PT1868642E

PT1868642E - Proteínas de fusão de alergénios de gato e suas utilizações

Info

Publication number: PT1868642E
Application number: PT67251405T
Authority: PT
Inventors: Martin Bachmann; Monika Bauer; Klaus Dietmeier; Nicole Schmitz; Stephan Utzinger
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2013-07-10
Also published as: WO2006097530A2; CN103203016A; RU2007138265A; CN101141979A; PL1868642T3; IL185103A0; RU2414239C2; US20090175896A1; JP2013155176A; JP2008535800A; US20110045013A1; CY1114171T1; US20130344098A1; WO2006097530A3; CA2599218A1; AU2006224529B2; EP1868642A2; US7767212B2; BRPI0608455A2; EP1868642B1

Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO DE ALERGÉNIOS DE GATO E SUAS UTILIZAÇÕES"

Campo da Invenção A presente invenção situa-se nos campos da medicina, saúde pública, imunologia, biologia molecular e virologia. A invenção proporciona composições compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula de vírus e, pelo menos, um antigénio, particularmente, pelo menos, um antigénio felino e, mais particularmente, pelo menos, um antigénio felino que é um alergénio humano. Em determinadas formas de realização, o antigénio é um antigénio Fel dl ou um seu fragmento, ligado covalentemente à VLP. A invenção também proporciona métodos para produzir as composições. As composições da invenção induzem respostas imunológicas eficientes, em particular respostas de anticorpos, em mamíferos, particularmente humanos. As composições e métodos da invenção são úteis na produção de vacinas, em particular para o tratamento e/ou prevenção de alergias a pêlo de gato e outro antigénios e alergénios de gato. Técnica Relacionada 0 gato doméstico (Felis domesticus) é uma fonte importante de alergénios dentro de casa (Lau, S., et al. (2000) Lancet 356, 1392-1397). De facto, os gatos estão presentes em cerca de 25% dos lares nos países Ocidentais e a alergia a gatos afecta uma grande parte da população. A gravidade dos sintomas vai desde 1 rinite e conjuntivite relativamente ligeiras até irritaçao asmática potencialmente fatal.

Apesar dos doentes estarem ocasionalmente sensibilizados para várias moléculas diferentes do pêlo e das peles de gato, o alergénio principal é Fel dl (i. e., alergénio 1 de Felis domesticus; anteriormente Gato 1, i. e., Alergénio de gato 1). A importância deste alergénio tem sido acentuada em numerosos estudos. De facto, mais de 80% dos doentes alérgicos a gatos exibem anticorpos de IgE para este alergénio potente (van Ree, R., et al. (1999) J. Allergy Clin Immunol 104, 1223-1230). O Fel dl é uma glicoproteína ácida de 35-39 kDa contendo 10-20% de hidratos de carbono ligados a N e encontra-se presente na pele, saliva e glândulas lacrimais de gatos. É constituída por dois heterodímeros ligados não covalentemente. Cada heterodímero consiste de um péptido de 70 resíduos (conhecido como "cadeia 1") e um péptido de 78, 85, 90 ou 92 resíduos (conhecido como "cadeia 2") os quais são codificados por genes separados (ver Duffort, O. A., et al. (1991) Mol Immunol 28, 301-309; Morgenstern, J. P., et al.; (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88, 9690-9694 e Griffith, I. J., et al. (1992) Gene 113, 263-268) .

Foi demonstrado por Kaiser et al. 2003 (J Biol Chem 278(39):37730-5) que o Fel dl recombinante, consistindo da cadeia 2 e da cadeia 1 fundidas em conjunto sem unidade de ligação adicional, tem propriedades imunológicas indistinguíveis da proteína heterodimérica natural.

Grõnlund et al. 2003 (J Biol Chem 2 78 (41):40144-51) produziram um Fel dl enrolado recombinante com propriedades 2 moleculares e biológicas semelhantes ao homólogo natural. Um gene sintético que codifica a fusão directa N-terminal da cadeia 2 de Fel dl com a cadeia 1 foi construído por oligonucleótidos sobrepostos em PCR. (1992) Gene 113,263-268). 0 tratamento de doentes alérgicos a gatos é actualmente efectuado por terapia de dessensibilização envolvendo injecções repetidas com dosagens crescentes de um extracto de pêlo de gato em bruto ou péptidos curtos derivados de Fel dl. Lilja et al. e Hedlin et al. divulgaram um programa de dessensibilização no decurso do qual extractos em bruto de pêlo de gato foram administrados a doentes alérgicos a gatos (Lilja, Q, et al. (1989) J Allergy Clin Immunol 83, 37-44 e Hedlin, et al. (1991) J Allergy Clin Immunol 87, 955-964). Este programa durou, pelo menos, dois a três anos e os doentes após três anos de tratamento ainda tinham sintomas sistémicos. A utilização de péptidos curtos derivados de Fel dl para dessensibilização resultou em diferenças não significativas entre o grupo de péptido e o grupo de placebo (Oldfield, W. L., et al. (2002)

Lancet 360, 47-53). Foi observada eficácia apenas quando foi administrada uma grande quantidade (750 pg) do péptido curto aos doentes (Norman, P. S., et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 154, 1623-1628) .

Foram descritos efeitos secundários alérgicos, tais como as reacções asmáticas tardias, no tratamento com o extracto em bruto de pêlo de gato e no tratamento com o péptido curto. Por conseguinte, o choque anafiláctico devido ao alergénio injectado é uma preocupação de segurança importante em qualquer programa de dessensibilização. No entanto, evitar um tal efeito reduzindo a quantidade de alergénio injectada, reduz a eficácia do tratamento ou prolonga o tratamento. Assim, no campo de 3 tratamento de alergias a gatos, existe uma grande necessidade de regimes de dessensibilização alternativos e, aqui em particular, de regimes de dessensibilização que sejam capazes de reduzir os sintomas alérgicos, mas sem desencadear reacções secundárias alérgicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A requerente verificou agora surpreendentemente que as composições e vacinas da invenção, respectivamente, compreendendo, pelo menos, um antigénio Fel dl da invenção, são não só capazes de induzir respostas imunológicas contra o Fel dl e, pela presente, em particular respostas de anticorpos, mas são, além disso, capazes de dessensibilizar um doente que sofre de alergia a gatos e, pela presente, em particular, num intervalo de tempo curto, indicando a alta eficácia das composições e vacinas da invenção, respectivamente. Além disso, a requerente verificou surpreendentemente que o Fel dl da invenção, quando ligado covalentemente à VLP de acordo com a invenção, tem actividade anafiláctica dramaticamente reduzida em comparação com o Fel dl da invenção não ligado covalentemente à VLP e que mantém, ao mesmo tempo, um grau elevado de antigenicidade e imunogenicidade. Isto é uma grande vantagem em relação aos tratamentos de alergia a gatos da técnica anterior porque as composições e vacinas da invenção, respectivamente, reduzem dramaticamente o risco de provocar choque anafiláctico nos animais e humanos a serem imunizados. Além disso, as composições e vacinas da invenção, respectivamente, permitem que o antigénio seja administrado numa dose muito mais alta em comparação com os tratamentos de alergia a gatos da técnica anterior, o que pode, por sua vez, melhorar a eficácia e/ou 4 encurtar todo o programa de dessensibilização. Assim, as composições e vacinas da invenção, respectivamente, induzem respostas imunológicas anti-Fel dl potentes mas não desencadeiam uma reacção alérgica.

Assim, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo: (a) uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação, em gue a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP), (b) , pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o referido, pelo menos, um antigénio é uma proteína de Fel dl, em que a referida proteína de Fel dl é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl, em gue a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da referida cadeia 1 de Fel dl directamente através de uma ligação peptídica ou através de um espaçador, e em que (a) e (b) estão ligados covalentemente através do referido, pelo menos um, primeiro e do referido, pelo menos um, segundo sítios de ligação.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de vacina. Além disso, é divulgado um método para administrar a composição de vacina a um mamífero humano ou não humano, tal como cão, o qual é alérgico a gatos, de um modo preferido, ao Fel dl de gato. Numa forma de realização preferida, a composição de vacina compreende ainda, pelo menos, um adjuvante. No entanto, a composição de vacina da invenção é 5 capaz de induzir uma resposta imunológica forte, em particular resposta de anticorpos, sem a presença do, pelo menos, um adjuvante. Assim, numa forma de realização preferida, a vacina é desprovida de um adjuvante. 0 evitar a utilização de adjuvante pode reduzir uma possível ocorrência de efeitos secundários relacionados com a utilização de adjuvantes.

Numa forma de realização preferida, a VLP compreendida pela composição e pela composição de vacina, respectivamente, é produzida de forma recombinante num hospedeiro e a VLP está essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, isenta de ácidos nucleicos do hospedeiro. É vantajoso reduzir ou, de um modo preferido, eliminar, a quantidade de hospedeiro, de um modo preferido, isento de ácidos nucleicos do hospedeiro, para evitar respostas indesejadas das células T bem como outros efeitos secundários indesejados, tal como febre. É ainda divulgada uma composição compreendendo, pelo menos, uma substância imunoestimulante, de um modo preferido, pelo menos, um ácido nucleico imunoestimulante. 0 ácido nucleico imunoestimulante pode ser empacotado dentro da VLP da invenção. A inclusão de substâncias imunoestimulantes, de um modo preferido, ácidos nucleicos imunoestimulantes, na composição da invenção pode conduzir as respostas imunológicas para respostas Thl e, desse modo, suprimir as respostas Th2 e, por este motivo, suprimir a produção de IgE. É ainda aqui divulgado um método de tratamento de alergia a gato administrando a composição ou vacina da invenção, respectivamente, a uma entidade alérgica a gatos, de um modo preferido, humano. 6

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo a composição da invenção e um veículo farmacêutico aceitável.

Mais uma vez, num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção da composição de qualquer uma das reivindicações 1-9 compreendendo: (a) proporcionar uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP); (b) proporcionar, pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o referido antigénio é uma proteína de Fel dl, em que a referida proteína de Fel dl é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl, em que a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da referida cadeia 1 de Fel dl directamente através de uma ligação peptídica ou através de um espaçador; e (c) ligar a referida partícula central e o referido, pelo menos, um antigénio para produzir a referida composição, em que o referido, pelo menos, um antigénio e a referida partícula central estão ligados através do referido, pelo menos um, primeiro e do referido, pelo menos um, segundo sítios de ligação. É ainda aqui divulgada uma proteína de fusão de Fel dl compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl fundidas através de um espaçador de aminoácidos, o qual liga a 7 extremidade N-terminal de uma cadeia com a extremidade C-terminal da outra cadeia, em que o referido espaçador de aminoácidos consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 10-30 residuos de aminoácido, e em que a referida proteína de fusão é produzida em E. coli ou em que a referida proteína de fusão não está glicosilada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG 1 mostra as proteínas de fusão de Fel dl purificadas e renaturadas, reveladas com Coomassie em gel não redutor de SDS-PAGE. As amostras na pista 1 tinham DTT como agente de redução As amostras na pista 2 não tinham DTT. A FIG 2 mostra a desgranulação de basófilos pelas proteínas de fusão de Fel dl sozinhas ou pelas proteínas de fusão de Fel dl acopladas a Q|5. O eixo dos X representa a concentração da proteína de Fel dl correspondente. O eixo dos Y representa a percentagem de basófilos que foram desgranulados. A FIG 3 mostra os resultados da prova intradérmica de um voluntário alérgico a gatos que recebeu Οβ-FELDl nos dias 0, 7 e 14 e os testes foram também realizados nos dias 0, 14 e 21. A FIG 4A mostra a pontuação de intensificação da dose nasal e pontuação global nasal (FIG 4B) de um voluntário alérgico a gatos que recebeu Ç^-FELD 1 nos dias 0, 7 e 14 e os testes foram realizados nos dias 0, 14 e 21.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que os geralmente entendidos por um técnico com conhecimento geral na matéria à qual esta invenção pertence.

Adjuvante: 0 termo "adjuvante" como aqui utilizado refere-se a estimuladores não específicos da resposta imunológica ou substâncias que permitem a produção de um depósito no hospedeiro, o qual quando combinado com a vacina e composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção pode proporcionar uma resposta imunológica ainda mais reforçada. Pode ser utilizada uma variedade de adjuvantes. Os exemplos incluem adjuvante completo e incompleto de Freund, hidróxido de alumínio e muramildipéptido modificado. Outros adjuvantes são geles minerais, tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas de caramujo, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes também são bem conhecidos na técnica. Outros adjuvantes que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, Imunomodulador de monofosforil-lípidos, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, Sais de alumínio (Alúmen), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 e Tecnologia adjuvante virossómica. Os adjuvantes podem também compreender uma mistura destas substâncias. A VLP tem sido geralmente descrita como um adjuvante. No entanto, o termo "adjuvante", como utilizado no contexto deste pedido, refere-se a um adjuvante que não a VLP utilizada nas composições da invenção, e não em adição à referida VLP. 9

Antigénio: Como aqui utilizado, o termo "antigénio" refere-se a uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo ou um receptor de células T (TCR) se apresentado por moléculas de MHC. 0 termo "antigénio", como aqui utilizado, também abrange epitopos de células T. Um antigénio é adicionalmente capaz de ser reconhecido pelo sistema imunitário e/ou ser capaz de induzir uma resposta imunológica humoral e/ou resposta imunológica celular que leva à activação de linfócitos B e/ou T. No entanto, isto pode requerer que, pelo menos, em determinados casos, o antigénio contenha ou esteja ligado a um epítopo de células Th e seja administrado como adjuvante. Um antigénio pode ter um ou mais epitopos (epitopos B e T) . A reacção especifica referida acima pretende indicar que o antigénio reagirá de um modo preferido, tipicamente de um modo altamente selectivo, com o seu anticorpo ou TCR correspondente e não com o sem-número de outros anticorpos ou TCR que podem ser promovidos por outros antigénios. Antigénios, como aqui utilizado, podem ser também misturas de vários antigénios individuais.

Sitio antigénico: A expressão "sitio antigénico" e a expressão "epítopo antigénico", as quais são aqui utilizados indistintamente, referem-se a porções contínuas ou descontínuas de um polipéptido, as quais podem ser ligadas imunoespecificamente por um anticorpo ou por um receptor de células T no contexto de uma molécula de MHC. A ligação imunoespecifica exclui a ligação não específica, mas não exclui necessariamente a reactividade cruzada. 0 sítio antigénico compreende tipicamente 5-10 aminoácidos numa conformação espacial que é única ao sítio antigénico. 10

Associado: 0 termo "associado" (ou o seu substantivo associação) como aqui utilizado refere-se a todos os modos possíveis, de um modo preferido, interacções quimicas, através das quais duas moléculas são ligadas em conjunto. As interacções quimicas incluem interacções covalentes e não covalentes. Os exemplos típicos de interacções não covalentes são interacções iónicas, interacções hidrófobas ou ligações de hidrogénio, enquanto que as interacções covalentes baseiam-se, a título de exemplo, em ligações covalentes, tais como éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, ligações carbono-fósforo, ligações carbono-enxofre tal como tioéter, ou ligações de imida. Sítio de ligação, Primeiro: Como aqui utilizada, a expressão "primeiro sítio de ligação" refere-se a um elemento que ocorre naturalmente com a VLP ou que é artificialmente adicionado à VLP, e ao qual pode estar ligado o segundo sítio de ligação. 0 primeiro sítio de ligação pode ser uma proteína, um polipéptido, um aminoácido, um péptido, um açúcar, um polinucleótido, um polímero natural ou sintético, um metabolito ou composto secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iões metálicos, fluoreto de fenilmetilsulfonilo), ou um grupo quimicamente reactivo, tais como um grupo amino, um grupo carboxilo, um grupo sulfidrilo, um grupo hidroxilo, um grupo guanidinilo, grupo histidinilo, ou uma sua associação. Uma forma de realização preferida de um grupo quimicamente reactivo que é o primeiro sítio de ligação é o grupo amino de um aminoácido tal como lisina. 0 primeiro sítio de ligação está localizado, tipicamente na superfície e, de um modo preferido, na superfície externa da VLP. Estão presentes primeiros sítios de ligação múltiplos na superfície, de um modo preferido, na superfície externa da partícula semelhante a vírus, tipicamente numa configuração repetida. Numa forma de realização preferida, 11 o primeiro sitio de ligaçao está associado à VLP, através de, pelo menos, uma ligação covalente, de um modo preferido, através de, pelo menos, uma ligação peptídica. Numa outra forma de realização preferida, o primeiro sítio de ligação ocorre naturalmente com a VLP. Alternativamente, numa forma de realização preferida o primeiro sítio de ligação é artificialmente adicionada à VLP. Sítio de ligação, Segundo: Como aqui utilizada, a expressão "segundo sítio de ligação" refere-se a um elemento que ocorre naturalmente ou que é artificialmente adicionado ao Fel dl da invenção e ao qual pode estar ligado o primeiro sítio de ligação. 0 segundo sítio de ligação de Fel dl da invenção pode ser uma proteína, um polipéptido, um péptido, um aminoácido, um açúcar, um polinucleótido, um polímero natural ou sintético, um metabolito ou composto secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iões metálicos, fluoreto de fenilmetilsulfonilo), ou um grupo quimicamente reactivo, tais como um grupo amino, um grupo carboxilo, um grupo sulfidrilo, um grupo hidroxilo, um grupo guanidinilo, grupo histidinilo, ou uma associação dos mesmos. Uma forma de realização preferida de um grupo quimicamente reactivo que é o segundo sítio de ligação é o grupo sulfidrilo, de um modo preferido, de um aminoácido cisteína. Por conseguinte, a expressão "Fel dl da invenção com, pelo menos um, segundo sítio de ligação" refere-se a uma construção compreendendo o Fel dl da invenção e, pelo menos um, segundo sítio de ligação. No entanto, em particular, para um segundo sítio de ligação, o qual não é natural no Fel dl da invenção, uma tal construção compreende ainda, tipicamente e de um modo preferido, uma "unidade de ligação". Noutra forma de realização preferida, o segundo sítio de ligação está associado ao Fel dl da invenção através de, pelo menos, uma ligação 12 covalente, de um modo preferido, através de, pelo menos, uma ligação peptídica. Numa outra forma de realização, o segundo sitio de ligação é natural no Fel dl da invenção. Ainda noutra forma de realização preferida, o segundo sitio de ligação é artificialmente adicionado ao Fel dl da invenção através de uma unidade de ligação, em que a referida unidade de ligação compreende ou, alternativamente, consiste de uma cisteina. De um modo preferido, a unidade de ligação está fundida com o Fel dl da invenção por uma ligação peptídica.

Proteína de revestimento: A expressão "proteína de revestimento" e a expressão utilizada indistintamente neste pedido "proteína da cápside", refere-se a uma proteína virai, de um modo preferido, uma subunidade de uma cápside natural de um vírus, de um modo preferido, de um fago de ARN, a qual é capaz de ser incorporada numa cápside de vírus ou uma VLP.

Fel dl da invenção: A expressão "Fel dl da invenção", como aqui utilizada, refere-se a, pelo menos, uma proteína de Fel dl ou, pelo menos, um fragmento de Fel dl.

Cadeia 1 de Fel dl: A expressão "cadeia 1 de Fel dl", como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido compreendendo ou, alternativamente, consistindo de uma sequência de aminoácidos como a SEQ ID N°: 22 ou uma sua sequência homóloga. A expressão "sequência homóloga da SEQ ID N°: 22", como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido que tem uma identidade com a SEQ ID N°: 22 que é superior a 70%, de um modo preferido, superior a 80%, de um modo mais preferido superior a 90%, e de um modo ainda mais preferido superior a 95%. A expressão "cadeia 1 de Fel dl", como aqui utilizada, deve também referir-se a um polipéptido que abrange, pelo menos, uma modificação pós- 13 tradução, que inclui mas não está limitada a, pelo menos, uma glicosilação da cadeia 1 de Fel dl, como aqui definida. De um modo preferido, a cadeia 1 de Fel dl, como aqui definida, consiste no máximo de 130, de um modo ainda mais preferido no máximo de 100 aminoácidos no total.

Cadeia 2 de Fel dl: A expressão "cadeia 2 de Fel dl", como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido compreendendo ou, alternativamente, consistindo de uma sequência de aminoácidos como a SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25 ou SEQ ID N°: 26, ou uma sua sequência homóloga. A expressão "sequência homóloga da SEQ ID N° : 23, SEQ ID N° : 25 ou SEQ ID N° : 26", como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido que tem uma identidade com a SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25 ou SEQ ID N°: 26 que é superior a 70%, de um modo preferido, superior a 80%, de um modo mais preferido superior a 90%, e de um modo ainda mais preferido superior a 95%. A expressão "cadeia 2 de Fel dl", como aqui utilizada, deve também referir-se a um polipéptido abrangendo, pelo menos, uma modificação pós-tradução, incluindo mas não estando limitada a, pelo menos, uma glicosilação da cadeia 2 de Fel dl, como aqui definida. De um modo preferido, a cadeia 2 de Fel dl, como aqui definida, consiste no máximo de 150, de um modo ainda mais preferido no máximo de 130, de um modo ainda mais preferido no máximo de 100 aminoácidos no total.

Proteína de Fel dl: A expressão "proteína de Fel dl", como aqui utilizada, refere-se a uma proteína compreendendo ou, alternativamente, consistindo da cadeia 1 de Fel dl e da cadeia 2 de Fel dl., de um modo preferido, a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl estão ligadas covalentemente. Numa forma de realização preferida, a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl estão ligadas através de, pelo menos, uma ligação 14 dissulfureto. Noutra forma de realização preferida, a cadeia 1 e cadeia 2 estão fundidas directamente ou através de um espaçador, em cujo caso a referida proteína de Fel dl compreende ainda ou, alternativamente, consiste de um espaçador. De um modo preferido, a proteína de Fel dl, como aqui definida, consiste no máximo de 300, de um modo ainda mais preferido no máximo de 200 aminoácidos no total. Tipicamente e de um modo preferido, a proteína de Fel dl, de acordo com a invenção, é capaz de induzir in vivo a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao Fel dl natural ou ao Fel dl recombinante como produzido de acordo com o EXEMPLO 5 da presente invenção.

Fragmento de Fel dl: A expressão "fragmento de Fel dl" como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido compreendendo ou, alternativamente, consistindo de, pelo menos, um sítio antigénico de Fel dl. Tipicamente e de um modo preferido, a expressão "fragmento de Fel dl" como aqui utilizada, refere-se a um polipéptido compreendendo ou, alternativamente, consistindo de, pelo menos, dois sítios antigénicos de Fel dl. De um modo preferido, os sítios antigénicos estão ligados covalentemente, de um modo mais preferido os sítios antigénicos estão ligados por, pelo menos, uma ligação peptídica, em cujo caso pode ser necessário um espaçador entre os sítios antigénicos. De um modo preferido, os, pelo menos, dois sítios antigénicos derivam ambos da cadeia 1 de Fel dl e da cadeia 2 de Fel dl. De um modo preferido, o fragmento de Fel dl, como aqui definido, consiste no máximo de 130, de um modo ainda mais preferido no máximo de 100, de um modo ainda mais preferido de 60 aminoácidos no total. Tipicamente e de um modo preferido, o fragmento de Fel dl é capaz de induzir in vivo a produção de anticorpos que se ligam especif icamente ao Fel dl natural ou ao Fel dl recombinante, como produzido de acordo com o EXEMPLO 5 da presente invenção. 15

Ligado: 0 termo "ligado" (ou o seu substantivo: ligação) como aqui utilizado, refere-se a todos os modos possíveis, de um modo preferido, interacções químicas, através das quais o, pelo menos um, primeiro sítio de ligação e o, pelo menos um, segundo sítio de ligação são ligados em conjunto. As interacções químicas incluem interacções covalentes e não covalentes. Os exemplos típicos de interacções não covalentes são interacções iónicas, interacções hidrófobas ou ligações de hidrogénio, enquanto que as interacções covalentes baseiam-se, a título de exemplo, em ligações covalentes, tais como éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, ligações carbono-fósforo, ligações carbono-enxofre tal como tioéter, ou ligações de imida. Em determinadas formas de realização preferidas, o primeiro sítio de ligação e o segundo sítio de ligação estão ligados através de, pelo menos, uma ligação covalente, de um modo preferido, através de, pelo menos, uma ligação não peptídica, e de um modo ainda mais preferido exclusivamente através de ligação/ligações não peptídica(s). No entanto, o termo "ligado" como aqui utilizado deve abranger não só uma ligação directa do, pelo menos um, primeiro sítio de ligação e do, pelo menos um, segundo sítio de ligação mas também, alternativamente e de um modo preferido, uma ligação indirecta do, pelo menos um, primeiro sítio de ligação e do, pelo menos um, segundo sítio de ligação através de molécula(s) intermediária(s) e, na presente, utilizando tipicamente e de um modo preferido, pelo menos, uma, de um modo preferido, uma, unidade de reticulação heterobifuncional.

Unidade de ligação: Uma "unidade de ligação", como aqui utilizada, associa o segundo sítio de ligação com o Fel dl da invenção ou já compreende, consiste essencialmente ou consiste 16 do segundo sítio de ligação. De um modo preferido, uma "unidade de ligação", como aqui utilizada, já compreende o segundo sítio de ligação, tipicamente e, de um modo preferido, - mas não necessariamente - como um resíduo de aminoácido, de um modo preferido, como um resíduo de cisteína. Uma "unidade de ligação" como aqui utilizada também é designada "unidade de ligação de aminoácidos", em particular quando uma unidade de ligação de acordo com a invenção contém, pelo menos, um resíduo de aminoácido. Assim, os termos "unidade de ligação" e "unidade de ligação de aminoácidos" são aqui utilizados indistintamente. No entanto, isto não implica que uma tal unidade de ligação consista exclusivamente de resíduos de aminoácido, mesmo no caso de uma unidade de ligação consistindo de resíduos de aminoácido ser uma forma de realização preferida da presente invenção. Os resíduos de aminoácido da unidade de ligação são, de um modo preferido, constituídos por aminoácidos naturais ou aminoácidos não naturais conhecidos na técnica, todos os L ou todos os D ou as suas misturas. Outras formas de realização preferidas de uma unidade de ligação de acordo com esta invenção são moléculas que compreendem um grupo sulfidrilo ou um resíduo de cisteína e, portanto, tais moléculas estão também abrangidas dentro desta invenção. Outras unidades de ligação úteis para a presente invenção são moléculas compreendendo uma unidade alquilo C1-C6, um cicloalquilo tais como um ciclopentilo ou ciclo-hexilo, uma cicloalcenilo, arilo ou heteroarilo. Além do mais, unidades de ligação compreendendo, de um modo preferido, uma unidade alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo ou heteroarilo e aminoácido ou aminoácidos adicionais também podem ser utilizadas como unidades de ligação para a presente invenção e devem estar abrangidas no âmbito da invenção. A associação da unidade de ligação com o Fel dl da invenção é, de um modo preferido, por 17 meio de, pelo menos, uma ligação covalente, de um modo mais preferido por meio de, pelo menos, uma ligação peptídica.

Matriz de antigénios ordenada e repetida: Como agui utilizado, a expressão "matriz de antigénios ordenada e repetida" refere-se geralmente a um padrão de repetição de antigénio ou caracterizado, tipicamente e de um modo preferido, por uma alta ordem de uniformidade no arranjo espacial dos antigénios em relação à partícula semelhante a vírus, respectivamente. Numa forma de realização da invenção, o padrão de repetição pode ser um padrão geométrico. Determinados formas de realização da invenção, tais como antigénios acoplados à VLP de fagos de ARN, são exemplos típicos e preferidos de matrizes de antigénios ordenadas e repetidas adeguadas, as quais, além disso, possuem ordens paracristalinas rigorosamente repetidas de antigénios, de um modo preferido, com espaçamentos de 1 a 30 nanómetros, de um modo preferido, 2 a 15 nanómetros, de um modo ainda mais preferido 2 a 10 nanómetros, de um modo novamente ainda mais preferido 2 a 8 nanómetros, e de um muito mais preferido 1,6 a 7 nanómetros.

Empacotado: O termo "empacotado" como aqui utilizado refere-se ao estado de uma macromolécula polianiónica ou substâncias imunoestimulantes em relação à VLP. O termo "empacotado" como aqui utilizado inclui uma ligação que pode ser covalente, e. g., por acoplamento químico, ou não covalente, e. g., interacções iónicas, interacções hidrófobas, ligações de hidrogénio, etc. O termo inclui também o incorporação, ou incorporação parcial, de uma macromolécula polianiónica. Assim, a macromolécula polianiónica ou substâncias imunoestimulantes podem ser incorporadas pela VLP sem a existência de uma ligação efectiva, em particular de uma ligação covalente. Em formas de realização preferidas, a, pelo menos, uma macromolécula 18 polianiónica ou substâncias imunoestimulantes é empacotada dentro da VLP, de um modo muito preferido de um modo não covalente.

Espaçador: 0 termo "espaçador", bem como o seu termo equivalentemente utilizado "espaçador de aminoácidos", como aqui utilizado, refere-se a um trecho de sequência de aminoácidos, o qual não tem mais do que 30 aminoácidos, e o qual liga a extremidade N-terminal de uma cadeia com a extremidade C-terminal de outra cadeia de Fel dl.

Partícula de vírus: A expressão "partícula de vírus" como aqui utilizada refere-se à forma morfológica de um vírus. Nalguns tipos de vírus, esta compreende um genoma rodeado por uma cápside proteica; outros têm estruturas adicionais (e. g., envelopes, caudas, etc.).

Partícula semelhante a vírus (VLP), como aqui utilizada, refere-se a uma partícula de vírus não replicativa ou não infecciosa, de um modo preferido, não replicativa e não infecciosa, ou refere-se a uma estrutura semelhante a uma partícula de vírus não replicativa ou não infecciosa, de um modo preferido, não replicativa e não infecciosa, de um modo preferido, uma cápside de um vírus. A expressão "não replicativa", como aqui utilizada, refere-se a ser incapaz de replicar o genoma compreendido pela VLP. A expressão "não infecciosa", como aqui utilizada, refere-se a ser incapaz de entrar na célula hospedeira. De um modo preferido, uma partícula semelhante a vírus de acordo com a invenção é não replicativa e/ou não infecciosa, uma vez que carece da totalidade ou parte do genoma virai ou função do genoma. Numa forma de realização, uma partícula semelhante a vírus é uma partícula de vírus, em 19 que o genoma virai foi física ou quimicamente inactivado. Tipicamente e de um modo mais preferido, uma partícula semelhante a vírus carece da totalidade ou parte dos componentes replicativos e infecciosos do genoma virai. Uma partícula semelhante a vírus de acordo com a invenção pode conter ácido nucleico diferente do seu genoma. Uma forma de realização típica e preferida de uma partícula semelhante a vírus de acordo com a presente invenção é uma cápside virai tal como a cápside virai do correspondente vírus, bacteriófago, de um modo preferido, fago de ARN. A expressão "cápside virai" ou o termo "cápside", referem-se a uma estrutura macromolecular constituída por subunidades de proteínas virais. Tipicamente, existem 60, 120, 180, 240, 300, 360 e mais do que 360 subunidades de proteínas virais. Tipicamente e de um modo preferido, as interacções destas subunidades levam à formação de uma cápside virai ou estrutura tipo cápside virai com uma organização repetitiva inerente, em que a referida estrutura é, tipicamente, esférica ou tubular. Por exemplo, as cápsides de fagos de ARN ou HBcAgs têm uma forma esférica de simetria icosaédrica. A expressão "estrutura tipo cápside" como aqui utilizada, refere-se a uma estrutura macromolecular constituída por subunidades de proteínas virais que se assemelha à morfologia da cápside no sentido definido acima mas que se desvia da estrutura simétrica típica e que mantém ao mesmo tempo um grau suficiente de ordem e repetitividade.

Uma característica comum da partícula de vírus e da partícula semelhante a vírus é o arranjo altamente ordenado e repetido das suas subunidades.

Partícula semelhante a vírus de um fago de ARN: Como aqui utilizado, a expressão "partícula semelhante a vírus de um fago 20 de ARN" refere-se a uma partícula semelhante a vírus compreendendo ou, de um modo preferido, consistindo essencialmente ou consistindo de proteínas de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos, de um fago de ARN. Além disso, a partícula semelhante a vírus de um fago de ARN semelhante à estrutura de um fago de ARN, o qual é não replicativo e/ou não infeccioso, e que carece, pelo menos, do gene ou genes que codificam a maquinaria de replicação do fago de ARN e que, tipicamente, também carecem do gene ou genes que codificam a proteína ou proteínas responsáveis pela fixação virai ou entrada no hospedeiro. No entanto, esta definição deve também abranger partículas semelhantes a vírus de fagos de ARN, em que os gene ou genes supramencionados estão ainda presentes mas inactivos e, por conseguinte, levam também a partículas semelhantes a vírus de um fago de ARN não replicativas e/ou não infecciosas. As VLP derivadas de fagos de ARN preferidas exibem simetria icosaédrica e consistem de 180 subunidades. Na presente divulgação, os termos "subunidade" e "monómero" são utilizados de forma intermutável e equivalente neste contexto. Neste pedido, a expressão "fago de ARN" e a expressão "bacteriófago de ARN" são utilizadas indistintamente. Os métodos preferidos para tornar uma partícula semelhante a vírus de um fago de ARN não replicativa e/ou não infecciosa é tipicamente por inactivação física, química, tais como irradiação com UV, tratamento com formaldeído e, de um modo preferido, por manipulação genética.

Um ou uma: quando os termos "um" ou "uma" são utilizados nesta divulgação, estes significam "pelo menos um" ou "um ou mais", salvo indicação em contrário. A identidade da sequência de aminoácidos de polipéptidos pode ser convencionalmente determinada utilizando programas de 21 computador conhecidos tal como o programa Bestfit. Ao utilizar o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências, de um modo preferido, ao utilizar o Bestfit, para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, os parâmetros são ajustados de tal forma que a percentagem de identidade é calculada ao longo de toda a sequência de aminoácidos de referência e sao permitidas lacunas na homologia de até 5% do número total de resíduos de aminoácido na sequência de referência. Este método supramencionado para determinar a percentagem de identidade entre polipéptidos é aplicável a todas as proteínas, polipéptidos ou um seu fragmento divulgados nesta invenção.

Neste pedido, os anticorpos são definidos como sendo de ligação específica se estes se ligarem ao antigénio com uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M_1 ou maior, de um modo preferido, 10 M“ ou maior, de um modo mais preferido 10 M ou maior, e de um modo muito preferido ΙΟ9 1Γ1 ou maior. A afinidade de um anticorpo pode ser facilmente determinada por um técnico médio na matéria (por exemplo, por análise de Scatchard.)

Esta invenção proporciona composições da invenção compreendendo: (a) uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula de vírus; e (b) , pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o, pelo menos, um antigénio é uma proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl, e em que (a) e (b) são ligados covalentemente através do, pelo menos um, primeiro e do, pelo menos um, segundo sítio de ligação. De um modo preferido, uma proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl 22 é ligado à partícula central, de modo a formar uma matriz de antigénio-VLP ordenada e repetida. Em formas de realização preferidas da invenção, pelo menos, 20, de um modo preferido, pelo menos, 30, de um modo mais preferido, pelo menos, 60, de um modo outra vez mais preferido, pelo menos, 120 e de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 180 proteínas de Fel dl ou fragmentos de Fel dl estão ligados à partícula central.

Qualquer vírus conhecido na técnica possuindo uma estrutura ordenada e repetida pode ser seleccionado como uma VLP ou uma partícula de vírus da invenção. Os vírus de ADN ou ARN ilustrativos, cujas proteínas de revestimento ou da cápside podem ser utilizadas para a preparação de VLP foram divulgados no documento WO 2004/009124 na página 25, linhas 10-21, na página 26, linhas 11-28, e na página 28, linha 4 até à página 31, linha 4.

Os vírus ou partícula semelhante a vírus podem ser produzidos e purificados a partir de cultura de células infectada por vírus. O vírus ou partícula semelhante a vírus resultante para efeitos de vacina devem ser, de um modo preferido, não replicativos ou não infecciosos, de um modo mais preferido não replicativos e não infecciosos. A irradiação com UV, tratamento químico, tal como com formaldeído ou clorofórmio, são os métodos gerais conhecidos pelo especialista na técnica para inactivar vírus.

Numa forma de realização preferida, a partícula central é uma partícula de vírus, e em que, de um modo preferido, a referida partícula de vírus é uma partícula de vírus de um bacterióf ago, e em que de um modo mais preferido o referido bacteriófago é um fago de ARN, e em que de um modo ainda mais 23 preferido o referido fago de ARN é um fago de ARN seleccionado de ζ)β, fr, GA ou AP205.

Numa forma de realização preferida, a partícula central é uma VLP. Numa outra forma de realização preferida, a VLP é uma VLP recombinante. Praticamente todos os vírus geralmente conhecidos foram sequenciados e estão facilmente disponíveis ao público. 0 gene que codifica a proteína de revestimento pode ser facilmente identificado por um especialista. A preparação de VLP expressando recombinantemente a proteína de revestimento num hospedeiro está dentro do conhecimento comum de um especialista.

Numa forma de realização preferida, a partícula semelhante a vírus compreende ou, alternativamente, consiste de proteínas recombinantes, mutantes ou os seus fragmentos, de um vírus seleccionado do grupo consistindo de: a) fagos de ARN; b) bacteriófagos; c) vírus da Hepatite B, de um modo preferido, a sua proteína da cápside (Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)) ou sua proteína superficial (documento WO 92/11291); d) vírus do sarampo (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) vírus Sindbis; f) rotavírus (documentos US 5 071 651 e US 5374426); g) vírus da febre aftosa (Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) vírus de Norwalk (Jiang, X., et al.,

Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin.

Invest 87:1456 1461 (1991)); i) Alfavírus; j) retrovírus, de um modo preferido, a sua proteína GAG (documento WO 96/30523); k) retrotransposão Ty, de um modo preferido, a proteína pl; l) vírus do Papiloma humano (documento WO 98/15631); m) vírus de Polioma; n) vírus do Mosaico do Tabaco; e o) Vírus Flock House.

Numa forma de realização preferida, a VLP compreende, ou consiste de, mais do que uma sequência de aminoácidos, de um modo preferido, duas sequências de aminoácidos, das proteínas recombinantes, mutantes ou os seus fragmentos. Neste pedido, a VLP que compreende ou consiste de mais do que uma sequência de aminoácidos é referida como VLP mosaico. A expressão "fragmento de uma proteína recombinante" ou a expressão "fragmento de um proteína de revestimento", como aqui utilizada, é definido como um polipéptido, o qual tem, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% do comprimento da proteína recombinante, ou proteína de revestimento, de tipo selvagem respectivamente e o qual, de um modo preferido, retém a capacidade de formar uma VLP. De um modo preferido, o fragmento é obtido por, pelo menos, uma supressão interna, pelo menos, um truncamento ou, pelo menos, uma associação das mesmas. A expressão "fragmento de uma proteína recombinante" ou "fragmento de um proteína de revestimento" deve ainda abranger um polipéptido, o qual tem, pelo menos, 80%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o "fragmento de uma proteína recombinante" ou "fragmento de uma proteína de revestimento", respectivamente, como definido acima e que, de um modo preferido, é capaz de se reunir numa partícula semelhante a vírus. A expressão "proteína mutante recombinante" ou a expressão "mutante de uma proteína recombinante" como indistintamente utilizadas nesta invenção, ou a expressão "proteína de revestimento mutante" ou a expressão "mutante de uma proteína de 25 revestimento", como indistintamente utilizadas nesta invenção, referem-se a um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos derivada da proteína recombinante, ou proteína de revestimento, de tipo selvagem, respectivamente, em que a sequência de aminoácidos é, pelo menos, 80%, de um modo preferido, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica à sequência de tipo selvagem e, de um modo preferido, retém a aptidão para reunir-se numa VLP.

Numa forma de realização preferida, a partícula semelhante a vírus da invenção é do vírus da Hepatite B. A preparação de partículas semelhantes a vírus da Hepatite B foi divulgada, inter alia, nos documentos WO 00/32227, WO 01/85208 e WO 02/056905. Outras variantes de HBcAg adequadas para serem utilizadas na prática da presente invenção foram divulgadas nas páginas 34-39 do documento WO 02/056905.

Numa outra forma de realização preferida da invenção, um resíduo de lisina é introduzido no polipéptido HBcAg, para mediar a ligação do Fel dl da invenção à VLP de HBcAg. Em formas de realização preferidas, as VLP e composições da invenção são preparadas utilizando um HBcAg compreendendo ou, alternativamente, consistindo dos aminoácidos 1-144, ou 1-149, 1-185 da SEQ ID N°: 20, o qual é modificado de modo que os aminoácidos nas posições 79 e 80 são substituídos por um péptido possuindo a sequência de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. Esta modificação altera a SEQ ID N°: 20 para SEQ ID N°: 21. Noutras formas de realização preferidas, os resíduos de cisteína nas posições 48 e 110 da SEQ ID N°: 21, ou os seus fragmentos correspondentes, de um modo preferido, 1-144 ou 1-149, são mutados para serina. A invenção inclui ainda composições compreendendo mutantes da proteína nuclear de Hepatite B 26 possuindo as alterações de aminoácidos correspondentes assinaladas acima. A invenção inclui ainda composições e vacinas, respectivamente, compreendendo polipéptidos HBcAg, os quais compreendem ou, alternativamente, consistem de sequências de aminoácidos que são, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idênticas à SEQ ID N°: 21.

Numa forma de realização preferida da invenção, a partícula semelhante a virus da invenção compreende, consiste essencialmente ou, alternativamente, consiste de proteínas de revestimento recombinantes, mutantes ou os seus fragmentos, de um fago de ARN. De um modo preferido, o fago de ARN é seleccionado do grupo consistindo da) bacteriófago Οβ; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago Mil; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; 1) bacteriófago PP7 e m) bacteriófago AP205.

Numa forma de realização preferida da invenção, a composição compreende a proteína de revestimento , mutantes ou os seus fragmentos, de fagos de ARN, em que a proteína de revestimento tem a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N°: 1; referindo-se a Οβ CP; (b) uma mistura da SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2 (referindo-se à proteína AI de QP); (c) SEQ ID N° : 3; (d) SEQ ID N° : 4; (e) SEQ ID N° : 5; (f) SEQ ID N° : 6, (g) uma mi stura da SEQ ID N° : 6 e SEQ ID N°: 7; (h) SEQ ID N 0 · 8 ; (i) SEQ ID N° : 9; (j) SEQ : ID Nc ’ : 10 ; (k) SEQ ID N° : 11 r (D SEQ ID N° : 12; (m) SEQ ID N° : 13; e (n) SEQ ID N° : 14. 27

Numa forma de realização preferida da invenção, a VLP é uma VLP mosaico compreendendo ou, alternativamente, consistindo de mais do que uma sequência de aminoácidos, de um modo preferido, duas sequências de aminoácidos, das proteínas de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos, de um fago de ARN.

Numa forma de realização muito preferida, a VLP compreende ou, alternativamente, consiste de duas proteínas de revestimento diferentes de um fago de ARN, em que as referidas duas proteínas de revestimento têm uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2, ou da SEQ ID N°: 6 e SEQ ID N°: 7.

Em formas de realização preferidas da presente invenção, a partícula semelhante a vírus da invenção compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente ou, alternativamente, consiste de proteínas de revestimento recombinantes, mutantes ou os seus fragmentos, do bacteriófago de ARN Οβ, fr, AP205 ou GA. Numa forma de realização preferida, a VLP é de um bacteriófago de ARN, de um modo preferido, de um bacteriófago de ARN QP, fr, AP205 ou GA.

Numa forma de realização preferida, a VLP da invenção é uma VLP de fago de ARN Οβ. A cápside ou partícula semelhante a vírus de Οβ apresentou uma estrutura de cápside tipo fago icosaédrica com um diâmetro de 25 nm e uma quase simetria T=3. A cápside contém 180 cópias da proteína de revestimento, as quais estão ligadas em pentâmeros e hexâmeros covalentes por pontes dissulfureto (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996)), levando a uma estabilidade acentuada da cápside de Οβ. No entanto, as cápsides ou VLP preparadas a partir da proteína de revestimento de Οβ recombinante podem conter subunidades não ligadas através de ligações dissulfureto a outras subunidades 28 dentro da cápside, ou incompletamente ligadas. A cápside ou VLP de ζ)β exibe uma resistência invulgar a solventes orgânicos e agentes desnaturantes. Surpreendentemente, a requerente observou que concentrações de DMSO e acetonitrilo tão altas quanto 30%, e concentrações de guanidinio tão altas quanto 1 , não afectam a estabilidade da cápside. A alta estabilidade da cápside ou VLP de ζ)β é uma caracteristica vantajosa, em particular, para a sua utilização em imunização e vacinação de mamíferos e humanos de acordo com a presente invenção.

Outras partículas semelhantes a vírus de fagos de ARN preferidas, em particular de QB e fr de acordo com esta invenção são divulgadas no documento WO 02/056905. O exemplo particular 18 do documento WO 02/056905 dá uma descrição detalhada da preparação de partículas VLP a partir de Οβ.

Noutra forma de realização preferida, a VLP da invenção é uma VLP de fago de ARN AP205. As formas mutantes competentes para montagem de VLP de AP205, incluindo a proteína de revestimento de AP 2 0 5 com a substituição da prolina no aminoácido 5 por treonina, também podem ser utilizadas na

prática da invenção e levam a outras formas de realização preferidas da invenção. O documento WO 2004/007538 descreve, em particular no Exemplo 1 e Exemplo 2, como obter VLP compreendendo proteínas de revestimento de AP205 e, pela presente, em particular a expressão e a purificação para esse fim. As VLP de AP205 são altamente imunogénicas e podem ser ligadas com o Fel dl da invenção para produzir, tipicamente e de um modo preferido, construções de vacinas que apresentam o Fel dl da invenção orientado de um modo repetitivo. É desencadeado um título de anticorpo alto contra o Fel dl da invenção apresentado deste modo, demonstrando que os Fel dl da invenção 29 ligados estão acessíveis para interagir com as moléculas de anticorpo e são imunogénicos.

Numa forma de realização preferida, a VLP da invenção compreende ou consiste de um proteína de revestimento mutante de um vírus, de um modo preferido, um fago de ARN, em que a proteína de revestimento mutante foi modificada através da remoção de, pelo menos, um resíduo de lisina por meio de substituição e/ou por meio de supressão. Noutra forma de realização preferida, a VLP da invenção compreende ou consiste de uma proteína de revestimento mutante de um vírus, de um modo preferido, um fago de ARN, em que a proteína de revestimento mutante foi modificada através da adição de, pelo menos, um resíduo de lisina por meio de substituição e/ou por meio de inserção. A supressão, substituição ou adição de, pelo menos, um resíduo de lisina permite variar o grau de acoplamento, i. e. a quantidade de Fel dl da invenção por subunidades da VLP de um vírus, de um modo preferido, de um fago de ARN, em particular, para regular e ajustar os requisitos da vacina.

Numa forma de realização preferida, as composições e vacinas da invenção têm uma densidade de antigénio que é desde 0,5 a 4,0. A expressão "densidade de antigénio", como aqui utilizada, refere-se ao número médio de Fel dl da invenção que está ligado por subunidade, de um modo preferido, por proteína de revestimento, da VLP e na presente, de um modo preferido, da VLP de um fago de ARN. Assim, este valor é calculado como uma média de todas as subunidades ou monómeros da VLP, de um modo preferido, da VLP do fago de ARN, na composição ou vacinas da invenção. 30

As VLP ou cápsides da proteína de revestimento de ζ)β exibem um número definido de resíduos de lisina na sua superfície, com uma topologia definida com três resíduos de lisina a apontar para o interior da cápside e a interagir com o ARN, e outros quatro resíduos de lisina expostos para o exterior da cápside. De um modo preferido, o, pelo menos um, primeiro sítio de ligação é um resíduo de lisina; a apontar para ou que está no exterior da VLP.

Na presente invenção podem ser utilizados mutantes de ζ)β cujos resíduos de lisina expostos estão substituídos por argininas. Assim, noutra forma de realização preferida da presente invenção, a partícula semelhante a vírus compreende, consiste essencialmente ou, alternativamente, consiste de proteínas de revestimento ζ)β mutantes. De um modo preferido, estas proteínas de revestimento mutantes compreendem ou, alternativamente, consistem de uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de a) 0β-240 (SEQ ID N°: 15, Lysl3-Arg da SEQ ID N° : 1) b) 0β-243 (SEQ ID N° : 16, AsnlO-Lys da SEQ ID N° : 1); c) 0β-250 (SEQ ID N° : 17, Lys2-Arg da SEQ ID N° : 1) d) 0β-251 (SEQ ID N° : 18, Lysl6-Arg da SEQ ID N° : 1); e e) 0β-259" (SEQ ID N° : 19, Lys2-Arg, Lysl6-Arg da SEQ ID N°: 1). A construção, expressão e purificação das proteínas de revestimento mutantes de Οβ, VLP e cápsides da proteína de revestimento de Qβ mutante, respectivamente, indicadas acima são descritas no documento WO 02/056905. Em particular refere-se aqui o Exemplo 18 do pedido supramencionado.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, a partícula semelhante a vírus compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente ou, alternativamente, consiste da 31 proteína de revestimento mutante de ζ)β, ou mutantes ou os seus fragmentos, e da proteína AI correspondente. Numa outra forma de realização preferida, a partícula semelhante a vírus compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente ou, alternativamente, consiste da proteína de revestimento mutante com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 15, 16, 17, 18 ou 19 e a proteína AI correspondente.

Foi também demonstrado que outras proteínas de revestimento de fago de ARN se auto-montar após expressão num hospedeiro bacteriano (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). Em particular foram divulgadas as propriedades biológicas e bioquímicas de GA (Ni, CZ., et al., Protein Sei. 5:2485 -2493 (1996), Tars, K et al. , J. Mol.Biol. 271:759-773(1997)) e de f r (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994)). Foi determinada a estrutura cristalina de vários bacteriófagos de ARN (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). Utilizando essa informação podem ser identificados resíduos expostos na superfície e, deste modo, as proteínas de revestimento de fago de ARN podem ser modificadas pelo que podem ser inseridos um ou mais resíduos de aminoácido reactivos por meio de inserção ou substituição. Outra vantagem das VLP derivadas de fagos de ARN é o seu rendimento de expressão elevado em bactérias, o que permite a produção de grandes quantidades de material a custos acessíveis.

Numa forma de realização preferida, a composição da invenção compreende, pelo menos, um antigénio, em que o referido, pelo menos, um antigénio é uma proteína de Fel dl. 32

Numa forma de realização preferida, a proteína de Fel dl compreendendo ou, alternativamente, consistindo de um Fel dl natural. A estrutura primária da cadeia 1 é a sequência da SEQ ID NO 22. As variantes descritas da cadeia 1 são Lys29-Arg ou Asn, Val33-Ser, Val60-Leu. A estrutura primária da cadeia 2 é a sequência da SEQ ID NO 23, 25 ou 26. As variantes descritas da cadeia 2 são Cys7-Phe, Phel5-Thr, Asnl9-Ser, Gly20-Leu, Ile55-Val, Arg57-Lys, Val58-Phe da SEQ ID N°: 23, 25 ou 26. Outras variantes da cadeia 2 são Glu69-Val, Tyr70-Asp, Met72-Thr, Gln-77-Glu e Asn86-Lys da SEQ ID N°: 25; Met74-Thr, Gln79-Glu e Asn88-Lys da SEQ ID N°: 23. (Griffith I.J. et ai., Gene 113:263-268 (1992); Morgenstern J.P. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:9690-9694 (1991). Duffort O.A., et ai. Mol. Immunol. 28:301-309 (1991); Leitermann K., et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 74:147-153 (1984); Kristensen, A. K, et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908) . O Fel dl natural é obtido por purificação, por exemplo, de saliva de gato, pêlo de gato, pó doméstico de uma casa onde vive um gato, etc.

Numa forma de realização preferida, o Fel dl da invenção é uma proteína de Fel dl recombinante ou um fragmento de Fel dl recombinante. Proteína de Fel dl recombinante ou fragmento de Fel dl recombinante, como aqui utilizado, refere-se a uma proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl que é obtido por um processo que compreende, pelo menos, um passo de tecnologia de ADN recombinante. As expressões "proteína de Fel dl dl recombinante ou fragmento de Fel dl recombinante" e "proteína de Fel dl dl produzida de forma recombinante ou fragmento de Fel dl produzido de forma recombinante" são aqui indistintamente utilizadas e devem ter um significado idêntico. A proteína ou fragmento de Fel dl dl recombinante pode ser produzido em sistemas de expressão procarióticos, tal como E. coli (documento 33 WO 2004/094639) ou em sistemas de expressão eucarióticos, tal como baculovírus (documento WO 00/20032) . Seppala et al. divulgaram a expressão da cadeia 1 e da cadeia 2 de Fel dl simultaneamente pelo promotor dicistrónico em baculovírus (J. Biol. Chem. Nov, 2004) . A proteína ou fragmento de Fel dl produzido de forma recombinante pode estar glicosilado ou não glicosilado, dependendo da célula hospedeira utilizada para produzir a proteína recombinante.

Numa forma de realização, a proteína de Fel dl recombinante compreende ou, alternativamente, consiste da cadeia 1 de Fel dl e da cadeia 2 de Fel dl, em que a referida cadeia 1 de Fel dl está associada à cadeia 2 de Fel dl exclusivamente por ligações não covalentes, tal como interacções hidrófobas.

Numa forma de realização preferida, a proteína de Fel dl recombinante compreende ou, alternativamente, consiste da cadeia 1 de Fel dl e da cadeia 2 de Fel dl, em que a referida cadeia 1 de Fel dl está associada à cadeia 2 de Fel dl por, pelo menos, uma ligação covalente. Numa forma de realização preferida, a, pelo menos, uma ligação covalente é uma ligação não peptídica, em que a referida ligação não peptídica é uma ligação dissulfureto ou em que, de um modo preferido, a referida ligação não peptídica é uma ligação dissulfureto. Por exemplo, a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl podem ser expressas separadamente e em seguida combinadas sob condições que permite a formação da ligação dissulfureto correcta, tal como o método de remodelação. Alternativamente, a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl podem ser expressas simultaneamente num hospedeiro, por exemplo por clonagem dos genes que codificam a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl, respectivamente, sob dois promotores num plasmídeo. No sistema de expressão 34 eucariótico, a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl podem ser transcritas num ARNm e traduzidas separadamente pelo sitio interno de entrada de ribossoma (IRES).

Numa forma de realização preferida, a proteína de Fel dl compreende ou, alternativamente, consiste de uma proteína de fusão, em que a referida proteína de fusão compreende a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl. Numa forma de realização preferida, a referida cadeia 1 de Fel dl e a referida cadeia 2 de Fel dl são fundidas directamente através de uma ligação peptídica, a qual liga a extremidade N-terminal de uma cadeia com a extremidade C-terminal da outra cadeia. Noutra forma de realização preferida, a referida cadeia 1 de Fel dl e a referida cadeia 2 de Fel dl são fundidas através de um espaçador, o qual liga a extremidade N-terminal de uma cadeia com a extremidade C-terminal da outra cadeia. De um modo preferido, o referido espaçador tem desde 1-30, de um modo preferido, 1-25, de um modo preferido, 1-20, de um modo preferido, 1-15, de um modo preferido, 1-9, de um modo preferido, 1-5, de um modo preferido, 1-3 aminoácidos. Alternativamente, o referido espaçador tem desde 10-30, de um modo preferido, 10-25, de um modo mais preferido 10-20, de um modo mais preferido 13-20, de um modo mais preferido 15-20, de um modo mais preferido 13-17, de um modo mais preferido 15-17 aminoácidos. De um modo preferido, o referido espaçador consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 resíduos de aminoácido. Numa forma de realização preferida, o referido espaçador tem 15 aminoácidos. Numa outra forma de realização preferida, o referido espaçador é (GGGGS)3. 35

Numa forma de realização preferida, a proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N° : 24; (b) SEQ ID N° : 54; (c) SEQ ID N°: 55; (d) SEQ ID N°: 56; e (e) SEQ ID N°: 57.

Numa forma de realização preferida, a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da cadeia 1 de Fel dl, directamente ou através de um espaçador. Numa outra forma de realização preferida, a referida proteína de Fel dl compreende ou, alternativamente, consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 24 . 0 documento WO 2004/094639 divulgou um Fel dl enrolado recombinante com propriedades moleculares e biológicas semelhantes ao homólogo natural e, especificamente, um gene sintético que codifica uma fusão directa N-terminal da cadeia 2 de Fel dl com a cadeia 1. A expressão em E. coli resultou num homodímero associado não covalentemente com um peso molecular aparente de 30 kDa definido por cromatografia de exclusão molecular, cada subunidade de 19177 Da exibiu um padrão dissulfureto idêntico ao encontrado no Fel dl natural, e que possui dobragem idêntica do Fel dl natural e recombinante. O Fel dl recombinante reagiu de forma análoga com a IgE de soros de doentes alérgicos a gatos que o Fel dl natural. Assim, esta proteína de fusão de Fel dl imita a antigenicidade do Fel dl natural.

Numa forma de realização preferida a cadeia 1 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia 2 de Fel dl, directamente ou através de um espaçador. 36

Numa forma de realização preferida, a cadeia 1 de Fel d 1 compreende ou, alternativamente, consiste da sequência da SEQ ID N°: 22 ou uma sua sequência homóloqa, em que a referida sequência homóloga tem uma identidade com a SEQ ID N°: 22 superior a 80%, de um modo preferido, superior a 90% ou de um modo ainda mais preferido superior a 95%.

Numa forma de realização preferida, a referida cadeia 2 de Fel d 1 compreende ou, alternativamente, consiste da sequência da SEQ ID N° : 23, SEQ ID N° : 25 ou SEQ ID N° : 26, ou uma sua sequência homóloga, em que a referida sequência homóloga tem uma identidade com a SEQ ID N° : 23, SEQ ID N° : 25 ou SEQ ID N° : 26 superior a 80%, de um modo preferido, superior a 90% e de um modo ainda mais preferido superior a 95%.

Numa forma de realização preferida, a proteína de Fel dl é uma proteína de Fel dl recombinante, em que, pelo menos, é rompida uma ligação dissulfureto, de um modo preferido, por mutação, de um modo mais preferido por substituição conservadora, tal como Cys para Ser. Foram identificadas três pontes dissulfureto inter-cadeia a ligar os dois péptidos no Fel d 1 nativo, i. e. Cys3(1)-Cys73(2), Cys44 (1)-48Cys (2) e Cys70(1)-Cys7 (2), sugerindo uma orientação antiparalela dos péptidos de Fel d 1. (Kristensen, A. K., et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908). Numa forma de realização preferida é rompida uma tal ligação dissulfureto da proteína de Fel d 1. Numa outra forma de realização preferida são rompidas duas dessas ligações dissulfureto da proteína de Fel dl. Ainda numa outra forma de realização preferida são rompidas todas as três ligações dissulfureto da proteína de Fel dl. Numa forma de realização preferida, a Cys70 da cadeia 1 está suprimida ou mutada. Noutra forma de realização preferida, a Cys 73 da cadeia está suprimida 37 ou mutada. Numa forma de realização preferida, a referida proteína de Fel dl é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl fundidas directamente ou através de um espaçador, em que estão rompidas todas as três ligações dissulfureto. Numa outra forma de realização preferida, a referida proteína de Fel dl compreende ou, alternativamente, consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 24, 55 ou 57, na qual, pelo menos, uma, de um modo preferido, pelo menos, três, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cinco cisternas são removidas por substituição ou por supressão.

Numa forma de realização preferida, o antigénio da invenção compreende ou, alternativamente, consiste de um fragmento de Fel dl. Sabe-se que a presença de imunogenicidade não requer geralmente o comprimento total de uma proteína e que uma proteína contém geralmente mais do que um epítopo antigénico, i. e. sítio antigénico. Um fragmento ou um péptido curto pode ser suficiente para conter, pelo menos, um sítio antigénico que pode ser ligado imunoespecificamente por um anticorpo ou por um receptor de células T no contexto de uma molécula de MHC. 0 sítio ou sítios antigénicos podem ser determinados por um número de técnicas geralmente conhecidas do especialista na técnica. Isto pode ser feito por alinhamento de sequências e previsão de estrutura. A título de exemplo, pode-se prever as hélices a, voltas, ligações dissulfureto inter- e intra-cadeia possíveis, etc. utilizando um programa tal como o Rasmol. Pode ainda prever-se sequências que estão ocultadas na molécula ou sequências que estão expostas na superfície da molécula. É mais provável que as sequências expostas na superfície da molécula compreendam sítio ou sítios antigénicos naturais e são assim úteis na indução de anticorpos terapêuticos. Depois de ter sido determinada uma sequência do péptido de superfície, o sítio 38 antigénico nesta sequência pode ser ainda definido, por exemplo, pelo método de mutagénese exaustiva (tal como mutagénese de varrimento de alanina, Cunningham BC, Wells JA. Science 1989 Jun 2; 244(4908):1081-5). Resumidamente, os aminoácidos nesta sequência são mutados para alanina um a um e os aminoácidos cujas mutações de alanina apresentem, respectivamente, ligação reduzida a um anticorpo (produzido contra a sequência de tipo selvagem) ou percam totalmente a ligação são provavelmente componentes do sitio antigénico. Um outro método para determinar sitio(s) antigénico(s) consiste em produzir péptidos sobrepostos que cobrem toda a sequência do Fel dl (Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) e Slootstra, J. W. et al., (1996) Mol. Divers. 1, 87-96).

Numa forma de realização preferida, o antigénio da invenção compreende ou, alternativamente, consiste de, pelo menos, um, de um modo preferido, pelo menos, dois epítopos de Fel dl, de um modo mais preferido, pelo menos, um epítopo deriva da cadeia 1 de Fel dl e, pelo menos, um epítopo deriva da cadeia 2 de Fel dl.

Os epítopos de Fel dl reactivos a células T foram mapeados ao longo da proteína de Fel dl e foram divulgados na técnica anterior, tal como no documento US 6120769, no quarto parágrafo da coluna 14, na coluna 130 e 131 do documento US6025162. Numa forma de realização preferida, o epítopo de células T do Fel dl é seleccionado de um grupo consistindo de: SEQ ID N°: 27-32. A presente invenção proporciona um método de produção da composição da invenção compreendendo (a) proporcionar uma VLP com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação; (b) proporcionar, pelo menos, um antigénio, em que o referido antigénio é uma 39 proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl, com, pelo menos um, segundo sítio de ligação; e (c) combinar a referida VLP e o referido, pelo menos, um antigénio para produzir a referida composição, em que o referido, pelo menos, um antigénio e a referida VLP estão ligados através do primeiro e do segundo sítios de ligação. Numa forma de realização preferida, a preparação do, pelo menos, um antigénio, i. e. uma proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl, com o, pelo menos um, segundo sítio de ligação é por meio de expressão, de um modo preferido, por meio de expressão num sistema bacteriano, de um modo preferido, em E. coli. Em geral é adicionada uma etiqueta, tal como uma etiqueta de His, etiqueta de Myc para facilitar o processo de purificação. Noutra abordagem, em particular os fragmentos de Fel dl com não mais do que 50 aminoácidos podem ser sintetizados quimicamente.

Numa forma de realização preferida da invenção, a VLP com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação é ligada ao Fel dl da invenção com, pelo menos um, segundo sítio de ligação através de, pelo menos, uma ligação peptídica. O gene que codifica o Fel dl da invenção, de um modo preferido, o fragmento de Fel dl, de um modo mais preferido um fragmento não mais comprido do que 50 aminoácidos, de um modo ainda mais preferido com menos de 30 aminoácidos, é ligado em grelha, internamente ou, de um modo preferido, à extremidade N- ou C-terminal do gene que codifica a proteína de revestimento da VLP. Formas de realização da utilização do antigénio da invenção para a proteína de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos, para uma proteína de revestimento de um vírus foram divulgadas no documento WO 2004/009124 página 62, linha 20 a página 68, linha 17. 40

Numa forma de realização preferida, um fragmento de Fel dl é fundido com a extremidade N- ou C-terminal de uma proteína de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos, do fago de ARN AP205. Numa outra forma de realização preferida, a proteína de fusão compreende ainda um espaçador, em que o referido espaçador está fundido com a proteína de revestimento, fragmentos ou mutantes da mesma, do AP205 e com um fragmento de Fel dl.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a composição compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente de uma partícula semelhante a vírus com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação ligado a, pelo menos, um Fel dl da invenção com, pelo menos um, segundo sítio de ligação através de, pelo menos, uma ligação covalente, de um modo preferido, a ligação covalente é uma ligação não peptídica. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o primeiro sítio de ligação compreende, ou, de um modo preferido, é um grupo amino, de um modo preferido, o grupo amino de um resíduo de lisina. Noutra forma de realização preferida da presente invenção, o segundo sítio de ligação compreende, ou, de um modo preferido, é um grupo sulfidrilo, de um modo preferido, um grupo sulfidrilo de uma cisteína.

Num forma de realização muito preferida da invenção, o, pelo menos um, primeiro sítio de ligação é um grupo amino, de um modo preferido, um grupo amino de um resíduo de lisina e o, pelo menos um, segundo sítio de ligação é um grupo sulfidrilo, de um modo preferido, um grupo sulfidrilo de uma cisteína.

Numa forma de realização preferida da invenção, o Fel dl da invenção é ligado à VLP por meio de reticulação química, tipicamente e de um modo preferido, utilizando uma unidade de 41 reticulação heterobifuncional. Em formas de realização preferidas, a unidade de reticulação heterobifuncional contém um grupo funcional que pode reagir com os primeiros sítios de ligação preferidos, de um modo preferido, com o grupo amino, de um modo mais preferido com os grupos amino do(s) resíduo (s) de lisina da VLP, e um outro grupo funcional que pode reagir com o segundo sítio de ligação preferido, i. e. um grupo sulfidrilo, de um modo preferido, de resíduo(s) de cisteína inerente(s) ou adicionado(s) artificialmente ao Fel dl da invenção e, opcionalmente, também tornados disponíveis para reacção por redução. Na técnica são conhecidas várias unidades de reticulação heterobifuncionais. Estas incluem as unidades de reticulação preferidas SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outras unidades de reticulação disponíveis, por exemplo, da Pierce Chemical Company, e que possuem um grupo funcional reactivo para grupos amino e um grupo funcional reactivo para grupos sulfidrilo. As unidades de reticulação supramencionadas levam todas à formação de uma ligação amida após reacção com o grupo amino e uma ligação tioéter com os grupos sulfidrilo. Outra classe de unidades de reticulação adequadas na prática da invenção é caracterizada pela introdução de uma ligação dissulfureto entre o Fel dl da invenção e a VLP após

acoplamento. As unidades de reticulação preferidas que fazem parte desta classe incluem, por exemplo, SPDP e Sulfo-LC-SPDP (Pierce) .

Numa forma de realização preferida, a composição da invenção compreende ainda uma unidade de ligação. A introdução de um segundo sítio de ligação no Fel dl da invenção é conseguida pela associação de uma unidade de ligação, de um modo preferido, contendo, pelo menos, um aminoácido adequado como 42 segundo sítio de ligação de acordo com as divulgações desta invenção. Por conseguinte, numa forma de realização preferida da presente invenção, uma unidade de ligação é associada ao Fel dl da invenção por meio de, pelo menos, uma ligação covalente, de um modo preferido, por, pelo menos, uma, tipicamente uma, ligação peptídica. De um modo preferido, a unidade de ligação compreende ou, alternativamente, consiste do segundo sítio de ligação. Numa outra forma de realização preferida, a unidade de ligação compreende um grupo sulfidrilo, de um modo preferido, de um resíduo de cisteína. Noutra forma de realização preferida, a unidade de ligação de aminoácidos é um resíduo de cisteína. A selecção de uma unidade de ligação dependerá da natureza do Fel dl da invenção, das suas propriedades bioquímicas, tal como pi, distribuição da carga e glicosilação. Em geral são preferidas unidades de ligação de aminoácidos flexíveis. Numa outra forma de realização preferida da presente invenção, a unidade de ligação consiste de aminoácidos, em que de um modo mais preferido a unidade de ligação consiste no máximo de 25, de um modo preferido, no máximo de 20, de um modo mais preferido no máximo de 15 aminoácidos. Numa forma de realização novamente preferida da invenção, a unidade de ligação de aminoácidos contém não mais do que 10 aminoácidos. As formas de realização preferidas da unidade de ligação são seleccionadas do grupo consistindo de: (a) CGG; (b) unidade de ligação de gama 1 N-terminal (e. g., CGDKTHTSPP, SEQ ID N°: 58); (c) unidade de ligação de gama 3 N-terminal (e. g. CGGPKPSTPPGSSGGAP, SEQ ID N°: 69); (d) regiões charneira de Ig; (e) unidades de ligação de glicina N-terminal (e. g. GCGGGG, SEQ ID N°: 59); (f) (G)kC(G)n com n=0-12 e k=0-5; (g) unidades de ligação de glicina-serina N-terminal ((GGGGS)n, n=l-3 com mais uma cisteína, (por exemplo, SEQ ID N°: 60, a qual corresponde a uma 43 forma de realizaçao em que n=l); (h) (G)kC(G)m(S)1(GGGGS)n com n=0-3, k=0-5, m=0- CM 1 O II 1—1 o 5-1 (por exemplo SEQ ID N°: 61, a qual corresponde a uma forma de realização em que n=l, k=l, 1=1 e m= 1) ; (i) GGC ; (k ) GGC-NH2; (1) unidade de ligação de gama 1 C-terminal (e. g. DKTHTSPPCG, SEQ ID N° : 62 ); (m) unidade de ligação de gama 3 C-terminal (e. g. PKPSTPPGSSGGAPGGCG, SEQ ID N° : 63); (n) unidades de ligação de glicina C-terminal (GGGGCG, SEQ ID N°: 64); (o) (G)nC(G)k com n=0-12 e k=0-5; (p) unidades de ligação de glicina-serina C-terminal ((SGGGG)n n=l-3 com mais uma cisteína, (por exemplo SEQ ID N°: 65, a qual corresponde a uma forma de realização em que n=l)); (q) (G) m(S)1(GGGGS)n(G)oC(G)k com n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, e o=0-8 (por exemplo SEQ ID N°: 66, a qual corresponde a uma forma de realização em que n=l, k=l, 1=1, o=l e m=l). Numa outra forma de realização preferida, a unidade de ligação é adicionada à extremidade N-terminal de Fel dl da invenção. Noutra forma de realização preferida da invenção, a unidade de ligação é adicionada à extremidade C-terminal de Fel dl da invenção.

As unidades de ligação preferidas de acordo com esta invenção são unidades de ligação de glicina (G)n contendo ainda um resíduo de cisteína como segundo sítio de ligação, tais como unidade de ligação de glicina N-terminal (GCGGGG) e unidade de ligação de glicina C-terminal (GGGGCG). Outras formas de realização preferidas são unidade de ligação de glicina-lisina C-terminal (GGKKGC, SEQ ID N°: 67) e unidade de ligação de glicina-lisina N-terminal (CGKKGG, SEQ ID N° : 68), unidades de ligação GGCG um GGC ou GGC-NH2 ("NH2" significa amidação) na extremidade C-terminal do péptido ou CGG na sua extremidade N-terminal. Em geral serão inseridos resíduos de glicina entre os aminoácidos volumosos e a cisteína a ser utilizada como 44 segundo sítio de ligação, para impedir o impedimento estérico potencial do aminoácido mais volumoso na reacção de acoplamento.

Numa forma de realização preferida, a unidade de ligação é fundida com a extremidade N-terminal da proteína de Fel dl ou fragmento de Fel dl. Numa outra forma de realização preferida, a unidade de ligação é GCGG. Noutra forma de realização preferida, a unidade de ligação é fundida com a extremidade C-terminal da proteína de Fel dl ou fragmento de Fel dl. Numa outra forma de realização preferida, a unidade de ligação é GGC. No caso da proteína de Fel dl ou fragmento de Fel dl consistir de duas cadeias polipeptídicas, essa proteína de Fel dl ou fragmento de Fel dl tem duas extremidades N-terminais e duas extremidades C-terminais. A unidade de ligação pode ser fundida com ambas as duas extremidades N-terminais ou com ambas as extremidades C-terminais. De um modo preferido, a unidade de ligação é fundida com apenas uma das duas extremidades N-terminais ou apenas uma das duas extremidades C-terminais. A ligação do Fel dl da invenção com a VLP utilizando uma unidade de reticulação heterobifuncional de acordo com os métodos preferidos descritos acima, permite o acoplamento do Fel dl da invenção com a VLP de um modo orientado. Outros métodos de ligação do Fel dl da invenção à VLP incluem métodos em que o Fel dl da invenção é reticulado com a VLP, utilizando a carbodiimida EDC, e NHS. 0 Fel dl da invenção também pode ser primeiro tiolado por reacção, por exemplo com SATA, SATP ou iminotiolano. 0 Fel dl da invenção, se necessário após desprotecção, pode ser depois acoplado à VLP como se segue. Após separação do reagente de tiolação em excesso, o Fel dl da invenção é feito reagir com a VLP, previamente activada com uma unidade de reticulação heterobifuncional compreendendo uma unidade reactiva de cisteína 45 e, portanto, apresentando, pelo menos, um ou vários grupos funcionais reactivos para residuos de cisteina, com a qual o Fel dl tiolado da invenção pode reagir, tal como descrito acima. Opcionalmente são incluídas pequenas quantidades de um agente de redução na mistura reaccional. Noutros métodos, o Fel dl da invenção é ligado à VLP, utilizando uma unidade de reticulação homobifuncional tal como glutaraldeido, DSG, BM[PE0]4, BS3, (Pierce) ou outras unidades de reticulação homobifuncionais conhecidas com grupos funcionais reactivo para grupos amina ou grupos carboxilo da VLP.

Noutras formas de realização da presente invenção, a composição compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente de uma partícula semelhante a vírus ligada ao Fel dl da invenção através de interacções químicas, em que, pelo menos, uma destas interacções não é uma ligação covalente. Por exemplo, a ligação da VLP ao Fel dl da invenção pode ser efectuada biotinilando a VLP e expressando o Fel dl da invenção como uma proteína de fusão de estreptavidina.

Uma ou várias moléculas de antigénio, i. e. Fel dl da invenção, podem ser ligadas a uma subunidade da VLP, de um modo preferido, das proteínas de revestimento de fago de ARN, de um modo preferido, através dos resíduos de lisina expostos das proteínas de revestimento da VLP de fago de ARN, se estericamente permitido. Uma característica específica das VLP de fago de ARN e, em particular, da VLP da proteína de revestimento de ζ)β é, deste modo, a possibilidade de acoplar vários antigénios por subunidade. Isto permite a produção de uma matriz de antigénio densa. 46

Em formas de realização muito preferidas da invenção, o Fel dl da invenção é ligado através de um resíduo de cisterna, que foi adicionado à extremidade N-terminal ou à extremidade C-terminal do Fel dl da invenção, ou um resíduo de cisteína natural dentro do Fel dl da invenção, aos resíduos de lisina das proteínas de revestimento das VLP de fago de ARN e, em particular, à proteína de revestimento de ζ)β.

Como descrito acima, quatro resíduos de lisina encontram-se expostos na superfície da VLP da proteína de revestimento de ζ)β. Tipicamente e de um modo preferido, estes resíduos estão derivatizados após reacção com uma molécula de unidade de reticulação. No caso de nem todos os resíduos de lisina expostos poderem ser acoplados a um antigénio, os resíduos de lisina que reagiram com a unidade de reticulação são deixados com uma molécula de unidade de reticulação ligada ao grupo amino ε após o passo de derivatização. Isto leva ao desaparecimento de uma ou várias cargas positivas, o que pode ser prejudicial para a solubilidade e estabilidade da VLP. Ao substituir alguns dos resíduos de lisina por argininas, como nos mutantes da proteína de revestimento de ζ)β divulgados, a requerente impediu o desaparecimento excessivo de cargas positivas, uma vez que os resíduos de arginina não reagem com as unidades de reticulação preferidas. Além do mais, a substituição dos resíduos de lisina por resíduos de arginina pode levar a matrizes de antigénio mais definidas, já que estão disponíveis menos sítios para reacção com o antigénio.

Por conseguinte, os resíduos de lisina expostos foram substituídos por argininas nos seguintes mutantes da proteína de revestimento de ζ)β: 0β-240 (Lysl3-Arg; SEQ ID N° : 15), 0β-250 (Lys 2-Arg, Lysl3-Arg; SEQ ID N°: 17), 0β-259 (Lys 2-Arg,

Lysl6-Arg; SEQ ID N° : 19) e 0β-251; (Lysl6-Arg, SEQ ID N° : 18). Numa outra forma de realização, a requerente divulga uma proteína de revestimento mutante de ζ)β com um resíduo de lisina adicional 0β-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID N°: 16), adequada para obter matrizes de antigénios ainda de maior densidade.

Numa forma de realização preferida da invenção, a VLP da invenção é produzida de forma recombinante por um hospedeiro e em que a referida VLP está essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro. Numa outra forma de realização preferida, a composição compreende ainda, pelo menos, uma macromolécula polianiónica ligada, de um modo preferido, empacotada dentro ou incluída na VLP. Ainda numa outra forma de realização preferida, a macromolécula polianiónica é poli(ácido glutâmico) e/ou poli(ácido aspártico).

Essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro: A expressão "essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro" como aqui utilizada, refere-se à quantidade de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro, compreendidos pela VLP, quantidade essa que é tipicamente e, de um modo preferido, inferior a 30 pg, de um modo preferido, inferior a 20 pg, de um modo mais preferido inferior a 10 pg, de um modo ainda mais preferido inferior a 8 ug, de um modo ainda mais preferido inferior a 6 pg, de um modo ainda mais preferido inferior a 4 pg, de um modo muito preferido inferior a 2 pg, por mg da VLP. Hospedeiro, como utilizado no contexto supramencionado, refere-se ao hospedeiro em que a VLP é produzida de forma recombinante. Os métodos convencionais de determinação da quantidade de ARN, 48 de um modo preferido, ácidos nucleicos, são conhecidos do especialista na técnica. 0 método típico e preferido para determinar a quantidade de ARN, de um modo preferido, ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção é descrito no Exemplo 17 do documento WO 2006/037787. Tipicamente, e de um modo preferido, são utilizadas condições idênticas, semelhantes ou análogas para determinar a quantidade de ARN, de um modo preferido, ácidos nucleicos, das composições da invenção compreendendo VLP diferentes de ζ)β. As modificações das condições eventualmente necessárias estão dentro do conhecimento do especialista na técnica. Tipicamente e de um modo preferido, o valor numérico das quantidades determinadas deve ser entendido como compreendendo valores possuindo um desvio de ± 10%, possuindo, de um modo preferido, um desvio de ± 5%, do valor numérico indicado.

Macromolécula polianiónica: A expressão "macromolécula polianiónica", como aqui utilizada, refere-se a uma molécula de massa molecular relativa alta, a qual compreende grupos repetitivos de carga negativa, cuja estrutura compreende essencialmente a repetição múltipla de unidades derivadas, real ou conceptual, de moléculas de massa molecular relativa baixa. Uma macromolécula polianiónica deve ter um peso molecular de, pelo menos, 2000 Dalton, de um modo mais preferido de, pelo menos, 3000 Dalton e de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, 5000 Dalton. A expressão "macromolécula polianiónica" como aqui utilizado refere-se, tipicamente e de um modo preferido, a uma molécula que não é capaz de activar receptores do tipo Toll. Assim, tipicamente e de um modo preferido, a expressão "macromolécula polianiónica" exclui ligandos dos receptores do tipo Toll, e de um modo ainda mais preferido, além disso, exclui substâncias imunoestimulantes tais como ligandos 49 dos receptores do tipo Toll, ácidos nucleicos imunoestimulantes e lipopolissacáridos (LPS). De um modo mais preferido, a expressão "macromolécula polianiónica" como aqui utilizada, refere-se a uma molécula que não é capaz de induzir a produção de citocinas. De um modo ainda mais preferido, a expressão "macromolécula polianiónica" exclui substâncias imunoestimulantes. A expressão "substância imunoestimulante", como aqui utilizada, refere-se a uma molécula que é capaz de induzir e/ou melhorar a resposta imunológica especificamente contra o antigénio compreendido na presente invenção. ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro: A expressão "ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro" ou a expressão "ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro, com estrutura secundária", como aqui utilizada, refere-se ao ARN, ou, de um modo preferido, ácidos nucleicos, os quais são originariamente sintetizados pelo hospedeiro. No entanto, o ARN, de um modo preferido, ácidos nucleicos, pode sofrer alterações químicas e/ou físicas durante o procedimento de redução ou eliminação da quantidade de ARN, de um modo preferido, ácidos nucleicos, tipicamente e de um modo preferido, por meio dos métodos inventivos, por exemplo, o tamanho do ARN, de um modo preferido, ácidos nucleicos, pode ser encurtado ou a estrutura secundária do mesmo pode ser alterada. No entanto, esse mesmo ARN ou ácidos nucleicos resultantes é ainda considerado como ARN do hospedeiro, ou ácidos nucleicos do hospedeiro.

Os métodos para determinar a quantidade de ARN e para reduzir a quantidade de ARN compreendida pela VLP foram divulgados no documento W02006/037787. A redução ou eliminação 50 da quantidade de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácido nucleico do hospedeiro, minimiza ou reduz as respostas indesejadas de células T, tais como resposta inflamatória de células T e resposta citotóxica de células T, e outros efeitos secundários indesejados, tal como febre, mantendo ao mesmo tempo uma resposta de anticorpos forte especificamente contra o Fel dl.

Numa forma de realização preferida, esta invenção proporciona um método de preparação das composições da invenção e VLP de um bacteriófago de ARN - Fel dl da invenção, em que a referida VLP é produzida de forma recombinante por um hospedeiro e em que a referida VLP está essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro, compreendendo os passos de: a) produzir de forma recombinante uma partícula semelhante a virus (VLP) com, pelo menos um, primeiro sitio de ligação por um hospedeiro, em que a referida VLP compreende proteínas de revestimento, variantes ou os seus fragmentos, de um bacteriófago de ARN; b) desmontar a referida partícula semelhante a vírus nas referidas proteínas de revestimento, variantes ou os seus fragmentos, do referido bacteriófago de ARN; c) purificar as referidas proteínas de revestimento, variantes ou os seus fragmentos; d) remontar as referidas proteínas de revestimento purificadas, variantes ou os seus fragmentos, do referido bacteriófago de ARN numa partícula semelhante a vírus, em que a referida partícula semelhante a vírus está essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro; e e) ligar, pelo menos, um antigénio da invenção com, pelo menos um, segundo sítio de ligação à referida VLP obtida do passo (d). Numa outra forma de realização preferida, a remontagem das referidas proteínas de revestimento purificadas, variantes ou os seus 51 fragmentos, é efectuada na presença de, pelo menos, uma macromolécula polianiónica.

Numa forma de realização preferida, a composição da invenção compreende ainda, pelo menos, uma substância imunoestimulante capaz de induzir e/ou melhorar uma resposta imunológica. De um modo preferido, a substância imunoestimulante é um ligando do receptor do tipo Toll, de um modo preferido, seleccionado do grupo consistindo de: (a) ácidos nucleicos imunoestimulantes; (b) peptidoglicanos; (c) lipopolissacáridos; (d) ácidos lipoteicónicos; (e) compostos de imidazoquinolina; (f) flagelinas; (g) lipoproteinas; (h) moléculas orgânicas imunoestimulantes; (i) oligonucleótidos contendo CpG não metilado; e (j) quaisquer misturas das substância de (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , (h) e (i) .

Numa outra forma de realização preferida, o ácido nucleico imunoestimulante é, de um modo preferido, seleccionado do grupo consistindo de: (a) um ácido nucleico de origem bacteriana; (b) um ácido nucleico de origem virai; (c) um ácido nucleico compreendendo o motivo CpG não metilado; (d) um ARN de cadeia dupla; (e) um ARN de cadeia simples; e (g) um ácido nucleico isento do motivo CpG não metilado. Os ácidos nucleicos imunoestimulantes que não contêm um motivo CpG não metilado foram divulgados na técnica anterior, por exemplo no documento WOOl/22972. A expressão "ácido nucleico", como aqui utilizada, refere-se a uma molécula constituída por monómeros linearmente ligados de forma covalente (nucleótidos). Este indica uma cadeia molecular de nucleótidos e não se referem a um tamanho especifico do produto. Assim, os oligonucleótidos estão incluídos dentro da definição de ácido nucleico. A ligação entre os nucleótidos é tipicamente e, de um modo preferido, uma 52 ligação de fosfodiéster. Os ácidos nucleicos compreendendo modificações de ligações, por exemplo, ligação de fosforotioato, também estão abrangidos pela presente invenção.

Numa forma de realização preferida, a substância imunoestimulante é misturada com a VLP recombinante. Noutro outra forma de realização preferida, a substância imunoestimulante é ligada, de um modo preferido, empacotada dentro da VLP da invenção.

As descrições detalhadas de substância imunoestimulante, particularmente ácido nucleico imunoestimulante, mais particularmente oligonucleótidos compreendendo CpG não metilado foram divulgadas nos documentos WO 03/024480, 03/024481 e WO 2004/084940. Os métodos de mistura das substâncias imunoestimulantes com a VLP-antigénio foram divulgados no documento WO 03/024480. Os métodos de empacotamento das substâncias imunoestimulantes dentro da VLP foram divulgados no documento WO 03/024481. A VLP pode geralmente induzir e/ou melhorar o sistema imunitário. No entanto, a expressão "substância imunoestimulante", como utilizado no contexto deste pedido, refere-se a uma substância imunoestimulante que não é a VLP utilizada nas composições da invenção, e não em adição à referida VLP. A inclusão de substâncias imunoestimulantes, de um modo preferido, ácidos nucleicos imunoestimulantes na composição da invenção para conduzir as respostas imunológicas para respostas Thl e desse modo suprimir as respostas Th2. 53

Num aspecto, a invenção proporciona uma vacina compreendendo a composição da invenção. Num aspecto, a invenção proporciona uma vacina compreendendo a composição da invenção e um tampão adequado. Numa forma de realização preferida, a composição de vacina compreende ainda, pelo menos, um adjuvante. A administração do, pelo menos, um adjuvante pode aqui ocorrer antes, simultaneamente ou após a administração da composição da invenção. 0 termo "adjuvante" como aqui utilizado refere-se a estimulantes não específicos da resposta imunológica ou substâncias que permitem a geração de um depósito no hospedeiro, o qual quando combinado com a vacina e composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção pode proporcionar uma resposta imunológica ainda mais reforçada.

Noutra forma de realização preferida, a composição de vacina é desprovida de adjuvante. Uma característica vantajosa da presente invenção é a alta imunogenicidade da composição, mesmo na ausência de adjuvantes. 0 evitar utilizar adjuvantes pode reduzir uma possível ocorrência de efeitos secundários relacionados com a utilização de adjuvantes. Assim, a administração da vacina da invenção a um doente ocorrerá, de um modo preferido, sem administrar o, pelo menos, um adjuvante ao mesmo doente antes, simultaneamente ou após a administração da vacina. A invenção divulga ainda um método de imunização compreendendo administrar a vacina da presente invenção a um humano e mamífero não humano, tal como cão ou gato. Sem pretender limitar a presente invenção pela teoria, a injecção da composição de vacina da invenção a um gato pode neutralizar o Fel dl e, por conseguinte, reduzir a quantidade de Fel dl na saliva do gato. 54 A vacina pode ser administrada por vários métodos conhecidos na técnica, mas será normalmente administrada por injecção, infusão, inalação, administração oral ou outros métodos físicos adequados. Alternativamente, os conjugados podem ser administrados por via intramuscular, intravenosa, transmucosa, transdérmica, intranasal, intraperitoneal ou subcutânea. Os componentes de conjugados para administração incluem soluções e suspensões aquosas (e. g., soro fisiológico) ou não aquosas estéreis. Os exemplos de solventes não aquosos são o propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tal como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tal como oleato de etilo. Podem ser utilizados veículos ou pensos oclusivos para aumentar a permeabilidade na pele e melhorar a absorção do antigénio.

As vacinas da invenção são referidas como sendo "farmacologicamente aceitáveis" se a sua administração pode ser tolerada por um indivíduo receptor. Além disso, as vacinas da invenção serão administradas numa "quantidade terapeuticamente eficaz" (i. e., uma quantidade que produz um efeito fisiológico desejado) . A natureza ou tipo de resposta imunológica não é um factor limitante desta divulgação. Sem pretender limitar a presente invenção pela seguinte explicação mecanicista, a vacina da invenção pode induzir anticorpos, presumivelmente dos subtipos de IgG, que se ligam ao Fel dl e, deste modo, impedem que o Fel dl seja visto pela IgE ligada aos mastócitos e basófilos. Alternativa ou simultaneamente, a composição da presente invenção conduz as respostas imunológicas para respostas Thl, suprimindo o desenvolvimento de respostas Th2 e, desse modo, a produção de anticorpos de IgE, um componente principal nas reacções alérgicas. 55

Num aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo a composição como ensinada na presente invenção e um veiculo farmacêutico aceitável. Quando a vacina da invenção é administrada a um indivíduo, esta pode estar numa forma que contém sais, tampões, adjuvantes ou outras substâncias que são desejáveis para melhorar a eficácia do conjugado. Os exemplos de materiais adequados para serem utilizados na preparação de composições farmacêuticas são proporcionados em numerosas fontes incluindo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. , (1990) ) . A invenção ensina um processo para produzir a composição da invenção compreendendo os passos de: (a) proporcionar uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sitio de ligação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus ou uma partícula de vírus; (b) proporcionar, pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o referido, pelo menos, antigénio é uma proteína de Fel dl ou um fragmento de Fel dl, e (c) combinar a referida partícula central e o referido, pelo menos, um antigénio para produzir uma composição, em que o referido, pelo menos, um antigénio e a referida partícula central estão ligados através do primeiro e do segundo sítios de ligação.

Numa outra forma de realização preferida, o passo de proporcionar a partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação compreende ainda os passos de: (a) desmontar a referida partícula central nas proteínas de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos, da referida partícula central; (b) purificar as referidas proteínas de revestimento, mutantes ou os seus fragmentos; (c) remontar as referidas proteínas de 56 revestimento purificadas, mutantes ou os seus fragmentos, da referida partícula central, em que a referida partícula central está essencialmente isenta de ARN do hospedeiro, de um modo preferido, ácidos nucleicos do hospedeiro. Ainda numa outra forma de realização preferida, a remontagem das referidas proteínas de revestimento purificadas é efectuada na presença de, pelo menos, uma macromolécula polianiónica ou, pelo menos, um ácido nucleico imunoestimulante. É ainda divulgado um método de utilização das composições da invenção para prevenir e/ou tratar alergia a gatos num mamífero, em que, de um modo preferido, o referido mamífero é um humano ou um cão.

Num aspecto, a invenção ensina a utilização da composição da invenção como um medicamento. Noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização da composição da invenção para o fabrico de um medicamento para o tratamento de alergia a gatos num mamífero, em que, de um modo preferido, o referido mamífero é um humano ou um cão.

Num aspecto, esta invenção proporciona uma proteína de fusão de Fel dl compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl fundidas através de um espaçador de aminoácidos, o qual liga a extremidade N-terminal de uma cadeia com a extremidade C- -terminal da outra cadeia, em que o referido espaçador de aminoácidos consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 10-30, de um modo preferido, 10-25, de um modo preferido, 10-20, de um modo preferido, 13-20, de um modo preferido, 15-20, de um modo preferido, 13-17, de um modo preferido, 15-17 resíduos de aminoácido, e em que a referida proteína de fusão não é uma proteína de fusão compreendendo a 57 cadeia 1 da SEQ ID N°: 22 fundida através de (GGGGS)3 com a extremidade N-terminal da cadeia 2 da SEQ ID N°: 23, 25 ou 26 e em que a referida proteína de fusão divulgada é expressa no sistema de expressão de baculovírus. 0 documento W02004094639 divulga uma proteína de fusão de Fel dl ligando a cadeia 1 e a cadeia 2 com uma unidade de ligação seleccionada de uma ligação carbono-azoto e um péptido curto, i. e. possuindo desde 1 a 9, de um modo preferido, 1 a 5, particular, de um modo preferido, 1 a 3 aminoácidos. Afirma, ainda, que surpreendentemente uma ligação ou um péptido curto não induz restrições ou desdobramento significativos. No entanto, o documento W02004094639 falha em divulgar unidades de ligação maiores do que 9 aminoácidos. 0 documento WO 00/20032 divulga o Fel dl recombinante expressado em baculovírus compreendendo a cadeia 1 e a cadeia 2 expressadas em série e ligadas em conjunto por uma unidade de ligação de glicina/serina (GGGGS)3. 0 documento WO 00/20032 também refere que a imunorreactividade do rFel dl para o anticorpo de IgG e IgE é dramaticamente melhorada expressando o alergénio em baculovírus, por comparação com o alergénio expresso em E. coli. A proteína de fusão de Fel dl da invenção pode ser produzida num sistema de expressão procariótico ou num sistema de expressão eucariótico, tal como um sistema de baculovírus. Numa forma de realização preferida, a referida proteína de fusão de Fel dl da invenção é produzida a partir de E. coli.

Numa forma de realização preferida, o espaçador compreendido pela proteína de fusão de Fel dl da invenção 58 consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 resíduos de aminoácido.

Numa forma de realização preferida, o espaçador compreendido pela proteína de fusão de Fel dl consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo a repetição GGGGS 2, 3 ou 4 vezes.

Numa forma de realização preferida, a cadeia 2 de Fel dl está na extremidade N-terminal da proteína de fusão da invenção.

Noutra forma de realização preferida, a cadeia 1 de Fel dl está na extremidade N-terminal da proteína de fusão da invenção. Numa outra forma de realização preferida, a proteína de fusão é produzida a partir de E. coli.

Numa forma de realização muito preferida, a proteína de fusão de Fel dl da invenção compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N°: 54; (b) SEQ ID N°: 55; e (c) SEQ ID N°: 57. A invenção proporciona ainda a sequência de nucleótidos que codifica a proteína de fusão de Fel dl da invenção. Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona a sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de fusão da invenção seleccionada do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N° : 54; (b) SEQ ID N°: 55; e (c) SEQ ID N°: 57. Numa outra forma de realização preferida, a proteína de fusão de Fel dl da invenção é produzida em E. coli. Numa outra forma de realização preferida, a proteína de fusão de Fel dl da invenção compreende ou, alternativamente, consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 57, em que a referida proteína de fusão da invenção é produzida em E. coli. 59 É ainda divulgada a utilização da proteína de fusão de Fel dl como aqui descrita para o diagnóstico e tratamento de alergia a gatos. EXEMPLOS EXEMPLO 1 invenção por macromoléculas

Preparaçao de VLP de Οβ da desmontagem/remontagem na presença de polianiónicas diferentes resultando em VLP de Οβ remontadas (A) Desmontagem da VLP de Οβ da técnica anterior

Foram reduzidos 45 mg de VLP de Οβ da técnica anterior (2,5 mg/mL, como determinado por análise de Bradford) em PBS (Fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) purificada de lisado de E. coli, com DTT 10 mM durante 15 min à temperatura ambiente sob condições de agitação. Foi então adicionado cloreto de magnésio até uma concentração final de 0,7 M e a incubação foi prosseguida durante 15 min à temperatura ambiente sob condições de agitação, o que levou à precipitação do ARN da célula hospedeira encapsulado. A solução foi centrifugada durante 10 min a 4000 rpm a 4 °C (Eppendorf 5810 R, num rotor de ângulo fixo A-4-62 utilizado em todos os passos subsequentes) para remover o ARN precipitado da solução. O sobrenadante, contendo a proteína de revestimento de Οβ dimérica libertada, foi utilizado nos passos de purificação cromatográfica. 60 (B) Purificação da proteína de revestimento de ζ)β por cromatografia de troca catiónica e por cromatografia de exclusão molecular 0 sobrenadante da reacção de desmontagem, contendo a proteína de revestimento dimérica, proteínas da célula hospedeira e ARN residual da célula hospedeira, foi diluído a 1:15 em água para ajustar a condutividade abaixo de 10 mS/cm e foi transferido para uma coluna de SP-Sepharose FF (xkl6/20, 6 mL, Amersham Bioscience). A coluna foi previamente equilibrada com tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7. A eluição da proteína de revestimento ligada foi conseguida por um gradiente descontínuo até fosfato de sódio 20 mM / cloreto de sódio 500 mM e a proteína foi recolhida num volume de fracção de aprox. 25 mL. A cromatografia foi realizada à temperatura ambiente com um caudal de 5 mL/min e a absorvância foi seguida a 260 nm e 280 nm.

No segundo passo, a proteína de revestimento de ζ)β isolada (a fracção eluída da coluna de troca catiónica) foi transferida (em duas corridas) para uma coluna Sephacryl S-100 HR (xk26/60, 320 mL, Amersham Bioscience), equilibrada com fosfato de sódio 20 mM / cloreto de sódio 250 mM; pH 6,5. A cromatograf ia foi realizada à temperatura ambiente com um caudal de 2,5 mL/min e a absorvância foi seguida a 260 nm e 280 nm. Foram recolhidas fracções de 5 mL. (Cl) Remontagem da VLP de ζ)β por diálise A proteína de revestimento de ζ)β purificada (2,2 mg/mL em fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5), uma macromolécula polianiónica 61 (2 mg/mL em água), ureia (7,2 M em água) e DTT (0,5 M em água) foram misturados às concentrações finais de 1,4 mg/mL de proteína de revestimento, 0,14 mg/mL da respectiva macromolécula polianiónica, ureia 1 M e DTT 2,5 mM. As misturas (1 mL cada) foram submetidas a diálise durante 2 dias a 5 °C em TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8, utilizando membranas com 3,5 kDa de corte. As macromoléculas polianiónicas foram: poli(ácido galacturónico) (25000-50000, Fluka), sulfato de dextrano (PM 5000 e 10000, Sigma), poli(ácido L-aspártico) (PM 11000 e 33400, Sigma), poli(ácido L-glutâmico) (PM 3000, 13600 e 84600, Sigma) e ARNt de levedura de padeiro e gérmen de trigo. (C2) Remontagem da VLP de ζ)β por diafiltração

Foram misturados 33 mL de proteína de revestimento de ζ)β purificada (1,5 mg/mL em fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5, NaCl 250 mM) com água e ureia (7,2 M em água), NaCl (5 M em água) e poli(ácido L-glutâmico) (2 mg/mL em água, PM: 84600). O volume da mistura foi de 50 mL e as concentrações finais dos componentes foram 1 mg/mL da proteína de revestimento, NaCl 300 mM, ureia 1,0 M e 0,2 mg/mL de poli (ácido L-glutâmico). A mistura foi então diafiltrada à temperatura ambiente, contra 500 mL de TrisHCl 20 mM, pH 8, NaCl 50 mM, aplicando um caudal transversal de 10 mL/min e um caudal de permeado de 2,5 mL/min, num aparelho de filtração de fluxo tangencial utilizando um cartucho de membrana Pellicon XL (Biomax 5K, Millipore). 62 EXEMPLO 2

Montagem in vitro de VLP de AP205 (A) Purificação da proteína de revestimento de AP205

Desmontagem: Foram misturados 20 mL de solução de VLP de AP205 (1,6 mg/mL em PBS, purificada de extracto de E.coli) com 0,2 mL de DTT 0,5 M e incubados durante 30 min à temperatura ambiente. Foram adicionados 5 mL de NaCl 5 M e a mistura foi então incubada durante 15 min a 60 °C, originando a precipitação das proteínas de revestimento reduzidas com DTT. A mistura turva foi centrifugada (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20 °C) e o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi disperso em 20 mL de Ureia 1 M/ Citrato de Na 20 mM, pH 3,2. Depois de agitar durante 30 min à temperatura ambiente, a dispersão foi ajustada a pH 6,5 por adição de Na2HPC>4 1,5 M e em seguida centrifugada (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20 °C) para obter o sobrenadante contendo proteína de revestimento dimérica.

Cromatografia de troca catiónica: 0 sobrenadante (ver acima) foi diluído com 20 mL de água para ajustar a uma condutividade de aprox. 5 mS/cm. A solução resultante foi transferida para uma coluna de 6 mL de SP Sepharose FF (Amersham Bioscience) a qual foi previamente equilibrada com tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5. Depois de transferir, a coluna foi lavada com 48 mL de tampão de fosfato de sódio 2 0 mM, pH 6,5, seguida de eluição da proteína de revestimento ligada por um gradiente linear até NaCl 1 M ao longo de 20 volumes de coluna. As fracções do pico principal foram misturadas e analisadas por SDS-PAGE e espectroscopia de UV. De acordo com a 63 SDS-PAGE, a proteína ________________ essencialmente pura de outras contaminações proteicas. De acordo com a espectroscopia de UV, a concentração da proteína era de 0,6 mg/mL (quantidade total 12 mg), admitindo que 1 unidade de A280 reflecte 1,01 mg/mL de proteína de revestimento de AP205. Além disso, o valor de A280 (0,5999) relativamente ao valor de A260 (0,291) é 2, indicando que a preparação está essencialmente isenta de ácidos nucleicos. de revestimento isolada estava (B) Montagem das VLP de AP205

Montagem na ausência de qualquer macromolécula polianiónica: A fracção de proteína eluída do processo acima foi diafiltrada e concentrada por TFF até uma concentração de proteína de 1 mg/mL em fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5. Foram misturados 500 pL daquela solução com 50 pL de solução de NaCl 5 M e incubados durante 48 h à temperatura ambiente. A formação de VLP remontadas na mistura foi mostrada por SDS-PAGE não redutora e por HPLC de exclusão molecular. Foi utilizada uma coluna TSKgel G5000 PWXL (Tosoh Bioscience), equilibrada com fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, para a análise por HPLC.

Montagem na presença de poli(ácido glutâmico): Foram misturados 3 75 pL de proteína de revestimento de AP205 purificada (1 mg/mL em fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5) com 50 pL de solução-mãe de NaCl (5 M em água), 50 pL de solução-mãe de poli(ácido glutâmico) (2 mg/mL em água, PM: 86400, Sigma) e 25 pL de água. A mistura foi incubada durante 48 h à temperatura ambiente. A formação de VLP remontada na mistura foi mostrada por SDS-PAGE não redutora e por HPLC de exclusão molecular. A proteína de revestimento na mistura foi quase completamente incorporada nas VLP, mostrando uma eficiência de montagem superior à da proteína de revestimento de AP205 montada na ausência de qualquer macromolécula polianiónica. EXEMPLO 3

Clonagem de proteínas de fusão de Fel dl

Os genes que codificam a cadeia 1 e a cadeia 2 de Fel dl, respectivamente, foram preparados por amplificação por PCR utilizando iniciadores de ADN sobrepostos, como se mostra abaixo. São indicados os iniciadores directos (F) e inversos (R). Os fragmentos foram ligados no vector pCRII-TOPO (Invitrogen) e transformados em XLl-Blue. As inserções da cadeia 1 e da cadeia 2 de Fel dl foram verificados quanto à sequência.

Sequência do Ini ciador 1F: SEQ ID N° : 34; Sequência do Ini ciador 2R: SEQ ID N° : 35 Sequência do Ini ciador 3F: SEQ ID N° : 36 Sequência do Ini ciador 4R: SEQ ID N° : 37 Sequência do Ini ciador 5F: SEQ ID N° : 38 Sequência do Ini ciador 6R: SEQ ID N° : 39 Sequência do Ini ciador 7F : SEQ ID N° : 40 Sequência do Ini ciador 8R: SEQ ID N° : 41 Sequência do Ini ciador 9F: SEQ ID N° : 42 Sequência do Ini ciador 10R : SEQ ! ID N° : 43 65

Construções de fusão de Fel dl: FELD1 refere-se à proteína com a cadeia 2 na extremidade N-terminal fundida directamente com a cadeia 1. A sequência de nucleótidos que codifica a FELD 1 foi criada por PCR de extensão de sobreposição por splicing (SOE) utilizando a unidade de ligação do iniciador 11 (SEQ ID N°: 44). FD12 refere-se à proteína com a cadeia 1 na extremidade N-terminal fundida directamente com a cadeia 2. A sequência de nucleótidos que codifica a FD12 foi criada por PCR de extensão de sobreposição por splicing (SOE) utilizando os iniciadores 12-1 (SEQ ID N°: 45), 12-3 (SEQ ID N°: 46) e 12-2-1 (SEQ ID N°: 47). FELD1-1Oaa e FELDl-15aa referem-se a proteínas com a cadeia 2 na extremidade N-terminal fundida através de um espaçador de 10 (GGGGS)2 ou 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, com a cadeia 1 na extremidade C-terminal. O plasmídeo que contém a sequência de nucleótidos que codifica a FELD 1 foi utilizado como cadeia molde para criar o espaçador de 10 aminoácidos ou 15 aminoácidos por mutagénese por PCR inversa (IPCRM) . Para o espaçador 1-15 foram utilizados dois iniciadores (iniciador l-10aa, SEQ ID N° : 48 e iniciador 2-5aa, SEQ ID N° : 49). Para o espaçador 1-10 dois iniciadores (iniciador l-5aa, SEQ ID N°: 50 e iniciador 2-5aa). O fragmento de PCR resultante foi circularizado por ligação. Este é resistente a digestão por Dpn I, a qual reconhece apenas sequências contendo adenina metilada, enquanto que a cadeia molde de plasmídeo foi digerida por Dpn I. 66 FD12-10aa e FD12-15aa referem-se a proteínas com a cadeia 1 na extremidade N-terminal fundida através de um espaçador de 10 (GGGGS)2 ou 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, com a cadeia 2 na extremidade C-terminal. As fusões FD12-10aa e FD12-15aa foram produzidas de forma análoga à descrita acima. Para o espaçador de 15 aminoácidos foram utilizados o iniciador FD2-10aa (SEQ ID N°: 51) e o iniciador FD1-5 aa (SEQ ID N°: 52). Para o espaçador de 10 aminoácidos foram utilizados os iniciadores FDl-5aa e FD2-5 aa (SEQ ID N°: 53). EXEMPLO 4

Expressão bacteriana e purificação de proteínas de fusão de Fel dl marcadas com His

As sequências de nucleótidos que codificam várias construções de fusão de Fel dl como descritas no EXEMPLO 3 foram subclonadas num sistema de expressão baseado em T7 pET-42T(+), modificado a partir do plasmídeo pET-42a(+)(Novagen). A extremidade C-terminal das construções de fusão foram fundidas com uma sequência de marcação de His seguida de GGC, uma unidade de ligação de aminoácidos contendo cisteína como o segundo sítio de ligação. Por conseguinte, as construções resultantes são designadas adicionando "-HC" no final.

As FELD1-HC, FELDI-1Oaa-HC e FELDl-15aa-HC e FD12-15aa-HC foram expressadas e purificadas como se segue: O plasmídeo foi transformado em BL21 (DE3). A expressão foi induzida adicionando IPTG 1 mM à cultura a uma OD600 de ap. 1. A cultura foi multiplicada durante mais 20 horas a 20°C, colhida e submetida a 67 lise por sonicaçao em tampao de lise nativo (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazole 10 mM, pH 8,0). 0 lisado bacteriano clarificado foi trazido até 50 mL com tampão de lise nativo. Foram adicionados 5 mL de agarose de niquel-ácido nitrilotracético (Ni-NTA) (Qiagen) e o lisado foi incubado por inversão durante uma hora a 4 °C. As proteínas ligadas não especificamente foram removidas lavando 4 vezes em tampão de lise nativo. A proteína ligada foi eluída por ressuspensão da agarose de Ni-NTA em 2 mL de tampão de eluição (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, pH 8,0). EXEMPLO 5

Ligações dissulfureto por dobragem oxidativa em proteínas de fusão de Fel dl purificadas A FELD1-HC purificada por afinidade em Ni2+ consiste de uma variedade de espécies com pontes de dissulfureto misturadas desde 15 kD até 20 kD. A dobragem nativa da FELDl-HC foi conseguida por remodelação intramolecular das ligações dissulfureto com glutationa oxidada (GSSG, Applichem) e glutationa reduzida (GSH, Applichem) numa proporção molar de 1:1. A reacção foi realizada durante 24 horas imediatamente após eluição da FELDl no tampão de eluição adicionando GSSG 2,5 mM e GSH 2,5 mM à temperatura ambiente. A FELDl-HC redobrada apresentou uma única banda a um peso molecular de 15 kD em condições não redutoras (FIG. 1, o primeiro painel, coluna 2). Os potenciais grupos sulfidrilo livres da FELDl-HC foram alquilados utilizando iodoacetamida (Sigma). As sondas foram 68 tratadas com iodoacetamida 5 mM em bicarbonato de amónio 20 mM a pH 8,0 durante 15 minutos à temperatura ambiente. A FELD1-HC redobrada foi ainda purificada até à homogeneidade por cromatografia de exclusão molecular (SEC) (Superdex 75 pg, Amersham Pharmacia Biosciences) equilibrada em PBS.

As FELDl-lOaa-HC e FELDl-15aa-HC foram renaturadas essencialmente pelo mesmo método como descrito acima (FIG. 1, os dois painéis centrais). A dobragem nativa da FD12-15aa-HC foi conseguida de forma análoga por remodelação das ligações dissulfureto com glutationa oxidada e glutationa reduzida numa proporção molar de 10:1. Após eluição, a FD12-15aa foi diluída vinte vezes em tampão de redobragem de FD12-15aa (Tris-Cl 50 mM, pH 8,5, NaCl 240 mM, KC1 10 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de PEG 3 550, GSH 1 mM, GSSH 0,1 mM) e incubada a 4°C durante 24 horas. A FD12-15aa redobrada apresentou uma única banda a um peso molecular de 20 kD que compara com a forma reduzida que corre a 23 kD (FIG. 1, último painel). EXEMPLO 6

Proteínas de fusão de Fel dl são reconhecidas por anticorpos monoclonais específicos para o epítopo

Foi medida a ligação das proteínas de fusão de Fel dl em comparação com a Fel dl natural (nFel dl) aos anticorpos monoclonais específicos para o epítopo (mAB) por um ELISA em 69 sanduíche utilizando o kit ELISA para Fel dl (6F9/3E4) da Indoor biotechnologies (Cardiff, UK).

Resumidamente, o mAB anti-Fel dl 6F9 fornecido como uma solução-mãe a 2 mg/mL foi diluído a 1:1000 em tampão de carbonato-bicarbonato 50 mM, pH 9,6. Os poços microtítulo foram revestidos com 100 pL do mAB 6F9 diluído por poço a 4 °C de um dia para o outro. As placas foram lavadas três vezes com PBS-0,05% de Tween20 (PBS-T) e, em seguida, bloqueadas com 100 pL de tampão de bloqueio (1% de BSA (Sigma) em PBS-T). Em seguida, os poços microtítulo foram incubados durante uma hora com 100 pL de proteínas de fusão de Fel dl ou padrão de nFel dl (Indoors technologies; UK) utilizando diluições por desdobramento desde 80-0,16 ng/mL. A referência de nFel dl foi sub-padronizada a partir da referência de pêlo de gato CBER E10, a qual contém 13,47 U/mL de Fel dl (1 unidade = 4 mg de proteína).

As placas foram em seguida lavadas e foram adicionados 100 pL de anticorpo mAB 3E4 anti-Fel dl biotinilado diluído (1:1000 em 1% de BSA/PBS-T) e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T utilizando 100 pL de Estreptavidina-Peroxidase (Sigma S5512, 0,25 mg reconstituídos em 1 mL de água destilada) diluída (1:1000 em 1% de BSA/PBS-T) . Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS-T. A detecção foi realizada com solução de substrato OPD e H2S04 a 5% como solução de paragem. A absorvância foi medida utilizando um leitor ELISA (BioRad) a 450 nm e para o cálculo das médias aritméticas e erro padrão da média (SEM) foi utilizado o software EXCEL (MS Office; Microsoft). Os resultados são mostrados no QUADRO 1. Assim, o reconhecimento das proteínas 70 de fusão de Fel dl e nFel dl pelos mAB específicos para o epítopo reflecte a alta semelhança da antigenicidade de ambas as proteínas. QUADRO 1

Proteínas testadas FELD1- HC FELD1-1Oaa-HC FELDl-15aa- HC Fel dl Natural Fel dl (ng/mL) a OD50% 00 6, 7 7,9 7,2 EXEMPLO 7

Acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl a VLP derivadas de Οβ

Uma solução de VLP de Οβ 143 μΜ em tampão HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) foi feita reagir com um excesso molar de 5 vezes (715 μΜ) de SMPH (Pierce) durante 30 minutos a 25 °C com agitação. A SMPH foi retirada de uma solução-mãe 50 mM dissolvida em dimetilsulfóxido. Os produtos da reacção foram submetidos a diálise contra duas alterações de PBS utilizando uma unidade de diálise com um corte de peso molecular de 10000 Da (Slide-A-Lyzer, Pierce). A diálise foi realizada a 4 °C à temperatura ambiente num excesso >1000 vezes de tampão em relação à mistura reaccional.

Antes de acoplar as proteínas de fusão de Fel dl com a VLP de οβ, FELD1, FELD1-1Oaa, FELDl-15aa e FD12-15aa, respectivamente, como obtidas do EXEMPLO 5, derivatizada com SMPH foi incubada com TCEP (Pierce, Perbio Science) em 71 quantidades equimolares durante 30 minutos à temperatura ambiente.

As proteínas de fusão de Fel dl foram adicionadas num excesso molar de 5 vezes a uma solução a 143 μΜ de VLP de ζ)β derivatizadas com SMPH. O volume reaccional foi de 650 pL e foram realizadas reacções múltiplas em paralelo. As reacções foram incubadas durante 4 horas à temperatura ambiente com agitação. Após acoplamento, as alíquotas foram centrifugadas a 16 000 x g durante 3 minutos a 4 °C para sedimentar o material insolúvel. Os sobrenadantes foram misturados em tubos novos. O acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl à VLP de ζ)β foi avaliada por SDS-PAGE redutora. O acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl à VLP de Οβ remontada (obtida do EXEMPLO 1) é substancialmente o mesmo que o descrito acima. EXEMPLO 8

Acoplamento de FELD1, FELDl-15aa e FD12-15aa a HBcAgl-185-Lys A construção de HBcAgl-185-Lys, sua expressão e purificação foram substancialmente descritas no EXEMPLO 2-5 do documento WO 03/040164. Uma solução de VLP de HBcAgl-185-Lys 120 μΜ em Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 é feita reagir durante 30 minutos com um excesso molar de 25 vezes de SMPH (Pierce) , diluída a partir de uma solução-mãe em DMSO, a 25 °C num agitador oscilante. A solução reaccional é subsequentemente submetida a diálise duas vezes durante 2 horas contra 1L de 72

Hepes 20 inM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4 °C. A mistura reaccional de HBcAgl-185-Lys submetida a diálise é em seguida feita reagir com o Fel dl recombinante obtido no EXEMPLO 5. Na reacção de acoplamento, as FELD1, FELDl-15aa e FD12-15aa, respectivamente, estão num excesso molar de duas vezes relativamente à VLP de HBcAgl-185-Lys derivatizada. A reacção de acoplamento prossegue durante quatro horas a 25 °C num agitador oscilante. EXEMPLO 9

Acoplamento de FELD1, FELDl-15aa e FD12-15aa a VLP derivadas de AP205 A preparação de VLP de AP205 foi descrita nos EXEMPLOS 1 e 2 do documento WO 2004/007538. A derivatização de VLP de AP205 é substancialmente igual à descrita no EXEMPLO 7 para a VLP de Οβ. Antes de acoplar as proteínas de fusão de Fel dl a VLP de AP205, FELD1, FELDl-15aa e FD12-15aa derivatizadas com SMPH, obtidas no EXEMPLO 5, respectivamente, é incubada com TCEP (Pierce, Perbio Science) em quantidades equimolares durante 30 minutos à temperatura ambiente.

As proteínas de fusão de Fel dl são adicionadas num excesso molar de 5 vezes relativamente à solução a 143 μΜ das VLP de AP205 derivatizadas com SMPH. As reacções são incubadas durante 4 horas à temperatura ambiente com agitação. O acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl à VLP de AP205 remontada (obtida a partir do EXEMPLO 2) é substancialmente o mesmo que o descrito acima. 73 EXEMPLO 10

Produção da composição da invenção baseada no bacteriófago Ωβ

Uma cultura de 60 L de E. coli AB259 (5xl07 células/mL) foi multiplicada durante 2-3 horas a 37 °C sob arejamento intensivo (1 volume de ar / volume de cultura-minuto) para obter uma cultura de cerca de 2-4X109 células/mL. O lisado de fago Οβ clarificado foi inoculado a uma multiplicidade de infecção de 5 e foi adicionado CaCl2 a uma concentração final de 2,2 mM. Após uma fase de adsorção de 5 minutos, o arejamento foi intensificado (1,5 volumes de ar / volume de cultura-minuto) As células foram adicionalmente multiplicadas durante 3 horas, até a OD650 nm alcançar um valor estável, produzindo 4-6X1012 partículas de fago na cultura. Estas foram purificadas como se segue. A E.coli foi submetida a lise adicionando 10 mL de CHCI3 / L de cultura, 0,1 mg de Lisozima / L de cultura e EDTA a uma concentração final de 20 mM. O lisado foi clarificado por centrifugação numa centrifugadora de corrente paralela arrefecida, as partículas de fago foram sedimentadas a partir do lisado por precipitação com sulfato de amónio (500 g/L, produzindo aprox. 66% de saturação). A suspensão foi primeiro decantada e o precipitado isolado por centrifugação durante 30 minutos utilizando uma centrifugadora Janetzki K26 com rotor W.R. 6x500mL a 6000 rpm, ou numa centrif ugadora Beckman J21 C utilizando um rotor JA-10. O sedimento foi ressolubilizado em tampão de NT (NaCl 0,15 M, 0,1% de Trypton) e clarificado por centrifugação. O sobrenadante foi precipitado com sulfato de amónio (adicionado 500 g/L, aprox. 66% de saturação). O precipitado foi isolado por centrifugação, ressolubilizado em 74 tampão de NT e novamente clarificado por centrifugação. As partículas de fago foram isoladas a partir do sobrenadante resultante por ultracentrifugação durante 3,5 h, utilizando um rotor Beckman tipo 35 a 32000 rpm. Os fagos sedimentados foram ressuspensos em tampão de NT e purificados por ultracentrifugação sobre um gradiente contínuo convencional de CsCl. A centrifugação foi realizada utilizando um rotor Beckman Ti-70 (8x38,5), a 55000 rpm durante 20 horas. As partículas de fago foram subsequentemente submetidas a diálise contra tampão de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a ser utilizado nos passos de reticulação química como descrito no EXEMPLO 7. EXEMPLO 11

Preparação da composição da invenção baseada no fago GA

Uma cultura de 12 L de E. coli Q 13 Hfr RNASse 1“ em meio M9 contendo 2% de caseína hidrolisada, 0,5% de Extracto de levedura, 0,2% de glucose foi multiplicada até uma OD540 nm de 0,6-0,7, o que corresponde a aprox. 2xl08 células/mL, e infectada com fago GA a uma multiplicidade de infecção de 10-20. A cultura foi multiplicada durante mais 2,5-3 horas a 37 °C, produzindo aprox. 1011 partículas de fago na cultura total. As células foram submetidas a lise adicionando 1-2% v/v de CHC13 e incubando a cultura durante 15 minutos. O lisado foi clarificado por centrifugação durante 30 minutos a 5000 rpm num rotor Janetzi K26. As partículas de fago foram precipitadas com sulfato de amónio (60% de saturação) a partir do meio de cultura durante vários dias a 4 °C. A suspensão foi primeiro decantada e o precipitado isolado por centrifugação durante 30 minutos a 75

6000 rpm num rotor Janetzki K26. O sedimento foi ressuspenso em tampão NET (Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM) e as partículas extraídas por vários ciclos de centrifugação e ressuspensão em pequenas porções de tampão NET. As porções contendo cápsides foram reunidas e precipitadas com sulfato de amónio a 60%. As partículas ressuspensas em tampão NET foram purificadas três vezes sobre uma coluna de Sepharose 4B, e subsequentemente sobre dois gradientes de sacarose. Resumidamente, um gradiente foi preparado com 7 mL de 50%, 7 mL de 43%, 7 mL de 36%, 7 mL de 29% e 7 mL de 22% p/p de sacarose em tampão NET em tubos centrífugos. A solução de fago (em tampão NET) foi aplicada em camada sobre o gradiente e centrifugada durante 17h num rotor Beckman SW 28 a 25 OOOrpm. As fracções contendo cápsides foram reunidas e separadas da sacarose por filtração em gel sobre uma coluna de Sepharose 4B. As partículas de fago foram subsequentemente submetidas a diálise contra água e liofilizadas para utilização posterior.

As condições de acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl ao bacteriófago Οβ ou GA são substancialmente as mesmas que as condições de acoplamento à VLP de ζ)β como divulgado no EXEMPLO 7. EXEMPLO 12

As proteínas de fusão Οβ-Fel dl são altamente imunogénicas em ratinhos

Ratinhos BALB/c foram imunizados sc com 50 ug de Οβ-FELDl obtida no EXEMPLO 7 ou 50 ug de Οβ misturado com Fel dl recombinante (obtido no EXEMPLO 5) nos dias 0, 14 e 21 e foi 76 recolhido sangue nos dias 0, 21 e 28. Os anticorpos específicos para Fel dl foram medidos por ELISA utilizando FELD1 para revestimento (10 ug/mL). Em resumo, foram utilizados F96 de 96 poços que foram pré-revestidos a 4 °C de um dia para o outro com 10 pg/mL de FELD1 em NaHC03 0,1 M, pH 9,6. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-Tween20 e o fundo foi reduzido incubando as placas 2 h a 3 7 °C em tampão de bloqueio (2% de BSA, (Sigma) em PBS-Tween20) . O soro foi diluído em tampão de diluição de soro (2% de BSA, 1% de FCS em PBS-Tween20) . Foram efectuados passos de diluição por desdobramento e incubados durante 2 h à temperatura ambiente num agitador de placas ELISA. As placas foram lavadas cinco vezes e o anticorpo de detecção diluído a 1:1000 (anti-IgG de ratinho acoplado a HRPO (Sigma)) foi incubado durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas cinco vezes com PBS-Tween20 e a detecção foi realizada utilizando solução de substrato OPD (Na2HP04 0,066 M, ácido cítrico 0,035 M, pH5,0 contendo 10 mg de OPD (Fluka) e 8 pL de H2O2 a 30% (Fluka) por 25 mL) e H2S04 a 5% em H20 como solução de paragem. A absorvância foi medida utilizando um leitor ELISA a 450 nm e para o cálculo das médias aritméticas e do erro padrão da média (SEM) foi utilizado o software EXCEL (Microsoft).

Os ratinhos imunizados com Ç^FELDl exibiram uma absorção semi-máxima de 120 000 e 75 000 no dia 21 e dia 28, respectivamente. Pelo contrário, os ratinhos imunizados com uma mistura de QP/FELD 1 não reticulada tinham um título baixo de 7000 e 6000 no dia 21 e dia 28, respectivamente. 77 EXEMPLO 13

Imunização de ratinhos com Alúmen como adjuvante

Ratinhos Balb/c fêmeas com 7-8 semanas de idade foram vacinados três vezes (dia 0, 14 e 28) com 50 pg da Q3VLP-FELD1-HC da técnica anterior. As vacinas foram diluídas em 200 uL de PBS estéril ou 100 pL de PBS e 100 pL de AluGel-S (Serva), respectivamente, e injectadas por via subcutânea na região inguinal esquerda e direita.

Foram recolhidos soros nos dias 14, 21, 28, 42, 56, 84 e 112. Os anticorpos específicos contra o Fel dl natural, FELD-HC e VLP de QB foram determinados por ELISA.

Placas microtítulo foram revestidas de um dia para o outro com 1 pg/mL de Fel dl natural (nFel dl, Indoors biotechnologies) , 10 mg/mL de FELD1-HC e 10 mg/mL de VLP de Qb, respectivamente. Depois de lavar (0,05% de Tween 20/PBS) e bloquear com 2% de BSA em PBS, foram adicionados soros a diluições diferentes em 2% de BSA/1% de FCS/PBS.

Depois disso, o ELISA foi realizado por um método corrente. As vacinas de VLP de Οβ-FELDl-HC induziram uma resposta de anticorpos específica para Feldl alta e duradoura, para o natural e FELD1. O título de anticorpo foi maior na presença de Alúmen do que sem Alúmen (QUADRO 2). 78 QUADRO 2 com Alúmen sem Alúmen datas nFel dl FELDl-HC nFel dl FELDl-HC Dia 13 15984 53939 3394 7871 Dia 20 100311 203636 38980 77323 Dia 2 7 173190 368716 38177 56836 Dia 42 240173 419072 88953 170377 Dia 56 228500 492520 65370 163093 Dia 84 157009 219834 59603 115049 Dia 112 127745 203719 62290 116132 EXEMPLO 14 FELD1 acoplado a Οβ tem potencial alérgico drasticamente reduzido in vitro A fim de testar a aptidão de Οβ-FELDl-HC para desencadear uma reacção alérgica in vitro foram isolados basófilos do sangue de três dadores alérgicos a gatos. Num indivíduo alérgico a gatos, estes basófilos estão revestidos com IgE específica para Fel dl e respondem com a regulação positiva de CD63 à estimulação alergénica. Assim, os basófilos do indivíduo alérgico foram estimulados com guantidades tituladas de Οβ-FELDl-HC ou FELD1-HC sozinha e a regulação positiva de CD63 foi avaliada por citometria de fluxo. Embora a FELD1-HC (obtida no EXEMPLO 5) tenha desencadeado uma regulação positiva forte de CD63 à diluição mais baixa testada (cerca de 0,2ng/mL), a Οβ-FELDl-HC (obtida no EXEMPLO 7) exibiu um potencial alérgico drasticamente reduzido e necessitou de quantidades 79 100-1000 vezes mais altas (cerca de 70ng/mL) de FELD1-HC para os basófilos responderem.

Analogamente, este teste foi repetido para as proteínas de fusão FELD-15aa-HC e FD12-15aa-HC sozinhas ou acopladas a Οβ. Os resultados são mostrados na FIG 2. Estas proteínas de fusão de Fel dl, quando acopladas a Οβ, exibiram todas um potencial alérgico drasticamente reduzido. EXEMPLO 15 FELD1 acoplada a Οβ não é capaz de desencadear uma reacção intradérmica num indivíduo alérgico

Se forem introduzidos alergénios por picagem na pele de um indivíduo alérgico é gerado um edema local em menos de cerca de 20 minutos devido à activação de mastócitos residentes na pele. Aqui, o teste cutâneo foi utilizado para determinar o potencial alérgico de Οβ-FELDl-HC (obtida no EXEMPLO 7). Quantidades tituladas de Qβ-FELDl-HC ou quantidades correspondentes de FELD1-HC (obtida no EXEMPLO 5) foram introduzidas na pele de um indivíduo alérgico a gatos e a reacção cutânea foi avaliada 20 minutos depois. A Οβ-FELDl-HC foi incapaz de desencadear uma reacção cutânea, enquanto a FELD1-HC foi activa a concentrações mais de 100 vezes menores (QUADRO 3) 80 QUADRO 3: Em ambas as preparações estavam presentes quantidades correspondentes de FELDl-HC.

Diluição FELDl-HC Οβ-FELDl-HC Puro + + + - 1:10 + + - 1:100 + - 1:1000 - - EXEMPLO 16

Imunização de um indivíduo alérgico com Οβ-ΕΕΕϋΙ-ΗΟ reduz a reactividade na prova intradérmica A fim de testar a aptidão de Οβ-ΕΕΕΌ-ΗΟ para melhorar sintomas clínicos, um doente que sofre de alergia a gatos foi vacinado com 17 ug de Οβ-ΕΕΕΌ1-Η0 (obtida no EXEMPLO 7) no dia 0 (3 injecções de 2, 5 e 10 ug) , 40 ug no dia 7 (3 injecções de 10, 10 e 20 ug) e 50 ug no dia 14 (2 injecções de 10 e 40 ug) .

Foram realizadas provas intradérmicas com um extracto de gato padronizado nos dias 0, 14 e 21 e foram quantificados os diâmetros da reacção de tumefacção central (FIG 3). Em menos de 3 semanas foram necessárias concentrações de alergénio 1000 vezes superiores para induzir sintomas clínicos na prova intradérmica do que a quantidade inicial suficiente para induzir sintomas na prova intradérmica. 81 EXEMPLO 17

Imunização de um indivíduo alérgico com Οβ-FELDl-HC reduz os sintomas alérgicos no teste de provocação nasal A fim de testar a aptidão de QP-FELD1-HC para melhorar sintomas clínicos, um doente que sofre de alergia a gatos foi vacinado com 17 ug de QP-FELD1-HC (obtida no EXEMPLO 7) no dia 0 (3 injecções de 2, 5 e 10 ug) , 40 ug no dia 7 (3 injecções de 10, 10 e 20 ug) e 50 ug no dia 14 (2 injecções de 10 e 40 ug) . Os testes de provocação nasal foram realizados com um extracto de gato padronizado nos dias 0, 14 e 21 e os sintomas clínicos foram avaliados a cada nível de intensificação de dose (FIG 4A) e foi feita uma classificação alérgica global de acordo com a (FIG 4B) . Em menos de 3 semanas foram necessárias concentrações de alergénio 100-1000 vezes superiores para induzir sintomas clínicos e a classificação alérgica global foi fortemente reduzida. EXEMPLO 18

Empacotamento de ácidos nucleicos imunoestimulantes na VLP de Οβ

Proteína de revestimento de QP desmontada e purificada foi obtida como descrito no EXEMPLO 1 (A) e (B) . Remontagem: foi adicionado β-mercaptoetanol à fracção de dímero de 10 mL até uma concentração final de 10% e foram adicionados 300 pL de uma solução do oligodesoxinucleótido (CpG)2oOpA, contendo 12,3 nmol de oligonucleótido. A mistura de remontagem foi primeiro submetida a diálise contra 30 mL de tampão NET (Tris-HCl 20 mM, 82 ρΗ 7,8 com EDTA 5mM e NaCl 150 mM) contendo 10% de beta-mercaptoetanol durante 2 horas a 4 °C e, em seguida, submetida a diálise de um modo continuo, com um caudal de tampão NET de 8 mL/h ao longo de 4 dias a 4 °C. A mistura de remontagem foi então dessalinizada contra água por diálise, com 6 trocas de tampão (4 X 100 mL, 2x1 litro). O acoplamento das proteínas de fusão de Fel dl com a VLP de Οβ com CpG empacotado no interior é realizado substancialmente do mesmo modo como descrito no EXEMPLO 7. EXEMPLO 19 0 soro específico para Fel dl inibiu a desgranulação de basófilos induzida pelas proteínas de fusão de Fel dl in vitro A fim de testar a aptidão da IgG específica anti-Fel dl para inibir a desgranulação, os basófilos de um indivíduo alérgico foram estimulados com uma quantidade definida de FELD1-HC ou FELDl-15aa-HC pré-incubada com um série de diluições de quantidades decrescentes de IgGs isoladas de coelhos imunizados com Οβ-FELDl-HC. A regulação positiva de CD63 foi avaliada por citometria de fluxo. A IgG anti-Fel dl bloqueou a desgranulação induzida por Fel dl a todas as concentrações testadas, enquanto a IgG de controlo não mostrou qualquer efeito (QUADRO 4) . 83 QUADRO 4 amostras FELD1-HC Percentagem de desgranulação FELDl-15aa-HC Percentagem de desgranulação Sem IgG 33 33 IgG específica para Fel dl (2 0 Ong/mL) 1,9 1,6 IgG especifica para Fel dl (10 Ong/mL) 5, 2 i—1 CN IgG específica para Fel dl (50ng/mL) 8,2 2,3 IgG específica para Fel dl (25ng/mL) QO O \—1 4,2 IgG não especifica 35 29 Sem estimulação de Fel dl 1,2 1,2 EXEMPLO 20

Imunização de ratinhos alérgicos a Fel dl com QP-FELD1-HC

Foi utilizado um modelo de asma experimental de inflamação alérgica das vias aéreas em ratinhos para avaliar os efeitos da vacinação contra o alergénio natural Fel dl na resposta de anticorpos de IgE no soro e BAL (Lavagem broncoalveolar) de ratinhos BALB/c. Foram sensibilizados 5 ratinhos por grupo por via peritoneal com lug de Fel dl natural em AlumGel-S no dia 0. Os ratinhos foram vacinados por via subcutânea no dia 35 e 49 com 50 ug de Οβ sozinho ou com 50 ug de Οβ-ΡΕΒϋΙ-ΗΟ antes de duas provas intranasais posteriores no dia 63 e dia 70. Depois de 5 dias da última prova intranasal, os ratinhos foram sacrificados para recolher o soro e o BALF (Liguido da Lavagem 84

Broncoalveolar) para análise da resposta imunológica humoral (títulos de subclasses de IgE) por ELISA.

Placas ELISA foram revestidas com um mAb anti-IgE de rato (2 ug/mL) diluído em tampão de Carbonato de um dia para o outro a 4 °C. Depois de bloquear a placa com PBS/5% de BSA durante 2 horas, as placas foram incubadas durante mais duas horas com soro (primeiro poço pré-diluído a 1:100, em seguida diluição a 1:3 ao longo de 8 passos) ou BAL (primeiro poço BAL puro, em seguida diluição a 1:3 ao longo de 8 passos) de ratinhos sensibilizados, vacinados e submetidos a prova de antigénio. Após 2 horas de incubação da amostra, o soro e BAL-IgE foi detectado com um anticorpo de rato anti-IgE de ratinho marcado com HRP antes da detecção com o substrato OPD. QUADRO 5

Grupo Soro (d75) BAL (d75) Título a OD50 o 0 redução Título a OD50 O, "0 redução Vacinado com Q3 1036 - 15 - Vacinado com Οβ -Fel dl 49 95 0 100 85

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Cytos Biotechnology AG

Bachmann, Martin F Monika, BAUER F Dietmeier, Klaus Schmitz, Nicole Uzinger, Stefan <120> Conjugados de alergénio de gato e suas utilizações <130> P1048PC00 <150> 60/662918 <151> 2005-03-18 <16 0> 69 <17 0> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Bacteriófago Q-beta 86 <4 Ο 0> 1

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15

Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Ala Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Bacteriófago Q-beta 87 <400> 2

Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly 1 5 10 15 Lys Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Vai Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Vai Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Vai Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe val Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160 Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175 Vai Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala 180 185 190 Vai Glu Leu Gin Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220 88

Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Gin Ala Met Arg Asp Gin Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255

Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270

Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285

Ala Asp Gly Vai Ile Vai Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300

Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320

Gin Ala Vai Ile Vai Vai Pro Arg Ala 325

<210> 3 <211> 129 <212> PRT <213> Bacteriófago R17 <400> 3

Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Vai Leu Vai Asn Asp Gly Gly Thr Gly 15 10 15

Asn Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser Vai 35 40 45

Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Vai Glu Vai 50 55 60 89

Pro Lys Vai Ala Thr Gin Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai Ala 65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Vai Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr <210> 4 <211> 130 <212> PRT<213> Bacteriófago fr <400> 4 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe 1 5 Gly Asp Vai Lys Vai Ala Pro Ser

Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr 10 15 20

Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser 35 40

Gin Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser 45

Vai Arg Gin Ser Ser Ala Asn Asn 50 55

Arg Lys Tyr Thr Vai Lys Vai Glu 60

Vai Pro Lys Vai Ala Thr Gin Vai 65 70

Gin Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Vai Phe 85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Vai Lys Ala Leu Gin Gly Thr 100 105 110 90

Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125

Ile Tyr 130

<210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriófago GA <400> 5

Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15

Asn Vai Thr Vai Vai Pro Vai Ser Asn Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30

Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Vai Thr Ala Ser Tyr 35 40 45

Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Vai 50 55 60

Pro Lys Ile Vai Thr Gin Vai Vai Asn Gly Vai Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80

Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Ala Thr Asp Asp Vai Thr Vai Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110

Lys Vai Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125

Tyr Ala 130

<210> 6 <211> 132 <212> PRT

<213> Bacteriófago SP 91 < 4 Ο Ο > 6

Met Ala Lys Leu Asn Gin Vai Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Gin Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Vai Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Vai Thr Vai Ser Vai Ala Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys 50 55 60 Vai Gin Ile Lys Leu Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Vai Thr Leu Ser Phe 85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Vai Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 7 <211> 329 <212> PRT <213> Bacteriófago SP <400> 7

Ala Lys Leu Asn Gin Vai Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp 15 10 15

Gin Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30 92

Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45 Thr Vai Ser Vai Ala Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Vai 50 55 60 Gin Ile Lys Leu Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp 65 70 75 80 Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Vai Thr Leu Ser Phe Thr 85 90 95 Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala 100 105 110 Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Vai Asp Ala ile Asp Asn Leu Asn 115 120 125 Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Vai Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp 130 135 140 Asn Pro Ser Asp Pro Asp Vai Pro Vai Vai Pro Asp Vai Lys Pro Pro 145 150 155 160 Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175 Ser Ile Tyr Glu Vai Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg 180 185 190 Gly Asp Glu Vai Ser Vai Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gin Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220 Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr ile Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ala Thr Ala Met Gin Ser Asp Asp Phe Vai Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255 Vai Arg Lys Vai Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu 260 265 270 93

Leu Asn Ile Gin Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Vai Thr Ala 275 280 285 Tyr Arq Ser Tyr Gly Met Vai Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Gin Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gin Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro 305 31Ò 315 320 Vai Gin Thr Vai Ile Ile Ile Pro Ser 325 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriófago MS 2 <400> 8 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Glv Asp Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser 35 40 45 Vai Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Vai Glu 50 55 60 Vai Pro Lys Vai Ala Thr Gin Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Vai Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 94

Ile Tyr 130

<210> 9 <211> 133 <212> PRT <213> Bacteriófago Mil <400> 9

Met Ala Lys Leu Gin Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly 15 10 15

Asp Vai Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Vai Thr Ile Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Vai Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Vai Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gin Tyr Ser Thr Vai Glu Glu Arg Ala Leu Vai Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Gin Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Vai Asn Ala Ile Asp Asn 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 10 <211> 133 <212> PRT <213> Bacteriófago MX1 95 <4 Ο 0> 10

Met Ala Lys Leu Gin Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Vai Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Vai Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Ara 35 40 45 Vai Thr Ile Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Vai Gin vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Vai Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 11 <211> 330 <212> PRT <213> Bacteriófago NL95 <40 0> 11

Met Ala Lys Leu Asn Lys Vai Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly 15 10 15

Asn Gin Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 96

Vai Thr Vai Ser Vai Ala Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Vai Gin Ile Lys Leu Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Vai Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Vai Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Vai Pro Asp Ser Pro Asn Vai Lys Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly 165 170 175 Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys 180 185 190 Gly Ser Glu Ala Leu Vai Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205 Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp 210 215 220 Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Vai Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ala Ser Vai Met Gin Ser Asp Glu Tyr Vai Leu Ser Gly Ala Tyr Asp 245 250 255 Vai Vai Lys Met Gin Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr 260 265 270 Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Vai Asp Leu Ala Glu Vai Thr Ala 275 280 285 Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Vai Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300 97

Pro Gin Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro 305 310 315 320

Vai Gin Thr Vai Ile Vai Ile Pro Ser Leu 325 330 <210> 12 <211> 129 <212> PRT <213> Bacteriófago f2 <400> 12

Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Vai Leu Vai Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30 Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser Vai 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Vai Glu Vai 50 55 60 Pro Lys Vai Ala Thr Gin Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arq Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Vai Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr 98

<210> 13 <211> 128 <212> PRT <213> Bacteriófago ΡΡ7 <400> 13

Met Ser Lys Thr Ile Vai Leu Ser Vai Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu 15 10 15

Thr Glu Ile Gin Ser Thr Ala Asp Arg Gin Ile Phe Glu Glu Lys Vai 20 25 30

Gly Pro Leu Vai Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gin Asn 35 40 45

Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Vai Asn Leu Lys Leu Asp Gin Ala Asp 50 55 60

Vai Vai Asp Cys Ser Thr Ser Vai Cys Gly Glu Leu Pro Lys Vai Arg 65 70 75 80

Tyr Thr Gin Vai Trp Ser His Asp Vai Thr Ile Vai Ala Asn Ser Thr 85 90 95

Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Vai Ala 100 105 110

Thr Ser Gin Vai Glu Asp Leu Vai Vai Asn Leu Vai Pro Leu Gly Arg 115 120 125

<210> 14 <211> 131 <212> PRT <213> bacteriófago AP205 99 <400> 14

Met Ala Asn Lys Pro Met Gin Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile 1 5 10 15 Vai Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Arg Gin Arg Vai Lys Vai Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser 35 40 45 Gly Gin Tyr Vai Ser Vai Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly 50 55 60 Cys Ala Asp Ala Cys Vai Ile Met Pro Asn Glu Asn Gin Ser Ile Arg 65 70 75 80 Thr vai Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu 85 90 95 Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Vai Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn 100 105 110 Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp 115 120 125 Thr Thr Ala 130

<210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Bacteriófago Qbeta 240 mutante 100 <4 Ο 0> 15

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45 Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60 Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125 Asn. Pro Ala Tyr 130 <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Bacteriófago Q-beta 243 mutante 101 < 4 Ο Ο > 16

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45 Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60 Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 17 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Bacteriófago Q-beta 250 mutante 102 < 4 Ο Ο > 17

Ala Arg Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys 15 10 15

Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Bacteriófago Q-beta 251 mutante 103 <4 Ο 0> 18

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg 15 10 15

Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr T3Õ1

<210> 19 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Bacteriófago Q-beta 259 mutante 104 <400> 19

Ala Arg Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg 15 10 15

Gin Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gin Vai Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 20 <211> 185 <212> PRT

<213> Vírus da Hepatite B <400> 20

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Vai Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 105

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Vai Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Vai Vai Asn Tyr Vai Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gin Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arq 100 105 110 Glu Thr Vai Leu Glu Tyr Leu Vai Ser Phe Gly Vai Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Vai Vai Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys 180 185

<210> 21 <211> 188 <212> PRT <213> vírus da Hepatite B 106

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Vai Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Vai Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Vai Vai Ser Tyr Vai Asn Thr Asn Vai 85 90 95 Gly Leu Lys Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His ile Ser Cys Leu Thr 100 105 110 Phe Gly Arg Glu Thr Vai Leu Glu Tyr Leu Vai Ser Phe Gly Vai Trp 115 120 125 Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser 130 135 140 Thr Leu Pro Glu Thr Thr Vai Vai Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys <400> 21 180 <210> 22 <211> 70 <212> PRT <213> Felis domesticus 107 <4Ο0> 22

Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly 1 5 10 15 Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30 Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys 35 40 45 Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys ile 50 55 60 Tyr Thr Ser Pro Leu Cys 65 70 <210> 23 <211> 92 <212> PRT <213> Felis domesticus <40 0> 23 Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 1 5 10 15 Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai 20 25 30 Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys 35 40 45 Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met 50 55 60 Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gin Asn 65 70 75 80

Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 85 90 108

<210> 24 <211> 162 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> fusão da cadeia 2 + cadeia 1 <400> 24

Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 1 5 10 15 Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30 Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys ile Gin Asp Cys 35 40 45 Tyr.. Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met 50 55 60 Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gin Asn 65 70 75 80 Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu Ile Cys Pro 85 90 95 Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu 100 105 110 Tyr Val Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu 115 120 125 Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu 130 135 140 Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro 145 150 155 160 Leu Cys 109 <210> 25

<211> 90 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 25

Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro 1 5

Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu 20

Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 25 30

Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr 35 40

Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys 45

Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser 50 55

Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met 60

Ile Ala Ile Asn Glu Tyr Cys Met 65 70

Gly Glu Ala Val Gin Asn Thr Val 75 80

Gly Arg 90

Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu 85

<210> 26 <211> 78 <212> PRT <213> Felis domesticus 110 <400> 26

Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 1 5 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30

Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys 35 40 45

Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met 50 55 60

Pro Ser Thr Asn Ile Ala Trp Val Lys Gin Phe Arg Thr Pro 65 70 75

<210> 27 <211> 27 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 27

Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val 15 10 15

Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Val 20 25

<210> 28 <211> 27 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 28

Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys 15 10 15

Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu 20 25 111 <210> 29 <211> 26

<212> PRT <213> Felis domesticus <400> 29

Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu 15 10 15

Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg 20 25

<210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 30

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 1 5 10 15

Ser Pro Leu

<210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 31

Met Gly Glu Ala Vai Gin Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr 15 10 15

Leu Gly Arg 112 <210> 32

<211> 16 <212> PRT <213> Felis domesticus <400> 32

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 15 10 15 <210> 33 <211> 174 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> fusão com marcador de <40 0> 33

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 15 10 15

Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 20 25 30

Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp 35 40 45

Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 50 55 60 113

Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gin 65 70 75 80

Aan Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu Ile Cys 85 90 95

Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp 100 105 110

Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu 115 120 125

Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu 130 135 140

Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser 145 150 155 160

Pro Leu Cys Leu Glu His His His His His His Gly Gly Cys 165 170

<210> 34 <211> 85 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0>

<223> iniciador 1F <400> 34 gtacatatgg aaatctgccc ggctgttaaa cgtgacgttg acctgttcct gaccggtacc ccggacgaat acgttgaaca ggttg 60 85

<210> 35 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial 114 <220> <223> iniciador 2R <400> 35 ggcagagctt tgtactgagc aacctgttca acgtattc 38 <210> 36 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 3F <400> 36 gctcagtaca aagctctgcc ggttgttctg gaaaacgctc gtatcctgaa aaactgcgtt 60 gacgctaaaa tgacc 75 <210> 37 <211> 89 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 4R <400> 37 cctctcgagg cacagcgggg aggtgtagat tttgtccagc agggacagag cgttttcttt 60 gtcttcttcg gtcattttag cgtcaacgc 89 115 <210> 38 <211> 76 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 5F <400> 38 gtacatatgg ttaaaatggc tgaaacctgc ccgatcttct acgacgtttt cttcgctgtt 60 gctaacggta acgaac 76 <210> 39 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 6R <400> 39 ggtacgttcc ggttcggtag cgttaacttt ggtcagggac aggtccagca gcagttcgtt 60 accgttagca acagc 75

<210> 40 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 7F 116 <4Ο0> 40 60 ctaccgaacc ggaacgtacc gctatgaaaa aaatccagga ctgctacgtt gaaaacggtc tgatctcccg tgttctggac 80 <210> 41 <211> 71 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 8R <400> 41 gcttcaccca tgcagtcttt ggaggaggag atggtggtca taaccagacc gtccagaaca 60 cgggagatca g 71 <210> 42 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 9F <400> 42 caaagactgc atgggtgaag ctgttcagaa caccgttgaa gacctgaaac tgaacaccct 60 gggtcgctcg agagg 75 <210> 43 <211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial 117 <220> <223> iniciador 10R <400> 43 cctctcgagc gacccagggt g 21 <210> 44 <211> 45 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> unidade de ligação de iniciador <400> 44 cgtttaacag ccgggcagat ttcacgaccc agggtgttca gtttc 45 <210> 45 <211> 28 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 12-1 <400> 45 gtacatatgg aaatctgccc ggctgtta 28 <210> 46 <211> 48 <212> ADN <213> sequência artificial 118 <220> <223> iniciador 12-3 <400> 46 gcaggtttca gccattttaa cgcacagcgg ggaggtgtag attttgtc 48 <210> 47 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 12-2-1 <400> 47 cctctcgaga cgacccaggg tgttcagttt caggtcttc 39 <210> 48 <211> 58 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador l-10aa <400> 48 ggtggaggag gtagcggtgg aggaggtagc gaaatctgcc cggctgttaa acgtgacg 58 <210> 49 <211> 41 <212> ADN <213> sequência artificial 119 <220> <223> iniciador 2-5aa <400> 49 gctacctcct ccaccacgac ccagggtgtt cagtttcagg t 41 <210> 50 <211> 43 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador l-5aa <400> 50 ggtggaggag gtagcgaaat ctgcccggct gttaaacgtg acg 43 <210> 51 <211> 59 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 2-10aa <400> 51 ggtggaggag gtagcggtgg aggaggtagc gttaaaatgg ctgaaacctg cccgatctt 59 <210> 52 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial 120 <220> <223> iniciador l-5aa <400> 52 gctacctcct ccaccgcaca gcggggaggt gtagattttg tc 42 <210> 53 <211> 44 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador 2-5aa <40 0> 53 ggtggaggag gtagcgttaa aatggctgaa acctgcccga tctt 44 <210> 54 <211> 175 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> FELD1-1Oaa 121 <4Ο0> 54

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 1 5 10 15 Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 20 25 30 Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp 35 40 45 Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 50 55 60 Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gin 65 70 75 80

Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp 100 105 110 Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai 115 120 125 Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu 130 135 140 Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala 145 150 155 160

Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Leu Glu 165 170 175 <210> 55 <211> 180 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> FELDl-15aa 122 <4Ο0> 55

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys 1 5

Pro Ile Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 10 15

Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu 20

Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 25 30

Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg 35 40

Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp 45

Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile 50 55

Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 60

Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys 65 70

Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gin 75 80

Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu 85

Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly 90 95

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100

Gly Gly Gly Ser Glu Ile Cys Pro 105 110

Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu 115 120

Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu 125

Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr 130 135

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu 140

Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys 145 150

Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu 165

Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu 155 160

Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro 170 175

Leu Cys Leu Glu 180

<210> 56 <211> 165 <212> PRT <213> sequência artificial 123 <22 0> <223> FD12 <4Ο0> 56

Met Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr 15 10 15

Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu 20 25 30

Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala 35 40 45

Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys 50 55 60

Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile 65 70 75 80

Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu 85 90 95

Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala 100 105 110

Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg 115 120 125

Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys 130 135 140

Met Gly Glu Ala Vai Gin Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr 145 150 155 160

Leu Gly Arg Leu Glu 165

<210> 57 <211> 180 <212> PRT <213> sequência artificial 124 <22 0> <223> FD12-15aa <4Ο0> 57

Met Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu 20 25 30 Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala 35 40 45 Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys 50 55 60 Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe 85 90 95 Tyr Asp Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp 100 105 110 Leu Ser Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met 115 120 125 Lys Lys Ile Gin Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai 130 135 140 Leu Asp Gly Leu Vai Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met 145 150 155 160 Gly Glu Ala Vai Gin Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu 165 170 175

Gly Arg Leu Glu 180 125

<210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> unidade de ligação gama 1 <400> 58

Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 15 10

<210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> unidade de ligação de glicina N-terminal <400> 59

Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5

<210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> unidade de ligação de glicina-serina N-terminal 126 < 4 Ο Ο > 60

Cys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> unidade de ligação GCGSGGGGS <400> 61

Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> unidade de ligação gama 1 C-terminal <400> 62

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly 15 10 artificial <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> sequência 127 <220> <223> unidade de ligação gama 3 C-terminal <400> 63

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly 15 10 15

Cys Gly

<210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> unidade de ligação de glicina C-terminal <400> 64

Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5

<210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> unidade de ligação de glicina-serina C-terminal <400> 65

Ser Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 128 1 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> sequência artificia <220> <223> unidade de ligação <400> 66 Gly Ser 1 Gly Gly Gly 5 Gly Ser Gly <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artificia <22 0> <223> unidade de ligação <40 0> 67 GSGGGGSGCG Cys Gly 10 1 Gly Gly Lys Lys Gly Cys 1 5 de glicina-lisina <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> sequência artifici <22 0> <223> unidade de ligaçao 1 de glicina-lisina 2 129 < 4 Ο Ο > 68 Cys Gly Lys Lys Gly Gly 1 5 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> CGGPKPSTPPGSSGGAP <40 0> 69

Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala 15 10 15

Pro

Lisboa, 28 de Junho de 2013 130

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo: (a) uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de ligação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP), (b) , pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o referido, pelo menos, um antigénio é uma proteína de Fel dl, em que a referida proteína de Fel dl é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl, em que a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da referida cadeia 1 de Fel dl directamente através de uma ligação peptídica ou através de um espaçador, e em que (a) e (b) estão ligados covalentemente através do referido, pelo menos um, primeiro e do referido, pelo menos um, segundo sítio de ligação.
2. Composição da reivindicação 1, em que a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da referida cadeia 1 de Fel dl através de um espaçador, em que o referido espaçador consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 1-20 resíduos de aminoácido, em que, de um modo preferido, o referido espaçador consiste de uma sequência de aminoácidos possuindo 10-20 resíduos de aminoácido. 1
3. Composição da reivindicação 2, em que o referido espaçador é (GGGGS)3.
4. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a referida proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N°: 24; (b) SEQ ID N°: 54; e (c) SEQ ID N°: 55.
5. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida cadeia 1 de Fel d 1 compreende uma sequência da SEQ ID N°: 22 ou uma sua sequência homóloga, em que a referida sequência homóloga tem uma identidade com a SEQ ID N° : 22 superior a 80%, de um modo preferido, superior a 9 0% ou de um modo ainda mais preferido superior a 95%.
6. Composição de qualquer um das reivindicações 1-4, em que a referida cadeia 2 de Fel d 1 compreende uma sequência da SEQ ID N° : 23, SEQ ID N° : 25 ou SEQ ID N° : 26, ou uma sua sequência homóloga, em que a referida sequência homóloga tem uma identidade com a SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25 ou SEQ ID N° : 26 superior a 80%, de um modo preferido, superior a 90%, e de um modo ainda mais preferido superior a 95%. 2
7. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a referida partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a vírus de um bacteriófago de ARN, em que, de um modo preferido, o referido bacteriófago de ARN é seleccionado de Οβ, fr, GA ou AP205.
8. Composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido primeiro sítio de ligação compreende, ou, de um modo preferido, é um grupo amino, de um modo preferido, um grupo amino de uma lisina.
9. Composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido segundo sítio de ligação compreende, ou, de um modo preferido, é um grupo sulfidrilo, de um modo preferido, um grupo sulfidrilo de uma cisteína.
10. Composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida partícula semelhante a vírus com o referido, pelo menos um, primeiro sítio de ligação está ligada à referida, pelo menos, uma proteína de Fel dl com o referido, pelo menos um, segundo sítio de ligação através de, pelo menos, uma ligação covalente não peptídica.
11. Composição de qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda uma unidade de ligação, em que a referida unidade de ligação está fundida com a extremidade C-terminal da referida proteína de Fel dl, e em que, de um modo preferido, a referida unidade de ligação compreende o referido segundo sítio de ligação. 3
12. Vacina compreendendo a composição de qualquer uma das reivindicações 1-9, em que, de um modo preferido, a referida vacina compreende ainda, pelo menos, um adjuvante.
13. Composição farmacêutica compreendendo: (a) a composição de qualquer uma das reivindicações 1-9; e (b) um veiculo farmacêutico aceitável.
14. Método de produção da composição de qualquer uma das reivindicações 1-9 compreendendo: (a) proporcionar uma partícula central com, pelo menos um, primeiro sítio de liqação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP); (b) proporcionar, pelo menos, um antigénio com, pelo menos um, segundo sítio de ligação, em que o referido antigénio é uma proteína de Fel dl, em que a referida proteína de Fel dl é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 de Fel dl e a cadeia 2 de Fel dl, em que a referida cadeia 2 de Fel dl está fundida através da sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da referida cadeia 1 de Fel dl directamente através de uma ligação peptídica ou através de um espaçador; e (c) ligar a referida partícula central e o referido, pelo menos, um antigénio para produzir a referida 4 composição, em que o referido, pelo menos, um antigénio e a referida partícula central estão ligados através do referido, pelo menos um, primeiro e do referido, pelo menos um, segundo sítios de ligação.
15. Utilização da composição de qualquer uma das reivindicações 1-9 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de alergia a gatos. Lisboa, 28 de Junho de 2013 5