JP2004521618A - 新規変異体アレルゲン - Google Patents
新規変異体アレルゲン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004521618A JP2004521618A JP2002543671A JP2002543671A JP2004521618A JP 2004521618 A JP2004521618 A JP 2004521618A JP 2002543671 A JP2002543671 A JP 2002543671A JP 2002543671 A JP2002543671 A JP 2002543671A JP 2004521618 A JP2004521618 A JP 2004521618A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- allergen
- recombinant
- mutant
- bet
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 356
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 127
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- -1 Q-36 Chemical compound 0.000 claims description 101
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 72
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 66
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 63
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 44
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 41
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 32
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 30
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 25
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 23
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 21
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- WYGWHHGCAGTUCH-ISLYRVAYSA-N V-65 Substances CC(C)CC(C)(C#N)\N=N\C(C)(C#N)CC(C)C WYGWHHGCAGTUCH-ISLYRVAYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 claims description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 8
- 239000004149 tartrazine Substances 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000238710 Dermatophagoides Species 0.000 claims description 6
- 239000004121 copper complexes of chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 claims description 6
- 239000004177 patent blue V Substances 0.000 claims description 6
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 claims description 5
- 241000256837 Apidae Species 0.000 claims description 4
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 claims description 4
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 241001536628 Poales Species 0.000 claims description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 241000208837 Asterales Species 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 95
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 86
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 67
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 52
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 46
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 46
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 43
- 108010061608 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 2 Proteins 0.000 description 42
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 35
- 102220267544 rs1555225967 Human genes 0.000 description 30
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 29
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 29
- 102220570133 Histone PARylation factor 1_K32Q_mutation Human genes 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 29
- 102220509819 General transcription factor II-I_K15E_mutation Human genes 0.000 description 27
- 102220539290 Programmed cell death 1 ligand 2_E62S_mutation Human genes 0.000 description 27
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 26
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 26
- 102220470904 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5_K48E_mutation Human genes 0.000 description 23
- 102220558262 Ras association domain-containing protein 1_S24N_mutation Human genes 0.000 description 23
- 102200011389 rs121908121 Human genes 0.000 description 23
- 102220005546 rs34273731 Human genes 0.000 description 23
- 102220581211 Oxidized purine nucleoside triphosphate hydrolase_I45K_mutation Human genes 0.000 description 22
- 102220423834 c.499C>A Human genes 0.000 description 22
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 21
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 18
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 18
- 102220072212 rs772406363 Human genes 0.000 description 18
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 15
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 15
- 102220044712 rs373563053 Human genes 0.000 description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102200115877 c.165G>T Human genes 0.000 description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 14
- 102200111231 rs28931605 Human genes 0.000 description 14
- 102220616965 Uncharacterized protein CLBA1_Y5V_mutation Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 102220560806 Acyl-CoA dehydrogenase family member 11_R99E_mutation Human genes 0.000 description 12
- 102220504483 Cell division cycle-associated protein 7_R161E_mutation Human genes 0.000 description 12
- 102220215242 rs1060500710 Human genes 0.000 description 12
- 102200082944 rs1135071 Human genes 0.000 description 12
- 102200001651 rs119103241 Human genes 0.000 description 12
- 102220096864 rs876658354 Human genes 0.000 description 12
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 11
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 102220534042 Angiopoietin-related protein 3_K65N_mutation Human genes 0.000 description 10
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 10
- 102220568085 Tetratricopeptide repeat protein 4_R156E_mutation Human genes 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 102200005764 c.296G>A Human genes 0.000 description 10
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 108010061629 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 1 Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102220531046 Nociceptin receptor_Y96A_mutation Human genes 0.000 description 9
- 102220503212 Thioredoxin_K72A_mutation Human genes 0.000 description 9
- 102220367041 c.140C>G Human genes 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 8
- 102220553625 Lens fiber major intrinsic protein_E42S_mutation Human genes 0.000 description 8
- 102220639700 Leptin_R78L_mutation Human genes 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 102220530046 N-chimaerin_E13S_mutation Human genes 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 102220286523 rs1554071538 Human genes 0.000 description 8
- 102220130536 rs199896612 Human genes 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 101001069692 Dickeya chrysanthemi Serralysin G Proteins 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100025656 Keratin, type II cytoskeletal 6A Human genes 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 102220483118 TLC domain-containing protein 4_H30N_mutation Human genes 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102200030832 rs121918243 Human genes 0.000 description 6
- 102220288227 rs141863326 Human genes 0.000 description 6
- 102200000886 rs201229537 Human genes 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 5
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 5
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 5
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 102220125339 rs764468720 Human genes 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 4
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 4
- 241000726768 Carpinus Species 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 102220487951 Isoaspartyl peptidase/L-asparaginase_R145E_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220530094 Linker for activation of T-cells family member 2_R20E_mutation Human genes 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 102200081514 rs1060503420 Human genes 0.000 description 4
- 102200123749 rs1572983 Human genes 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 4
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 3
- 235000001543 Corylus americana Nutrition 0.000 description 3
- 240000007582 Corylus avellana Species 0.000 description 3
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010082995 Dermatophagoides farinae antigen f 2 Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219427 Fagales Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102220619547 L-lactate dehydrogenase B chain_T10P_mutation Human genes 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 241000256834 Vespula vulgaris Species 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 102220352424 c.229A>G Human genes 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000006392 myotrophin Human genes 0.000 description 3
- 108010058605 myotrophin Proteins 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102220054671 rs145551875 Human genes 0.000 description 3
- 102220082323 rs35269563 Human genes 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102220598613 5-hydroxytryptamine receptor 1E_K29A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 102220465445 Angiogenin_Q36A_mutation Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 2
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102220519232 Casein kinase I isoform gamma-2_V2F_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000723382 Corylus Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000001840 Dandruff Diseases 0.000 description 2
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 2
- 108010055622 Dermatophagoides farinae antigen f 1 Proteins 0.000 description 2
- 102220526133 Dihydrofolate reductase_Q36K_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220516781 Dynein light chain 1, cytoplasmic_T67A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102220516017 Fractalkine_K78A_mutation Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102220585134 Histone H1t_K103T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 102220487745 Protein eyes shut homolog_D25N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220481680 Rap guanine nucleotide exchange factor 3_A16P_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220474458 Ribitol-5-phosphate xylosyltransferase 1_D72N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220487957 S-formylglutathione hydrolase_S149T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 102220355148 c.260A>G Human genes 0.000 description 2
- 102220348510 c.458C>G Human genes 0.000 description 2
- 102220368494 c.4G>A Human genes 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 239000009342 ragweed pollen Substances 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 102200063015 rs137852850 Human genes 0.000 description 2
- 102220058215 rs202168814 Human genes 0.000 description 2
- 102200080859 rs2233328 Human genes 0.000 description 2
- 102200123746 rs28937579 Human genes 0.000 description 2
- 102220005188 rs33958358 Human genes 0.000 description 2
- 102220005275 rs33958358 Human genes 0.000 description 2
- 102220074134 rs760435152 Human genes 0.000 description 2
- 102200086277 rs775019409 Human genes 0.000 description 2
- 102220060547 rs786203080 Human genes 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,4a,5,5,6,6,7,7,8,8,8a-octadecafluoronaphthalene 4-(2-aminoethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound NCCc1ccc(O)c(O)c1.FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C1(F)F QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 241000219496 Alnus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 241001380536 Argna Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 235000003826 Artemisia Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 1
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000339490 Brachyachne Species 0.000 description 1
- XAZKFISIRYLAEE-UHFFFAOYSA-N CC1CC(C)CC1 Chemical compound CC1CC(C)CC1 XAZKFISIRYLAEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N CC1CCCC1 Chemical compound CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000281762 Chenopodium ambrosioides Species 0.000 description 1
- 235000000509 Chenopodium ambrosioides Nutrition 0.000 description 1
- 235000005490 Chenopodium botrys Nutrition 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000689227 Cora <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000209210 Dactylis Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 244000290594 Ficus sycomorus Species 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102220531708 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain_D25G_mutation Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 101100476928 Mus musculus Sdc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000392928 Parachromis friedrichsthalii Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000238675 Periplaneta americana Species 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000186704 Pinales Species 0.000 description 1
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 1
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102220616378 Rhombotin-1_D72H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241001454295 Tetranychidae Species 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 241000256838 Vespula Species 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 244000030166 artemisia Species 0.000 description 1
- 235000009052 artemisia Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004161 brilliant blue FCF Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001914 calming effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 210000005090 tracheal smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43568—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from wasps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、天然に存在するアレルゲンの変異体である新規組換えアレルゲンに関する。また本発明は、新規組換え変異体アレルゲンの混合物を含む組成物にも関する。さらに本発明は、前記組換え変異体アレルゲンの調製方法、及び、組換え変異体アレルゲンを含むワクチンを含む医薬組成物の調製方法に関する。さらなる態様において本発明は、対象者に免疫応答を発生させる方法、対象者のワクチン接種又は治療、及び、本発明の前記組成物を調製するための方法に関する。
(背景技術)
遺伝的素因がある個体は、種々の環境原因に由来する抗原に対し、曝露されるアレルゲンに対して感作される(アレルギー性)。以前に感作された個体が同じ又は相同なアレルゲンに再び曝露された時に、アレルギー反応が起こる。アレルギー応答は花粉症、鼻結膜炎、鼻炎及び喘息から、例えばミツバチ又はスズメバチの針又は虫刺されに応答しての全身アナフィラキシー及び死亡までにわたる。この反応は即時型であり、草本、樹木、雑草、虫、食物、薬物、化学薬品及び香水に由来する化合物のような種々のアトピー性アレルゲンによって引き起こされ得る。
しかしながら、個体が初めてアレルゲンに暴露された時には、応答は起こらない。最初の適応応答は時間がかかり、通常は何の症状も引き起こさない。しかしアレルゲンと反応する能力がある抗体及びT細胞が産生されると、続いて起こるいかなる暴露も症状を誘発し得る。このようにアレルギー応答は、命にかかわり得る深刻な病理状態を免疫応答自身が引き起こし得ることを実証する。
【0002】
アトピー性アレルギーに関与する抗体は、本来IgEクラスの免疫グロブリンに属する。IgEは、肥満細胞及び好塩基球の表面の特異的レセプターに結合する。肥満細胞に結合したIgEと特異的アレルゲンの複合体形成に続く細胞表面上のレセプターの架橋結合が、標的細胞のレセプターを通じたシグナル伝達及び生理反応を生じさせる。脱顆粒が特にヒスタミン、へパリン、好酸性白血球に対する化学走化因子、気管平滑筋細胞の長期的な収縮を引き起こすロイコトリエンC4、D4及びE4の放出を生じさせる。その結果生じる影響は、事実上全身又は局所的であり得る。
抗体媒介性の過敏反応は四種類、すなわちI型、II型、III型及びIV型に分類することができる。I型アレルギー反応は、抗原の曝露に続いて数秒又は数分以内に起こる古典的即時型過敏反応である。これらの症状はアレルゲン特異的IgEによって媒介されている。
一般的にアレルギー反応は、例えば花粉、イエダニ、動物の毛及びフケ、毒物及び食品に存在するタンパク質アレルゲンに対する応答として観察される。
アレルギー反応を減少させる又は排除するために、慎重に制御され繰り返されるアレルギーワクチン投与が通常用いられる。アレルギーワクチン接種は、かなり長期間にわたって投与量を増加しながら非経口、鼻腔内又は舌下投与によって伝統的に行われており、患者の脱感作を導く。その正確な免疫学的メカニズムは知られていないが、誘導されるアレルゲン特異的T細胞の表現型の違いが特に重要であると考えられる。
【0003】
アレルギーワクチン接種
ワクチン接種の概念は2つの基本的な免疫系の特徴、すなわち特異性及び記憶に基づく。ワクチン接種はレシピエントの免疫系を初回抗原刺激し得て、同様なタンパク質に対する曝露が繰り返された時に、例えば微生物感染症の攻撃に対して免疫系はさらに厳しく応答する状態になり得る。ワクチンは、レシピエントにそのような防御免疫応答を発生させることを目的としてワクチン接種に用いられることを意図するタンパク質の混合物である。この防御は、ワクチン及び相同抗原に存在する構成成分のみを含み得る。
他の種類のワクチン接種と比較して、アレルギーワクチン接種はアレルギー患者において進行中の免疫応答の存在によって複雑にされている。この免疫応答は、アレルゲンに対する曝露においてアレルギー症状の放出を媒介するアレルゲン特異的IgEの存在によって特徴付けられる。このように、自然源由来のアレルゲンを用いるアレルギーワクチン接種は、患者に対し命にかかわる極端な結果となる副作用の本来的な危険性を有する。
この問題を回避するアプローチは、三つのカテゴリーに分類され得る。実際には多くの場合、2つ以上のカテゴリーに由来する処置が併用される。処置の第一カテゴリーは、充分な累積投与量を達成するための長期間にわたる少用量の複数回投与を含む。処置の第二カテゴリーは、アルミニウムヒドロキシドのようなゲル状物質中へのアレルゲンの混合によるアレルゲンの物理改変を含む。アルミニウムヒドロキシド製剤はアジュバント効果、及び、活性アレルゲン成分の組織濃度を減少させる緩慢なアレルゲン放出という徐放製剤効果を有する。処置の第三カテゴリーは、アレルギー性すなわちIgE結合性を減少するためのアレルゲンの化学改変を含む。
成功したアレルギーワクチン接種の背後にある詳細なメカニズムには、議論の余地が残されている。しかしながら、免疫応答の全体的な調節においてT細胞が重要な役割を果たすことは同意されている。現在の総意によると、T細胞表現型の両極端であるTh1及びTh2間の関係が個体のアレルギー状態を決定する。アレルゲンで刺激されると、Th1細胞はインターフェロンγによって支配されるインターロイキンを分泌して防御免疫をもたらし、個体は健康である。反対にTh2細胞はインターロイキン4及び5を優勢に分泌してIgE合成及び好酸球増加をもたらし、個体はアレルギー状態にある。In vitroの研究は、関連するT細胞エピトープを含むアレルゲン由来のペプチドでの攻撃によってアレルゲン特異的T細胞応答を変化させる可能性を示している。従って、新しいアレルギーワクチンに対する現在のアプローチは主にT細胞に対処することに基づき、T細胞を静めること(アネルギー誘導)又は応答をTh2表現型からTh1表現型にシフトすることを目的とする。
【0004】
抗体結合エピトープ( B 細胞エピトープ)
Fab−抗原複合体のX線結晶解析は、抗体結合エピトープの理解を高めている。この種類の解析によると、抗体結合エピトープは15〜25アミノ酸残基に由来する原子を含む抗原表面の一部分として定義することができ、前記アミノ酸残基は抗体原子と直接相互作用できる距離範囲内にある。抗原抗体相互作用の親和性は、ファンデルワールス相互作用、水素結合又はイオン結合が寄与するエンタルピーのみからは予測することができない。界面からの水分子のほぼ完全な排除に付随するエントロピーは、同様な規模のエネルギー貢献を示す。これは、相互作用する分子の輪郭間の完全な適合が、抗原抗体高親和性相互作用の根底にある主要な要因であることを意味する。
WO 97/30150(参考文献1)においてタンパク質分子の集団がクレームされており、このタンパク質分子は親タンパク質に比べてアミノ酸配列における特異的変異の分布を有する。この記述からこの発明は、親タンパク質と比べて改変されるが、処理され消化された、T細胞に対して親タンパク質(天然に存在するアレルゲン)と同じ様式で提示されるアナログを作製することに関すると考えられる。これにより、改変されたT細胞応答が得られる。改変タンパク質ライブラリーはPM(節約(parsimonious)変異誘発)を表す技術を用いて調製される。
WO 92/02621(参考文献2)において組換えDNA分子が記述されており、この分子はAln g 1、Cor a 1及びBet v 1より選択されるファガレス目樹木アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを有するポリペプチドをコードするDNAを含む。この明細書に記述される組換え分子は全て、天然に存在するアレルゲンの配列に対応するアミノ酸配列又はその一部を有する。
WO 90/11293(参考文献3)は特に、ブタクサ花粉の単離アレルギー性ペプチド及び改変ブタクサ花粉ペプチドに関する。ここで開示されたペプチドは、天然に存在するアレルゲンの配列又はその天然に存在するイソフォームの配列のいずれかに対応するアミノ酸配列を有する。
【0005】
アレルゲンの化学改変
アレルゲンの化学改変に対して複数のアプローチが行われている。70年代初めのアプローチは、アレルゲンのポリマーとの化学共役、及び、ホルムアルデヒドを用いたアレルゲンの化学架橋結合などを含み、いわゆる「アレルゴイド」を作製することを含む。これらのアプローチの理論的根拠は、化学リガンドの付加によるIgE結合エピトープのランダム破壊が、この複合体分子量を増加することによって免疫原性を保持する一方でIgE結合性を減少することである。「アレルゴイド」作製に固有な不利益は、化学架橋結合工程の制御における困難、及び、得られる高分子量複合体の解析及び標準化における困難に結び付けられる。「アレルゴイド」は現在臨床使用されており、IgE結合エピトープのランダム破壊のために従来ワクチンに比べて多い用量を投与することができる。しかし、その安全性及び有効性評価基準は、従来ワクチンの使用を超えて改善されていない。
より最近のアレルゲンの化学改変に対するアプローチは、アレルゲンの三次構造を全体的に破壊してIgE結合を排除することを目的とし、治療上の本質的な標的がT細胞特異的なアレルゲンであると仮定している。このようなワクチンは最小T細胞エピトープを表す合成ペプチド由来のアレルゲン配列、結合T細胞エピトープを表すさらに長いペプチド、免疫優性T細胞エピトープ領域を表す合成ペプチド由来のより長いアレルゲン配列、又は、組換え技術により二つ半分に切断されたアレルゲン分子を含む。この理論的根拠に基づく別のアプローチは、“低IgE結合”組換えイソフォームの使用を提案している。天然アレルゲンは不均一であって、およそ25%に至るアミノ酸置換を有するイソアレルゲン及び変異体を含むことが、近年明らかになっている。幾つかの組換えイソアレルゲンは、おそらく不可逆的な変性によって三次構造が全体的に破壊されるため、IgE結合における効果が弱まることが見出されている。
【0006】
In vitro の変異誘発及びアレルギーワクチン接種
In vitroの部位特異的変異誘発によりアレルゲン性を減少する試みが、Der f 2(Takai et al、参考文献4)、Der p 2(Smith et al、参考文献5)、39 kDaのデルマトファゴイデス・ファリナエ(Dermatophagoides farinae)アレルゲン(Aki et al、参考文献6)、ハチ毒物ホスホリパーゼA2(Forster et al、参考文献7)、Ara h 1(Burks et al、 参考文献8)、Ara h 2(Stanley et al、参考文献9)、Bet v 1(Ferreira et al、参考文献10及び11)、カバノキ・プロフィリン(Wiedemann et al、参考文献12)及びOry s 1(Alvarez et al、参考文献13)を含む種々のアレルゲンを用いて行われている。
これらのアプローチの理論的根拠は、この場合もやはりアレルゲン特異的T細胞に向けられているが、一方同時に組換え変異体アレルゲンの三次構造の破壊によるIgE結合性の減少又は排除によってIgEが媒介する副作用の危険性を減少することである。これらのアプローチの理論的根拠は、優性IgE結合エピトープの概念を含まず、B細胞及び抗体産生をも伴う新しい防御免疫応答を開始させるという概念を含まない。
Ferreira等の論文(参考文献11)は、IgE結合性を減少する目的で部位特異的変異誘発の使用を記述している。この論文の中でBet v 1の三次元構造が述べられているが、著者等は変異のためのアミノ酸残基(その半分は低い程度の溶媒露出を有する)の予測のためにこの構造を使用していない。彼等はむしろ、ここに記述する保存表面領域の同定に基づく構造という概念と異なり、タンパク質における機能的残基の予測のために開発された方法を用いている。この著者等はα炭素骨格三次構造の保存を議論しているが、その概念は治療的ストラテジーの一部ではなく単にin vitroのIgE結合性を評価するために含まれるだけである。さらに、一般的な問題であるがCDスペクトルの標準化がサンプルの空間的な大きさの変性の評価を妨げるために、示された証拠は不充分である。記載された治療的ストラテジーはアレルゲン特異的T細胞におけるトレランスの誘導を目的としており、新しい免疫応答の開始は述べられていない。
Wiedemann等による論文(参考文献12)は、モノクローナル抗体エピトープを特徴付ける目的のため、部位特異的変異誘発及びペプチド合成の使用を記述している。この著者等は抗原の三次構造について知識があり、この知識を使用し変異誘発のためアミノ酸を露出する表面を選択している。相同配列と異なるアミノ酸が選択されているため、用いられたアルゴリズムは本発明者により記述されるものと反対であると言える。この研究は、表面露出アミノ酸の置換はモノクローナル抗体の結合特性を改変する能力を有することを実証しているが、これは通常の知識を考慮すれば驚くべきことではない。記述された実験はアレルギー患者の血清IgEのようなポリクローナル抗体の結合性における変化を評価することを設計していない。この実験の一つは定量的評価には適していないが血清IgEを適用することを含み、行われた変異誘発によってIgE結合性は影響されないようである。
Smith等による論文(参考文献5)は、モノクローナル抗体のエピトープマッピング及びIgE結合性の減少を目的とする部位特異的変異誘発の使用を記述している。この著者等は三次構造の知識がなく、α炭素骨格三次構造の保存を評価する試みを行っていない。用いられたアルゴリズムは、変異誘発のために選択されたアミノ酸が実際に分子表面に露出されることを保証していない。記述された変異体の一つのみが、IgE結合性の実質的な減少をもたらす。この変異体は試験した抗体全部の結合性を欠いており、三次構造が破壊されていることを示している。この著者等は治療的ストラテジーを定めておらず、新しい免疫応答の開始は言及されていない。
Colombo等による論文(参考文献14)は、部位特異的変異誘発及びペプチド合成の使用によるIgE結合エピトープの研究を記述している。この著者等は、相同タンパク質の結晶構造に基づく三次元コンピューターモデル構造を使用し、分子表面上のエピトープの存在を例示している。エピトープを表す合成ペプチドを用いて、一次構造相同性を示す異なるアレルゲン上のエピトープのさらなる存在が取り扱われている。この治療的ストラテジーは、一価IgE結合エピトープを表すこの合成ペプチドを用いた治療に基づく。相同アレルゲン間の保存表面領域及び新しい防御免疫応答を開始するという治療的概念は、言及されていない。
Spangfort等による論文(参考文献15)は、主要なカバノキアレルゲンの三次元構造及び保存された表面露出パッチを記述している。この論文は主要なIgE結合エピトープも部位特異的変異誘発も言及しておらず、治療的応用も扱われていない。
上記研究のいずれにおいても、表面露出アミノ酸の置換によってIgE結合性が減少する一方でα炭素骨格三次構造を保存することを記述していない。上記言及されたアプローチの理論的根拠は、優性IgE結合エピトープの概念を含まず、新しい防御免疫応答を開始するという治療的概念を含まない。
WO 99/47680は、アレルゲンのα炭素骨格三次構造を保持したままでの規定した重要な位置への人為的アミノ酸置換の導入を開示している。特にWO 99/47680は天然に存在するアレルゲンに由来する天然に存在しない変異体である組換えアレルゲンを開示し、この組換えアレルゲンにおいてはB細胞エピトープの少なくとも一つの保存された表面露出アミノ酸残基が他の残基によって置換され、これは前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置には起こらない。前記変異体アレルゲンは前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有し、前記天然に存在するアレルゲンに比べ変異アレルゲンに対する特異的IgE結合性が減少している。
WO 99/47680において開示される組換えアレルゲンは、a)前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある全既知相同タンパク質において、70%より高い同一性で保存される天然に存在するアレルゲンのアミノ酸残基を同定すること、b)少なくとも一つのB細胞エピトープを含み、少なくとも20%の溶媒接触性を有することにより定義され、アレルゲン分子の三次元表面の少なくとも400Å2にわたって密着して連結される保存アミノ酸残基の少なくとも一つのパッチを決定すること、及びc)前記少なくとも一つのパッチにおいて、少なくとも一つのアミノ酸残基がアレルゲン分子の全体的なα炭素骨格三次構造を本質的に保存しながら特定の位置で他の非保存的アミノ酸残基により置換されることによって、得ることができる。
【0007】
(発明の目的)
本発明の理論的根拠
本発明はユニークな原理に基づいている。この原理によると、成功したアレルギーワクチン接種のメカニズムは進行中のTh2型免疫応答の変更ではなく、むしろB細胞及び抗体形成物による三次エピトープ認識に関する新しい免疫応答の並行的開始である。この新しい免疫応答は部分的にTh1型免疫応答であると信じられている。このモデルは、成功したワクチン接種治療により特異的IgEレベルが影響されないこと、及び、成功した治療は多くの場合アレルゲン特異的IgG4の実質的な増加を伴うことの観察によって支持される。加えて、アレルゲン攻撃前後の鼻のバイオプシー研究はTh2様表現型を有するT細胞の減少を示さないが、むしろTh1様T細胞の増加が観察される。ワクチン(又は医薬組成物)が気道以外の経路を経て投与される場合、進行中のTh2応答とは物理的に離れた位置において新しい免疫応答が発達し、二つの応答が並行して存在することを可能にしていることが仮定される。
免疫系の別の重要な側面は、いわゆる優性IgE結合エピトープの存在の表明である。これら優性IgE結合エピトープは、抗体結合を収容するのに充分な大きさの密着した表面領域に依存する三次構造によって構成されており、近縁種由来のイソアレルゲン、変異体及び/又は相同アレルゲンのうちで保存されることが提唱される。相同アレルゲン上の同様なエピトープに結合する能力がある交差反応性のIgEの存在は、例えばハンノキ、カバノキ及びハシバミといった種々の近縁種、多様な草本種又はデルマトファゴイデ種の様々なイエダニに対してアレルギー患者が頻繁に反応するという臨床観察によって支持される。これはさらに、近縁種由来の相同アレルゲン間のIgE交差反応性、及び、相同アレルゲンに対するIgE結合を阻害する一つのアレルゲンの能力を実証する研究室での実験(Ipsen et al.1992,参考文献16)によって支持される。曝露及び免疫応答は、用量依存的な様式に関連することがよく知られている。これらの観察の組合せに基づき、保存表面領域は非保存表面領域よりも高用量で免疫系に対して曝露されて高親和性を伴うIgE抗体産生を生じることが仮定され、従って「優性IgE結合エピトープ」という用語で呼ぶ。
この原理によると、アレルゲンは天然アレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有し、IgE結合性の減少を目的とする変異誘発のための標的を表す保存パッチを取り囲む領域の表面トポロジーの保存を確実にすることが必要不可欠である。これらの基準を満たすことにより、アレルゲンは安全性を妥協することなく防御免疫応答を発生させることにおいてその効果が改善し、相対的に高い用量で投与される可能性を有する。さらに本発明は、アレルギー症状はエフェクター細胞、すなわち肥満細胞及び好塩基球の表面に高親和性IgEレセプターFceRIを介して結合した二つの特異的IgEとアレルゲンの架橋結合により引き起こされるという発見に基づく。説明のために、我々はIgE結合エピトープを伴うアレルゲンの理論的モデルを示す図15に言及する。肥満細胞からのメディエーター放出の誘導及びそれによるアレルギー症状は、肥満細胞表面に結合したIgEのアレルゲン媒介架橋結合によって影響を受ける(図15Aを参照)。図15Bに示す状態において、エピトープの二つがIgE結合能力を減少するように変異させられて、それによりアレルゲン媒介架橋結合が妨害される。これに関連して、アレルゲンは通常三つより多いB細胞エピトープを含むことを述べるべきである。しかしながら、図15に描かれた理論上の状態から、より多くのエピトープがIgE結合能力を除去又は減少されるように変異させられるにつれて、アレルゲン媒介架橋結合及び結果として生ずるアレルギー症状の危険性がより低下することが想定され得る。
しかしながら、変異アレルゲンがIgG応答を含む新しい免疫応答を生じることが可能になるためには、アレルゲンは少なくとも一つの原型のエピトープを含まなければならない。好ましくは、この原型のエピトープが優性エピトープである。なぜならそのような変異アレルゲンがワクチン接種に用いられる場合、改善された防御を提供するであろうからである。
結論として、本発明の発明概念は、複数のB細胞エピトープにおいてIgE結合性を減少する変異及び少なくとも一つの原型のエピトープを有する変異アレルゲンが、一方ではアレルゲン媒介架橋結合を減少し他方ではIgEに競合する結合能力を有するIgG応答の発生を可能にし得るという認識に基づく。このように、前記変異アレルゲンはアナフィラキシー反応の危険性を強く減少させ得る点で非常に有利なアレルゲンを構成するであろう。
また、本発明は、理想的にはその多数又は全エピトープが原型のまま提示されるような変異アレルゲンの異なる混合物を含むワクチンは、アレルギー症状に対して防御を誘導する能力において、この変異アレルゲンの起源である天然に存在するアレルゲンと同等な効果が有り得るという認識に基づく。
【0008】
(発明の要約)
本発明は、各変異エピトープの特異的IgE結合能力の減少を目的として、複数の特定の重要な位置、すなわちIgE結合エピトープへの人為的なアミノ酸置換の導入に関する。
本発明は、以下の点で特徴付けられる組換えアレルゲンを提供する。この組換えアレルゲンは天然に存在するアレルゲンの変異体であって、各々が前記天然に存在するアレルゲンのIgE結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的IgE結合能力を減少する少なくとも四つの第一変異を有し、各第一変異は他の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、各第一変異は各他の第一変異から少なくとも15Å隔てられており、かつ面積800Å2の円形表面領域の少なくとも一つが変異を含まないように配置される。
理論に縛られることなく、B細胞エピトープはアレルゲンの全表面の大部分にわたって分布し得ることが信じられている。さらに、少なくとも複数のエピトープが重複エピトープの多数を含むエピトープのクラスターの一部を構成することの実験証拠が存在する。従って本発明に対する理論的根拠は、どの表面露出アミノ酸も変異の潜在的部位を構成し、結果として変異は特異的IgEを結合する能力を減少し得ることである。
従って、第一変異は相互に関してその位置によって規定され、すなわち離して隔てられ、それらがエピトープの分離クラスターに存在する変異であることを確実にする。
本発明は、請求項1に記載する二つ以上の異なる組換え変異体アレルゲンを含む組成物も提供する。各前記変異体は少なくとも一つの主要な変異を有することによって規定され、その変異は別の変異体の少なくとも一つには存在しない。各変異体に対して各前記主要な第一変異から半径15Åの範囲内に第二変異は存在しない。この組成物は、好ましくは2〜12、さらに好ましくは3〜10、さらに好ましくは4〜8、最も好ましくは5〜7の変異体を含む。
本発明は、a)〜c)の点で特徴付けられる請求項1記載の組換えアレルゲンの調製方法も提供する。
a) 天然に存在するアレルゲンにおいて少なくとも20%の溶媒接触性を有するアミノ酸の番号を同定すること;
b)同定されたアミノ酸残基から少なくとも四つを選択することであって、各選択されたアミノ酸は他の選択されたアミノ酸の各々から少なくとも15Å隔てられており、面積800Å2の円形表面領域内の少なくとも一つに存在しないように配置されていること;及び
c)選択されたアミノ酸の各々に対して、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的IgE結合能力を減少する第一変異を行うことであって、各第一変異は選択されたアミノ酸残基の別のアミノ酸による置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在しないこと。
別の側面において本発明は、対応する天然に存在するアレルゲンをコードするDNAのDNAシャッフリング(shuffling)(分子育種)によって得られたDNA配列からアレルゲンが作製されることによって特徴付けられる、本発明の組換えアレルゲンの調製方法に関する。
さらに、本発明は医薬品として使用するための請求項1の組換えアレルゲンに関する。
また、本発明はアレルギーを予防及び/又は治療するための医薬品を調製するための請求項1の組換えアレルゲンの使用に関する。
さらに、本発明は医薬品として使用するための請求項37の組成物に関する。
また、本発明はアレルギーを予防及び/又は治療するための医薬品を調製するための請求項37の組成物の使用に関する。
さらに、本発明は請求項1の組換えアレルゲン又は請求項37の組成物を含み、これに組合せて医薬的に許容される担体及び/又は賦形剤を含んでもよく、アジュバントを含んでもよいことを特徴とする医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、アレルギーを患う患者において天然に存在するアレルゲンによって誘発されるアレルギー反応に対するワクチンの形態をとり得る。
また、本発明は請求項1の組換えアレルゲン、請求項37の組成物、又は、請求項41−42若しくは46の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者に免疫応答を発生させる方法に関する。
さらに、本発明は請求項1の組換えアレルゲン、請求項37の組成物、又は、請求項41−42若しくは46の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のワクチン接種又は治療に関する。
また、本発明は請求項1の組換えアレルゲン又は請求項37の組成物を医薬的に許容される物質及び/又は賦形剤とともに混合することを含む、請求項41又は42の医薬組成物を調製する方法に関する。
さらに本発明は請求項45の方法によって得ることができる医薬組成物に関する。
また、本発明は請求項1の組換えアレルゲン、請求項37の組成物、又は、請求項41−42若しくは46の医薬組成物を対象者に投与することを含む、患者のアレルギー反応の治療、予防又は軽減のための方法に関する。
さらに本発明は、本発明のアレルゲンをコードするDNA配列、その誘導体、その部分配列、その縮重配列、又は、ストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダイズする配列であって、少なくとも一つのB細胞エピトープを有するペプチドをコードする前記誘導体、前記部分的配列、前記縮重配列又は前記ハイブリダイズする配列に関する。
また、本発明は本発明のDNAを含む発現ベクターに関する。
さらに、本発明は本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
加えて、本発明は本発明の宿主細胞を培養する工程を含む組換え変異体アレルゲンを作製する方法に関する。
最後に、本発明は、天然に存在するアレルゲンに特異的なT細胞クローン又はT細胞株を刺激する能力がある少なくとも一つのT細胞エピトープを含む、本発明の組換えアレルゲン又は本発明のDNA配列によってコードされる組換えアレルゲンに関する。本発明の変異体は、T細胞刺激指標の測定による同様な様式/程度でアレルゲン特異的T細胞株を刺激し得るのが好ましい。
【0009】
(発明の詳細な説明)
本発明の好ましい態様では、第一変異同士が20Å、好ましくは25Å、最も好ましくは30Å隔てられている。
アレルゲンは特異的IgEに対して幾つかの潜在的結合領域を含み、その各領域はおよそ800Å2の大きさを有し、その各表面領域は重複エピトープの多数を含むことが信じられている。このように、アレルゲンは800Å2で分割された表面領域の潜在的第一変異の幾つかを有する。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンが5〜20、好ましくは6〜15、さらに好ましくは7〜12、最も好ましくは8〜10の第一変異を含む。
本発明の好ましい態様では、変異を含まない表面領域が700Å2、好ましくは600Å2、さらに好ましくは500Å2、最も好ましくは400Å2の面積を有する。
本発明の好ましい態様では、組換えアレルゲンが、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力に比べて各々が変異アレルゲンの特異的IgE結合能力を減少する第二変異を幾つか含み、この各第二変異は別の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在せず、前記円形領域の外側に位置する。
第二変異は第一変異の近くに位置付けることができ、すなわち第二変異は第一変異によって変異された同じエピトープに対する付加的な変異であるだろう。
本発明の好ましい態様では、天然に存在するアレルゲンにおいて置換される少なくとも一つの表面露出アミノ酸が約20%、好ましくは約30%、さらに好ましくは約40%、最も好ましくは約50%の溶媒接触性を有する。
本発明の別の好ましい態様では、天然に存在するアレルゲンにおいて置換される少なくとも一つの表面露出アミノ酸が、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において70%より高く、好ましくは80%より高く、最も好ましくは90%より高い同一性で保存される。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンが本質的に前記天然に存在するアレルゲンと同じα炭素骨格三次構造を有する。
変異体及び天然に存在するアレルゲン分子のα炭素骨格三次構造を比較した場合、原子座標の平均標準偏差が2Åより小さいのが好ましい。
本発明の組換えアレルゲンの好ましい態様では、変異体アレルゲンに組み込まれる各アミノ酸残基は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、好ましくは亜科、さらに好ましくは科、さらに好ましくは上科、さらに好ましくは亜綱、さらに好ましくは亜目、最も好ましくは目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在しない。
本発明の好ましい態様では、本発明の組換え変異体アレルゲンは天然に存在しないアレルゲンである。
変異アレルゲンに対する特異的IgE結合性が、起源特異的IgE反応性アレルギー患者由来の血清又はそのプールを用いた免疫アッセイにおいて、天然に存在するイソアレルゲン又は同様な組換えタンパク質と比較して、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%減少されるのが好ましい。
変異体の減少したIgE結合性及び減少した架橋結合媒介能力を評価する別の手段は、変異体のヒスタミン放出(HR)を開始する能力である。ヒスタミンの放出は種々のヒスタミン放出アッセイで測定することができる。変異体の減少したヒスタミン放出は、細胞表面の特異的IgE結合に対する減少した親和性、及び、架橋結合促進の減少した能力に由来する。天然に存在するアレルゲンと比較して本発明の変異体に対し、HRが好ましくは5〜100%、さらに好ましくは25〜100%、さらに好ましくは50〜100%、最も好ましくは75〜100%減少される。
一般的に、変異を含まない面積800Å2の円形表面領域は、15〜25のアミノ酸残基の原子を含む。
本発明の好ましい組換えアレルゲンは、表面露出アミノ酸残基が溶媒接触性に関して順位付けられ、より溶媒接触可能なアミノ酸残基のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることに特徴付けられる。
本発明のさらに好ましい組換えアレルゲンは、表面露出アミノ酸残基が前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して順位付けられ、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることに特徴付けられる。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンは第一変異あたり一つ〜四つの第二変異を含む。
本発明の好ましい態様は、一つ以上の置換が部位特異的変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明の別の好ましい態様は、一つ以上の置換がランダム変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明のさらに好ましい態様は、一つ以上の置換がDNAシャッフリングによって行われることに特徴付けられる。
本発明の組換えアレルゲンは、特に樹木、草本、ハーブ、菌類、イエダニ、ゴキブリ及び動物の毛若しくはフケに由来する吸入アレルゲンの変異体であるのが適切であろう。樹木、草本又はハーブ由来の重要な花粉アレルゲンは、特にカバノキ(ベツラ(Betula))、ハンノキ(アルナス(Alnus))、ハシバミ(コリルス(Corylus))、シデ(カルピナス(Carpinus))及びオリーブ(オレア(Olea))を含む分類学上ファガレス(Fagales)目、オレアレス(Oleales)目及びピナレス(Pinales)目、特にロリウム(Lolium)属、フェレウム(Phleum)属、ポア(Poa)属、シノドン(Cynodon)属、ダクチリス(Dactylis)属及びセカレ(Secale)属の草本を含むポアレス(Poales)目、特にアンブロシア(Ambrosia)属及びアルテミシア(Artemisia)属のハーブを含むアステラレス(Asterales)目及びウルチカレス(Urticales)目に由来する。菌類由来の重要な吸入アレルゲンは、特にオルターナリア(Alternaria)属及びクラドスポリウム(Cladosporium)属に由来する。他の重要な吸入アレルゲンは、デルマトファゴイデス属のイエダニ由来、ゴキブリ由来及びネコ、イヌ及びウマのような哺乳動物由来である。さらに、本発明の組換えアレルゲンはミツバチ(アピダエ(Apidae)上科)、ワスプ(ベスピデア(Vespidea)上科)及びアリ(フォルミコイダエ(Formicoidae)上科)を含む分類学上ヒメノプテラ(Hymenoptera)目に由来するような虫が刺すこと又は噛むことに由来するアレルゲンを含む毒物アレルゲンの変異体であり得る。
特異的アレルゲン成分は、例えばファガレス目のBet v 1(B.ベルルコサ(verrucosa)、カバノキ)、Aln g 1(アルナス・グルチノサ(glutinosa)、ハンノキ)、Cor a 1(コリルス・アベラナ(avelana)、ハシバミ)及びCar b 1(カルピナス・ベツルス(betulus)、シデ)を含む。他のものは、Cry j 1(ピナレス)、Amb a 1及び2、Art v 1(アステラレス)、Par j 1(ウルチカレス)、Ole e 1(オレアレス)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1及び5、Pas n 1、Phl p 1及び5、Poa p 1、2及び5、Sec c 1及び5、及びSor h 1(種々の草本の花粉)、Alt a 1及びCla h 1(菌類)、Der f 1及び2、Der p 1及び2(イエダニ、それぞれD.ファリナエ及びD.プテロニスシナス(pteronyssinus)、Lep d 1及び2(レピドグリフュス・デストルクター(Lepidoglyphus destructor);倉庫(storage)ダニ)、Bla g 1及び2、Per a 1(ゴキブリ、それぞれブラテルラ・ジャーマニカ(Blatella germanica)及びペリプラネタ・アメリカーナ(Periplaneta americana))、Fel d 1(ネコ)、Can f 1(イヌ)、Equ c 1、2及び3(ウマ)、Apis m 1及び2(ミツバチ)、Ves v 1、2及び5、Pol a 1、2及び5(全スズメバチ)及びSol i 1、2、3及び4(ハリアリ)である。
一つの態様では、組換えアレルゲンはBet v 1の変異体である。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸V2, D72, E87, K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87及びE−73を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、V2F, V2L, V2I, V2M, Y5V, T10P, T10A, K20N, D25E, N28T, K32Q, Q36A, Q36K, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, D72H, D72Q, D72N, T77A, N78K, E87G, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K129N, K134E, R145E, S149R, S149T, D156H及び+160Nからなる群より選択され得る(+は付加的なアミノ酸が含まれることを意味する)。
本発明によるBet v 1変異体の例は以下である(用いられている括弧は第一及び第二変異を示す):
変異体A:
(Asn28Thr, Lys32Gln), (Asn78Lys, Lys103Val), Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn)
変異体B:
Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123Ile, Lys134Glu, Asp156His
変異体2595(実施例2):
N28T, K32Q, E45S, P108G
変異体2628(実施例4):
Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu
変異体2637(実施例4):
Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro)
変異体2724:
N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N
変異体2733(実施例4):
(Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn)
変異体2744:
(Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123Ile, (Asp156His, +160Asn)
変異体2753(実施例4):
(Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu
変異体2744+2595:
Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N
変異体2744+2628:
Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N
変異体2744+2595+2628:
Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N
さらに、上記変異体の全ては以下の置換を一つ以上含む:V2F, V2L, V2I, V2M, T10A, K20N, Q36A又はQ36K, D72H, D72Q, D72N, E87G, K129N及びS149R又はS149T。
別の態様では、組換えアレルゲンは分類学上ベスピダエ目、アピダエ目及びフォルミコイダエ目由来の毒物アレルゲンに由来する。
さらなる態様では、組換えアレルゲンはVes v 5に由来する。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸K−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149, K−128, E−184, K−112, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85及びI−182を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M及びN203Gからなる群より選択され得る。
さらなる態様では、組換えアレルゲンはDer p 2に由来する。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸R−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109及びR−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109, K−15を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N及びR128Qからなる群より選択され得る。
本発明によるBet v 1変異体の例は、以下である。
変異体A:
K6A, K15E, H30N, E62S
変異体B:
K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N
変異体C:
K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N及びR128Q
【0010】
ワクチン
ワクチンの調製は、この技術分野において一般的によく知られている。ワクチンは通常、溶液又は懸濁液いずれかのように注射可能物質として調製される。前記ワクチンは、経鼻投与及び、口内及び舌下を含む経口投与を可能にするため、乳化又は調合されることもある。問題とする免疫成分(本明細書に定義する組換えアレルゲン)は、適切には医薬的に許容される賦形剤と混合され得、さらに活性成分と互換性がある。適切な賦形剤の例は、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等及びこれらの組合せである。ワクチンは付加的に、湿潤剤、乳化剤、緩衝化剤又はワクチンの効果を増強するアジュバントのような他の物質を含み得る。
ワクチンは皮下又は筋肉内注射によって、最も頻繁に投与される。他の経路による投与に対して適切な製剤は、経口製剤及び坐剤を含む。経口投与のためのワクチンは、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常前記製剤に使用される賦形剤と適切に調合され得る。組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、エアロゾル、粉末又は顆粒として調合されることが可能である。
ワクチンは、治療上効果的かつ免疫原性のある量を適合する投薬製剤形態の方法で投与される。ワクチンに含まれる活性成分の量は、治療される対象者、特に治療に対して対象者の免疫系が応答する能力、投与経路、及び、対象者の年齢若しくは体重に依存する。適切な処方量の範囲は、約0.0001 μg〜1000μgの範囲内で変えることができる。
既に述べたように、製剤にアジュバントを加えることにより増加した効果が得られ得る。このようなアジュバントの具体例は、リン酸緩衝生理食塩水の水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム(アルム)又はリン酸カルシウムの0.05〜0.1%溶液、糖又はポリラクチドグリコリド(PLG)の合成ポリマーの0.25%溶液である。C.パルブム(parvum)のような細菌細胞、グラム陰性菌のエンドトキシン又はリポ多糖成分の混合物、マンニド(mannide)モノアセテート(アラセルA)のような生理的に許容されるオイルビヒクルのエマルジョン、又は、遮断物質として用いられるペルフルオロカーボン(例えばFluosol−DA)の20%溶液のエマルジョンも使用され得る。MF−59のようなオイルエマルジョンも用いられ得る。完全及び不完全フロイントアジュバントのような他のアジュバント、QuilA、Qs−21及びISCOMのようなサポニン、及びRIBIも用いられ得る。
ほとんどの場合、効果を確実にするためワクチンの複数回投与が必要である。多くの場合、ワクチンは最初の投与とそれに続く接種又は他の投与によって投与される。ワクチン接種の回数は1〜50の範囲内が典型であり、通常は35回のワクチン接種を超えない。ワクチン接種は普通、3ヶ月〜5年の期間に週2回〜隔月で行われる。これは所望する予防的又は治療的効果レベルを与えるために企図される。
組換えアレルゲンは医薬製剤として用いられてもよく、症状が起こる(予防)期間中にアレルギー応答に対してある種の防御を提供することに適する。通常、防御効果を維持するためこの処置を毎年繰り返さなければならないであろう。経鼻、経口及び舌下の適用に対して調合された製剤は、この目的に特に適する。
【0011】
本研究の組換えアレルゲンを調製する方法
既に述べたように、本発明は本発明の組換え変異体アレルゲンを調製する方法にも関する(請求項48を参照)。
本発明によると置換に適する表面露出アミノ酸は、表面露出の程度を表す溶媒(水)接触性の情報に基づいて同定され得る。本発明の方法の好ましい態様は、前記同定されたアミノ酸残基を溶媒接触性に関して順位付けすること、及び、より溶媒に接触可能なアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することによって特徴付けられる。
本発明において置換に適する表面露出アミノ酸の同定に貢献し得る第二パラメーターは、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質においてアミノ酸が保存される程度である。あるいは、前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、亜科、科、上科、亜綱、亜目又は目の範囲内にある全既知相同タンパク質における程度が、前記第二パラメーターとして用いられる。
従って、本発明の方法の好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において70%より高く、好ましくは80%より高く、最も好ましくは90%より高い同一性が保存される同定されたアミノ酸残基を選択することに特徴付けられる。
さらに、本発明の方法の特に好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して前記同定されたアミノ酸残基を順位付けすること、及び、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することに特徴付けられる。
本発明の方法のさらなる好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する変異体アレルゲンを形成するように、同定されたアミノ酸を選択することを含む。
本発明の方法のもう一つの好ましい態様は、アミノ酸残基の置換が部位特異的変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明の方法の別の好ましい態様は、アミノ酸残基の置換がDNAシャッフリングによって行われることに特徴付けられる。
【0012】
置換に対する基準
三次構造が決定されている(例えば、X線結晶解析又はNMR電子顕微鏡によって)分子に対して、置換されたアミノ酸を持つ変異体は、好ましくは次の基準を満たすべきである:
1.分子の全体的なα炭素骨格三次構造が保存されているのが好ましい。保存とは、構造を比較して原子座標の平均標準偏差が2Åより少ないこととして定義される。これは二つの理由のため重要である:a)天然アレルゲンの全体表面は潜在的抗体結合エピトープの重複連続体を構成することが予測される。分子表面の大部分はこの置換によって影響されずその抗体結合誘導特性を維持し、このことは天然のアレルゲン上にも存在するエピトープに向けられる新しい防御抗体特異性の発生に重要である。b)保存期間及び体液へ注入する際の両方に関係する安定性。
2.置換されるアミノ酸は表面に位置し、それにより抗体結合に対して接触可能であるのが好ましい。三次元構造において表面に位置するアミノ酸は通常少なくとも20%、適切には20〜80%、さらに適切には30〜80%の溶媒(水)接触性を有する。溶媒接触性は、溶媒分子に匹敵する半径(水、r=1.4Å)の球に対して接触可能な分子の面積として定義される。
3.置換されたアミノ酸の各々は、好ましくは400Å2より大きい面積を有する保存されたパッチに位置する。保存されたパッチは、表面露出保存アミノ酸残基及び骨格の密着して連結した面積として定義される。保存アミノ酸残基は、分類学上の同じ種、属、亜科、科、上科、亜綱、亜目又は目の範囲内にある相同タンパク質の全既知(導き出された)アミノ酸配列の配列アラインメントによって定義される。配列の70%より高く同一なアミノ酸残基を有するアミノ酸配置を、保存されたとみなす。保存されたパッチは、患者の大部分のIgEが対象とするエピトープを含むと予想される。
α炭素骨格三次構造の保存は、変異誘発前及び変異誘発後のX線結晶解析又はNMRにより同一構造が得られることによって決定されるのが最もよい。変異体を表す構造的データが無い場合、構造的に決定された分子の解析によって得られるデータと比較してみて、区別できないCDスペクトル又は例えば抗体反応性といった免疫学的データがα炭素骨格三次構造の保存を与え得る。
4.保存されたパッチ中にある変異誘発のためのアミノ酸は、好ましくは保存されたパッチの中心近くに位置する最も溶媒(水)接触可能なアミノ酸の中から優先的に選択されるべきである。
5.極性アミノ酸残基が他の極性残基によって優先的に置換され、非極性アミノ酸残基は他の非極性アミノ酸残基によって置換される。
アレルゲンの三次元構造を本質的に維持する目的で組み込まれるアミノ酸は、アレルゲンと構造的相同体であって例えばアレルゲンと分類学上同じ目に属しアレルゲンとどんな交差反応性も持たないタンパク質、との比較に基づいて選択され得る。
【0013】
本発明の DNA
好ましい態様では、本発明のDNA配列が天然に存在するアレルゲンをコードするDNA配列の誘導体である。
好ましくは、DNA誘導体が天然に存在するアレルゲンをコードするDNAの部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発によって得られる。
特に好ましい第一態様では、DNA配列が図3に示す配列の誘導体である。図3に示すDNA配列は、K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87, E−73からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
特に好ましい第二態様では、DNA配列が図13に示す配列の誘導体である。この図13に示すDNA配列は、K−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149, K−128, E−184, K−112, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85及びI−182からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
特に好ましい第三態様では、DNA配列が図16に示す配列の誘導体である。この図16に示すDNA配列は、R−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109及びR−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109, K−15からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
【0014】
DNA シャッフリング
本発明の組換え変異体アレルゲンは、対応する天然DNAのDNAシャッフリング(分子育種)によって得られたDNA配列を用いて作製され得る。DNAシャッフリングはPunnonen等による論文(参考文献25)で開示される手順及び前記論文中で言及された論文で開示される手順に従って行われ得る。これら前記論文は全て、この参照により本明細書中に含まれるものとする。
診断的アッセイ
さらに、本発明の組換え変異体アレルゲンは診断的な可能性及び利点を有する。先行技術のアレルギーワクチンは天然に存在するアレルゲン原料の抽出物に基づいており、そのため多種多様なイソフォームを表す。アレルギー性の個体は最初に感作されて、一つ又は複数の存在するイソフォームに対するIgEを持つ。イソフォームの幾つかは、相同性及び続いて起こるアレルギー性の個体に対するイソフォームとの交差反応のため、アレルギー性の個体のアレルギー反応について関係し得る。一方他のイソフォームは、アレルギー性の個体が有する特異的IgEに対するいかなるIgE結合エピトープも保持しないため、無関係であり得る。このIgE集団の特異性の不均一性によって、幾つかのイソフォームは結果的に投与が安全であり得、すなわちこれらはIgEを介してアレルギー応答を起こす結果とならず、一方他のイソフォームは望ましくない副作用を引き起こし有害であり得る。
このように、治療的に投与されることを意図する本発明の変異体及び組成物は、前記変異体又は組成物を用いる治療の妥当性、安全性又は成果をモニターするin vivo又はin vitroでの診断的アッセイにも用いられ得る。適用される診断サンプルは、血清のような身体サンプルを含む。
このように本発明は、本発明による組換え変異体アレルゲン又は組成物を用いる対象者の治療の妥当性、安全性又は成果を評価する診断的アッセイにも関する。対象者のIgEを含むサンプルが前記変異体又は前記組成物と混合され、サンプル中IgEの前記変異体間の反応性レベルを評価される。サンプル中のIgEと前記変異体間の反応性レベルの評価は、既知の免疫アッセイを用いて行われ得る。
【0015】
定義
本発明に関して「前記天然に存在するアレルゲンのIgE結合能力と比較して特異的IgE結合能力を減少する」という表現は、天然に存在するアレルゲンに対してアレルギー性の対象者に由来する血清を用いる少なくとも一つの免疫アッセイにおいて、減少が統計的に有意な様式で(P<0.05)測定可能であることを意味する。好ましくはIgE結合能力が少なくとも5%、さらに好ましくは少なくとも10%減少される。
「表面露出アミノ酸」という表現は、アレルゲンが溶液中に存在する場合にアミノ酸残基の少なくとも一原子の少なくとも一部分が周囲の溶媒と接触可能であるように、アミノ酸残基が三次元構造の表面に位置することを意味する。好ましくは、三次元構造中のアミノ酸酸基が少なくとも20%、適切には少なくとも30%、さらに適切には少なくとも40%、最も好ましくは少なくとも50%の溶媒(水)接触性を有する。
「溶媒接触性」という表現は、溶媒分子に匹敵する半径(水、r=1.4Å)を有する球に接触し得る分子の面積として定義される。
「表面露出」及び「溶媒露出」という表現は互換的に用いられる。
「前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種」という表現は、分類学上の系統における種を意味する。
さらに「前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する前記変異体アレルゲン」という表現は、構造を比較する場合に原子座標の平均標準偏差が2Åより小さいことを意味する。
本発明に関して「置換」という表現は、天然に存在するアレルゲンのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の欠失、置換又は付加を意味する。
本発明は以下の非限定的な実施例によって、さらに説明される。
【0016】
(実施例)
実施例1
実施例1は、一つ及び三つの第一変異を有する組換え変異体アレルゲンの調製を記述する。本発明の組換え変異体アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含むアレルゲンは、同じ手順を用いて調製され得る。
ファガレス花粉アレルゲンに含まれる共通エピトープの同定
主要なカバノキ花粉アレルゲンBet v 1は、分類学上の近縁な樹木すなわちファガレス(例えばハシバミ及びシデ)の花粉に由来する主要なアレルゲンと約90%のアミノ酸配列同一性を示し、カバノキ花粉アレルギー患者は多くの場合これらBet v 1相同タンパク質に対してアレルギー交差反応性の臨床症状を示す。
Bet v 1は、ある種の果物(例えばリンゴ及びサクランボ)及び野菜(例えばセロリ及びニンジン)に存在するアレルギー性タンパク質とも約50〜60%の配列同一性を示し、Bet v 1及びこれら食物関連タンパク質間のアレルギー性交差反応性に対する臨床的証拠が存在する。
加えてBet v 1は病原関連タンパク質(PR−10)と呼ばれる植物タンパク質群と有意な配列同一性(20〜40%)を共有するが、しかしながら、これらPR−10タンパク質に対するアレルギー性交差反応性の報告は存在しない。
分子モデリングは、ファガレス及び食物アレルゲン及びPR−10タンパク質の構造がBet v 1の構造とほぼ同一であることを示唆する。
アレルギー性Bet v 1交差反応性の構造的根拠は(Gajhede et al 1996,参考文献17)で報告されており、Bet v 1分子表面上の三つのパッチが既知の主要な樹木花粉アレルゲンに対して共通であることが確認できた。このように、Bet v 1上のこれらパッチを認識するどのIgEも他のファガレス主要花粉アレルゲンに対し交差反応及び結合することが可能であり、アレルギー症状を生じさせ得る。主要な樹木花粉アレルゲンの全既知アミノ酸配列アラインメント後に、参考文献17に報告されたα炭素骨格三次構造により明らかにされたBet v 1分子表面の解析と組合せて、これらの共通パッチの同定を行った。加えてパッチは、結合している抗体によって覆われた面積に基づいて一定の最小サイズ(400Å2より大きい)を有することが明らかにされた。
【0017】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基は、その改変が臨床樹木花粉アレルギー性交差反応性を示している患者の大部分に由来する血清IgEの結合性に影響することが予想されるので、Bet v 1特異的領域及び共通パッチに存在する残基の中から選択した。
それぞれのパッチ内にある各アミノ酸残基の相対方向及び溶媒露出のパーセンテージを、それらの原子座標に基づいて計算した。低度の溶媒露出(20%より少ない)を有する残基は、構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性があるために、変異に対して適切であるとみなさなかった。残りの残基を、溶媒露出の程度に従って順位付けした。
配列アラインメント
問い合わせ配列(Bet v 1ナンバー2801、WHO IUISアレルゲン学名小委員会)に対する配列相同性は、BLAST検索(Altschul et.al.,参考文献18)によってGenBank及びEMBL配列データベースから得た。BLASTが0.1より少ない確率を報告した全配列を考慮し、相同配列の非重複性一覧表を含む一つの一覧表を構成した。これらをCLUSTAL W(Higgins et al.,参考文献19)によって整列させ、完全な一覧表又は分類学上の近縁種のみを考慮した配列における各位置に対し同一性のパーセンテージを計算した。全部で122の配列がBet v 1ナンバー2801に対して相同で、そのうちの57配列が分類学上の近縁種に由来していた。
Bet v 1 をコードする遺伝子のクローニング
フェノール抽出及びLiCl沈殿によって、ベツラ・ベルルコサの花粉(Allergon、スウェーデン)からRNAを調製した。オリゴ(dT)−セルロースアフィニティークロマトグラフィーをエッペンドルフチューブ中でバッチ式に行い、商業的に入手可能なキット(Amersham)を用いて二重鎖cDNAを合成した。Bet v 1をコードするDNAをPCRにより増幅し、クローニングを行った。簡単に言うと、鋳型としてのcDNA、及びBet v 1のアミノ末端及び3’非翻訳領域に対応する位置のcDNA配列に適合するようにそれぞれ設計したプライマーを用いてPCRを行った。前記プライマーはpKK233−2への方向性を有するクローニングのため制限酵素部位(NcoI及びHindIII)を提供するように5’末端を延長した。
【0018】
pMAL−c へのサブクローニング
続いてBet v 1をコードする遺伝子を、マルトース結合タンパク質融合ベクターpMAL−c(New England Biolabs)にサブクローニングした。参考文献15に記述されるように、この遺伝子をPCRによって増幅しmalEとイン・フレームにサブクローニングしてMBP及びBet v 1が切断時にBet v 1真正アミノ末端配列を回復するように配置した因子Xaプロテアーゼ切断部位によって隔てられたマルトース結合タンパク質(MBP)−Bet v 1タンパク質融合オペロンを生成した。簡単に言うと、鋳型としてBet v 1を挿入したpKK233−3、及び、このタンパク質のアミノ及びカルボキシ末端にそれぞれ対応するプライマーを用いてPCRを行った。プロモーターに近いプライマーは、イン・フレームのXa因子プロテアーゼ切断部位をコードする四つのコドンを提供するように5’末端を延長した。両プライマーは、クローニングのための制限酵素部位(KpnI)を提供するように5’末端をさらに延長した。Bet v 1をコードする遺伝子を、PCRアーチファクトの頻度を減少するため20サイクルのPCRを用いてサブクローニングした。
In vitro の変異誘発
Bet v 1を挿入した組換えpMAL−cを鋳型として用いたPCRによって、In vitroの変異誘発を行った。各変異体Bet v 1遺伝子を、四つのプライマーを用いる三つのPCR反応によって生成させた。
二つの変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、各DNA鎖に対し一つ、各変異を提供するように合成した(図1及び2を参照)。変異ヌクレオチドを起点として用い、両プライマーを5’末端で7ヌクレオチド、3’末端で15ヌクレオチドを延長した。延長ヌクレオチドは実際領域のBet v 1遺伝子と同一であった。
さらに二つの一般的に適用可能なプライマー(図2で「全センス」及び「全非センス」と表示)を合成し、全変異体に対して用いた。これらのプライマーは長さが15ヌクレオチドであり、pMAL−cベクターのBet v 1からおよそ1キロベース上流及び下流の領域に対応する配列であった。上流プライマーの配列はセンス鎖に由来し、下流プライマーの配列は非センス鎖に由来する(図2を参照)。
【0019】
PCRアーチファクトの頻度を減らすために20回しか温度サイクルを行わなかったことを除き、本質的には標準的手順(Sakai et al 1988,参考文献20)に従って二つの独立なPCR反応を行った。各PCR反応は、鋳型としてBet v 1を挿入したpMAL−c、及び、一つの変異特異的プライマー及び一つの一般的に適用可能なプライマーの意味の有る組合せを用いた。
三重パッチ変異体における四つのアミノ酸置換(Asn28Thr、Lys32Gln、Glu45Ser、Pro108Gly)の導入は、上述したように段階的処理で行った。鋳型としてBet v 1ナンバー2801、Bet v 1(Glu45Ser)、Bet v 1(Glu45Ser、Pro108Gly)をそれぞれ挿入したpMAL−cを用いて、最初にGlu45Ser変異、次にPro108Gly変異、最後にAsn28Thr、Lys32Gln変異を導入した。
このPCR産物を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出に続くエタノール沈殿によって精製した。第三PCR反応は、鋳型として二つの第一PCR反応によるPCR産物の組合せ、及び、一般的に適用可能な両プライマーを用いて行った。再度、20サイクルの標準的PCRを用いた。このPCR産物を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出に続くエタノール沈殿によって精製し、制限酵素(BsiWI/EcoRI)で切断し、同じ制限酵素で切断したBet v 1挿入pMAL−cへ方向性を持たせてライゲーションさせた。
図3は、以下の全9つのBet v 1変異体の概観を示す。
Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser (非パッチ), Thr77Ala及びPro108Gly。四つの変異を有する付加変異体も作製した(Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly)。これらから、さらなる試験のために五つの変異体を選択した:Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly及び三重パッチ変異体Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly。
【0020】
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前と後、及びin vitroの変異誘発後にそれぞれ、Bet v 1をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン0.1 g/lを補充したLB培地中で一晩飽和状態まで増殖させた細菌培養液10 mlから、プラスミドDNAをQiagen−tip 20カラムで精製し、シークエネース(Sequenase)バージョン2.0 DNAシークエンシングキット(USB)を用い、供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換え Bet v 1 及びその変異体の発現及び精製
参考文献15に記述されるように、マルトース結合タンパク質と融合した組換えBet v 1(Bet v 1 ナンバー2801及び変異体)を大腸菌DH5aで過剰発現させ、精製した。簡単に言うと、組換えE.coli細胞を436 nmでの光学密度1.0まで37℃で増殖させてから、IPTGの添加によってBet v 1融合タンパク質の発現を誘導した。細胞を3時間誘導した後、遠心分離によって収穫し、溶菌緩衝液に再懸濁し、超音波処理によって破砕した。超音波処理後さらなる遠心分離を行い、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによって組換え融合タンパク質を単離し、続けてXa因子とインキュベーションすることによって切断した(参考文献15)。第Xa因子切断後、組換えBet v 1をゲル濾過によって単離した。必要があれば、微量のマルトース結合タンパク質を除去するために、さらにもう一回アミロースアフィニティークロマトグラフィーを行った。
精製組換えBet v 1を限外濾過によって約5 mg/mlまで濃縮し、4℃で保存した。精製組換えBet v 1調製品の最終的な収率は、E coli細胞培養液1リットルあたり2〜5 mgであった。
精製組換えBet v 1調製品は、銀染色SDS−ポリアクリルアミド電気泳動の後に見かけ上の分子量17.5 kDaの単一なバンドとして現れた。N末端シークエンシングは、cDNAヌクレオチド配列由来の期待される配列を示し、定量アミノ酸分析は予想されるアミノ酸構成成分を示した。
我々は既に、組換えBet v 1ナンバー2801が天然に存在するBet v 1と免疫化学的に区別がつかないことを示している(参考文献15)。
【0021】
ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫電気泳動
Bet v 1の七つの変異体を組換えBet v 1タンパク質として作製し、上述のように精製し、カバノキ花粉から単離したBet v 1に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体に対する反応性を試験した。未変性状態で免疫電気泳動(ロケットライン免疫電気泳動)によって分析した場合ウサギ抗体は全変異体を沈殿させることができ、このことは変異体が保存されたα炭素骨格三次構造を有することを示している。
ヒトポリクローナルIgE応答への効果を分析する目的で、変異体Glu45Ser、Pro108Gly、Asn28Thr+Lys32Gln及びGlu60Serをさらなる分析のために選択した。
Bet v 1 Glu45Ser 変異体
位置45のグルタミン酸は高度の溶媒露出(40%)を示し、ファガレスアレルゲンに共通な分子表面パッチ(パッチI)に位置する。Bet v 1相同PR−10タンパク質の幾つかにおいて位置45を占めるセリン残基が見出され、グルタミン酸がα炭素骨格三次構造の歪み無しにセリンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの既知ファガレスアレルゲン配列も位置45にセリンを有していないことから、セリンによるグルタミン酸の置換が天然に存在しないBet v 1分子を生ずる。
組換え Glu45Ser Bet v 1 変異体を用いた T 細胞増殖アッセイ
この分析は、Spangfort等の1996aに記述されたように行った。組換えBet v 1 Glu45Ser変異体は、三つの異なるカバノキアレルギー患者由来のT細胞株において、組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数で増殖を誘導することが可能であったことが見出された。
【0022】
組換え Glu45Ser Bet v 1 の結晶化及び構造決定
組換えGlu45Ser Bet v 1の結晶を、本質的には(Spangfort et al 1996b、参考文献21)に記述されたように、25℃の蒸発拡散によって成長させた。濃度5 mg/mlのGlu45Ser Bet v 1を等体積の2.0 M硫酸アンモニウム、0.1 Mクエン酸ナトリウム、1% (v/v)ジオキサン、pH 6.0と混合し、100倍の体積の2.0 M硫酸アンモニウム、0.1 Mクエン酸ナトリウム、1% (v/v)ジオキサン、pH 6.0に対して平衡化した。24時間の平衡化の後、組換え野生型Bet v 1の結晶を種のもととして用い参考文献21に記述される播種技術を応用することによって、結晶の成長を誘導した。
約2ヶ月後に結晶を収穫し、参考文献21に記述されるようにRigaku回転アノードから発生させたX線を用いて解析し、分子置換を用いて構造を明らかにした。
Bet v 1 Glu45Ser 変異体の構造
回転アノードから発生させたX線によって三次元のBet v 1 Glu45Serタンパク質結晶回析を解像度3.0Åまで上げて解析し、変異誘発の構造的効果に取り組んだ。位置45におけるセリンによるグルタミン酸の置換がBet v 1 Glu45Ser構造電子密度マップによって検証され、全体的なα炭素骨格三次構造が保存されていることも示された。
【0023】
Bet v 1 Glu45Ser 変異体の IgE 結合特性
カバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Bet v 1 Glu45Ser変異体のIgE結合特性を組換えBet v 1と比較した。
組換えBet v 1ナンバー2801を、1:5(Bet v 1ナンバー2801:ビオチン)のモル分率でビオチン化した。阻害アッセイは次のように行った:血清サンプル(25 μl)を抗IgE固体相とインキュベートし、洗滌し、ビオチン化Bet v 1ナンバー2801(3.4 nM)及び得られた変異体(0〜28.6 nM)の混合物に再懸濁してさらにインキュベートし、固体相に結合したビオチン化Bet v 1ナンバー2801の量をアクリジニウムエステル標識ストレプトアビジンとインキュベーションした後に測定したRLUから推定した。緩衝液及び阻害剤として変異体を用いて得られたRLUの間の比として、阻害の程度を計算した。
図4は、非ビオチン化Bet v 1、Bet v 1 Glu45Ser変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えBet v 1は約6.5 ngで50%阻害を達成する一方、Bet v 1 Glu45Ser変異体の対応する濃度は約12 ngである。このことは、Bet v 1 Glu45Ser変異体に導入された点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/2に低下させることを示す。Bet v 1 Glu45Ser変異体によって達成された阻害の最大値は、組換えBet v 1と比べて明らかに低くなる。このことは、Glu45ser置換すると血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかはBet v 1 Glu45Ser変異体を認識できないことを示し得る。
【0024】
Bet v 1 変異体 Asn28Thr + Lys32Gln
位置28及び32のアスパラギン及びリジンはそれぞれ、高度の溶媒露出(それぞれ、35%及び50%)を示し、ファガレスアレルゲンに共通の分子表面パッチ(パッチII)に位置する。構造上、アスバラギン28及びリジン32は分子表面上で互いに近接して位置し、水素結合を介して相互作用する可能性が高い。Bet v 1相同PR−10タンパク質の幾つかにおいてスレオニン及びグルタミン残基がそれぞれ位置28及び32を占めるのが見出され、アスパラギン及びリジンがそれぞれα炭素骨格三次構造の歪み無しにスレオニン及びグルタミンで置き換えられることが可能なことを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置28及び32にそれぞれスレオニン及びグルタミンを有していないことから、この置換が天然に存在しないBet v 1分子を生ずる。
Bet v 1 変異体 Asn28Thr + Lys32Gln の IgE 結合特性
上述のように、カバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、変異体Asn28Thr+Lys32GlnのIgE結合特性を組換えBet v 1と比較した。
図5は、非ビオチン化Bet v 1、Bet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnによる、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えBet v 1は約6.5 ngで50%阻害を達成する一方、Bet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnの対応する濃度は約12 ngである。このことは、Bet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnに導入された点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/2に低下させたことを示す。
Bet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnにより達成された阻害の最大値は、組換えBet v 1に比べて明らかに低くなる。このことは、Asn28Thr+Lyn32Gln置換すると血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかはBet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnを認識できないことを示し得る。
【0025】
Bet v 1 変異体 Pro108Gly
位置108のプロリンは高度の溶媒露出(60%)を示し、ファガレスアレルゲンに共通する分子表面パッチ(パッチIII)に位置する。Bet v 1相同PR−10タンパク質の幾つかにおいてグリシン残基が位置108を占めるのが見出され、プロリンはα炭素骨格三次構造の歪み無しにグリシンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置108にグリシンを有さないことから、グリシンによるプロリンの置換が天然に存在しないBet v 1分子を生ずる。
Bet v 1 Pro108Gly 変異体の IgE 結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Bet v 1 Pro108Gly変異体のIgE結合特性を組換えBet v 1と比較した。
図6は、非ビオチン化Bet v 1、Bet v 1 Pro108Gly変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えBet v 1は約6.5 ngで50%阻害を達成する一方、Bet v 1 Pro108Glyの対応する濃度は15 ngである。このことは、Bet v 1 Pro108Glyに導入された一つの点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/2に低下させることを示す。
Bet v 1 Pro108Gly変異体によって達成される阻害の最大値は、組換えBet v 1と比べていくらか低くなる。このことは、Pro108Gly置換すると血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかはBet v 1 Pro108Gly変異体を認識できないことを示し得る。
【0026】
Bet v 1 変異体 Glu60Ser (非パッチ変異体)
位置60のグルタミン酸は高度の溶媒露出(60%)を示すが、ファガレスアレルゲンに共通の分子表面パッチに位置しない。Bet v 1相同PR−10タンパク質の幾つかにおいてセリン残基が位置60を占めるのが見出され、グルタミン酸がα炭素骨格三次構造の歪み無しにセリンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置60にセリンを有さないことから、セリンによるグルタミン酸の置換が天然に存在しないBet v 1分子を生ずる。
Bet v 1 Glu60Ser 変異体の IgE 結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Bet v 1 Glu60Ser変異体のIgE結合特性を組換えBet v 1と比較した。
図7は非ビオチン化Bet v 1、Bet v 1 Glu60Ser変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。Glu45Ser、Pro108Gly及びAsn28Thr+Lyn32Gln変異体とは対照的に、グルタミン酸60のセリンへの置換はIgE結合特性にどんな有意な効果も示さない。このことは、明らかにされたファガレス共通パッチの外側の置換は、特異的血清IgEの結合に重要でない効果を有するのみであることを示し、保存されたアレルゲン分子表面領域が優性IgE結合エピトープを含むという概念を支持している。
Bet v 1 三重パッチ変異体
三重パッチ変異体では、上述した三つの異なるファガレス共通パッチに導入された点変異(Glu45Ser、Asn28Thr+Lys32Gln及びPro108Gly)を同時に導入して、四つのアミノ酸置換を有する人為的変異体を作成した。
Bet v 1 三重パッチ変異体の構造解析
精製三重パッチ変異体の構造上の完全性を、円二色性(CD)分光法によって解析した。図8は、ほぼ等しい濃度で記録された組換え体及び三重パッチ変異体のCDスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のCDスペクトルにおけるピークの振幅及び位置における重複は二つの調製品が二次構造を等量含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆している。
【0027】
Bet v 1 三重パッチ変異体の IgE 結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Bet v 1三重パッチ変異体のIgE結合特性を組換えBet v 1と比較した。
図9は、非ビオチン化Bet v 1、Bet v 1三重パッチ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。上述した単変異体とは対照的に、三重パッチ変異体の阻害曲線は組換え体に対し、もはや並行関係でない。このことは、三重パッチ変異体に導入された置換が組換え体と比べてIgE結合特性及びエピトープの外形を変化させていることを示す。この並行性の欠如が、特異的血清IgEに対する三重パッチ変異体の親和性の減少を定量化することを困難にしている。
組換えBet v 1は約6 ngで50%阻害を達成する一方、Bet v 1三重パッチ変異体の対応する濃度は30 ng、すなわち1/5の親和性減少である。しかしながら、80%阻害を達成するための対応する値はそれぞれ20 ng及び400 ng、すなわち1/20の減少である。
組換え Bet v 1 三重パッチ変異体を用いた T 細胞増殖アッセイ
この分析は、参考文献15に記述されたように行った。三つの異なるカバノキ花粉アレルギー患者由来のT細胞株において、組換えBet v 1三重パッチ変異体が組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数で増殖を誘導できることが見出された。このことは、三重パッチ変異体が抗体産生に必要な細胞性免疫応答を開始可能であることを示唆する。
【0028】
実施例2
実施例2は、一つの第一変異を有する組換え変異体アレルゲンの調製を記述する。本発明の組換え変異体アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含むアレルゲンは、同じ手順を用いて調製され得る。
ベスプラ・ブルガリス毒物主要アレルゲン抗原 5 に含まれる共通エピトープの同定
抗原5は、ヒトにおけるアレルゲンとして知られる三つのスズメバチ毒物タンパク質の一つである。前記スズメバチはホーネット、イエロージャケット及びワスプを含む。他二つのスズメバチ毒物の既知アレルゲンは、ホスホリパーゼA1及びヒアルロニダーゼである。ベスプラ・ブルガリス由来の抗原5(Ves v 5)はクローニングされて、酵母系において組換えタンパク質として発現されている(Monsalve et al.1999、参考文献22)。組換えVes v 5の三次元結晶構造は1.8Åの解像度で最近決定されている(近刊)。この構造の主な特徴は、「α−β−αサンドイッチ」を生じる三つの積み重ねられた層に配置された四つのβ鎖及び四つのαへリックスから構成される。異なるベスプラ種に由来する抗原5の相同アレルゲン間の配列同一性は約90%であり、保存された分子表面領域及び保存されたB細胞エピトープの存在を示唆している。
既に樹木花粉アレルゲンに対して述べたように、ベスプラ抗原5アレルゲンの全既知アミノ酸配列のアラインメント後、Ves v 5の三次元構造によって明らかにされた抗原5の分子表面の解析と組合せて、共通パッチの存在を明らかにし、その同定を行った。図10は、個々に整列させた抗原5の残基の溶媒接触性、及び、ベスプラ抗原5配列アラインメント(左パネル)を示す。図10右パネル上で、ベスプラ抗原5:sの中の保存された領域を着色して、抗原5の分子表面を示す。
【0029】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
臨床ベスプラアレルギー性交差反応性を示す患者の大部分に由来する血清IgEの結合性にアミノ酸残基の改変が影響することが予測されるため、部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基をベスプラに共通するパッチに存在する残基の中から選択した。
各パッチ内の各アミノ酸残基の相対方向及び溶媒露出パーセンテージを、各アミノ酸残基の原子座標に基づいて計算した。低度の溶媒露出を有する残基は、構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性により、変異誘発に適切であるとみなさなかった。残りの残基を溶媒露出の程度に従って順位付けした。
Ves v 5 をコードする遺伝子のクローニング
全RNAを(Fang et al.1988、参考文献23)に記述されるようにベスプラ・ブルガリス・スズメバチの毒物胃酸分泌線から単離した。
第一鎖cDNA合成、PCR増幅及びVes v 5遺伝子のクローニングを(Lu et al.1993、参考文献24)に記述されるように行った。
pPICZ α A へのサブクローニング
続いてVes v 5をコードする遺伝子を、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)におけるVes v 5の分泌発現のため、pPICZαAベクター(Invitrogen)へサブクローニングした。この遺伝子をPCRによって増幅し、酵母のα因子分泌シグナルのためのコード配列とともに、イン・フレームにサブクローニングした。この構築物において、α因子はタンパク質分泌の間にピチア・パストリスKex2プロテアーゼ系によりin vivoで切断除去される。
簡単に言うと、鋳型としてVes v 5、及び、タンパク質のアミノ及びカルボキシル末端にそれぞれ対応するプライマーを用いてPCRを行った。このプライマーはそれぞれ、クローニングのためのEcoRI及びXbaI制限酵素部位を提供するように5’末端を延長した。Kex2切断部位をコードするヌクレオチドを、この構築物においてタンパク質のアミノ末端に対し18ヌクレオチド上流に配置し、アミノ末端に六つの付加アミノ酸Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pheを有するVes v 5を発現させた。P. パストリスへの pPICZ α A−Ves v 5 の挿入
Ves v 5遺伝子が挿入されたpPICZαAベクターをSacI制限酵素切断によって線形にし、ピチア・パストリスのゲノム上のAOX1遺伝子座に挿入した。Invitrogenの推奨に従ってKM71細胞のピチア・パストリス上の相同組換えによって、挿入を行った。
【0030】
In vitro の変異誘発
鋳型としてVes v 5を挿入した組換えpPICZαAを用いたPCRによって、in vitroの変異誘発を行った。四つのプライマーを用いた三つのPCR反応によって各変異体Ves v 5遺伝子を生成させた。
二つの変異誘発特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、各変異を提供するように、各DNA鎖に対し一つずつ合成した(図11及び12を参照)。変異ヌクレオチドを起点として用い、両プライマーを5’末端側に6〜7ヌクレオチド、3’末端側に12〜13ヌクレオチド延長した。延長ヌクレオチドは、実際領域においてVes v 5遺伝子と配列が同一であった。
さらに、二つの一般的に適用可能なプライマー(図12において「全センス」及び「全非センス」と表示)を合成して、全変異体に対して用いた。真正アミノ末端を有するVes v 5変異体の発現を保証するために、タンパク質のアミノ末端に対応する一つのプライマーはXhoI認識部位を有するように5’末端で延長した。Ves v 5変異体遺伝子のpPICZαAベクターへの挿入時に、Kex2プロテアーゼ切断部位をVes v 5アミノ末端の上流に直接再生成させた。第二プライマーは、pPICZαAベクターのVes v 5遺伝子からおよそ300 bp下流に位置する領域の配列に対応させた。Ves v 5アミノ末端に対応するプライマー配列はセンス鎖由来であり、下流プライマー配列は非センス鎖由来である(図11を参照)。
PCRアーチファクトの頻度を減少するために20回しか温度サイクルを行わなかったことを除き、二つの独立したPCR反応を本質的には標準的手順(Saiki et al 1988)に従って行った。各PCR反応は、鋳型としてVes v 5を挿入されたpPICZαA、一つの変異特異的プライマー及び一つの一般的に適用可能なプライマーの意味のある組合せを用いた。
このPCR産物を”コンサート,ラピッドPCRピュアリフィケーションシステム” (Life Technologies)を用いて精製した。鋳型として二つの第一PCR反応によるPCR産物の組合せ、及び、一般的に適用可能な両プライマーを用いて、第三PCR反応を行った。再び、20サイクルの標準的PCRを用いた。このPCR産物を” コンサート,ラピッドPCRピュアリフィケーションシステム” (Life Technologies)を用いて精製し、制限酵素(XhoI/XbaI)で切断し、同じ酵素で制限酵素切断したpPICZαAベクターに方向性を持たせてライゲーションさせた。図13は、全Ves v 5変異の概要を示す。
【0031】
P. パストリスへの pPICZ α A−Ves v 5 変異体の挿入
Ves v 5変異体遺伝子を挿入されたpPICZαAベクターをSacI制限酵素切断によって線形にし、ピチア・パストリスのゲノム上のAOX1遺伝子座に挿入した。Invitrogenの推奨に従ってKM71細胞のピチア・パストリス上の相同組換えによって、挿入を行った。
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前及び後、in vitroの変異誘発後にそれぞれ、Ves v 5をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン0.1 g/lを補充したLB培地中で一晩飽和に達するまで増殖させた細菌培養液10 mlから、プラスミドDNAをQiagen−tip 20カラムで精製し、シークエネース・バージョン2.0 DNAシークエンシングキット(USB)を用いて供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換え Ves v 5 の発現及び精製
酵母窒素塩基、ビオチン、グリセロール及びヒスチジンを含むpH 6.0のリン酸緩衝液100 mlを含む500 mlボトル中、30℃、225 rpmで軌道振盪しながら、ピチア・パストリス株KM71の組換え酵母細胞をA600 nmが4〜6になるまで増殖させた。細胞は遠心分離によって集め、グリセロールの代わりにメタノールを含む同様な緩衝化培地10 mlに再懸濁した。毎日メタノール0.05 mlを加えながら、30℃で7日間インキュベーションを続けた。
細胞を遠心分離によって収穫し、集めた培養液を限外濾過によって濃縮した。pH 4.6の50 mMアンモニウムアセテート緩衝液に透析した後、このサンプルを同じ緩衝液で平衡化したFPLC (Pharmacia) SE−53カチオン交換カラムに装填した。このカラムを0〜1.0 M NaCl、50 mMアンモニウムアセテートの直線グラジエントで溶離した。約0.4 M NaClで溶離された組換えVes v 5のピークを集め、0.02 N酢酸に透析した。約10 mg/mlまで濃縮した後、精製Ves v 5を4℃で保存した。
【0032】
組換え Ves v 5 の結晶化
Ves v 5の結晶を、25℃の蒸発拡散技術によって成長させた。結晶化のために、5 μlの5 mg/ml Ves v 5を5 μlの18% PEG 6000、0.1 Mクエン酸ナトリウム、pH 6.0と混合し、1 mlの18% PEG 6000、0.1 Mクエン酸ナトリウム、pH 6.0に対して平衡化した。
天然Ves v 5結晶及び重原子取込み後の誘導体から100KでX線回析データを集め、Ves v 5三次元構造を解析することに用いた(図10を参照)(原稿は準備中)。
ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫電気泳動
二つのVes v 5変異体を組換えVes v 5タンパク質として作製し、組換えVes v 5に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体に対する反応性を試験した。未処理状態下でロケット免疫電気泳動によって分析した場合、ウサギ抗体は組換えVes v 5及び両前記変異体を沈殿させることが可能であった。このことは前記変異体が保存されたα炭素骨格三次構造を有することを示している。
特異的血清 IgE の阻害
スズメバチ毒物アレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Ves v 5変異体のIgE結合特性を組換えVes v 5と比較した。
この阻害アッセイは、Bet v 1の代わりにビオチン化組換えVes v 5を用いて上述のように行った。
Ves v 5 Lys72Ala 変異体
位置72のリジンは高度の溶媒露出(70%)を示し、ベスプラ抗原5に共通な分子表面パッチに位置する。この相対方向及び高度の溶媒露出は、リジン72がα炭素骨格三次構造の歪み無しにアラニン残基によって置き換えられることが可能であることを支持した。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置72にアラニンを有さないことから、アラニンによるリジンの置換が天然に存在しないVes v 5分子を生ずる。
【0033】
Ves v 5 Lys72Ala 変異体の IgE 結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Ves v 5 Lys72Ala変異体のIgE結合特性を組換えVes v 5と比較した。
図14は、非ビオチン化Ves v 5、Ves v 5 Lys72Ala変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えVes v 5の結合の阻害を示す。
血清中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えVes v 5は約6 ngで50%阻害を達成する一方、ves v 5 Lys72Alaの対応する濃度は40 ngである。このことは、Ves v 5 Lys72 Ala変異体に導入された一つの点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/6に低下させることを示す。Ves v 5 Lys72Ala変異体によって達成された阻害の最大値は、組換えVes v 5に比べて著しく低下する。このことは、Lys72Ala置換すると血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかはVes v 5 Lys72Ala変異体を認識できないことを示し得る。
【0034】
Ves v 5 Tyr96Ala 変異体
位置96のチロシンは高度な溶媒露出(65%)を示し、ベスプラ抗原5に共通な分子表面パッチに位置する。この相対方向及び高度な溶媒露出は、チロシン96が三次元構造の歪み無しにアラニン残基で置き換えられることが可能であることを支持した。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置96にアラニンを有さないことから、アラニンによるチロシンの置換が天然に存在しないVes v 5分子を生ずる。
Ves v 5 Tyr96Ala 変異体の IgE 結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Ves v 5 Tyr96Ala変異体のIgE結合特性を組換えVes v 5と比較した。
図14は、非ビオチン化Ves v 5、Ves v 5 Tyr96Ala変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えVes v 5の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えVes v 5は約6 ngで50%阻害を達成する一方、Ves v 5 Tyr96Ala変異体の対応する濃度は40 ngである。
このことは、Ves v 96 Tyr96Ala変異体に導入された一つの点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/6に低下させることを示す。
Ves v 5 Tyr96Ala変異体により達成された阻害の最大値は、組換えVes v 5に比べて著しく低下する。このことは、Tyr96Ala置換すると血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかは、Ves v 5 Tyr96Ala変異体を認識できないことを示し得る。
【0035】
実施例3
置換のためのアミノ酸の同定及び選択
溶媒接触性及び保存の程度のパラメータを用いて、アレルゲンBet v 1、Der p 2及びVes v 5のための置換に適する表面露出アミノ酸の同定及び選択をした。溶媒接触性
ソフトウエアInsightIIバージョン97.0(MSI)及び半径1.4Å(コナリー(Connolly)表面)のプローブを用いて、溶媒接触性を計算した。
ソフトウエアPASS(球による推定活性部位)を用いプローブで満たすことによって解析から内部空洞を排除した。その後、表面上のプローブを手動で取り出した。
保存
Bet v 1:
3−D構造は、アクセッション番号Z80104(1bv1.pdb)に基づく。
保存残基の解析に含まれた38の他のBet v 1配列は、アクセッション番号:P15494=X15877=Z80106, Z80101, AJ002107, Z72429, AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110, Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106, P43178=X77267, P43179=X77268, P43177=X77266, Z72438, P43180=X77269, AJ001551, P43185=X77273, AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200, P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437, S47249を含む。
【0036】
Der p 2:
3−D構造はアクセッション番号P49278(1a9v.pdb)に基づく。
保存残基の解析に含まれた6つの他のDer p 2配列は、以下の置換を含む:
ALK−G: V40L, T47S, M111L, D114N.
ALK−101: M76V
ALK−102: V40L, T47S
ALK−104: T47S, M111I, D114N
ALK−113: T47S
ALK−120: V40L, T47S, D114N。
Ves v 5:
3−D構造はアクセッション番号Q05110(pdb座標は公知でない)に基づく。
保存残基の解析における他のVes v 5配列は、一つのアミノ酸置換:M202Kを含む。
結果
Bet v 1
高度に溶媒露出された59アミノ酸:
K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, T−77, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, L−62, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87, E−73。
【0037】
高度に溶媒露出され、70%より高く保存された57アミノ酸:
K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87, E−73。
実施した23変異:
Y5V, T10P, D25E, N28T, K32Q, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, T77A, N78K, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K134E, R145E, D156H, +160N。
表1は、Bet v 1アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第1欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第2欄は1文字略語でアミノ酸を記載し、第3欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第4欄はこの位置において関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【0038】
【表1】
【0039】
Der p 2
高度に溶媒露出された55アミノ酸:
R−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, D−114, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109, K−15。
高度に溶媒露出され、70%より高く保存された54アミノ酸:
R−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109, K−15。
実施した6変異:
K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N。
表2は、Der p 2アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第1欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第2欄はアミノ酸を1文字略語で記載し、第3欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第4欄はこの位置における関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【0040】
【表2】
【0041】
Ves v 5
高度に溶媒露出された89アミノ酸:
K−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149,K−128, E−184, K−112, K−202, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85, I−182。
高度に溶媒露出され、70%より高く保存された88アミノ酸:
K−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149, K−128, E−184, K−112, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85, I−182。
実施した9変異:
K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M, N203G。
表3は、Ves v 5アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第1欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第2欄はアミノ酸を1文字略語で記載し、第3欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第4欄はこの位置における関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【0042】
【表3】
【0043】
実施例4
この実施例は、本発明の組換え変異体Bet v 1アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含みIgE結合親和性を減少させたアレルゲンの調製及び特徴付けを記述する。
Bet v 1 の部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
Bet v 1アミノ酸残基の溶媒接触性を、実施例3の表1に示す。アミノ酸保存の割合は、ExPaSy分子生物学サーバー(http://www.expasy.ch/)において、Bet v 1.2801野生型アミノ酸配列を入力配列として用いたBLAST検索にClustalWアルゴリズムを用いて行われた配列アラインメントに基づく。このアラインメントは、ファガレス目の範囲内の種(Bet v 1:ベツラ・ベルルコサ;Car b 1:カルピナス・ベツルス;Cor a 1:コリルス・アベルラナ(avellana);Aln g 1:アルナス・グルチノサ)に由来する67アレルゲン配列(39のBet v 1配列、11のCar b 1配列、6のCor a 1配列及び13のAln g 1配列)を含む。実施例中に示された変異組換えBet v 1アレルゲンに関し、置換のための標的残基は95%以上のアミノ酸同一性に基づいた。
実施例1に記述するように、高度な溶媒露出、及び、近縁種に由来する花粉アレルゲン間において高度な保存を有するアミノ酸残基を部位特異的変異誘発のために選択した。低度の溶媒露出(20%より低い)を有する残基は、三次構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性のため、変異誘発に適切であるとみなさなかった。
導入された残基は、病原関連(PR−10)タンパク質と呼ばれる植物タンパク質群のイソフォームにおいて対応する位置に全て存在した。分子モデリングは、ファガレスアレルゲン及びPR−10タンパク質の三次構造がほぼ同一であることを示唆する。Bet v 1は、有意な配列同一性(20〜40%)をPR−10タンパク質と共有する。しかしながら、これらPR−10タンパク質に対するアレルギー性交差反応性の報告は存在しない。このように、Bet v 1由来の高度に保存及び溶媒露出されたアミノ酸をPR−10タンパク質の対応する位置のアミノ酸と交換することにより、未改変のα炭素骨格三次構造を有するが減少したIgE結合親和性を有する変異Bet v 1タンパク質が生じる。
【0044】
In vitro の変異誘発
Bet v 1を挿入された組換えpMAL−cを鋳型として用いたPCRによって、in vitroの変異誘発を行った。5〜9の第一変異を含む組換え変異体アレルゲンの調製は二つのPCR工程;工程I及びIIを含む。最初に、図17(I)で概略的に説明するように、各変異を提供するセンス及びアンチセンス変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーに加えて、変異に隣接する上流若しくは下流又はBet v 1のN末端/C末端のいずれかを提供するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ用いて、各一つの変異(又は、DNA配列上で共に近接して位置する場合には複数の変異)をBet v 1.2801又はBet v 1.2801誘導体の一連のDNA配列に導入した。第二に、図17(II)で概略的に説明するように、PCR反応IによるPCR産物を精製し、混合し、追加PCR反応(II)のための鋳型として、Bet v 1のN末端及びC末端を提供するオリゴヌクレオチドプライマーとともに用いた。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動及びPCRゲル精製(Life Technologies)に続くエタノール沈殿によって精製し、制限酵素(SacI/EcoRI)又は(SacI/XbaI)で切断し、同じ酵素で制限酵素切断したpMAL−cに方向性を持たせてライゲーションを行った。
図18は、合成したオリゴヌクレオチドプライマー、及び、5〜9の第一変異を有するBet v 1変異体の構築の概略的な説明を示す。変異アミノ酸は、好ましくは実施例3で記述したように高度に溶媒露出及び保存されたことによって特徴付けられるアミノ酸からなる群より選択した。Bet v 1変異体は、括弧内に示された以下の第一及び第二変異である:
変異体Bet v 1 (2628): Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu
変異体Bet v 1 (2637): Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro)
変異体Bet v 1 (2733): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn)
変異体Bet v 1 (2744): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123Ile, (Asp156His, +160Asn)
変異体Bet v 1 (2753): (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu。
【0045】
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前及び後、in vitroの変異誘発後のそれぞれで、Bet v 1をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン0.1 g/lを補充したLB培地で一晩飽和に達するまで増殖させた細菌培養液10 mlから、プラスミドDNAをQiagen−tip 20カラムで精製し、(Perkin Elmer)から入手したレディ(Ready)・リアクション・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキット及び蛍光シークエンサーAB PRISM 377を用い、供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換え Bet v 1 及び変異体の発現及び精製
参考文献15に記述されるように、組換えBet v 1(Bet v 1.2801及び変異体)をマルトース結合タンパク質に融合した状態で大腸菌DH5αにおいて過剰発現させ、精製した。簡単に言うと、組換えE.coli細胞を600 nmにおける光学密度0.8に達するまで37℃で増殖させた後、IPTGの添加によってBet v 1融合タンパク質の発現を誘導した。細胞を3時間のインキュベーションの後、遠心分離によって収穫し、溶菌緩衝液中に再懸濁させ、超音波処理によって破砕した。超音波処理及びさらなる遠心分離の後、組換え融合タンパク質をアミロースアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、その後Xa因子とともにインキュベーションすることにより切断した(参考文献15)。第Xa因子切断後、組換えBet v 1をゲル濾過によって単離し、微量のマルトース結合タンパク質を除去するためにもう一回アミロースアフィニティークロマトグラフィーで処理した。
精製組換えBet v 1を限外濾過によって約5 mg/mlまで濃縮し、4℃で保存した。精製組換えBet v 1調製品の最終的な収率は、E.coli細胞培養液1リットルあたり2〜5 mgであった。
精製組換えBet v 1調製品は、銀染色SDS−ポリアクリルアミド電気泳動後見かけ上の分子量17.5 kDaの単一バンドとして現れた。
我々は既に、組換えBet v 1ナンバー2801が天然に存在するBet v 1と免疫化学的に区別がつかないことを示している(参考文献15)。
【0046】
Bet v 1(2628) 及び Bet v 1(2637) 変異体
図19は、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の分子表面に導入された点変異を示す。変異体Bet v 1(2628)では、五つの第一変異がBet v 1の半分に導入され、残り半分は不変のままであった。変異体Bet v 1(2637)では、五つの第一変異及び三つの第二変異が前記残り半分に導入され、もう半分は不変のままであった。このように、変異体Bet v 1(2628)及び変異体Bet v 1(2637)における変異は、それぞれBet v 1表面の異なる半分に影響する。
組換え Bet v 1(2628) 変異体タンパク質の結晶化及び構造決定
本質的には(Spangfort et al 1996b、参考文献21)に記述されるように、組換えBet v 1(2628)の結晶を25℃の蒸発拡散によって成長させた。濃度5 mg/mlのBet v 1(2628)を、等体積の2.2 M硫酸アンモニウム、0.1 Mクエン酸ナトリウム、1% (v/v)ジオキサン、pH 6.3と混合し、100倍の体積の2.2 M硫酸アンモニウム、0.1 Mクエン酸ナトリウム、1% (v/v)ジオキサン、pH 6.3に対して平衡化した。24時間の平衡化の後、組換え野生型Bet v 1の結晶を種のもととして用い、参考文献21に記述される播種技術を応用することによって、結晶の成長を誘導した。
約4ヶ月後に結晶を収穫し、参考文献21に記述されるようにRigaku回転アノードから発生させたX線を用いて解析し、分子置換を用いて構造を明らかにした。
Bet v 1(2628) 変異体の構造
回転アノードから発生させたX線によって、三次元のBet v 1(2628)タンパク質結晶回析を2.0Åの解像度で解析することによって、変異誘発の構造的効果に取り組んだ。Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Gluの置換はBet v 1(2628)構造電子密度マップによって検証され、全体的なα炭素骨格三次構造が保存されていることも示された。
【0047】
Bet v 1(2637) 変異体の構造解析
精製Bet v 1(2637)変異体の構造上の完全性を、円二色性(CD)分光法により解析した。図20は、ほぼ等しい濃度で記録された組換えBet v 1.2801(野生型)及びBet v 1(2637)変異体のCDスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のCDスペクトルにおけるピークの振幅及び位置の重複は、この二つの調製品が等量の二次構造を含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆する。
Bet v 1(2628) 及び Bet v 1(2637) 変異体の IgE 結合特性
カバノキアレルギー患者由来の血清IgEのプールを用いた流動相IgE阻害アッセイによって、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)のIgE結合特性、及び、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の1:1混合物のIgE結合特性を、組換え野生型Bet v 1.2801と比較した。
実施例1で記述したように、組換えBet v 1.2801を1:5(Bet v 1ナンバー2801:ビオチン)のモル比でビオチン化した。阻害アッセイは次のように行った:血清サンプル(25 μl)を抗IgE固体相とインキュベートし、洗滌し、ビオチン化Bet v 1.2801及び得られた変異体の混合物、又は、二つの変異体の1:1混合物に再懸濁してさらにインキュベートし、固体相に結合したビオチン化Bet v 1.2801の量をアクリジニウムエステル標識ストレプトアビジンとインキュベーションした後に測定したRLUから推定した。阻害の程度は、緩衝液及び阻害剤として変異体を用いて得られたRLUの間の比として計算した。
図21は、非ビオチン化Bet v 1.2801、Bet v 1(2628)、Bet v 1(2637)、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の1:1混合物による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1.2801の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清IgEに対する結合の50%阻害を達成するために必要である各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えBet v 1.2801は約5 ngで50%阻害を達成する一方、Bet v 1(2628)変異体の対応する濃度は約15〜20 ngである。このことは、Bet v 1(2628)変異体に導入された点変異が特異的血清IgEに対する親和性を約1/3〜1/4に低下させることを示す。
【0048】
Bet v 1(2628)変異体タンパク質によって達成された阻害の最大値は、組換えBet v 1.2801と比べて明らかに低下している。このことは、血清プール中に存在する特異的IgEの幾らかは導入された点変異のためにBet v 1(2628)変異体タンパク質を認識できないことを示し得る。
Bet v 1(2637)は約400〜500 ngで50%阻害を達成し、Bet v 1(2637)変異体に導入された点変異が特異的血清IgEに対する親和性をBet v 1.2801に比べて1/80〜1/100に低下させることを示す。IgE結合性における大きな差異は、Bet v 1.2801の阻害曲線と比較してBet v 1(2637)変異体タンパク質から得られた阻害曲線の傾きの明らかな相違によって、さらに支持される。この異なる傾きは、IgE結合性の減少はBet v 1.2801と比べて明確に異なる変異体のエピトープパターンによることの証拠を提供する。
単改変アレルゲンでの阻害アッセイに加えて、Bet v 1(2628)又はBet v 1(2637)の各サンプルそれぞれがBet v 1と同じモル濃度を有するBet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の1:1混合物を試験すると、組換えBet v 1.2801に対してIgE結合を阻害する完全な(100%)能力を示した。このIgE結合を完全に阻害する能力は、Bet v 1.2801上に存在する反応性エピトープ全部が前記1:1アレルゲン混合物中に存在したことを明確に示している。このことはBet v 1.2801及び前記アレルゲン混合物による二つの阻害曲線の傾きの比較によって、さらに支持される。IgE結合の50%阻害を得るためにBet v 1.2801と比べて四倍高濃度のアレルゲン混合物を必要とすることから、混合アレルゲンサンプルの減少したIgE反応性が実証される。
【0049】
変異組換え Bet v 1 アレルゲンを用いた T 細胞増殖アッセイ
この分析は参考文献15に記述されるように行った。Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)変異体タンパク質は両方とも、組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数でカバノキ花粉アレルギー患者由来のT細胞株の増殖を誘導することができた。このことは、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の両変異体タンパク質それぞれが、抗体産生のために必要な細胞性免疫応答を開始可能であることを示唆する。
ヒト好塩基球を用いたヒスタミン放出アッセイ
好塩基性白血球からのヒスタミン放出を次のように行った。各カバノキ花粉患者から採取したヘパリン添加血液(20 ml)を室温で保存し24時間以内に用いた。ヘパリン添加全血25 μlをグラスファイバーコートしたミクロタイターウェルに加え(関連研究室、コペンハーゲン、デンマーク)、25 μlのアレルゲン又は抗IgEと37℃で1時間インキュベートした後、前記プレートをリンスして妨害物質を除去した。最後にミクロファイバーに結合したヒスタミンを蛍光分光分析的に測定した。
Bet v 1(2628) 及び Bet v 1(2637) 変異体タンパク質のヒスタミン放出特性
ヒスタミン放出データを図22及び図23に示す。Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)変異体タンパク質が二つのカバノキ花粉アレルギー患者由来のヒト好塩基球におけるヒスタミン放出を誘導する作用強度を試験した。両方のケースにおいて、ヒスタミン放出を誘導する変異アレルゲンの放出曲線はBet v 1.2801の放出曲線に比べ明らかに右にシフトしている。このシフトは、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の作用強度が1/3〜1/10に減少されたことを示す。
【0050】
変異体 Bet v 1(2744) 及び変異体 Bet v 1(2753)
Bet v 1(2744)及びBet v 1(2753)を混合アレルゲンワクチンとしての使用のため同様に構築した。これらの変異アレルゲンの点変異は全体表面において図24及び図25に示されるような配置様式で分布し、ここでも図26に示されるように二分子それぞれにおいて異なる表面領域に影響するように設計した。しかしながら、これらの改変アレルゲンが個々に単一アレルゲンワクチンとしても用いることができるであろう。
Bet v 1(2744) 変異体タンパク質の構造解析
精製Bet v 1(2744)変異体の構造上の完全性を円二色性(CD)分光法によって解析した。図27は、ほぼ等しい濃度で記録された組換えBet v 1.2801(野生型)及びBet v 1(2744)変異体のCDスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のCDスペクトルにおけるピークの振幅及び位置の重複は、この二つの調製品が二次構造を等量含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆している。
Bet v 1(2744) のヒスタミン放出特性
五つの異なるカバノキ花粉アレルギー患者由来の好塩基性白血球を用いた五つの実施例からのヒスタミン放出データを、図28及び図29A−Dに示す。Bet v 1(2744)変異体タンパク質がヒト好塩基球におけるヒスタミン放出を誘導する作用強度を試験した。変異アレルゲンの放出曲線はBet v 1.2801の放出曲線と比べて明らかに右にシフトしており、Bet v 1(2744)のヒスタミン放出する作用強度が1/3〜1/5に減少されたことを示している。
変異体 Bet v 1(2733)
九つの第一変異を有する変異体Bet v 1(2733)を構築し、組換え的に発現させた。Bet v 1(2733)における点変異の分布は、構成要素となるそれぞれの表面領域を400Å2より大きく変化させないままにする。図30は、Bet v 1(2733)の分子表面に導入された点変異を示す。
【0051】
実施例5
この実施例は、デルマトファゴイデス・プテロニスシナス由来のDer p 2をコードする遺伝子のクローニング、及び、IgE結合親和性を減少した変異体の構築を記述する。
デルマトファゴイデス・プロテニスシナス全RNAの第一鎖cDNA合成からPCR増幅した産物を、Dr.Wendy−Anne Smith及びDr.Wayne Thomas(TVW 児童健康調査テレソン研究所、100 Roberts Rd、Subiaco、Western Australia 6008)から入手した。第一鎖cDNAライブラリーの増幅の際に、Der p 2特異的プライマーを用いてDer p 2を選択的に増幅した。続いてPCRフラグメントをpUC19(New England BioLabs)のBamHI認識部位へクローニングした。Der p 2のDNAサブクローニングを、ベクター特異的なセンス(5’−GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG−3’)プライマー及びアンチセンス(5’−GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC−3’)プライマーを用いて行った。
ALK−101、ALK−102、ALK−103、ALK−104、ALK−113、ALK−114及びALK−120と命名した全部で七つのユニークなDer p 2イソフォームを同定した。データーベースのアクセッション番号1A9Vを有するDer p 2のNMR構造と高い配列同一性を有することから、ALK−114と題したクローンを低親和性IgE変異体生成のための出発点として選択した。ALK−114と比べると、他の6つの天然に存在するイソフォームは以下の置換を含む:
ALK−101: M76V
ALK−102: V40L, T47S
ALK−103: M111L, D114N
ALK−104: T47S, M111I, D114N
ALK−113: T47S
ALK−120: V40L, T47S, D114N。
【0052】
Der p 2 の pGAPZ α −A への挿入
酵母ピチア・パストリスにおけるDer p 2の分泌発現のため、続いてDer p 2(ALK−114)をコードする遺伝子をpGAPZα−Aベクター(Invitogen)に挿入した。この遺伝子を、Der p 2ポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端にそれぞれ対応するセンスプライマーOB27(5’−GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC−3’)及びアンチセンスプライマーOB28(5’− CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC−3’)を用いて増幅した。これらプライマーは、制限酵素部位XhoI及びXbaIをそれぞれ提供するように5’末端を延長した。XhoI制限酵素部位は、Der p 2の第一コドンをpGAPZα−AのKEX2切断部位(LYS−ARG)をコードする核酸配列とイン・フレームに融合させる。PCR増幅の1ラウンドを、体積100 μl中:0.1 mgの鋳型ALK−114 DNA、1x伸長ポリメラーゼ緩衝液(Boehringer Mannheimより入手可能)、各四つのdNTPを0.2 mMずつ、各0.3 μMのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、2.5ユニットの伸長ポリメラーゼ(Boehringer Mannheimより入手可能)で行った。前記DNAを95℃ 15秒、45℃ 30秒、72℃ 1分の25サイクルで増幅し、続いて72℃ 7分の1サイクルを行った。得られた475 bpのALK−114 PCRフラグメントを、QIAクイック・スピン・ピュアリフィケーション・プロシージャー(Qiagenより入手可能)を用いて精製した。この精製DNAフラグメントをXhoI及びXbaIで消化し、ゲル精製し、同様に消化したpGAPZα−Aへライゲーションさせた。このライゲーション反応物をE.coli株DH5αにトランスフォームして、プラスミドpCBo06が得られた。
クローニングの前及び後、in vitroの変異誘発の後に、DNAシークエンシングによってDer p 2のヌクレオチド配列を確かめた(以下を参照)。
【0053】
Der p 2 配列
配列番号1は、Der p 2(ALK−114)の核酸配列に対応する:
配列番号2は、Der p 2(ALK−114)の導き出されたアミノ酸配列に対応する:
pGAPZ α −A−Der p 2 の P. パストリスへの挿入
AvrII制限酵素を用いてベクターpCBo06を線形にし、コンピテントなP.パストリス株X−33へInvitrogenのマニュアルに記述されるようにトランスフォームした。100 μg/mlのゼオシンに対して抵抗性を持つ組換え細胞を選択し、ゼオシン100 μg/mlを含む新しいYPDプレート上でコロニー精製した。
組換え Der p 2 の発現及び精製
ゼオシン100 μg/mlを含むYPD培地250 ml(1%イーストエクストラクト、2%ペプトン、2%グルコース)に、Der p 2を発現する組換え酵母細胞の一夜培養液を植え付けた。この培養液を30℃で72時間、最適なDer p 2発現が得られるまで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、得られた培養上清を50%硫酸アンモニウムで飽和させた。3000x g、30分間の遠心分離に続いて、この上清を80%硫酸アンモニウムで飽和させた。遠心分離の後、ペレットを150 mM NH4HCO3に再懸濁し、同じ緩衝液で平衡化したSuperdex 75ゲル濾過カラム上で分画した。Der p 2を、その予測された分子量に対応する主要なピークとして溶離した。Der p 2の溶離は、SDS−PAGE電気泳動に続く銀染色、及び、SDS−PAGE電気泳動に続くDer p 2特異的ポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット分析の両方によってモニターした。
【0054】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
変異誘発のためのアミノ酸残基の選択は、イエダニ(Der p 2/f 2及びEur m 2)及び倉庫ダニ(Tyr p 2、Lep d 2、Gly d 2)由来のアレルゲンのうちで高く溶媒露出され高く保存された残基の同定に基づいた。高く溶媒露出されたアミノ酸残基は、Der p 2 NMR構造(#1.9、1A9V.pdb)の分子表面解析によって視覚的に同定した。12のアミノ酸残基を、変異誘発のために選択した:K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N及びR128Q。
部位特異的変異誘発
一つの第一変異及びそれら複数の組合せを有する組換え変異体アレルゲンの構築を、以下に記述する。
Der p 2変異体をコードする発現プラスミドを、鋳型DNAとしてpCBo06を用いて作製した。特定の変異を取り込んだセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、PCR反応を行った。特定の変異を生成させるためにPCR反応に用いたプライマー対を、図31に列挙する。この図では、変異をボールド体で表し、その後に続くクローニング工程に用いた制限酵素部位に下線を引いている。変異体K6A、K15E、H30N、H74N及びK82Nの構築のため、本質的には「Der p 2のpGAPZα−Aへのクローニング」の節で記述するようにPCR反応を行った。精製PCRフラグメントを表示の制限酵素部位(図31を参照)で消化し、ゲル精製し、同様に消化したpCBo06にライゲーションし、E.coli DH5αへトランスフォームした。
実施例1においてBet v 1変異体生成について記述した選択的PCR変異誘発方法論を用い、変異E62Sを生成させた。二つの変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、特定の変異を網羅するように合成した(OB47及びOB48、図31に記載した)。第二増幅工程に対して用いた二つの追加プライマーは、「Der p 2のpGAPZα−Aへの挿入」の節で記述するOB27及びOB28であった。
作製した変異体アレルゲンは実施例4で記述する方法、例えば円二色性(CD)分光法、結晶化、IgE結合特性の測定、ヒスタミン放出、T細胞増殖刺激能力等と同じ方法を用いて特徴付ける。
【0055】
実施例6
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換えダニアレルゲン( Der p 2 )
この実施例において、イエダニアレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Der p 2によって例証する。他のイエダニアレルゲンの操作は、同等の手順によって行うことができる。
変異組換え Der p 2 分子の設計
配列番号3は、野生型イソフォームであるDer p 2−ALK−Gクローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
配列番号3:Der p 2−ALK−Gのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
【0056】
図32は、ExPaSy分子生物学サーバー(http://www.expasy.ch/)において、配列番号3に示すDer p 2−ALK−Gアミノ酸配列を入力配列として用いたBLAST検索にClustalWアルゴリズムを用いて行った配列アラインメントを示す。このアラインメントは、イエダニ種すなわちDer p 2、Der f 2及びEur m 2由来の配列を含む。図32において、Der p 2−ALK−Gタンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基は、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は、白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
イエダニグループ2アレルゲンを表すアミノ酸配列は85%より高い類似性を有し、分子表面の幾らかを保存する(灰色に着色したゾーン)(図33を参照)。
図33は、Der p 2−ALK−Gタンパク質配列を公知のPDB:1A9V NMR構造(PDBファイルに含まれる10のうちの構造番号1)に重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。
全体表面にわたり25〜30Åの距離範囲内に空間的に分布する保存され高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節では、次の情報を与える:変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト(A)、設計された変異体のリスト(B)及び前記設計された変異体を表すDNA配列(C)。図34は一例として、変異体番号1の表面輪郭を示す。灰色は保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【0057】
A.変異のために選択されたアミノ酸のリスト
K15, S24, H30, R31, K48, E62, H74, K77, K82, K100, R128
B . 設計された変異体のリスト
変異体1:
K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N
変異体2:
K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R128Q
変異体3:
K15E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q
変異体4:
K15E, S24N, H30G, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
変異体5:
K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
変異体6:
S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
変異体7:
K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N
変異体8:
K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q
変異体9:
K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q
変異体10:
K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
変異体11:
K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
変異体12:
S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
【0058】
C . 変異体のヌクレオチド配列
変異体1:
K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N
【0059】
変異体2:
K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R128Q
【0060】
変異体3:
K15E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q
【0061】
変異体4:
K15E, S24N, H30G, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
【0062】
変異体5:
K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
【0063】
変異体6:
S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q
【0064】
変異体7:
K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N
【0065】
変異体8:
K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q
【0066】
変異体9:
K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q
【0067】
変異体10:
K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
【0068】
変異体11:
K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
【0069】
変異体12:
S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q
【0070】
実施例7
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換えダニアレルゲン( Der p 1 )
この実施例において、イエダニアレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Der p 1によって例証する。他のイエダニアレルゲンの操作は、同等な手順によって行うことができる。
変異組換え Der p 1 分子の設計
配列番号4は、野生型イソフォームであるDer p 1−ALKクローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
【0071】
配列番号4:Der p 1−ALKのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
【0072】
図35は、ExPaSy分子生物学サーバー(http://www.expasy.ch/)において、配列番号4に示すDer p 1−ALKアミノ酸配列を入力配列として用いたBLAST検索にClustalWアルゴリズムを用いて行った配列アラインメントを示す。このアラインメントは、イエダニ種すなわちDer p 1、Der f 1及びEur m 1由来の配列を含む。図35において、Der p 1−ALKタンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基を、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
イエダニグループ1アレルゲンを表すアミノ酸配列はある程度類似しており、分子表面の幾らかは保存されている(灰色に着色したゾーン)(図36を参照)。図36は、Der p 1−ALKタンパク質配列をDer p 1分子構造モデルに重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。
全体表面にわたり25〜30Åの距離範囲内に空間的に分布する保存され高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節で、次の情報を与える:変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト(A)、設計された変異体のリスト(B)及び前記設計された変異体を表すDNA配列(C)。図37は、一例として変異体番号11の表面輪郭を示す。灰色は、保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【0073】
A.変異のために選択されたアミノ酸のリスト
E13, P24, R20, Y50, S67, R78, R99, Q109, R128, R156, R161, P167, W192
B.設計された変異体のリスト
変異体1:
P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T
変異体2:
P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T
変異体3:
R20E, Y50V, R78Q, R99Q, R156E, R161E, P167T
変異体4:
R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R161Q, P167T
変異体5:
P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P167T
変異体6:
R20E, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161E, P167T
変異体7:
R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R156E, R161E, P167T
変異体8:
E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T
変異体9:
E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T
変異体10:
E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F
変異体11:
E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T, W192F
【0074】
C.変異体のヌクレオチド配列
変異体1:
P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T
【0075】
変異体2:
P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T
【0076】
変異体3:
R20E, Y50V, R78Q, R99Q, R156E, R161E, P167T
【0077】
変異体4:
R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R161Q, P167T
【0078】
変異体5:
P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P167T
【0079】
変異体6:
R20E, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161E, P167T
【0080】
変異体7:
R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R156E, R161E, P167T
【0081】
変異体8:
E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T
【0082】
変異体9:
E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T
【0083】
変異体10:
E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F
【0084】
変異体11:
E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T, W192F
【0085】
実施例8
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換え草本アレルゲン( Phl p 5 )
この実施例において、草本花粉アレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Phl p 5によって例証する。他の草本花粉アレルゲンの操作は、同等な手順によって行うことができる。
変異組換え Phl p 5 分子の設計
配列番号5は、野生型イソフォームであるPhl p 5.0103クローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
配列番号5:Phl p 5.0103のヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
【0086】
図38は、ExPaSy分子生物学サーバー(http://www.expasy.ch/)において、配列番号5に示すPhl p 5.0103のアミノ酸配列を入力配列として用いたBLAST検索にClustalWアルゴリズムを用いて行われた配列アラインメントを示す。このアラインメントは、草本種すなわちPhl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Hol l 5、Pha a 5、Hor v 9及びHor v 5由来のグループ5アレルゲン配列を含む。図38において、Phl p 5.0103タンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基を、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は、白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
草本花粉グループ5アレルゲンを表すアミノ酸配列はある程度類似しており、分子表面の幾らかは保存されている(灰色に着色したゾーン)(図39を参照)。図39は、Phl p 5.0103タンパク質配列をPhl p 5分子構造モデルに重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。この構造モデルはニ分割した形で分子を含み、モデルA(アミノ酸34〜142)を図39Aに示し、モデルB(アミノ酸149〜259)を図39Bに示す。
全体表面にわたり25〜30Åの距離範囲内に空間的に分布する高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節において、次の情報を与える:変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト(A)、設計された変異体のリスト(B)及び前記設計された変異体を表すDNA配列(C)。図40A及びBはそれぞれ、一例として変異体番号1のモデルA及びモデルBの表面輪郭を示す。灰色は、保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【0087】
A.変異のために選択されたアミノ酸のリスト
I45, R66, E133, R136, I137, D186, F188, K211, P214, Q222, P232, L243, Q254
B.設計された変異体のリスト
変異体1:
I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体2:
R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体3:
I45K, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体4:
I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体5:
I45K, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K
変異体6:
I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K
変異体7:
I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K
変異体8:
I45K, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K
変異体9:
R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体10:
R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K
変異体11:
I45K, E133S, D186H, P214G, L243E, Q254K
変異体12:
I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K
変異体13:
I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K
変異体14:
I45K, E133S, K211N, P232G, L243E, Q254K
【0088】
C.変異体のヌクレオチド配列
変異体1:
I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0089】
変異体2:
R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0090】
変異体3:
I45K, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0091】
変異体4:
I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0092】
変異体5:
I45K, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K
【0093】
変異体6:
I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K
【0094】
変異体7:
I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K
【0095】
変異体8:
I45K, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K
【0096】
変異体9:
R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0097】
変異体10:
R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K
【0098】
変異体11:
I45K, E133S, D186H, P214G, L243E, Q254K
【0099】
変異体12:
I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K
【0100】
変異体13:
I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K
【0101】
変異体14:
I45K, E133S, K211N, P232G, L243E, Q254K
【0102】
実施例9
組換え Bet v 1 及び変異体 Bet v 1 の T 細胞反応性
目的:
変異アレルゲンに対するin vitroのT細胞応答を、増殖及びサイトカイン産生に関して調査すること。
方法:
アレルギー患者由来のPBL(末梢血リンパ球)を以下の調査に用いた。
既刊のプロトコール(26)に記述されるように、T細胞に提示されるbet v 1イソフォームの多様性を維持する目的で、PBL及び天然な精製bet v 1から八つのbet v 1特異的T細胞株を樹立した。
十のPBL及び八つのT細胞株を、カバノキ抽出物(Bet v)、天然な精製bet v 1(nBet v 1)、組換えBet v 1(rBet v 1又はwt; 27)及びrBet v 1の四つの異なる変異型(他の箇所に記述する):2595、2628、2637、2744、2773で刺激した。2637変異体は部分的に折り畳まれないことが後に見出され、以後議論しないことにする。
簡単に言うと:丸底の96ウェルプレートに、PBLを1ウェルあたり2x105加えた。異なるカバノキサンプルを3つの異なる濃度で四つ組で加え、6日間増殖させた。6日目に、最も高濃度のカバノキを加えた各ウェルから、半分の体積(100 μl)の細胞をサイトカイン産生のために収集した。放射性標識したチミジンを前記ウェルに加えた。翌日(7日目)、この細胞をフィルター上に収集した。シンチレーション液をフィルターに加え、シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
同様に丸底の96ウェルプレートにT細胞を1ウェルあたり3x104加え、照射した自家PBL(1x105 細胞数/ウェル)及び、異なるカバノキサンプルの3つの異なる濃度で刺激した。1日後、最も高濃度のカバノキを加えた各ウェルから、サイトカイン産生のために細胞を収集した。放射性標識したチミジンを前記ウェルに加えた。2日後、細胞をフィルター上に収集し、PBLに対して記述したようにカウントした。
四つ組のプレートから上清をプールし、Becton Dickinsonから入手したCBA(サイトカインビーズアレイ)キットを用いてサイトカインを測定した。
【0103】
結果:
十のPBL培養物は、カバノキに対し特異的な刺激を示した。一般的に、異なるカバノキサンプルに対するPBLの増殖は類似していたが、多様性が見られた。3つのPBLにおいて、nBet v 1がrBet v 1及びこの変異体よりも増殖をより刺激した。前記変異体カバノキサンプルはrBet v 1とほぼ同じにPBLを刺激した(図41)。図41は、上述のBet v 1調製品に対する刺激指数を示す。刺激指数(SI)は、刺激されたサンプル(最も高濃度)の増殖(cpm:1分あたりのカウント)をコントロールである培地の増殖(cpm)で割って計算する。PPDは、ポジティブコントロールとして役立つミコバクテリウム結核菌由来の精製タンパク質を指し示す。
サイトカイン産生はIFN−γによって支配され、PBL増殖に比例して増加した。Th1/Th2シフトの徴候は現れなかった(図42〜44)。図42は、Th0プロフィールを有する患者を示し、図43はTh1プロフィール、図44はTh2プロフィールを有する患者を示す。サイトカイン産生はpg/mlで測定してバーとして表示し、IL−5/IFN−γ間の比は下方の点線である(右側のY軸)。増殖をcpmで測定し、右側のY軸においてcpmで測定した実線として示す。培地及びMBP(マルトース結合タンパク質)をバックグラウンドコントロールとして含む。
nBet v 1に対して八つのT細胞株が樹立され、一つを除き、その全てが全カバノキサンプルに対し等しく充分に増殖した。四つのT細胞株は、IL−5及びIFN−γ比に基づけば(Th2 > 5、5 > Th0 >0.2、0.2 > Th1)Th0様サイトカインを分泌していた。三つのT細胞株はTh1サイトカインを分泌しており、一つのT細胞株はTh2サイトカインを分泌していた。IL−5/IFN−γ比は、カバノキサンプルの違いによって影響されなかった。
結論:
nBet v 1に対して特異的興奮を示した全PBL培養物及び7/8のT細胞株は、rBet v 1及びその変異体に対しても応答した。これらのデータは、T細胞刺激に関してBet v 1の一つのイソフォーム又はその4つの変異体が、天然アレルゲン調製品に見出される個々のイソフォームの混合物を代用できることを示唆する。このように組換えアレルゲン又はその4つの変異体に基づくワクチンが、既存のBet v 1特異的T細胞集団に対処するであろう。
【0104】
実施例10
組換え体及び変異体 Bet v 1 タンパク質を用いた免疫に続く Bet v 1 特異的 IgG 抗体及び遮断抗体の誘導:
この節において「遮断抗体」という用語は、ヒトIgE抗体と異なり、抗原に結合可能であって抗原に対するヒトIgE抗体の結合を妨害することができる抗体を定義する。
組換えBet v 1 2227野生型タンパク質(rBet v 1)及びBet v 1 2595、2628、2744及び2773変異体タンパク質がBet v 1特異的IgG抗体及び遮断抗体を誘導する能力を、マウスでの免疫実験において試験した。
BALB/cAマウス(各群8匹ずつ)を、腹腔注射によって組換えBet v 1 2227野生型タンパク質又は四つの変異体タンパク質で免疫した。このマウスを、14日間の間隔で1用量を四回免疫した。前記異なるタンパク質を、1.25 mg/mlアルヒドロゲル(Alhydrogel)(水酸化アルミニウムゲル、1.3% pH 8.0〜8.4、Superfos Biosector)と複合化させた。前記マウスを、1 μgタンパク質/1用量又は10 μgタンパク質/1用量のいずれかで免疫した。血液サンプルは、0、14、35、21、49及び63日目に眼窩採血によって採取した。
特異的IgG抗体レベルを、rBet v 1でコートしたミクロタイタープレート及び検出抗体としてのビオチン化ウサギ抗マウスIgG抗体(Jackson)を用いた直接的ELISAによって分析した。組換えBet v 1 2227野生型タンパク質又はその四つの変異体タンパク質を用いた免疫は、強いrBet v 1特異的IgG応答を誘導した。この知見は、前記四つの変異タンパク質がBet v 1 2227野生型タンパク質に対して高く交差反応性である抗体を誘導することが可能であることを実証する。
【0105】
遮断抗体の誘導を評価するため、カバノキ花粉アレルギー患者由来の血清サンプルをモノクローナルマウス抗ヒトIgE抗体でコートした常磁性ビーズと共にインキュベートした。インキュベーション後、このビーズを洗滌し、緩衝液中、又は、免疫していないマウス(コントロール)若しくは上述のように免疫したマウス由来のマウス血清の希釈サンプル(1:100)中に再懸濁させた。それから、このビーズ及びマウス血清抗体の混合物にビオチン化rBet v 1を加えた。インキュベーション後、このビーズを洗滌し、アクリジニウム標識ストレプトアビジンを用いて結合したビオチン化rBet v 1を検出した。免疫していないマウス由来の血清とビーズのインキュベーションは、ビーズに対するrBet v 1の結合性を変化させなかった。反対に、組換えBet v 1 2227野生型タンパク質又はその四つの変異体タンパク質で免疫したマウス由来の血清とビーズのインキュベーションは、ビーズに対するBet v 1の結合性を著しく減少させ、血清サンプル中のBet v 1特異的遮断抗体の存在を実証する。このように、63日目には全高用量(10 μg/1用量)免疫群由来の一つ以上の血清サンプルが、ビーズに対するrBet v 1の結合性を80%より大きく減少させることができた。これらの知見は、前記四つの変異タンパク質がBet v 1特異的遮断抗体として作用可能な抗体を誘導することが可能であることを実証する。
【0106】
(参考文献)
【図面の簡単な説明】
【図1】
変異体番号1のBet v 1 に対して用いた変異体特異的オリゴヌクレオチドプライマーを示す。変異させたヌクレオチドは下線を引いてある。
【図2】
合成し、全ての変異体に対して用いた二つの一般的に適用可能なプライマー(「全センス」及び「全非センス」と表示)を示す。
【図3】
天然に存在するアレルゲンBet v 1のDNAおよびアミノ酸配列、及び、Bet v 1変異の番号を示す。
【図4】
非ビオチン化Bet v 1及びBet v 1 Glu45Ser変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
【図5】
非ビオチン化Bet v 1及びBet v 1変異体Asn28Thr+Lys32Glnによる、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
【図6】
非ビオチン化Bet v 1及びBet v 1 Pro108Gly変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
【図7】
非ビオチン化Bet v 1及びBet v 1 Glu60Ser変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
【図8】
ほぼ等しい濃度で記録された、組換え変異体及び三つのパッチ変異体のCDスペクトルを示す。
【図9】
非ビオチン化Bet v 1及びBet v 1三つのパッチ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1の結合の阻害を示す。
【図10】
個々に整列させた抗原5の残基の溶媒接触性及びベスプラ抗原5配列アラインメントを示す(左パネル)。図10の右パネルは、ベスプラ抗原5:sの中で保存された面積の抗原5の分子表面を示す。
【図11】
センス鎖に由来するVes v 5のアミノ末端に対応するプライマー配列を示す。
下流プライマー配列は非センス鎖に由来する。
【図12】
合成し、全変異体に対して用いた二つの一般的に適用可能なプライマー(「全センス」及び「全非センス」と表示)を表す。
【図13】
天然に存在するアレルゲンVes v 5及び二つのVes v 5変異体のDNA及びアミノ酸配列を示す。
【図14】
非ビオチン化Ves v 5及びVes v 5 Lys72Ala変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えVes v 5の結合の阻害を示す。
【図15】
IgE架橋結合によるアレルゲン及び肥満細胞間の反応の理論的モデルを示す。
【図16】
天然に存在するアレルゲンDer p 2のDNA及びアミノ酸配列を示す。
【図17】
変異体を作製するために用いたプライマーを模式的に示す。(I)はセンス及びアンチセンスプライマーを示す。(II)は、指示した位置に変異を含む最終的な組換えタンパク質を示す。
【図18】
Bet v 1変異体の構築の説明図、及び、用いたプライマーの一覧表を示す。変異体は5〜9のアミノ酸を含む。
【図19】
Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)の表面に導入された点変異を示す。Bet v 1(2628) 変異体では五つの第一変異がBet v 1の半分に導入され、残り半分は変わらないままであった。Bet v 1(2637)変異体では、五つの第一変異及び三つの第二変異が前記残り半分に導入され、前記半分は変わらないままであった。
【図20】
ほぼ同一の濃度で記録された、組換えBet v 1.2801(野生型)及びBet v 1(2637)変異体の円二色性(CD)スペクトルを示す。
【図21】
非ビオチン化Bet v 1.2801及びBet v 1(2628)、Bet v 1(2637)、及び、1:1混合比のBet v 1(2628)及びBet v 1(2637)による、アレルギー患者のプール由来の血清IgEに対するビオチン化組換えBet v 1.2801(野生型)の結合の阻害を示す。
【図22】
Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図23】
Bet v 1.2801(野生型)、Bet v 1(2628)及びBet v 1(2637)のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図24】
Bet v 1(2744)の表面での点変異を示す。
【図25】
Bet v 1(2753)の表面での点変異を示す。
【図26】
Bet v 1(2744)及びBet v 1(2753)の表面での点変異を示す。
【図27】
ほぼ等しい濃度で記録されたBet v 1(2744)(野生型)及びBet v 1(2744)の円二色性(CD)スペクトルを示す。
【図28】
Bet v 1.2801(野生型)及び変異体Bet v 1(2744)のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図29】
図29A〜Dは、Bet v 1.2801(野生型)及び変異体Bet v 1(2744)のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図30】
Bet v 1(2733)の表面での点変異を示す。
【図31】
Der p 2の部位特異的変異誘発のために用いたプライマーを示す。
【図32】
他のグループ2のイエダニアレルゲンと共にDer p 2の配列一覧表を示す。
【図33】
四つの異なる角度からのDer p 2の表面輪郭を示す。
【図34】
四つの異なる角度からのDer p 2変異体の表面輪郭を示す。
【図35】
図35A及びBは、他のグループ1のイエダニアレルゲンと共にDer p 1の配列一覧表を示す。
【図36】
四つの異なる角度からのDer p 1の表面輪郭を示す。
【図37】
四つの異なる角度からのDer p 1変異体の表面輪郭を示す。
【図38】
図38A〜Dは、他のグループ5の草本アレルゲンと共にPhl p 5の配列一覧表を示す。
【図39】
図39A及びBはそれぞれ、Phl p 5モデルA及びモデルBの四つの異なる角度からの表面輪郭を示す。
【図40】
図40A及びBはそれぞれ、Phl p 5変異体モデルA及びモデルBの四つの異なる角度からの表面輪郭を示す。
【図41】
種々のBet v 1調製品に対する刺激指標(SI)として表された末梢血リンパ球の増殖を示す。
【図42】
種々のBet v調製品で刺激されたTh0プロフィールを有する患者のT細胞のサイトカイン特性を示す。
【図43】
種々のBet v調製品で刺激されたTh1プロフィールを有する患者のT細胞のサイトカイン特性を示す。
【図44】
種々のBet v調製品で刺激されたTh2プロフィールを有する患者のT細胞のサイトカイン特性を示す。
Claims (65)
- 天然に存在するアレルゲンの変異体であって各々が前記天然に存在するアレルゲンのIgE結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的なIgE結合能力を減少する少なくとも四つの第一変異を有し、前記第一変異の各々が別の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、前記第一変異の各々が各他の第一変異から少なくとも15Åが隔てられ少なくとも一つの面積800Å2である円形表面領域が変異を含まないように配置されることを特徴とする組換えアレルゲン。
- 第一変異が互いに20Å、好ましくは25Å、最も好ましくは30Å隔てられている、請求項1記載の組換えアレルゲン。
- 幾つかの第二変異を含み、前記第二変異の各々が前記天然に存在するアレルゲンと比べて変異アレルゲンの特異的IgE結合能力を減少させ、前記第二変異の各々は他の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、前記第二変異が前記円形領域の外側に位置する、請求項1又は2に記載の組換えアレルゲン。
- 天然に存在するアレルゲンの置換される表面露出アミノ酸の少なくとも一つが約20%、好ましくは約30%、より好ましくは約40%、最も好ましくは約50%の溶媒接触性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 天然に存在するアレルゲンの置換される表面露出アミノ酸の少なくとも一つが、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において70%より高く、好ましくは80%より高く、最も好ましくは90%より高い同一性で保存されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 変異体アレルゲンへ組み込まれる各アミノ酸残基が前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、好ましくは亜科、さらに好ましくは科、より好ましくは上科、より好ましくは亜綱、より好ましくは亜目、最も好ましくは目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在しない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 変異アレルゲンに対する特異的IgE結合性が少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%減少されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 変異体及び天然に存在するアレルゲン分子のα炭素骨格三次構造を比較した場合、原子座標の平均標準偏差が2Åより小さいことを特徴とする、請求項6記載の組換えアレルゲン。
- 前記円形表面領域が15〜25アミノ酸残基の原子を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか記載の組換えアレルゲン。
- 表面露出アミノ酸残基が溶媒接触性に関して順位付けられること、及び、より溶媒接触可能であるアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 表面露出アミノ酸残基が、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して順位付けられること、及び、より保存されるアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 変異体アレルゲンが天然に存在しないアレルゲンである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 5〜20、好ましくは6〜15、さらに好ましくは7〜12、最も好ましくは8〜10の第一変異を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 変異体アレルゲンが第一変異あたり1〜4つの第二変異を含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 一つ以上の置換が部位特異的変異誘発によって行われることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 一つ以上の置換がDNAシャッフリングによって行われることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 吸入アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項18記載の組換えアレルゲン。
- 分類学上ファガレス目、オレアレス目又はピナレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項19記載の組換えアレルゲン。
- Bet v 1の変異体であることを特徴とする、請求項20記載の組換えアレルゲン。
- 一つ以上の置換がV2, D72, E87, K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87及びE−73からなる群より選択される、請求項21記載の組換えアレルゲン。
- 分類学上ポアレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項19記載の組換えアレルゲン。
- 分類学上アステラレス目又はウルチカレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項19記載の組換えアレルゲン。
- イエダニアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項18記載の組換えアレルゲン。
- デルマトファゴイデス由来のダニアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項25記載の組換えアレルゲン。
- ゴキブリアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項18記載の組換えアレルゲン。
- 動物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項18記載の組換えアレルゲン。
- ネコ、イヌ又はウマ由来の動物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項28記載の組換えアレルゲン。
- 毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 分類学上ヒメノプテラ目由来の毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項30記載の組換えアレルゲン。
- 分類学上ベスピダエ目、アピダエ目又はフォルミコイダエ目由来の毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項31記載の組換えアレルゲン。
- Ves v 5の変異体であることを特徴とする、請求項30〜32のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- 一つ以上の置換がK−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149, K−128, E−184, K−112, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, −−V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85及びI−182からなる群より選択されることを特徴とする、請求項33記載の組換えアレルゲン。
- 医薬品として使用するための、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン。
- アレルギーを予防及び/又は治療するための医薬品を調製するための、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲンの使用。
- 各変異体が他の変異体の少なくとも一つに存在しない第一変異の少なくとも一つを有し、前記各変異体について第二変異が前記第一変異の各々から半径15Åの範囲内に存在しない、請求項1〜34のいずれか1項に記載の2つ以上の組換え変異体アレルゲンを含む組成物。
- 2〜12、好ましくは3〜10、さらに好ましくは4〜8、最も好ましくは5〜7の変異体を含む請求項37記載の組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項37又は38記載の組成物。
- アレルギーを予防及び/又は治療するための医薬品を調製するための、請求項37又は38に記載の組成物の使用。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項37若しくは38に記載の組成物を含み、これに組合せて任意で医薬として許容される担体及び/又は賦形剤、及びアジュバントを含んでもよいことを特徴とする医薬組成物。
- アレルギーを患う患者の天然に存在するアレルゲンによって誘発されるアレルギー反応に対するワクチンの形態であることを特徴とする、請求項41記載の医薬組成物。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、請求項37若しくは38記載の組成物、又は、請求項41若しくは42記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者に免疫応答を発生させる方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、請求項37若しくは38記載の組成物、又は、請求項41若しくは41記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のワクチン接種又は治療。
- 医薬として許容される物質及び/又は賦形剤と共に、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項37若しくは38記載の組成物を混合することを含む、請求項41若しくは42記載の医薬組成物を調製する製法。
- 請求項45記載の製法によって得られる医薬組成物。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、請求項37若しくは38記載の組成物、又は、請求項41−42若しくは46のいずれか1項に記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のアレルギー反応の治療、予防又は軽減のための方法。
- a)天然に存在するアレルゲンにおいて少なくとも20%の溶媒接触性を有するアミノ酸残基の番号を同定すること;
b)前記同定されたアミノ酸残基から少なくとも四つのアミノ酸残基を選択することであって、各選択されたアミノ酸が各他の選択されたアミノ酸から少なくとも15Å隔てられており、少なくとも一つの面積800Å2の円形表面領域が前記選択されたアミノ酸を含まないように配置されるように前記選択を行うこと;及び
c)前記各選択されたアミノ酸に対して、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的IgE結合能力を減少させる第一変異を起こすことであって、前記第一変異の各々は別のアミノ酸による前記選択されたアミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在しないことを特徴とする、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲンを調製する方法。 - 前記同定されたアミノ酸残基を溶媒接触性に関して順位付けること、及び、より溶媒接触可能なアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することを特徴とする、請求項48記載の方法。
- 前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において、70%より高い同一性を保存する同定されたアミノ酸残基を選択することを特徴とする、請求項48又は49記載の方法。
- 前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して前記同定されたアミノ酸残基を順位付けすること、及び、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することを特徴とする、請求項50記載の方法。
- 前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する変異体アレルゲンを形成するために、前記同定されたアミノ酸を選択することを含む、請求項48〜51のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ酸残基の置換が部位特異的変異誘発によって行われることを特徴とする、請求項48〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 対応する天然に存在するアレルゲンをコードするDNAのDNAシャッフリング(分子育種)によって得られるDNA配列からアレルゲンが作製されることを特徴とする、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲンを調製する方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲンをコードするDNA配列、その誘導体、その部分配列、その縮重配列又はストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダイズする配列であって、少なくとも一つのB細胞エピトープを有するペプチドをコードする前記誘導体、前記部分配列、前記縮重配列又は前記ハイブリダイズする配列。
- 天然に存在するアレルゲンをコードするDNA配列の誘導体である、請求項55記載のDNA配列。
- 天然に存在するアレルゲンをコードするDNAの部位特異的変異誘発によって誘導体が得られる、請求項56記載のDNA配列。
- 図3に示す配列の誘導体であって、V2, D72, E87, K−129, E−60, N−47, K−65, P−108, N−159, D−93, K−123, K−32, D−125, R−145, D−109, E−127, Q−36, E−131, L−152, E−6, E−96, D−156, P−63, H−76, E−8, K−134, E−45, T−10, V−12, K−20, S−155, H−126, P−50, N−78, K−119, V−2, L−24, E−42, N−4, A−153, I−44, E−138, G−61, A−130, R−70, N−28, P−35, S−149, K−103, Y−150, H−154, N−43, A−106, K−115, P−14, Y−5, K−137, E−141, E−87及びE−73からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するDNA配列である、請求項55〜57のいずれか1項に記載のDNA配列。
- 図13に示す配列の誘導体であって、K−16, K−185, K−11, K−44, K−210, R−63, K−13, F−6, K−149, K−128, E−184, K−112, F−157, E−3, K−29, N−203, N−34, K−78, K−151, L−15, L−158, Y−102, W−186, K−134, D−87, K−52, T−67, T−125, K−150, Y−40, Q−48, L−65, K−81, Q−101, Q−208, K−144, N−8, N−70, H−104, Q−45, K−137, K−159, E−205, N−82, A−111, D−131, K−24, V−36, N−7, M−138, T−209, V−84, K−172, V−19, D−56, P−73, G−33, T−106, N−170, L−28, T−43, Q−114, C−10, K−60, N−31, K−47, E−5, D−145, V−38, A−127, D−156, E−204, P−71, G−26, Y−129, D−141, F−201, R−68, N−200, D−49, S−153, K−35, S−39, Y−25, V−37, G−18, W−85及びI−182からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するDNA配列である、請求項55〜57のいずれか1項に記載のDNA配列。
- 図16に示す配列の誘導体であって、R−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109及びR−128, D−129, H−11, H−30, S−1, K−77, Y−75, R−31, K−82, K−6, K−96, K−48, K−55, K−89, Q−85, W−92, I−97, H−22, V−65, S−24, H−74, K−126, L−61, P−26, N−93, D−64, I−28, K−14, K−100, E−62, I−127, E−102, E−25, P−66, L−17, G−60, P−95, E−53, V−81, K−51, N−103, Q−2, N−46, E−42, T−91, D−87, N−10, M−111, C−8, H−124, I−68, P−79, K−109及びK−15からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するDNA配列である、請求項55〜57のいずれか1項に記載のDNA配列。
- 請求項55〜60のいずれか1項に記載のDNAを含む、発現ベクター。
- 請求項61記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項62記載の宿主細胞を培養する工程を含む、組換え変異体アレルゲンを作製する方法。
- 天然に存在するアレルゲンに対して特異的なT細胞クローン又はT細胞株を刺激する能力を有するT細胞エピトープを少なくとも一つ含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項55〜60のいずれか1項に記載のDNA配列によってコードされる組換えアレルゲン。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換え変異体アレルゲン、又は、請求項37若しくは38記載の組成物を用い、対象者のIgEを含むサンプルと前記変異体又は前記組成物を混合して前記サンプル中のIgEと前記変異体間の反応性レベルを評価する、対象者の治療の妥当性、安全性又は成果を評価するための診断的アッセイ。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24936100P | 2000-11-16 | 2000-11-16 | |
DKPA200001718 | 2000-11-16 | ||
US29817001P | 2001-06-14 | 2001-06-14 | |
PCT/DK2001/000764 WO2002040676A2 (en) | 2000-11-16 | 2001-11-16 | Mutant allergens |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004521618A true JP2004521618A (ja) | 2004-07-22 |
JP2004521618A5 JP2004521618A5 (ja) | 2006-02-09 |
Family
ID=27222455
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002543671A Pending JP2004521618A (ja) | 2000-11-16 | 2001-11-16 | 新規変異体アレルゲン |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1373510B1 (ja) |
JP (1) | JP2004521618A (ja) |
KR (1) | KR100919914B1 (ja) |
CN (1) | CN100577804C (ja) |
AT (1) | ATE414773T1 (ja) |
AU (2) | AU2002223505B2 (ja) |
CA (1) | CA2429172C (ja) |
CZ (1) | CZ20031653A3 (ja) |
DE (1) | DE60136653D1 (ja) |
DK (1) | DK1373510T3 (ja) |
ES (1) | ES2317955T3 (ja) |
HK (1) | HK1060371A1 (ja) |
HU (1) | HUP0302601A3 (ja) |
MX (1) | MXPA03004174A (ja) |
NO (1) | NO329721B1 (ja) |
NZ (1) | NZ525820A (ja) |
PL (1) | PL214225B1 (ja) |
WO (1) | WO2002040676A2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011239781A (ja) * | 2010-05-18 | 2011-12-01 | Stallergenes Sa | 免疫療法と診断を目的としてピキア・パストリスにおいて“天然様”アレルゲンとして発現する組み換えDerp2 |
JP2013516962A (ja) * | 2010-01-14 | 2013-05-16 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | プロリン残基の突然変異誘発により低減したアレルゲン性を有するイネ科のグループ5アレルゲンの変異体 |
JP2014515752A (ja) * | 2011-04-18 | 2014-07-03 | テクノロジアン・トゥトキムスケスクス・ブイティティー | 低刺激性アレルゲン |
JP2018058856A (ja) * | 2013-06-06 | 2018-04-12 | アネルギ エスアー | イエダニアレルギーの処置のための連続したオーバーラップペプチド |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020051794A1 (en) | 2000-08-09 | 2002-05-02 | Alk-Abello A/S | Novel parenteral vaccine formulations and uses thereof |
CN1668737A (zh) * | 2002-05-16 | 2005-09-14 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 重组Bet.V.1过敏原突变体及其方法和制备 |
FR2841906B1 (fr) * | 2002-07-05 | 2006-08-18 | Stallergenes Sa | Molecule d'acide nucleique codant une preproproteine d'allergene d'un acarien du genre dermatophagoides ou euroglyphus et son utilisation pour la production dudit allergene dans les plantes |
AU2003275941A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-25 | Alk-Abello A/S | Recombinant protein variants |
AU2003280324A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-06-18 | Alk-Abello A/S | Pharmaceutical allergen product |
AU2004216559B2 (en) | 2003-02-28 | 2010-05-27 | Alk-Abello A/S | Dosage form having a saccharide matrix |
US8012505B2 (en) | 2003-02-28 | 2011-09-06 | Alk-Abello A/S | Dosage form having a saccharide matrix |
AU2004245184B2 (en) * | 2003-06-04 | 2011-03-24 | Merck Patent Gmbh | Phl p 5a derivatives with reduced allergenicity and retained T-cell reactivity |
RU2006126051A (ru) | 2003-12-19 | 2008-01-27 | Альк-Абелло А/С (Dk) | Способы получения партии активного фармацевтического ингредиента, контейнер, содержащий криогранулы аллергенного продукта, и криогранула аллергенного продукта |
ES2363342T3 (es) * | 2003-12-19 | 2011-08-01 | Alk-Abelló A/S | Procedimiento para criogranulación y almacenamiento de alérgenos. |
EP1756150A2 (en) * | 2004-04-23 | 2007-02-28 | Novozymes A/S | Group 1 mite polypeptide variants |
US20060115499A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-06-01 | Alk-Abello A/S | Liquid allergy vaccine formulation for oromucosal administration |
EP1812463A2 (en) * | 2004-10-22 | 2007-08-01 | Novozymes A/S | Group 2 mite polypeptide variants |
PT1868642E (pt) | 2005-03-18 | 2013-07-10 | Cytos Biotechnology Ag | Proteínas de fusão de alergénios de gato e suas utilizações |
JP2009510136A (ja) | 2005-10-04 | 2009-03-12 | アルク−アベッロ エイ/エス | 固体ワクチン製剤 |
BRPI0618241A2 (pt) * | 2005-11-04 | 2011-08-23 | Alk Abello As | uso de um alérgeno para fabricação de uma formulação de vacina lìquida para prevenção ou tratamento de alergia |
AU2006310881B2 (en) * | 2005-11-04 | 2012-07-19 | Alk-Abello A/S | Use of a liquid allergy vaccine formulation for oromucosal administration |
ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
AT503297B1 (de) * | 2006-05-18 | 2007-09-15 | Biomay Ag | Allergen-spezifische antikörper |
AT503690A1 (de) * | 2006-06-09 | 2007-12-15 | Biomay Ag | Hypoallergene moleküle |
EP1908777B1 (en) * | 2006-10-06 | 2016-02-03 | Stallergenes | Mite fusion proteins |
CA2682054A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Alk-Abello A/S | Use of an adjuvanted allergy vaccine formulation for parenteral administration |
CA2696563A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Circassia Limited | Peptides for vaccine |
DE202008006598U1 (de) | 2008-04-11 | 2008-10-02 | Alk-Abelló A/S | Allergie-Impfstoff-Formulierung zur mucosalen Verabreichung |
EP2442828B1 (en) | 2009-06-19 | 2016-08-03 | Alk-Abelló S.A. | Novel manner of administrating allergen in allergen specific immunotherapy |
FI20115375A0 (fi) | 2011-04-18 | 2011-04-18 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy | Uudet hypoallergeenit |
ITMI20112301A1 (it) * | 2011-12-19 | 2013-06-20 | Lofarma Spa | Varianti ipoallergeniche dell'allergene maggiore phl p 5 di phleum pratense |
EP2692732A1 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-05 | Stallergenes S.A. | Novel allergen from ragweed pollen and uses thereof |
CN110075285A (zh) | 2012-10-30 | 2019-08-02 | 阿拉沃克斯有限公司 | 新颖的免疫治疗分子和其用途 |
WO2015044789A2 (en) | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Fibar Group sp. z o.o. | Intelligent smoke sensor |
KR20160075532A (ko) | 2013-09-25 | 2016-06-29 | 아라백스 피티와이 엘티디 | 신규한 면역치료제 조성물 및 이의 용도 |
EP2952200A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-09 | Alk-Abelló A/S | Allergen for prophylactic treatment of allergy |
US9898175B2 (en) | 2014-08-05 | 2018-02-20 | Fibar Group S.A. | Home network manager for home automation |
EP3269730A1 (en) * | 2016-07-12 | 2018-01-17 | Universität Salzburg | Allergen variant |
JP6978516B2 (ja) * | 2017-05-19 | 2021-12-08 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 胸腺細胞上清を産生するための方法 |
CN110093336B (zh) * | 2018-01-29 | 2023-03-24 | 上海雅心生物技术有限公司 | 一种稳定的胰蛋白酶及其制备方法 |
RU2761431C9 (ru) | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
WO2023242436A1 (en) * | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Danmarks Tekniske Universitet | Allergy vaccines based on consensus allergens |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU1874997A (en) * | 1996-02-15 | 1997-09-02 | Pangenetics B.V. | Molecules for the induction of immunological tolerance |
DE19713001A1 (de) * | 1997-03-27 | 1998-10-01 | Merck Patent Gmbh | Graminaenpollenallergenmutanten zur spezifischen Immuntherapie, deren Herstellung und Verwendung |
DE69940805D1 (de) * | 1998-01-31 | 2009-06-10 | Sinai School Medicine | Verfahren und reagenzien zur verminderung der klinischen reaktion zur allergie |
NZ506665A (en) * | 1998-03-16 | 2003-08-29 | Alk Abello As | Mutant recombinant allergens |
-
2001
- 2001-11-16 CZ CZ20031653A patent/CZ20031653A3/cs unknown
- 2001-11-16 DK DK01996610T patent/DK1373510T3/da active
- 2001-11-16 EP EP01996610A patent/EP1373510B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 ES ES01996610T patent/ES2317955T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 AT AT01996610T patent/ATE414773T1/de active
- 2001-11-16 DE DE60136653T patent/DE60136653D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 CA CA2429172A patent/CA2429172C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-16 MX MXPA03004174A patent/MXPA03004174A/es active IP Right Grant
- 2001-11-16 PL PL362273A patent/PL214225B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 JP JP2002543671A patent/JP2004521618A/ja active Pending
- 2001-11-16 KR KR1020037006644A patent/KR100919914B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 HU HU0302601A patent/HUP0302601A3/hu unknown
- 2001-11-16 AU AU2002223505A patent/AU2002223505B2/en not_active Ceased
- 2001-11-16 AU AU2350502A patent/AU2350502A/xx active Pending
- 2001-11-16 NZ NZ525820A patent/NZ525820A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 WO PCT/DK2001/000764 patent/WO2002040676A2/en active IP Right Grant
- 2001-11-16 CN CN01820783A patent/CN100577804C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-15 NO NO20032213A patent/NO329721B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-05-14 HK HK04103424.6A patent/HK1060371A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013516962A (ja) * | 2010-01-14 | 2013-05-16 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | プロリン残基の突然変異誘発により低減したアレルゲン性を有するイネ科のグループ5アレルゲンの変異体 |
JP2011239781A (ja) * | 2010-05-18 | 2011-12-01 | Stallergenes Sa | 免疫療法と診断を目的としてピキア・パストリスにおいて“天然様”アレルゲンとして発現する組み換えDerp2 |
JP2014515752A (ja) * | 2011-04-18 | 2014-07-03 | テクノロジアン・トゥトキムスケスクス・ブイティティー | 低刺激性アレルゲン |
US9856296B2 (en) | 2011-04-18 | 2018-01-02 | Desentum Oy | Hypoallergen |
JP2018058856A (ja) * | 2013-06-06 | 2018-04-12 | アネルギ エスアー | イエダニアレルギーの処置のための連続したオーバーラップペプチド |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1373510A2 (en) | 2004-01-02 |
DK1373510T3 (da) | 2009-02-23 |
NO20032213D0 (no) | 2003-05-15 |
ATE414773T1 (de) | 2008-12-15 |
HK1060371A1 (en) | 2004-08-06 |
HUP0302601A3 (en) | 2010-01-28 |
PL214225B1 (pl) | 2013-07-31 |
AU2350502A (en) | 2002-05-27 |
PL362273A1 (en) | 2004-10-18 |
EP1373510B1 (en) | 2008-11-19 |
ES2317955T3 (es) | 2009-05-01 |
WO2002040676A2 (en) | 2002-05-23 |
HUP0302601A2 (hu) | 2003-11-28 |
CA2429172C (en) | 2012-03-20 |
WO2002040676A3 (en) | 2003-10-09 |
AU2002223505B2 (en) | 2006-12-07 |
KR100919914B1 (ko) | 2009-10-06 |
DE60136653D1 (de) | 2009-01-02 |
CA2429172A1 (en) | 2002-05-23 |
NO329721B1 (no) | 2010-12-06 |
CN1484699A (zh) | 2004-03-24 |
NO20032213L (no) | 2003-07-02 |
KR20030076577A (ko) | 2003-09-26 |
MXPA03004174A (es) | 2004-12-02 |
CZ20031653A3 (en) | 2004-03-17 |
NZ525820A (en) | 2005-01-28 |
CN100577804C (zh) | 2010-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2004521618A (ja) | 新規変異体アレルゲン | |
AU2002223505A1 (en) | Mutant allergens | |
EP1062341B1 (en) | Mutant recombinant allergens | |
JP2004521618A5 (ja) | ||
JP6068544B2 (ja) | アレルギーの治療に用いるための、主要グループ1ダニアレルゲンおよび主要グループ2ダニアレルゲンの低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質 | |
CA2486112A1 (en) | Allergen mutants | |
US20110052639A1 (en) | Allergen mutants | |
US7384635B2 (en) | Protein variants of naturally occurring allergens | |
RU2285042C2 (ru) | Новые мутантные аллергены | |
US20030175312A1 (en) | Novel mutant allergens | |
JP2003526320A (ja) | 複数の腫瘍において過剰発現される抗原casb414 | |
ZA200303667B (en) | Novel mutant allergens. | |
US9446121B2 (en) | Cloning of honey bee allergen | |
Bonura et al. | Genetic engineering of allergens for immunotherapy | |
TWI276636B (en) | Modified mite allergen and pharmaceutical uses thereof | |
Thomas | Recombinant allergens for immunotherapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20041116 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070903 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20071203 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080811 |