施例

材料和方法

重组DNA技术

如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。

培养基和缓冲液

ELISA用封闭缓冲液包含1X PBS和1％BSA。

ELISA用包被缓冲液包含4.29g Na₂CO₃*10H₂O和2.93g NaHCO₃，添加水至终体积1升，用2N HCl调节pH 9.6。

RNA分离用乙醇溶液包含70％乙醇或80％乙醇。

免疫荧光染色用FACS缓冲液包含1X PBS和0.1％BSA。

ELISA用IMDM缓冲液包含1X PBS、5％IMDM和0.5％BSA。

ELISA用温育缓冲液1包含1X PBS、0.5％CroteinC。

ELISA用温育缓冲液2包含1X PBS、0.5％CroteinC和0.02％Tween 20。

ELISA用温育缓冲液3包含1X PBS、0.1％BSA。

ELISA用温育缓冲液4包含1X PBS、0.5％BSA、0.05％Tween、PBS(10X)、0.01MKH₂PO₄、0.1M Na₂HPO₄、1.37M NaCl、0.027M KCl，pH 7.0。

PCR缓冲液包含500mM KCl、15mM MgCl₂、100mM Tris/HCl，pH 9.0。

ELISA用洗涤缓冲液1包含1X PBS、0.05％Tween 20。

ELISA用洗涤缓冲液2包含1X PBS、0.1％Tween 20。

ELISA用洗涤缓冲液3包含水、0.9％NaCl、0.05％Tween 20。

EL-4B5培养基包含补充有10％FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA,Pasching,奥地利)、2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,德国)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco,Paisley,苏格兰)的RPMI 1640(PanBiotech、Aidenbach，德国)。

动物护理

根据德国动物保护法(TierSCHG)以及根据相应欧洲指南维持实验动物。

小鼠和仓鼠在6至8周龄接收并且在12周年龄之前免疫接种。将抗原连同弗氏完全佐剂(CFA)一起首次施加。随弗氏不完全佐剂(IFA)进一步施加。皮下施加含有抗原的乳液，其中取决于接收时实验动物的体重，乳液包含50至100μg量的抗原。

增殖测定法

a)Cell Titer Glo(CTG)活力测定法

根据生产商的说明使用CTG活力测定法(Promega；#G7571)。

b)³H胸苷测定法

在6天温育后，添加³H-胸苷(0.5μCi/孔)并进一步温育16小时。用微量平板闪烁计数器(Wallac)测定细胞增殖期间³H-胸苷的掺入。

c)显微分析

为了采集显微镜图像，使用与高分辨照相机(Leica DFC290 HD)组合的来自Leica的相差显微镜(Leica DM IL)。

d)借助CFSE标记法分析B细胞活化。

用无菌磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤分离的B细胞。将多达1 x 10⁷个细胞重悬于1ml无蛋白质PBS中并且在37℃与终浓度2.5μM的CFSE(#C34554，Invitrogen/MolecularProbes)温育3至10分钟。通过添加补充有FCS的过量培养基终止CFSE加载。用含有FCS的培养基充分洗涤后，B细胞用于共培养实验中。在指示的时间点后，通过流式细胞分析(FL-1通道)证实因CFSE稀释所致的CD19⁺设门的(B)细胞增殖。

IgG定量

共培养七天后，将其中进行共培养的96孔多孔平板以300x g离心5分钟。取出150μl上清液并且用PBS按比率2:1在第二块96孔多孔平板中稀释。

以50ng/ml的浓度使用抗体。如果在5分钟温育时间后OD为或超过1，则测试0.8至108ng/ml IgG的稀释系列。

抗原上淘洗

a)平板包被

生物素/链霉亲和素：将链霉亲和素包被的无菌6孔平板(细胞培养级)与PBS中浓度0.5–1(2)μg/ml的生物素酰化抗原在室温温育一小时。使用前，将平板在无菌PBS中洗涤三次。

共价结合的蛋白质：将无菌的细胞培养6孔平板用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠，34mM碳酸钠，pH 9.55)中的2μg/ml蛋白质在4℃包被过夜。使用前，将平板在无菌PBS中洗涤三次。

B)在肽上淘洗B细胞

经相应抗原包被的6孔组织培养板用多达6 x 10⁶个细胞/4ml培养基铺种并且允许在培养箱中37℃结合一小时。通过用1 x PBS小心洗涤各孔1-2次，移除未贴壁的细胞。借助胰蛋白酶在37℃在培养箱中10分钟，将剩余的黏附细胞脱离并且随后在培养基中洗涤二次。将细胞在冰上保持直至免疫荧光染色。

基因合成

在Geneart GmbH(雷根斯堡，德国)制备编码cDNA的目的基因区段。基因区段旁侧分布有单一限制性核酸内切酶切割位点以促进如下文描述的表达构建体克隆过程。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。

兔B细胞培养基/EL4-B5培养基：

兔B细胞培养基添加物

SAC#507858 Calbiochem

多孔平板

96孔U形平板#3799 Corning

抗体的表型分型/分选

山羊抗兔IgG Fc抗体AbDSerotec STAR121F

抗人/鼠(兔交叉反应性)

抗CD40L抗体：

抗muCD40L抗体R&D systems AF1163

抗huCD40L抗体&D systems AF617 R

驴抗山羊IgG抗体Alexa 488 Molecular Probes A11055

杂项

抗FITC抗体偶联的微珠Miltenyi Biotec#130-048-701

人B细胞阴性分离试剂盒Invitrogen#113.13D

Nucleofector试剂盒T Lonza VCA-1002

总IgG的CBA BD Biosciences#558679

实施例1

兔免疫接种

NZW兔(Charles River Laboratories International,Inc.)用于免疫接种。将抗原以1mg/ml的浓度溶解于K₃PO₄缓冲液pH 7.0中并且与弗氏完全佐剂(CFA)混合(1:1)直至产生稳定的乳液。兔接受皮内(i.d.)注射2ml乳液，随后第二次肌内(i.m.)注射和第三次皮下(s.c.)注射，每次采用1ml，间隔一周。二周后进行第四次i.m.注射1ml，随后是两次进一步s.c.注射1ml，间隔四周。

在免疫接种期间，用抗原特异性测定法测定血清抗体滴度。在IC₅₀ 1:10000的抗体滴度时，取出免疫接种的动物的血液或脾脏。为了再活化抗原特异性B细胞，在取出血液或脾脏之前三天，将30μg至50μg抗原静脉内施加至实验动物。

实施例2

取出器官、血液和巨噬细胞

通过穿刺耳静脉或(为了较大体积)穿刺耳动脉从兔获得血液。在第三、第四、第五和第六次免疫接种后4-6天，从兔采集全血(10ml)并且用于FACS单细胞分选。

通过贴附于细胞培养塑料件从获得的血液分离巨噬细胞。

如果需要较大的量，则分离腹膜巨噬细胞。为此，动物不得不为至少3月龄。为了取出腹膜巨噬细胞，处死动物并将温度为37℃的5ml EL-4B5培养基立即注入腹膜腔。在捏合动物腹部5分钟后，取出含有细胞的溶液。

将含有EDTA的全血用1 x PBS二倍稀释，之后在Lympholyte-Mammal(CedarlaneLaboratories)或Ficoll Paque Plus(GE Healthcare,目录号17-1440-03)上密度离心，其中进行所述密度离心以分离兔PBMC。用抗体染色之前，将PBMC洗涤二次。

实施例3

密度梯度离心

采用根据生产商的说明书A(-mammal,Cedarlane)通过密度梯度实现外周血单个核细胞(PBMC)的分离。

将抽取的血液(任选地补充有EDTA)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)1:1稀释，例如60ml血液加60ml缓冲液。在离心机小瓶中，提供相同体积的密度分离介质并将稀释的血液经由小瓶的壁小心地添加在密度分离介质的顶部。密度分离介质对PBS稀释的血液的比率是约1:1.5。取决于稀释的血液的总体积，将需要某个数目的小瓶。将小瓶以800x g离心20分钟，无制动。将每个分别的白色中间层添加至25ml PBS，用PBS补充至总计50ml并且以800x g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1/120终体积的PBS中，按1:1基础合并沉淀物并且添加PBS至终体积50ml。此后，将小瓶再次离心。取决于血液样品的份数，在每个离心步骤后，将样品按1:1比率合并直至仅留下一份样品。最终的沉淀物重悬于PBS中。

实施例4

红细胞的低渗溶胞

为了通过低渗溶胞作用破坏红细胞，将氯化铵溶液(BD Lyse^TM)用水1:10稀释并且以1:16的比率添加至全血。为了裂解红细胞，将混合物于黑暗下温育15分钟。为了分离细胞碎片与完好的细胞，将溶液以800x g离心10分钟。弃上清液，将沉淀物重悬于PBS中，再次洗涤，离心并将沉淀物重悬于PBS中。实施例8

实施例5

消耗巨噬细胞

无菌6孔平板(细胞培养级)用来通过非特异性贴附消耗巨噬细胞和单核细胞。用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉亲和素及对照肽包被各孔。每个孔用3ml至(最多)4ml培养基和来自免疫接种兔的多达6 x 10⁶个外周血单个核细胞填充并且允许在37℃在培养箱中结合60至90分钟。此后，转移含有淋巴细胞的上清液至离心小瓶并以800x g离心10分钟。将沉淀物重悬于PBS中。

实施例6

富集抗原特异性B细胞

用包被缓冲液稀释相应抗原至终浓度2μg/ml。将3ml这种溶液添加至6孔多孔平板的各孔并在室温温育过夜。在使用之前，移除上清液并且将孔用PBS洗涤两次。调节B细胞溶液至细胞密度2 x 10⁶个细胞/ml并且将3ml添加至6孔多孔平板的每个孔(每3-4ml培养基多达6 x 10⁶个细胞)。将平板在37℃温育60至90分钟。移除上清液并且通过用1 x PBS小心洗涤各孔1-4次，移除未贴壁的细胞。为了回收黏附的抗原特异性B细胞，将1ml胰蛋白酶/EDTA溶液添加至多孔平板的各孔并在37℃温育10至15分钟。通过添加培养基终止温育并且将上清液转移至离心小瓶。将孔用PBS洗涤两次并将上清液与其他上清液合并。通过以800xg离心10分钟，使细胞沉淀。将细胞在冰上保持直至免疫荧光染色。将沉淀物任选地重悬于PBS中。

实施例7

T细胞培养

分别从3-4周龄小鼠和仓鼠的胸腺或4-5周龄兔的胸腺分离T细胞。将细胞离心并且立即以4-5 x 10⁷个细胞等分培养或冷冻。在175cm²培养瓶中，以5 x 10⁵个细胞/ml EL-4B5培养基的最小细胞密度接种胸腺细胞并且在37℃温育长达48小时(40-48小时，这取决于使用巨噬细胞的TSN产生方法；参见实施例9和实施例10)。

实施例8

巨噬细胞培养

分别从年龄至少三个月的小鼠和仓鼠的腹膜腔分离巨噬细胞。将来自小鼠或仓鼠的腹膜巨噬细胞或来自兔的血单个核细胞在175cm²培养瓶的EL-4B5培养基中按至少1 x10⁵个细胞/ml的细胞密度在37℃培养1.5小时。此后，移除培养基，并且通过用温EL-4B5培养基洗涤，从贴壁的巨噬细胞移除未贴壁的细胞，随后是在35ml培养基中培养约48小时。

实施例9

根据本发明的T细胞和巨噬细胞共培养

在分别的培养瓶中培养T细胞(参见实施例7，40小时培养)和巨噬细胞(参见实施例8)。在合并这两个细胞群体之前，将T细胞以800x g离心10分钟。弃上清液并使细胞沉淀物重悬于10ml EL-4B5培养基中。最终的培养基含有调节至细胞密度5 x 10⁵个细胞/ml的T细胞、10ng佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)/ml培养基和5μg植物凝集素M(PHA-M)/ml培养基(＝T细胞悬液)。此后，从巨噬细胞移除培养基(＝移除了培养基的巨噬细胞)。将某个量/体积的T细胞悬液添加至含有移除了培养基的巨噬细胞的培养瓶，以获得1.25-2 x10⁶个巨噬细胞/ml起的最终但确定的巨噬细胞的细胞密度。在共培养30-46小时后，取出培养基并称作TSN溶液。为了移除残留细胞，通过0.22μm滤器过滤TSN溶液。将TSN溶液按等分试样(4.2ml)冷冻在-80℃。

实施例10–对比实施例

根据现有技术的T细胞和巨噬细胞的共培养

在独立的培养瓶中培养T细胞(参见实施例7，48小时培养)和巨噬细胞(参见实施例8)。在合并这两个细胞群体之前，将T细胞以800x g离心10分钟。弃上清液并使细胞沉淀物重悬于10ml EL-4B5培养基中。最终的培养基含有调节至细胞密度5 x 10⁵个细胞/ml的T细胞、10ng佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)/ml培养基和5μg植物凝集素M(PHA-M)/ml培养基(＝T细胞悬液)。此后，从巨噬细胞移除培养基(＝移除了培养基的巨噬细胞)。将某个量/体积的T细胞悬液添加至含有移除了培养基的巨噬细胞的培养瓶，以获得1 x 10⁶个巨噬细胞/ml的最终巨噬细胞的细胞密度。在共培养36小时后，取出培养基并称作TSN溶液。为了移除残留细胞，通过0.22μm滤器过滤TSN溶液。将TSN溶液按等分试样(4ml)冷冻在-80℃。

实施例11

培养EL-4B5细胞

使冷冻的EL-4B5细胞在水浴槽中在37℃快速解冻并且用10ml EL-4B5培养基稀释。以300x g离心10分钟后，丢弃上清液并且将沉淀物重悬于1ml培养基中。

将EL-4B5细胞以8 x 10个细胞/ml的细胞密度接种在T175培养瓶中。每两天测定细胞密度并且调节至8 x 10⁴个细胞/ml。细胞具有大约10小时的加倍时间。

收获细胞并调节至1 x 10⁶个细胞/ml的细胞密度，之后以50Gy进行γ辐射。

实施例12

B细胞和EL-4B5细胞共培养

在培养箱中在37℃于5％CO₂气氛下，将分选的单一B细胞在含210μl/孔EL-4B5培养基的96孔板中与Pansorbin细胞(1:20000)(Calbiochem(Merck)，达姆施塔特，德国)、根据实施例9或10产生的5％胸腺细胞上清液和γ-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×10⁴个细胞/孔)培养7天。取出B细胞培养上清液供筛查并且将细胞立即收获以克隆可变区基因或在100μl RLT缓冲液(Qiagen，希尔登，德国)中冷冻于-80℃。

已经发现，取决于胸腺细胞(T细胞)与单个核细胞(巨噬细胞)共培养时存在的巨噬细胞的量，即取决于所述细胞的比率，产生的TSN显示不同的特性。下表中显示相应结果(总孔数＝4*84)。采用根据实施例10的对比性现有技术方法获得参比值。

表

实施例13

采用根据实施例9和实施例10产生不同批次时B细胞和EL-4B5细胞的共培养

为了相比从现有技术已知的方法，显示本文报告的TSN生产方法的稳健性，已经采用根据实施例9和实施例10的方法制备了多个批次。下表中展示结果。

根据实施例10：

TSN批次	相对于参比的IgG阳性孔比率	相对于参比的平均生产性比率
			参比	1.00	1.00
1	0.80	0.75
			2	0.83	0.89
3	0.84	0.65
			4	0.78	0.42
5	1.04	0.49
			6	0.88	0.56
7	0.96	0.64
			8	0.94	0.69
9	1.11	0.79
			10	0.83	0.66
11	1.11	0.39
			12	1.04	0.78
13	0.95	0.48
			平均数	0.93	0.63

根据实施例9：

Claims

1.一种用于产生胸腺细胞上清液的方法，包括以下步骤：

-将胸腺细胞和单个核细胞以0.5:1.2或更大的细胞比率在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯和植物凝集素M存在下共培养多达60小时，和

-将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中胸腺细胞/单个核细胞比率是0.5:1.25至0.5:4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中比率是约0.5:2。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中胸腺细胞的细胞密度在共培养时是约5x 10⁵个细胞/ml。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在共培养之前，将胸腺细胞在37℃在培养基中温育多达60小时。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过以2x 10⁶个细胞/ml的细胞密度贴附于固体表面，从PBMC分离单个核细胞并且将贴壁的单个核细胞在培养基中温育约40小时，之后与胸腺细胞共培养。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在共培养胸腺细胞和单个核细胞之前，将胸腺细胞的培养基替换为含有10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和5μg/ml植物凝集素M(PHA-M)的新鲜培养基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过从单个核细胞移除培养基并添加胸腺细胞悬液，启动共培养。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中培养基是RPMI培养基，所述RPMI培养基补充有10％(v/v)FCS、1％(w/v)包含青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液，还包含0.05μMβ-巯基乙醇。

10.用于共培养一种或多种B细胞的方法，包括步骤-将一种或多种B细胞与EL4-B5细胞在用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生的TSN存在下共培养。

11.胸腺细胞上清液，其用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生。

12.用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生的胸腺细胞上清液的用途，用于共培养B细胞和饲养细胞。